CN115838631B - 一种高富集砷工程藻株及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高富集砷工程藻株及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。发明创造了一个过表达PHT基因的莱茵衣藻突变株。所述莱茵衣藻突变株可以在正常条件下大量富集砷，不仅在工程生产中操作方便，而且可以从根本上降低成本，该藻种的其他生理指标正常，代谢产物也有大量积累，性状十分良好。

Description

一种高富集砷工程藻株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种高富集砷工程藻株及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

微藻是一类能进行光合作用的单细胞真核生物，藻种类繁多且在环境中分布广泛，存在于从海洋到淡水和土壤等水生环境中，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)因具有生长速度快、培养方法简单、基因工程操作简便、已完成全基因组测序等优势，是微藻研究的重要模式生物之一。

砷是在自然界中普遍存在的一种微量金属，被列为Ⅰ类致癌物质。在水生环境中砷的主要存在形态为无机砷，即亚砷酸盐As(Ⅲ)和砷酸盐As(Ⅴ)。目前通过化学方法处理含砷废水会产生大量的固体废物且难以处理，生产成本高且效率低下。

微藻繁殖快，生命周期短，并且微藻对环境的适应能力强，可以利用废水中的氮磷元素，生成蛋白质等代谢物质增加对砷的抗性，通过吸附和吸收作用富集溶液中的砷，当使用微藻作为修复含砷废水的生物材料时，具有经济高效的优点。野生型莱茵衣藻在正常的培养条件下砷富集量较低。目前，报道的大部分高富集砷微藻(盐藻)生长和生物量较低，对高富集砷的微藻突变株研究较少。因此，亟需获得砷富集量更高的突变藻株。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种高富集砷工程藻株及其构建方法与应用。本发明通过在莱茵衣藻中对PHT基因高表达，获得了可高富集砷的突变藻株，能够在As(Ⅴ)浓度为0～3000μg/L的体系中正常生长，且生成了相对更多的代谢产物，因此可进一步研究莱茵衣藻砷代谢调控机制，为利用藻类进行污水处理奠定基础。

本发明通过基因工程改造藻种，成功筛选出一种可以大量富集砷的藻种，且其代谢产物等能量化合物的积累也有所增加，性状表现良好。从整体研究不同亚细胞定位的转运蛋白是否具有协同运输五价砷的功能，揭示提高五价砷转运水平对总砷富集的影响。这些研究将进一步完善微藻体内砷高效转运的调控网络，为进一步提高其它产藻及植物的砷富集提供新策略，为高效富集砷奠定理论基础。

本发明通过转录组学筛选将盐生杜氏藻中差异表达的砷转运基因PHT构建了过表达载体，将PHT转运基因在莱茵衣藻中过表达。通过转基因的方式，将PHT导入莱茵衣藻中，筛选出过表达PHT的莱茵衣藻突变株(EX-18/EX-22/EX-33)。

本发明提供了一种莱茵衣藻突变株，所述莱茵衣藻突变株中过表达PHT基因。

进一步地，上述技术方案中，所述DsPHT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，上述技术方案中，所述莱茵衣藻突变株的保藏编号为CCTCC No:M20221698，保藏日期为2022年10月31日。

本发明还提供了上述莱茵衣藻突变株的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建包含编码磷酸盐转运蛋白的一个同源基因PHT以及转运蛋白编码基因PHT的表达载体；

(2)通过电击转化的转基因的方式，将含有PHT的表达载体转入莱茵衣藻中，筛选获得莱茵衣藻突变株。

本发明还提供了上述莱茵衣藻突变株的应用，在莱茵衣藻的正常培养条件下高富集砷。所述莱茵衣藻突变株在正常条件下砷富集量最高可达莱茵衣藻野生株的6.4倍。

进一步地，上述技术方案中，所述正常培养条件为在全温培养箱中使用无磷-TAP培养基培养，转速100-140rpm，优选为120rpm；持续光照光强为80-120μmol m^-2s^-1，优选为100μmol m^-2s^-1，培养温度为室温，优选为25℃。

进一步地，上述技术方案中，所述砷包括三价砷(AsIII)、五价砷(AsV)和有机砷。

进一步地，上述技术方案中，所述莱茵衣藻突变株应用于工业废水处理。

进一步地，上述技术方案中，所述工业废水中砷含量为0～3000μg/L。

在本发明中，对莱茵衣藻突变株的TAs检测发现，其在无磷-TAP培养条件下，当体系中加入As(V)浓度为3000μg/L时，莱茵衣藻突变株(EX-33的胞内TAs含量最高于亲本(未转基因)33％，因此可将EX-33应用到工业高砷浓度废水的处理当中。除此外蛋白质、类胡萝卜素和多糖含量均有所提高：EX-18蛋白质含量为亲本(未转基因)的1.11倍，类胡萝卜素含量为亲本(未转基因)的2.18倍，多糖含量为1.04倍。综上，经过转基因所获得的突变株，在正常培养条件下就可以大量富集砷，并且蛋白质、类胡萝卜素和多糖的含量也有所增加。

发明有益效果

本发明的藻种能够在无磷情况下大量砷转运，并且生物量和代谢产物含量也会有所提高。以往提高砷富集方法是通过对微藻进行藻种筛选，但是在水中生物量低，在工程化生产中进行过程比较繁杂，且生物量积累的降低会使生产成本更高，所以本研究创造了在正常培养条件下就可以大量富集砷的藻种，该藻种不仅在工程生产中操作方便，而且可以从根本上降低成本。且该藻种的其他生理指标没有受到影响，淀粉含量还会有所积累，性状十分良好。

附图说明

图1为莱茵衣藻野生株及突变株的生物量图。

图2为莱茵衣藻野生株及突变株藻细胞内总砷含量对比图。

图3为莱茵衣藻野生株及突变株藻细胞内总磷含量对比图。

图4为莱茵衣藻野生株及突变株藻细胞内蛋白(A)、可溶性糖(B)和淀粉(C)含量对比图。

图5为莱茵衣藻野生株及突变株藻细胞内叶绿素(A)、β-胡萝卜素(B)含量对比图。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

下述实施例中所用的培养基配方如下：

莱茵衣藻TAP培养基配方：Tris base 2.42g、SolutionA(盐溶液)10ml、PhosphateBufferⅢ(磷酸盐溶液)1ml、Hutner's(微量元素混合溶液)1ml、冰乙酸1ml，按顺序加入各组分，调节pH至7.0～7.4，定容至1L。TAP固体培养基则加入20g Agar(琼脂)，突变株固体培养基另加入10mg巴龙霉素溶液。

莱茵衣藻去磷TAP培养基配方：Tris base 2.42g、SolutionA(盐溶液)10ml、Hutner's(微量元素混合溶液)1ml、冰乙酸1ml，按顺序加入各组分，调节pH至7.0～7.4，定容至1L。

实施例1

(1)目的基因的克隆：

PHT引物名称及序列：

SEQ ID NO.2：F1(c):5’-TATGGTATGATGTGCGCGGCCATTT-3’

SEQ ID NO.3：F1(d):5’-CACCACCACCATACACCAGACCAAA-3’

PHT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列可在Phytozome(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)PHT查找。

将构建好的含有PHT转运蛋白编码基因的表达载体，通过电穿孔法导入到莱茵衣藻中，构建PHT突变株。

(2)过表达载体的构建方法：

请根据莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)细胞核基因密码子表进行密码子优化。密码子表见邮件附件或在下面的网址下载。

http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝3055。然后将优化后的密码子连接在pClamy_4载体上，合成基因：PHT-cDNA，然后转入到大肠杆菌DH5α感受态，挑选克隆PCR结果正确的单克隆质粒送到公司测序。

将测序正确的两个单克隆菌落进行质粒抽提，然后用EcoR I和BamH I进行双酶切并片段回收，对空载pClamy_4用EcoR I和Xba I进行双酶切回收长片段，DNA连接转化大肠杆菌DH5α感受态，挑选克隆PCR结果正确的单克隆质粒送到公司测序，最终获得过表达PHT-cDNA的过表达载体。

所述转基因方法采用的是电穿孔法，在每个转化实验中使用大约1.0μg限制性内切酶SspI处理后线性化质粒DNA，莱茵衣藻细胞在TAP培养基中生长至大约1.5×10⁶个细胞/mL。通过离心收集指数生长的细胞(2.5×10⁷个细胞)并悬浮在250μL补充有40mM蔗糖的TAP培养基中。将细胞悬液置于预冷的一次性电穿孔比色皿中，在16℃下保持5分钟，间隔为4毫米(Bio-Rad)。电穿孔由BioRad Gene Pulser Xcell进行，设置如下(电压500V，容量50μF和电阻800Ω)。电穿孔后的细胞用5.0mL的40mM蔗糖在TAP培养基中，在暗光(10μmol m^-2s^-1)下培养16小时，然后接种在含有抗生素(15μg/mL博来霉素zeocin和20μg/mL巴龙霉素)，将平板在连续光照(50μmol m^-2s^-1)下于25℃培养。大约7天后可以看到具有抗生素抗性单克隆藻株。

对转基因后的阳性转化子进行进一步的微藻克隆PCR验证，并用半定量和实时荧光定量PCR进行表达水平检测，筛选出高表达PHT的莱茵衣藻突变株。

本发明获得了同时高富集砷的莱茵衣藻突变株(EX-18、EX-22和EX-33)，其中EX-18、EX-22在砷添加浓度为300μg/L时，胞内砷富集量较野生株有明显提高，EX-33在砷添加浓度为3000μg/L时，胞内砷富集量较野生株有明显提高，且生物量、类胡萝卜素、多糖、蛋白质和细胞内磷含量均有增加。

所述莱茵衣藻突变株保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编430072)。莱茵衣藻突变株(Chlamydomonas reinhardtii)EX-33菌种保藏号为CCTCC No:M 20221698，保藏日期为2022年10月31日，分类命名为莱茵衣藻突变株(Chlamydomonas reinhardtii)，名称为EX-33。

实施例2

测定实施例1获得的莱茵衣藻野生株及突变株的生物量并进行生物总砷、总磷的提取和分析。

(1)将莱茵衣藻野生株和突变株EX-18、EX-22和EX-33从TAP固体培养基中转接至含有TAP液体培养基的锥形瓶中，置于摇床上，在连续光照的条件下培养3天，使其浓度达到1.5×10⁷个细胞/ml。将培养好的细胞按藻液：培养基为2：1的比例扩培，扩培3次。

(2)在超净工作台内收集100ml细胞至50ml灭菌离心管中，3500rpm离心3min，在超净工作台内倒去上清，重悬入300ml去磷TAP培养基中。

(3)向莱茵衣藻野生株和突变株中加入As(Ⅴ)，砷浓度梯度为0、3、30、300、3000μg/L，在摇床中连续光照培养，每次测定OD750，连续培养17天后离心收集藻细胞。

(4)将离心后藻细胞进行冷冻干燥后待分析测定。

(5)称取冷冻干燥后的藻粉约20mg于坩埚中，加入2.0ml 2％硝酸，0.5ml高氯酸，放置过夜。加入0.125ml 10％硫酸后于电热板上加热，升温至80℃后恒温5分钟，升温至120℃后恒温5分钟后升温至250℃。过程中若出现棕褐色，则取下冷却后补加2％硝酸0.5ml～1ml，继续加热至消解完全后再持续蒸发至高氯酸的白烟散尽，硫酸白烟开始冒出，消化液呈无色透明或略带黄色，取下冷却后加入2ml超纯水蒸发至冒硫酸白烟，待白烟散尽后取下冷却后用超纯水转移至试管定容。

(6)通过原子荧光光谱仪测定消化液中的总砷浓度，根据向藻液中加入As(Ⅴ)的浓度，将消化液稀释不同的倍数后，向1ml样品中加入1ml 50％盐酸和1ml 5％硫脲—抗坏血酸溶液后定容至10ml，反应12h后上机进行测定。

(7)加入5％硝酸溶液稀释消化液样品，通过ICP-OES测定样品中的总磷浓度。

实验结果表明：

如图1所示，当在体系中加入微量(3μg/L)的As(Ⅴ)时，相比于对照组，野生株及突变株的生长量有一定的增加，但当加入3000μg/L的As(Ⅴ)时，野生株及突变株的生长量均大幅下降，但此时突变株的生物量高于亲本(未转基因)其中突变株EX-33的砷吸收量相对最高为亲本(未转基因)生物量的1.87倍。说明在PHT基因高表达的情况下，突变株的生长状况优于亲本(未转基因)。

如图2所示，根据对生长至第17天的微藻细胞胞内总砷含量的测定，结果表明加入的As(Ⅴ)浓度为3μg/L时，突变株EX-18的砷吸收量相对最高亲本(未转基因)的6.4倍，As(Ⅴ)浓度为30、300μg/L时，突变株EX-22的砷吸收量相对最高分别为亲本(未转基因)砷吸收量的1.07倍和3.25倍，As(Ⅴ)浓度为3000μg/L时，突变株EX-33的砷吸收量相对最高分别为亲本(未转基因)砷吸收量的1.33倍，说明PHT高表达的突变株内对砷的吸收量更高。由于当添加的As(Ⅴ)浓度30μg/L时，砷吸收量并未有明显提高，因此后续主要测定As(Ⅴ)添加浓度为3、300和3000μg/L的相关指标。如图3所示，胞内磷含量的测定结果表明，随着砷浓度的增加，野生株和EX-18胞内磷含量呈下降趋势，EX-22和EX-33胞内磷含量随砷浓度的增加变化不大，说明高砷浓度处理下并未对藻细胞内营养物质的合成造成影响。

实施例3

实施例1获得的莱茵衣藻突变株中代谢产物及C、H、N含量的提取及检测。

(1)蛋白质含量测定：称取莱茵衣藻藻粉约5mg至10ml离心管中，加入1ml 0.1mol/L的氢氧化钠溶液后90℃水浴10分钟后，5000rpm离心2分钟，弃去上清液，重复三次后测定收集上清液至2ml离心管中。

配置蛋白标准溶液见表1：

表1

通过改良型Bradford法测定蛋白浓度：向2ml离心管中加入100μL样品上清液，各管加入1ml Bradford工作液，迅速混匀。室温25～30℃，反应10分钟后，通过紫外分光光度计测定各管A₅₉₅值。绘制“A595吸光度—蛋白质浓度”标准曲线回归方程计算样品中的蛋白质浓度。

蛋白质标准曲线：

BSA(μL/ml)＝259.06A₅₉₅+0.3715

(2)可溶性糖含量测定：通过植物可溶性糖含量检测试剂盒(比色法)测定样品中的多糖含量，称取约20mg藻粉样本，加入1ml超纯水研磨成匀浆，倒入有盖离心管中，沸水浴10分钟(盖紧，以防止水分散失)，冷却后，8000rpm常温离心10分钟，取上清液于10ml试管中，用超纯水定容至10ml，摇匀备用。

配置浓度分别为0.00625、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2mg/L的葡萄糖标准液各4ml，具体见表2。

表2

在2ml离心管中桉顺序加入200μL样品、200μL超纯水、100μL植物可溶性糖含量检测试剂盒中的工作液、1ml浓硫酸，混匀后于95℃水浴10分钟(盖紧，以防止水分散失)，冷却至室温后，于620nm处测定吸光值，分别记为A测定管、A标准管、A空白管。

以浓度(y)为纵坐标，吸光度ΔA标准(x)为横坐标建立标准曲线，根据标准曲线，将ΔA测定带入公式中计算样本浓度y(mg/mL).

标准曲线：y＝0.2037x+0.0104

并按样本质量计算：

V1：加入样本体积，ml

V2：提取液体积，ml

W：样本质量，g

(3)淀粉含量测定：通过淀粉含量检测试剂盒(比色法)测定样品中的淀粉含量，称取约20mg样品于研钵中研碎，加入1ml淀粉含量检测试剂盒中的工作液试剂一，充分匀浆后转移至EP管中，80℃水浴提取30分钟，3000rpm常温离心5分钟，弃上清液，留沉淀；向沉淀中加入0.5ml超纯水，在沸水浴中糊化15分钟(盖紧，以防止水分散失)；冷却后，加入0.35ml淀粉含量检测试剂盒中的工作液试剂二，常温提取15分钟，震荡3～5次；加入0.85ml超纯水，混匀，3000rpm常温离心10分钟，取上清液，并将上清液稀释20倍后备用。

配置浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1mg/L的葡萄糖标准液各2ml，具体见表3。

表3

在2ml离心管中桉顺序加入200μL样品、1ml淀粉含量检测试剂盒中的工作液试剂三，混匀后于95℃水浴10分钟(盖紧，以防止水分散失)，自然冷却至室温后，于620nm处测定吸光值，分别记为A测定管、A标准管、A空白管。计算ΔA＝A标准-A空白，ΔA’＝A测定-A空白。

以浓度(y)为横坐标，吸光度ΔA(x)为纵坐标建立标准曲线，得到标准曲线y＝kx+b，将ΔA’代入标准曲线得到x(mg/mL)。

标准曲线：y＝6.6039x-0.0052

并根据样本质量计算：

淀粉含量(mg/g质量)＝x×稀释倍数×V提取÷W÷1.11

V提取：提取后体积，1.7ml

W：样品质量，g

1.11：此法测得葡萄糖含量换算为淀粉含量的常数。

细胞C、N、H含量测定：通过有机元素分析系统(CHNO)模式系统测定藻细胞内C、N和H元素含量。

实验结果表明：

如图4，有研究表明微藻可以通过合成蛋白质来增加对砷的耐性，相较于野生株，突变株合成了更多的蛋白质，As(Ⅴ)浓度为3、300和3000μg/L时，EX-22生成了更多蛋白质，为亲本(未转基因)的1.45、1.2和1.4倍，砷浓度为3000μg/L时，EX-33在胞内砷富集量提高33％的条件下，蛋白质产量提高11％。糖类是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质，As(Ⅴ)浓度为3μg/L时，EX-22生成了更多可溶性糖，为亲本(未转基因)的1.3倍，As(Ⅴ)浓度为3000μg/L时，EX-18生成了更多可溶性糖，为亲本(未转基因)的1.54倍，EX-33为亲本(未转基因)的1.04倍。淀粉是植物中糖的主要储存形式，植物通过光合作用合成葡萄糖，葡萄糖快速转化为淀粉。当体系中的As(Ⅴ)浓度上升时，藻细胞内淀粉含量普遍呈上升趋势。结合藻细胞内总砷的测定数据，当As(Ⅴ)浓度为3、3000μg/L时，EX-18生成了更多的淀粉，均为亲本(未转基因)的1.1倍，当As(Ⅴ)浓度为300μg/L时，EX-33生成了更多的淀粉，为亲本(未转基因)的1.17倍。

如表4，通过测定藻细胞的C、H、N含量，可以看出无论是野生株还是突变株，As(Ⅴ)浓度在0～3000mg/L的范围内，不同砷浓度下，藻细胞内的C和H含量均无显著性差异，当As(Ⅴ)浓度增加时，突变株合成了更多的含氮物质来增加对砷的抗性。

表4莱茵衣藻野生株及突变株藻细胞内C、H、N含量

实施例4

实施例1获得的莱茵衣藻突变株中光合色素含量的测定：

(1)用1ml 90％(v/v)丙酮提取约10mg干燥的生物质，涡旋20s，然后以10000rpm离心2分钟，重复上述提取程序直到溶液为无色。

(2)使用分光光度计分别在665nm，645nm和470nm处测量chlorophy(叶绿素)和类胡萝卜素含量的吸光度。

(3)按下式进行计算：

Chlorophy(mg/L)：(11.75×A₆₆₅-2.35×A₆₄₅₊18.61×A₆₄₅-3.96×A₆₆₅)

类胡萝卜素(mg/L)：(1000A₄₇₀-2.27Chla-81.4Chlb)/198

A_x：吸光度

实验结果表明：

如图5所示，在培养体系中加入As(Ⅴ)后，对光合色素叶绿素的产生会有一定的抑制作用，但此时As(Ⅴ)浓度为3μg/L时，EX-33生成的叶绿素含量为亲本(未转基因)的7.13倍，As(Ⅴ)浓度为300μg/L时，EX-22生成的叶绿素含量为亲本(未转基因)的5.68倍，As(Ⅴ)浓度为3000μg/L时，EX-33生成的类胡萝卜素含量为亲本(未转基因)的2.18倍，生成的类胡萝卜素含量随着As(Ⅴ)浓度的增加而增加，表明藻细胞受到了胁迫作用。

Claims (6)

1.一种莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)突变株EX-33，其特征在于，所述莱茵衣藻突变株EX-33中过表达PHT基因；所述PHT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述莱茵衣藻突变株EX-33保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M20221698，保藏日期为2022年10月28日。

2.权利要求1所述的莱茵衣藻突变株的应用，其特征在于，在莱茵衣藻的正常培养条件下高富集砷。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述正常培养条件为在全温培养箱中使用无磷-TAP培养基培养，转速100-140rpm，持续光照光强为80-120 µmol m⁻² s⁻¹，培养温度为室温。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述砷选自三价砷、五价砷和有机砷。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述莱茵衣藻突变株应用于工业废水处理。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述工业废水中砷含量为300~3000 μg/L。