CN1597697A - 一种人的甲状旁腺素1－34肽相关肽－Pro－Pro－[Arg11]]hPTH(1－34)－Pro－Pro - Google Patents

Abstract

本发明提供了人甲状旁腺素1－34肽相关肽－Pro－Pro－[Arg¹¹]hPTH(1－34)－Pro－Pro，及其构建方法和生产工艺。本发明所述的人甲状旁腺素1－34肽相关肽－Pro－Pro－[Arg¹¹]hPTH(1－34)－Pro－Pro是一种前体肽，在机体内N端的两个脯氨酸残基会被切除，生成有生物活性的[Arg¹¹]hPTH(1－34)－Pro－Pro。本发明还提供了[Arg¹¹]hPTH(1－34)－Pro－Pro的产生方法。甲状旁腺素1－34肽相关肽的制备包含以下步骤：(a)在适合表达人甲状旁腺素1－34肽相关肽－Pro－Pro－[Arg¹¹]hPTH(1－34)－Pro－Pro的条件下，培养含有权利要求3所述重组质粒pED－4P－[Arg¹¹]hPTH(1－34)的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有Pro－Pro－[Arg¹¹]hPTH(1－34)－Pro－Pro肽片段的融合蛋白；(c)分离纯化出Pro－Pro－[Arg¹¹]hPTH(1－34)－Pro－Pro肽；(d)借助体内的二肽酶IV等酶将Pro－Pro－[Arg¹¹]hPTH(1－34)－Pro－Pro肽N端的两个脯氨酸残基切除，形成[Arg¹¹]hPTH(1－34)－Pro－Pro肽。本发明还提供了人甲状旁腺素1－34肽相关肽基因和氨基酸序列、载体和宿主细胞。本发明可高效简便地生产高纯度、高活力的人甲状旁腺素1－34肽相关肽。

Description

一种人的甲状旁腺素1-34肽相关肽——Pro-Pro-[Arg11]hPTH(1-34)-Pro-Pro

技术领域

本发明涉及DNA重组技术及医学相关领域。更具体地，本发明涉及人甲状旁腺素1-34肽相关肽——Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro，构建方法及其生产工艺，以及[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽的生成方法。以及相应的编码序列、载体和宿主细胞，用途。

背景技术

甲状旁腺素(PTH)是一个调解胞外钙平衡的84个氨基酸组成的多肽。PTH发挥生物学活性不需要完整的分子。实验表明hPTH(1-34)在体内、外保持有完整PTH的几乎全部生物活性。

1.PTH(1-34)的结构及与受体作用研究概况

hPTH(1-34)的空间结构由N端α-螺旋、C端α-螺旋及连接它们的结构随环境而改变的连接区三部分组成。N端α-螺旋的N末端及C端α-螺旋的C末端为柔性区。N端是负责生理活性的片段，C端是负责受体结合的片段。

受体结合点位于C末端区(Arg²⁵-Phe³⁴)，而(His¹⁴-Leu²⁴)节段的一些残基看来可形成第二个受体结合点。研究发现，Arg²⁵-Val³¹附近的残基最有可能直接参与结合。14-24位残基很可能只是简单地稳定C末端螺旋结构而未直接参与受体结合。

PTH(1-34)和PTH1R的结合包括PTH配体C端15-34与受体胞外N-端的高亲和力作用(这对受体的结合起决定性作用)以及PTH配体N-端1-14与受体近膜区的低亲和力作用(这与受体的激活密切相关)。

将N末端的NH₃ ⁺放入受体的信号传导部位是hPTH(1-34)发挥生理活性所绝对必要的，N末端三肽一定的柔性以及连接区的柔性也许可协助将N末端的NH₃ ⁺放在受体中正确的部位这一相配过程。hPTH(1-34)的Ser¹，Gly¹²，Lys¹³，Arg²⁰等氨基酸在hPTH(1-34)发挥生理作用时起着更特殊的作用。

晶体结构的研究表明，hPTH(1-34)的整体结构是个微弯的螺旋，弯曲介于12-21位残基之间，N末端螺旋(3-11位残基)与C末端螺旋(21-33位残基)之间弯曲了15°。在Asn¹⁶与Glu¹⁹，Ser¹⁷与Arg²⁰之间有氢键，Glu²²与Arg²⁵之间有盐桥。虽然hPTH(1-34)是一个连续的螺旋，但它实际分成6-20位残基及21-33位残基两个油水两亲性螺旋，此二螺旋的疏水侧链朝向不同方向。Gly¹²周围螺旋构型对于整个生物活性是必需的。

hPTH(1-34)中间区域的刚性与螺旋的弯曲方向都有重要的功能作用。在晶体结构中连贯的螺旋构型也许能更好地代表hPTH(1-34)有活性的受体的结合构型。

Adams等用p-苯甲酰苯丙氨酸做的光亲和交联及定点突变的结果鉴别出在hPTH(1-34)·PTH/PTHrP受体复合物上的两个接触点，hPTH(1-34)的Ser¹与受体的Met4²⁴以及hPTH(1-34)的Lys¹³与受体的Arg¹⁸⁶用过去光亲和交联及定点突变研究的知识将hPTH(1-34)对接到了受体当中。

在Jin等的模型当中，具有激动剂活性的hPTH(1-34)的N-末端区域与由受体的跨膜3区、跨膜4区、跨膜6区及第2及第3个胞外环区组成的口袋结合。hPTH(1-34)的中间区域夹在第1个胞外环区与跨膜1区相邻的受体的N末端胞外区之间。hPTH(1-34)的C末端区与推测的PTH/PTHrP受体的结合域形成广泛的相互作用。该接触面由hPTH(1-34)的Leu²⁴，Trp²³及Leu²⁸残基与受体的Phe¹⁷³及Leu¹⁷⁴之间的疏水相互作用及hPTH(1-34)的Arg²⁴与受体的Glu¹⁸⁰及Glu⁷⁷之间和hPTH(1-34)的Lys²⁷及受体的Glu¹⁶⁹之间的亲水相互作用构成。在此模型中，hPTH(1-34)的Leu²⁴和Leu²⁸位于接触面的中心，而Val³¹位于疏水块的末端，Asp³⁰暴露于溶剂中。

由分子模建结果可知，hPTH(1-34)的Ser¹在与受体相互作用中是形成hPTH(1-34)·PTH/PTHrP受体复合物的两个接触点之一，是一关键性的氨基酸，表明要使hPTH(1-34)及相关肽发挥最大活性，Ser¹是不能被取代及受空间位阻影响的，即它必须以游离氨基(末端氨基酸)的形式存在。由分子模建的结果还可推断出，在hPTH(1-34)的C末端Phe³⁴上连上其它氨基酸或Leu¹¹被其它氨基酸替代，不影响其C末端与受体的结合。

由于hPTH在预防和治疗骨质疏松症方面有着潜在的医学及药学应用前景，因此寻找廉价，简便，低毒的hPTH相关肽及其制备方法成了近几十年人们密切关注的问题。

 2.PTH(1-34)，PTH(1-38)的基因工程

当将PTH连续以低剂量给药时，PTH对动物及人具有体内促合成或促骨生长作用。涉及到在骨细胞中激活AC及促骨质量增加作用，hPTH前34个氨基酸组成的肽片段具有与hPTH(1-84)完全一致的生物活性。因此开发PTH，特别是hPTH(1-34)和hPTH(1-38)来治疗各种骨失调，特别是骨质疏松症，是相当有前景的。因而必须找到生产hPTH(1-34)及hPTH(1-38)的新方法，因为传统的化学合成方法不仅耗时而对于大规模生产来说成本相当高。

HPTH(1-34)表达产物是可溶性的，对E.coli有一定的毒性，可抑制细胞的生长，从而降低了hPTH的表达。因此有必要采用一种诱导体系，使hPTH直到被诱导后才表达。

国内有人采用了带有T7RNA聚合酶和强的T7启动子的pET11C表达质粒(该质粒可以高水平地指导目的基因的转录，使宿主细胞mRNA的转录大大降低，因而可以高产量地表达目的基因)，成功地在E.coli中较高水平地表达了hPTH。因该短肽的分子量很小，占菌体总蛋白的绝对含量较低。但小分子短肽的纯化较为方便，可通过超滤等方法即可获得较高程度的纯化产物

Hermann Gram为大规模生产hPTH(1-38)在融合方面进行了新的开拓：T4噬菌体编码的gp55的12.5kD的氨基末端片段被改编以做为hPTH(1-38)肽的载体。T4噬菌体的gp55蛋白及其称为gp55Δ的截短的12.5kD形式，容易在E.coli中高水平表达并积累于包涵体中。HPTH(1-38)含有两个蛋氨酸残基，一个色氨酸残基，并以丝氨酸为起始。这种情况不适合用上述化学裂解法。因此他们在gp55Δ部分及hPTH(1-38)肽中间加入了一个对酸不稳定的天冬氨酰-脯氨酰-脯氨酰接头。先用稀盐酸溶解包涵体，然后在最佳条件下使反应发生以促进用工程法导入的在融合蛋白中对酸不稳定的天冬氨酰-脯氨酰肽键的裂解，这样即直接从包涵体中释放出该激素片段。在酸水解后，从融合蛋白上释放出了在氨基端含有脯氨酰-脯氨酰二肽的hPTH(1-38)衍生物，随后二肽部分用从Lactococcus lactis克隆得到的，在E.coli中过表达的，并从重组细菌的胞液中纯化得近乎均质的重组二肽酶除去。在试验规模的发酵中，用于该研究的那批发酵中gp55Δ-hPTH(1-38)的浓度介于0.9g/L至1.2g/L之间，其表达水平占菌体总蛋白50％以上，每升菌培养液可获得80mg以上的纯hPTH(1-38)，总产率为35％。用同一重组菌株的150L规模的发酵结果显示重组蛋白的表达可以增至4g/L，即该过程适合大规模生产，花费不多。在运作中，gp55Δ-hPTH(1-38)融合蛋白是故意以包涵体的形式表达的，因为这些不溶性的蛋白聚集物可抵抗全部或部分的蛋白水解性降解。并且，含有融合蛋白的包涵体易于用差速离心法及在洗涤过程得到纯化。

在日本有人利用β-galactosidase derivative与hPTH(1-34)融合后在大肠杆菌中形成包涵体，利用Kex2-660和V8蛋白酶对其进行修饰以得到正确加工的人PTH(1-34)肽。然后，通过以下工艺流程：菌体发酵——洗涤纯化融合蛋白(包涵体)——酶解——加乙酸初步去除杂质蛋白——POROS HS50柱纯POROS R2 50纯化——去除乙腈——TSK凝胶-120T纯化的纯品。最终，得到了0.5g/L的产量。

还有人利用人PTH(1-34)-Asp-Pro-与胰岛素前体基因融合表达的方式在大肠杆菌中进行表达，采用酸解的方式来获取人PTH(1-34)-Asp-，得到了约300mg/L的产量。

除了PTH(1-34)和PTH(1-84)以外，用基因工程方法表达的其他PTH衍生物还有PTH(1-37)，PTH(1-38)，PTH(3-84)等。

一般来说，完整的84肽可采用单独表达的方式进行表达(包括分泌型表达)，而PTH34肽则采用与宿主蛋白融合表达的方式。

迄今为止，PTH(1-34)肽的生产工艺还有待完善，而且，有必要设计出PTH(1-34)相关肽以及探讨其药用，医用价值。

3.二肽酶IV及PPCE

二肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV，DPP IV)是一种丝氨酸外肽酶，存在于脊椎动物的许多细胞和组织中，能从肽的氨基末端释放二肽。最适合底物是N末端二肽为X_aa-Pro的少于30个氨基酸的寡肽。是由Hopsu-Havo和Glenner 1966年发现，并从肝、肾组织中提取的。DPPIV的天然底物有P物质，血纤维蛋白的A链，白介素-2，细胞因子，绒毛膜促性腺激素，肾素抑制剂，人生长激素释放激素，人胃泌激素释放激素，人胰多肽，生长因子，神经递质，催乳激素，抑肽酶，促黑激素释放抑制因子及其它出现的底物。

DPPIV参与蛋白质及肽的末端消化：在肠细胞(enterocyte)及近端肾小管的刷状缘上。通过降解肽激素、生长因子及其它调节蛋白，DPPIV参与了细胞活化、生长及分化。在血管内皮细胞中，DPPIV从血纤维蛋白单体上切掉二肽，妨碍血液凝集，并在内皮细胞中作为影响蛋白合成的级联反应的一部分。

DPPIV的分布显示出物种、性别、器官依赖的差别。

大鼠、小鼠、豚鼠、猫、兔、仓鼠的小肠肠细胞及近曲小管细胞的微绒毛区域都有DPPIV的分布，而在其它器官(如肝、血管及胸腺)的分布上却显示出种属特异性。

人体DPPIV分布在：

①肾；

②消化道(小肠、唾液腺、胰、肝)；

③免疫系统(脾、扁桃腺、胸腺)；

④血细胞；

⑤心血管系统(主要存在于毛细血管床的静脉部分的内皮细胞中，显示有DPPIV活性的毛细血管所在的系统及器官最重要的有：心脏、消化道、肺、泌尿生殖系统、免疫系统、内分泌系统、运动系统及胎盘。对于心肌、条状肌、主动脉及肺，这部分活性几乎是这些器官DPPIV的全部活性)；

⑥呼吸系统；

⑦胎盘；

⑧皮肤(在正常皮肤的表皮基部及基部上角质细胞中，人黑素细胞，以及真皮的成纤维细胞、炎细胞中都有分布)；

⑨肾上腺；

⑩前列腺。

PPCE为水解-Pro-X-的内肽酶。

由于Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro的N端第2位为-Pro-，Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro应归为DPPIV的推测底物。

Hermann Gram用重组的DPPIV在体外以DPPIV：Pro-Pro-hPTH(1-38)＝1∶106655的摩尔比(重量比为1∶2000，DPPIV的分子量以250000 Dalton计算)，将Pro-Pro-hPTH(1-38)的Pro-Pro-切掉，反应完全约需24小时。

有人测定过8个志愿者的DPPIV血浆浓度，平均值为16.5±2.9nmol/L，而hPTH(1-84)的正常值为2.122×10^-3nmol/L(20ng/L)，则正常血浆中DPPIV与hPTH(1-84)的摩尔比为7775.6∶1。

文献中骨质疏松症的hPTH(1-34)治疗用量为每天50ug-100ug。如果我们认为该多肽在血中均匀分布，而正常人的平均血容量为6.25L，则血中hPTH(1-34)的浓度为1.9436～3.8873nmol/L(8000～16000ng/L)。则给药后血浆中DPPIV与hPTH(1-34)的摩尔比为8.5～4.24∶1。

并且，除了血浆中存在的可溶性DPPIV外，体内尚有丰富的的DPPIV嵌于细胞膜上，它们在各种活化的炎症细胞及上皮细胞上高度表达。

这样，体内总DPPIV含量远远超过提供治疗量[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro的Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro的水平。

GLP-1中含有的N末端X-Ala-可被DPPIV切掉，GLP-1的体内半衰期少于2min。而DPPIV外切-Ala-X-键的速度仅为外切-Pro-X-速度的1％～5％，PPCE内切-Ala-X-键的速度仅为内切-Pro-X-速度的0.1％～1％。因此，Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro的N末端X-Pro-应在2min内被体内的DPPIV和/或PPCE切掉。

并且，只有DPPIV将Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro的Pro-Pro-切掉后，Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro的Ser¹才能充分暴露出来，用于与受体的对接过程，从而发挥活性。

4.体内与hPTH降解有关的主要酶

肽酶并非肽特异，而是肽键特异，即它们有切割多种不同肽或同一肽的相同肽键的趋势。因而，在一定程度上，人们可以从某种酶降解某些底物(即已知该酶对该底物的水解位点)的能力来推断该酶降解一个氨基酸序列已知的多肽的可能性，即我们可推断hPTH(1-34)中对身体中一些酶来说哪些是敏感键，并通过蛋白质工程的方法避开它们，从而创造出更高活力，更长半衰期的多肽。

(1)作用于C末端的酶

a.羧肽酶A和B催化C末端氨基酸的顺序水解。羧肽酶的作用受到其特异性的限制。如果C末端残基为Arg，Pro或Lys，羧肽酶A将不起作用。而且，如果倒数第二位残基是Pro，则两种酶都不起作用。

b.肽酰脯氨酰-氨基酸水解酶(Peptidyl prolyl-amino acid hydrolase)(EC3.4.16.2，PCP)，即原来的angiotensinase C，对具有下列通式的底物有催化作用：R₁-Pro-R₂-OH，将Pro与R₂之间的键切断。对没有氨基末端保护的Pro-R₂二肽，C末端氨基酸R₂为Pro，Hyp的多肽，倒数第二位氨基酸不是Pro的多肽不能水解。

(2)内肽酶

a.Meprin对hPTH在肾的微绒毛膜上的降解有决定作用，而Leu⁶⁷-Gly⁶⁸是纯Meprin在hPTH上可断裂的肽键之一。

b.另一种来自牛肾皮质细胞膜上的内肽酶可切断hPTH的Phe³⁴-Val³⁵及Leu³⁷-Gly³⁸之间的肽键。

5.以往有关个别氨基酸取代与活性关系的研究

用弱活性片段——大鼠PTH(1-14)NH₂的类似物及缺失了大部分氨基末端胞外域的截短的PTH-1受体hP1R-delNt研究了PTH的氨基末端信号部分与受体的反应。在(1-14)的132种单取代类似物中，多数(1-9)区域的取代物对在稳定表达hP1R-WT的LLC-PK1细胞中的cAMP形成无活性，而多数在(10-14)区域的取代物有活性。一些取代(如Ser³→Ala，Asn¹⁰→Ala或Gln，Leu¹¹→Arg，Gly¹²→Ala，His¹⁴→Trp)使活性增加2～10倍。

发明内容：

本发明的一个目的是设计出一种人甲状旁腺素1-34肽相关肽——Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro。

本发明的另一个目的就是提供人甲状旁腺素1-34肽相关肽的生产工艺，该工艺可高效，简便地生产高纯度，高活力的人甲状旁腺素1-34肽相关肽。

本发明的另一个目的就是提供[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro的生成方法。

本发明的另一个目的是提供相应的编码序列，载体和宿主细胞。

在本发明的第一方面，提供了一种人甲状旁腺素1-34肽相关肽，它包含[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro，以及在[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro前的二肽酶IV及PPCE酶切位点。在一种优选例中，该甲状旁腺素相关肽具有SEQ ID NO：2氨基酸序列。

在本发明的第二方面，在上段提到的[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro的结构中，提供了使[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro较hPTH(1-34)肽具有对抗体内某些特定酶水解的特征并有可能使活性增加的个别氨基酸替换及氨基酸末端加载。

在本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，它包含一核苷酸序列，本发明中的人甲状旁腺素1-34相关肽的核苷酸序列。在优选例中，该核苷酸序列编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。在另一优选例中，该多核苷酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在本发明的第四方面，是重组人甲状旁腺素1-34肽相关肽的用途。在医学上，重组人甲状旁腺素1-34肽相关肽能用于增强骨骼、软骨、肌腱、韧带、血管、皮肤的生物力度，预防及治疗骨质疏松症及骨关节病，防止骨折，减缓骨的衰老性蜕变，促进伤口愈合；在美容方面，用于维持皮肤的湿润、弹性，除皱，营养皮肤、头发、指甲；也可作为体育运动营养的补充材料。

在本发明的第五方面，提供了一种人甲状旁腺素1-34肽相关肽的制备方法，该方法包含步骤：

(a).在适合表达人甲状旁腺素1-34肽相关肽Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro的条件下，培养含有权利要求3所述重组质粒pED-4P-[Arg¹¹]hPTH(1-34)的宿主细胞；

(b).从培养物中分离出具有Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽片段的融合蛋白。

(c).分离纯化出Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽。

(d).借助体内二肽酶IV及PPCE酶切Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽，形成[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽

在一优选例中，在本发明的方法中，所述的步骤(b)包括通过溶菌，洗涤，乙醇沉淀等方法分离出Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽与大肠杆菌L-天冬酰胺酶II的C末端组成的融合蛋白；用酸水解方法从所述融合蛋白中切下大肠杆菌L-天冬酰胺酶II的C末端，形成Pro-Pro-[Arg¹¹]-PTH(1-34)-Pro-Pro肽；

在另一优选例中，所述的步骤(c)包括通过CM52离子交换柱分离出Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽。

在另一优选例中，所述的步骤(c)还包括Sephadex G-25柱脱盐和冻干。

附图说明

图1A为Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro融合表达质粒pED-4P-[Arg¹¹]hPTH(1-34)的质粒结构图。

图1B为pED-4P-[Arg¹¹]hPTH(1-34)融合基因的表达及在诱导后表达产物占全菌蛋白的百分含量随时间变化的情况.泳道1为中分子量蛋白标准对照，泳道2为PET28a空载体表达，泳道3为pED-4P-[Arg¹¹]hPTH(1-34)/BL21未被乳糖诱导的情况，泳道4-10分别为pED-4P-[Arg¹¹]hPTH(1-34)/BL21在乳糖诱导1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h后的蛋白表达情况。

图1C为Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro融合表达质粒pED-4P-[Arg¹¹]hPTH(1-34)的DNA测序图谱。

图2融合蛋白加工及目的肽纯化电泳图谱

Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro的融合蛋白加工及目的肽纯化电泳图谱.泳道1为中分子量蛋白标准对照；泳道2为胰岛素A链；泳道3为pED-4P-[Arg¹¹]hPTH(1-34)/BL21在乳糖诱导7h后的蛋白表达；泳道4为酸水解前的融合蛋白；泳道5为融合蛋白在酸水解后的水解液；泳道6为柱层析纯化后的Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro纯品。

图3等电聚焦(IEF)电泳图谱.Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro的IEF电泳图谱。

图4质谱法(MS)测定分子量.Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro的MS图谱。

图5 HPLC纯度鉴定图谱.Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro的HPLC纯度鉴定图谱。

图6氨基酸组成分析数据.Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro的氨基酸组成分析数据。

图7生物活性测定图(促雏鸡血钙升高法)Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro的剂量活力关系。

图8药理活性的大鼠骨密度指标。在每天给与不同剂量的Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro，16周后的大鼠骨密度(bonematerial density，BMD)。(SHAMb-假手术组基础值，SHAM baseline；OVXb-卵巢摘除组基础值，OVX baseline；SHAM-假手术组；NS-生理盐水组，卵巢摘除14周后，每天给与含0.001N HCl的生理盐水，给药16周；Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro-L-Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro低剂量，卵巢摘除14周后，每天给与溶解在含0.001N HCl的生理盐水中的Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro 0.4nmol/100g，给药16周；Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro-M-Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro中剂量，卵巢摘除14周后，每天给与溶解在含0.001N HCl的生理盐水中的Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro0.6nmol/100g，给药16周；Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro-H-Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro高剂量，卵巢摘除14周后，每天给与溶解在含0.001N HCl的生理盐水中的Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro 0.9nmol/100g，给药16周。(以上图中凡标为4PPTH者均为Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro。)

具体实施方式

为了改进hPTH(1-34)肽相关肽制备的基因工程方法，本文充分利用了已有的能够专一性酶切Pro-Pro-X肽键的二肽酶IV及PPCE的研究结果，并结合CM52离子交换层析方法，成功地实现了重组人PTH(1-34)肽相关肽的高效表达，经发酵，乙醇沉淀，酸水解，柱层析纯化，每升发酵液至少可达26.61mg产物。

具体说来，本发明采用基因工程的方法，将hPTH(1-34)肽相关肽与大肠杆菌L-天冬酰胺酶II的C末端融合并采用酸水解及体内酶切后加工的方法，不仅获得了较高的表达量，提供了一种快速纯化hPTH(1-34)肽相关肽的方法，极大简化了纯化过程，而且避免了化学合成中副产物对人体带来较高毒性的弊端及小肽单独表达后易分解，不利于检测，纯化，体外酶切造成二次污染，易带来抗原反应，费用高，操作复杂等缺点。

PTH84肽内部的某些位点在表达和纯化过程中，易于被蛋白酶降解而造成损失，回收率降低。针对这些位点，特别在hPTH(1-34)相关肽的结构中，做了个别氨基酸替换及末端加载，使这些蛋白酶无法作用而起到在制备过程中稳定及体内半衰期延长的作用。

虽然在hPTH(1-34)的结构中含Asp(Asp³⁰)，但由于在酸水解条件下Asp-Pro比Asp-Val(Asp³⁰-Val³¹)更易被水解，因此适当控制酸水解条件(温度，浓度，时间等)，是可以达到选择性水解而使Asp³⁰-Val³¹不断裂的。

充分利用了体内大量存在的二肽酶IV及PPCE已知的性质特征，在[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽N-端加入了一个Pro-Pro-接头，从而较好地解决了由于融合表达而产生的后加工问题。

由于二肽酶IV只能加工N-末端第二位为-Pro-或-Ala-的二肽，PPCE也只能水解-Pro-X，-Ala-X肽键，还需要先用酸水解的方法先将融合伙伴先切掉，而且为避免引起抗原性，这段在体外提前去掉也是非常必要的。留下的这个Pro-Pro-接头到体内不会引起抗原反应：不仅小，而且在体内会被大量的二肽酶IV及PPCE迅速地水解掉。

本发明对PTH应用中的大量样品来源问题，以及增加活性，延长半衰期等有一定启示，为今后研究，利用PTH，并发展创新的PTH相关肽打下良好的基础。同时由于本发明可做为一个多肽表达体系的平台，因此本发明同样适用于其他符合酸水解和二肽酶IV及PPCE加工条件的多肽。

本发明提供了甲状旁腺素1-34肽相关肽，其中在hPTH(1-34)肽的中部用Arg取代了原有的Leu¹¹，在C末端Phe³⁴上连上了保护性“尾勾”-Pro-Pro，[Arg¹¹]-PTH(1-34)-Pro-Pro肽前引入了二肽酶IV及PPCE酶切位点。一种优选的前体肽包含SEQ ID NO：2氨基酸序列。

本发明还提供了相应的编码该相关肽的核苷酸序列，一种优选的多核苷酸具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了生产PTH(1-34)肽相关肽的方法。

通常，该方法包括以下步骤：

a.表达[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽前体——Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro

该步骤就是在适合表达的条件下，培养本发明上述转化的，携带表达载体的宿主细胞，而所述表达载体中含有编码甲状旁腺素前体肽或其融合蛋白的DNA序列。

一种优选的发酵条件是：BIOSTAT C20-3型20升自动发酵罐(B.Braun BiotechInternational，Germany)中进行，挑取表达量达50％以上的pED-4P-[Arg¹¹]hPTH(1-34)/BL21，接种到320mL自制的玉米浆培养基中，37℃过夜培养。将过夜培养物转接至含16L自制的玉米浆培养基的20L的发酵罐中于37℃进行恒溶氧培养(溶氧量12％左右)，当OD600达到0.6左右时，加入终浓度为5mmol/L的乳糖，诱导7小时后终止发酵。

b.从培养物中分离Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽的融合蛋白，然后酸水解去除大肠杆菌L-天冬酰胺酶II的C末端

一种优选的分离纯化融合蛋白的条件是：

纯化：将发酵结束后，离心收集的菌体置于含溶菌酶的菌体裂解缓冲液中，37℃搅拌过夜。8000rpm离心20min，收集沉淀。用包涵体洗涤缓冲液洗涤沉淀，8000rpm离心20min，收集沉淀。用2M尿素洗涤沉淀，8000rpm离心20min，收集沉淀。用包涵体裂解缓冲液溶解沉淀，搅拌下过夜。次日8000rpm离心20min，收集上清。用乙醇沉淀出融合蛋白，离心收集沉淀。

沉淀用50mM盐酸溶解，48℃保温，进行酸水解。

c.分离纯化出Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽

一种优化方法是通过CM52离子交换柱分离Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽

此外，所述的步骤c还包括Sephadex G-25柱脱盐和冻干。

一种离子交换纯化Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro的优选条件是：将酸水解产物用等电点沉淀法除掉融合伙伴大肠杆菌L-天冬酰胺酶II的C末端。上清液或滤液稀释后上样于用0.10mol/L乙酸铵平衡好的CM52离子交换柱，将0.10mol/L乙酸铵对0.28mol/L乙酸铵进行梯度洗脱，收集样品峰。

d.利用生物体内大量存在的二肽酶IV及PPCE酶切Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽，在体内得到[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽，并被生物体直接利用。

由于本发明改进了人甲状旁腺素的编码序列，并采用乙醇沉淀，酸水解，CM52离子交换层析法的工艺，因此本发明工艺可高效，简便，经济地生产高纯度，高活力的人甲状旁腺素1-34肽相关肽。

下边结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

材料：

(1)菌株与质粒：

大肠杆菌(Escherichia coli AS1.357)该菌种从中国菌种保藏中心获得。

宿主菌E.coli BL21是基因工程常用工具菌种，在与基因工程研究有关的实验室一般都有保存。

质粒pET28a购自Novagen公司。

(2)酶和试剂：

分子克隆工具酶和试剂、细菌基因组、质粒抽提试剂盒为普洛麦格(Promega)公司产品；

PTH(1-34)肽购自Sigma公司；

CM52离子纤维素树脂购自Whatman公司(No.4037050)；

低分子量标准蛋白(14400-97400道尔顿)购自上海西巴斯生物技术开发有限公司(中国科学院上海生物化学研究所)；

胰岛素注射液购自徐州万邦生化制药有限公司。

(4)培养基：

LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。该书是基因工程技术的经典著作，在许多高校图书馆都有收藏。

玉米浆培养基含有：玉米浆25g/L，牛肉浸膏15g/L，味精10g/L。

方法

分子生物学操作方法

质粒提取、聚合酶链反应、内切酶酶切、DNA片断的回收、连接和转化大肠杆菌：在基因工程研究领域，这些都是常规操作方法，参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。

重组蛋白表达量的测定：参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；ALaboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，方法进行。)

实施例1

基因的合成

1.根据Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，设计并由上海生工生物工程技术服务有限公司在美国PE公司391型DNA自动合成仪上合成了如下3个片段。

(1)5′-GGG GGA TCC ACC GTC CGT TTC CGA AAT CCA ACT GAT GCA TAA TCGTGG TAAACA TCA G-3′

(2)5′-AAAAAG CTT ACG GCG GGAAGT TAT GTA CAT CCT GCA GTT TC-3′

(3)5′-TGCCAAGCTTACGGCGGG-3′

2.PCR扩增得到目的基因。DNA序列分析由上海生物工程公司代为测定。测序结果证实了以人工合成的基因片段(1)，(2)为引物，pED-hPTH(1-34)重组质粒为模板得到的PCR产物的序列含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

可编码具有SEQ ID NO：2所示的蛋白质。

实施例2

工程菌的构建

pED是本实验室构建的适合于短肽高效表达与加工的重组质粒，该重组质粒系将消去了唯一酸水解位点的L-天门冬酰胺酶C末端127肽基因以及一组多克隆位点引入质粒pET28a的NcoI和BamHI位点之间构建而成。

(1)用限制性内切酶BamHI和HindIII将用人工和PCR方法合成的hPTH(1-34)基因切下装入pED的相应位点之间，并保持原有阅读框架。重组质粒经限制酶分析法筛出重组质粒pED-hPTH(1-34)。转化感受态BL21(DE3)，得相应工程菌，DNA序列分析也与预期的相符。该菌株命名为大肠杆菌pED-hPTH(1-34)/BL21。

(2)将实施例1中构建的目的基因用BamHI/HindIII双酶切后，于经同样处理的pED-hPTH(1-34)重组质粒连接，转染宿主菌BL21。抗性平板筛选阳性克隆，挑选单菌落进行培养。当菌体密度达到0.6OD600时，加入终浓度为5mmol/L的乳糖进行诱导表达，该阳性菌株表达目的产物。抽提该阳性菌株质粒，以基因片段5′-TGCCAAGCTTACGGCGGG-3′为引物，进行PCR反应，可见到预期长度的PCR扩增片段。DNA序列分析也与预期的相符(基因测序结果见图1C)。该菌株命名为大肠杆菌pED-4P-[Arg¹¹]hPTH(1-34)/BL21，其表达结果见图1B，在分子量为22000道尔顿处，可见到明显的蛋白表达条带，表达量与空载体的门冬酰胺酶C末端片段蛋白表达量相近，并为不可溶性蛋白。

实施例3

基因工程菌发酵及Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽的融合蛋白的表达与分离纯化

将单克隆的工程菌pED-4P-[Arg¹¹]hPTH(1-34)/BL21接种含卡那霉素的液体LB培养基，37℃震荡培养至A600约0.6时加入诱导剂乳糖至终浓度5mmol。继续培养7小时，取样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，在分子量约22000D处出现新的蛋白条带(图1B)与理论推算值一致。Densitometric analysis分析显示：在诱导7h后，pED-4P-[Arg¹¹]hPTH(1-34)/BL21表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的53.6％，并且在胞内形成了包涵体。用0.68V乙醇沉淀4M尿素中的融合蛋白，-20℃预冷20min后，9000rpm离心，收集上清，再用3.5V乙醇沉淀其中的融合蛋白。用30h，48℃，50mM，5％的条件对融合蛋白进行酸水解。

实施例4

分离纯化出Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽

将Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro融合蛋白的酸水解产物调节至融合伙伴的等电点4.86，待产生沉淀后用离心或过滤方法除掉沉淀。上清或滤液再调至与洗脱液基本一致的pH值，稀释至原水解液体积的10倍左右，流动上样于用0.10mol/L乙酸铵平衡好的CM52离子交换柱，将0.10mol/L乙酸铵对0.28mol/L乙酸铵进行梯度洗脱，收集样品峰。

实施例5

Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽的鉴定

(1)Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽的HPLC纯度鉴定

将样品上HPLC反向柱(Shim-pack CLC-ODS 6.0mmID×15cm P/N 228-00808-91)。

采用溶液A对溶液B(70％：30％→35％：65％)40分钟线性梯度洗脱。溶液A：0.1％TFA水溶液；溶液B为含0.1％TFA的60％乙腈水溶液。

HPLC鉴定纯度为90％(图5为在215nm的HPLC图谱)

(3)质谱分析

方法为：电喷雾质谱

测得重组制备的Pro-Pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-Pro-Pro肽分子量为4549.7898道尔顿。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权力要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110>中国药科大学

<120>一种人的甲状旁腺素1-34肽相关肽——Pro-Pro-[Arg11]hPTH(1-34)-Pro-Pro

<130>4ppth

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>114

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(114)

<400>1

 cca ccg tcc gtt tcc gaa atc caa ctg atg cat aat cgt ggt aaa cat    48

 Pro Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Arg Gly Lys His

 1                   5                       10                 15

 ctg aac tcc atg gaa cgt gtt gaa tgg ctg cgt aag aaa ctg cag gat    96

 Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

                 20                      25                  30

gta cat aac ttc ccg ccg                                             114

Val His Asn Phe Pro Pro

        35

<210>2

<211>38

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>Synthetic Construct

<400>2

Pro Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Arg Gly Lys His

1                   5                       10                   15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

              20                      25                    30

Val His Asn Phe Pro Pro

         35

Claims (10)

1.一种重组人甲状旁腺素1-34肽相关肽，其特征在于，它具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，即Pro Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Arg Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu ArgVal Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe Pro Pro。

2.一种多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，即cca ccg tccgtt tcc gaa atc caa ctg atg cat aat cgt ggt aaa cat ctg aac tcc atg gaa cgt gtt gaatgg ctg cgt aag aaa ctgcag gat gta cat aac ttc ccg ccg。该核苷酸序列编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

3.一种重组人甲状旁腺素1-34肽相关肽的构建方法：将由PCR方法生成的末端加有Asp-Pro-Pro-的大肠杆菌L-天冬酰胺酶II的C末端127个氨基酸的DNA片段引入质粒pET28a的NcoI和BamHI位点之间构成重组质粒pED。将用人工和PCR方法合成的Pro-Pro-hPTH(1-34)基因插入到pED载体T7启动子的下游。这个重组质粒称作pED-hPTH(1-34)。pED-hPTH(1-34)包括了一个融合伙伴和一个asp-pro-pro-hPTH(1-34)基因组成的片段。pED-hPTH(1-34)上的hPTH(1-34)片段，被由人工和PCR方法合成的[Arg¹¹]hPTH(1-34)-Pro-Pro基因通过双酶切的方法置换下来，重组质粒称作pED-4P-[Arg¹¹]hPTH(1-34)。pED-4P-[Arg¹¹]hPTH(1-34)包括了一个融合伙伴和一个asp-pro-pro-[Arg¹¹]-hPTH(1-34)-pro-pro基因组成的片段。所述的该相关肽的构建方法，其特征在于：该融合蛋白使用大肠杆菌L-天冬酰胺酶II的C末端127个氨基酸残基作为融合伙伴，在融合伙伴基因与活性多肽基因之间以天冬-脯-脯三肽连接，天冬-脯之间的肽键对酸敏感。表达产物可经50mM盐酸特异性水解，释放目的多肽。

4.一种重组人甲状旁腺素1-34肽相关肽的纯化方法：取重组菌体，经含有溶菌酶，Triton X-100裂解液裂解和经含有Triton X-100的洗涤液等多次洗涤，收集沉淀。沉淀重新溶解在4mol/L的尿素溶液中。该悬液经乙醇分级沉淀，收集0.68～3.5倍乙醇的沉淀。该沉淀用50mmol/L的HCl将其溶解进行酸水解。水解液用稀氨水调pH到4.86，然后离心收集上清。上清液过CM52色谱柱。经乙酸铵溶液梯度洗脱，收集相应的峰。后者再过Sephadex G-25柱脱盐。最终样品Pro-Pro-[Arg¹¹]hPTH(1-34)-Pro-Pro经冷冻干燥，-20℃保存。

5.一种基因工程产品生成体内激素的方法。其特征在于，利用待预防或治疗疾病的生物体自身(或人体自身)作为生物反应器，完成最后一步酶切，得到目的肽，并在体内发挥作用。即在前体药物进入体内后，通过体内丰富的二肽酶IV迅速酶切掉人的甲状旁腺素1-34肽相关肽——Pro-Pro-[Arg¹¹]hPTH(1-34)-Pro-Pro N端的Pro-Pro-，产生促成骨作用的活性形式——[Arg¹¹]hPTH(1-34)-Pro-Pro肽。

6.一种延长基因工程产品半衰期的方法。其特征在于，先找出原活性多肽对体内某些含量较丰的酶的敏感位点，进行氨基酸替换(在本案中是将hPTH(1-34)的Leu¹¹→Arg)及末端加载(在本案中是将hPTH(1-34)中的Phe³⁴→Phe³⁴Pro³⁵Pro³⁶)，使之抵抗机体多肽水解酶(如内肽酶，氨基肽酶，肽酰脯氨酰-氨基酸水解酶等)的能力增加，半衰期延长。借用生物信息学提供的活性多肽与受体对接时某些区域的特殊用途及存在位置，找出合适的改造部位。

7.一种提高基因工程产品活性的方法。其特征在于，利用对某些类似片段改造的构效关系信息(在本案中为[Arg¹¹]hPTH(1-14)的活性大于hPTH(1-14)的活性)，使我们获得活性增高的基因工程产品的几率增加。(在本案中Pro-Pro-[Arg¹¹]hPTH(1-34)-Pro-Pro的活性比Pro-Pro-hPTH(1-34)的活性高。)

8.权力要求1所述重组人甲状旁腺素1-34肽相关肽，其特征在于，它有下述用途：在医学上，重组人甲状旁腺素1-34肽相关肽能用于增加骨密度，增强骨骼、软骨、肌腱、韧带、血管、皮肤的生物力度，预防及治疗骨质疏松症及骨关节病，防止骨折，减缓骨的衰老性蜕变，促进伤口愈合；在美容方面，用于维持皮肤的湿润、弹性，除皱，营养皮肤、头发、指甲；也可作为体育运动营养的补充材料。

9.权力要求8所述重组人甲状旁腺素1-34肽相关肽的用途，其特征在于，Pro-Pro-[Arg¹¹]hPTH(1-34)-Pro-Pro可与药物载体组合制成药物组合物。

10.权力要求8所述重组人甲状旁腺素1-34肽相关肽的用途，其特征在于，Pro-Pro-[Arg¹¹]hPTH(1-34)-Pro-Pro可与其他药物活性成分组合制成药物组合物。

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