CN1318070A - 修饰的大肠杆菌内毒素ⅱ信号肽以及表达该肽与异源蛋白质的融合蛋白的微生物 - Google Patents

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Abstract

一种如下制备的异源蛋白质：(ⅰ)培养一种转化了表达载体的微生物以便产生异源蛋白质并分泌到周质中，其中的表达载体包含编码融合在一起的修饰过的大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽和异源蛋白质的基因，所述修饰过的大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽是通过将氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)的大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽中第2、第4、第5、第12、第20和第22个氨基酸中的至少一个用其他氨基酸取代获得的，条件是修饰后的肽第2和第4个氨基酸至少一个是赖氨酸；(ⅱ)从周质中纯化所述异源蛋白质。

Description

修饰的大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽以及表达 该肽与异源蛋白质的融合蛋白的微生物
发明领域
本发明涉及修饰过的大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽，编码该肽的基因，包含融合在一起的该基因和编码异源蛋白质的基因的载体，转化了所述载体的微生物，以及利用该微生物制备所述异源蛋白质的方法。
发明背景
已有许多异源蛋白质是利用基因工程化的宿主微生物通过胞内方法或者分泌法制备的。
在胞内方法中，编码异源蛋白质的基因在微生物的细胞质内表达和积累。虽然公知该方法能得到较高的异源蛋白质产量，但表达出来的异源蛋白质不是天然活性形式而是氨基端甲硫氨酸化了的。此外，通过这种方法制备的没有生物活性的异源蛋白质经常形成不溶的包涵体，必须将其溶解并经过重折叠步骤转化为天然的活性形式。
对于分泌法来说，编码信号肽和异源蛋白质的融合蛋白的基因在微生物的细胞质内表达，然后融合蛋白质在跨过胞质膜时被微生物的信号肽酶加工去掉信号肽。加工过的蛋白质被分泌到微生物的细胞质(内)膜和外膜之间的周质空间。但是，已知该方法与胞内方法相比，异源蛋白质的产量低得多。因此，分泌法的产率需要提高。就此方法而言，已有报道说信号肽酶准确和有效地切割被表达融合蛋白的信号肽基元在提高分泌异源蛋白质的产量上非常重要(Akita,M.等，生物化学杂志265:8164(1990))。
一般来说，信号肽分为两种，亲水信号肽和疏水信号肽。亲水信号肽通常由12到70个氨基酸组成。典型的疏水信号肽，例如大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽含有13到30个氨基酸，它包含3个区域：含有1或2个碱性氨基酸的氨基端亲水区；含有大约10个碱性氨基酸的中央疏水区；以及含有带小侧链的氨基酸的羧基端亲水区。
由于以和信号肽形成融合蛋白的形式表达的异源蛋白质经常被胞质蛋白酶迅速降解，当信号肽的分泌效率低时，分泌出来的异源蛋白质的产量下降。因此，通过修饰宿主微生物中表达的融合蛋白质的信号肽基元能增加分泌出来的异源蛋白质的产量。
人生长激素(hGH)包含191个氨基酸，分子量为21500Da。自从1956年首次从人垂体中分离到纯化形式的hGH(Li和Papkoff，科学124:1293(1956))以来，对hGH已做了大量研究来阐述，例如hGH对人代谢的影响(Beck,J.C.等，科学125:884(1957))以及hGH对垂体小躯干的抑制活性(Raben,M.S.，临床内分泌学杂志18:901(1958))。最近，有报道说hGH对治疗唐氏综合症、骨质疏松症、创伤和烧伤也有效。
由于从人垂体获得的hGH量有限，有人试图通过胞内方法在基因工程化的大肠杆菌中产生大量hGH(Goeddel,D.V.等，自然281:544(1979))。但是，该方法也受到前面提到的产生不适合人用的甲硫氨酸化hGH问题的牵制。进一步尝试利用二肽氨肽酶除去甲硫氨酸化hGH的甲硫氨酸导致hGH产量低得令人难以接受。
相应地，也试过分泌生产天然hGH。例如，EP55942、20147和114695公开了表达天然形式的hGH并通过分泌回收它的方法。然而，由这些方法产生的可回收量的hGH仍然很低。
EP177343公开了一种制备hGH的方法，包括在有表达诱导物异丙基硫代-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的情况下，表达编码hGH和碱性磷酸酶或者内毒素信号肽的融合蛋白的基因，并将hGH分泌到周质中。但是，该方法hGH产量低，并且需要使用昂贵的表达诱导物IPTG。
因此，需要建立一种高产hGH的有效方法。
发明概述
因此，本发明的一个目的是提供一种修饰过的大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽，用它能有利地在分泌法产生异源蛋白质中增强分泌效率。
本发明的另一个目的是提供编码该肽的基因。
本发明的再一目的是提供包含融合在一起的该基因和编码异源蛋白质的基因的载体，
本发明的再一目的是提供转化了所述载体的微生物，
本发明的再一目的是提供利用该微生物制备所述异源蛋白质的方法。
与本发明的一个方面相对应，此处提供了一种修饰过的大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽(命名为MST)，其特征在于氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)的大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽中第2、第4、第5、第12、第20和第22个氨基酸中的至少一个被其他氨基酸取代，条件是MST第2和第4个氨基酸至少一个是赖氨酸：
Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser IleAla Thr Asn Ala Tyr Ala
附图简述
从以下对优选实施方案的描述并结合附图可以容易地看出本发明以上所述目的和特点，其中：
图1显示构建载体pT-hGH的过程；
图2描述了构建载体pUC19ST和pUC19SH的过程；
图3表示构建载体pT14SSH的过程；
图4显示构建载体pT14S1SH的过程；
图5再现了纯hGH的SDS-PAGE分析结果。
发明详述
在本发明所述修饰过的大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽(MST)中，优选的是那些，其中
第2个氨基酸Lys未被取代；
第4个氨基酸Asn被Ser、Thr、Lys或Gln取代；
第5个氨基酸Ile未被取代，或者被Thr或Ser取代；
第12个氨基酸Met未被取代，或者被Ala、Gly、Val、Leu或Ile取代；
第20个氨基酸Asn未被取代，或者被Ile、Phe、Ala或Val取代；以及
第22个氨基酸Tyr未被取代，或者被Gln、Asn、Ala或Lys取代。
同样优选的是那些，其中
第2个氨基酸Lys被任何其他氨基酸取代；
第4个氨基酸Asn被Lys取代；
第5个氨基酸Ile被Ser、Thr、Asn、Gln或Arg取代；
第12个氨基酸Met未被取代，或者被Ala、Gly、Val、Leu或Ile取代；
第20个氨基酸Asn未被取代，或者被Ile、Phe、Ala或Val取代；以及
第22个氨基酸Tyr未被取代，或者被Gln、Asn、Ala或Lys取代。
更优选的MST是那些有以下氨基酸取代情况的：
(a)第4个Thr取代Asn，第22个Gln取代Tyr；
(b)第4个Thr取代Asn，第20个Val取代Asn，第22个Gln取代Tyr；
(c)第4个Lys取代Asn，第5个Thr取代Ile，第22个Gln取代Tyr；
(d)第4个Ser取代Asn，第22个Gln取代Tyr；
(e)第4个Ser取代Asn，第20个Val取代Asn，第22个Gln取代Tyr；
(f)第4个Thr取代Asn，第12个Gly取代Met，第20个Val取代Asn，第22个Gln取代Tyr；
(g)第4个Thr取代Asn，第12个Leu取代Met，第20个Val取代Asn，第22个Gln取代Tyr；
(h)第4个Lys取代Asn，第5个Ser取代Ile，第22个Gln取代Tyr；
(i)第2个Val取代Lys，第4个Lys取代Asn，第5个Ser取代Ile，第22个Gln取代Tyr；以及
(j)第4个Lys取代Asn，第20个Val取代Asn，第22个Gln取代Tyr。
本发明的MST可以由含有从MST氨基酸序列根据遗传密码子推导的核苷酸序列的基因编码。由于密码子简并性，可能存在编码相同氨基酸的不同密码子，因此本发明的MST包括所有推导自MST氨基酸序列的核苷酸序列。优选，所述MST基因可以包括1或多个大肠杆菌的偏爱密码子。
可以利用定点突变(Papworth,C.等，策略9:3(1996))通过将天然大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽基因(命名为STⅡ基因)的1或多个核苷酸突变来制备MST基因。可以利用常规方法(Sambrook等，分子克隆：实验指南，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA(1989))来获得大肠杆菌的STⅡ基因。此外，也可以化学合成MST基因。
本发明的MST当与异源蛋白质融合时能带来该异源蛋白质通过微生物(例如大肠杆菌)细胞膜的高效分泌。这样，利用含有融合在一起的MST基因和编码异源蛋白质的基因的表达载体，就能够便利地在大肠杆菌的细胞质中表达MST和异源蛋白质的融合蛋白(称为MST/异源蛋白)，并且融合蛋白能被有效地加工除去MST基元从而将异源蛋白质迅速地释放到大肠杆菌的周质中。因此，利用本发明的MST将导致异源蛋白质产率大幅提高。
MST基因和编码异源蛋白质的基因的融合可以依照常规连接方法操作(Sambrook等，同前)。
代表性的异源蛋白质包括人生长激素(hGH)、集落刺激因子(G-CSF)、干扰素、白介素、尿激酶原、胰岛素、Ⅷ因子、水蛭素、超氧化物歧化酶和降钙素，但它们并不限制可以用于本发明的异源蛋白质。编码异源蛋白质的基因可以通过常规方法获得，例如cDNA文库筛选和PCR。
本发明的表达载体可以进一步包含如下核苷酸序列(SEQ ID NO:2)之修饰过的大肠杆菌内毒素ⅡShine-Dalgano序列(修饰过的STⅡ SD序列)，该序列刚好插在MST基因的起始密码子之前：
5’-GAGGTGTTTT-3’
修饰过的STⅡ SD序列含有一个4核苷酸长的STⅡ SD序列(GAGG)和一个6核苷酸长的富T序列。修饰过的STⅡ SD序列中的STⅡ SD序列提供了一个非常强的核糖体结合位点，在没有表达诱导物(例如异丙基硫代-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))时它能增强表达水平。修饰过的STⅡSD序列中的富T序列起到防止由此转录出来的mRNA形成二级结构的作用，从而增强表达效率。修饰过的STⅡ SD序列可以通过常规方法制备(Sambrook等，同前)，例如化学合成法。此外，可以对具有如下核苷酸序列(SEQ ID NO:3)的SDⅡ SD基因进行定点突变来获得修饰过的STⅡ SD序列：
5’-GCTCTAGAGGTTGAGGTGTTTTATGAAAAAGAATA-3’
可以将修饰过的STⅡ SD序列插在MST基因的ATG起始密码子前面，或者可以将MST基因的ATG起始密码子前面的STⅡ SD序列进行修饰。
本发明的表达载体的例子包括在实施例1到10中制备的pT14S1SH-4T22Q、pT14S1SH-4T20V22Q、pT14S1SH-4KST22Q、pT14S1SH-4S22Q、pT14S1SH-4S20V22Q、pT14S1SH-4T12G20V22Q、pT14S1SH-4T12L20V22Q、pT14SSH-4K5S22Q、pT14SSH-2V4K5T22Q和pT14SSH-4K20V22Q，优选的载体是pT14S1SH-4T22Q和pT14S1SH-4T20V22Q。
可以按照常规转化方法(Sambrook等，同前)将本发明的表达载体导入微生物，例如大肠杆菌中。在转化微生物中，优选转化子大肠杆菌HM10011和HM10012，它们已根据用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约的规定，于1998年8月12日保藏在韩国微生物培养物保藏中心(KCCM)(地址：食品工程系，工学院，Yonsei University,Sodaemungu,Seoul120-749,Republic of Korea)，保藏号分别为KCCM-10137和KCCM-10138。
通过培养转化微生物使它表达编码MST/异源蛋白质融合蛋白的基因并将异源蛋白质分泌到周质，以及从周质中回收异源蛋白质可以制备到异源蛋白质。转化微生物的培养可以按照常规方法(Sambrook等，同前)进行。可以将微生物培养物离心或过滤来收集分泌异源蛋白质的微生物。可以按照常规方法(Ausubel,F.M.等，现代分子生物学指南，1989)将所述转化微生物破碎来获得周质溶液。例如可以在低渗溶液(例如蒸馏水)中通过渗透压冲击来破碎微生物。周质液中的异源蛋白质的回收可以按照常规方法(Sambrook等，同前)操作，例如离子交换层析、凝胶过滤柱层析或者免疫柱层析。例如，可以通过DEAE-Separose柱层析、Phenyl Separose柱层析和Sephadex G-100柱层析等连续操作来纯化hGH。
根据本发明制备的异源蛋白质是天然形态的，氨基端没有甲硫氨酸化，因此，可以直接用于各种用途。
以下实施例意在进一步阐述本发明，而非限制其范围。预备实施例1：筛选人生长激素cDNA基因
(步骤1)构建人垂体cDNA文库
向1g人垂体加入10ml胍溶液(4M异硫氰酸胍，50mM Tris-HCl,pH7.5,10mM EDTA，和5％2-巯基乙醇)并匀浆。匀浆物于6℃、10000rpm离心10分钟。向上清液中加入1/10体积的2％乙醚肌氨酰(Sigma,USA),混合物于65℃保持2分钟。所得溶液中加入氯化铯至终浓度0.1g/ml,将混合物在9ml垫层溶液(5.7M CsCl和0.1mM EDTA)上于25000rpm离心16小时以便得到RNA沉淀。沉淀物溶于3ml悬浮液(5mM EDTA,0.5％肌氨酰和5％巯基乙醇)中，然后相继用酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1,v/v/v)体系和氯仿/异戊醇(24∶1,v/v/)抽提。向合并在一起的抽提液中加入1/10体积的3M醋酸钠和2.5体积的乙醇，利用常规方法(Sambrook等，同前)离心混合物以便获得RNA沉淀。将RNA沉淀溶于蒸馏水(D.W.)中，于70℃保持10分钟。然后加入氯化锂至浓度为0.5M，用寡dT-纤维素层析(Type3,Collaboratory Research,USA)按照Aviv和Leder的方法(Aviv,H和Leder P，分子生物学杂志134:743(1972))分离poly(A)+RNA。这样获得的poly(A)+RNA于65℃处理5分钟，冷却至0℃，立即加入20μl5mM dNTP、40μl5X缓冲液(0.25MTris-HCl,pH8.3,0.5M KCl和50mM MgCl2)、10μl 200mM DTT、20μl0.5mg/ml oligo(T12-18)(Pharmacia Inc.,Sweden)、80μl D.W.、10μl(10单位)RNAsin(Promega,USA)和20μl(20单位)AMV反转录酶(Life ScienceInc.,USA)。混合物于42℃反应90分钟后，向反应体系中加入5ul 0.5MEDTA(pH8.0)和200μl Tris缓冲的酚，混匀，并于室温、10000rpm离心10分钟。用二乙醚将上清液提取两次，向合并在一起的提取液中混入20μl3M醋酸钠和1ml 95％乙醇来沉淀单链cDNA(ss cDNA)。
为了由ss cDNA合成双链cDNA(ds cDNA)，将ss cDNA沉淀溶于284μl D.W.中，加入40μl 5mM NTP、80μl 5X第二链(SS)缓冲液(250mM Tris-HCl(pH7.2)、450mM KCl、15mM二硫苏糖醇、15mM MgCl2和0.25mg/ml牛血清清蛋白)、12μl 5mM β-NAD+、2μl 3000Ci/mmol[α-32P]dCTP、4μl(4单位)大肠杆菌DNA连接酶以及10μl(100单位)大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ。混合物于14℃反应16小时后，反应体系如上进行酚提取和乙醇沉淀来获得ds cDNA沉淀。
为了产生ds cDNA的平末端，将ds cDNA沉淀溶于42μl D.W.中，随后加入5μl NTP、16μl 5XSS缓冲液、1μl 5mM β-NAD+、4μlRNAase(2μg/ml,Biolabs,USA)、4μl(4单位)RNAase H、2μl(20单位)大肠杆菌DNA连接酶和4μl(8单位)T4 DNA连接酶，随后使混合物于37℃反应45分钟。反应完成后，反应体系如上进行酚提取和乙醇沉淀以便获得平末端的ds cDNA沉淀。
为了通过甲基化保护ds cDNA的EcoRⅠ限制位点，将平末端ds cDNA沉淀溶于25μl D.W.中，然后加入27μl 2X甲基化酶缓冲液(100mM NaCl、100mM Tris-HCl,pH8.0和1mM EDTA)、1μl 50X SAM溶液(1mg S-腺苷甲硫氨酸)和10μl(10单位)EcoRⅠ甲基化酶(Biolabs,USA)。混合物于37℃反应2小时，反应体系如上进行酚提取和乙醇沉淀。将沉淀的cDNA与EcoRⅠ接头(Biolabs,USA)和T4 DNA连接酶混合，混合物于4℃反应16小时以便获得EcoRⅠ接头连接的cDNA。
用EcoRⅠ处理所述EcoRⅠ接头连接的cDNA，经过Sepharose CL-4B柱层析来除去残留的接头。将EcoRⅠ接头连接的cDNA插入λgt11(Amersham,USA)的EcoRⅠ位点。利用入体外包裹试剂盒(AmershamCo.,USA)将这样得到的λgt11进行体外包裹，然后转染大肠杆菌Y1088(ATCC37195)从而获得人垂体cDNA文库。
(步骤2)筛选人生长激素cDNA基因
为了从步骤1制备的cDNA文库中筛选出人生长激素克隆，如下进行噬斑杂交。
根据报道的人生长激素的氨基端氨基酸序列(Liu W.K.，等，生物化学与生物物理学报93:428(1964)；Li,C.H.等，美国化学学会杂志88:2050(1966))，设计并合成以下核苷酸序列代表的30核苷酸片段混合序列寡核苷酸探针：
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg(SEQ ID NO:4)
5’-TTCCCAACCATTCCCTTATCCAGG-3’(SEQ ID NO:5)
利用混合序列寡核苷酸探针，按照Benton等的方法(Benton,W.E.等，科学196:180(1977))进行初级噬斑杂交以便得到阳性克隆。对这些克隆进行次级和三级噬斑杂交从而获得含有人生长激素cDNA基因的克隆。
为了证实该克隆含有人生长激素基因，用EcoRⅠ切割所克隆的噬菌体DNA，然后利用混合序列寡核苷酸探针对DNA片段做Southern印迹(Southern,E.，分子生物学杂志98:503(1975))。此外，将含有人生长激素基因的0.65kb EcoRⅠ片段插入M13mp18载体(Pharmacia,USA)的EcoRⅠ位点从而获得载体M13-hGH。利用双脱氧介导的链终止法(Sanger,F.等，美国科学院学报74:5463-5467(1977))确定载体M13-hGH中的人生长激素基因的核苷酸序列。预备实施例2：制备编码成熟人生长激素的基因
为了制备编码成熟人生长激素的cDNA基因，利用以下引物S1和AS1对在预备实施例1的步骤2中获得的载体M13-hGH做PCR。设计有义引物S1来提供位于成熟人生长激素第1个氨基酸的密码子上游的NdeⅠ限制位点(5’-CATATG-3’)，反义引物AS1提供终止密码子下游的BamHⅠ限制位点(5’-GGATCC-3’)。
有义引物S1(SEQ ID NO:6)
5’-CCGCATATGTTCCCAACCATTCCC-3’
反义AS1(SEQ ID NO:7)
5’-GCTGGATCCTAGAAGCCACAGCTGC-3’
用NdeⅠ和BamHⅠ切割扩增好的人生长激素基因从而获得编码成熟人生长激素的基因(命名为hGH基因)。将hGH基因插入载体pET14b(Movagen,USA)来获得载体pT-hGH。
图1显示了以上构建载体pT-hGH的过程。预备实施例3：构建含有编码大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽/hGH融合蛋白的基因的载体
(步骤1)克隆大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽基因
为了制备大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽基因，在大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽的核苷酸序列的基础上设计下面一对互补寡核苷酸，并用DNA合成仪(380B型，Applied Biosystem,USA)合成。
有义链寡核苷酸STⅡ S1(SEQ ID NO:8)5’-TCATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTACGCGT-3’
反义链寡核苷酸STⅡ AS1(SEQ ID NO:9)
5’-ACGCGTAGGCATTTGTAGCAATAGAAAAAACGAACATAGATGCAAGAAGAAATGCGATATTCTTTTTCATGA-3’
将寡核苷酸设计成大肠杆菌内毒素Ⅱ的起始密码子上游有NcoⅠ和BspHⅠ限制位点，另一端通过一个沉默突变引入MluⅠ限制位点。
将两个寡核苷酸于95℃退火得到含有编码大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽的核苷酸序列(STⅡ基因)的平末端ds DNA片段。
将所述STⅡ基因插入载体pUC19(Biolabs,USA)中的SmaⅠ位点以获得载体pUC19ST。
(步骤2)制备编码STⅡ/hGH融合蛋白的基因
为了制备编码STⅡ/hGH融合蛋白的基因，利用在预备实施例2中使用过的引物S2和AS1，将预备实施例2中得到的载体pT-hGH做PCR。将有义引物S2设计成成熟人生长激素第1个氨基酸(苯丙氨酸)的密码子上游有MluⅠ限制位点(5’-CATATG-3’)。
有义引物S2(SEQ ID NO:10)
5’-GCGACGCGTTCCCAACCATTCCCTTATCC-3’
用MluⅠ和BamHⅠ切割扩增好的DNA片段，然后插入步骤2中获得的pUC19ST的MluⅠ/BamHⅠ部分。这样获得的载体pUC19SH含有编码STⅡ/hGH融合蛋白的基因(命名为STⅡ/hGH基因)。
图2描述了以上构建载体pUC19ST和pUC19SH的过程。
(步骤3)向STⅡ/hGH基因添加大肠杆菌内毒素Ⅱ Shine-Dalgarno序列
用BspHⅠ和BamHⅠ切割步骤2中获得的载体pUC19SH从而得到一个640bp的STⅡ-hGH片段，将它插入载体pET14b(Novagen,USA)的NcoⅠ/BamHⅠ部分得到载体pT14SH。
利用引物S3和AS3将载体pT14SH做PCR。将有义引物S3设计成提供大肠杆菌内毒素Ⅱ Shine-Dalgarno序列(称为STⅡ SD序列)和XbaⅠ限制位点，反义引物AS3提供位于成熟hGH终止密码子下游的BamHⅠ从而得到含有STⅡ SD和STⅡ-hGH融合基因的DNA片段(STⅡ SD-STⅡ-hGH)。
有义引物S3(SEQ ID NO:11)
5’-GCTCTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATA-3’
反义引物AS3(SEQ ID NO:12)
5’-GGATGCCACGCTGGATCCTAGAAAGCCACAGCTGC-3’
用XbaⅠ和BamHⅠ切割所述STⅡ SD-STⅡ-hGH片段，然后插入载体pET14b(Movagen,USA)的XbaⅠ/BamHⅠ部分得到载体pET14SSH。用载体pET14SSH转化大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene,USA)得到转化子命名为大肠杆菌HM10010。
图3表示以上构建载体pT14SSH的过程。预备实施例4：用STⅡ-hGH基因生产hGH
为了检验大肠杆菌内毒素ⅡSD序列对产生hGH的影响，分别在有和没有表达诱导物(IPTG)的情况下，将转化了载体pET14SSH的大肠杆菌BL21(DE3)和同样得自预备实施例3步骤3的大肠杆菌HM10010在LB培养基(1％bacto-蛋白胨，0.5％bacto-酵母提取物和1％NaCl)中于37℃培养24小时。每份培养物在10000rpm离心10分钟以便沉淀细菌细胞，将沉淀悬浮在1/10体积等渗溶液(20％蔗糖，含有1mM EDTA的10mM Tris-Cl缓冲液，pH7.0)中。悬浮液在室温下保持30分钟，然后在10000rpm离心15分钟以收集细菌细胞。将细胞于4℃重悬在D.W.中，在12000rpm离心20分钟从而得到上清液，作为周质液。利用抗hGH的抗体(Boehringer Mannheim)按照ELISA方法(Kato,K.等，免疫学杂志116:1554(1976))检测周质液中的hGH水平，计算每升培养物产生的hGH量。结果如表1所示。
                       表1
     pT14SH      pT14SSH
     IPTG     -     +    -     +
 hGH水平(mg/l)    120    100   330    250
从表1可以看出，含有STⅡ SD序列的载体pT14SSH即使在没有表达诱导物IPTG时也高产hGH。
实施例1到10
实施例1到10描述了根据本发明构建含有编码MST/hGH融合蛋白的基因的载体，其中MST代表修饰过的大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽。按照定点突变(Papworth C.等，策略9:3(1996))将得自预备实施例3之步骤3的质粒pT14SSH中的STⅡ基因或STⅡ SD序列进行修饰，这是通过利用一个带有修饰过的核苷酸序列的有义引物和带有与有义引物互补的核苷酸序列的反义引物做PCR进行的。
在实施例1到10中获得的修饰过的大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽MST(MST1到MST10)和STⅡ的特征见表2，以下描述实施例1到10的制备过程。
                                   表Ⅱ
 实施例          MST    2nd    4th     5th    12th    20th    22th
 STⅡ(SEQ ID NO:1)    Lys    Asn     Ile    Met    Asn    Tyr
    1  MST1(SEQ ID NO:13)    Lys    Thr     Ile    Met    Asn    Gln
    2  MST2(SEQ ID NO:14)    Lys    Thr     Ile    Met    Val    Gln
    3  MST3(SEQ ID NO:15)    Lys    Lys     Thr    Met    Asn    Gln
    4  MST4(SEQ ID NO:16)    Lys    Ser     Ile    Met    Asn    Gln
    5  MST5(SEQ ID NO:17)    Lys    Ser     Ile    Met    Val    Gln
    6  MST6(SEQ ID NO:18)    Lys    Thr     Ile    Gly    Val    Gln
    7  MST7(SEQ ID NO:19)    Lys    Thr     Ile    Leu    Val    Gln
    8  MST8(SEQ ID NO:20)    Lys    Lys     Ser    Met    Asn    Gln
    9  MST9(SEQ ID NO:21)    Val    Lys     Thr    Met    Asn    Gln
    10  MSTl0(SEQ ID NO:22)    Lys    Lys     Ile    Met    Val    Gln
实施例1：构建含有编码MST1/hGH融合蛋白的基因的载体
(步骤1)
利用以下互补引物S4和AS4将得自预备实施例3的载体pT14SSH做PCR，上述引物设计来以Thr密码子(ACA)取代STⅡ的第4个密码子(ATT)。
有义引物S4(SEQ ID NO:23)
5’-GGTGTTTTATGAAAAAGACAATCGCATTTCTTC-3’
反义引物AS4(SEQ ID NO:24)
5’-GAAGAAATGCGATTGTCTTTTTCATAAAACACC-3’
用XbaⅠ和MluⅠ切割这样得到的载体从而获得一个0.1kb的XbaⅠ/MluⅠ片段，将其插入载体pT14SSH的XbaⅠ/MluⅠ部分获得载体pT14SSH-4T。载体pT14SSH-4T含有编码修饰过的STⅡ/hGH融合蛋白的基因，所述蛋白STⅡ的第4个氨基酸被Thr代替。
(步骤2)
利用以下互补引物S5和AS5将载体pT14SSH-4T做PCR，上述引物设计来以Gln密码子(CAA)取代STⅡ的第22个密码子(AAT)从而获得载体pT14SSH-4T22Q。
有义引物S5(SEQ ID NO:25)
5’-CAAATGCCCAAGCGTTCCCA-3’
反义引物AS5(SEQ ID NO:26)
5’-TGGGAACGCTTGGGCATTTG-3’
载体pT14SSH-4T22Q含有编码MST1/hGH融合蛋白的基因，该蛋白中STⅡ的第4和22个氨基酸分别被Thr和Gln取代。
(步骤3)
利用以下互补引物S6和AS6将载体pT14SSH-4T22Q做PCR，所述引物在STⅡ SD序列5’-GAGG-3’和STⅡ起始密码子之间有如下所示的6核苷酸序列以便防止其mRNA转录物形成二级结构。
有义引物S6(SEQ ID NO:27)
5’-TCTAGAGGTTGAGGTGTTTTATGA-3’
反义引物AS6(SEQ ID NO:28)
5’-TCATAAAACACCTCAACCTCTAGA-3’
这样得到的载体pT14S1SH-4T22Q含有一个修饰过的STⅡ SD序列和编码MST1/hGH融合蛋白的基因，该蛋白的STⅡ的第4和第22个氨基酸分别被Thr和Gln取代。
图4显示了以上构建载体pT14S1SH的过程。
用载体pT14S1SH-4T22Q转化大肠杆菌BL21(DE3)得到一个转化子，命名为大肠杆菌HM10011，已于1998年8月12日保藏在韩国微生物培养物保藏中心(KCCM)，保藏号KCCM-10137。实施例2：构建含有编码MST2/hGH融合蛋白的基因的载体
重复实施例1中步骤2的过程，只是使用以下互补引物S7和AS7，所述引物设计来以Val和Gln密码子(GTT和CAA)分别取代STⅡ的第20和22个密码子(AAT和TAT)从而得到载体pT14SSH-4T20V22Q。
有义引物S7(SEQ ID NO:29)
5，-GTTTTTTCTATTTGCTACAGTTGCCCAAGCGTTCCCAACCATTCCC-3’
反义引物AS7(SEQ ID NO:30)
5’-GGGAATGGTTGGGAACGCTTGGGCAACTGTAGCAATAGAAAAAAC-3’
然后，重复实施例中步骤3的过程，只是利用载体pT14SSH-4T20V22Q得到载体pT14S1SH-4T20V22Q。载体pT14S1SH-4T20V22Q含有修饰过的STⅡ SD序列和一个编码MST1/hGH融合蛋白的基因，该蛋白的STⅡ的第4、第20和第22个氨基酸分别被Thr、Val和Gln取代。
用载体pT14S1SH-4T20V22Q转化大肠杆菌BL21(DE3)得到一个转化子，命名为大肠杆菌HM10012，已于1998年8月12日保藏在韩国微生物培养物保藏中心(KCCM)，保藏号KCCM-10138。实施例3：构建含有编码MST3/hGH融合蛋白的基因的载体
重复实施例1中步骤1的过程，只是使用以下互补引物S8和AS8，所述引物设计来以Lys和Thr密码子(AAG和ACA)分别取代STⅡ的第4和5个密码子(AAT和ATC)从而得到载体pT14SSH-4K5T。
有义引物S8(SEQ ID NO:31)
5’-GAGGTGTTTTATGAAAAAGAAGACAGCATTTCTTC-3’
反义引物AS8(SEQ ID NO:32)
5’-GAAGAAATGCTGTCTTCTTTTTCATAAAACACCTC-3’
使用载体pT14SSH-4K5T，重复实施例1中步骤2的过程以便得到载体pT14SSH-4K5T22Q。
然后，用载体pT14SSH-4K5T22Q重复实施例1中步骤3的过程以便得到载体pT14S1SH-4K5T22Q。载体pT14S1SH-4K5T22Q含有修饰过的STⅡ SD序列和一个编码MST3/hGH融合蛋白的基因，其中STⅡ的第4、5和22个氨基酸分别被Lys、Thr和Gln取代。
用载体pT14S1SH-4K5T22Q转化大肠杆菌BL21(DE3)从而获得转化子，命名为大肠杆菌HM10013。实施例4：构建含有编码MST4/hGH融合蛋白的基因的载体
重复实施例1中步骤1的过程，只是使用以下互补引物S9和AS9，所述引物设计来以Ser密码子(TCT)取代STⅡ的第4个密码子(AAT)从而得到载体pT14SSH-4S。
有义引物S9(SEQ ID NO:33)
5’-GAGGTGTTTTATGAAAAAGTCTATCGCATTTCTTC-3’
反义引物AS9(SEQ ID NO:34)
5’-GAAGAAATGCGATAGACTTTTTCATAAAACACCTC-3’
使用载体pT14SSH-4S，重复实施例1中步骤2的过程以便得到载体pT14SSH-4S22Q。
然后，用载体pT14SSH-4S22Q重复实施例1中步骤3的过程以便得到载体pT14S1SH-4S22Q。载体pT14S1SH-4S22Q含有修饰过的STⅡSD序列和一个编码MST4/hGH融合蛋白的基因，其中STⅡ的第4和22个氨基酸分别被Ser和Gln取代。
用载体pT14S1SH-4S22Q转化大肠杆菌BL21(DE3)从而获得转化子，命名为大肠杆菌HM10014。实施例5：构建含有编码MST5/hGH融合蛋白的基因的载体
重复实施例1中步骤2的过程，只是使用实施例4中得到的载体pT14SSH-4S和实施例2中使用的引物S7和AS7，从而得到载体pT14SSH-4S20V22Q。
然后使用载体pT14SSH-4S20V22Q，重复实施例1中步骤3的过程以便得到载体pT14S1SH-4S20V22Q。载体pT14S1SH-4S20V22Q含有修饰过的STⅡ SD序列和一个编码MST5/hGH融合蛋白的基因，其中STⅡ的第4、20和22个氨基酸分别被Ser、Val和Gln取代。
用载体pT14S1SH-4S20V22Q转化大肠杆菌BL21(DE3)从而获得转化子，命名为大肠杆菌HM10015。实施例6：构建含有编码MST6/hGH融合蛋白的基因的载体
用以下互补引物S10和AS10将实施例2中获得的载体pT14SSH-4T20V22Q做PCR，所述引物设计来以Gly密码子(GGT)取代STⅡ的第12个密码子(ATG)从而获得载体pT14SSH-4T12G20V22Q。
有义引物S10(SEQ ID NO:35)
5’-GCATTTCTTCTTGCATCTGGTTTCGTTTTTTCTATTGC-3’
反义引物AS10(SEQ ID NO:36)
5’-GCAATAGAAAAAACGAAACCAGATGCAAGAAGAAATGC-3’
然后使用载体pT14SSH-4T12G20V22Q重复实施例1中步骤3的过程以便得到载体pT14S1SH-4T12G20V22Q。载体pT14S1SH-4T12G20V22Q含有修饰过的STⅡ SD序列和一个编码MST6/hGH融合蛋白的基因，其中STⅡ的第4、12、20和22个氨基酸分别被Thr、Gly、Val和Gln取代。
用载体pT14S1SH-4T12G20V22Q转化大肠杆菌BL21(DE3)从而获得转化子，命名为大肠杆菌HM10016。实施例7：构建含有编码MST7/hGH融合蛋白的基因的载体
用以下互补引物S11和AS11将实施例6中获得的载体pT14SSH-4T12G20V22Q做PCR，所述引物设计以Leu密码子(CTT)取代STⅡ的第12个密码子(GGT)从而获得载体pT14SSH-4T12L20V22Q。
有义引物S11(SEQ ID NO:37)
5’-GCATTTCTTCTTGCATCTCTTTTCGTTTTTTCTATTGC-3’
反义引物AS11(SEQ ID NO:38)
5’-GCAATAGAAAAAACGAAAAGAGATGCAAGAAGAAATGC-3’
然后使用载体pT14SSH-4T12L20V22Q重复实施例1中步骤3的过程以便得到载体pT14S1SH-4T12L20V22Q。载体pT14S1SH-4T12L20V22Q含有修饰过的STⅡ SD序列和一个编码MST7/hGH融合蛋白的基因，其中STⅡ的第4、12、20和22个氨基酸分别被Thr、Leu、Val和Gln取代。
用载体pT14S1SH-4T12L20V22Q转化大肠杆菌BL21(DE3)从而获得转化子，命名为大肠杆菌HM10017。实施例8：构建含有编码MST8/hGH融合蛋白的基因的载体
重复实施例1中步骤1的过程，但使用以下互补引物S12和AS12，所述引物设计以Lys和Ser密码子(AAG和TCT)取代STⅡ的第4和第5个密码子(AAT和ATC)从而获得载体pT14SSH-4K5S。
有义引物S12(SEQ ID NO:39)
5’-GAGGTGTTTTATGAAAAAGAAGTCTGCATTTCTTC-3’
反义引物AS12(SEQ ID NO:40)
5’-GAAGAAATGCAGACTTCTTTTTCATAAAACACCTC-3’
使用载体pT14SSH-4K5S重复实施例1中步骤2的过程以便得到载体pT14SSH-4K5S22Q。载体pT14SSH-4K5S22Q含有编码MST8/hGH融合蛋白的基因，其中STⅡ的第4、5和22个氨基酸分别被Lys、Ser和Gln取代。
用载体pT14SSH-4K5S22Q转化大肠杆菌BL21(DE3)从而获得转化子，命名为大肠杆菌HM10018。实施例9：构建含有编码MST9/hGH融合蛋白的基因的载体
重复实施例1中步骤1的过程，但使用以下互补引物S13和AS13，所述引物设计以Val、Lys和Thr密码子(GTT、AAG和ACA)取代STⅡ的第2、4和5个密码子(AAA、AAT和ATC)从而获得载体pT14SSH-2V4K5T。
有义引物S13(SEQ ID NO:41)
5’-GAGGTGTTTTATGGTTAAGAAGACAGCATTTCTTC-3’
反义引物AS13(SEQ ID NO:42)
5’-GAAGAAATGCTGTCTTCTTAACCATAAAACACCTC-3’
使用载体pT14SSH-2V4K5T重复实施例1中步骤2的过程以便得到载体pT14SSH-2V4K5T22Q。载体pT14SSH-2V4K5T22Q含有编码MST9/hGH融合蛋白的基因，其中STⅡ的第2、4、5和22个氨基酸分别被Val、Lys、Thr和Gln取代。
用载体pT14SSH-2V4K5T22Q转化大肠杆菌BL21(DE3)从而获得转化子，命名为大肠杆菌HM10019。实施例10：构建含有编码MST10/hGH融合蛋白的基因的载体
重复实施例1中步骤1的过程，但使用以下互补引物S14和AS14，所述引物设计以Lys密码子(AAG)取代STⅡ的第4个密码子(AAT)从而获得载体pT14SSH-4K。
有义引物S14(SEQ ID NO:43)
5’-GAGGTGTTTTATGAAAAAGAAGATCGCATTTCTTC-3’
反义引物AS14(SEQ ID NO:44)
5’-GAAGAAATGCGATCTTCTTTTTCATAAAACACCTC-3’
使用载体pT14SSH-4K重复实施例1中步骤2的过程以便得到载体pT14SSH-4K22Q。用实施例2中使用的引物S7和AS7将载体pT14SSH-4K22Q做PCR从而获得载体pT14SSH-4K20V22Q。载体pT14SSH-4K20V22Q含有编码MST10/hGH融合蛋白的基因，其中STⅡ的第4、20和22个氨基酸分别被Lys、Val和Gln取代。
用载体pT14SSH-4K20V22Q转化大肠杆菌BL21(DE3)从而获得转化子，命名为大肠杆菌HM10020。实施例11：利用MST/hGH基因制备hGH
为了检验MST对hGH产量的影响，利用实施例1到10制备的转化子(大肠杆菌HM10011到HM10020)，在不加IPTG的情况下重复预备实施例4的过程。在预备实施例3之步骤3中制备的转化子HM10010作为对照。hGH水平计算为每升培养基中hGH的产量。结果如表Ⅲ所示。
                        表Ⅲ
    转化子     表达载体  hGH水平(mg/l)
大肠杆菌HM10010  p14SSH     330
大肠杆菌HM10012  pT14S1SH-4T20V22Q     1300
大肠杆菌HM10013  pT14S1SH-4K5T22Q     1270
大肠杆菌HM10014  pT14S1SH-4S22Q     1320
大肠杆菌HM10015  pT14S1SH-4S20V22Q     1230
大肠杆菌HM10016  pT14S1SH-4T12G20V22Q     1173
大肠杆菌HM10017  pT14S1SH-4T12L20V22Q     1282
大肠杆菌HM10018  pT14SSH-4K5S22Q     1150
大肠杆菌HM10019  pT14SSH-2V4K5T22Q     1140
大肠杆菌HM10020  pT14SSH-4K20V22Q     1230
从表Ⅲ可以看出，本发明的每个含有MST基因的载体hGH产量高于含有天然STⅡ的对照载体p14SSH。另外，在本发明的载体中，含有修饰过的STⅡ SD序列的载体与含有天然STⅡ SD序列的那些相比，hGH产量高。
实施例12:hGH的纯化
将实施例1中制备的转化子大肠杆菌HM10011培养在LB培养基中，用IPTG诱导MST/hGH的表达，培养物于6000rmp离心20分钟来收获细胞。通过重复预备实施例4的过程由这些细胞制备周质液。
将周质液调节至pH5.3到6.0，吸附到预平衡至pH5.8的DEAE-Separose(Pharmacia Inc.,Sweden)柱子上，然后用10mM NaCl溶液洗柱子。利用分别含有20mM、40mM和80mM的NaCl缓冲液洗脱hGH,收集含有hGH的流分并合并。
合并的流分经Phenyl Separose(Pharmacia Inc.,Sweden)柱层析获得纯度99％的hGH，经Sephadex G-100(Pharmacia Inc.,Sweden)柱层析进一步纯化。
纯化的hGH流分经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来确定纯度和hGH的大致浓度，然后经ELISA确定流分中的确切浓度。
图5再现了SDS-PAGE的结果，其中1道显示蛋白大小标记蛋白质；2道显示纯化的hGH。从图5可以看出，通过培养本发明的转化子可以获得高纯度的hGH。
此外，确定了hGH的氨基端氨基酸序列，结果显示按照本发明制备的hGH氨基端未被甲硫氨酸化。
参考以上具体实施方案对本发明进行了描述，但应当认识到本领域技术人员可以做出各种改进和变化，它们也落在所附权利要求限定的本发明的范围内。

Claims (15)

1．一种修饰过的大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽，其特征在于氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)的大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽中第2、第4、第5、第12、第20和第22个氨基酸中的至少一个被其他氨基酸取代，条件是修饰后的肽第2和第4个氨基酸至少一个是赖氨酸：
Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser IleAla Thr Asn Ala Tyr Ala
2．权利要求l所述修饰过的大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽，其中：
第2个氨基酸Lys未被取代；
第4个氨基酸Asn被Ser、Thr、Lys或Gln取代；
第5个氨基酸Ile未被取代，或者被Thr或Ser取代；
第12个氨基酸Met未被取代，或者被Ala、Gly、Val、Leu或Ile取代；
第20个氨基酸Asn未被取代，或者被Ile、Phe、Ala或Val取代；以及
第22个氨基酸Tyr未被取代，或者被Gln、Asn、Ala或Lys取代。
3．权利要求1所述修饰过的大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽，其中：
第2个氨基酸Lys被任何其他氨基酸取代；
第4个氨基酸Asn被Lys取代；
第5个氨基酸Ile被Ser、Thr、Asn、Gln或Arg取代；
第12个氨基酸Met未被取代，或者被Ala、Gly、Val、Leu或Ile取代；
第20个氨基酸Asn未被取代，或者被Ile、Phe、Ala或Val取代；以及
第22个氨基酸Tyr未被取代，或者被Gln、Asn、Ala或Lys取代。
4．权利要求1所述修饰过的大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽，其具有以下氨基酸取代情况：
(a)第4个Thr取代Asn，第22个Gln取代Tyr；
(b)第4个Thr取代Asn，第20个Val取代Asn，第22个Gln取代Tyr；
(c)第4个Lys取代Asn，第5个Thr取代Ile，第22个Gln取代Tyr；
(d)第4个Ser取代Asn，第22个Gln取代Tyr；
(e)第4个Ser取代Asn，第20个Val取代Asn，第22个Gln取代Tyr；
(f)第4个Thr取代Asn，第12个Gly取代Met，第20个Val取代Asn，第22个Gln取代Tyr；
(g)第4个Thr取代Asn，第12个Leu取代Met，第20个Val取代Asn，第22个Gln取代Tyr；
(h)第4个Lys取代Asn，第5个Ser取代Ile，第22个Gln取代Tyr；
(i)第2个Val取代Lys，第4个Lys取代Asn，第5个Thr取代Ile，第22个Gln取代Tyr；以及
(k)第4个Lys取代Asn，第20个Val取代Asn，第22个Gln取代Tyr。
5．编码权利要求1到4任何一项所述修饰过的大肠杆菌内毒素Ⅱ信号肽的基因。
6．包含融合在一起的权利要求5所述基因和编码异源蛋白质的基因的表达载体。
7．权利要求6的表达载体，其中所述异源蛋白质是人生长激素。
8．权利要求6的表达载体，它还包含具有如下核苷酸序列的一个修饰过的大肠杆菌内毒素Ⅱ Shine-Dalgano序列，该序列紧接在权利要求5所述基因的起始密码子前面：
5’-GAGGTGTTTT-3’
9．权利要求8的表达载体，它是pT14S1SH-4T22Q或者pT14S1SH-4T20V22Q。
10．转化了权利要求6到9任何一项所述表达载体的微生物。
11．权利要求10的微生物，它是被转化的大肠杆菌。
12．权利要求11的微生物，其中所述转化大肠杆菌是大肠杆菌HM10011(KCCM-10137)或大肠杆菌MH10012(KCCM-10138)。
13．一种在微生物中产生异源蛋白质的方法，包括培养权利要求10所述转化微生物以便产生异源蛋白质并将其分泌至周质；以及从周质中纯化该异源蛋白质。
14．权利要求13的方法，其中所述转化微生物是大肠杆菌HM10011(KCCM-10137)或大肠杆菌MH10012(KCCM-10138)。
15．权利要求14的方法，其中所述异源蛋白质是人生长激素。
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6242177B1 (en) * 1995-03-01 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
KR100356140B1 (ko) 1999-07-08 2002-10-19 한미약품공업 주식회사 인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체 및 이의 생산 방법
KR100360594B1 (ko) * 2000-01-19 2002-11-13 한미약품공업 주식회사 인간 인터페론 알파의 발현 분비벡터 및 이를 이용한인터페론 알파의 생산 방법
KR100570422B1 (ko) * 2003-10-16 2006-04-11 한미약품 주식회사 대장균 분비서열을 이용하여 항체 단편을 분비·생산하는 발현벡터 및 이를 이용하여 항체 단편을 대량 생산하는 방법
WO2005047334A1 (en) 2003-11-13 2005-05-26 Hanmi Pharmaceutical. Co., Ltd. Igg fc fragment for a drug carrier and method for the preparation thereof
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
ES2605022T3 (es) 2006-07-06 2017-03-10 Daewoong Co., Ltd. Una formulación líquida estable de la hormona del crecimiento humana
US20080124355A1 (en) 2006-09-22 2008-05-29 David Gordon Bermudes Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment
US8241623B1 (en) 2009-02-09 2012-08-14 David Bermudes Protease sensitivity expression system
US8771669B1 (en) 2010-02-09 2014-07-08 David Gordon Bermudes Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria
US8524220B1 (en) 2010-02-09 2013-09-03 David Gordon Bermudes Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria
US9597379B1 (en) 2010-02-09 2017-03-21 David Gordon Bermudes Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies
KR101831300B1 (ko) 2010-10-29 2018-02-23 한미사이언스 주식회사 재조합 대장균으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 정제하는 방법
US9593339B1 (en) 2013-02-14 2017-03-14 David Gordon Bermudes Bacteria carrying bacteriophage and protease inhibitors for the treatment of disorders and methods of treatment
US9737592B1 (en) 2014-02-14 2017-08-22 David Gordon Bermudes Topical and orally administered protease inhibitors and bacterial vectors for the treatment of disorders and methods of treatment
US11446398B2 (en) 2016-04-11 2022-09-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
EA037848B1 (ru) 2016-07-14 2021-05-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Биохимический Агент" Гибридный белок, полинуклеотид, генетическая конструкция, продуцент, препарат для регенерации хряща (варианты)
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US20220403001A1 (en) 2018-06-12 2022-12-22 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
WO2020086742A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
EP3935159A1 (en) 2019-03-08 2022-01-12 Obsidian Therapeutics, Inc. Human carbonic anhydrase 2 compositions and methods for tunable regulation
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
US20220267398A1 (en) 2019-06-12 2022-08-25 Obsidian Therapeutics, Inc. Ca2 compositions and methods for tunable regulation
US20220259284A1 (en) 2019-06-12 2022-08-18 Obsidian Therapeutics, Inc. Ca2 compositions and methods for tunable regulation
US20220348937A1 (en) 2019-09-06 2022-11-03 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine
TW202237634A (zh) 2020-12-15 2022-10-01 美商阿凡達醫療公司 用於治療ｃｏｖｉｄ－１９之ｄｓｇ２組成物和方法
TW202334190A (zh) 2021-11-02 2023-09-01 美商阿凡達醫療公司 Ｄｓｇ２組成物及方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3586386T2 (de) * 1984-10-05 1993-01-14 Genentech Inc Dna, zellkulturen und verfahren zur sekretion von heterologen proteinen und periplasmische proteinrueckgewinnung.
JPS63230089A (ja) * 1987-03-18 1988-09-26 Takeda Chem Ind Ltd 分泌発現による蛋白質の製造法
JPH0479898A (ja) * 1990-07-23 1992-03-13 Kitasato Inst:The コレラ菌及び毒素原性大腸菌を同時検出するためのｄｎａ及びｒｎａプローブとそれらを用いたコレラ菌及び毒素原性大腸菌の検出方法
EP0626448A3 (de) * 1993-05-26 1998-01-14 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Verfahren zur Herstellung und Reinigung von alpha-Interferon

Also Published As

Publication number Publication date
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