CN1063489C - 新多肽及编码该多肽的dna - Google Patents

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Abstract

本发明是关于序列编号1所示的DNA和该DNA所编码的氨基酸序列。来自鲎变形细胞的(1→3)-β-D葡聚糖酶感性因子a亚基的DNA和氨基酸序列对真菌细胞壁的(1→3)-β-D-葡聚糖具有强亲和性。对于真菌的临床诊断，作为与抗真菌剂结合而成的抗菌剂或除真菌剂都是有用的。

Description

新多肽及编码该多肽的DNA
技术领域
本发明涉及来自鲎的(1→3)-β-D-葡聚糖敏感性因子(以下称G因子)的以氨基酸序列表示的多肽及编码该多肽的DNA。特别是G因子的a亚基以氨基酸序列表示的多肽及编码该多肽的DNA。
背景技术
人们历来知道使用鲎的溶解液测定内毒素的方法。该方法以用鲎的溶解液凝固10-9g的数量级的微量内毒素为基础，后来从生物化学上阐明了这一反应是由几个凝固因子分阶段的激活机制构成的(也称作级联反应)(中村隆范他，日本细菌学杂志38，781-803(1983))。图1所示为用日本产的鲎(Tachypleus tridentatus)所进行的凝固级联反应。关于图1所示的三种丝氨酸蛋白酶前体(C因子、B因子、凝固酶前体)和凝胶化的蛋白质(称作凝固素原)，通过cDNA克隆化，阐明了它们的结构(T.Muta et al(1991)J.Biol.Chem.,266,6554-6561、T.Muta etal(1991)J.Biol.Chem.,265,22426-22433、T.Miyata et al(1986)J.Biochem.,100,213-220)。
另一方面，也已知用这种溶解物与真菌及酵母菌备胞壁中存在的(1→3)-β-D-葡聚糖反应，灵敏度达10-8～10-9数量级，引起凝胶化(参见图1)。作为这种与(1→3)-β-D-葡聚糖相互作用启动凝胶化反应的因子，即为G因子。G因子和其它的因子同样为丝氨酸蛋白酶的前体，已经知道是72 k Da的a亚基和37 k Da的b亚基以非共价键结合的糖蛋白(1991年第64回日本生化学会上发表)。
此外，目前认为G因子的a亚基上具有(1→3)-β-D-葡聚糖的特异结合部位，而且b亚基上具有丝氨酸蛋白酶区域，(1→3)-β-D-葡聚糖在a亚基上的结合使G因子激活从而显示出丝氨酸蛋白酶的功能。但是，G因子的全构造尚不清楚。
发明的公开
本发明考虑到上述的状况，把来自鲎的G因子，特别是具有(1→3)-β-D-葡聚糖结合部位的a亚基分离纯化，并弄清了它的全构造。
本发明的目的是提供含有G因子的(1→3)-β-D-葡聚糖结合部位的多肽及编码该多肽的cDNA。
本发明的另一个目的是提供G因子的a亚基的多肽及编码该多肽的DNA。
本发明还有一个目的是提供含有a亚基的G因子的多肽及编码该多肽的DNA。
因此，本发明涉及含有至少一个以Gln-Gln-Trp-Ser氨基酸序列表示的结构单元的多肽，编码这种多肽的单链DNA或由该DNA与互补DNA所构成的双链DNA以及以该氨基酸序列表示的多肽。
此外，本发明涉及编码下面的氨基酸序列或与之有同源性的序列所表示的多肽的单链DNA或由该DNA与互补DNA构成的双链DNA以及该氨基酸序列所表示的多肽。SerHisGluProLysTrpGlnLeuValTrpSerAspGluPheThrAsnGlyIleSerSerAspTrpGluPheGluMetGlyAsnGlyLeuAsnGlyTrpGlyAsnAsnGluLeuGlnTyrTyrArgArgGluAsnAlaGlnValGluGlyGlyLysLeuValIleThrAlaLysArgGluAspTyrAspGlyPheLysTyrThrSerAlaArgLeuLysThrGlnPheAspLysSerTrpLysTyrGlyLysIleGluAlaLysMetAlaIleProSerPheArgGlyValTrpValMetPheTrpMetSerGlyAspAsnThrAsnTyrValArgTrpProSerSerGlyGluIleAspPheIleGluHisArgAsnThrAsnAsnGluLysValArgGlyThrIleHisTrpSerThrProAspGlyAlaHisAlaHisHisAsnArgGluSerAsnThrAsnGlyIleAspTyrHisIleTyrSerValGluTrpAsnSerSerIleValLysTrpPheValAsnGlyAsnGlnTyrPheGluValLysIleGlnGlyGlyValAsnGlyLysSerAlaPheArgAsnLysValpheValIleLeuAsnMetAlaIleGlyGlyAsnTrpProGlyPheAspValAlaAspGluAlaPheProAlaLysMetTyrIleAspTyrValArgValTyrGlnAspAlaSerThrSerSerProValGlyAspThrSerLeuAspGlyTyrTyrPheValGlnAsnArgHisSerGluLeuTyrLeuAspValThrAspAlaSerAsnGluAspGlyAlaPheLeuGlnGlnTrpSerTyrSerGlyAsnGluAsnGlnGlnPheAspPheGluHisLeuGluAsnAsnValTyrLysIleThrAsnLysLysSerGlyLysSerLeuAspValTyrAsnPheGlyThrGluAsnGlyValArgIleGlnGlnTrpSerTyrGlyGlyAlaArgAsnGlnGlnPheThrValGlnSerValGlyAspGlyTyrTyrLysIleIleProArgGlySerGlyLysLeuValGluValAlaAspPheSerLysAspAlaGlyGlyLysIleGlnGlnTrpSerAspAsnAsnGlnLeuSerGlyGlnTrpLysLeuIleLysSerLysSerTyrSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheAspSerSerLysValGlnLeuGluAspThrSerAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheproSerSerGlyAsnTyrArgIleGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValProSerThrGlyGlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrValAsnValAspSerGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArgAlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleLysIleThrLysIleProGluGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArgArgAsnSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluValGlnLeuGluAspThrLeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspLysGluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlySerTyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspIleProSerThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSerHisIleValAsnValAspLeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnLysAlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleArgIleThrLysVal
至今已知有四种鲎，就这四种来说，对于发挥变形细胞(ァメボサィト)成分的凝固素原的功能所必要的结构部分彼此非常相似(73～99％)。据此，推测本发明的多肽在4种鲎之间，氨基酸序列和凝固素原的情况有同样程度的类似。
于是，多肽之间有相同性的场合，尽管氨基酸序列不全同，但由于这种类似的氨基酸序列，而发挥相同或类似的功能，所以本发明不仅包括上述氨基酸序列而且还包括与之有相同性的氨基酸序列，对此，从事本行业的人是容易理解的。
下面对本发明作详细说明。
首先G因子的纯化可从鲎的血球抽提液，经各种柱层析操作，例如葡聚糖硫酸琼脂糖CL-6B(Dextran sulfate-Sapharose CL-6B)和伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B(Con A-Sepharose-4B)亲和层析，然后用Sephacryl S-200HR进行凝胶过滤层析加以精制(T.Moria et al 1981FEBS Lett.,129(2),318-321，特公平3-399号公报)。进一步，可以用G因子的变性剂(表面活性剂等)使构成G因子的a亚基和b亚基变性，用分子筛高速液相色谱法(HPLC)分部分离得到a和b亚基。将各亚基还原、烷化后用酶消化，用肽序列测定仪等测定，得到肽片断的氨基酸序列，从而可测得各亚基的部分氨基酸序列。然后，从鲎血球分离出的poly(A)+RNA制作的cDNA库，根据上述各亚基的部分氨基酸序列合成的寡核苷酸或用各亚基的抗体将编码各亚基的cDNA分离出来，用双脱氧核苷酸终止法等可测定其碱基序列(proc).Natl.Acad.Sci,U.S.A.74,5463-5467(1977)Sanger,F.et al.)。然后，根据如此测定的碱基序列和上述的部分氨基酸序列就可确定各亚基的氨基酸序列。
用以上方法，弄清了序列号1的编码G因子的a亚基多肽的cDNA(AGC……GTG；碱基编号114～2075)和与其对应的氨基酸序列(Ser……Val；氨基酸编号1～654)。
接着，根据G因子a亚基氨基酸序列确定其具有区域结构。
即，在a亚基的氨基末端一侧(Pro……Ala；氨基酸编号4～236)存在具有与β-1，3-葡聚糖酶的羧基末端序列相似序列的葡聚糖酶区域(参见图2)。另一方面，在羧基末端一侧存在着由126个氨基酸构成的重复结构(Ser……Ile；氨基酸编号391～516和Ser……Val；氨基酸编号529～654)，并且该序列和木聚糖酶Z的氨基末端序列相似(参见图3)。然后，在葡聚糖酶区域和木聚糖酶区域之间具有一个QQWS(Gln-Gln-Trp-Ser)基本结构，并存在着重复了三次的与木聚糖酶A的序列类似的序列(Leu……Leu，氨基酸编号247～293、Glu……Val；氨基酸编号294～340和Gly……Ser；氨基酸编号341～387)(参见图4)。
图2至图4中用一个字母表示各氨基酸。
本发明中，制备了含有编码这些肽的DNA的重组DNA载体，然后将其整合进缩主，培养或增殖，以所谓基因工程的方法生产出这些肽。
图1表示鲎血球的内毒素敏感性和(1→3)-β-D-葡聚糖敏感性凝固级联反应的机制。
图2表示G由子的a亚基的葡聚糖酶区域(氨基酸编号4～236)的氨基酸序列。图中FGA表示G因子的a亚基的氨基酸编号4～236的氨基酸序列，βG1A1表示β-1,3-葡聚糖酶的氨基酸编号421～682的氨基酸序列。
图3表示G因子的a亚基的氨基酸编号391～654区域。图中FGA表示G因子的a亚基的氨基酸编号391～654的氨基酸序列，XynZ表示木聚糖酶Z的氨基酸编号295～434的氨基酸序列。
图4表示G因子的a亚基的氨基酸编号247～387区域。图中FGA表示G因子的a亚基的氨基酸编号247～387的氨基酸序列，XlnA表示木聚糖酶A的氨基编号351～477的氨基酸序列。
发明的最佳实施方案
以下说明本发明的具体实施例，但是本发明不限于这些实施例。
实施例1
1．G因子的纯化
(1)血球抽提液的制备
在113g鲎(Tachypleus tridentatus)的血球中加入400ml 0.02m Tris-盐酸缓冲液，pH8.0(含有50mm氯化钠)，在高速匀浆器(商品名，ヒスコトロン，日本精密工业(株)制造)中匀浆3分钟后，8000rpm离心30分钟，得到上清液。然后在离心生成的沉淀物中加入300ml同一缓冲液，采用同上的操作进行匀浆和离心再得到上清液。沉淀物中再加入同一缓冲液，离心回收上清液，再如此重复二次，收集离心操作所得的全部上清液，共得1250ml血球抽提液。
(2)由血球抽提液纯化G因子的方法
a．葡聚糖硫酸-琼脂糖-Cl-6B柱层析将上述1250ml抽提液加到预先以抽提用缓冲液平衡过的葡聚糖硫酸-琼脂糖-CL6B柱(5×17.8cm)(准备柱子的方法参照特公平3-399号公报的制备例2)上，用相同的缓冲液充分洗净后，用0.02M Tris-HCl缓冲流pH8.0(含有0.15MNaCl)将吸附在柱上后多余的蛋白质洗去。然后，用0.02M Tris-HCl缓冲液pH8.0(含有0.25M NaCl)将附在柱上的蛋白质洗脱出来，得到G因子部分。
b．伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B柱层析
将上述G因子部分加到预先用0.02M Tris-Hcl缓冲液pH8.0(含有0.25M NaCl)平衡过的Co nA-Sepharose 4B柱(Pharmacia Biotech(公司)生产)(2×16cm)上，用平衡化缓冲液充分洗净后，再用0.02MTris-HCl缓冲液pH8.0(含有0.5M NaCl)把柱子充分洗净。洗净后用0.02MTris-HCl缓冲液pH8.0(含0.5M NaCl，0.5M甲基-α-D-葡糖苷)将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来，得到G因子部分。
C．Sephacryl S-200 HR柱层析
将上述G因子部分用超滤法浓缩后加到预先用0.05M磷酸钠缓冲液pH6.5平衡过的Sephacryl S-200 HR柱(Pharmacia Biotech公司产品)(2.7×98cm)上，用相同缓冲液将蛋白质洗脱出来。用这一层析法最后洗脱出并收集，280nm波长处仅显示一点点吸收的蛋白质部分。这样得到的蛋白质，就作为G因子的最终精制标准品。从113g血球最后得到按牛血清白蛋白换算约300μgG因子。
2．G因子的a亚基的部分序列的测定
(a)G因子的a亚基和b亚基的分离为了进行G因子的a亚基和b亚基的cDNA克隆化，须弄清楚必要的G因子的a、b亚基的部分氨基酸序列，为此先分离G因子的a亚基和b亚基。将上述1所得的G因子脱盐并浓缩，用甲醇和氯仿沉淀(Methods in Enzymology vol.182,p78-79,(1990))后，溶解在2％ SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中，100℃加热5分钟。将此加热过的试样，用二根连接起来的TSK凝胶G3000SW进行凝胶过滤，以0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0(含0.1％SDS)作为流动相，将G因子的a、b亚基分离开。
(2)G因子的a亚基的酶消化
在上述2(a)中得到的G因子的a亚基的部分中加入最终浓度为17.4％(w/v)的三氯乙酸(TCA)，沉淀G因子的a亚基。按照PaulMatsu-daira的方法(A Practical Guide to Protein and Peptide Purificationfor Microsequencing,p42-43,1989,Academic Press,Inc.出版)将沉淀的G因子的a亚基溶解在0.4M碳酸氢铵(含8M尿素)中、用碘乙酰胺进行还原烷化，然后加水将尿素浓度稀释到4M之后，以酶-底物1∶60重量比加入赖氨酰肽链内切酶((lysyl endopeptidase，和光纯药工业(株))37℃下酶解20小时。将此消化产物加到预先用0.06％v/v三氟乙酸平衡过的μBondasphere 5μC8-300 φ(2.1×150mm)(ウォ-タ-ズ社)上，将柱子充分洗净后，用乙腈浓度连续上升的直线浓度梯度法，5分钟后0％(v/v)，65分钟后24％(v/v)，125分钟后56％(v/v)、135分钟后达到80％(v/v)，以0.2ml/min的流速将吸附的蛋白质洗脱下来。这时洗脱出的各肽，用210nm紫外吸收进行监测，全部分别收集。
(3)部分氨基酸序列的测定
用气相序列仪47 7A(Applied Biosystems Japan公司)测定所得到的各肽的氨基酸序列。此结果表示于表1。
但是Xaa表示自然界存在的一个氨基酸。
表1肽    1
Ser-Xaa-Glu-Pro-Lys-Xaa-Gln-Leu-Val-肽    2
Arg-Glu-Asp-Tyr-Asp-Gly-Phe-Lys肽    3
Tyr-Thr-Ser-Ala-Arg-Leu-Lys肽    4
Thr-Gln-Phe-Asp-Lys肽    5
ser-Trp-Lys肽    6
Tyr-Gly-Lys肽    7
Met-Ala-Ile-Pro-Ser-Phe-Arg-Gly-Val-Trp-Val-Met-
Phe-Trp-Met-Ser-Gly-Xaa-Asn-Thr-Asn-Tyr-Val-Xaa-
Xaa-Pro-肽    8
Ser-Ala-Phe-Arg-Asn-Lys肽    9
Val-Phe-Val-Ile-Leu-Asn-Met-Ala-Ile-Gly-Gly-Asn-
Xaa-Pro-Gly-Phe-Xaa-Val-Ala-肽    10
Ile-Ile-Pro-Arg-Gly-Ser-Gly-Lys肽    11
Val-Gln-Leu-Glu-Asp-Thr-Ser-Asp-Val-Gly-Gly-Gly-
Lys肽    12
Cys-Asp-Asn-Glu-Gly-Ala-Trp-Met-Ala-Tyr-Lys肽    13
Asp-Ile-Asp-Phe-Pro-Ser-Ser-Gly-Asn-Tyr-Xaa-Ile-
Glu-Tyr-Xaa-Val-Ala-肽    14
Leu-Ile-Gln-Ala-Glu-Xaa-Tyr-Phe-Xaa-Tyr-Xaa-Glu-
Val-Gln-Leu-Glu-肽    15
Glu-Gly-Ala-Trp-Met-Ala-Tyr-Lys肽    16
Val-Arg-Gly-Thr-Ile-His-Trp-Ser-Thr-Pro-Asp-Gly-
Ala-His-Ala-His-His-Asn-Arg-
3．寡核苷酸的合成
由表1中的测定的氨基酸序列，利用2种氨基酸序列A:-Glu-Asp-Tyr-Asp-Gly-Phe-,B:-Trp-Val-Met-Phe-Trp-Met-将A逆翻译为意义链，B逆翻译成反义链，然后在5′末端加上限制酶识别序列和保护DNA的2个碱基，用DNA合成仪-380A(Applied Biosystems Japan公司)合成了如下面所示的25个碱基与26个碱基的寡核苷酸的混合物。
Figure 9419046600161
这里所示的寡核苷酸A′和B′分别包括相当于A和B的序列或互补的序列的全部可能性(但是，A的phe密码z(TT(C/T))中的第3个核苷酸(T,C)例外)。
4．含有编码G因子的mRNA的poly(A)+RNA的制备从鲎的血球纯化了G因子，从而从鲎的血球分离出poly(A)+RNA。
(1)总RNA的制备
用AGPC法(参见实验医学Vol.9,p1937～1940)从11.8g鲎的血球中分离出约11mg总RNA。
(2)poly(A)+RNA的制备
取2mg分离出的总RNA用Oligotex-dT 30 Super试剂盒(日本ロシュ(株)生产)分离poly(A)+RNA。然后，为了提高一次分离的poly(A)+RNA的纯度，再重复一次同样的操作。由如此进行的二次Oligotex-dT30 Super试剂盒操作，从2mg总RNA获得了34.5μg高纯度的poly(A)+RNA。
5．鲎血球cDNA库的制备
(1)cDNA的合成
由上述4中制备的poly(A)+RNA 34.5μg中取出5μg poly(A)+RNA，用Amecrsham公司的cDNA合成试剂盒合成了cDNA。(2)cDNA库的制备
由(1)中合成的cDNA，用Amersham公司的cDNA克隆系统入gt10接头法制备了鲎的血球cDNA库。
6．G因子a亚基的cDNA克隆
以上述4(2)中获得到的poly(A)+RNA为模板，再用上述3合成的寡核苷酸，采用PCR法Saiki,R.K.et.al,Science,239,487-491,1988)扩增了编码G因子a亚基一部分的cDNA片段。用多引物DNA标记试剂盒(日本基因株式会社生产)以[α-32p]d CTP标记此cDNA片段，将其用作探针，对上述5(2)中制备的cDNA库进行筛选，获得了含最长约为2,400 dp的插入cDNA的二个阳性克隆。这二个克隆的插入cDNA除5′末端和3′末端的长度有数个碱基的差异之外全部相同。然后测定了这二者的碱基序列，它们复合起来的碱基序列含有起始密码子和poly(A)+尾巴。大小为2400bp。
7．编码G因子的a亚基的cDNA碱基序列的测定
将上述6中得到的插入cDNA重组进了pUC118和pBluescriptⅡSK载体中。为了测定克隆在pUC118载体和pBluescript Ⅱ SK载体中的cDNA全碱基序列，利用cDNA片段上的限制酶识别位点以及长链缺失试剂盒(宝酒造公司产品)进行缺失和亚克隆。使用鲎光标记的核苷酸引物和DNA序列分析仪-370A(Applied Biosystems Japan公司产品)测定了以上述方法制备的克隆中的cDNA的碱基序列。(Smith L.M.et al(1986)Nature 321,674-679)。
序列表的序列号1表示这样测定的G因子a酸基的cDNA的碱基序列，以及由此弄清楚的氨基酸序列。在此氨基酸序列中全部包含了2(3)中测定的部分氨基酸序列(表1)，确定了该碱基序列的插入cDNA确实是编码G因子的a亚基的密码子。
8．G因子或其它基的表达及纯化
由上述得到的克隆，用超声波处理、限制酶处理或这一技术领域已知的其它方法将编码G因子的a亚基的基因的全部或一部分分离出来并重组进适当的载体。载体是用能在宿主微生物体内或细胞内自主增殖的噬菌体或质粒经基因重组而构建的，即所谓含有装上适当的启动子、SD序列、翻译起始密码子ATG或者再有适当的结构基因的载体都是适用的。这样构建的载体转移入适当的宿主生物体或细胞可得到转化子，各种大肠杆菌株、各种酵母菌株、鼷鼠、大鼠、中国仓鼠等动物的卵母细胞(CHO)之类的动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、动植物昆虫宿主等都可作为宿主。将这样得到的转化子用营养培养基进行培养，或者用营养食物饲喂就可稳定地生产大量的G因子或其亚基(以下称作G因子等)。转化子的培养或饲育条件尽管在生产G因子等的范围内可作适当改变，而所用宿主的繁殖，可用该技术领域中一般公知的条件。培养物中的或喂养物中的G因子、含菌体或细胞的培养液或用适当的机械方法破碎了的个体的抽提液，也可以就这样采取使用。然而，一般按通常的方法，当G因子等存在于培养液中或抽提液中时，用过滤、离心分离等方法将含G因子等的溶液与菌体细胞或个体的破碎的碎片分离之后再使用。当G因子等存在于菌体内，细胞内或个体内脏膜内时，将获得的培养物或碎片先用过滤或离心分离等方法收集菌体，细胞或碎片，然后将其用机械的方法或超声波处理或溶菌酶等酶方法或添加EDTA等螯合剂和/或表面活性剂使G因子等溶解之后加以分离。从这样得到的含有G因子等的溶液分离G因子等可以使用通常人们知道的蛋白质纯化方法。
这时若G因子等以嵌合的多肽表达的话，则可以利用其他蛋白质的性质容易地进行分离。比如利用其他的蛋白质对某种物质的亲和性，用亲和层析法就可以容易地分离出来。
实际上G因子α亚基可以用下面的方法来表达。
先合成具有5′-AGCCACGAACCAAAGTGGCA-3′序列的寡核苷酸，然后将5′端磷酸化。再将此寡核苷酸与编码G因子α亚基的基因掺入的质粒制备的单链DNA进行杂交，用Klenow片段等DNA聚合酶进行延伸反应，用绿豆核酸酶等DNA酶切断这时生成的单链部分，得到双链DNA。用限制酶SphⅠ将此双链DNA切断，这时产生的连接末端，用DNA聚合酶或Klenow片段或用削平试剂盒将其弄成平头。预先用NcoⅠ限制酶切断此双链DNA，这时产生的连接末端用T4DNA聚合酶或Klenow片段或削平试剂盒弄成平头，重组进了pTV118N(含氨苄青霉素抗性基因)。将此质粒导入E.coli JM109或E.coli MV1184得到转化子。这时可以利用质粒的性质以一般的方法选择必要的转化子。即在含有氨苄青霉素的LB平板(预先涂布了(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)/异丙基硫半乳糖苷(IPTG))上培养，将导入了目标质粒的白色菌落挑选出来。然后用合成寡核苷酸5′-AAACAGACCATGAGCCACGAACCA-3′做探针可以筛选得到具有正确序列的质粒。然后用RV-N引物(宝酒造公司产品)作为序列分析引物进行DNA序列分析，就可以确认正确质粒的结构。将具有正确序列的质粒导入E.Coli JM 109或MV1184，用含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的3％营养肉汤(日水制药公司产品)30℃下培养此细菌24小时。使用一般的方法，从此培养物的上清液或菌体抽提液纯化出G因子的a亚基。这时使用抗体或与G因子的a亚基有亲和性的配基进行亲和层析，就可以比较简单地纯化出来。
实施例2
1．G因子的b亚基的部分氨基酸序列的测定
(1)G因子b亚基的分离
实施例1的2(1)中由于把G因子分离成了a亚基的b亚基，因而同样也得到了b亚基。
(2)G因子的b亚基的酶消化
用和实施例1的2(2)相同的方法，由上述(1)中得到的G因子的b亚基得到了肽片段。
(3)部分氨基酸序列的测定
按和实施例1的2(3)相同的方法测定了所得的各肽的氨基酸序列。此结果列于表2。
表22．寡核苷酸的合成
根据测定的氨基酸序列，利用2种氨基酸序列C:-Asn-Glu-Gln-Gys-(Asn)-Lys,D:-Met-Tyr-Gln-Asn-Pro-Thr-序列，逆翻译C成意义链，逆翻译D成反义链，用和实施例1的3相同的方法合成了如下所示的各25个寡核苷酸C′和D′的混合物。上述C中的-(Asn)-表示推测为Asn。
Figure 9419046600221
这里所示的寡核苷酸C′及D′，包括了和C及D相同的或互补的序列的全部可能的(但是C和D的C末端氨基酸的Lys，以及D的Thr的各密码子(AA(A/G)和(AC(A/C/G/T))第三核苷酸(各A,G和T,C,A,G)除外)。
4．G因子的b亚基的cDNA克隆。
以实施例1的4(2)中得到的poly(A)+RNA做模板，再用上述2中合成的寡核苷酸，用和实施例1的6相同的方法进行实验，得到了含有1979bp的cDNA的阳性克隆。分析此克隆的插入cDNA的碱基序列时，证实它含有与来自上述1(2)中所得的G因子b亚基的肽的氨基酸序列相当的碱基序列，并见存在添加poly A信号，根据其大小推想这个克隆是全长的cDNA。
5．编码G因子的b亚基的cDNA碱基序列的测定
用和实施例1的7相同的方法测定了G因子的b亚基的cDNA碱基序列。这样分析的结果，弄清楚了以G因子b亚基的cDNA的碱基序列以及由此弄清楚的G因子的b亚基的氨基酸序列，列于第2号序列表中。
由于在这一氨基酸序列中完全含有实施例2的1(3)测定的部分氨基酸序列(表2)，所以现在测定碱基序列的插入cDNA确实是编码G因子b亚基的。
含有编码实施例2中提取的多肽的cDNA的重组DNA载体，在转移进有可能复制的宿主微生物，适当的动物细胞、昆虫或昆虫细胞之后，以载体的标记和结合(1→3)-β-D-葡聚糖的能力作为指标，筛选得到了保持该重组DNA载体的微生物，动物细胞、昆虫或昆虫细胞，经过培养或饲养就可以提取本发明的多肽。
工业上的应用性
用本发明分离纯化了鲎的变形细胞溶解液的G因子的a亚基，测定了它的氨基酸序列和编码它的cDNA碱基序列。
其结果，在此序列中含有(1→3)-β-D-葡聚糖结合部位，利用它们的cDNA，借助基因工程的方法可以得到相当于结合部位的多肽。得到的多肽显示出如下种种的效果。
(1)近年来伴随着免疫不全患者的增加和高龄化，由于白色念珠菌属，曲霉菌属等类通常致病性弱的二次病原体引起的条件真菌感染明显增加。然而，特别是因真菌引起的内脏等的深部真菌病，除了一部分特殊的病型以外，不靠侵袭性手段的有限临床诊断是困难的，因此多是在解剖检查后做出初步诊断(参见微生物学辞典、1989年，技报堂)。
上述深部感染的真菌病口诊断，可以用含有该(1→3)-β-D-葡聚糖结合部位的多肽或将(1→3)-β-D-葡聚糖用放射性同位素、酶、萤光物质、发光物质等标记物质标记了的结合部位多肽，用配基-受体检测法测定(1→3)-β-D-葡聚糖。此外也可以使用将此多肽结合在微型平板，试管或小珠等固相上，特异地捕捉检出(1→3)-β-D-葡聚糖等的测定方法。用这样的测定方法能特异地测定体液中的来自真菌的可1→3)-β-D-葡聚糖，可以对深部真菌病进行简便迅速的诊断。
(2)此外，含有(1→3)-β-D-葡聚糖结合部位的多肽上结合了抗真菌剂的药物对病灶具有很强的亲和性，就有可能制出对细胞壁上存在(1→3)-β-D-葡聚糖的病灶中的真菌有特异性杀菌作用的新的选择性抗真菌剂。
(3)其次，伴随着近年来基因操作技术的发展，在表达目的蛋白质时，将酵母菌作为含有编码目的蛋白质的基因的载体的宿主，进行繁殖。这样，因为可与细菌同时大量培养，从而可生产糖蛋白。但是，问题在于，产物中大多含有酵母菌的残渣，残渣带有极微量的作为构成成分的(1→3)-β-D-葡聚糖，必须将它定量和清除。这时使用将含有(1→3)-β-D-葡聚糖结合部位的多肽结合在支持体上的亲和载体进行亲和层析，可以特异地除去酵母菌的残渣，或者进行定量，而且确认除去残渣后的产物中不含有酵母菌菌体成分，如(1)中所述的使用含有(1→3)-β-D-葡聚糖结合部位的多肽进行的定量法，比起使用鲎变形细胞溶解物，可以更简便地，高度特异性地确认。
序列表
序列编号：1
序列长度：2408
序列类型：双链
拓扑结构：直链
起源：鲎血球
序列
     10      20         30       40GTGGGGGGTTTAGTTGAAACAGTAAATACGTTAACTGTTTAATCT50        60         70       80        90TGTTAATTGCAATGTTGGTGTTGCTGTGTTGTGTTGTTTTGCATG
       MetLeuValLeuLeuCysCysValValLeuHisVal
                    -15           -10
   100        110      120       130TTGGTGTTGCAAGAATTTGCTGTAGCCACGAACCAAAGTGGCAGCGlyValAlaArgIleCysCysSerHisGluProLysTrpGlnLeu
      -5          -1 1           5140       150        160      170       180TCGTCTGGTCGGATGAATTTACCAATGGAATAAGTTCTGATTGGGValTrpSerAspGluPheThrAsnGlyIleSerSerAspTrpGlu
  10             15             20
   190       200       210       220AATTTGAAATGGGCAATGGCCTCAATGGTTGGGGTAATAACGAACPheGluMetGlyAsnGlyLeuAsnGlyTrpGlyAsnAsnGluLeu
      25              30              35
230      240      250       260       270TGCAATATTATCGTCGTGAAAATGCCCAAGTTGAGGGAGGGAAACGlnTyrTyrArgArgGluAsnAlaGlnValGluGlyGlyLysLeu
   40             45             50
   280       290       300       310TGGTAATTACTGCTAAAAGAGAAGACTATGATGGCTTCAAATACAValIleThrAlaLysArgGluAspTyrAspGlyPheLysTyrThr
 55              60             65320       330       340       350       360CTTCTGCTAGGCTGAAAACCCAGTTTGATAAATCTTGGAAGTATGSerAlaArgLeuLysThrGlnPheAspLysSerTrpLysTyrGly
 70               75            80
  370       380        390       400GTAAAATTGAAGCCAAAATGGCGATTCCATCATTTCGGGGAGTCTLysIleGluAlaLysMetAlaIleProSerPheArgGlyValTrp
    85           90             95410       420       430       440       450GGGTGATGTTCTGGATGTCAGGAGACAACACTAATTATGTTAGATValMetPheTrpMetSerGlyAspAsnThrAsnTyrValArgTrp100            105            110
   460     470      480        490GGCCATCTTCTGGTGAAATTGACTTTATTGAACATAGAAACACTAProSerSerGlyGluIleAspPheIleGluHisArgAsnThrAsn115            120            125500       510       520       530       540ACAATGAAAAAGTCAGAGGAACTATTCACTGGTCCACTCCTGACGAsnGluLysValArgGlyThrIleHisTrpSerThrProAspGly130            135            140
  550       560        570       580GTGCTCATGCGCATCATAACAGAGAAAGTAATACAAATGGGATTGAlaHisAlaHisHisAsnArgGluSerAsnThrAsnGlyIleAsp
  145           150            155590       600       610       620       630ATTATCACATTTATTCTGTAGAGTGGAATTCTTCCATTGTTAAATTyrHisIleTyrSerValGluTrpAsnSerSerIleValLysTrp
  160            165            170
  640       650        660       670GGTTTGTTAATGGAAATCAATACTTTGAAGTGAAAATTCAGGGAGPheValAsnGlyAsnGlnTyrPheGluValLysIleGlnGlyGly
  175            180            185680        690      700       710       720GAGTAAATGGGAAAAGTGCATTTCGTAACAAAGTTTTCGTTATTTValAsnGlyLysSerAlaPheArgAsnLysValPheValIleLeu
 190           195             200
   730       740        750       760TAAACATGGCGATTGGTGGAAACTGGCGAGGATTCGATGTTGCTGAsnMetAlaIleGlyGlyAsnTrpProGlyPheAspValAlaAsp
 205            210            215770       780       790       800       810ACGAGGCTTTCCCTGCTAAAATGTACATTGATTATGTCCGTGTATGluAlaPheProAlaLysMetTyrIleAspTyrValArgValTyr
 220            225            230
   820        830     840        850ACCAGGATGCCAGTACATCTTCTCCTGTTGGGGATACCTCTTTAGGlnAspAlaSerThrSerSerProValGlyAspThrSerLeuAsp
 235            240            245860      870        880       890       900ATGGTTACTATTTTGTCCAAAACAGGCACAGTGAATTGTATCTTGGlyTyrTyrPheValGlnAsnArgHisSerGluLeuTyrLeuAsp
 250            255            260
  910        920       930       940ATGTCACTGATGCCAGTAACGAAGATGGAGCATTTCTGCAACAATValThrAspAlaSerAsnGluAspGlyAlaPheLeuGlnGlnTrp
 265            270            275950     960         970       980      990GGTCTTATAGTGGTAATGAGAACCAACAGTTTGATTTTGAGCATCSerTyrSerGlyAsnGluAsnGlnGlnPheAspPheGluHisLeu
 280            285            290
  1000     1010       1020      1030TCGAAAATAATGTTTATAAAATTACTAATAAAAAAAGTGGAAAATGluAsnAsnValTyrLysIleThrAsnLysLysSerGlyLysSer
 295            300            3051040      1050      1060      1070      1080CTTTGGATGTTTATAATTTTGGGACTGAGAATGGTGTTAGAATCCLeuAspValTyrAsnPheGlyThrGluAsnGlyValArgIleGln
 310            315            320
 1090      1100      1110      1120AACAGTGGTCATATGGAGGGGCTCGCAATCAGCAGTTTACTGTACGlnTrpSerTyrGlyGlyAlaArgAsnGlnGlnPheThrValGln
 325            330            3351130      1140      1150      1160      1170AAAGTGTTGGTGATGGTTATTATAAGATTATTCCACGCGGCAGTGSerValGlyAspGlyTyrTyrLysIleIleProArgGlySerGly
 340            345            350
  1180      1190     1200       1210GAAAGTTAGTGGAAGTAGCAGATTTTAGTAAAGATGCAGGAGGGALysLeuValGluValAlaAspPheSerLysAspAlaGlyGlyLys
 355            360            365
 1220      1230     1240       1250      1260AGATACAACAATGGTCTGATAACAACCAATTATCTGGACAGTGGAIleGlnGlnTrpSerAspAsnAsnGlnLeuSerGlyGlnTrpLys
 370            375            380
 1270       1280      1290      1300AACTTATTAAAAGTAAAAGTTATTCTAAATTAATTCAGGCAGAAALeuIleLysSerLysSerTyrSerLysLeuIleGlnAlaGluSer
 385            390             3951310      1320      1330      1340      1350GTTATTTTGATTCCTCAAAAGTACAATTGGAAGATACCTCAGATGTyrPheAspSerSerLysValGlnLeuGluAspThrSerAspVal
 400            405            410
  1360      1370      1380      1390TAGGAGGTGGGAAGAATGTTAAATGTGATAATGAAGGAGCCTGGAGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGluGlyAlaTrpMet
 415            420            4251400      1410      1420      1430      1440TGGCTTATAAGGATATTGATTTCCCCAGTTCAGGTAATTATCGAAAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyrArgIle
 430            435            440
 1450       1460      1470     1480TAGAATACAGAGTAGCAAGTGAACGTGCAGGAGAAAGCTGTCTC  GluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeu
 445            450            4551490      1500      1510      1520      1530TGGATTTGAATGCAGGCTCTATAGTTCTTGGCATGCTGGATGTTCAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValPro
 460            465            470
  1540      1550      1560      1570CTTCAACAGGAGGATGGCAGAAGTGGACCACCATTTCCCATACAGSerThrGlyGlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrVal
 475            480            4851580      1590      1600      1610      1620TGAATGTGGATTCAGGTACATATAACTTGGGGATCTATGTTCAACAsnValAspSerGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArg
 490            495            500
  1630      1640       1650     1660GAGCCAGCTGGAATATCAACTGGATAAAGATTACAAAAATACCTGAlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleLysIleThrLysIleProGlu
 505            510            5151670      1680      1690      1700      1710AACAGTCAAATTTGAATCAAGGGCGTCGTAATTCTAAATTAATTCGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArgArgAsnSerLysLeuIleGln
 520            525            530
   1720     1730       1740     1750AGGCAGAAAGTTATTTTAGTTACTCAGAAGTACAACTGGAAGATAAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluValGlnLeuGluAspThr
 535            540            5451760     1770       1780      1790      1800CCTTAGATGTAGGAGGTGGAAAGAATGTTAAATGTGATAAAGAAGLeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspLysGluGly
 550            555            560
  1810      1820      1830      1840GGGCCTGGATGGCTTACAAGGATATTGATTTCCCCAGTTCAGGAAAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlySer
 565            570            5751850      1860      1870      1880      1890GTTATCGAGTAGAATACAGAGTGGCAAGTGAACGTGCAGGAGGAATyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaG1yG1yLys
 580           585             590
  1900      1910      1920      1930AGCTGTCCCTAGATTTGAATGCAGGCTCTATAGTGCTTGGCATGCLeuSerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeu
 595            600            6051940      1950      1960      1970      1980TGGATATTCCTTCAACAGGAGGATTGCAGAAGTGGACCACCATTTAspIleProSerThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSer
    610             615             620
 1990      2000      2010       2020CTCATATAGTGAATGTGGATTTAGGTACATATAACTTGGGAATTTHisIleValAsnValAspLeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyr
 625            630             6352030     2040       2050      2060      2070ATGTTCAAAAAGCCAGTTGGAATATCAATTGGATTAGAATTACAAValGlnLysAlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleArgIleThrLys
 640            645            650
  2080     2090      2100      2110AAGTGTAGGATACAAGAGCAAACCAATTGTATTATTTTGAAGAAAVal6542120      2130      2140      2150      2160CAACAGCTGTTGACCATAATCTTTGTTCATTGAGAATTTATCCAA
  2170      2180      2190      2200CTGTTATAGAATCTATCACCTTTCCAGATGTACGCATTGCTGATG2210      2220      2230      2240      2250GTTTTGAACTAATAAATGAGGAGATTATAAGTGCTAATGTGTTTG
 2260      2270       2280      2290TTATATCTTTAATTTTTAAAAACAAATTATCAACTAACTTTTCAA 2300      2310      2320      2330      2340TTCAGGCATGGTGTTTCTCTTTTTAATCTGTATTTCTAATAAATT
  2350      2360      2370      2380AATGTCTTTAAGAGTTGTTTTGTTTACAATAAATAAAGTTTGATT2390      2400GTGTGGGATAAAAAAAAAAAAAA
序列编号：2
序列长度：1979
序列类型：双链
拓扑结构：直链
起源：鲎血球
序列
   10         20        30        40GAAGACAAGAGAGTTGAAACAACCATAGCCTGTTTGCTTATGACT50        60        70        80        90TTCAATAAGAGATACTCGGCTTAAAGGGAACTGACTTATTCGTAG
  100        110       120       130AGGCTATACCATGGATATCAGTTTCCTGGTTTTTATCACACTGTC
      MetAspIleSerPheLeuValPheIleThrLeuSer
         -30            -25            -20140      150        160       170       180TATGGCTCTCTTCTCGAGCAACGTGACAGGAACGTCAGTAACATC  MetAlaLeuPheSerSerAsnValThrGlyThrSerValThrSer
          -15            -10            -5
   190        200       210      220AAGGGTACGACGTGGAATAAATGAAAAACATTGTGGGTTCCGACCArgValArgArgGlyIleAsnGluLysHisCysGlyPheArgPro
        -1  1           5             10230       240       250      260        270AGTAATTACAAGAATTATTGGTGGAGGAATAGCGACGCCTCATTCValIleThrArgIleIleGlyGlyGlyIleAlaThrProHisSer
       15              20            25
   280        290      300       310ATGGCCGTGGATGGTTGGAATTTTCAAAGTAAATCCTCACCGTTTTrpProTrpMetValGlyIlePheLysValAsnProHisArgPhe
       30             35              40320       330       340       350       360CCTTTGTGGTGGATCTATTATTAATAAAGTCTCTGTTGTTACTGCLeuCysGlyGlySerIleIleAsnLysValSerValValThrAla
       45             50              55
   370       380       390        400CGCCCATTGTCTTGTGACGCAGTTTGGAAACAGACAGAATTATTCAlaHisCysLeuValThrGlnPheGlyAsnArgGlnAsnTyrSer
       60              65             70  410       420       430       440       450TATCTTCGTAAGAGTTGGAGCCCATGACATAGACAATTCGGGTACIlePheValArgValGlyAlaHisAspIleAspAsnSerGlyThr
        75            80              85
    460      470        480      490AAATTATCAAGTGGATAAAGTTATTGTTCACCAGGGCTACAAACAAsnTyrGlnValAspLysValIleValHisGlnGlyTyrLysHis
       90              95            100500       510       520       530      540CCATTCACACTACTACGATATCGGTTTGATTTTACTCTCGAAACCHisSerHisTyrTyrAspIleGlyLeuIleLeuLeuSerLysPro
       105            110            115
   550        560      570       580AGTCGAATACAACGACAAAATACAGCCTGTCTGTATTCCTGAGTTValGluTyrAsnAspLysIleGlnProValCysIleProGluPhe
       120            125            130590       600       610       620       630CAACAAACCTCACGTGAACTTGAACAATATTAAGGTCGTCATTACAsnLysProHisValAsnLeuAsnAsnIleLysValValIleThr
      135             140            145
   640       650       660       670TGGTTGGGGTGTTACTGGGAAAGCTACTGAGAAACGTAACGTTCTGlyTrpGlyValThrGlyLysAlaThrGluLysArgAsnValLeu
      150             155           160680      690        700       710       720TCGTGAATTGGAGTTGCCCGTGGTTACAAACGAACAGTGCAACAAArgGluLeuGluLeuProValValThrAsnGluGlnCysAsnLys
       165            170            175
   730       740       750       760ATCTTATCAGACACTCCCATTCTCAAAATTGAACCGAGGAATCACSerTyrGlnThrLeuProPheSerLysLeuAsnArgGlyIleThr
       180            185             190770       780       790        800      810TAACGACATGATTTGTGCGGGGTTTCCGGAAGGAGGGAAAGATGCAsnAspMetIleCysAlaGlyPheProGluGlyGlyLysAspAla
       195            200            205
   820       830       840       850TTGTCAGGGCGACTCTGGTGGTCCCCTGATGTATCAGAATCCAACCysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuMetTyrGlnAsnProThr
       210            215            220860        870      880       890       900AACAGGAAGAGTGAAAATAGTTGGAGTTGTATCATTTGGGTTCGAThrGlyArgValLysIleValGlyValValSerPheGlyPheGlu
       225            230            235
     910       920        930       940ATGTGCTCGTCCCAACTTCCCCGGTGTTTACACGCGCCTCTCGAGCysAlaArgProAsnPheProGlyValTyrThrArgLeuSerSer
       240            245            250950      960        970       980       990CTACGTTAACTGGCTCCAGGAAATCACCTTCGGACAGTCACTCGCTyrValAsnTrpLeuGlnGluIleThrPheGlyGlnSerLeuAla
       255            260            265
  1000      1010       1020     1030TTCTTTATTTGAAGTTGTACCAATATTTATACCCGAGTGAGACTGSerLeuPheGluValValProIlePheIleProGlu
       270            2751040      1050      1060      1070      1080AAGATAAATATTGAAGAGAAATCTAGAATAATGTACAATATAAGA
   1090     1100      1110      1120AGCCTGAAATTACTGAAATAGAAAGGCGCGTGATGAGAAATACGT1130      1140      1150      1160      1170TTCAAATTTTATTTTTTATTAACTTTATTGTGTTTAACTATTCTT
  1180      1190      1200      1210TACGTGGGACATGAAATATAAATCTTTATTTCTTCTTTATATACT1220      1230      1240      1250      1260TTAGATTTTCATTTCATCTATCTTTATCAGTTTTGTAATGTTACT
  1270      1280      1290      1300AATAATATTTCTTATGGCACGGATCGAGCCTCGTGAATCACAGTA1310      1320      1330      1340      1350AATAATAATAATTATAAAATCACACATTATTAAAAGCAATAGCAT
 1360       1370      1380      1390TCAGAGTGAGTAACATATAAACTTCACTATGAGTGGACTTTTTTA1400      1410      1420      1430      1440TTCACATTTTAAGTTCATTACTAACTGTTGGGAGGTCTTTATATT
  1450      1460      1470      1480GTTGTATATTTATATATTAATTAGGTTGGTTTAGTACATTGTTGT1490      1500      1510      1520      1530TAATGGTGGAATAGGGCGTAGGTTTTAAATGTGTTTGCAAAAAAA
  1540      1550      1560      1570CAAACAAAACAAGTAATGGTGGATGATGGTTCCAAAGTAACCGAA1580      1590      1600      1610      1620AGAACACTTTGAACATTTTTATACAAAAATTTATGTTTTAAAATA
  1630      1640      1650      1660CGAGTATATACAATCGATCTCTAAGTACAAGAAAAACTGAAGTGT 1670      1680      1690      1700     1710TCATTCAGGTTTAACAGTGCAACTTAAATCAACAGTTAGTTGTTC
  1720      1730      1740      1750ACTAAACATTACAATTTGATCCTTTATAAACGCTAATACTGTTTA1760      1770      1780     1790      1800AACAGTCAGTAATAATACAGTATCATAGCATATCATATATGAAGG
  1810      1820      1830      1840TATTTTAACATTCTATATACAAAGCCAGAATTGAAAACGGTAATA1850      1860      1870      1880      1890TTTTGTACGATTAGTGAATTATTGTTTTTAAGAACAAACTGGTAT
 1900       1910      1920      1930CAAATTTAAAATATGAATCTGTGATTTAATATTTTTTACAACGTT1940      1950      1960       1970CTAACTTACCACTTTTGTTGTGAATAAAGGTGTTTACAAATGGA

Claims (9)

1．编码如下氨基酸序列所示的含有三个Gln-Gln-Trp-Ser基本构造的多肽的单链DNA或由该DNA与互补DNA构成的双链DNA。LeuAspGlyTyrTyrPheValGlnAsnArgHisSerGluLeuTyrLeuAspValThrAspAlaSerAsnGluAspGlyAlaPheLeuGlnGlnTrpSerTyrSerGlyAsnGluAsnGlnGlnPheAspPheGluHisLeuGluAsnAsnValTyrLysIleThrAsnLysLysSerGlyLysSerLeuAspValTyrAsnPheGlyThrGluAsnGlyValArgIleGlnGlnTrpSerTyrGlyGlyAlaArgAsnGlnGlnPheThrValGlnSerValGlyAspGlyTyrTyrLysIleIleProArgGlySerGlyLysLeuValGluValAlaAspPheSerLysAspAlaGlyGlyLysIleGlnGlnTrpSerAspAsnAsnGlnLeuSerGlyGlnTrpLysLeuIleLysSer
2．如权利要求1所述的氨基序列所表示的多肽。
3．编码如下氨基酸序列所示的葡聚糖酶区域多肽的单链DNA或由该DNA与互补DNA构成的双链DNA。ProLysTrpGlnLeuValTrpSerAspGluPheThrAsnGlyIleSerSerAspTrpGluPheGluMetGlyAsnGlyLeuAsnGlyTrpGlyAsnAsnGluLeuGlnTyrTyrArgArgGluAsnAlaGlnValGluGlyGlyLysLeuValIleThrAlaLysArgGluAspTyrAspGlyPheLysTyrThrSerAlaArgLeuLysThrGlnPheAspLysSerTrpLysTyrGlyLysIleGluAlaLysMetAlaIleProSerPheArgGlyValTrpValMetPheTrpMetSerGlyAspAsnThrAsnTyrValArgTrpProSerSerGlyGluIleAspPheIleGluHisArgAsnThrAsnAsnGluLysValArgGlyThrIleHisTrpSerThrProAspGlyAlaHisAlaHisHisAsnArgGluSerAsnThrAsnGlyIleAspTyrHisIleTyrSerValGluTrpAsnSerSerIleValLysTrpPheValAsnGlyAsnGlnTyrpheGluValLysIleGlnGlyGlyValAsnGlyLysSerAlaPheArgAsnLysValPheValIleLeuAsnMetAlaIleGlyGlyAsnTrpProGlyPheAspValAlaAspGluAlaPheProAlaLysMetTyrIleAspTyrValArgValTyrGlnAspAla
4．如权利要求3所述的氨基酸序列所表示的多肽。
5．编码如下氨基酸序列所示的木聚糖酶区域的多肽的单链DNA或由该DNA与互补DNA构成的双链DNA。SerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheAspSerSerLysValGlnLeuGluAspThrSerAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyrArgIleGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValProSerThrGlyGlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrValAsnValAspSerGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArgAlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleLysIleThrLysIleProGluGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArgArgAsnSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluValGlnLeuGluAspThrLeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspLysGluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlySerTyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspIleProSerThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSerHisIleValAsnValAspLeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnLysAlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleArgIleThrLysVal
6．如权利要求5所述的氨基酸序列所表示的多肽。
7．编码如下氨基酸序列所示(1→3)-β-D-葡聚糖敏感性因子a亚基的多肽的单链DNA或由该DNA与互补DNA构成的双链DNA。SerHisGluproLysTrpGlnLeuValTrpSerAspGluPheThrAsnGlyIleSerSerAspTrpGluPheGluMetGlyAsnGlyLeuAsnGlyTrpGlyAsnAsnGluLeuGlnTyrTyrArgArgGluAsnAlaGlnValGluGlyGlyLysLeuValIleThrAlaLysArgGluAspTyrAspGlyPheLysTyrThrSerAlaArgLeuLysThrGlnPheAspLysSerTrpLysTyrGlyLysIleGluAlaLysMetAlaIleProSerPheArgGlyValTrpValMetPheTrpMetSerGlyAspAsnThrAsnTyrValArgTrpProSerSerGlyGluIleAspPheIleGluHisArgAsnThrAsnAsnGluLysValArgGlyThrIleHisTrpSerThrProAspGlyAlaHisAlaHisHisAsnArgGluSerAsnThrAsnGlyIleAspTyrHisIleTyrSerValGluTrpAsnSerSerIleValLysTrpPheValAsnGlyAsnGlnTyrPheGluValLysIleGlnGlyGlyValAsnGlyLysSerAlaPheArgAsnLysValPheValIleLeuAsnMetAlaIleGlyGlyAsnTrpProGlyPheAspValAlaAspGluAlaPheproAlaLysMetTyrIleAspTyrValArgValTyrGlnAspAlaSerThrSerSerProValGlyAspThrSerLeuAspGlyTyrTyrPheValGlnAsnArgHisSerGluLeuTyrLeuAspValThrAspAlaSerAsnGluAspGlyAlaPheLeuGlnGlnTrpSerTyrSerGlyAsnGluAsnGlnGlnPheAspPheGluHisLeuGluAsnAsnValTyrLysIleThrAsnLysLysSerGlyLysSerLeuAspValTyrAsnPheGlyThrGluAsnGlyValArgIleGlnGlnTrpSerTyrGlyGlyAlaArgAsnGlnGlnPheThrValGlnSerValGlyAspGlyTyrTyrLysIleIleProArgGlySerGlyLysLeuValGluValAlaAspPheSerLysAspAlaGlyGlyLysIleGlnGlnTrpSerAspAsnAsnGlnLeuSerGlyGlnTrpLysLeuIleLysSerLysSerTyrSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheAspSerSerLysValGlnLeuGluAspThrSerAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyrArgIleGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValproSerThrGlyGlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrValAsnValAspSerGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArgAlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleLysIleThrLysIleProGluGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArgArgAsnSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluValGlnLeuGluAspThrLeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspLysGluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlySerTyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspIleProSerThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSerHisIleValAsnValAspLeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnLysAlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleArgIleThrLysVal
8．如权利要求7所述的氨基酸序列所表示的多肽。
9．如权利要求8所述的多肽和序列编号2的序列表所示的G因子b亚基的氨基酸序列所示的多肽构成的多肽。
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