CN101977928A

CN101977928A - 用于改进植物的水分利用效率、肥料利用效率、生物/非生物胁迫耐受性、产量和生物量的分离多肽、多核苷酸

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Publication number: CN101977928A
Application number: CN200880127757XA
Authority: CN
Inventors: G·罗南; B·J·维诺库尔; A·迪伯; S·阿亚尔; H·卡基; Y·赫施科维茨
Original assignee: Evogene Ltd
Current assignee: Evogene Ltd
Priority date: 2007-12-27
Filing date: 2008-12-23
Publication date: 2011-02-16
Anticipated expiration: 2028-12-23
Also published as: MX340504B; CA2709517C; EP2240510A2; MX357387B; US9670501B2; WO2009083958A2; US20110119791A1; AU2008344935C1; WO2009083958A8; BRPI0819476A2; ZA201004460B; WO2009083958A3; US20130219562A1; AU2008344935B2; US10407690B2; US20170204428A1; CA2709517A1; CN101977928B; AU2008344935A1; US8426682B2

Abstract

本发明提供多核苷酸、多肽、表达相同多肽的植物细胞和使用相同核苷酸、多肽和植物细胞以提高植物的非生物胁迫耐受性、水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生长势和/或产量的方法。所述方法通过在植物中表达编码包含与选自以下的氨基酸序列有至少80％同源性的氨基酸序列的多肽的外源多核苷酸来实现：SEQ IDNO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065和3067-3259，从而提高植物的水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生长势和/或产量。

Description

用于改进植物的水分利用效率、肥料利用效率、生物/非生物胁迫耐受性、产量和生物量的分离多肽、多核苷酸

发明领域与背景

在本发明的一些实施方案中，本发明涉及新的水通道蛋白多核苷酸和多肽，更准确但并非唯一地讲是涉及使用所述多核苷酸和多肽提高植物的非生物胁迫耐受性、水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生长势和/或产量的方法。

非生物胁迫条件例如盐分、干旱、洪涝、亚适温和有毒化学污染，给农业植物造成极大损失。大多数植物进化出保护自身免受这些条件侵害的策略。然而，如果胁迫条件的严重性太大，持续时间太久，则对大多数农作物的植物发育、生长和产量的影响都十分深远。此外，大多数农作物都非常易受到非生物胁迫(ABS)的影响，因此对于经济作物产量而言需要最佳的生长条件。连续暴露于胁迫会引起植物代谢发生较大改变，最终将导致细胞死亡，结果使产量蒙受损失。

全球性供水短缺是影响植物生长和作物产量最严重的农业问题之一，已进行努力以减轻全球耕地沙漠化和盐碱化的有害作用。为此，Agbiotech公司试图生产耐受不同非生物胁迫的新的作物品种，主要集中在开发新的可以耐受较长时期缺水的新品种。

研究表明，植物对不利环境条件适应是具有多基因性质的复杂遗传特性。当供水受限时，植物WUE对于作物的存活和产量至关重要。因为世界范围内缺水日渐严重，水质下降，因此增加水分生产率和植物WUE十分重要。许多环境非生物胁迫例如干旱、低温或高盐，降低根系导水性，影响植物生长，降低作物生产率。

可以通过传统育种或者通过遗传工程产生遗传上改进的植物FUE。在转基因植物中改进FUE的努力可参见Choo等人的美国专利申请20020046419；Edgerton等人的美国专利申请20030233670；Chomet等人的美国专利申请20060179511；Yanagisawa等[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2004，101(20)：7833-8]；Good AG等[Trends Plant Sci.2004，9(12)：597-605]；以及Good等人的美国专利第6,084,153号。

水通道蛋白(AQP，Aquaporin/water channel protein)参与水分跨膜转运，在环境和发育条件发生变化的情况下维持细胞水平衡和稳态[Maurel C.Plant aquaporins：Novel functions and regulation properties(植物水通道蛋白：新的功能与调节性质).FEBS Lett.2007，581(12)：2227-36]。这些蛋白质被认为是能够使水和小的中性溶质例如尿素和CO₂跨膜转运的主要通道[Maurel C.Plant aquaporins：Novelfunctions and regulation properties(植物水通道蛋白：新的功能与调节性质).FEBS Lett.2007年6月12日；581(12)：2227-36]。植物中，AQP以内在蛋白的4个亚家族存在：质膜蛋白(PIP)、液泡膜蛋白(TIP)、碱性小蛋白(SIP)和NOD26样蛋白(NIP)。与动物相比，植物中AQP成员的总数似乎出人意料的高[Maurel C.，2007(同上)]。例如，在拟南芥基因组中已鉴定出35种AQP基因[Quigley F等，“From genome tofunction：the Arabidopsis aquaporins(从基因组到功能：拟南芥水通道蛋白)”.Genome Biol.2002，3(1)：RESEARCH0001.1-1.17]；玉米中36种[Chaumont F等，2001，“Aquaporins constitute a large and highlydivergent protein family in maize(水通道蛋白在玉米中构建大量高度趋异的蛋白质家族).Plant Physiol”，125(3)：1206-15]；水稻中33种[Sakurai，J.等，2005，Identification of 33 rice aquaporin genes and analysisof their expression and function(33种水稻水通道蛋白基因的鉴定及其表达与功能的分析).Plant Cell Physiol.46，1568-1577]。植物中大量的AQP表明在环境条件发生变化的情况下的不同作用和差异性调节[Maurel C.，2007(同上)]。

本发明的发明人的WO2004/104162教导了多核苷酸序列和使用同样的多核苷酸序列提高植物对非生物胁迫的耐受性和/或提高植物生物量的方法。

本发明的发明人的WO2007/020638教导了多核苷酸序列和使用同样的多核苷酸序列提高植物对非生物胁迫的耐受性和/或提高植物的生物量、生长势和/或产量的方法。

Lian HL等，2006(Cell Res.16：651-60)在水稻中过量表达AQP的PIPl亚组成员。Aharon R.等，2003(Plant Cell，15：439-47)在转基因烟草植物中过量表达拟南芥质膜水通道蛋白PIP1b。

发明概述

本发明一些实施方案的一个方面提供提高植物的非生物胁迫耐受性的方法，所述方法包括在植物中表达编码包含与选自以下的氨基酸序列有至少80％同源性的氨基酸序列的多肽的外源多核苷酸：SEQID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065和3067-3259，从而提高植物的非生物胁迫耐受性。

本发明一些实施方案的一个方面提供提高植物的水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生长势和/或产量的方法，所述方法包括在植物中表达编码多肽的外源多核苷酸，所述外源多核苷酸包含与选自以下的氨基酸序列有至少80％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065和3067-3259，从而提高植物的水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生长势和/或产量。

本发明一些实施方案的一个方面提供分离多核苷酸，所述多核苷酸包含与选自以下的核酸序列有至少80％同一性的核酸序列：SEQ IDNO：7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857和2859-3051。

本发明一些实施方案的一个方面提供核酸构建体，所述核酸构建体包含本发明的分离多核苷酸和指导核酸序列转录的启动子。

本发明一些实施方案的一个方面提供分离多肽，所述多肽包含与选自以下的氨基酸序列有至少80％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065和3067-3259。

本发明一些实施方案的一个方面提供包含外源多肽的植物细胞，所述多肽具有与选自以下的氨基酸序列有至少80％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065和3067-3259。

本发明一些实施方案的一个方面提供包含外源多核苷酸的植物细胞，所述外源多核苷酸包含与选自以下的核酸序列有至少80％同源性的核酸序列：SEQ ID NO：7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857和2859-3051。

本发明一些实施方案的一个方面提供提高植物的非生物胁迫耐受性的方法，所述方法包括在植物中表达编码多肽的外源多核苷酸，所述多肽包含由SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065、3067-3258或3259所示的氨基酸序列，从而提高植物的非生物胁迫耐受性。

本发明一些实施方案的一个方面提供提高植物的水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生长势和/或产量的方法，所述方法包括在植物中表达编码多肽的外源多核苷酸，所述多肽包含由SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065、3067-3258或3259所示的氨基酸序列，从而提高植物的水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生长势和/或产量。

本发明一些实施方案的一个方面提供分离多核苷酸，所述多核苷酸包含由SEQ ID NO：7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857、2859-3050或3051所示的核酸序列。

本发明一些实施方案的一个方面提供分离多肽，所述多肽包含由SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065、3067-3258或3259所示的氨基酸序列。

本发明一些实施方案的一个方面提供包含外源多肽的植物细胞，所述多肽具有由SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065、3067-3258或3259所示的氨基酸序列。

本发明一些实施方案的一个方面提供包含外源多核苷酸的植物细胞，所述外源多核苷酸包含由SEQ ID NO：7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857、2859-3050或3051所示的核酸序列。

按照本发明的一些实施方案，所述多核苷酸选自SEQ ID NO：7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857和2859-3051。

按照本发明的一些实施方案，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065和3067-3259。

按照本发明的一些实施方案，所述多肽选自SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065和3067-3259。

按照本发明的一些实施方案，非生物胁迫选自盐分、脱水、低温、高温、重金属毒性、无氧生活、养分缺乏、养分过量、大气污染和紫外幅射。

按照本发明的一些实施方案，所述方法还包括使表达外源多核苷酸的植物在非生物胁迫下生长。

按照本发明的一些实施方案，所述启动子是组成型启动子。

按照本发明的一些实施方案，植物细胞形成植物的一部分。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。尽管类似或等同于本文所述方法与材料的方法与材料可用于本发明实施方案的实践或试验中，但是下面描述了示例性的方法和/或材料。万一发生抵触，则以本专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例只是说明性的，并不一定是限制性的。

附图简述

本发明仅通过实施例并参照附图进行描述。要强调的是，有关具体附图详情，所表示的具体细节是通过实施例的方式进行的，而且仅仅是为了举例论述本发明优选的实施方案的目的。在这一点上，附图中的说明使本领域技术人员明白本发明的实施方案是如何体现在实践中的。

在附图中：

图1是用于表达本发明的分离多核苷酸序列的pGI二元质粒示意图。RB-T-DNA右边界；LB-T-DNA左边界；H-HindIII限制性内切酶；X-XbaI限制性内切酶；B-BamHI限制性内切酶；S-SalI限制性内切酶；Sm-SmaI限制性内切酶；R-I-EcoRI限制性内切酶；Sc-SacI/SstI/Ecl136II；(数字)-碱基对长度；NOS pro＝胭脂碱合酶启动子；NPT-II＝新霉素磷酸转移酶基因；NOS ter＝胭脂碱合酶终止子；聚A信号(聚腺苷酸化信号)；GUSintron-GUS报道基因(编码序列和内含子)。将本发明一些实施方案的分离多核苷酸序列克隆至载体中，同时置换GUS内含子报道基因。

图2A-B是在透明琼脂平板中生长的植物根发育的照片。使不同的转基因在透明琼脂平板中生长10-15天，自第1天开始，每2-5天对平板进行拍照。图2A-在琼脂平板上12天后拍摄的示例性植物照片。图2B-对根进行分析的示例性照片，其中所测量的根长用红色箭头表示。

图3A-F直方图表示在200mM氯化钠(NaCl)浇灌方案(分别为图3A-C)下或在两种不同的水胁迫方案(分别WLI-1和WLI-2；图3D-F)下，在市售温室中生长的TOM-ABST36(黑色条形柱)与对照(白色条形柱)植物的经济果实总产量、植物生物量和收获指数。与在标准浇灌条件(0mM NaCl和WLI-0)下生长的植物的产量表现进行了比较。结果是4件独立事件的平均值。*在P≤0.05下显著不同。

图3G-J是生长在不同条件下的转基因番茄植物或对照植物的照片。图3G-生长在定时浇灌条件下的TOM-ABST36植物；图3H-生长在定时浇灌条件下的对照植物；图3I-在整个生长季节期间在200mM NaCl浇灌方案下生长后的TOM-ABST36植物；图3J-在整个生长季节期间在200mM NaCl浇灌方案下生长后的对照植物。

本发明具体实施方案详述

在本发明的一些实施方案中，涉及新的水通道蛋白多核苷酸和多肽，更准确但并非唯一地讲是涉及使用同样的多核苷酸和多肽以提高植物的非生物胁迫耐受性、水分利用效率、肥料利用效率、生物量、生长势和/或产量的方法。

在详细解释至少一个本发明的实施方案前，要了解的是，本发明不一定局限于在下面说明书中给出或在实施例中列举的细节。本发明能够有其它实施方案或者能够以各种方式实施或进行。

在将本发明付诸实施时，本发明的发明人鉴定出新的水通道蛋白(AQP)多核苷酸和由其编码的多肽。

因此，如随后的实施例部分所示，本发明的发明人利用将数字表达分析法(digital expression analysis)与跨种比较基因组学相结合的生物信息学方法，并从单子叶和双子叶植物品种两者的1,195个相关EST文库中筛选出7.2x10⁶个表达序列标签(EST)。采用该方法，鉴定出1,114种不同的AQP基因，并且将其进一步分成11个亚组(表1)。进一步的分析显示，TIP2亚组的EST显著过多呈现在植物根部和暴露在非生物胁迫(ABS)的植物中，而且由TIP2亚组的多核苷酸(例如SEQID NO：1、2、19-22，表2)编码的多肽(例如SEQ ID NO：27-28、45-48，表2)有着共同的共有序列TLXFXFAGVGS(SEQ ID NO：2826)。以在根部的过量呈现、ABS条件和水分水平低的组织(例如种子和花粉)为基础，鉴定出水通道蛋白基因家族另外的多核苷酸(SEQ ID NO：3-18、23-26，表2)以及其同源物或直系同源物(orthologue)(多核苷酸的SEQID NO：53-1400、2844-3051，多肽的SEQ ID NO：1401-2746、3052-3259；表3)。而且，定量RT-PCR分析表明在盐胁迫下，代表性AQP基因(例如SEQ ID NO：5、6和7)的表达增加，与对盐胁迫敏感的植物(表5，随后实施例部分的实施例2)相比，这在具有耐盐性的植物中较高。正如在随后实施例部分的实施例3-4中进一步描述的一样，对代表性AQP多核苷酸进行克隆(表7、8和9)，产生过量表达所述克隆的转基因植物(实施例4)。研究表明这些植物对各种非生物胁迫例如渗透胁迫(表10-14；实施例5)和盐分胁迫(表30-45；实施例6)的耐受性提高，肥料利用效率(在氮限制条件下，表59-68，实施例7)提高，以及在正常条件下[表15-29(实施例5)、46-58(实施例6)]或非生物胁迫(实施例5-8)下的生长、生物量和产量提高。总之，这些结果表明本发明的AQP多核苷酸和多肽可用于提高植物的非生物胁迫耐受性、水分利用效率、肥料利用效率、生物量、生长势和/或产量。

应当注意的是，在胁迫下影响(例如提高)植物代谢、生长、繁殖和/或生活力的多肽或多核苷酸，还可在最优条件下影响植物生长、生物量、产量和/或生长势。

因此，按照本发明的一个方面，提供提高植物的非生物胁迫耐受性、水分利用效率、肥料利用效率、生长、生物量、产量和/或生长势的方法。所述方法通过在植物中表达编码包含由SEQ ID NO：2826所示氨基酸共有序列TLXFXFAGVGS的多肽的外源多核苷酸来实现，其中所述多肽的表达在正常或胁迫条件下提高植物的生物量/生长势和/或产量。

研究表明，多肽的活性在结构上与上述共有序列(SEQ ID NO：2826)的完整性有关。在本发明这一方面的一些实施方案中，所述活性是通常存在于液泡膜(vacuaolar membrane(tonoplast))和/或植物细胞质膜中的水分通道活性，并且能够跨膜转运水分和/或小的中性溶质，例如尿素、硝酸盐和二氧化碳(CO₂)。

本文使用的术语“非生物胁迫”是指对植物代谢、生长、繁殖和/或生活力的任何不利作用。因此，非生物胁迫可由亚适度环境生长条件引起，例如盐分、脱水、淹水、冷冻、低温或高温、重金属毒性、无氧生活、养分缺乏、大气污染或紫外幅射。在背景部分论述了非生物胁迫的含义。

本文使用的术语“非生物胁迫耐受性”是指植物忍受非生物胁迫而不会在代谢、生长、生产率和/或生活力方面遭受实质改变的能力。

本文所使用的术语“水分利用效率(WUE)”是指植物消耗的每单位水分所产生的有机物的水平，即植物干重与植物水分利用之比，例如每单位蒸腾所产生的生物量。

本文所使用的术语“肥料利用效率”是指从土壤中吸收的一种或多种无机物和有机部分的摄取、传送、吸收、蓄积、再定位(植物内)和利用，例如氮、磷酸盐和/或钾。

本文所使用的术语“植物生物量”是指生长季节内由植物产生的组织量(测量单位为风干组织的克数)，这还可决定或影响植物产量或每生长面积的产量。

本文所使用的术语“植物产量”是指每株植物或每个生长季节所产生的组织的量(用重量/尺寸测定)或数量(数目)。因此产量的提高可以影响人们能够从某一生长面积和/或生长期的植物中所获取的经济利益。

本文所使用的术语“植物生长势”是指在指定时间由植物产生的组织的量(用重量测量)。因此生长势的提高可以决定或影响植物产量或每生长期或每生长面积的产量。

本文所使用的术语“提高/增长”是指与天然植物[即没有用本发明的生物分子(多核苷酸或多肽)修饰的植物，例如生长在相同生长条件下同一品种的非转化植物)]相比，植物非生物胁迫耐受性、水分利用效率、肥料利用效率、生长、生物量、产量和/或生长势提高至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％。

本文所使用的术语“外源多核苷酸”是指可以不是植物内天然表达的异源核酸序列，或者其在植物中的过量表达是需要的异源核酸序列。可以稳定或瞬时方式将外源多核苷酸序列导入植物中，以便产生核糖核酸(RNA)分子和/或多肽分子。应当注意的是，外源多核苷酸可包含与植物内源核酸序列相同或部分同源的核酸序列。

按照本发明的一些实施方案，本发明的外源多核苷酸编码具有与选自SEQ ID NO：27-28、45-48、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561、2449-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2484和2765的氨基酸序列有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多比如100％同源性的氨基酸序列的多肽。

同源性(例如百分比同源性)可以采用任何同源性比较软件确定，包括例如当自多肽序列开始时，通过使用默认参数的例如国立生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)的BlastP或TBLASTN软件；或者例如通过使用默认参数的tBLASTX算法(可通过NCBI获取)，这可对核苷酸查询序列(两条链)的6读框概念翻译产物(six-frame conceptual translation product)与蛋白质序列数据库进行比较。

同源序列包括直系同源序列和旁系同源序列两者。术语“旁系同源(paralogous)”是指某一品种基因组内产生旁系同源基因的基因复制。术语“直系同源(orthologous)”是指不同生物由于祖先关系所引起的同源基因。

在单子叶植物品种中鉴定直系同源物的一种备选方法是进行交互比对检索(blast)搜索。这可通过第一次比对检索进行，包括使目标序列针对任何序列数据库进行比对检索，例如公众可获取的NCBI数据库，可参见：超文本传输协议(Hypertext TransferProtocol)://www.ncbi.nlm.nih.gov。如果查到水稻的直系同源物，可将目标序列针对例如可获自NCBI的日本晴水稻(Oryza sativaNipponbare)的28,469个全长cDNA克隆进行比对检索。可对比对检索结果进行过滤。然后，使过滤结果或未过滤结果两者的全长序列反过来与目标序列得自其中的生物的序列进行比对检索(第二次比对检索)。然后比较第一次和第二次比对检索的结果。当在第一次比对检索中产生最高得分(最佳命中)的序列在第二次比对检索中鉴定查询序列(原始目标序列)为最佳命中时，便鉴定出直系同源物。利用相同原理找出旁系同源物(paralogue)(同一生物中基因的同源物)。在大序列家族的情况下，可以运用ClustalW程序[超文本传输协议://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html]，接着运用有助于目测观察聚簇(clustering)的邻接系统树(neighbor-joining tree)(超文本传输协议://en.wikipedia.org/wiki/Neighbor-joining)。

按照本发明的一些实施方案，外源多核苷酸编码由如SEQ ID NO：27-28、45-48、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561、2449-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2484或2765中所示的氨基酸序列组成的多肽。

按照本发明的一些实施方案，外源多核苷酸包含与选自SEQ IDNO：1、2、19、20-22、53-55、57-87、89-141、143-147、149-195、197-206、208-212、214、1102-1103、1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、2751-2752和2748-2750的核酸序列有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、例如100％同一性的核酸序列。

同一性(例如百分比同源性)可运用任何同源性比较软件确定，包括例如通过使用默认参数的例如国立生物技术信息中心(NCBI)的比对BlastN软件。

按照本发明的一些实施方案，外源多核苷酸如SEQ ID NO：1、2、19、20-22、53-55、57-87、89-141、143-147、149-195、197-206、208-212、214、1102-1103、1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、2751-2752、2748-2749或2750所示。

尽管如此，另外的AQP多核苷酸和由其编码的多肽也包括在本发明的教导中。

按照本发明的一些实施方案，外源多核苷酸编码具有与SEQ IDNO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065、3067-3258或3259有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％例如100％同源性的氨基酸序列的多肽。

按照本发明的一些实施方案，外源多核苷酸编码由如SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065、3067-3258或3259所示的氨基酸序列组成的多肽。

在示例性实施方案中，外源多核苷酸不编码具有选自SEQ ID NO：1828、1867、1404、1436、1495、1543、1554、1560、2451、2452、2459、2464、2482、2484和3066的氨基酸序列的多肽。

按照本发明的一些实施方案，外源多核苷酸与SEQ ID NO：7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857、2859-3050或3051有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％例如100％同一性。

按照本发明的一些实施方案，多核苷酸如SEQ ID NO：7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857、2859-3050或3051所示。

在一个示例性实施方案，外源多核苷酸不是如SEQ ID NO：481、520、56、88、148、196、207、213、1104、1105、1112、1117、1135、1137或2858所示的多核苷酸。

本文所使用的术语“多核苷酸”是指分离的单链或双链核酸序列，并且以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(composite polynucleotide sequence)(例如上述的组合)的形式提供。

本文所使用的术语“互补多核苷酸序列”是指利用反转录酶或任何其它RNA依赖性DNA聚合酶使信使RNA反转录的序列。这类序列随后可以利用DNA依赖性DNA聚合酶在体内或体外扩增。

本文所使用的术语“基因组多核苷酸序列”是指从染色体得到(分离)的序列，因此它代表着染色体的连续部分。

本文所使用的术语“复合多核苷酸序列”是指至少部分是互补且至少部分是基因组的序列。复合序列可包括一些需要编码本发明多肽的外显子序列以及一些介于外显子序列之间的内含子序列。内含子序列可以是任何来源，包括其它基因的内含子序列，通常可包括保守剪接信号序列。这类内含子序列另可包括顺式作用表达调节元件。

按照本发明的一些实施方案，本发明的多核苷酸包含长度不超过5000个的核酸。按照本发明的一些实施方案，本发明的多核苷酸包含长度不超过4000个的核酸，例如不超过3000个核酸，例如不超过2500个核酸。

可使编码本发明多肽的核酸序列最优化以进行表达。SEQ ID NO：2751中提供了最优化的核酸序列的非限制性实例，该序列编码包含SEQ ID NO：27所示氨基酸序列的最优化多肽。这类序列修饰的实例包括但不限于改变G/C含量以更紧密地接近通常存在于目标植物品种的含量，并且剔除非典型存在于植物品种的密码子，通常亦称密码子优化。

术语“密码子优化”是指选择合适的DNA核苷酸用于接近目标植物内密码子用法的结构基因或其片段内。因此，最适基因或核酸序列是指这样的基因，其中天然基因或天然存在的基因的核苷酸序列已经修饰以便利用植物内在统计上优选或统计上有利的密码子。通常在DNA水平上研究核苷酸序列，可以采用任何合适的方法确定优化用于在植物品种中表达的编码区，例如参见Sardana等(1996，Plant CellReports 15：677-681)。在该方法中，密码子用法的标准差、密码子用法偏倚的量度，可以通过首先得出天然基因的各个密码子使用率的平方比例偏差(squared proportional deviation)与高表达的植物基因相比较，接着计算均方差来计算。所用方程式为：1SDCU＝n＝1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N，其中Xn是指在高表达的植物基因中密码子n的使用频率，其中Yn是指目标基因中密码子n的使用频率，N是指目标基因中密码子的总数。利用Murray等(1989，Nuc Acids Res.17：477-498)的数据编制双子叶植物的高表达基因的密码子用法表。

按照特定植物细胞类型的优选的密码子用法使核酸序列最优化的一种方法是基于直接利用密码子优化表，而无需进行任何额外的统计学计算，密码子优化表例如通过日本NIAS(国立农业生物科学研究院(National Institute of Agrobiological Sciences))DNA库(超文本传输协议://www.kazusa.or.jp/codon/)的密码子用法数据库在线提供的密码子优化表。密码子用法数据库含有多种不同品种的密码子用法表，其中每个密码子用法表根据Genbank中提供的数据以统计方法确定。

通过使用上述密码子用法表确定特定品种(例如水稻)中每个氨基酸最优选或最有利的密码子，可对编码目标蛋白质的天然存在的核苷酸序列进行密码子优化以用于该特定植物品种。对于氨基酸，通过用在统计学上较有利的相应密码子置换特定品种基因组中可能具有低统计发生率的密码子来实现这一点。然而，可以选出一个或多个较不利的密码子以剔除存在的限制位点，并在可能有用的连接点(5′端和3′端添加信号肽或终止盒，可用来同时切割和剪接区段产生正确的全长序列的内部位点)上产生新的限制位点，或者去掉可能负面影响mRNA稳定性或表达的核苷酸序列。

事先进行任何修饰的天然存在的编码核苷酸序列可能已含有相当于特定植物品种中在统计上有利的密码子的多个密码子。因此，天然核苷酸序列的密码子优化可包括确定天然核苷酸序列内的哪一个密码子对于特定植物不是统计上有利的，并且按照特定植物的密码子用法表对这些密码子进行修饰，产生密码子最优化的衍生物。假若由修饰核苷酸序列编码的蛋白质以高于由相应的天然存在的基因或天然基因编码的蛋白质的水平产生，则用于植物密码子用法的修饰核苷酸序列可以是完全优化或部分优化的。通过改变密码子用法进行合成基因的构建可参见例如PCT专利申请93/07278。

因此，本发明包括在上文中描述的核酸序列、其片段、与之杂交的序列、与之同源的序列、编码具有不同密码子用法的相似多肽的序列、特征在于突变的经改变的序列，所述突变例如一个或多个天然存在的核苷酸或者人造核苷酸随机或定向方式产生的缺失、插入或取代。

如上所述，本发明的发明人揭示了之前未表征的多肽，该多肽都共有如SEQ ID NO：2826所示的氨基酸共有序列。

因此，本发明提供具有与选自SEQ ID NO：27-28、45-48、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561、2449-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2484和2765的氨基酸序列有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多比如100％同源性的氨基酸序列的分离多肽。

按照本发明的一些实施方案，本发明提供具有与选自SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065和3067-3259的氨基酸序列有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多比如100％同源性的氨基酸序列的分离多肽。

按照本发明的一些实施方案，所述多肽如SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065、3067-3258或3259中所示。

在一个示例性实施方案中，所述多肽不是由SEQ ID NO：1828、1867、1404、1436、1495、1543、1554、1560、2451、2452、2459、2464、2482、2484或3066所示的多肽。

本发明还包括上述多肽的片段和具有突变的多肽，所述突变例如一个或多个天然存在的氨基酸或人造氨基酸随机或以定向方式产生的缺失、插入或取代。

本文使用的术语“植物”包括整株植物；植物的祖先和子代及植物组成部分，包括种子、苗、茎、根(包括块茎)；以及植物细胞、组织和器官。植物可以是任何形式，包括悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、配子体、孢子体、花粉和小孢子。特别用于本发明方法的植物包括属于绿色植物(Viridiplantae)总科的全部植物，特别是选自以下的单子叶植物和双子叶植物，包括豆科饲料或豆科牧草、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木：金合欢(Acacia spp.)、槭木(Acer spp.)、猕猴桃(Actinidia spp.)、七叶树(Aesculus spp.)、澳大利亚贝壳杉(Agathisaustralis)、Albizia amara、Alsophila tricolor、须芒草(Andropogon spp.)、花生(Arachis spp)、槟榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、鹰嘴紫云英(Astragalus cicer)、多小叶红苏木(Baikiaea plurijuga)、桦木(Betula spp.)、芸苔(Brassica spp.)、木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、伯克苏木(Burkeaafricana)、甄叔迦树(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱樱花(Calliandraspp)、普洱茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒(Capsicumspp.)、决明(Cassia spp.)、Centroema pubescens、Chacoomeles spp.、肉桂(Cinnamomum cassia)、小粒咖啡(Coffea arabica)、Colophospermummopane、Coronillia varia、Cotoneaster serotina、山楂(Crataegus spp.)、黄瓜(Cucumis spp.)、柏木(Cupressus spp.)、银蕨(Cyathea dealbata)、榅桲(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata、榅桲(Cydonia oblonga)、Dalbergiamonetaria、Davallia divahcata、山蚂蟥(Desmodium spp.)、粗糙蚌壳蕨(Dicksonia squarosa)、Dibeteropogon amplectens、Dioclea spp、镰扁豆(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidalis、Ehraffiaspp.、穇子(Eleusine coracana)、画眉草(Eragrestis spp.)、刺桐(Erythrinaspp.)、桉树(Eucalypfus spp.)、Euclea schimperi、Eulalia vi/losa、荞麦(Pagopyrum spp.)、南美稔(Feijoa sellowlana)、草莓(Fragaria spp.)、千斤拔(Flemingia spp)、Freycinetia banksli、Geranium thunbergii、银杏(GinAgo biloba)、爪哇大豆(Glycine javanica)、毒鼠豆(Gliricidia spp)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银桦(Grevillea spp.)、Guibourtiacoleosperma、岩黄耆(Hedysarum spp.)、Hemaffhia altissima、Heteropogon contoffus、大麦(Hordeum vulgare)、Hyparrhenia rufa、小连翘(Hypericum erectum)、Hypeffhelia dissolute、Indigo incamata、鸢尾(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子(Lespediza spp.)、莴苣(Lettuca spp.)、银合欢(Leucaena leucocephala)、Loudetia simplex、Lotonus bainesli、百脉根(Lotus spp.)、Macrotyloma axillare、海棠(Malusspp.)、花叶木薯(Manihot esculenta)、紫花苜蓿(Medicago saliva)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、芭蕉(Musa sapientum)、烟草(Nicotianum spp.)、驴豆(Onobrychis spp.)、鸡足豆(Ornithopus spp.)、水稻(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草(Pennisetum spp.)、鳄梨(Persea gratissima)、矮牵牛(Petunia spp.)、菜豆(Phaseolus spp.)、加拿利海枣(Phoenix canariensis)、Phormium cookianum、石楠(Photiniaspp.)、Picea glauca、松树(Pinus spp.)、豌豆(Pisum sativam)、新西兰罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonaffhria squarrosa、杨树(Populus spp.)、Prosopis cineraria、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、矮生西洋梨(Pyrus communis)、栎树(Quercusspp.)、厚叶石斑木(Rhaphiolepsis umbellata)、Rhopalostylis sapida、Rhusnatalensis、欧洲醋栗(Ribes grossularia)、醋栗(Ribes spp.)、刺槐(Robiniapseudoacacia)、蔷薇(Rosa spp.)、悬钩子(Rubus spp.)、柳树(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、Sciadopitys vefficillata、北美红杉(Sequoiasempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、高粱(Sorghumbicolor)、菠菜(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburusalopecuroides、矮柱花草(Stylosanthos humilis)、葫芦茶(Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium distichum)、黄背草(Themeda triandra)、三叶草(Trifolium spp.)、小麦(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophylla)、越桔(Vaccinium spp.)、蚕豆(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、Watsoniapyramidata、马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、玉米(Zea mays)、苋菜、洋蓟、芦笋、青花椰菜、孢子甘蓝、甘蓝、油菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝、亚麻、散叶甘蓝、兵豆、油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、水稻、大豆、稻草、糖甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、squash tea、玉米、小麦、大麦(barely)、黑麦、燕麦、花生、豌豆、兵豆和苜蓿、棉花、油菜籽、油菜、辣椒、向日葵、烟草、茄子、桉树、乔木、观赏植物、多年生牧草和饲料作物。或者水藻和其它非植物也可用于本发明的方法。

按照本发明的一些实施方案，本发明的方法所使用的植物是农作物，例如水稻、玉米、小麦、大麦、花生、马铃薯、芝麻、橄榄树、棕榈油、香蕉、大豆、向日葵、油菜(canola)、甘蔗、苜蓿、小米、豆科植物(菜豆、豌豆)、亚麻、羽扇豆、油菜籽、烟草、杨树和棉花。

植物中表达本发明的外源多核苷酸可如下进行：用外源多核苷酸转化植物的一个或多个细胞，接着从转化细胞产生成熟植物，并在适于成熟植物表达外源多核苷酸的条件下培养成熟植物。

按照本发明的一些实施方案，转化通过将包括本发明一些实施方案的外源多核苷酸和至少一个能够指导外源多核苷酸在植物细胞中转录的启动子的核酸构建体导入植物细胞来实现。合适的转化方法的更多详情见下文。

本文使用的术语“启动子”是指位于基因的转录起始位点上游的DNA区，RNA聚合酶与之结合启动RNA转录。启动子控制基因在何处(例如植物的哪一个部分)和/或何时(例如在生物生命中的哪一个阶段或情况下)进行表达。

本发明的核酸构建体可以使用任何合适的启动子序列。优选启动子是组成型启动子、组织特异性启动子或非生物胁迫诱导型启动子。

合适的组成型启动子包括例如CaMV 35S启动子(SEQ ID NO：2825；Odell等，Nature 313：810-812，1985)；拟南芥At6669启动子(SEQID NO：2823；参见PCT公布号WO04081173A2)；玉米Ubi 1(Christensen等，Plant Sol.Biol.18：675-689，1992)；水稻肌动蛋白(McElroy等，Plant Cell 2：163-171，1990)；pEMU(Last等，Theor.Appl.Genet.81：581-588，1991)；CaMV 19S(Nilsson等，Physiol.Plant100：456-462，1997)；GOS2(de Pater等，Plant J Nov；2(6)：837-44，1992)；泛蛋白(Christensen等，Plant Mol.Biol.18：675-689，1992)；水稻亲环蛋白(Bucholz等，Plant Mol Biol.25(5)：837-43，1994)；玉米H3组蛋白(Lepetit等，Mol.Gen.Genet.231：276-285，1992)；肌动蛋白2(An等，Plant J.10(1)；107-121，1996)和合成的Super MAS(Ni等，The PlantJournal 7：661-76，1995)。其它组成型启动子包括美国专利第5,659,026、5,608,149、5.608,144、5,604,121、5.569,597、5.466,785、5,399,680、5,268,463和5,608,142号中的启动子。

合适的组织特异性启动子包括但不限于叶特异性启动子[例如参见例如Yamamoto等，Plant J.12：255-265，1997；Kwon等，Plant Physiol.105：357-67，1994；Yamamoto等，Plant Cell Physiol.35：773-778，1994；Gotor等，Plant J.3：509-18，1993；Orozco等，Plant Mol.Biol.23：1129-1138，1993；以及Matsuoka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：9586-9590，1993]；种子优选的启动子[例如得自种子特异性基因(Simon等，Plant Mol.Biol.5.191，1985；Scofield等，J.Biol.Chem.262：12202，1987；Baszczynski等，Plant Mol.Biol.14：633，1990)；巴西坚果白蛋白(Pearson’等，Plant Mol.Biol.18：235-245，1992)；豆球蛋白(Ellis等，Plant Mol.Biol.10：203-214，1988)；谷蛋白(水稻)(Takaiwa等，Mol.Gen.Genet.208：15-22，1986；Takaiwa等，FEBS Letts.221：43-47，1987)；玉米醇溶蛋白(Matzke等，Plant Mol Biol，143).323-321990)；napA(Stalberg等，Planta 199：515-519，1996)；小麦SPA(Albanietal，Plant Cell，9：171-184，1997)；向日葵油质蛋白(Cummins等，Plant Mol.Biol.19：873-876，1992)]；胚乳特异性启动子[例如小麦LMW和HMW、麦谷蛋白-1(Mol Gen Genet 216：81-90，1989；NAR 17：461-2)；小麦a、b和g麦醇溶蛋白(EMBO3：1409-15，1984)；大麦ltrl启动子、大麦B1、C、D大麦醇溶蛋白(Theor Appl Gen 98：1253-62，1999；Plant J 4：343-55，1993；Mol Gen Genet 250：750-60，1996)；大麦DOF(Mena等，The PlantJournal，116(1)：53-62，1998)；Biz2(EP99106056.7)；合成启动子(Vicente-Carbajosa等，Plant J.13：629-640，1998)；水稻谷醇溶蛋白NRP33、水稻球蛋白Glb-1(Wu等，Plant Cell Physiology 39(8)885-889，1998)；水稻α-球蛋白REB/OHP-1(Nakase等，Plant Mol.Biol.33：513-S22，1997)；水稻ADP-葡萄糖PP(Trans Res 6：157-68，1997)；玉米ESR基因家族(Plant J12：235-46，1997)；高粱(sorgum)γ-高粱醇溶蛋白(PMB 32：1029-35，1996)]；胚特异性启动子[例如水稻OSH1(Sato等，Proc.Nati.Acad.Sci.USA，93：8117-8122)；KNOX(Postma-Haarsma等，Plant Mol.Biol.39：257-71，1999)，水稻油质蛋白(Wu等，J.Biochem.，123：386，1998)]；以及花特异性启动子[例如AtPRP4、查耳酮(chalene)合酶(chsA)(Van der Meer等，Plant Mol.Biol.15，95-109，1990)；LAT52(Twell等，Mol.Gen Genet.217：240-245；1989)、apetala-3]。

合适的非生物胁迫诱导型启动子包括但不限于盐诱导启动子，例如RD29A(Yamaguchi-Shinozalei等，Mol.Gen.Genet.236：331-340，1993)；干旱诱导性启动子例如玉米rab17基因启动子(Pla等，Plant Mol.Biol.21：259-266，1993)、玉米rab28基因启动子(Busk等，Plant J.11：1285-1295，1997)和玉米Ivr2基因启动子(Pelleschi等，Plant Mol.Biol.39：373-380，1999)；热诱导性启动子例如得自番茄的番茄热hsp80启动子(美国专利第5,187,267号)。

本发明一些实施方案的核酸构建体可另包括合适的选择标记和/或复制起点。按照本发明的一些实施方案，所使用的核酸构建体是穿梭载体，该载体既可在大肠杆菌(E.coli)(其中构建体包含合适的选择标记和复制起点)增殖，而且又可与在细胞中的增殖相容。本发明的构建体可为例如质粒、杆粒(bacmid)、噬菌粒、黏粒、噬菌体、病毒或人工染色体。

可利用本发明一些实施方案的核酸构建体来稳定或瞬时转化植物细胞。在稳定转化中，将外源多核苷酸整合到植物基因组中，因此它代表稳定的遗传性状。在瞬时转化中，外源多核苷酸由转化的细胞进行表达，但是不整合到基因组中，因此它代表瞬时性状。

有各种方法将外源基因导入单子叶植物和双子叶植物(Potrykus，I.，Annu.Rev.Plant.Physiol.，Plant.Mol.Biol.(1991)42：205-225；Shimamoto等，Nature(1989)338：274-276)。

使外源DNA稳定整合入植物基因组DNA的主要方法包括两种主要方法：

(i)土壤杆菌介导的基因转移：Klee等(1987)Annu.Rev.PlantPhysiol.38：467-486；Klee和Rogers，载于Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants，第6卷，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes，主编Schell，J.和Vasil，L.K.，Academic Publishers，San Diego，Calif.(1989)，第2-25页；Gatenby，载于Plant Biotechnology，主编Kung，S.和Arntzen，C.J.，Butterworth Publishers，Boston，Mass.(1989)，第93-112页。

(ii)直接DNA摄取：Paszkowski等，载于Cell Culture and SomaticCell Genetics of Plants，第6卷；Molecular Biology of Plant NuclearGenes，主编Schell，J.和Vasil，L.K.，Academic Publishers，San Diego，Calif.(1989)，第52-68页；包括将DNA直接摄入原生质体的方法，Toriyama，K.等(1988)Bio/Technology 6：1072-1074。通过对植物细胞进行短暂电击诱导DNA摄取：Zhang等，Plant Cell Rep.(1988)7：379-384。Fromm等，Nature(1986)319：791-793。通过粒子轰击将DNA注入植物细胞或组织，Klein等，Bio/Technology(1988)6：559-563；McCabe等，Bio/Technology(1988)6：923-926；Sanford，Physiol.Plant，(1990)79：206-209；通过使用微量移液系统：Neuhaus等，Theor.Appl.Genet.(1987)75：30-36；Neuhaus和Spangenberg，Physiol.Plant.(1990)79：213-217；细胞培养物、胚或愈伤组织的玻璃纤维或碳化硅晶须转化，美国专利第5,464,765号；或者通过使DNA与萌发的花粉直接孵育，DeWet等，载于Experimental Manipulation of Ovule Tissue，主编Chapman，G.P.，Mantell，S.H.和Daniels，W.Longman，London，(1985)第197-209页；以及Ohta，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83：715-719。

土壤杆菌系统包括使用含有整合到植物基因组DNA的规定DNA区段的质粒载体。植物组织的接种方法随植物品种和土壤杆菌递送系统而变化。一种广泛使用的方法是叶盘法，该法可用提供用于引发整株植物分化的良好来源的任何组织外植体进行。参见例如Horsch等，载于Plant Molecular Biology Manual A5，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht(1988)，第1-9页。一种补充方法应用土壤杆菌递送系统与真空过滤结合。土壤杆菌系统在转基因双子叶植物创建中尤为可行。

存在将直接DNA转移至植物细胞的各种方法。在电穿孔中，将原生质体短暂暴露于强电场。在显微注射中，用非常小的微量移液管以机械的方式将DNA直接注入细胞。在微粒轰击中，使DNA吸附在硫酸镁晶体或钨粒子等微轰击粒子上，并且使微轰击粒子进行物理加速进入细胞或植物组织中。

接着进行稳定转化植物繁殖。植物繁殖最常见的方法是通过种子。然而，通过种子繁殖的再生在作物中因缺乏一致性所引起的杂合性而存在缺陷，因为种子是根据由孟德尔定律控制的遗传变异由植物产生的。每粒种子基本上在遗传上都不相同，各自将以其自身的特定性状生长。因此，优选产生这样的转化植物，使得再生植物具有与亲本转基因植物相同的性状和特征。因此，优选通过提供转化植物快速且一致繁殖的微繁殖(micropropagation)使转化植物再生。

微繁殖是从选定的亲本植物或栽培品种中切取一块组织生长出新一代植物的过程。该过程允许具有表达融合蛋白的优选组织的植物进行大量繁殖。所产生的新一代植物在遗传上与原始植物相同，并且具有原始植物的全部特征。微繁殖可供在短时间内大量生产优质的植物材料，并在保存原始转基因植物或转化植物的特征方面提供快速倍增的精选栽培品种。克隆植物的优势是植物倍增的速度和所产生植物的品质和一致性。

微繁殖是在各阶段之间需要更换培养基或生长条件的多阶段过程。因此，微繁殖过程包括4个基本阶段：第一阶段，起始组织培养；第二阶段，组织培养物倍增；第三阶段，分化和植物形成；第四阶段，温室栽培和锻炼。在第一阶段，即起始组织培养，确立组织培养物并确定不含污染物。在第二阶段，使起始组织培养物倍增直到产生足够数量的组织样品以达到生产目标。在第三阶段，使在第二阶段生长的组织样品分化，并生长成为独立幼苗。在第四阶段，将转化幼苗转移到温室中进行锻炼，在温室中逐步提高植物耐光性，使之可在自然环境下生长。

按照本发明的一些实施方案，转基因植物通过叶细胞、分生组织细胞或整株植物的瞬时转化产生。

可以通过上述直接DNA转移的任何方法或使用修饰的植物病毒通过病毒感染进行瞬时转化。

研究表明可用于植物宿主转化的病毒包括CaMV、烟草花叶病毒(TMV)、雀麦花叶病毒(BMV)和菜豆普通花叶病毒(BV或BCMV)。使用植物病毒的植物转化参见美国专利第4,855,237号(菜豆金色花叶病毒；BGV)、EP-A 67，553(TMV)、日本公布申请号63-14693(TMV)、EPA 194，809(BV)、EPA 278，667(BV)；以及Gluzman，Y.等，Communications in Molecular Biology：Viral Vectors，Cold SpringHarbor Laboratory，New York，第172-189页(1988)。在许多宿主(包括植物)中用于表达外源DNA的假病毒颗粒参见WO 87/06261。

按照本发明的一些实施方案，用于瞬时转化的病毒是无毒力的，因此不能引起严重症状，例如生长率降低、花叶病、环斑病、卷叶病、变黄、起条纹、痘形成、瘤形成和锈斑。合适的无毒病毒可以是天然存在的无毒病毒或人工减毒病毒。病毒减毒可通过用本领域众所周知的方法进行，包括但不限于亚致死加热、化学处理或通过定向诱变技术，例如参见诸如Kurihara和Watanabe(Molecular Plant Pathology4：259-269，2003)、Gal-on等(1992)、Atreya等(1992)和Huet等(1994)。

合适的病毒毒株可从有效来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type culture Collection，ATCC)或通过从受感染植物中分离出来。可通过本领域众所周知的技术从受感染植物组织中分离病毒，例如参见诸如Foster和Tatlor主编，“Plant Virology Protocols：FromVirus Isolation to Transgenic Resistance(植物病毒学方案：从病毒分离到转基因抗性)(Methods in Molecular Biology(Humana Pr))”，HumanaPress，1998。简单地说，将据信含有高浓度的适当病毒的受感染植物的组织(优选嫩叶和花瓣)在缓冲溶液(例如磷酸缓冲溶液)中研磨以产生可用于随后接种的病毒感染液。

用于在植物中导入和表达非病毒外源多核苷酸序列的植物RNA病毒的构建可参见上述参考文献以及Dawson，W.O.等，Virology(1989)172：285-292；Takamatsu等，EMBO J.(1987)6：307-311；French等，Science(1986)231：1294-1297；Takamatsu等，FEBS Letters(1990)269：73-76；以及美国专利第5,316,931号。

当病毒是DNA病毒时，可对病毒本身进行适当修饰。或者，可先将病毒克隆至细菌质粒中以易于构建所需要的具有外源DNA的病毒载体。然后可从质粒中切取病毒。如果该病毒是DNA病毒，则可将细菌复制起点与此病毒DNA连接，然后通过细菌复制。该DNA的转录和翻译将产生将用来包裹病毒DNA的外壳蛋白。如果该病毒是RNA病毒，则一般将病毒作为cDNA克隆，并插入质粒。然后使用质粒进行全部的构建。然后通过质粒病毒序列的转录和病毒基因的翻译以产生包裹病毒RNA的外壳蛋白，来产生RNA病毒。

在一个实施方案中，提供植物病毒多核苷酸，其中从病毒多核苷酸中剔除天然外壳蛋白编码序列，通过重组植物病毒多核苷酸，插入能够在植物宿主中表达的非天然植物病毒外壳蛋白编码序列和非天然启动子，优选非天然外壳蛋白编码序列的亚基因组启动子，包装重组植物病毒多核苷酸，并确保宿主系统性感染。或者，可通过在外壳蛋白基因中插入非天然多核苷酸序列使外壳蛋白基因失活，使得产生蛋白质。重组植物病毒多核苷酸可含有一个或多个另外的非天然亚基因组启动子。每个非天然的亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达邻接基因或多核苷酸序列，并且不能彼此重组以及与天然亚基因组启动子重组。如果包括不止一个多核苷酸序列，则可将非天然(外源)多核苷酸序列插入天然植物病毒亚基因组启动子或天然和非天然植物病毒亚基因组启动子附近。在产生所需产物的亚基因组启动子的控制下，非天然多核苷酸序列在宿主植物中转录或表达。

在第二个实施方案中，提供与第一个实施方案一样的重组植物病毒多核苷酸，只是将天然外壳蛋白编码序列置于非天然外壳蛋白亚基因组启动子之一的邻接位置而不是非天然外壳蛋白编码序列的邻接位置。

在第三个实施方案中，提供重组植物病毒多核苷酸，其中天然外壳蛋白基因邻接其亚基因组启动子，一个或多个非天然亚基因组启动子被插入病毒多核苷酸。插入的非天然亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达邻接基因，并且不能彼此重组以及与天然亚基因组启动子重组。可将非天然多核苷酸序列邻接插入非天然亚基因组植物病毒启动子，使得该序列在产生所需产物的亚基因组启动子控制下在宿主植物中转录或表达。

在第四个实施方案中，提供与第三个实施方案一样的重组植物病毒多核苷酸，只是天然外壳蛋白编码序列被非天然外壳蛋白编码序列置换。

病毒载体用由重组植物病毒多核苷酸编码的外壳蛋白包裹，以产生重组植物病毒。使用重组植物病毒多核苷酸或重组植物病毒感染合适的宿主植物。重组植物病毒多核苷酸能够在宿主中复制，在宿主中系统性扩散，并且在宿主中转录或表达外源基因(外源多核苷酸)以产生所需要的蛋白质。

用于将病毒接种到植物中的技术可参见Foster和Taylor主编，“Plant Virology Protocols：From Virus Isolation to Transgenic Resistance(植物病毒学方案：从病毒分离到转基因抗性)(Methods in MolecularBiology(Humana Pr)，第81卷)”，Humana Press，1998；Maramorosh和Koprowski主编，“Methods in Virology”，第7卷，Academic Press，NewYork 1967-1984；Hill，S.A.“Methods in Plant Virology”，Blackwell，Oxford，1984；Walkey，D.G.A.“Applied Plant Virology”，Wiley，NewYork，1985；以及Kado和Agrawa，主编，“Principles and Techniques inPlant Virology”，Van Nostrand-Reinhold，New York。

除上述方法外，还可将本发明的多核苷酸导入叶绿体基因组从而能够进行叶绿体表达。

用于将外源多核苷酸序列导入叶绿体基因组的技术是已知的。该技术包括下列步骤。首先，用化学方式处理植物细胞，以便使每个细胞的叶绿体数目减少至大约一个。其次，通过粒子轰击将外源多核苷酸导入细胞，其目的在于将至少一个外源多核苷酸分子导入叶绿体中。选择外源多核苷酸，使之容易通过叶绿体固有的酶实现同源重组而整合到叶绿体基因组中。为此，除目标基因以外，外源多核苷酸还包括至少一个从叶绿体基因组得到的多核苷酸序列段。另外，外源多核苷酸还包括选择标记，这用于顺序选择方法以确保在这类选择后叶绿体基因组的全部拷贝或基本上全部拷贝都将包括该外源多核苷酸。有关该技术的更多详情可参见美国专利第4,945,050和5,693,507号，所述专利通过引用结合到本文中。因此，多肽可通过叶绿体的蛋白质表达系统产生，并可整合到叶绿体内膜上。

由于在植物中非生物胁迫耐受性、水分利用效率、肥料利用效率、生长、生物量、产量和/或生长势可涉及多个起累加作用或起增效作用的基因(参见例如Quesda等，Plant Physiol.130：951-063，2002)，因此本发明还设想在单一宿主植物中表达大量外源多核苷酸从而在非生物胁迫耐受性、水分利用效率、肥料利用效率、生长、生物量、产量和/或生长势方面获得较好作用。

在单一宿主植物中表达大量外源多核苷酸可通过将多个核酸构建体共导入单个植物细胞来实现，每个构建体包括不同的外源多核苷酸。然后可采用在上文中描述的方法，使转化细胞再生成为成熟植物。

或者，可通过将包括大量不同外源多核苷酸的单个核酸构建体共导入单个植物细胞来实现在单一宿主植物中表达大量的外源多核苷酸。这类构建体可设计成具有单一启动子序列，所述启动子序列可转录包括所有不同外源多核苷酸序列在内的多顺反子信使RNA。为了使由多顺反子信使RNA编码的不同多肽能够共翻译，可将多核苷酸序列通过促进位于IRES序列下游的多核苷酸序列翻译的内部核糖体进入位点(IRES)序列相互连接。在这种情况下，经转录的编码上述不同多肽的多顺反子RNA分子将从两个封端的5′末端和多顺反子RNA分子的两个内部IRES序列起开始翻译，因此在细胞中产生所有不同的多肽。或者，构建体可包括各与不同外源多核苷酸序列连接的若干启动子序列。

可采用在上文中描述的方法，使包括大量不同外源多核苷酸的构建体转化的植物细胞再生成为成熟植物。

或者，可以通过将不同核酸构建体(包括不同的外源多核苷酸)导入大量植物来实现在单一宿主植物中表达大量的外源多核苷酸。然后，可以采用常规植物育种技术，使再生的转化植物进行杂交，从所得到的子代中选出较好的非生物胁迫耐受性、水分利用效率、肥料利用效率、生长、生物量、产量和/或生长势性状。

因此，本发明包括外源性表达(如上所述)本发明的多核苷酸和/或多肽的植物。多肽在植物细胞或整株植物中一经表达，便可通过本领域众所周知的方法测定由外源多核苷酸编码的多肽水平，例如活性测定法，使用能够特异性结合多肽的抗体进行的蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、免疫组织化学法、免疫细胞化学法、免疫荧光法等。

植物中自外源多核苷酸转录的RNA水平的测定方法是本领域众所周知的，包括例如RNA印迹分析、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析(包括定量、半定量或实时RT-PCR)和RNA原位杂交。

如上所述，本发明一些实施方案的多肽起水分通道的作用。因此，本发明的一些实施方案包括该多肽的功能等同物(例如能够具有水分通道的生物活性的多肽)，这可通过使用例如细胞膨胀实验(cell-swelling assay)的功能测定法(例如能够在植物中运送水分)来测定(Meng，Q.X.等，2008.Cell Physiol Biochem，21.第123-128页)。

在上文中描述的多核苷酸和多肽可以安全和成本效益的方式用于多种经济植物中。

转基因(编码所述多肽的外源多核苷酸)对非生物胁迫耐受性、水分利用效率、肥料利用效率、生长、生物量、产量和/或生长势的作用可使用已知方法测定。

非生物胁迫耐受性--使转化(即表达转基因)和非转化(野生型)的植物暴露于非生物胁迫条件下，例如脱水、亚适温(低温、高温)、养分缺乏、养分过量、盐胁迫条件、渗透胁迫、重金属毒性、无氧生活、大气污染和紫外幅射。

耐盐性测定--预期具有高盐浓度耐受性的转基因植物在高盐情况下显示更好的萌发、幼苗活力或生长。可以多种方式实现盐胁迫，例如通过用高渗溶液浇灌植物，通过在高渗生长溶液(例如Hoagland溶液)中对植物进行溶液培养，或通过在高渗生长培养基[例如50％Murashige-Skoog培养基(MS培养基)]中培育植物。因为不同的植物在其耐盐性方面极为不同，可根据具体植物栽培品种或变种的具体特征，调节浇灌水、生长溶液或生长培养基中的盐浓度，以便使植物的生理和/或形态受到轻微或中等的作用(有关合适浓度的指引参见Bernstein和Kafkafi，Root Growth Under Salinity Stress(盐分胁迫下的根部生长)，载于：Plant Roots，The Hidden Half第3版，Waisel Y，EshelA和Kafkafi U.(主编)Marcel Dekker Inc.，New York，2002及其中的参考文献)。

例如，通过在不同的发育阶段，用浓度递增的氯化钠(例如50mM、100mM、200mM、400mM NaCl)浇灌植物，从底部及从上部浇灌以确保盐的均匀分布，来进行耐盐性试验。在暴露在胁迫条件下之后，不时监测植物直到在野生型植物中出现可观的生理作用和/或形态作用。因此，在对照植物和转基因植物之间，对外部表型外观、萎蔫程度及成功达到成熟期的总数和子代产量进行比较。所测量的耐受性的定量参数包括但不限于平均湿重和干重、所产生种子的重量、平均种子大小和每株植物所产生的种子数量。未显示实质生理作用和/或形态作用，或者显示生物量比野生型植物的高的转化植物被鉴定为非生物胁迫耐受性植物。

渗透压耐受性试验--进行渗透胁迫实验(包括氯化钠和甘露醇实验)以确定渗透胁迫表型是否是氯化钠特异性的或者是否是一般渗透胁迫相关性表型。耐受渗透胁迫的植物可能对干旱和/或冷冻具有更大的耐受性。对于盐和渗透胁迫萌发实验，培养基用例如50mM、100mM、200mM NaCl或100mM、200mM NaCl、400mM甘露醇补充。另参见随后实施例部分的实施例5。

干旱耐受性实验/渗压剂实验--进行耐旱性实验以鉴定在严重脱水后使植物较好地存活的基因。为了分析转基因植物是否较耐受干旱，在培养基中进行了通过非离子渗压剂山梨醇产生的渗透胁迫。使对照植物和转基因植物萌发，并在植物琼脂平板上生长4天，之后将其转移到含有500mM山梨醇的平板中。该处理引起生长迟缓，然后，通过测量植物重量(湿重和干重)、产量，并通过按开花时间测量的生长率，对对照植物和转基因植物两者进行了比较。

相反地，基于土壤的干旱筛选用过量表达上文中详述的多核苷酸的植物进行。使对照拟南芥植物的种子或过量表达本发明多肽的其它转基因植物萌发，并移栽到盆中。在浇灌停止并同时将盆放在吸水纸上以提高土壤干燥率来达到干旱胁迫。当大部分对照植物出现严重萎蔫时，对转基因植物和对照植物彼此间进行了比较。在获得相当一部分显示严重萎蔫的对照植物后，给植物再次浇水。按下列两个标准中每一个，将植物与对照进行比较分级：干旱条件的耐受性和再浇水后的复原状况(存活)。

冷胁迫耐受性--为了分析冷胁迫，将成熟(25天龄)植物转移到4℃、必要光照(constitutive light)的室内达1周或2周。之后，将植物移回到温室。2周后，通过测量植物重量(湿重和干重)，并通过比较以开花时间、植物大小、产量等测量的生长率，在对照植物和转基因植物之间对导致生长迟缓和其它表型的低温期冷害进行比较。

热胁迫耐受性--通过将植物暴露于34℃以上温度达一定时期，达到热胁迫耐受性。在将植物转移回到22℃以复原后，对植物耐受性进行分析，5天后，相对于内部对照(非转基因植物)或既未暴露于冷胁迫也未暴露于热胁迫的植物进行评价。

萌发试验--萌发试验对可完成萌发过程的转基因植物种子的百分比与以相同方式处理的对照植物种子的百分比进行比较。例如在每日22小时光照2小时避光周期下于22℃培育被视为正常条件。在种植后4天和14天之间，对萌发和幼苗活力进行评价。基础培养基为50％MS培养基(Murashige和Skoog，1962，Plant Physiology 15，473-497)。

同样在不利条件下，例如冷(在10℃以下的温度而不是22℃下培育)或含有高浓度渗压剂例如山梨醇(以50mM、100mM、200mM、300mM、500mM和高达1000mM的浓度)的种子抑制溶液或施加浓度递增的盐(50mM、100mM、200mM、300mM、500mM NaCl)，检查萌发。

水分利用效率--可以每单位蒸腾所产生的生物量来确定。为了分析WUE，可在对照植物和转基因植物中测量叶片相对含水量。及时记录鲜重(FW)；然后，在室温避光下，将叶片在浸泡在蒸馏水中8小时，记录吸胀重量(TW)。在60℃下将叶片干燥至恒重后，记录总干重(DW)。按照下列方程式I计算相对含水量(RWC)：

方程式I

(FW-DW/TW-DW)x100

肥料利用效率--为了分析转基因植物是否对肥料的反应更灵敏，使植物在具有有限量的肥料的琼脂平板或盆中生长，参见例如下文中的实施例6和Yanagisawa等(Proc Natl Acad Sci U S A.2004；101：7833-8)。对植物的整体大小、开花时间、产量、芽和/或谷物的蛋白质含量进行分析。检查的参数为成熟植物的整体大小、其湿重和干重、所产生的种子的重量、平均种子大小及每株植物所产生的种子的数目。可以测定的其它参数为：叶片的叶绿素含量(因为植物氮素状况与叶片青绿程度高度相关)、种子或其它植物组成部分(例如叶或苗)的氨基酸含量和总蛋白含量、油含量等。同样，可以递增的浓度加入磷酸盐或钾而不是提供有限量的氮。此外，测量了与上列参数一样的参数。同样，对氮素利用效率(NUE)、磷酸盐利用效率(PUE)和钾利用效率(KUE)进行评价，检查转基因植物在氮素抑制条件下健壮生长的能力。

氮素测定--测定植物的结构部分中的N(氮)浓度的方法包括将器官N转化成NO₃ ^-的过硫酸钾消化方法(Purcell和King 1996 Argon.J.88：111-113)；改进的Cd^-介导NO₃ ^-还原成NO₂ ^-(Vodovotz 1996Biotechniques 20：390-394)以及通过Griess试验测定亚硝酸盐(Vodovotz 1996，同上)。针对NaNO₂的标准曲线，在550nm下测定吸光度值。该方法的详情参见Samonte等，2006 Agron.J.98：168-176。

谷物蛋白质浓度--谷物蛋白质含量(谷物蛋白质g/m²)用谷物的N质量(谷物N g/m²)乘以N/蛋白质转换率k-5.13的乘积来估算(Mosse1990，同上)。谷物蛋白质浓度用每单位谷物质量的谷物蛋白质含量(谷物蛋白质g/kg谷物)来估算。

含油量--可通过从种子或植物的营养部分中提取油来测定植物的含油量。简单地说，在特定的溶剂(例如己烷或石油醚)存在下，可通过研磨植物组织，并且在连续提取器中抽提油，从而从植物(例如种子)中提取脂质(油)。间接含油量分析可采用各种已知方法进行，例如测量液体状态的样品中由氢原子吸收的共振能的核磁共振(NMR)光谱法[参见例如Conway TF.和Earle FR.，1963，Journal of the AmericanOil Chemists′Society；Springer Berlin/Heidelberg，ISSN：0003-021X(印刷)1558-9331(在线)]；利用样品吸收近红外能(1100-2500nm)的近红外(NI)光谱法；以及WO/2001/023884中所描述的方法，该方法以在溶剂中提取油为基础，在气体流中蒸发溶剂形成油颗粒，并把光照向气体流和油粒子，这就形成了可检测的反射光。

植物生长势可通过每段时间内生长参数的增加来计算，生长参数例如叶面积、纤维长度、莲座(rosette)直径、植物鲜重等。

可以应用生长植物的数字分析来测定生长率。例如，可以每3天拍摄温室中在试验区(plot)基础上生长的植物的照片，通过数字分析计算莲座面积。莲座面积生长(growth)用取样天数之间莲座面积的差异除以样品间天数的差异来计算。

可通过同时从8-16株植物上采集总的种子，使用分析天平称量，将总重量除以植物总数，来进行种子产量的测量。每生长面积的种子可以同样方式同时考虑给定某一单种植物的生长面积来计算。增加每生长面积的种子产量可通过增加每株植物的种子产量，和/或通过增加在指定面积上生长的植物数量来实现。

可将通过测量从8-16株植物产生和收获的干种子的量(重量或大小)或数量(即数目)除以植物数，来估算每株植物的种子产量。

可通过测量每段时间所产生的植物生物量、莲座面积、叶大小或根长来估算生长率(可按叶面积cm²/天进行测量)。

纤维长度可以使用纤维照影机测量。使用纤维照影机系统计算长度，用“上半部平均长度”表示。上半部平均长度(UHM)是纤维分布中较长一半的平均长度。纤维照影机测量规定百分点的跨度距离内的长度(超文本传输协议://www.cottoninc.com/ClassificationofCotton/？Pg＝4#Length)。

因此，本发明具有较高农业价值，用于促进所需经济作物的产量(例如营养器官(例如杨树木材)的生物量，或繁殖器官的生物量(例如种子数或种子生物量))。

本文所使用的术语“约”是指±10％。

术语“包含”、“含有”、“包括”、“包括”、“具有”及其变化形式是指“包括但不限于”。

术语“由......组成”是指“包括并限于”。

术语“基本由......组成”是指组合物、方法或结构可包括额外的成分、步骤和/或组成部分，但只有当额外成分、步骤和/或组成部分不实质性地改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新的特征才可以。

本文所使用的未给定数量词的单数形式包括复数形式，除非文中另有明确说明。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可包括大量化合物，包括其混合物。

在整个申请书中，本发明的各种实施方案以范围格式提供。应当了解的是，范围格式中的描述仅仅是出于方便和简明，不应解释为是对本发明范围的不可变更的限制。因此，范围的描述应视为特别公开的所有可能的子范围以及在该范围内的各个数值。例如诸如1-6范围的描述应视为特别公开的例如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等的子范围，以及该范围内的每个数，例如1、2、3、4、5和6。这不论范围宽度如何都适用。

每当本文表明数字范围时，是指包括所引用的指定范围内的任何数字(分数或整数)。术语“介于”第一规定数字和第二规定数字“之间”，以及“自”第一规定数字“至”第二规定数字的“范围”在本文可互换使用，是指包括第一规定数字和第二规定数字以及它们之间的所有分数和整数。

本文所使用的术语“方法”是指用于完成指定任务的方式、手段、技术和方法步骤，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学从业人员已知的或者易由所述从业人员从已知方式、手段、技术和方法步骤开发的方式、手段、技术和方法步骤。

要了解的是，为了清楚起见在单独的实施方案内容中描述的本发明的某些特征，也可结合起来在一个实施方案中提供。相反地，为了简明起见在一个实施方案中内容中描述的本发明的各种特征，也可以单独提供或以任何合适的再组合或以适于任何其它描述的本发明实施方案提供。各种实施方案内容中描述的某些特征不得视为是所述实施方案不可缺少的特征，除非无这些要素实施方案无法实施。

上文中描述的本发明的各种实施方案和方面，以及所附权利要求书部分所要求保护的内容的实验支持参见在下面的实施例。

实施例

下面列出下列实施例的参考文献，所述参考文献与上文中的说明书一起以非限制性方式对本发明的一些实施方案予以说明。

一般而言，本文所使用的术语和用于本发明的实验室方法包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。文献中对这类技术进行了全面的讲解。参见例如“Molecular Cloning：A laboratory Manual”Sambrook等，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”，第I-III卷，Ausubel，R.M.，主编(1994)；Ausubel等，“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等，“Recombinant DNA”，Scientific AmericanBooks，New York；Birren等(主编)“Genome Analysis：A LaboratoryManual Series”，第1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork(1998)；美国专利第4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057号中所述方法；“Cell Biology：A Laboratory Handbook”，第I-III卷，Cellis，J.E.主编(1994)；“Current Protocols in Immunology”第I-III卷，Coligan J.E.主编(1994)；Stites等(主编)，“Basic and ClinicalImmunology”(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(主编)，“Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；专利和科技文献中大量记载的可应用的免疫测定法，参见例如美国专利第3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521号；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.主编(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”Hames，B.D.和Higgins S.J.主编(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.和Higgins S.J.主编(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I.主编(1986)；“ImmobilizedCells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to MolecularCloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods in Enzymology”第1-317卷，Academic Press；“PCR Protocols：A Guide To Methods AndApplications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等，“Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual”CSHL Press(1996)，所有文献都通过引用予以结合就如全部列举在本文中一样。其它一般参考文献贯穿在本文中提供。其中的方法步骤被视为是本领域众所周知的，为了方便读者而提供。其中所包含的全部信息通过引用结合到本文中。

实施例1

应用数字表达分析和跨种比较基因组鉴定AQP基因

植物中存在大量的AQP，而且当AQP在植物中过量表达时所得到的相抵触的结果表明，需要选择性地鉴定可以改进植物的水分利用效率(WUE)、在非生物胁迫下以及在不利条件下导致产量和生物量提高的AQP基因。

在不利的胁迫条件下，植物的一些生物活性终止或降低，而其它不是初期活性的生长活性则启动。尽管如此，仍然维持对植物存活必不可少的一些活性。一种假设是，对于植物在不利条件下维持生命活性的所需要的关键基因应当在大范围的生物胁迫和非生物胁迫下具有活性。

为了检验这个假设并且鉴定出具有在不同的生物胁迫和/或非生物胁迫条件(例如盐或干旱胁迫)下改进植物性能潜力的关键AQP基因，综合进行了数字表达分析(亦称电子RNA印迹法)和跨种比较基因组学分析。所利用的数据库可获自NCBI(超文本传输协议://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/)，并包括了源自15种不同品种的1,195个相关EST文库的7.2x 10⁶个表达序列标签(EST)，同时包括单子叶植物和双子叶植物品种，即：拟南芥、大麦、芜菁(Brassica rapa)、棉花、葡萄、玉米、苜蓿、杨树、马铃薯、水稻、苜蓿、大豆、甘蔗、番茄和小麦。

根据可用于数据挖掘的得自若干番茄品种的高品质番茄数据库以及本发明的发明人在使用番茄基因组作为模式植物中的经验，选择番茄植物作为模式植物。另外，各种番茄品种具有相对高的耐盐性，使得番茄基因组成为用于鉴定新的胁迫耐受性机制的优良的候选植物。而且，番茄不仅仅用作遗传学研究的模式植物，而且它还用作具有界限清晰的产量参数的重要作物，所述参数可用来区分影响非生物胁迫耐受性的基因和防止在非生物胁迫条件下产量受损失的基因。

基因分析和数据挖掘--对于基因分析和数据挖掘，所使用的生物信息过滤方法具有三个阶段：

1.聚簇和装配：从GenBank 157、160、161、162、164、165、166版中提取15个品种每一种的EST和mRNA序列，采用CompugenLEADS聚簇和装配平台(Compugen′s LEADS clustering and assemblyplatform，Compugen Ltd.，Tel Aviv，Israel；Yelin等2003，NatureBiotechnology 21，379-85)进行聚簇和装配。自动摘录的EST文库注释用手工校正并根据解剖学、发育阶段、非生物/生物胁迫处理和栽培品种进行分类。将结果录入Oracle数据库。然后预测的蛋白质使用InterPro(2)(超文本传输协议://www.ebi.ac.uk/interpro/)注释。

2.聚簇的选择--选择包含主要内在蛋白结构域(IPR000425)的全部聚簇用于进一步分析(n＝1,114)。

3.获取聚簇表达谱--通过数字表达方法，根据植物解剖学(即基因在哪些组织/器官中表达)、发育阶段(即在哪个发育阶段可存在某一基因)和处理特征(提供在哪种生理条件下(例如干旱、冷、病菌感染等)基因进行表达)，获得全部聚簇的表达谱。

数字表达计算法如下计算：以m/(n*M/N)计算过量表达倍数，其中“N”是具体生物的EST总数；“M”是给定文库/组织/种类的EST数；“n”是给定重叠群的EST总数；“m”是重叠群中文库/组织/种类的EST数；P值应用Fisher精确检验统计量计算。在根部和非生物胁迫条件下过量表达的综合P值用1-(1-p1)x(1-p2)计算。在种间转录数据库鉴定出1,114个不同的AQP基因。对于数据挖掘方法，本发明的发明人结合使用两种方法：根部与苗相比，或者在各种非生物胁迫(包括干旱、冷、盐分、热、化学处理等)下与非胁迫对照相比，精选AQP聚簇显示显著过量表达(EST分布是正常的两倍以上；过量表达的统计显著--性p值＜0.05)。研究发现，约9％的AQP基因的EST显著过量存在于根中，在不同非生物胁迫下诱导其中的3.5％。选出高过量存在于根部的AQP基因，因为预期具有有效根系的植物能从干燥土壤中夺取更多水分。另外，鉴于AQP基因可提供对各种胁迫的高耐受性，因此选择过量存在于各种非生物胁迫(例如养分缺乏、热、盐分和重金属胁迫)及生物胁迫(例如施用激位素(elicitor)和病原体)中的AQP基因。

按照文献中已知的可接受的组别，对同一组的1,114个AQP进行了分类：第一次分成4个主要亚组：PIP、TIP、NIP和SIP，第二次分类按照其在氨基酸序列中的同源性，将这4个亚组分成11个亚组。然后，利用Fisher精确检验鉴定在根部和当暴露在不同非生物胁迫下过量存在的大量EST的亚组。如下文中的表1所示，11个亚组中，仅TIP2亚组显示在根部和当暴露于非生物胁迫时过量存在大量的EST(P值分别1.7X10^-5和1.6X10^-3)。

表1

在根部以及在非生物胁迫时AQP类型分布和过量表达

表1.

这些结果表明Tip2亚组的过量表达和/或蛋白质过量蓄积可改进植物水分利用效率、ABST和产量。

Tip2亚组的基因在根部以及在非生物胁迫时高表达--如上文中的表1所示，TIP2亚组(或亚家族)在根部以及在非生物胁迫时高表达。TIP2亚组存在于公共数据库[超文本传输协议://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/]可获得的38种植物品种和其它生物中(核酸SEQ ID NO：1、2、19、20-22；表2)中。在番茄中，TIP2基因在根部(6倍，p≤1.01E-24)以及在生物胁迫(2倍，p≤4.6E-02)和非生物胁迫(4.5倍，p≤E-02)(数据未显示)时高表达。

Tip2亚家族的短共有序列的鉴定--在比较水通道蛋白的共有氨基酸序列时，鉴定出Tip2亚家族蛋白质中独特的短共有序列。本发明的发明人提出，这个基序对水分利用效率(WUE)具有重要作用，当在植物中过量表达时可赋予ABST并且提高产量。鉴定出的氨基酸共有序列是TLXFXFAGVGS(SEQ ID NO：2826)，其中X表示任何氨基酸。

另外，根据在根、水分水平低的组织(例如种子和花粉)中以及在非生物胁迫条件下的综合数字基因表达谱，通过生物信息学工具，鉴定出水通道蛋白基因家族的其它基因可提高ABST和产量。这些包括SEQ ID NO：3-18，23-26(表2)。

表2

鉴定出的水通道蛋白基因

表2.

与AQP基因同源[当运用国立生物技术信息中心(NCBI)的BlastP和tBlastN算法计算时，对80％的全命中(global hit)或查询长度，显示有至少80％蛋白质序列同一性]的序列或AQP基因的直系同源物参见表2，预期在提高植物的ABST和产量方面具有同样的作用，参见下文中的表3(SEQ ID NO：6、215-1101和1138-1400；表3)。另外，表3还包括AQP TIP2亚家族的同源物和直系同源物(SEQ ID NO：21、53-214、1102-1137)和其它的同源物和直系同源物(SEQ ID NO：2844-3051)。

表3

AQP同源和直系同源的多核苷酸和多肽序列

表3：提供了AQP蛋白质的同源物和直系同源物。同源性用相对于比对序列的同一性％计算。Polynuc.＝多核苷酸；Polypep.＝多肽；Hom.＝同源物/直系同源物；％Ident.＝百分比同一性；Cover.＝覆盖。

实施例2

在计算机芯片上表达的多核苷酸的mRNA表达

采用反转录实验，随后进行定量实时PCR(qRT-PCR)分析，来测定信使RNA水平。对在盐水中生长的20天龄番茄植物幼苗的叶片RNA水平进行了比较。为了确定基因在植物中的作用，对不同实验条件/遗传背景中的mRNA水平进行了相关分析。

材料与实验方法

定量实时RT-PCR(qRT-PCR)--为了验证表达水平、特异性与性状相关性，对从2个番茄品种即YO361(耐盐变种)和FA191(盐敏感变种)的叶片中提取的总RNA相继进行了反转录和定量实时PCR(qRTPCR)。测定了在正常和胁迫条件下表达的AQP基因的信使RNA(mRNA)水平。

20天龄番茄幼苗在土壤中生长，用300mM NaCl浸泡0小时、1小时、6小时、24小时、118小时。收获叶片，并在液氮中冷冻，然后保存在-80℃下直到提取RNA。使用RNeasy植物小试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)，通过使用生产商提供的方案，从叶中提取总RNA。用1μg总RNA，使用200U Super Script II反转录酶(Invitrogen)、150ng随机脱氧核苷酸六聚体(Invitrogen)、500μM脱氧核苷三磷酸(dNTP)混合物(Takara，Japan)、0.2体积的x5反转录酶(RT)缓冲剂(Invitrogen)、0.01M二硫苏糖醇(DTT)、40U RNAsin(Promega)进行反转录，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的重蒸馏水(DDW)至多24μl。

使RNA、随机脱氧核苷酸六聚体、dNTP混合物和DEPC处理的DDW的混合物在65℃下孵育5分钟，随后在4℃下5分钟。将反转录酶(RT)缓冲剂、二硫苏糖醇(DTT)和RNAsin的混合物加入室温反应物中，接着在25℃下孵育10分钟，然后在42℃下2分钟。最后，将Super Script II反转录酶加入室温反应物中，再在42℃下孵育50分钟，接着在70℃下15分钟。

对于MAB69和持家基因，将cDNA在Tris EDTA(pH＝7.5)中以1∶20稀释。对于MAB58和MAB59cDNA由于表达非常弱因而以1∶2稀释，随后持家基因cDNA以1∶8稀释以便将Ct值插入标准曲线范围内。5μL稀释的cDNA用于qPCR。

对于qPCR扩增，设计了AQP基因的引物，概括于下表4中。测定了持家基因：肌动蛋白(SEQ ID NO：2841)、GAPDH(SEQ ID NO：2842)和RPL19(SEQ ID NO：2747)的表达水平以使不同组织内的表达水平归一化。

表4

qPCR扩增的引物

表4.

实验结果

在耐盐情况下植物叶片AQP基因的mRNA水平的变化--在盐分条件下，耐受品系与敏感品系叶片中的番茄AQP基因的稳态水平概括于下表5中。在所有3种情况下，在植物暴露于盐胁迫后，水通道蛋白基因表达增加。耐盐性番茄品系(YO361)的基因峰值表达比敏感品系(FA191)的高。基因表达升高表明所测定的AQP基因参与番茄植物中的高盐耐受性。

表5

番茄AQP基因的表达水平

孔名称(cDNA)

MAB58

MAB59

MAB69^＊

叶FA191 0h	2.86	5.97	875
				叶FA191 1h	4.56	5.73	597
叶FA191 6h	5.34	8.2	945
				叶FA191 24h	42.7	62.4	613
叶FA191 118h	55.4	22.2	1800
				叶Y0361 0h	1.96	2.81	638
叶Y0361 1h	2.33	0.517	583
				叶Y0361 6h	2.88	5.66	464
孔名称(cDNA)	MAB58	MAB59	MAB69^＊
				叶Y0361 24h	75.4	139	513
叶Y0361 118h	26.3	未测定	2300

表5：所提供的是番茄AQP基因在盐分条件下[在盐溶液中的孵育时间以小时(h)表示]的稳态水平。使用不同稀释度的cDNA(MAB69为1∶20MAB58和MAB59为1∶2)。数值在每个样品归一化后给出。

实施例3

基因克隆和用于植物表达的二元载体的产生

为了证实AQP基因在ABST和产量中的作用，如下使AQP基因在植物中过量表达。

克隆策略

将从实施例1中提供的基因中选出的基因克隆到用于产生转基因植物的二元载体中。为了进行克隆，对全长可读框(ORF)进行了鉴定。通过比较得自其它植物品种的已知蛋白质的若干种翻译算法的结果，对EST聚簇和一些情况下的mRNA序列进行了分析以鉴定完整可读框。在其中不存在完整编码序列的情况下，使用得自Ambion或Clontech的RACE(RACE＝Rapid Access to cDNA Ends)试剂盒制备植物样品的RNA，从而接近基因的完全cDNA转录物。

为了克隆全长cDNA，对从在正常或养分缺乏条件下生长的叶、根或其它植物组织中提取的总RNA进行了反转录PCR(ReverseTranscription followed by PCR)(RT-PCR)。采用其它部分描述的标准方案(Sambrook J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.1989.Molecular Cloning.ALaboratory Manual.，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork)和对于本领域技术人员是基础的标准方案进行总RNA提取、cDNA的产生和PCR扩增。使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)对PCR产物进行了纯化，并且使用ABI 377测序仪(Applied Biosystems)，对扩增PCR产物进行了测序。

通常订制2组引物通过嵌套PCR(是指使用外部引物使基因进行第一次扩增，然后使用所产生的PCR产物作为模板用于第二次PCR反应，其中使用内部引物组)用于各基因的扩增。或者，在第一次和第二次PCR反应中均使用内部引物的一种或两种用于基因扩增(是指仅为基因设计了2-3种引物)。为了进一步促进cDNA的克隆，将8-12bp突出端添加到每个内部引物的5′引物端。引物突出端包括内切核酸酶限制位点。采用两个参数选择限制位点：(a)限制位点不存在于cDNA序列中；和(b)在正向引物和反向引物中设计限制位点，使消化的cDNA以有义形式插入用于转化的二元载体中。在下表6中，提供用于克隆番茄和大麦AQP的引物。

表6

用于克隆番茄和大麦AQP基因的引物

表6.

按照引物中的位点设计(下表8和表9)，用限制性内切核酸酶(Roche，Switzerland)对PCR产物进行纯化(PCR纯化试剂盒，Qiagen，Germany)和消化。将消化的PCR产物的每一种首先克隆至用同一限制性内切酶消化的高拷贝质粒pBlue-script KS中[超文本传输协议://www.stratagene.com/manuals/212205.pdf]。在一些情况下(下表8)，来源于二元载体pBI101.3[GenBank检索号U12640中的核苷酸坐标4417-4693(SEQ ID NO：2824)]的胭脂碱合酶(NOS)终止子已被克隆至介于限制性内切核酸酶位点SacI和EcoRI之间的pBlue-script KS，从而使基因被导入终止子的上游。在其它情况下(下表9)，At6669启动子(SEQ ID NO：2823)已被克隆至pBlue-script KS，从而使基因被导入启动子的下游。使用T4DNA连接酶(Roche，Switzerland)，将消化的PCR产物和线性化质粒载体连接。使用ABI 377测序仪(AppliedBiosystems)，对插入基因进行了测序。将少数克隆的AQP基因及其编码蛋白的序列列于下表7中。

表7：克隆的序列

表7.

再次将基因消化，并与带有At6669启动子的pPI或pGI二元质粒连接(介于HindIII和SalI限制性内切核酸酶位点之间)(表8)。在其它情况下，使用表8中给出的限制性内切核酸酶，将At6669启动子连同基因从pBlue-script KS质粒中消化出来，并与pPI或pGI二元质粒连接。

表8

用于将MAB AQP基因克隆至pKS+NoS终止子高拷贝质粒，随后克隆至二元载体pGI+At6669启动子的限制性内切酶位点

表8：克隆至pKS+NOS终止子高拷贝质粒，接着克隆至二元载体pGI+At6669启动子的MAB AQP基因。

表9

用于将MAB AQP基因克隆至pKS+At6669启动子高拷贝质粒，接着将启动子+基因克隆至pGI二元载体的限制性内切酶位点

表9：将MAB AQP基因克隆至pKS+At6669启动子高拷贝质粒，接着将启动子+基因克隆至pGI二元载体。

通过将来源于pGL3基础质粒载体(Promega检索号U47295；bp4658-4811)的合成聚(A)信号序列插入二元载体pBI101.3(Clontech检索号U12640)的HindIII限制位点，来构建pPI质粒载体。pGI(图1)与pPI相似，但是主链中的原始基因是GUS-内含子，而不是GUS。对克隆的基因进行了测序。

从供应商(GeneArt，GmbH)订购一些克隆多核苷酸的合成序列(例如MAB54的合成序列，编码蛋白质SEQ ID NO：27的核苷酸SEQ IDNO：2751；或编码SEQ ID NO：2769的MAB72SEQ ID NO：2843)。为了使编码序列最优化，采用了从植物转录物组计算的密码子用法表[这类表的实例可参见在线获取的密码子用法数据库超文本传输协议://www.kazusa.or.jp/codon/]。以这样的方式设计最优化的编码序列，即在双子叶植物(主要是番茄和拟南芥)、单子叶植物(例如玉米)中使用对于表达是优选的密码子的同时，不会将变化导入编码的氨基酸序列。这类最优化序列更好地促进翻译速率，因此具有较高的蛋白质表达水平。向邻接另外的独特限制性内切酶位点添加最优化的序列以利于二元载体中的克隆基因。

所使用的启动子：CaMV 35S启动子(SEQ ID NO：2825)和拟南芥At6669启动子(SEQ ID NO：2823；这是Evogene Ltd.的WO04081173的SEQ ID NO：61)。

实施例4

表达AQP基因的转基因植物的产生

实验结果

拟南芥转化--按照Clough SJ，Bent AF(1998)”Floral dip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana(花浸泡：用于土壤杆菌介导的拟南芥转化的简化方法)”.Plant J.16(6)：735-43；以及Desfeux C，Clough SJ，Bent AF.(2000)”Female reproductive tissues are the primary targets ofAgrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dipmethod(雌性繁殖组织是通过拟南芥花浸泡方法的土壤杆菌介导的转化的主要目标)”.Plant Physiol.123(3)：895-904，加以少量修改，来进行下列MAB基因和直系同源物的拟南芥转化：MAB115、MAB54、MAB55、MAB56、MAB57、MAB58、MAB59(MAB58的直系同源物)、MAB69、MAB70、MAB71、MAB72、MAB74、MAB76、MAB77、MAB79、MAB116(MAB115和MAB55的直系同源物)和MAB117(克隆多核苷酸的序列标识符及其表达多肽见上表7)。简单地说，将拟南芥(Arabidopsis thaliana Columbia)(Col0)T₀植物播种在250ml装满湿的基于泥碳的生长混合物的盆中。盆用铝箔和塑料圆盖覆盖，保持在4℃下3-4天，然后揭开盖，在生长室内，在18-24℃、16/8小时光/暗周期下培育。在开花期前6天，T₀植物准备好转化。将携带含有AQP基因的二元载体的土壤杆菌的单个集落在补充了卡那霉素(50mg/L)和庆大霉素(50mg/L)的LB培养基中培养。在剧烈振荡下将培养物在28℃下孵育48小时，在4000rpm下离心5分钟。将包含土壤杆菌细胞的沉淀重新悬浮于转化培养基中，所述培养基含有半强度(2.15g/L)Murashige-Skoog(Duchefa)、0.044μM苄基氨基嘌呤(Sigma)、112μg/L B5Gambourg维生素(Sigma)、5％蔗糖和0.2ml/L Silwet L-77(OSISpecialists，CT)的重蒸水溶液(pH 5.7)。

通过将各植物转到土壤杆菌悬液中，使花柄(flowering stem)浸没3-5秒钟，来进行T₀植物的转化。立即将各接种的T₀植物种植在塑料盘中，然后用透明塑料圆盖盖上以保持湿度，在室温下避光保持18小时以利于侵染和转化。然后，揭开转化(转基因)植物上的盖子，并转移到温室中进行恢复和成熟。转基因T₀植物在温室中生长3-5周，直到长角果成熟，然后收获种子，并保存在室温下直到播种。

为了产生带有所述基因的T₁和T₂转基因植物，将从转基因T₀植物收集的种子通过浸泡在70％乙醇中1分钟，接着浸泡在5％次氯酸钠和0.05％Triton X-100中5分钟而进行表面灭菌。将表面灭菌种子在无菌蒸馏水中充分洗涤，然后放到装有半强度Murashige-Skoog(Duchefa)、2％蔗糖、0.8％植物琼脂、50mM卡那霉素和200mM羧苄西林(carbenicylin)(Duchefa)的培养皿中。培养皿在4℃下培育48小时，然后转移到25℃的生长室再培育一周。将有活力的T₁拟南芥植物转移到新鲜培养皿中再培育一周。培育后，从培养皿中取出T₁植物，并栽培在含有生长混合物的250ml盆中。使转基因植物在温室中生长到成熟期。在与T₁植物培育和生长相同的条件下，培育从T₁植物收获的种子并生长到成熟期成为T₂植物。从收集的T2种子的各构建体产生了至少10件独立的转化事件。对所产生的各事件中提取的基因组DNA进行PCR，测定各事件的基因的导入。

具有推定棉花基因的番茄(Var M82)植物的转化--按照以下方法略作改动来进行番茄(Solanum esculentum，栽培种M82)转化和转基因植物的培育：“Curtis I.S，Davey M.R和Power J.B.1995.“Leaf disktransformation(叶盘转化)”.Methods Mol.Biol.44，59-70；以及Meissner R，Chague V，Zhu Q，Emmanuel E，Elkind Y，Levy A.A.2000.“Technical advance：a high throughput system for transposontagging and promoter trapping in tomato(技术发展：用于番茄中的转座子标记法和启动子捕获法的高通量系统)”.Plant J.22，265-74。

实施例5

对在组织培养实验中生长在非生物胁迫以及不利条件下的转基因拟南芥植物进行评价

实验1：在组织培养条件下在渗透胁迫[聚(乙二醇)(PEG)]下的植物生长--干旱的一个结果是在根周围区域引起渗透胁迫；因此，在许多科学研究中，使用PEG(例如25％PEG8000)模拟类似于干旱胁迫期间存在的高摩尔渗透压浓度的渗透胁迫条件。

在卡那霉素(用于只选择转基因植物)的存在下，将表面灭菌的种子播种在基础培养基[50％Murashige-Skoog培养基(MS)，补充了0.8％植物琼脂作为固化剂]上。播种后，将板转移至4℃下2-3天进行层化，然后在25℃下生长，每日12小时光照12小时避光周期达7-10天。在该时间点上，将随机选择的幼苗小心地转移到装有25％PEG、0.5MS培养基或正常生长条件(0.5MS培养基)的平板中。每板包含相同转基因事件的5株幼苗，各事件3-4个不同的平板(一式多份)。对于本发明的每种多核苷酸，对各个构建体的至少4件独立转化事件进行了分析。对表达本发明多核苷酸的植物与用于同一实验中的对照植物(在相同启动子下的空载体或GUS报道基因)的平均测量值进行了比较。

数字成像--实验室图像采集系统由安装在再现装置(reproduction device)(Kaiser RS)上的附带55mm焦距透镜(Canon EF-S系列)的数码反射式照相机(Canon EOS 300D)组成，再现装置包括4个光度单位(4x150瓦电灯泡)，并放置在暗房中，该系统用于拍摄播种在琼脂平板上幼苗的图片。

图片拍摄过程自第1天起每2-5天重复进行直到第10-15天为止(参见例如图2A-B中的照片)。

使用图像分析系统，该系统由个人台式计算机(Intel P4 3.0GHz处理器)和公共结构域程序-ImageJ 1.39(基于Java的图像处理程序，由美国国立卫生研究院(U.S National Institutes of Health)开发，可免费获自互联网从超文本传输协议://rsbweb.nih.gov/)组成。图像以10兆像素(3888x2592像素)的分辨率拍摄，并以低压缩JPEG(静止图像压缩标准(Joint Photographic Experts Group standard))格式保存。接下来，把分析数据保存到文本文件中，应用JMP统计分析软件(SAS institute)进行了处理。

幼苗分析--采用数字分析，对幼苗数据进行了计算，包括叶面积、根覆盖(coverage)和根长。

按照下式II、式III和式IV，对各种幼苗参数的相对生长率进行了计算。

方程式II：

叶面积的相对生长率＝(Δ莲座面积/Δt)*(1/莲座面积t₁)

Δ莲座面积是现时莲座面积(在t₂时测量)和前一日测量的莲座面积(面积t₁)的差异。

Δt是现分析图像日(t₂)和前一日(t₁)之间的时间间隔(t₂-t₁，单位：天)。

因此，叶面积的相对生长率的单位是1/天。

方程式III：

根覆盖的相对生长率＝(Δ根覆盖面积/Δt)*(1/根覆盖面积t₁)

Δ根覆盖面积是现时根覆盖面积(在t₂时测量)和前一日测量的根覆盖面积(面积t₁)的差异。

Δt是现分析图像日(t₂)和前一日(t₁)的时间间隔(t₂-t₁单位：天)。

因此，根覆盖面积的相对生长率的单位为1/天。

方程式IV：

根长的相对生长率＝(Δ根长/Δt)*(1/根长t₁)

Δ根长是现时根长(在t₂时测量)和前一日测量根长(面积t₁)之间的差异。

Δt是现分析图像日(t₂)和前一日(t₁)的之间的时间间隔(t₂-t₁单位：天)。

因此，根长的相对生长率的单位是1/天。

在实验结束时，将幼苗从培养基中取出，称重以确定植物鲜重。然后将幼苗在60℃下干燥24小时，再次称重测量植物干重用于稍后的统计分析。在每成对连续照片之间，通过比较叶面积覆盖(leaf areacoverage)、根覆盖和根长，确定生长率，使用所述结果分析在渗透胁迫下以及在最优条件下，导入的基因对植物生长势的作用。同样，通过将植物鲜重和干重与对照植物(含有在相同启动子下的空载体或GUS报道基因)的进行比较，确定在渗透胁迫下以及在最优条件下导入的基因对生物量蓄积的作用。从所创建的每个构建体中，一式多份对3-5个独立转化事件进行了研究。

统计分析--为了鉴定提供显著改进的非生物胁迫耐受性或扩展的根系结构的基因，对从转基因植物中得出的结果与从对照植物得出的结果进行了比较。为了鉴定性能更好的基因和构建体，对得自所测定的独立转化事件的结果进行了个别分析。为了评价基因事件优于对照的作用，通过斯氏t检验对数据进行了分析，计算得到p值。如果p≤0.1，则结果视为显著。使用了JMP统计软件包(5.2.1版，SASInstitute Inc.，Cary，NC，USA)。

实验结果--对本发明的多核苷酸序列的多种所需性状进行了实验。

表10-14表示对当生长在渗透胁迫下(25％PEG)条件下，对在At6669启动子(SEQ ID NO：2823)调节下过量表达本发明多核苷酸的幼苗的上述生长参数进行的分析。

表10

MAB70--25％PEG

表10：提供在25％PEG下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。指定天数是指自种植日起的天数。

表11

MAB76--25％PEG

表11：提供在25％PEG下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表12

MAB79--25％PEG

表12：提供在25％PEG下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表13

MAB56--25％PEG

表13：提供在25％PEG下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表14

MAB58--25％PEG

表14：提供在25％PEG下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表15-29表示对在正常生长条件(0.5MS培养基)下，在At6669启动子调节下过量表达本发明多核苷酸的幼苗的上述生长参数进行的分析。

表15

MAB70--正常生长条件

表15：提供在正常生长条件下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表16

MAB71--正常生长条件

表16：提供在正常生长条件下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表17

MAB74--正常生长条件

表17：提供在正常生长条件下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表18

MAB76--正常生长条件

表18：提供在正常生长条件下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表19

MAB77--正常生长条件

表19：提供在正常生长条件下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表20

MAB79--正常生长条件

表20：提供在正常生长条件下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表21

MAB115--正常生长条件

表21：提供在正常生长条件下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表22

MAB54--正常生长条件

表22：提供在正常生长条件下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表23

MAB55--正常生长条件

表23：提供在正常生长条件下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表24

MAB56--正常生长条件

表24：提供在正常生长条件下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表25

MAB57--正常生长条件

表25：提供在正常生长条件下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表26

MAB58--正常生长条件

表26：提供在正常生长条件下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表27

MAB59--正常生长条件

表27：提供在正常生长条件下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表28

MAB69--正常生长条件

表28：提供在正常生长条件下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表29

MAB72--正常生长条件

表29：提供在正常生长条件下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

实施例6

对温室实验中生长在非生物胁迫以及有利条件下的转基因拟南芥植物的评价

ABS耐受性：在温室条件下在高盐浓度下的产量和植物生长率--本实验跟踪生长在温室中的植物的莲座面积生长以及高盐浇灌下的种子产量。在育苗条件下，将种子播种在只补充了选择剂(卡那霉素)的琼脂培养基和Hoagland溶液中。然后，将T₂转基因幼苗移栽到装满泥碳和珍珠岩的1.7盘中。该盘用自来水浇灌(从盆底提供)。一半植物用盐溶液(40-80mM NaCl和5mM CaCl₂)浇灌，以便引起盐分胁迫(胁迫条件)。另一半植物用自来水(正常条件)浇灌。全部植物都在温室中生长直到种子成熟，然后收获(地上组织)，称重(立即或在50℃烤箱中干燥24小时后)。用含有40-80mM NaCl(“ABS”生长条件)的溶液浇灌获得高盐条件，并与正常生长条件进行了比较。

各构建体在其T2代时进行了验证。转基因植物用包括在AT6669启动子下的uidA报道基因(GUS)的构建体转化，或者将包括AT6669启动子的空载体用作对照。

对植物的整体大小、生长率、开花、种子产量、1,000粒种子重量、干物质和收获指数(HI--种子产量/干物质)进行了分析。将转基因植物性能与在相同条件下平行生长的对照植物进行了比较。表达uidA报道基因(GUS-内含子)或在相同启动子下的完全无该基因的假-转基因植物用作对照。

以网巢状随机试验区分布设计实验。对于本发明的每种基因，对各构建体的3-5个独立转化事件进行了分析。

数字成像--实验室图像采集系统由安装在再现装置(Kaiser RS)上的附带55mm焦距透镜(Canon EF-S系列)的数码反射式照相机(Canon EOS 300D)组成，再现装置包括4个光度单位(4x150瓦电灯泡)，用于拍摄植物样品的图像。

图片拍摄过程自第1天起每2天重复进行直到第16天为止。放置在定制铁支架上的相同照相机，用于拍摄播种在环境受控温室中的白色桶内的较大植物的图像。桶为正方形，包括1.7升盘。在拍摄过程中，将桶放在铁支架下，同时避免直接日照和投下阴影。

使用图像分析系统，该系统由个人台式计算机(Intel P4 3.0 GHz处理器)和公共结构域程序-ImageJ 1.39(基于Java的图像处理程序，由由美国国立卫生研究院开发，可免费版获自互联网从超文本传输协议://rsbweb.nih.gov/)组成。图像以10兆像素(3888x2592像素)的分辨率拍摄，并以低压缩JPEG(静止图像压缩标准)格式保存。接下来，将分析数据保存到文本文件中，应用JMP统计分析软件(SAS institute)进行了处理。

叶分析--采用数字分析，对叶片数据进行了计算，包括叶片数、叶面积、叶周长、叶长和叶宽。

营养生长率：叶片数和莲座面积的相对生长率(RGR)分别用式V和式VI计算。

方程式V：

叶片数的相对生长率＝(Δ叶片数/Δt)*(1/叶片数t₁)

Δ叶片数是现时叶片数(在t₂时测量)与在前一日测量的叶片数(面积t₁)之间的差异。

Δt是现分析图像日(t₂)和前一日(t₁)之间的时间间隔(t₂-t₁单位：天)。

因此，叶片数的相对生长率的单位为1/天。

方程式VI：

莲座面积的相对生长率＝(Δ莲座面积/Δt)*(1/莲座面积t₁)

Δ莲座面积是现时莲座面积(在t₂时测量)和前一日测量的莲座面积(面积t₁)之间的差异。

因此，莲座面积的相对生长率的单位为1/天。

种子平均重量--在实验结束时，收集全部种子。将种子分散在玻璃盘中，拍摄照片。应用数字分析，计算出每个样品的种子数。

干重和种子产量--在播种80天左右，收获植物，放置在干燥室内于30℃干燥。测定每试验区的生物量和种子重量，除以每试验区的植物数。干重＝在干燥室内于30℃干燥后地上营养部分的总重(不包括根)；每株植物的种子产量＝每株植物的种子总重量(g)。1000粒种子重量(1000粒种子的重量)(g)。

收获指数(HI)--运用方程式VII，计算出收获指数。

方程式VII：

收获指数＝每株植物的平均种子产量/平均干重

统计分析--为了鉴定提供显著改进的非生物胁迫耐受性的基因，对从转基因植物得到的结果与从对照植物得到的结果进行了比较。为了鉴定性能更好的基因和构建体，对得自所测定的独立转化事件的结果进行了个别分析。应用斯氏t检验对数据进行了分析，如果p值小于0.1，则结果视为显著。使用了JMP统计软件包(5.2.1版，SASInstitute Inc.，Cary，NC，USA)。

实验结果

表30-45表示对在盐浇灌条件[NaCl 40-80mM；NaCl电导率(E.C.)为7-10]下过量表达在At6669启动子调节下的本发明多核苷酸的上述植物参数进行的分析。

表30

MAB115--盐浇灌(40-80mM NaCl)

表30：提供在温室中在盐浇灌下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表31

MAB54--盐浇灌(40-80mM NaCl)

表31：提供在温室中在盐浇灌下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表32

MAB55--盐浇灌(40-80mM NaCl)

表32：提供在温室中在盐浇灌下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表33

MAB56--盐浇灌(40-80mM NaCl)

表33：提供在温室中在盐浇灌下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表34

MAB57--盐浇灌(40-80mM NaCl)

表34：提供在温室中在盐浇灌下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表35

MAB58--盐浇灌(40-80mM NaCl)

表35：提供在温室中在盐浇灌下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表36

MAB59--盐浇灌(40-80mM NaCl)

表36：提供在温室中在盐浇灌下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表37

MAB69--盐浇灌(40-80mM NaCl)

表38：提供在温室中在盐浇灌下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表39

MAB70--盐浇灌(40-80mM NaCl)

表39：提供在温室中在盐浇灌下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表40

MAB71--盐浇灌(40-80mM NaCl)

表40：提供在温室中在盐浇灌下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表41

MAB72--盐浇灌(40-80mM NaCl)

表41：提供在温室中在盐浇灌下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表42

MAB74--盐浇灌(40-80mM NaCl)

表42：提供在温室中在盐浇灌下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表43

MAB76--盐浇灌(40-80mM NaCl)

表43：提供在温室中在盐浇灌下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表44

MAB77--盐浇灌(40-80mM NaCl)

表44：提供在温室中在盐浇灌下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表45

MAB79--盐浇灌(40-80mM NaCl)

表45：提供在温室中在盐浇灌下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表46-58表示对在正常生长条件下过量表达在6669启动子调节下的本发明多核苷酸的植物参数(如上所述)进行的分析[正常浇灌包括1-2的NaCl电导率(E.C.)]。

表46

MAB115--正常生长

表46：提供在温室中在正常浇灌条件下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表47

MAB54--正常生长

表47：提供在温室中在正常浇灌条件下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表48

MAB55--正常生长

表48：提供在温室中在正常浇灌条件下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表49

MAB56--正常生长

表49：提供在温室中在正常浇灌条件下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表50

MAB57--正常生长

表50：提供在温室中在正常浇灌条件下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表51

MAB58--正常生长

表51：提供在温室中在正常浇灌条件下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表52

MAB59--正常生长

表52：提供在温室中在正常浇灌条件下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表53

MAB69--正常生长

表53：提供在温室中在正常浇灌条件下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表54

MAB70--正常生长

表54：提供在温室中在正常浇灌条件下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表55

MAB71--正常生长

表55：提供在温室中在正常浇灌条件下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表54

MAB72--正常生长

表55

MAB74--正常生长

表56

MAB76--正常生长

表56：提供在温室中在正常浇灌条件下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表57

MAB77--正常生长

表57：提供在温室中在正常浇灌条件下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表58

MAB79--正常生长

表58：提供在温室中在正常浇灌条件下测定的转基因植物或对照植物的生长、生物量和产量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

实施例7

在拟南芥组织培养实验中肥料利用效率得到改进对在组织培养实验中下列MAB基因的转基因植物的肥料利用效率进行了测定：MAB115、MAB54、MAB55、MAB56、MAB57、MAB58、MAB59、MAB69、MAB70、MAB71、MAB72、MAB74、MAB76、MAB77、MAB79、MAB116和MAB117(克隆的多核苷酸及其表达多肽的序列标识符见上表7)。

实验1：在组织培养条件下在缺氮下的植物生长

本发明的发明人发现，氮素利用效率(NUE)实验与ABST候选基因的评价有关，因为NUE不足促进根伸长，增加根覆盖，并且便于检测植物在干旱条件下产生较好根系的潜力。另外，在文献中有证据表明，NUE的生物学机制和干旱耐受性相关联(Wesley等，2002 Journalof Experiment Botany，第53卷，第366期，第13-25页)。

在卡那霉素存在下(用于只选择转基因植物)，将表面灭菌的种子播种在基础培养基[50％Murashige-Skoog培养基(MS)，补充了0.8％植物琼脂作为固化剂]上。播种后，将板转移到4℃下2-3天以进行层化，然后在25℃、每日12小时光照12小时避光周期下生长7-10天。在该时间点上，小心地将随机选出的幼苗转移到具有以下有限氮条件的板中：0.5MS培养基，其中综合氮浓度(NH₄NO₃和KNO₃)为0.75mM(缺氮条件)或3mM[正常(最佳)氮浓度]。每板含有相同事件的5株幼苗，每事件3-4块不同的板(一式多份)。对于本发明的每种多核苷酸，对各构建体的至少4个独立转化事件进行了分析。对表达本发明多核苷酸的植物与用于相同实验中的对照植物(在相同启动子下的空载体或GUS报道基因)的平均测量值进行了比较。

数字成像和统计分析--按照之前描述的上述实施例5实验1中的方法测定参数并进行分析。

表59-68表示在缺氮条件下对过量表达在At6669启动子调节下的本发明多核苷酸的幼苗参数(如上所述)进行的分析。

表59

MAB70--缺氮(0.75mM氮)

表59：提供在缺氮(0.75mM N)下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表60

MAB71--缺氮(0.75mM氮)

表60：提供在缺氮(0.75mM N)下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表61

MAB74--缺氮(0.75mM氮)

表61：提供在缺氮(0.75mM N)下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表62

MAB76--缺氮(0.75mM氮)

表62：提供在缺氮(0.75mM N)下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表63

MAB77--缺氮(0.75mM氮)

表63：提供在缺氮(0.75mM N)下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表64

MAB79--缺氮(0.75mM氮)

表64：提供在缺氮(0.75mM N)下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表65

MAB115--缺氮(0.75mM氮)

表65：提供在缺氮(0.75mMN)下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表66

MAB54--缺氮(0.75mM氮)

表66：提供在缺氮(0.75mM N)下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表67

MAB57--缺氮(0.75mM氮)

表67：提供在缺氮(0.75mM N)下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

表68

MAB72--缺氮(0.75mM氮)

表68：提供在缺氮(0.75mM N)下的组织培养物生长中测定的转基因植物或对照植物的生长和生物量参数。A＝平均值；P＝p值；RGR＝相对生长率。所示天数是指自种植日起的天数。

实施例8

转基因番茄和拟南芥植物在田间条件下显示盐胁迫耐受性和缺水胁迫耐受性得到改进

为了检验AQP TIP2基因对植物胁迫耐受性的作用，本发明的发明人之前克隆并过量表达了包含由SEQ ID NO：2827(亦称ABST36，由WO2004/104162中的SEQ ID NO：13所示；或S1TIP2；2)所示的核酸序列的多核苷酸及编码由SEQ ID NO：2828(其包含共有序列TLXFXFAGVGS；SEQ ID NO：2826)所示TIP2多肽的多核苷酸。将包含在组成型拟南芥At6669启动子(SEQ ID NO：2823)调节下的ABST36多核苷酸的核酸构建体(又称为At6669::ABST36构建体)进一步转化至作为模式农作物(Tom-ABST36)的番茄(Solanum lycopersicum)中，以及转化至拟南芥中。在两种不同的盐胁迫田间试验和一种缺水胁迫田间试验(由两种缺水方案构成)中，对以杂合形式过量表达ABST36的4个独立T₂转基因番茄基因型对盐和缺水的耐受性进行了评价。将每个田间试验的转基因基因型与作为对照的其空分离系对映株(null-segregant counterpart)进行了比较。

材料与实验方法

番茄盐胁迫田间试验--所有田间试验都在以色列Rehovot附近的户外(网格室(net-house))的轻质土中进行。在正常浇灌条件下，使ABST36转基因MicroTom植物与M82番茄植物杂交的4件独立事件的F1杂种在苗圃中生长头3周。然后将幼苗成行移栽并在商用温室中生长。将盐胁迫试验分成四块。在每块中，建立两种不同的浇灌系统：一种为番茄栽培的正常水方案，一种为连续用盐水(添加180-200mM NaCl)浇灌。每块由如下划分的共60株植物组成：将每事件6株植物和6株幼苗空分离系在对照行中种植，将相似数目的植物在盐胁迫行中种植。在植物上有大约80％红色果实的阶段，计算果实产量、植物鲜重和收获指数。用产量/植物生物量计算收获指数。

番茄缺水胁迫田间试验--所有田间试验在以色列Rehovot附近的户外(网格室)的轻质土上进行。4件独立事件的F1杂种的最初生长如上所述。将生长3周的幼苗移栽到网格温室(net-greenhouse)中。将实验安排成为4块，每块包括用不同的浇水水平和间隔浇灌的3行(WLI-0、WLI-1、WLI-2)。在每块中，对所分析的每事件6株转基因植物和6株非转基因植物移栽在各行中。四周后将幼苗移栽到湿土中。在移栽前用来统一浇灌的用水量在60cm深处达到最大持水量[20％重量/重量(w/w)]，但并未造成水分过量。按照商用生长方案，将每株植物移栽到滴头附近，植物间相距30cm，使总密度达2,600株植物/1,000m²。采用标准方法步骤，从以下三个深度采集土样，计算土壤持水量：0-20cm、20-40cm和40-60cm。每周按常规测定这些土层的含水量。土壤含有5％湿存水，而土壤的最大持水量为20％。在植物移栽之前将全部肥料施于土壤中。磷和钾两者的量经计算足够用于整个季节。按照推荐，通过浇灌系统施氮，所有处理都相同。每行包括3条滴灌管线，产生9个滴头/1m²的覆盖范围。单独进行各个处理的水对照。在开始实验之前将土壤完全干燥。在移栽仅4周当植物开始开花期时，开始进行不同的水方案。按照标准生长方案的推荐，在每周开始时计算得到在实验期间的每周浇水量。WLI-0处理(对照)接受推荐的将每周总的浇灌体积分成3次浇灌。WLI-1一周浇灌3次，但是浇水量是用于WLI-0的一半。在每周结束时，WLI-1植物接受达到最大土壤持水量所需水分的量。WLI-2植物仅在每周开始时浇灌，一周1次。水胁迫实验持续整个花期(23天)，相当于上述胁迫的4个循环。然后，所有处理都接受推荐量的水。计算的水量等于干土中的含水量和具有最大持水量的土壤中的含水量间的差异。在每个胁迫循环结束时，按照土壤的实际含水量，对各处理间的含水量进行了比较(S3)。在胁迫期间，处理WLI-1和WLI-2接受的水比对照(WLI-0)的共少了75％。

实验结果

转基因植物显示盐胁迫耐受性提高--为了引发盐胁迫，将转基因和对照番茄植物在田间试验时连续用180-200mM NaCl浇灌。如图3a-c、图3g-j和下表69中所示，Tom-ABST36植物在全部实验中显得比对照植物更有活力，对照植物较小，并出现叶和嫩枝坏死的严重症状(参见例如图3.j)。这还与Tom-ABST36植物比对照有较高的果实产量有关(图3a)。

表69

盐胁迫田间试验

表69：计算得到生长在田间盐胁迫条件(180mM NaCl)下的TOM ABST36与对照植物的总产量(吨果实/英亩)、植物鲜重(FW)和收获指数。结果是4件独立事件的平均值。后面接不同上标字母a、b值的一栏，表示显著不同。

转基因植物显示缺水胁迫耐受性提高--遭受缺水胁迫的转基因植物显示植物生物量比对照植物的显著较高(26％，p≤0.05)(图3e)。而且Tom-ABST36植物在缺水方案下(水分水平间隔WLI-1)果实产量显著增加(高达21％，p≤0.05)，而在正常浇灌条件下，产量改进甚至更高(27％，p≤0.05；图3d)。当植物生长在正常条件和WLI-1条件下时，Tom-ABST36植物的收获指数也较高，而当缺水方案由一周一次浇灌(WLI-2)构成时，与对照保持类似(图3f)。

得自3次田间试验的结果提供了强有力的证据，与对照植物相比，番茄Tom-ABST36植物显示盐胁迫耐受性和缺水胁迫耐受性得到改进，这就转化成植物生物量的显著增加，更重要的是果实产量显著增加。

拟南芥盐胁迫温室试验--用表达ABST36构建体的转基因拟南芥植物的补充实验表明，与对照植物相比，对150mM NaCl盐胁迫的耐受性提高，反映在42％较高的新鲜生物量和60％较高的干生物量(下表70)。

体外盐胁迫实验--将带有At6669::ABST36构建体或35S::GUS构建体(此用作对照)的转基因拟南芥植物的种子播种在含有用于选择的40mg/l卡那霉素的1/2MS培养基中。将选定幼苗在具有0或150mM NaCl的1/2MS培养基中进行再次培养。使植物生长3周时间。结果是在4次重复实验中进行分析的4件独立事件的平均值。为了测定嫩枝干重，采集嫩枝植物，在60℃下干燥24小时，然后称重。

表70

拟南芥盐胁迫实验

表70.在组织培养条件下生长在0和150mM NaCl中的拟南芥幼苗。所显示的是在正常条件(0mM NaCl)或盐分胁迫(150mM NaCl)下ABST36(SEQ ID NO：2827)转基因或野生型对照的鲜重(FW)和总干重(DW)(两者的单位均为毫克)。后面标不同上标字母a、b值的一栏表示在P＜0.05下显著不同。

尽管本发明结合其具体实施方案加以描述，但是十分明显的是，许多替换、修改和变化对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，本发明包括所有落入所附权利要求书的精神和广大范围内的这些替换、修改和变动。

本说明书所提及的所有出版物、专利、专利申请都通过引用全部结合到本说明书中，其程度与每个独立出版物、专利、专利申请具体而单独指明通过引用结合到本文中一样。另外，在本申请中任何参考文献的引用或标示都不得解释为承认这样的参考文献都可作为本发明的现有技术获得。就使用的每节标题而言，不应解释为必然限制性的。

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Claims

1.一种提高植物的非生物胁迫耐受性的方法，所述方法包括在植物中表达编码包含与选自以下的氨基酸序列有至少80％同源性的氨基酸序列的多肽的外源多核苷酸：SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065和3067-3259，从而提高植物的非生物胁迫耐受性。

2.一种提高植物的水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生长势和/或产量的方法，所述方法包括在植物中表达编码包含与选自以下的氨基酸序列有至少80％同源性的氨基酸序列的多肽的外源多核苷酸：SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065和3067-3259，从而提高植物的水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生长势和/或产量。

3.一种分离多核苷酸，所述多核苷酸包含与选自以下的核酸序列有至少80％同一性的核酸序列：SEQ ID NO：7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857和2859-3051。

4.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含权利要求3的分离多核苷酸和用于指导所述核酸序列转录的启动子。

5.一种分离多肽，所述多肽包含与选自以下的氨基酸序列有至少80％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065和3067-3259。

6.一种植物细胞，所述细胞包含具有与选自以下的氨基酸序列有至少80％同源性的氨基酸序列的外源多肽：SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065和3067-3259。

7.一种植物细胞，所述植物细胞包含含有与选自以下的核酸序列有至少80％同源性的核酸序列的外源多核苷酸：SEQ ID NO：7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857和2859-3051。

8.权利要求1或2的方法、权利要求3的分离多核苷酸、权利要求4的核酸构建体或权利要求7的植物细胞，其中所述多核苷酸选自SEQ ID NO：7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857和2859-3051。

9.权利要求1或2的方法、权利要求5的分离多肽或权利要求6的植物细胞，其中所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065和3067-3259。

10.权利要求1或2的方法、权利要求5的分离多肽或权利要求6的植物细胞，其中所述多肽选自SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065和3067-3259。

11.一种提高植物的非生物胁迫耐受性的方法，所述方法包括在植物中表达编码包含由SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065、3067-3258或3259所示的氨基酸序列的多肽的外源多核苷酸，从而提高植物的非生物胁迫耐受性。

12.一种提高植物的水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生长势和/或产量的方法，所述方法包括在植物中表达编码包含由SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065、3067-3258或3259所示的氨基酸序列的多肽的外源多核苷酸，从而提高植物的水分利用效率(WUE)、肥料利用效率(FUE)、生物量、生长势和/或产量。

13.一种分离多核苷酸，所述多核苷酸包含由SEQ ID NO：7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857、2859-3050或3051所示的核酸序列。

14.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含权利要求13的分离多核苷酸和用于指导所述核酸序列转录的启动子。

15.一种分离多肽，所述多肽包含由SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065、3067-3258或3259所示的氨基酸序列。

16.一种植物细胞，所述细胞包含具有由SEQ ID NO：33、34、30、27-29、31、32、35-52、1401-1403、1405-1435、1437-1494、1496-1542、1544-1553、1555-1559、1561-1827、1829-1866、1868-2450、2453-2458、2460-2463、2465-2481、2483、2485-2746、2765-2769、3052-3065、3067-3258或3259所示的氨基酸序列的外源多肽。

17.一种植物细胞，所述细胞包含含有由SEQ ID NO：7、8、4、1-3、5、6、9-26、53-55、57-87、89-147、149-195、197-206、208-212、214-480、482-519、521-1103、1106-1111、1113-1116、1118-1134、1136、1138-1400、2748-2764、2843-2857、2859-3050或3051所示核酸序列的外源多核苷酸。

18.权利要求1或11的方法，其中所述非生物胁迫选自盐分、脱水、低温、高温、重金属毒性、无氧生活、养分缺乏、养分过量、大气污染和紫外幅射。

19.权利要求1或11的方法，所述方法还包括使表达所述外源多核苷酸的植物在非生物胁迫下生长。

20.权利要求4或14的核酸构建体，其中所述启动子是组成型启动子。

21.权利要求6、7、16或17的植物细胞，其中所述植物细胞形成植物的组成部分。