CN1840664A - 受高盐诱导的盐藻基因片段和钠／磷共转运通道基因 - Google Patents

Abstract

本发明受高盐胁迫诱导的盐藻基因片段和一个盐藻Na⁺/H₂PO₄ ^－共转运通道基因的分离及鉴定属于基因工程领域。本发明所要解决的技术问题是提供盐藻受高盐胁迫诱导的差减cDNA文库、筛选盐藻受高盐胁迫诱导的cDNA片段及其基因。本发明公开了特征在于用抑制差减杂交法构建的盐藻受高盐胁迫诱导的差减cDNA文库及其构建方法；并公开了盐藻受高盐胁迫诱导cDNA片段及盐藻的Na⁺/H₂PO₄ ^－共转运膜通道蛋白cDNA、全长基因及其氨基酸序列。本发明的差减cDNA文库可以筛选盐藻在受高盐胁迫诱导时特异表达基因，为进一步分离盐藻响应盐胁迫相关基因的分离及耐盐分子机制的研究奠定了基础，有望将盐藻的Na⁺/H₂PO₄ ^－共转运膜通道蛋白基因用于利用植物基因工程提高作物的土壤磷利用效率。

Description

受高盐诱导的盐藻基因片段和钠/磷共转运通道基因

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，属于受高盐胁迫诱导的新的盐藻差减cDNA文库、基因片段的分离和一个受高盐胁迫和无机磷饥饿诱导表达的新的盐藻(Dunaliella viridis)的Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白基因及其编码的蛋白质。

背景技术

植物对渗透胁迫的反应是一个多基因控制的复杂过程。不同植物对渗透胁迫的反应也不尽相同，具有丰富的多样性。但是，对渗透胁迫的细胞水平的反应则似乎在整个生物界都是保守的(Yancey等.Living with water stress：evolution of osmolyte systems.Science 1982，217：1214-1222)。已有相当多的例子表明，从高等植物中获得的一些基因，往往是间接利用了从动物、低等植物、甚至是酵母、细菌中发现的该类同源基因才分离出来的。实际上，这些同源基因也经常被直接应用于转基因作物遗传改良中。

同样的道理，从一些生存于极端环境如高盐碱环境中的低等生物中，应该能较方便地分离得到与抗渗透胁迫相关的基因，这些基因很可能被直接或间接用于转化各种重要农作物。盐藻(Dunaliella viridis)就是一个具有这样特性的真核单细胞绿藻(Cowan.A.K等.Dunaliella salina：A model system for studying theresponase of plant cells to stress.J Exp Bot 1992；43：1535-1547)。它的抗环境胁迫的能力异乎寻常，是迄今所知的最耐盐的真核生物，可以在从接近淡水(NaCl＜50mM)直到饱和盐水(NaCl＞5M)的环境中生长。同时还具有极强的渗透调节能力，其细胞一次可以耐受3-4倍渗透压的变化(Sadka A等.A 150kilodalton cell surface protein is induced by salt in the halotolerantgreen alga Dunaliella salina.Plant physiol 1991；95：822-831)。因此，盐藻因其极强的耐受渗透胁迫和其它极端环境的能力被作为研究耐逆机制及其发掘抗逆基因的模式生物而倍受关注(Hans J.Bohnert等.A genomics approachtowards salt stress tolerance，Plant Physiol.Biochem.2001，39，295-311)。

抑制差减杂交(Suppression subtractive hybri dization，SSH)技术(Diatchenko L.等，Suppression subtractive hybridization：a method forgenerating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes andlibraries.Proc.Natl Acad Sci USA，1996，93(12)：6025-6030)是近年兴起并广泛应用于细胞生殖、发育、分化、癌变、衰老及程序化死亡等生命过程有关基因的差异表达以及相关基因的分子克隆的最有效的方法之一。

为了更好地从分子水平上对盐藻进行耐盐机制的研究、发掘可用于植物基因工程改良作物的抗逆基因资源，本领域迫切需要开发高盐胁迫诱导表达的基因及其编码蛋白。现有技术中没有盐藻高盐胁迫诱导表达的基因及其分离鉴定的报道。

发明内容

发明人进行了广泛的研究，利用当前的分子生物学技术如抑制差减杂交技术、基因芯片及生物信息学等构建了极端耐盐的模式生物盐藻(Dunaliellaviridis)受高盐胁迫诱导的差减cDNA文库，并从中克隆到10个新的受盐胁迫诱导的基因片段和1个Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白基因cDNA(DvSPT1)和基因组DNA(GDvSPT1)，并对DvSPT1基因进行功能分析。

根据上述的研究工作，本发明所要解决的技术问题之一是提供盐藻受高盐胁迫诱导的差减cDNA文库用于筛选盐藻受高盐胁迫诱导的基因。

本发明所要解决的技术问题之二是提供盐藻受高盐胁迫诱导的差减cDNA文库的构建方法。

本发明所要解决的技术问题之三是提供盐藻受高盐胁迫诱导的cDNA片段。

本发明所要解决的技术问题之四是提供盐藻的Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白基因的cDNA序列及其全长基因序列。

另外，本发明所要解决的技术问题是提供盐藻的Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白的氨基酸序列。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

采用本领域常用的抑制差减杂交法构建盐藻高盐胁迫诱导的差减cDNA文库。优选地盐藻在低盐条件下培养，用抑制差减杂交法构建差减cDNA文库。优选地，盐藻在低盐条件下培养，然后经4倍渗透压的高盐胁迫诱导，盐藻从0.5M NaCl到2.0M NaCl诱导24小时，用抑制差减杂交法构建差减cDNA文库。

盐藻高盐胁迫诱导的差减cDNA文库的构建方法包括如下步骤：

(a)盐藻从低盐到高盐胁迫诱导；

(b)提取盐藻诱导前后的mRNA；

(c)将(b)所获得的mRNA反转录合成cDNA，诱导后的cDNA为测试cDNA(Tester cDNA)，诱导前的cDNA为参照cDNA(Driver cDNA)；

(d)将Tester cDNA和Driver cDNA均用RsaI酶切产生较短的平末端片段；将Tester产物分成两等份，分别与不同的接头(Adaptor 1和Adaptor 2R)连接，而Driver cDNA不与接头连接；

(e)两份Tester(Tester cDNA-Adaptor 1和Tester cDNA-Adaptor2R)分别与Driver cDNA混合，进行第一次差减杂交；

(f)将(e)的两份杂交产物未经变性即进行混合，并加入过量Driver cDNA混合，进行第二次差减杂交；

(g)接头末端填平；

(h)抑制性PCR扩增差异表达的序列；

(i)用巢式引物(Nested Primer)进行第二轮PCR扩增，使差异表达的片段得到富集；

(j)将(i)的扩增产物插入克隆载体，转化感受态细胞，构建盐藻高盐胁迫诱导的差减cDNA文库。

其中，提取盐藻诱导前后的mRNA、反转录合成cDNA的方法在本领域是公知的，而且有商品化的产品可以使本领域的普通技术人员方便地实施之。通常将靶序列所在的样本称为检测样本(Tester)，而把用于参照的样本称为参照样本(Driver)。在本发明中，盐藻诱导后的mRNA即为测试样本(Tester)而诱导前的mRNA即为参照样本(Driver)。RsaI为四碱基位点(GTAC)识别酶，可以将由mRNA而来的双链cDNA酶切为几个片段并产生平末端，增加了差异表达基因检出的几率、防止长链cDNA片段所形成的复杂结构对有效差减杂交的干扰。接头(Adaptor 1和Adaptor 2R)是由一长链(约40余个核苷酸)和一短链(约10余个核苷酸)组成的一端是平末端的双链DNA片段，而且双链两个5’端均无磷酸基团，保证了接头以唯一的方向与cDNA片段连接即接头长链的3’端与cDNA的双链5’端连接。接头长链外侧序列与第一次PCR引物序列相同，内侧序列与第二次PCR引物序列相同。在接头上含有T7启动子序列并含有内切酶识别位点(如Not I、Srf I、Sma I、Xba I)，为以后该片段插入克隆载体提供酶切位点。接头(Adaptor 1和Adaptor 2R)的序列对本领域的普通技术人员来说是公知的，或者采用商品化的产品。

在本发明构建盐藻差减cDNA文库的步骤(h)中选用与接头(Adaptor 1和Adaptor 2R)外侧端核苷酸序列相同的引物进行抑制差减PCR扩增。在步骤(i)中选用一对与接头内侧端核苷酸序列相同的引物进行第二轮PCR扩增。这样经过两轮PCR、基于PCR抑制效应的存在以及选用两对引物可以特异扩增代表了盐藻经高盐胁迫诱导的差异表达的cDNA片段。基于上述描述，接头(Adaptor1和Adaptor 2R)的序列对本领域的普通技术人员来说是公知的，或者采用商品化的产品，因而步骤(h)和(i)所选用的引物对本领域的普通技术人员来说是公知的，或者采用商品化的产品。PCR扩增选用本领域常用的条件。

接头上含有酶切位点，因而利用本领域公知的方法可以方便地实现将上述PCR产物插入克隆载体。用本领域常用的方法将插入了PCR产物的克隆载体转化感受态细胞。

其中步骤(a)高盐胁迫诱导盐藻的方法是：盐藻在低盐条件下培养，然后经4倍渗透压的高盐胁迫诱导。在本发明的一个实施例中，盐藻在含有0.5M NaCl的DM培养基中培养，然后在含有2.0M NaCl的DM培养基中诱导24小时。

利用接头引物(步骤(h)和步骤(i)的引物)对上述差减cDNA文库的部分克隆进行PCR鉴定。以差减cDNA第二轮PCR产物为探针，用d-³²p dCTP标记，通过Micro-Array技术对所得到上述差减cDNA文库的克隆做进一步鉴定，其中有11个cDNA克隆其表达明显地受高盐胁迫诱导而增强表达，并对这些克隆进行了测序和BLASTX分析。

因而，本发明提供了盐藻受高盐胁迫诱导的cDNA片段，SEQ ID NO：1～11。其中SEQ ID NO：8编码了一个已知的叶绿素a/b结合蛋白(chlorophyll a/bbinding protein)，其余包括SEQ ID NO：1～7及SEQ ID NO：9～11在基因库(Genbank)中无同源序列发现，均为可能的新基因。

本发明的另一方面，利用盐藻高盐胁迫诱导的差异cDNA片段(SEQ IDNO：1)为探针筛选盐藻cDNA文库，得到1个特异阳性克隆，测序鉴定结果表明，cDNA全长是2649bp，含有绿藻基因特异的加尾信号TGTAA(Andrens HW等，Primary structure of the plasma membrane H-ATPase from the halotolerantalga Dunaliella bioculata.1995，Plant Mol Biol，28：657-666)及poly(A)结构，命名为DvSPT1，SEQ ID NO：12，系编码盐藻(Dunaliella viridis)的Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白的全长cDNA。其中79～2097编码盐藻的Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白。

在本发明的说明中，盐藻cDNA文库是指用本领域常用的方法提取盐藻mRNA，然后反转录成cDNA，然后插入克隆载体并转化感受态细胞而得到的代表盐藻基因表达的cDNA文库。而盐藻差减cDNA文库指本发明用抑制差减杂交法构建的盐藻受高盐胁迫诱导前后的差异表达cDNA文库。

本发明另一方面还提供盐藻(Dunaliella viridis)的Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白，命名为DvSPT1，其氨基酸序列为SEQ ID NO：13。

本发明还提供了盐藻Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白的全长基因，命名为GDvSPT1，SEQ ID NO：14。

本发明还提供了编码盐藻的Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白的基因序列，SEQID NO：15。由于密码子具有简并性，因而本发明的范围不限于SEQ ID NO：15的序列，应延及其编码Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白的任一核苷酸改变。

利用本发明提供的盐藻受高盐胁迫诱导的差减cDNA文库可以筛选盐藻在受高盐胁迫诱导时特异表达基因，如本发明的一个实施例筛选获得了编码盐藻的Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白的基因，SEQ ID NO：12。因而利用本发明的成果能更好地从分子水平上对盐藻进行耐盐机制的研究和发掘可用于植物基因工程改良作物的抗逆基因资源。利用本发明的构建盐藻受高盐胁迫诱导的差减cDNA文库的方法及构建的差减文库可以快速、高效、高度灵敏地同时分离几十甚至几百个差异表达的基因。

本发明人提供的利用上述差减cDNA文库分离获得的受盐胁迫诱导表达的基因片段SEQ ID No.1～11，除SEQ ID No.8以外，均为新基因片段，这为进一步分离盐藻响应盐胁迫相关基因的分离及耐盐分子机制的研究奠定了基础。

另外，本发明提供的Na⁺/H₂POx^-共转运膜通道蛋白的基因DvSPT1基因cDNA及基因组序列GDvSPT1是首次从盐藻中分离的新基因，其编码了一个Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白，这个基因受高盐胁迫和无机磷饥饿诱导特异表达，在盐藻响应逆境胁迫过程中起到重要的作用。由于该基因编码的通道蛋白DvSPT1为一个受无机磷饥饿诱导而快速增强表达而提高细胞无机磷的吸收和运输，有望将该基因用于利用植物基因工程提高作物的土壤磷利用效率和分离得到一个受逆境特异诱导的启动子原件。

附图说明

图1显示了盐藻Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白DvSPT1 cDNA序列及其编码的氨基酸序列分析。

图2显示了盐藻DvSPT1的氨基酸序列及同源蛋白的同源性比较分析，图2A显示的是N端同源性比较，图2B显示的是C端同源性比较。

图3显示了盐藻Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白全长基因(GDvSPT1)5’-启动子区(图3)。

图4显示了盐藻DvSPT1基因在高盐胁迫(图4A)和无机磷饥饿(图4B)条件下的Northern表达分析。

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件和Sambrook等《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)或Melody S.Clark编《植物分子生物学—实验手册》(PlantMolecular Biology：A Laboratory Manual)(Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)或迪芬巴赫(Dieffenbach，C.W)等《PCR技术实验指南》(PCR Primer：ALaboratory Manual)(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2003，第二版)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。在描述了本发明和详细描述了这些具体的实施方式之后，本领域的普通技术人员会充分知晓如何设计其它可靠的方法，从而通过应用本发明的成果获得同样的信息，因此无论描述得如何详细具体，都不应理解为限制本发明的总体范围。本发明的范围仅为权利要求所记载的法律结构所确定。

具体实施方式

实施例1盐藻受高盐胁迫诱导的差异cDNA文库的构建及初步鉴定

取在含有0.5mol/L NaCl的DM培养基(Sun Y等，Expression of foreigngene in Dunaliella by electroporation，Molecular Biotechnology，30(3)(2005)185-92)中稳定培养的盐藻细胞和再将上述培养状态的盐藻转移到2mol/L NaCl浓度的培养基DM中继续渗透振荡培养24小时后的盐藻细胞提取mRNA(Oligotex^TM mRNA Kit，QIAGEN)。按试剂盒(PCR-selected^TM cDNAsubtraction kit，clontech)要求，每一个样品需要2μg的mRNA，由于纯化的mRNA样品中有少量rRNA的残留，各取了2.4μg在两种状态下获得的mRNA样品，进行相应的cDNA合成。为了很方便的检测合成效率，在反应中加入1μl以1/10稀释的10mCi/ml，3000Ci/mmol的[α³²-P]dCTP。第一链cDNA合成完成后，取出置于冰上终止第一链cDNA合成反应，立即进行第二链的合成。然后纯化回收合成好的cDNA，并用盖革计数器(Geiger counter)监测沉淀的放射性以初步确认合成效率，再电泳检测合成cDNA片段的大小和效率。结果表明合成的cDNA主要集中分布在500bp到4000bp的范围内，质量好。

然后，选用四碱基识别位点(GTAC)并产生平头末端的RsaI酶对合成好的cDNA进行酶切，酶切产物电泳检测主要集中在200bp-1000bp的范围。

将酶切样品取部分作为Tester cDNA，并且每一份样品分作两份，分别连接上有一段同源序列的接头(Adaptor 1和Adaptor 2R)。其余的经过酶切的诱导前的cDNA样品则作为Driver cDNA。连接反应完成后，取少量样品进行连接效率检测，样品内源激动蛋白的连接效率基本上＞25％，说明连接反应是成功的。

将以上两端分别连有Adaptor 1和Adaptor 2R的cDNA作为Tester cDNA(2.0M)，与对应的Driver cDNA(0.5M)进行两轮差减杂交反应，富集得到由0.5M到2.0M NaCl渗透振荡时特异表达或受诱导的基因片段。将两轮差减杂交下来的cDNA群体经过末端补平后，即进行PCR扩增。在进行第一次PCR扩增之前，首先需要把cDNA的末端填平，以产生PCR Primer 1的结合位点。由于Adaptor1和Adaptor 2R的5’端有一个长22个碱基的相同片段，因此第一次PCR扩增时仅需使用一个引物，这就解决了引物聚合的问题。另外，对于这些两端连有不同Adaptor的差异表达分子而言，这个相同的片段就造成了一种抑制PCR效果，由于短分子更易形成环状结构，因此这种抑制效果对于非常短的cDNA(200bp以下)而言尤其明显。这样就大大的提高了长分子的含量，从而平衡差减过程中由短片段更易杂交、扩增和克隆而造成的潜在优势。第一次扩增后，只有两端含有不同Adaptor的ds cDNA片段能以指数形式扩增。然后再用与接头内侧序列互补的另一对巢式引物进行第二次PCR扩增，以进一步降低背景、富集差异表达的cDNA片段。

将经过第二次扩增的PCR产物直接与pMD18-T Vector(TaKaRa)进行连接，转化大肠杆菌DH5α热激感受态细胞，构建了1个代表了盐藻受0.5M～2.0M高盐渗透诱导过程中特异表达基因片段的差减cDNA文库(SSH cDNA文库)。利用接头引物(Nested PCR primer 1，Nested PCR primer 2R)对SSH文库的部分克隆进行PCR鉴定，其插入片段的平均大小为300bp左右。

以差减cDNA第二轮PCR产物为探针，用α-³²p dCTP标记，通过Micro-Array技术对所得到的SSH cDNA文库384个克隆做进一步鉴定，每张膜上的矩阵分布为8*2，即每一个克隆在一个矩阵里有两个重复。根据杂交信号的强弱，其中有11个cDNA克隆其表达明显地受高盐胁迫诱导而增强表达，并对这些克隆进行了测序和BLASTX分析(表1)。SEQ ID NO：1～11参见序列表SEQ ID NO：1～11。其中SEQ ID NO：8编码了一个已知的叶绿素a/b结合蛋白(chlorophyll a/bbinding protein)，其余包括SEQ ID NO：1～7及SEQ ID NO：9～11在基因库(Genbank)中无同源序列发现，均为可能的新基因。

实施例2盐藻Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道基因的分离及序列分析

(a)盐藻Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道基因全长cDNA的克隆及序列分析

通过利用SSH差异片段CP1A60(SEQ ID NO：1)为探针筛选盐藻cDNA文库，得到1个特异阳性克隆，测序鉴定结果表明，cDNA全长是2649bp(SEQID NO：12)，含有绿藻基因特异的加尾信号TGTAA(Andrens HW等，Primarystructure of the plasma membrane H-ATPase from the halotolerant algaDunaliella bioculata.1995，Plant Mol Biol，28：657-666)及poly(A)结构，命名为DvSPT1。Vector NTI8.0软件的分析结果显示，最长读码框编码了一个含672个氨基酸的蛋白(图3)(SEQ ID NO：13)，蛋白分子量大小为73.3kDa，蛋白分子量大小为73.4kDa，等电点为5.29的酸性蛋白，命名为DvSPT1。

                          表1 SSH阳性克隆及可能编码蛋白

SEQ ID NO	SSH克隆编号	片段长度(bp)	BLASTX
				SEQ ID NO：1	CP1A60	241	Unknown
SEQ ID NO：2	CP1E4	349	Unknown
				SEQ ID NO：3	CP1F1	257	Unknown
SEQ ID NO：4	CP2F6	375	Unknown
				SEQ ID NO：5	CP2F7	238	Unknown
SEQ ID NO：6	CP3B2	496	Unknown
				SEQ ID NO：7	CP3D1	287	Unknown
SEQ ID NO：8	CP1E6	290	chlorophyll a/b binding protein
				SEQ ID NO：9	CP2B2	517	Unknown
SEQ ID NO：10	CP2A10	242	Unknown
				SEQ ID NO：11	CP2A6	321	Unknown

序列分析显示，CP1A60处在全长cDNA的3’端非翻译区的2064-2304bp处，可见，所获得的SSH cDNA片段并不在基因编码区而在多变的非编码区。

利用BLASTP程序对DvSPT1预测得到的氨基酸序列分析发现，该蛋白与其它物种来源的无机磷通道中的钠/磷共转运膜通道蛋白同源性较高(图2)，如：周氏扁藻的TcPHO，衣藻的B₂型磷通道蛋白(BAB96548)，酵母的高亲合性钠依赖型磷通道蛋白PHO89(NP-009855)，链孢霉的高亲合性钠依赖型磷通道蛋白PHO4，白血病病毒受体高亲合性钠依赖型磷通道蛋白Na-Pi III(AAA52572)等。其中，DvSPT1编码的蛋白同周氏扁藻TcPHO同源性最高，同源性可以达到31.2％，其次是衣藻的B₂型磷通道蛋白，同源区段主要集中在N端和C端的跨膜区域(图2)。进一步对所编码的蛋白进行跨膜区的预测( http：//www.ch.embnet.org/)显示，DvSPT1蛋白为包含11个跨膜区的膜蛋白(图1，图2)，与以往描述的其它物种来源的无机磷通道蛋白有10-12个跨膜区的特征十分相似。但需要指出的是，DvSPT1的11个跨膜区呈不对称分布，7个跨膜区分布在N-端，4个跨膜区分布在C-端，这与其它物种中发现的跨膜区通常呈对称分布不同。

此外，DvSPT1这个蛋白中含有二段7个氨基酸残基的保守重复序列-GANDVAN-(图1，图2)，与所有已报道的磷转运通道蛋白中几乎包含两段-GANDVAN-保守序列的特征非常一致。DvSPT1的两段-GANDVAN-保守序列处在N端的第一和第二跨膜区之间(57-63Aa)和C端的第八跨膜区(405-411Aa)处。

(b)盐藻Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道基因全长基因组序列的克隆及序列分析

用CP1A60(SEQ ID NO：1)为探针，从盐藻的基因组文库(Yang Zhiyong等，Construction of a genomic DNA library of Dunaliella viridis.ActaPhytophysiologica sinica 26(2000)75-78)经过两轮筛选得到1个特异的噬菌体克隆(λGDvSPT1-1)。提取噬菌体DNA，SacI酶切电泳，利用DvSPT1全长cDNA为探针进行Southern分析，杂交后只有一个单一的杂交带(～8kb)，说明这个杂交片段已完全覆盖了DvSPT1的cDNA全长序列。

将与DvSPT1全长cDNA杂交的λGDvSPT1-1^#单一片段亚克隆并进行了测序，结果显示，得到的基因序列全长为7925bp，包括位于第一翻译起始密码子上游的1321bp的5’启动子序列(图3)，同时也包括终止密码子下游的1921bp的3’端终止序列。将DvSPT1cDNA序列与得到的基因全长序列通过GCG网站的BESTFIT程序进行分析，这个片段确实完全覆盖了DvSPT1的编码区域，因此将这个基因命名为GDvSPT1(SEQ ID NO：14)。该基因包括20个外显子(平均大小132bp)和19个内含子(平均大小185bp)，所有内含子的5’端都是GT，3’端都是AG(表2)(Shapiro，M.B.等，RNA splice junctionsdifferent classes of eukaryotes sequence statistics and functionalimplications in gene expression.Nucleic Acids Res.15(1987)7155-7174)。

网上( http：//genes.mit.edu/McPromoter.html)预测(图3A)显示，GDvSPT1基因启动子核心区域包括了一段50个碱基的序列，这段序列的起始点在-40bp处，在+10bp处终止，其中包括了可能的TATA box序列(TATAA)和转录的起始位点

如果将转录起始位点 定义为该基因序列的“+1”，其编码区的第一个可能的起始密码子ATG就位于在+462～+464bp处。值得注意的是，一个受Pho4p结合的核心序列(CACGT)(Uthappa T.Mukatira等，Negative regulation of phosphate Starvation-induced genes.PlantPhysiology.127(2001)1854-1862)位于-711～-715bp的位置，而Pho4p在酵母中研究的比较清楚，这提示从盐藻克隆的这个基因很可能也是受PHO调控系统的调节。而且，CACGT这个顺式元件也是植物界一个与逆境相关的极其保守的调控元件(Heinemeyer T.等，Databases on transcriptionalregulation：TRANSFAC，TRRD，and COMPEL.Nucleic Acids Res.26(1998)364-367)，表明所分离的这个基因跟适应外界逆境具有极为密切的关系。

实施例3盐藻Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道基因在高盐胁迫和无机磷饥饿条件下的诱导表达

(a)盐藻Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道基因在高盐胁迫条件下的诱导表达

为了研究DvSPT1这个基因在盐藻细胞体内转录水平及与盐浓度之间的相关性，首先将盐藻细胞在含1.0M NaCl的DM培养基中进行培养，在2×10⁶cell/ml的时候收集细胞，然后将其转移至含有2.0M NaCl的新鲜DM培养基中继续培养，分别在含有2.0M NaCl的新鲜DM培养基中继续培养0分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时、9小时、12小时和24小时，然后提取盐藻细胞总RNA，采用α-³²P-dCTP标记的DvSPT1(2121bp-2633bp)的3‘端特异片段(PCR扩增引物：DvT1RTS：5’-ccctgttccactcactgc-3’(SEQ ID NO：16)，DvT1RTA：5’-gaacaggggtggtgcttaca-3’(SEQ ID NO：17)，)为探针进行Northern分析(图4A)。结果表明，盐藻细胞经历1.0M NaCl→2.0M NaCl高渗振荡后，DvSPT1基因受到诱导而表达增强。从杂交信号可以看出，这两个基因的表达模式基本一致，在高渗振荡1小时后2小时之前就开始受到诱导，而且到3小时快速积累到最高的转录水平。随着诱导时间的延长，转录水平又逐渐降低，到24小时基本降低到正常培养条件下的表达水平。

(b)盐藻Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道基因在无机磷饥饿条件下的诱导表达

为了进一步研究DvSPT1这个基因的表达水平是否受到无机磷饥饿的诱导，将生长在含有2.0M NaCl的DM培养基(0.2mM KH₂PO₄)中的盐藻细胞，在其生长达到2×10⁶cell/ml的时候收集，然后用新鲜的无磷培养基洗涤细胞两次，再重悬于无磷的等渗培养基中继续培养，分别取继续培养0小时、1小时、3小时、6小时、18小时和36小时的盐藻细胞提取总RNA，同上述相关实验一样，用α-³²P-dCTP标记的DvSPT1的3‘端特异片段为探针进行Northern分析(图4B)。结果显示，DvSPT1的转录水平在无机磷饥饿处理1小时的时候开始受到明显的诱导，在6小时转录水平达到最高，到18小时往后表达水平逐渐回落到一较为恒定的表达水平。Meira Weiss等(Meira Weiss，Gal Haimovich，Uri Pick，Phosphate and sulfate uptake in thehalotolerant alga Dunaliella are driven by Na⁺-symport mechanis m.J.Plant Physiology 158(2001)1519-1525)诱导动力学研究结果显示盐藻在无机磷饥饿3～6小时才可以检测到无机磷的诱导吸收，这种诱导吸收主要是依赖于吸收速率的增加而不是Km值的变化，因此他们推测无机磷的诱导吸收是由于管家基因的诱导合成起作用而不是新的转运系统的诱导产生。研究结果显示DvSPT1在无机磷饥饿诱导6小时转录水平达到最高，这与Meria W.等所得到的动力学结果正好相符合，可以推断，无机磷的诱导吸收是发生在无机磷转运通道诱导转录完成之后或转录产物积累到一定的量的时候才开始的，这时候重新合成的转录产物经过翻译和后加工产生了足够的无机磷转运蛋白来增加细胞对环境中有限的无机磷的吸收来满足正常的生长需要。

表2盐藻Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道基因(GDvSPT1)内含子和外显子组成

Intron	5’exon/intron	3’intron/exon	Intronsize(bp)	Preceding exonsize(bp)
					Intron 1Intron 2Intron 3Intron 4Intron 5Intron 6Intron 7Intron 8Intron 9Intron 10Intron 11Intron 12Intron 13Intron 14Intron 15Intron 16Intron 17Intron 18Intron 19Totalaverage	GGCAAGgtgagcgcgGGCAAGgtgagcgacCCACAAgtgagcactTGCGTGgtgggtgccCCCCAGgtatttcttCTGCAAgtgagtagcGATGAGgtgagaccaCACCAGgtgtgtgccCTGAAGgtgagcagaGCTCCAgtgagtctcTGAAGAgtgagtgatACTGAGgtgggtttcTATCTGgtaagtgaaATTGCGgtgagtattGTTGTGgtgagtgatCCATCGgtgagtgtgCTCCTTgtgagtcacCCATGGgtaagttctAACGAGgtaagctgt	cacgcacagGCGAGAgtcctgcagTGGTCTgtcctgcagTGGTCTgcatcacagATTGCGaacctgcagATTTTTtttccgcagTTGGGTtccctgcagTTCCCCctcctgcagGATTGTcacgtgcagAGTGTGggcctacagGGAGGAcgcctgcagACTTTGctcttgcagGATGTGttcctgcagGGACACttcctgcagACCCTGcccttgcagACTGGCttcctgcagGTGTGTgttctgcagGACCGAtccttgcagGTGACCtgtgcgcagTACAAC	221bp258bp236bp267bp174bp166bp164bp160bp119bp196bp230bp149bp134bp147bp125bp272bp160bp160bp186bp3524bp185bp	151bp29bp100bp41bp108bp100bp74bp98bp106bp140bp179bp110bp101bp123bp123bp142bp95bp100bp71bp645bp2636bp132bp

                                    序列表

<110>上海大学

<120>受高盐胁迫诱导的盐藻基因片段和一个盐藻Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运通道基因的分离及鉴定

<160>17

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>241

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>1

gtacgagaac gtgtctgagc agaccatgcc ttaattctga agtcttgaca atcttttccc     60

tgttccactc actgcactct tgctcttcag ttaccaattc atcctttttg aagtcttgct    120

tttgttctga gattgaacac taagcatgac ccgttctgtt gtgttcacat agccatatca    180

tttagtcagg tgttgtggct ggttcatatc ctgaccaaat ttagatctat tgctggtatt    240

g                                                                    241

<210>2

<211>349

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<220>

<221>misc_feature

<222>(174)..(175)

<223>n is a，c，g，or t

<220>

<221>misc_feature

<222>(213)..(213)

<223>n is a，c，g，or t

<220>

<221>misc_feature

<222>(227)..(227)

<223>n is a，c，g，or t

<400>2

cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca     60

ccattccaca ccacatacga gccggaagca taaagtgtaa aagctggggt gcctaatgag    120

tgagcttact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc ttccagtcgg ggannctgtc    180

gtgccagctg cattaatgat ccgccaacgc gcngggagag gccgttngcc tattgggcgc    240

tcttccggct tcctcgctca ctgactcgct gcggctcggt cgtttcggct gcggcgagcg    300

gtatcagctc actcaaaggc ggtattacgg gttattccac gaaatcagg                349

<210>3

<211>257

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>3

acaaacagga tgcattattc tcagatgcaa gtcacagatg cgagtcacaa aataccacca     60

ggaaacaaga cgagctgcac atcaaacggg cagcaaagaa tagtattgag ttcagtgcac    120

agcacacatc cccaagccaa tggaaggtgt gtatgatctc aagccacagt tcggaaatcc    180

aaggggagtc cgcatgtgca tacagcattt atgaattgag tgaagcatac caatgaaatt    240

ccaattcagt tgtatgt                                                   257

<210>4

<211>375

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>4

acaggattgg gctagcttgg tcaggagcgt aactctgttt tgtgctgaga gttctgcttt     60

aggcagcagg cacgcttgca tgagcagccc agttggatcc atttccaagc atgactcggt    120

tagcgcagtg ccaggcctaa taacagcact gttgctttcc aggtgcgcgg ttagagaaga    180

gatgcacaca ttttgatgcc tgaataaact tgggaggcca tatctaggtc tgtgattttg    240

aacgggaagg gcagcttgct ctagaatttg aggtgtgata accttattat tttgctcggg    300

acccgtcttg gcagctctct cccgctggat tgtcatgcat agaaacatgt gtgttcatcg    360

gcgtgctttt aaagt                                                     375

<210>5

<211>238

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>5

accacataac accaaggtcg taaatatcta caaggatcca ctttcaggat ccccgccttg     60

agtgcctgtc tctctcccga cagcttctac tactggcact actctctgcc tacccagcaa    120

tgccagctca gacacagagc tctaggtccc agctacaact acacctgcaa actacctagg    180

aaataatcta atctagacct cggccgcgac cacgctaatc tctagaggat ccccgggt      238

<210>6

<211>496

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>6

acattcgcat gcgtcctttg tgtgcaccac caactctcca tccagtccct gctcatccct     60

gtccttgtgt gtatgtgtgt gaggtgtttg aaactgtggc atctgtgcgt gtatgatgct    120

catgcgcagc gtggaaatgc acagatgtgt tcgcgtgtgc atgcctcagt gtgtgtgctt    180

gtaggccagg gaccccctgt agttgcctgg cacaaaaatg caatccctgc atctgccaat    240

gttgcagacg taggcaggga aggctgagaa gaacactctt aataggcctt tcccatgttt    300

cgcgcatgtc caagcattcc aagatgatcc tgcttgctct gttttcattt catggagacc    360

tcgacctagc ttgtttctct ctctgctaca ttgcacggat gagtgtgtgt gtgtgtgtgt    420

gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgttgtc ttcccgctca tatataagtg    480

caattatatg taaaaa                                                    496

<210>7

<211>287

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>7

acatgctgag gcagatcaac agcctgttca agttcacctt cttccccaga aacttctccg     60

agttcgcggg cgcttctaac cagaccgttc cctagattag attatttcct aggtagtttg    120

caggtgtagt tgtagctggg acctagagct ctgtgtctga gctggcattg ctgggtaggc    180

agagagtagt gccagtagta gaagctgtcg ggagagagac aggcactcaa ggcggggatc    240

ctgaaagtgg atccttgtag atatttacga ccttggtgtt atgtggt                  287

<210>8

<211>290

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>8

acccaggcga ggccttcgac ccccctgggc ctggctgatg accctgacac cttcgctgag     60

ctgaaggtca aggagatcaa gaacggccgt ctggctatgt tetcttgcct aggcttcttc    120

gtccaggcca ttgtgaccgg caagggcccc attgagaacc tgatggacca cctggccaac    180

cccgctgaga acaacgcctt cgccttcgcc accaagttca cccccaacgc ataaatgccg    240

gactctccct cccgatagta gttttcaatg taatgtaggt ctccagctgt               290

<210>9

<211>517

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<220>

<221>misc_feature

<222>(491)..(491)

<223>n is a，c，g，or t

<220>

<221>misc_feature

<222>(510)..(510)

<223>n is a，c，g，or t

<400>9

aactgcatgc ctgcatgtcg acgattagcg tggtcgcggc cgaggtaagg tgtttgagcc     60

gcttgttgtg cttggaggca tcggccttgg cctcgctgcc tatgccctca agctcaagta    120

aggggtatgc tcgattcatg gctgtgttga acctctgaga gtttgcacct gagagtgact    180

tcaagcccaa ttggctggtt tgatttgagt gtagaaatgg tgatcacgtg atccatccag    240

ctttttccct tttcctttct tgtgctttgg acttaagttg cttcgagaaa ctttggcctt    300

tttatggcga gcttattcat tgtgcgctct gtgagcagct gaccacttca gtgaagctgg    360

acgcctgtgc tttattacgt tcatctactt gttggactgc taggtgtttt cagcacgtta    420

tgctgttaat tgattttggg attttatatg aacaggctga gaagtctgga tctgcatgcg    480

tgcacttgag nggactgagt taatgtgaan ggttgtt                             517

<210>10

<211>242

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>10

actaagcgca ccaccacgtg ctcctgttag cttggcccca tcagtcccca gcctctacta     60

gatgacgtat gtgacacctg aagtgtgtgg gtttgtggtg tggccctgca cttgctgttg    120

cccaacgcgg cacaggcagt gagggtatgt aggtttactt cttgactgca gcagcagtgt    180

tctgcagttc gtgaagtggt gaggcagtgg atgtgtgttg caaacgcacc atcgctgcgt    240

gt                                                                   242

<210>11

<211>321

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>11

acaagctctc tcgttggcca ctcgataaca ccaacccagt gcagaaacaa taataaaatt     60

ggcaatggaa atgctgtgca ttagagcaca tggagtggcc tttattcatc acagggctct    120

ggaaacaagc ttgctcacat cttactgttc aggatgcacc ttgttagcct ccttagtggc    180

ttccacgtcc gactttccac tgtcgctttc acctgctaga agcttctcat acgcagcctt    240

gccacgcatt gacctactct ccatggcaaa ccgcagaacc tgcccgggcg gccgctcgaa    300

atctctagag gatccccggg t                                              321

<210>12

<211>2649

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<220>

<221>CDS

<222>(79)..(2097)

<400>12

cttgtacatc ggtgcacgca ccgagcccct ccccaccgcc acttcgtctg cgaaagcagg     60

aggggtaggc acgcagcc atg acg gac gtg gac agc ttc agc ggc aac atg      111

                    Met Thr Asp Val Asp Ser Phe Ser Gly Asn Met

                    1               5                   10

ccc aac ctc tcg ggc ttt gag tcc gca gcg ggc tgg caa ggc gag aac      159

Pro Asn Leu Ser Gly Phe Glu Ser Ala Ala Gly Trp Gln Gly Glu Asn

            15                  20                  25

ttc acc tac cac gat ggc aag tgg tct gcc tac gtg tgg ctg ctg gtc      207

Phe Thr Tyr His Asp Gly Lys Trp Ser Ala Tyr Val Trp Leu Leu Val

        30                  35                  40

atc ggc tcc ttc acc tca ttc atg gct gca tgg ggc atc ggt gcc aac      255

Ile Gly Ser Phe Thr Ser Phe Met Ala Ala Trp Gly Ile Gly Ala Asn

    45                  50                  55

gat gtg gcc aac tcc ttc gcc aca agt gtg ggc tcc aag gct ttg acc    303

Asp Val Ala Asn Ser Phe Ala Thr Ser Val Gly Ser Lys Ala Leu Thr

60                  65                  70                  75

atg ttc caa gcc tgc gtg att gcg ggc atc ttt gaa ttt gtc ggc gct    351

Met Phe Gln Ala Cys Val Ile Ala Gly Ile Phe Glu Phe Val Gly Ala

                80                  85                  90

gtg tcc ctg ggt ggt act gtt gtg aag acc gtg aag ggc tcc atc act    399

Val Ser Leu Gly Gly Thr Val Val Lys Thr Val Lys Gly Ser Ile Thr

            95                  100                 105

gac ccc tca atg ttc aag cac cag ccc cag att ttt gcg tac ggc atg    447

Asp Pro Ser Met Phe Lys His Gln Pro Gln Ile Phe Ala Tyr Gly Met

        110                 115                 120

ctt ggt gcc tct act tct gta gcc att gtg ctc ttc ctg gcc aca tac    495

Leu Gly Ala Ser Thr Ser Val Ala Ile Val Leu Phe Leu Ala Thr Tyr

    125                 130                 135

ttg aag cag gct gtg tcc acc aca cac act gca att ggg tct gtg ctt    543

Leu Lys Gln Ala Val Ser Thr Thr His Thr Ala Ile Gly Ser Val Leu

140                 145                 150                 155

ggc ttc ggc ttg gtg tat gga ggc gct gat ggt gtg acc tgg aac gag    591

Gly Phe Gly Leu Val Tyr Gly Gly Ala Asp Gly Val Thr Trp Asn Glu

                160                 165                 170

gtg tcc gat gag ttc ccc ttc cgc aag ggg ttc aca cct gtc gtc atc    639

Val Ser Asp Glu Phe Pro Phe Arg Lys Gly Phe Thr Pro Val Val Ile

            175                 180                 185

tcc tgg ttc gtc tcc ccc gtc ttc act gcc att ctg tcc tcc gga ttc    687

Ser Trp Phe Val Ser Pro Val Phe Thr Ala Ile Leu Ser Ser Gly Phe

        190                 195                 200

ttc atc atc acc agg att gtc tgc ctg cag cgc cag caa tcc tac aag    735

Phe Ile Ile Thr Arg Ile Val Cys Leu Gln Arg Gln Gln Ser Tyr Lys

    205                 210                 215

att gcc ttc ttc atg atc cct gtg ctg atg atg atc acc atc ttc att    783

Ile Ala Phe Phe Met Ile Pro Val Leu Met Met Ile Thr Ile Phe Ile

220                 225                 230                 235

gtc ctg ctg gcc atc ttc ctg aag agt gtg gac tct gga cac gac cgt    831

Val Leu Leu Ala Ile Phe Leu Lys Ser Val Asp Ser Gly His Asp Arg

                240                 245                 250

gag ggt gag ctg aac tgg tcc aca gac aag aag gcc tgg gtg gca att    879

Glu Gly Glu Leu Asn Trp Ser Thr Asp Lys Lys Ala Trp Val Ala Ile

            255                 260                 265

gtt gtc ggt gct ggt gcc ggt ctg ctg acc atc ccc tac acc atc tgg    927

Val Val Gly Ala Gly Ala Gly Leu Leu Thr Ile Pro Tyr Thr Ile Trp

        270                 275                 280

ctg agg aag tcc atg ctc cag gag gac cag gaa gtg cac gag gag aat    975

Leu Arg Lys Ser Met Leu Gln Glu Asp Gln Glu Val His Glu Glu Asn

    285                 290                 295

atg gct cgt gat gct gag acc gcc cac gtc gca gct ggt ggc aca ctg   1023

Met Ala Arg Asp Ala Glu Thr Ala His Val Ala Ala Gly Gly Thr Leu

300                 305                 310                 315

aag gag aag aac cct gag gat gat gtg cat gag ctg acc aag gct gag   1071

Lys Glu Lys Asn Pro Glu Asp Asp Val His Glu Leu Thr Lys Ala Glu

                320                 325                 330

aag ttt atg gag tgg ttc aac ggc acc tgg ttc ggc cag aga cag ttt   1119

Lys Phe Met Glu Trp Phe Asn Gly Thr Trp Phe Gly Gln Arg Gln Phe

            335                 340                 345

gtg aag aac ttt gtt gca gct atg aca tac gat gtg cac gcc cat gtg   1167

Val Lys Asn Phe Val Ala Ala Met Thr Tyr Asp Val His Ala His Val

        350                 355                 360

gcc acc atg gac aac ccc aag gtt gcc cag atg cat gca gat gct gag   1215

Ala Thr Met Asp Asn Pro Lys Val Ala Gln Met His Ala Asp Ala Glu

    365                 370                 375

gtc ttc gac ccc cgc act gag gat gtg ttt aag cgc atg cag atc atc   1263

Val Phe Asp Pro Arg Thr Glu Asp Val Phe Lys Arg Met Gln Ile Ile

380                 385                 390                 395

act gcc tct gct gtg gcc ttc gtg cac ggt gcc aat gat gtc gcc aac   1311

Thr Ala Ser Ala Val Ala Phe Val His Gly Ala Asn Asp Val Ala Asn

                400                 405                 410

ggt gtg ggc cct ctt gcc ggt atc tgg gac acc tac aac acc tac cag   1359

Gly Val Gly Pro Leu Ala Gly Ile Trp Asp Thr Tyr Asn Thr Tyr Gln

            415                 420                 425

tct ggc agt ggc aag gcg tct cag ccc cgc tgg att ctg gtc atc ggt    1407

Ser Gly Ser Gly Lys Ala Ser Gln Pro Arg Trp Ile Leu Val Ile Gly

        430                 435                 440

gct gct ggc att gtg ttc ggc ctg gcc atg tac ggc tac cgt atc att    1455

Ala Ala Gly Ile Val Phe Gly Leu Ala Met Tyr Gly Tyr Arg Ile Ile

    445                 450                 455

gcg acc ctg ggt gtg gac ttg gtg gtc atg acc ccc aac cgt ggt tac    1503

Ala Thr Leu Gly Val Asp Leu Val Val Met Thr Pro Asn Arg Gly Tyr

460                 465                 470                 475

tct gtg gag ctg gca gca gct gct atc att gcc ctg gcc tcc acg tac    1551

Ser Val Glu Leu Ala Ala Ala Ala Ile Ile Ala Leu Ala Ser Thr Tyr

                480                 485                 490

ggt ctg ccc gtc tcc act acg caa gtt gtg act ggc ggt aag ata ggg    1599

Gly Leu Pro Val Ser Thr Thr Gln Val Val Thr Gly Gly Lys Ile Gly

            495                 500                 505

gtg ggc atg tgc gag agc tgg aag atg aca ggc gtg aac tgg ctc ctg    1647

Val Gly Met Cys Glu Ser Trp Lys Met Thr Gly Val Asn Trp Leu Leu

        510                 515                 520

ttt atc cgc acc ttc tgg ggc tgg gtt ggt gct ctg gtg act ggc gcc    1695

Phe Ile Arg Thr Phe Trp Gly Trp Val Gly Ala Leu Val Thr Gly Ala

    525                 530                 535

atc ctc tca gct ctg ctc ttc tcc atc ggt gtg tac ggc ccc agc cgc    1743

Ile Leu Ser Ala Leu Leu Phe Ser Ile Gly Val Tyr Gly Pro Ser Arg

540                 545                 550                 555

act gac ctg gac tac gtg acc cac tac cag agg gcg atg aag atc gac    1791

Thr Asp Leu Asp Tyr Val Thr His Tyr Gln Arg Ala Met Lys Ile Asp

                560                 565                 570

atc gac cag tcc atg caa gct ctc ctt gac cg atgt gct gct gct cct    1839

Ile Asp Gln Ser Met Gln Ala Leu Leu Asp Arg Cys Ala Ala Ala Pro

            575                 580                 585

gca cct acc aat ggt ggt gga ggc tgt ggc acc gga gac ttg aac tgc    1887

Ala Pro Thr Asn Gly Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Asp Leu Asn Cys

        590                 595                 600

tct tgc cag cag agg atc ccc tac acc atg ggt gac ctg caa ggc ctg    1935

Ser Cys Gln Gln Arg Ile Pro Tyr Thr Met Gly Asp Leu Gln Gly Leu

    605                 610                 615

aag acg cag gtt gat ggg ctg ttc aac ttc gag gaa aat ggc cag atc    1983

Lys Thr Gln Val Asp Gly Leu Phe Asn Phe Glu Glu Asn Gly Gln Ile

620                 625                 630                 635

aac gag tac aac atg atg tac atg ctg agg cag atc aac agc ctg ttc    2031

Asn Glu Tyr Asn Met Met Tyr Met Leu Arg Gln Ile Asn Ser Leu Phe

                640                 645                 650

aag tac acc ttc ttc gat ggc gac ttc tct cag tac gag aac gtg tct    2079

Lys Tyr Thr Phe Phe Asp Gly Asp Phe Ser Gln Tyr Glu Asn Val Ser

            655                 660                 665

gag cag acc atg cct taa ttctgaagtc ttgacaatct tttccctgtt           2127

Glu Gln Thr Met Pro

        670

ccactcactg cactcttgct cttcagttac caattcatcc tttttgaagt cttgcttttg  2187

ttctgagatt gaacactaag catgacccgt tctgttgtgt tcacatagcc atatcattta  2247

gtcaggtgtt gtggctggtt catatcctga ccaaatttag atctattgct ggtattgtgt  2307

actggtggaa gcttgggttc ccagcatggt cgtctccctc aagtacgcag gctgtattgc  2367

attacctctt gttgaccgaa gacagtatct cttctaccaa tgcttgttgc ctgaacctca  2427

agcgtgactg tttcgttgct tcactcttgt gtgttggctc atatttcatt ttcaccttct  2487

tcagcccact gaactgattg aataatgcaa ctgcaagaat aaacacacgt ctatgtatct  2547

gcactgtttg tgcaattgat ccttcttgtt gatcattttg gaatcctccg ctgattgtgt  2607

aaattttgta agcaccaccc ctgttcaaaa aaaaaaaaaa aa                     2649

<210>13

<211>672

<212>PRT

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>13

Met Thr Asp Val Asp Ser Phe Ser Gly Asn Met Pro Asn Leu Ser Gly

1               5                   10                  15

Phe Glu Ser Ala Ala Gly Trp Gln Gly Glu Asn Phe Thr Tyr His Asp

            20                  25                  30

Gly Lys Trp Ser Ala Tyr Val Trp Leu Leu Val Ile Gly Ser Phe Thr

        35                  40                  45

Ser Phe Met Ala Ala Trp Gly Ile Gly Ala Asn Asp Val Ala Asn Ser

    50                  55                  60

Phe Ala Thr Ser Val Gly Ser Lys Ala Leu Thr Met Phe Gln Ala Cys

65                  70                  75                  80

Val Ile Ala Gly Ile Phe Glu Phe Val Gly Ala Val Ser Leu Gly Gly

                85                  90                  95

Thr Val Val Lys Thr Val Lys Gly Ser Ile Thr Asp Pro Ser Met Phe

            100                 105                 110

Lys His Gln Pro Gln Ile Phe Ala Tyr Gly Met Leu Gly Ala Ser Thr

        115                 120                 125

Ser Val Ala Ile Val Leu Phe Leu Ala Thr Tyr Leu Lys Gln Ala Val

    130                 135                 140

Ser Thr Thr His Thr Ala Ile Gly Ser Val Leu Gly Phe Gly Leu Val

145                 150                 155                 160

Tyr Gly Gly Ala Asp Gly Val Thr Trp Asn Glu Val Ser Asp Glu Phe

                165                 170                 175

Pro Phe Arg Lys Gly Phe Thr Pro Val Val Ile Ser Trp Phe Val Ser

            180                 185                 190

Pro Val Phe Thr Ala Ile Leu Ser Ser Gly Phe Phe Ile Ile Thr Arg

        195                 200                 205

Ile Val Cys Leu Gln Arg Gln Gln Ser Tyr Lys Ile Ala Phe Phe Met

    210                 215                 220

Ile Pro Val Leu Met Met Ile Thr Ile Phe Ile Val Leu Leu Ala Ile

225                 230                 235                 240

Phe Leu Lys Ser Val Asp Ser Gly His Asp Arg Glu Gly Glu Leu Asn

                245                 250                 255

Trp Ser Thr Asp Lys Lys Ala Trp Val Ala Ile Val Val Gly Ala Gly

            260                 265                 270

Ala Gly Leu Leu Thr Ile Pro Tyr Thr Ile Trp Leu Arg Lys Ser Met

        275                 280                 285

Leu Gln Glu Asp Gln Glu Val His Glu Glu Asn Met Ala Arg Asp Ala

    290                 295                 300

Glu Thr Ala His Val Ala Ala Gly Gly Thr Leu Lys Glu Lys Asn Pro

305                 310                 315                 320

Glu Asp Asp Val His Glu Leu Thr Lys Ala Glu Lys Phe Met Glu Trp

                325                 330                 335

Phe Asn Gly Thr Trp Phe Gly Gln Arg Gln Phe Val Lys Asn Phe Val

            340                 345                 350

Ala Ala Met Thr Tyr Asp Val His Ala His Val Ala Thr Met Asp Asn

        355                 360                 365

Pro Lys Val Ala Gln Met His Ala Asp Ala Glu Val Phe Asp Pro Arg

    370                 375                 380

Thr Glu Asp Val Phe Lys Arg Met Gln Ile Ile Thr Ala Ser Ala Val

385                 390                 395                 400

Ala Phe Val His Gly Ala Asn Asp Val Ala Asn Gly Val Gly Pro Leu

                405                 410                 415

Ala Gly Ile Trp Asp Thr Tyr Asn Thr Tyr Gln Ser Gly Ser Gly Lys

            420                 425                 430

Ala Ser Gln Pro Arg Trp Ile Leu Val Ile Gly Ala Ala Gly Ile Val

        435                 440                 445

Phe Gly Leu Ala Met Tyr Gly Tyr Arg Ile Ile Ala Thr Leu Gly Val

    450                 455                 460

Asp Leu Val Val Met Thr Pro Asn Arg Gly Tyr Ser Val Glu Leu Ala

465                 470                 475                 480

Ala Ala Ala Ile Ile Ala Leu Ala Ser Thr Tyr Gly Leu Pro Val Ser

                485                 490                 495

Thr Thr Gln Val Val Thr Gly Gly Lys Ile Gly Val Gly Met Cys Glu

            500                 505                 510

Ser Trp Lys Met Thr Gly Val Asn Trp Leu Leu Phe Ile Arg Thr Phe

        515                 520                 525

Trp Gly Trp Val Gly Ala Leu Val Thr Gly Ala Ile Leu Ser Ala Leu

    530                 535                 540

Leu Phe Ser Ile Gly Val Tyr Gly Pro Ser Arg Thr Asp Leu Asp Tyr

545                 550                 555                 560

Val Thr His Tyr Gln Arg Ala Met Lys Ile Asp Ile Asp Gln Ser Met

                565                 570                 575

Gln Ala Leu Leu Asp Arg Cys Ala Ala Ala Pro Ala Pro Thr Asn Gly

            580                 585                 590

Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Asp Leu Asn Cys Ser Cys Gln Gln Arg

        595                 600                 605

Ile Pro Tyr Thr Met Gly Asp Leu Gln Gly Leu Lys Thr Gln Val Asp

    610                 615                 620

Gly Leu Phe Asn Phe Glu Glu Asn Gly Gln Ile Asn Glu Tyr Asn Met

625                 630                 635                 640

Met Tyr Met Leu Arg Gln Ile Asn Ser Leu Phe Lys Tyr Thr Phe Phe

                645                 650                 655

Asp Gly Asp Phe Ser Gln Tyr Glu Asn Val Ser Glu Gln Thr Met Pro

            660                 665                 670

<210>14

<211>7924

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>14

tcacttagaa agtgaaaaaa actgaatgct aagatggagc aagtaattac ttgtttatga     60

acaaaacaaa caaggagaag cagagggaag tcctctggcc tcacgcatta catcagggca    120

gctaaatgct cacacacaca cacgtgcgtt aatgcatacg cgcgtgcaca cacaagcgcg    180

cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacggt ggtggggctc acactagtca    240

caatgctggt gttgggtctt tccttaatgc ctgctggtta aatccagcgt agacttttac    300

ttttttacac acgcatacac gcacgcacgc acgcacgcac gcacgcacgc acgcacgcac    360

gcacgcacgc acgcgcacac gcacacgcac acacgcacac acacacacac acacacacac    420

acacacacac acacacacac agaacttgca atgcacaaaa acagcgaaaa aggaatcctt    480

gaattccaca actttcttgc aagtctgaag gagacagaag agtcatgggg aggacgtgca    540

ctcgcgttct gggcatgaaa ggcaagaacc cagcacgcat acgctaattc acagcgagca    600

ccacacccaa ccagaggcga gtggacactc gccctgagcc cacgactgca cctgggcagg    660

caagcccctt aggatgcaca ttttgccttg acatgcgctg ccattccaag cgcacacaag    720

caggagcaat ccttgctgtc cacacgcctg cactgccctc acctctcgtg tgcgcgcaca    780

tcatgtgtgc gcatgcatgc gtgagacgat tgcaagccta ttggcgatta taagtgcagg    840

gccctgccgg cattgcacga gcgcatgcct tgcaggtgca ccgcgctttg tcccctccat    900

ctcctggatg tgtgtacaat acctcttgtg ataatactaa ttcaattctc ccaaggaggc    960

atgggagctg tgaattttct ggcagtgccc cggcacccat gagacgcgtt actcacctga   1020

aatatctgcg ctgcatccac atccgatgat acagcaatag cgcgagagcg tctacacact   1080

cttcccccaa agaccaagca gcagagccgc ctctctgggc gtgagttcac actgtggtgg   1140

tgtgaagcgg ccgtgttcac agtggcatca tcgagagaag atgccctgcc cgaggaaaag   1200

tgacccgccg cacccacctg cgccaccaaa caatcatctc ttgtacatcg gtgcacgcac   1260

cgagcccctc cccaccgcca cttcgtctgc gaaagcagga ggggtaggca cgcagccatg   1320

acggacgtgg acagcttcag cggcaacatg cccaacctct cgggctttga gtccgcagcg   1380

ggctggcaag gtgagcgcgg gtgcctgccc cacgcccttg aaaagctggg agctgggcgt   1440

gcccagcgag ccgaggaggg agagggccag tggcctattt cgcgtgcgag cgtggccaga   1500

aagctgcatc tacacaggag ggggcattcc tgcaccctct tttccatccc actgcggcac   1560

tgcactcact ccgccacaca cacccaccca cccacacaca cacacgcaca ggcgagaact   1620

tcacctacca cgatggcaag gtgagcgacg ggctgggtgg gtgggccgct gtgcggtagg   1680

ggtccctcat gtcatggtcc ctctaagagg atgccgatgc cggatttctg tcgggaggag   1740

ataggcctga gagcattgta gctctccttt gtactgagac ctccattcct gtgctttgcg    1800

ttgtgtctgc cctgctgctc atcagtgtgt tcagcgcatg gacacgcgag catggtgccc    1860

agcatctgcc ctgccatccc ctcgctctcg tcctgcagtg gtctgcctac gtgtggctgc    1920

tggtcatcgg ctccttcacc tcattcatgg ctgcatgggg catcggtgcc aacgatgtgg    1980

ccaactcctt cgccacaagt gagcactcgg tcaatgtgca tgcctgcatg agcttatgct    2040

gcacttgtgt gcacgtgtgt gcctatgttt agggatgctg gctgttgagc agtacattgc    2100

atgtctgaat agatgtgatg atgtgaataa acagctttag atgatgtgaa taaacagctt    2160

tagactgttg ggcatacccc aacaaccgca tcgtgtcagt gcctctactc tctgtgctct    2220

cctctccact gcaggtgtgg gctccaaggc tttgaccatg ttccaagcct gcgtggtggg    2280

tgccccgtgc ttgtgtgggg tttggtgctc ttaggttctt gaaaacccct gcttgccagt    2340

gccccccttt ttccaaaatg tgtttgagag ttaacgttac catattctcc agtcagactg    2400

ttaattcctc tggttgagca tcactctgta caactgagca tcagtgctga gccttttctg    2460

agagcaattc cagtgctcgt tcgatgctgg gcctccaccc agactgacat ctccctttgt    2520

gtttgacact cgtgcatcac agattgcggg catctttgaa tttgtcggcg ctgtgtccct    2580

gggtggtact gttgtgaaga ccgtgaaggg ctccatcact gacccctcaa tgttcaagca    2640

ccagccccag gtatttcttt ctttcgggtg tacctgtgcg agcatgcaca tgtgtgcgca    2700

ggttatgtgc cccccttttc acaagaaatt ttgtgaatcc tgtttccagc cgagtgttag    2760

tttctgtccc tttctcccgt ttcatggtgc taaaaccaaa ccaatcatcg ctctcaacct    2820

gcagattttt gcgtacggca tgcttggtgc ctctacttct gtagccattg tgctcttcct    2880

ggccacatac ttgaagcagg ctgtgtccac cacacacact gcaagtgagt agcagcagtg    2940

attgcttgag cctcgtgcta cttgcttgca atctgcttga cgttggaggt taagaaggca    3000

ctttctggcg taaggatgct ctggatcgtt gtgactgaaa cagcaagcac ttactattat    3060

taaccagcac tgcacttgcc ttttccgcag ttgggtctgt gcttggcttc ggcttggtgt    3120

atggaggcgc tgatggtgtg acctggaacg aggtgtccga tgaggtgaga ccattgcatt    3180

gctaggagtc atacatagcg ccttactgca agctgctgtg taacaagaac tggtatcctt    3240

ttagtttttc cgctaattct ctttccaaga gagggaaaac taattgttgc tcctatcatg    3300

catcaccacc cgtcttcgtt ccctgcagtt ccccttccgc aaggggttca cacctgtcgt    3360

catctcctgg ttcgtctccc ccgtcttcac tgccattctg tcctccggat tcttcatcat    3420

caccaggtgt gtgccccaaa ggctgggtgt ccttgattaa ttaaggtgtg tttgctcgtt    3480

gacatcatct ttctgttgca agttgtagct cacatgccaa gctgcgcaga acaaggtgga    3540

aggaaggaga aagcacttcc ctctctgaat ccctgtcctc ctgcaggatt gtctgcctgc    3600

agcgccagca atcctacaag attgccttct tcatgatccc tgtgctgatg atgatcacca    3660

tcttcattgt cctgctggcc atcttcctga aggtgagcag aattgtctga tctctcttct    3720

cttgtacgct tgtttctggc ttgtcaagct cgcatgcatt cttgcacatg catacagaca    3780

tgcatgcaca cacatgcacc aacacgtgca gagtgtggac tctggacacg accgtgaggg    3840

tgagctgaac tggtccacag acaagaaggc ctgggtggca attgttgtcg gtgctggtgc    3900

cggtctgctg accatcccct acaccatctg gctgaggaag tccatgctcc agtgagtctc    3960

tgtttgatcc tgtcatgagt aggctccatt cagtgcagta agttcagcag tgcactgagt    4020

cttgctcatc ctcatcaaca cacaagtttc ctgtgtttag agacaaaaac caacagcctt    4080

actggtgctc aacttactcc atgtctcgac acaatcgatc tcaccacaaa ttttcgctgg    4140

cctacaggga ggaccaggaa gtgcacgagg agaatatggc tcgtgatgct gagaccgccc    4200

acgtcgcagc tggtggcaca ctgaaggaga agaaccctga ggatgatgtg catgagctga    4260

ccaaggctga gaagtttatg gagtggttca acggcacctg gttcggccag agacagtttg    4320

tgaagagtga gtgatgctct gcgatgcttt caatgctctg catgttggat gtgtgtatgt    4380

tctcacctct tgaggaagac ttcagcatct gtgcattcca aatgcttgat tttggatgcc    4440

tggctgagat gccctgtact gtacgggaag taagagtctg cagtgtgctc ctgggagttg    4500

gaatcctaag gaaatgccag cctgtactaa ccgacctctt ctgcttgcgc ctgcagactt    4560

tgttgcagct atgacatacg atgtgcacgc ccatgtggcc accatggaca accccaaggt    4620

tgcccagatg catgcagatg ctgaggtctt cgacccccgc actgaggtgg gtttcgagct    4680

gctcgctgca gccaagcatg cagaagactg catattccaa tggagtcaag atgatgatat    4740

gcggagagat ttcatgccgc ccccccccta cccccatgca aactcactgt gaaccatcac    4800

tgtcctctct tgcaggatgt gtttaagcgc atgcagatca tcactgcctc tgctgtggcc    4860

ttcgtgcacg gtgccaatga tgtcgccaac ggtgtgggcc ctcttgccgg tatctggtaa    4920

gtgaacctgg ccttgcgttg atgctgaaag ccactctgca gggggttgtg tagtactgtg    4980

tgctgtttgt tgggttactc aagttctgga agctgtgccc gtaattcgtc tttgttttcc    5040

tttcctgcag ggacacctac aacacctacc aagtctggca gtggcaaggc gtctcagccc    5100

cgcttggatt ctggtcatcg gtgctgctgg cattgtgttc ggcctggcca tgtacggcta    5160

ccgtatcatt gcggtgagta ttttgttaga cgaggcaggg acgctgtaga atgcagacca    5220

gtttccagcc tgatgtgttc agcttagcat ctgctgcagg acttgcatgg cgtgcatcct    5280

tgataactaa tatctctctt tctgtctgtt tttcctgcag accctgggtg tggacttggt    5340

ggtcatgacc cccagccgtg gttactctgt ggagctggca gcagctgcta tcattgccct    5400

ggcctccacg tacggtctgc ccgtctccac tacgcaagtt gtggtgagtg atgtgcttgt    5460

gcaatatggc ggatgttgac atgagctgcc tgctctctgt gcttcacatt gctgcatgtt    5520

ctgggagtct tgttagttga ctaactacat ggcatccgtc ccttgcagac tggcggtgag    5580

ataggggtgg gcatgtgcga gagctggaag atgacaggcg tgaactggct cctgtttatc    5640

cgcaccttct ggggctgggt tggtgctctg gtgactggcg ccatcctctc agctctgctc    5700

ttctccatcg gtgagtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgcgtgtgt    5760

gtgcgtgtgt gtgcgtgtgt gtgcgtgtgt gcgtgtgcgt gtgtgcgtgt gcgtgtgtgc    5820

gtgtgcgtgt gcgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgc ctgtgctgac    5880

aaaacagagt tctgcttttg tgcgatttgc ttgagcttat gtttgcattc aagggataaa    5940

taaaaaagaa acaacaatgc ctgcaacgtg tatttcctgc aggtgtgtac ggccccagcc    6000

gcactgacct ggactacgtg acccactacc agagggcgat gaagatcgac atcgaccagt    6060

ccatgcaagc tctccttgtg agtcactggt gtaatgcatg catgcaggcc tgctctctct    6120

aattggtctg tagtccaagt tcgctaccta aactgcttgc accaggagga ggaacctttt    6180

gcttgcttgt gacatcatct ggactgatgt cccctctttt tctgttttgt tctgcaggac    6240

cgatgtgctg ctgctcctgc acctaccaat ggtggtggag gctgtggcac cggagacttg    6300

aactgctctt gccagcagag gatcccctac accatgggta agttctacct gtcactgaag    6360

gtgcctcaag cagccctgtt gccagtgttt ggttgttgtt aatgaggagg gttgctattt    6420

tctaggcctt taaatgtgat atggagctga gggagctgat tcacctcctt aaatacgctg    6480

gttctttctc cttgcaggtg acctgcaagg cctgaagacg caggttgatg ggctgttcaa    6540

cttcgaggaa aatggccaga tcaacgaggt aagctgtgtg tctttggttg tcttgcagtc    6600

aggcttcctg gtgtgatact ccctttaaca ccgtcagctt gccttgcatg gatgtacgga    6660

tgtaactgca agttgccttg ggtgctcttg ggtcagcact gcacaccagc acacaccaag    6720

tttgacattg ccctcacctg ctttttgtgc gcagtacaac atgatgtaca tgctgaggca    6780

gatcaacagc ctgttcaagt acaccttctt cgatggcgac ttctctcagt acgagaacgt    6840

gtctgagcag accatgcctt aattctgaag tcttgacaat cttttccctg ttccactcac    6900

tgcactcttg ctcttcagtt accaattcat cctttttgaa gtcttgcttt tgttctgaga    6960

ttgaacacta agcatgaccc gttctgttgt gttcacatag ccatatcatt tagtcaggtg    7020

ttgtggctgg ttcatatcct gaccaaattt agatctattg ctggtattgt gtactggtgg    7080

aagcttgggt tcccagcatg gtcgtctccc tcaagtacgc aggctgtatt gcattacctc    7140

ttgttgaccg aagacagtat ctcttctacc aatgcttgtt gcctgaacct caagcgtgac    7200

tgtttcgttg cttcactctt gtgtgttggc tcatatttca ttttcacctt cttcagccca    7260

ctgaactgat tgaataatgc aactgcaaga ataaacacac gtctatgtat ctgcactgtt    7320

tgtgcaattg atccttcttg ttgatcattt tggaatcctc cgctgattgt gtaaattttg    7380

taagcaccac ccctgttcat atgccgtggc tgctcctttg tgtggacata ctatgcaaca    7440

ataactccca aacaacaatt gggtcccaat ttggtttcgt aattaaatta attatacgaa    7500

caacgcggca cctgttatac gaagagaaac caccaaataa gtctggatag ttctccctga    7560

gctgctagga ttaaggttgc attacgccac taaatgaact tgcgcaactt ctgggcaatg    7620

aggaagatca gtcaggagaa aattcaaaaa ggacagagtt cgtgttgtcc ggttacatta    7680

aacaagtcaa ccgatctgac tgagtggcgt attgtaactg attagcagac tacattcaat    7740

gtgttactta agtcaataag gatgaaatca agttgaaaag gcccctgata gtctggtggc    7800

ttgactgctg ggctaaggag tgcgtctttg tcaaactgag atcagatcag atccgtttta    7860

catgtaaagt gaaagtgtac acccttttag tcaggtggct taactgctgg gtaaagaact    7920

gggt                                                                 7924

<210>15

<211>2019

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(2019)

<400>15

atgacggacg tggacagctt cagcggcaac atgcccaacc tctcgggctt tgagtccgca     60

gcgggctggc aaggcgagaa cttcacctac cacgatggca agtggtctgc ctacgtgtgg    120

ctgctggtca tcggctcctt cacctcattc atggctgcat ggggcatcgg tgccaacgat    180

gtggccaact ccttcgccac aagtgtgggc tccaaggctt tgaccatgtt ccaagcctgc    240

gtgattgcgg gcatctttga atttgtcggc gctgtgtccc tgggtggtac tgttgtgaag    300

accgtgaagg gctccatcac tgacccctca atgttcaagc accagcccca gatttttgcg     360

tacggcatgc ttggtgcctc tacttctgta gccattgtgc tcttcctggc cacatacttg     420

aagcaggctg tgtccaccac acacactgca attgggtctg tgcttggctt cggcttggtg     480

tatggaggcg ctgatggtgt gacctggaac gaggtgtccg atgagttccc cttccgcaag     540

gggttcacac ctgtcgtcat ctcctggttc gtctcccccg tcttcactgc cattctgtcc     600

tccggattct tcatcatcac caggattgtc tgcctgcagc gccagcaatc ctacaagatt     660

gccttcttca tgatccctgt gctgatgatg atcaccatct tcattgtcct gctggccatc     720

ttcctgaaga gtgtggactc tggacacgac cgtgagggtg agctgaactg gtccacagac     780

aagaaggcct gggtggcaat tgttgtcggt gctggtgccg gtctgctgac catcccctac     840

accatctggc tgaggaagtc catgctccag gaggaccagg aagtgcacga ggagaatatg     900

gctcgtgatg ctgagaccgc ccacgtcgca gctggtggca cactgaagga gaagaaccct     960

gaggatgatg tgcatgagct gaccaaggct gagaagttta tggagtggtt caacggcacc    1020

tggttcggcc agagacagtt tgtgaagaac tttgttgcag ctatgacata cgatgtgcac    1080

gcccatgtgg ccaccatgga caaccccaag gttgcccaga tgcatgcaga tgctgaggtc    1140

ttcgaccccc gcactgagga tgtgtttaag cgcatgcaga tcatcactgc ctctgctgtg    1200

gccttcgtgc acggtgccaa tgatgtcgcc aacggtgtgg gccctcttgc cggtatctgg    1260

gacacctaca acacctacca gtctggcagt ggcaaggcgt ctcagccccg ctggattctg    1320

gtcatcggtg ctgctggcat tgtgttcggc ctggccatgt acggctaccg tatcattgcg    1380

accctgggtg tggacttggt ggtcatgacc cccaaccgtg gttactctgt ggagctggca    1440

gcagctgcta tcattgccct ggcctccacg tacggtctgc ccgtctccac tacgcaagtt    1500

gtgactggcg gtaagatagg ggtgggcatg tgcgagagct ggaagatgac aggcgtgaac    1560

tggctcctgt ttatccgcac cttctggggc tgggttggtg ctctggtgac tggcgccatc    1620

ctctcagctc tgctcttctc catcggtgtg tacggcccca gccgcactga cctggactac    1680

gtgacccact accagagggc gatgaagatc gacatcgacc agtccatgca agctctcctt    1740

gaccgatgtg ctgctgctcc tgcacctacc aatggtggtg gaggctgtgg caccggagac    1800

ttgaactgct cttgccagca gaggatcccc tacaccatgg gtgacctgca aggcctgaag    1860

acgcaggttg atgggctgtt caacttcgag gaaaatggcc agatcaacga gtacaacatg    1920

atgtacatgc tgaggcagat caacagcctg ttcaagtaca ccttcttcga tggcgacttc    1980

tctcagtacg agaacgtgtc tgagcagacc atgccttaa                           2019

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>16

ccctgttcca ctcactgc                                                    18

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>17

gaacaggggt ggtgcttaca                                                  20

Claims (15)

1.盐藻差减cDNA文库，其特征在于它是用抑制差减杂交法构建的盐藻受高盐胁迫诱导的差减cDNA文库。

2.根据权利要求1所述的盐藻差减cDNA文库，其特征在于它是盐藻在含有0.5M NaCl的DM培养基中培养到对数生长期，然后转移到含有2.0M NaCl的DM培养基中诱导24小时，用抑制差减杂交法构建的差减cDNA文库。

3.根据权利要求2所述的盐藻差减cDNA文库，其特征在于包括SEQ ID NO：1～11的cDNA片段。

4.根据权利要求2或3任一所述的盐藻差减cDNA文库的构建方法，包括如下步骤：

(a)盐藻从低盐到高盐胁迫诱导；

(b)提取盐藻诱导前后的mRNA；

(c)将(b)所获得的mRNA反转录合成cDNA，诱导后的cDNA为测试cDNA(Tester cDNA)，诱导前的cDNA为参照cDNA(Driver cDNA)；

(d)将Tester cDNA和Driver cDNA均用RsaI酶切产生较短的平末端片段；将Tester产物分成两等份，分别与不同的接头(Adaptor 1和Adaptor 2R，)连接，而Driver cDNA不与接头连接；

(e)两份Tester(Tester cDNA-Adaptor1和Tester cDNA-Adaptor2R)分别与Driver cDNA混合，进行第一次差减杂交；

(f)将(e)的两份杂交产物未经变性即进行混合，并加入过量Driver cDNA混合，进行第二次差减杂交；

(g)接头末端填平；

(h)抑制性PCR扩增差异表达的序列；

(i)用巢式引物(Nested Primer)进行第二轮PCR扩增，使差异表达的片段得到富集；和

(j)将(i)的扩增产物插入克隆载体，转化感受态细胞，构建获得盐藻高盐胁迫诱导的差减cDNA文库，

其特征在于，盐藻在含有0.5M NaCl的DM培养基中培养，然后在含有2.0MNaCl的DM培养基中诱导24小时，诱导前后的盐藻分别提取mRNA，用抑制差减杂交法构建cDNA文库。

5.SEQ ID NO：1～11任一的盐藻cDNA片段。

6.含有权利要求5的盐藻cDNA片段的载体。

7.包括权利要求6的盐藻cDNA片段的载体的转化体。

8.盐藻的Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白的全长cDNA，SEQ ID NO：12。

9.含有权利要求8的盐藻Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白的全长cDNA的载体。

10.包括权利要求9的载体的转化体。

11.盐藻的Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白的全长基因，SEQ ID NO：14。

12.盐藻的Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：13。

13.编码如权利要求12所述的盐藻的Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白的核苷酸序列，SEQ ID NO：15。

14.如权利要求13所述的编码盐藻的Na⁺/H₂PO₄ ^-共转运膜通道蛋白的核苷酸序列的片段。

15.根据权利要求8、11、13或14任一的核苷酸序列在植物基因工程育种的应用。

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