CN1269829A - 有胺氧化酶活性的血管粘着蛋白－1 - Google Patents
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Abstract
VAP－1是一种内皮唾液酸糖蛋白,其细胞表面表达受炎症条件诱导。先前已显示它能调节再循环淋巴细胞以L选择蛋白非依赖方式与人外周淋巴结血管内皮细胞的结合。已纯化出VAP－1的cDNA并显示其编码一种在分子远N末端位置有单一跨膜功能域的84.6KDⅡ型跨膜蛋白质。在体内,VAP－1主要作为170—180的二聚体存在。六个潜在的N糖基化位点位于细胞外域,三个0糖基化位点也一样。VAP－1与目前任何已知粘着分子没有明显类似性,但与含铜胺氧化酶家族有明显同一性。酶检测已确定VAP－1为一种膜结合胺氧化酶。因此,VAP－1是一种有双重功能的新型粘着分子。伴随适当的糖基化,和恰当的炎症环境,在调节淋巴细胞粘着位点中的管腔内皮细胞表面上表达的VAP－1使其作为与淋巴细胞归巢有关的一种粘着受体而发挥功能。其在其它位点的主要功能可取决于其内在胺氧化酶的活性。
Description
发明领域
本发明涉及编码一种新型人内皮细胞粘着蛋白的核酸，这种被称之为VAP-1的蛋白质具有粘着功能和胺氧化酶活性。本发明还涉及VAP-1核酸与多肽的使用。
发明背景
血液和组织之间的淋巴细胞的连续再循环是免疫系统发挥功能的关键。这个过程容许淋巴细胞巡查全身各位点，同时使它们发育并程序化其对特化的微环境组织间隙中来自抗原性威胁之反应。随后，淋巴细胞能专一返回(归巢)到其遇到抗原的位点，由此增强免疫反应的敏感性。循环淋巴细胞上的多受体及其在毛细管后微静脉中内皮细胞表面表达的配体之间的粘着性相互作用既提供了迁移过程的方式又提供了选择性控制所述过程的途径。虽然，近期在描述循环白细胞从自由流动的血液进入组织所需要的级联反应方面已取得很大进展，该过程中的许多内容尚有待发现。特别是，近期了解到的粘着分子的功能不足以定义迄今在正常与炎症环境中所定义的全部个体再循环途径和结合特异性。
本理论提示了白细胞粘着到内皮细胞的一个多步骤模型，所述模型依赖于数个受体配体对之间顺序的而非重叠的分子相互作用的级联反应(Butcher，E.G.and Picker，L.J.，Science 272：60-66(1996)：Springer，T.A.，Cell 76：301-314(1994))。血流中的白细胞与血管壁之间的初始瞬间和有限范围内的相互作用主要通过选择蛋白及其糖蛋白配体进行。整联蛋白和其他分子也可在此相中起作用。在适当信号存在时，继这种周而复始的尝试步骤之后的是通过激活整联蛋白与其Ig超家族配体的结合而调节的牢固粘着。局部上升的固定化细胞因子和其它趋化物水平可能与起始该局部反应有关，所述反应受适当受体和随后的细胞内信号转导的调节。最后的阶段包括所述结合的细胞通过尚不清楚的机制从内皮内衬向组织的迁移。组织特异性再循环途径依赖于具体粘着分子受体-配体复合物在所述适当位点的调节性表达。
我们先前已经描述了单克隆抗体(MAb)，1B2，它识别新型人内皮细胞粘着分子并可阻断淋巴细胞与冷冻切片检测中的扁桃腺高端内皮微静脉(HEV)的结合(Salmi，M.，and Jakanen，S.，Science257：1407-1409(1992)；美国专利号5,512,442和5,580,780和美国申请号08/447,799，此处全部引用做参考)。Mab 1B2对血管粘着蛋白-1(VAP-1)是特异的并由此而定义。在炎症环境中，VAP-1的表面表达被诱导并且其分子在血管内皮细胞的管腔表面被发现(Salmi，M.，等，J.Exp.Med.178：2255-2260(1993))。通过扁桃体组织的MAb 1B2免疫沉淀可检测出两种VAP-1，一种是90KD，而另一种是170-180KD。然而，在非还原条件下的免疫印迹后，主要是170-180KD种类(Salmi，M.，and Jalkanen，S.，J.Exp.Med.183：569-579(1996))。还可在其他位点发现有略微不同分子质量的免疫反应性VAP-1，特别是在血管平滑肌细胞和其他含平滑肌细胞的组织中，尽管其在这些细胞中的功能尚未确定。McNab等已报道VAP-1在肝窦状内皮上表达并可调节与T淋巴细胞的结合(McNab，G.等，Gastroenterology 110：522-528(1996))。用特异性糖苷酶消化扁桃体VAP-1的研究已表明VAP-1是一种唾液酸糖蛋白，可能含有丰富α2，3和α2，6连接型唾液酸残基的N-和-O联糖。该研究还表明在剪切条件下，VAP-1以唾液酸依赖的方式调节淋巴细胞与淋巴细胞组织中的HEV的结合，因为脱唾液酸的分子可能不再支持淋巴细胞在冷冻切片检测中的结合(Salmi，M.，and Jalkanen，S.J.Exp.Med.183：569-579(1996))。在皮肤，肠道和滑膜疾病引发的一些炎症条件下，所述分子受到正调节，尽管引发这种现象的调节因子尚未鉴定出(Arvilommi，A-M.，等，Eur.J.Immunol.26：825-833(1996)；Salmi，M.等J.Exp.Med.178：2255-2260(1993))。虽然VAP-1与PNAd均可调节淋巴细胞与PLN在剪切条件下的结合，VAP-1与MAbMECA-79定义的PLN(外周淋巴结)地址素(PNAd)是不同的。然而，与PNAd相比，VAP-1可以L选择蛋白非依赖方式发挥功能并支持L选择蛋白阴性淋巴细胞的结合(Salmi，M.，andJalkanen，S.，J.Exp.Med.183：569-579(1996))。因此，VAP-1是有以不依赖于已知选择蛋白的新型操作方式发挥重要粘着功能的分子并且可调节淋巴细胞与PLN型HEV结合中的早期相互作用。
发明综述
本发明涉及编码血管粘着蛋白-1(VAP-1)的纯化的核酸分子，所述核酸分子选自：
(a)编码含图1中氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的多肽之纯化的核酸分子；
(b)含编码图1中VAP-1核苷酸序列(SEQ ID NO：1)之VAP-1编码序列的纯化核酸分子；
(c)编码VAP-1多肽的纯化的核酸分子，所述多肽含保藏物登录号.DSM 11536中包含的VAP-1 cDNA克隆编码的氨基酸序列；
(d)含保藏物登录号为DSM 11536中所包含的VAP-1核苷酸序列之编码序列之纯化的核酸分子；
(e)含与(a)，(b)，(c)或(d)中VAP-1核苷酸序列互补的核苷酸序列的纯化核酸分子；
(f)含由于遗传密码的简并性而与核酸分子(b)或(d)的编码序列不同的核苷酸序列之纯化的核酸分子；
(g)纯化的核酸分子，其中包含与(e)中的分子杂交的核苷酸序列，并编码显示与图1中VAP-1序列(SEQ ID NO：2)有至少80％一致之氨基酸序列的VAP-1。
本发明还涉及构建重组载体的方法，包括插入含VAP-1核酸分子的序列到可起载体作用的DNA序列中。本发明还涉及含此类VAP-1的重组载体的方法。本发明涉及向宿主细胞提供VAP-1的方法，包括将编码VAP-1的DNA引入到宿主细胞中。本发明涉及含此类被引入DNA的重组宿主细胞。本发明还涉及产生血管粘着蛋白-1(VAP-1)多肽的方法，包括在使所述编码的VAP-1多肽表达的条件下培养含本发明VAP-1编码DNA的重组宿主细胞。
本发明还涉及通过转化编码VAP-1的核酸进入宿主细胞为宿主细胞提供胺氧化酶活性的方法。
本发明还涉及改变血管粘着蛋白-1(VAP-1)的表达的方法，包括：(a)向宿主细胞引入一种DNA构建物，包括：(i)VAP-1导向序列；和(ii)与VAP-1导向序列连接的VAP-1调节序列；并且(b)在适合所述DNA结构与内源VAP-1序列同源重组的条件下维持所述宿主细胞。本发明还涉及此类宿主细胞，其中VAP-1的表达已被上述方法所改变。
本发明还涉及重组宿主细胞，其含有：(a)VAP-导向序列；和(b)与所述VAP-1导向序列相关的调节序列。
本发明涉及氧化胺的方法，包括用本发明的VAP-1多肽与胺反应。例如所述胺可以是苄胺或甲胺。所述VAP-1多肽含与选自如下组分之序列有至少95％同一性的氨基酸序列：
(a’)含图1中VAP-1氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的纯化多肽；
(b’)含图1中VAP-1核酸序列(SEQ ID NO：1)编码的VAP-1氨基酸序列的纯化多肽；
(c’)含保藏物登录号为DSM11536中包含的VAP-1 cDNA克隆编码的氨基酸序列之纯化多肽；
(d’)含与编码(a’)到(c’)任何之一的多肽之DNA互补序列杂交的核酸序列所编码的VAP-1氨基酸序列的纯化多肽，并且所述核酸序列编码VAP-1并含与图1(SEQ ID NO：2)中的序列有至少80％同一性氨基酸序列；和
(e’)含(a’)或(b’)中多肽的表位携带部分之氨基酸序列的纯化多肽。
本发明还涉及抑制胺氧化酶活性的方法，包括向具有胺氧化酶活性的样品提供有效量的抑制剂。例如所述抑制剂可以是氨基脲，羟胺，炔丙胺，异烟肼，丙酰苄胺异烟肼，hydrallazine，甲基苄肼，一甲基肼，3，5-乙氧基-4-氨甲基-吡啶，或MDL72145((E)-2-(3，4-二甲氧苯基)-3-氟烯丙胺)。
本发明进一步涉及处理血管粘着蛋白-1(VAP-1)介导的内皮细胞与淋巴细胞的结合的方法，包括通过抑制与增强作用改变内皮细胞中胺氧化酶的活性。
附图简述
图1.从人肺cDNA库分离的VAP-1 cDNA序列和所预期的VAP-1蛋白质序列。被框起的是从免疫纯化的VAP-1蛋白质纯化和测序的N末端，胰蛋白酶和V8肽。在框起的区域内斜体字表示的氨基酸残基表明没有氨基酸可被指定到肽测序的循环。箭头加圆圈表示潜在的N糖基化位点而天冬酰胺和推定的O糖基化位点用箭头加方框表示。残基5与27之间的跨膜区用阴影表示。在所述图的底部刻度图表明所述跨膜区的位置(用填实的TMD区表示)并分别用N和O标明所述分子的细胞外部分中推定的糖基化位点的相对位置，以分别指明N-和O联糖。刻度条表示50个氨基酸。
图2.FACS分析VAP-1转染的COS-7细胞以确定VAP-1的膜取向与细胞定位。表示两个用于转染COS-7细胞的VAP-1表达质粒的图示在所述图解的顶部给出。VAP-1是天然的VAP-1表达构建物。VAP-1FLAG是FLAG表位标记过的VAP-1。用于模拟转染的阴性对照由一种VAP-1以所述表达系统中反向存在的构建物提供。列1：用于转染的表达构建物。列2：未透化(-)或透化的转染细胞。列3：阴性对照MAb的染色。列4：抗-VAP-1 MAb IB2的染色。列5：抗FLAG MAb M2的染色。行A-F表明用于转染的表达构建物或模拟对照以及所得到的被转染细胞的染色带型。箭头表明阳性染色细胞群。用抗VAP-1 MAb1B2观察到在未透化的细胞上的染色(FACS泳道，第4列，B和C行)模拟对照转染细胞是阴性(FACS泳道，行1，列4)。用抗-FLAG MAb在VAP-1 FLAG转染细胞中的染色没有染色被观察到(行C，列5)。然而，在透化的细胞中，VAP-1转染的细胞仍为阳性(行E，列4)而现在用抗-FLAG MAb也使VAP-1 FLAG转染的细胞被阳性染色成阳性(行F，列5)，从而表明细胞对抗FLAG MAb的透化已使其接触FLAG表位，因此该表位存在于所述细胞内部。
图3.有可用序列资料(包括VAP-1)的铜胺氧化酶家族之哺乳动物成员的序列多重排比。在左边的标记指每行中排列的具体蛋白质：BSAO，牛血清胺氧化酶；VAP-1，人血管粘着蛋白-1；PDAO1，人胎盘二胺氧化酶1；PDAO2，人胎盘二胺氧化酶2；大鼠DAO，大鼠二胺氧化酶。数字对应于每行排比蛋白质的第一个氨基酸。序列选自最新可用数据库并用GCG Pileup进行排比。用GCG Boxshade突出与VAP-1一致的残基。
图4.在COS-7细胞中表达的VAP-1的唾液酸酶处理。来自VAP-1转染和模拟转染的COS-7细胞的细胞裂解物用唾液酸酶处理(+)或不处理(-)，然后进行SDS-PAGE，免疫印迹并用VAP-1 MAb 1B2(泳道1-4)或阴性对照MAb 3G6(泳道5-8)探察。
图5.A.Northern印迹分析从通过洗涤和压榨而被部分除去淋巴细胞的人肠平滑肌和扁桃体基质提取的poly A+RNA中VAP-1 mRNA。在两个泳道中可见到4.2kb的杂交mRNA。B.不同人组织中VAP-1 mRNA的Northern印迹分析。从Clontech Laboratories获得Northern印迹并将等量mRNA上载到每个泳道中。用含完整编码序列的32P标记的VAP-1 cDNA探针探察全部杂交滤膜并在高严格条件下(杂交后洗涤条件是0.1 x SSC，0.1％SDS，65℃，2 x 45分钟)洗涤。
图6.用VAP-1 cDNA转染的斧型(Ax)细胞调节淋巴细胞的粘着。A.VAP-1在VAP-1 cDNA稳定转化的斧型细胞或模拟对照的细胞表面的表达。在直方图中，记录刻度的染色强度在X轴显示，而细胞的相对数目在Y轴显示。B.淋巴细胞与VAP-1转染细胞的VAP-1依赖型结合的增加。PBL(在单层的顶部的小圆球，例如箭头所指的)与VAP-1转染细胞(左侧)结合比与模拟转染细胞(右侧)结合多得多。相差显微摄影，100倍放大。C.所述结合的定量。五个独立实验的结果被表示为平均值±SEM。
发明详述
白细胞表面受体及其血管内皮细胞上的配体之间的相互作用关键性控制着血液和各种淋巴类器官之间的淋巴细胞转移以及白细胞向炎症位点的外渗。披露了编码调节白细胞内皮细胞粘着反应的粘着蛋白-1(VAP-1)的cDNA克隆。令人吃惊的是这种被编码的VAP-1也有胺氧化酶活性。在高等生物中，胺氧化酶被认为是与生物起源的胺类的代谢相关(Mcintire，V.and C.Hartmann，in Principles andApplications of Ouinoproteins，V.L.Davidson，编辑，MarcelDekker Inc.，N.Y.第六章，(1992))。VAP-1 cDNA
本发明提供一种纯化的核酸分子，其中包含编码血管粘着蛋白-1(VAP-1)多肽的多核苷酸，所述多肽的氨基酸序列在图1(SEQ ID NO：2)中给出，所述序列是通过对cDNA克隆测序得到图1(SEQ ID NO：1)给出的核苷酸序列而被确定的。含所述核苷酸序列的一只克隆按照布达佩斯协约的条款，于1997年5月7日保存在InternationalDepository Authority of DSMZ-Deutsche Sammlung VonMikroorganismen Und Zellkulturen GmbH，地址是MascheroderWeg1b，D-38124 Braunschweig，Germany，并给予保藏物登录号为DSM11536。所保存的克隆包含在pUC19质粒中。
在胰蛋白酶和V8蛋白酶消化后，用单克隆抗体(MAb)免疫亲合层析柱，从平滑肌的去污剂裂解物分别大量纯化90和170-180KD单体和二聚体以获得内源性肽序列。对一部分90KD VAP-1进行N端测序并用于设计产生变性引物以用于对人肠平滑肌制备的mRNA进行RT-PCR实验。
用这些引物进行约700bp单一cDNA片段的扩增并克隆到pUC18以确定其序列。为发现较长的cDNA克隆，通过PCR分析一组10个人的cDNA库以鉴定含VAP-1 cDNAs的克隆，并用PCR产生的VAP-1 cDNA片段筛选给出最长信号的库。以此方式，从人肺和心c DNA库分离出一些重叠的cDNA克隆。从这些克隆中得到图1(SEQ ID NO：1)中描述的一个单一2501bp cDNA，其中含以ATG甲硫氨酸密码子起始的2292bp连续开放读框并将其亚克隆到pUC19中。图1所示该克隆中所包含的被确定的VAP-1 cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO：1)包含编码图1(SEQ ID NO：2)的一个763氨基酸残基的开放读框，其起始密码子位于图1中核苷酸序列(SEQ ID NO：1)的80-82位，而其分子量约为84.6KD。
本发明的VAP-1与称为含铜胺氧化酶(EC1.4.3.6)的酶系有明显同一性。图1所示VAP-1蛋白质(SEQ ID NO：2)与Escherichiacoli Cu-单氨氧化酶有约24％的同一性而与该酶系的哺乳动物成员有约41-81％的类似性。被发现与其有最高同一性的是牛血清胺氧化酶(81％)。
除非另有说明，本文所提出每个“核苷酸序列”被表示为脱氧核糖核苷酸(缩写为A，G，C和T)的序列。然而，就一个DNA分子或多核苷酸而言，一个核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”是指一个脱氧核糖核苷酸序列。就一个RNA分子或多核苷酸分子而言，其相应序列是核糖核苷酸(A，G，C与U)的序列，其中具体脱氧核糖核苷酸序列中的每个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(T)被核糖核苷酸尿嘧啶(U)所取代。
本发明的核酸分子可以是RNA的形式，如mRNA，或DNA的形式，包括通过克隆或合成产生而获得的cDNA和基因组DNA。所述DNA可以是双链或单链的。单链DNA或RNA可以是编码链，亦称为有义链，或其可以是非编码链，亦称为反义链或互补链。
“纯化的”核酸分子(DNA或RNA)是指从自然环境中分离出的或合成产生的核酸分子。纯化的RNA分子包括本发明DNA分子的体外RNA转录物。
另一方面，本发明提供编码VAP-1多肽的纯化核酸分子，其含有1997年5月7日以登录号DSM11536保存的质粒中cDNA所编码的氨基酸序列。本发明进一步提供含图1所示核苷酸序列(SEQ ID NO：1)的纯化的核酸分子或含上述保存克隆中所含的VAP-1cDNA核苷酸序列，或含上述序列之一的互补序列。如此分离的分子，特别是DNA分子，作为探针用于基因作图，染色体原位杂交，和检测人组织中VAP-1基因的表达，例如Northern印迹分析。
本发明进一步涉及本文描述的纯化核酸分子之片段。含所述保存的cDNA之VAP-1核苷酸序列的纯化核酸分子之片段或在图1中给出的VAP-1核苷酸序列(SEQ ID NO：1)是指至少约15nt的片段，并更优选至少约20nt，更加优选至少约30nt，并甚至更优选至少40nt的长度，它们可作为诊断探针或如本文讨论的引物。当然，较长的片段50-1500nt长度，按照本发明，作为与所述保存的cDNA核苷酸序列的大多数(若不是全部的话)相对应的片段或作为如图1中给出的序列(SEQ ID NO：1)是有用的。由于所述VAP-1基因已被保存并提供了图1中给出的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，产生这类DNA片段将是本领域专业人员的常规技术。例如，限制性内切酶切割，超声剪切，或寡核苷酸合成可易于用来产生各种大小的片段。
另一方面，本发明提供纯化的核酸分子，其包含在严紧条件下与本发明上述核酸分子(例如保藏物登录号DSM11536中所含的VAP-1cDNA)中部分多核苷酸杂交的多核苷酸。“严紧杂交条件”是指在如下组成的溶液中42℃过夜培养：50％甲酰胺，5xSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5xDenhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20克/毫升变性的，剪切的鲑鱼精子DNA，然后在0.1xSSC中在65℃洗涤滤膜。
与“部分”多核苷酸杂交的多核苷酸指与至少约15(nt)，并更优选约至少30nt，并甚至更优选约30-70nt的本发明多核苷酸杂交的多核苷酸(DNA或RNA)。这些多核苷酸作为诊断探针和引物是有用的。当然，与较长部分的本发明多核苷酸(例如所述保存的cDNA本身)杂交的多核苷酸，例如50-750nt长度的部分)，或甚至与参比多核苷酸的全长杂交的多核苷酸作为符合本发明的探针也是有用的，正如对应于大部分(若非全部)所述保存的cDNA的VAP-1核苷酸序列或如图1(SEQ ID NO：1)中给出的核苷酸序列的多核苷酸。所述部分诊断上用做常规DNA杂交技术的探针或用做聚合酶链反应(PCR)的靶序列的扩增引物，例如在J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.，编辑，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1989)出版的分子克隆，实验室手册第二版中描述的，本文引用为参考。
本发明的纯化核酸分子包括含带有图1给出的VAP-1核苷酸序列(SEQ ID NO：1)第80-82位起始密码子之开放读框(ORF)的DNA分子并包含基本上不同于上述序列但(由于遗传密码的简并性)仍编码所述VAP-1蛋白的DNA分子。当然，遗传密码是本领域众所周知的。因此，对本领域专业人员而言，产生简并性突变子是常规技术。
本发明进一步涉及本发明核酸分子的突变子，其编码所述VAP-1蛋白的部分，类似物或衍生物。突变子可自然发生，如等位基因或剪接突变子。“等位基因突变子”指在生物染色体上占据一给定座位的基因的可相互代替的几种不同形式之一。Genes II，Lewin，B.，等，John Wiley & Sons，New York(1985)。非自然发生的突变子可用本领域已知诱变技术产生。
此类突变子包括由核苷酸替换，缺失或添加产生的突变子。替换，缺失或添加可涉及一个或多个核苷酸。突变子可在编码区，非编码区或两者均发生改变。编码区中的改变可产生保守或不保守的氨基酸替换，缺失或添加。特别优选那些静默替换，缺失或添加，它们并不改变VAP-1蛋白或其部分的性质和活性。这方面还特别优选的是保守性替换。
本发明的进一步实施方案包括纯化的核酸分子，其中含与下述核酸分子至少有90％同一性的核苷酸序列，并更优选至少有95％，96％，97％，98％或99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，(a)编码含图1(SEQ ID NO：2)中氨基酸序列之多肽的核酸分子；(b)含编码图1(SEQ ID NO：1)中VAP-1核苷酸序列的VAP-1编码序列之核酸分子；(c)编码VAP-1多肽的核酸分子，其中含由保藏物登录号DSM11536中所含VAP-1 cDNA克隆编码的氨基酸序列；(d)包含保藏物登录号为DSM11536中所含VAP-1核苷酸序列之编码序列的核酸分子；(e)包含与(a)，(b)，(c)或(d)中VAP-1核苷酸序列互补的核苷酸序列之核酸分子；(f)包含由于所述遗传密码的简并性而与(b)或(d)的核酸分子编码序列不同的核苷酸序列之核酸分子；和(g)包含与(e)的分子杂交的核苷酸序列之核酸分子，并且该核酸分子编码与图1中VAP-1序列(SEQ ID NO：2)有至少90％同一性氨基酸序列的VAP-1。这与它们是否编码有VAP-1活性的多肽无关。这因为即使具体核酸分子不编码有VAP-1活性的多肽，本领域技术人员仍知道如何使用这种核酸分子，例如一种杂交探针或一种聚合酶链反应(PCR)引物。然而，优选核苷酸分子含与图1给出的VAP-1核酸序列(SEQ ID NO：1)或与(事实上)确实编码有VAP-1蛋白活性之多肽的保存cDNA的VAP-1核酸序列有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的序列。
例如，一个多肽含与编码VAP-1多肽的关联核苷酸序列有至少90％“一致”的核苷酸序列是指所述多核苷酸的核苷酸序列，除了可包括编码VAP-1多肽之关联核苷酸序列中每100个核苷酸多达10个点突变外，与所述关联序列是一致的。无论任何具体核苷酸分子与例如图1给出的VAP-1核苷酸序列(SEQ ID NO：1)还是与所述核苷酸有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性，都可用已知计算机程序如the Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)方便测定保存的cDNA克隆之序列。载体与宿主细胞
本发明还涉及载体，包括本发明纯化的DNA分子，用编码VAP-1之DNA遗传工程化的宿主细胞，和通过重组技术产生的VAP-1多肽或其片段。
所述多肽可被结合到含可筛选标记的载体中用于在宿主中繁殖。一般说，质粒载体在沉淀中，如在磷酸钙沉淀中，或在混有带电脂质的混合物中被引入。如果载体是病毒，可用适当的包装细胞系对其进行体外包装，然后转导进入宿主细胞。可选择的标记包括二氢叶酸还原酶或用于真核细胞培养的新霉素抗性以及用于在E.coli中或其他细菌中进行培养的四环素或青霉素抗性基因。
优选的是含目的多核苷酸之顺式作用控制区的载体。适当的反式作用因子可由宿主提供，由互补载体提供或由载体本身在引入所述宿主细胞时提供。在这方面的某些优选实施方案中，所述载体提供特异性表达，其可以是诱导型的和/或细胞型特异性的。特别优选的此类载体是可由易于控制的环境因素(如温度与营养添加剂)诱导的。
本发明中有用的表达载体包括染色体，附加型和病毒衍生的载体，例如从细菌质粒，噬菌体，酵母附加体，酵母染色体元件，衍生的载体，病毒衍生的载体如杆状病毒，乳多空病毒，痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒，假狂犬病毒和逆转录病毒，以及从其组合物衍生的载体，如粘粒与噬菌粒。
所述DNA片段应与适当的启动子如噬菌体λPL启动子，大肠杆菌lac，trp和tac启动子，SV40早和晚启动子以及逆转录病毒LTRs等进行有效连接。其他适当的启动子是专业人员所熟知的。表达构建物将进一步包含转录起始，终止和(在转录区)参与翻译的核糖体结合位点。所述构建物所表达的成熟转录物的编码部分将优选包括位于起始处的翻译起始密码子和在编码序列末端适当定位的终止密码子(UAA，UGA或UAG)。
此类重组DNA技术还包括Treco等WO 94/12650和Treco等，WO95/31560(两者在此引用为参考)描述的重组方法，其可被用于改变VAP-1的表达和细胞中的胺氧化酶活性。特别是，调节区(例如启动子)可被引入到宿主基因组中以改变内源性VAP-1的表达。
因此，本发明涉及创建改变血管粘着蛋白-1(VAP-1)的表达之重组宿主细胞的方法，其中包括：(a)将一种DNA构建物引入到宿主细胞；所述DNA构建物包含(i)一个VAP-1导向序列；和(ii)一个与VAP-1导向序列相连的调节序列；和(b)维持所述宿主细胞在适于所述DNA构建物与内源性VAP-1序列之间进行同源重组的条件下。本发明还涉及通过上述方法改变了VAP-1的表达之重组宿主细胞。
本发明还涉及例如通过激活非正常表达，或在所要求的环境中或在激素条件下非正常表达VAP-1的细胞内VAP-1的表达而改变VAP-1基因之表达的方法。改变VAP-1的表达还可包括使用本发明序列灭活天然基因的表达。同源重组或导向被用于以引起所述基因比相应未受转染细胞明显更高水平表达或使所述基因呈现明显不同于相应未受转染细胞的调节或诱导模式的调节序列替换与正常内源性VAP-1基因结合的调节区或使之失效。因此，本发明涉及通过激活编码细胞中需要的产物之内源性基因制造蛋白质的方法。
如果所述DNA构建物被导向，其必须包括至少一个导向序列，并优选还包括一个调节序列。如Treco等WO94/12650和Treco等的WO95/31560中描述的，通常存在另外的序列成分，如选择性标记，扩增标记，或外显子以及未配对剪接供体位点。在这种构建物中的DNA可被认为是外源性DNA，其通过本发明方法被引入到宿主细胞。外源DNA可具有一致于或不同于在转染前就存在于细胞内的内源性DNA。
所述导向序列或DNA构建物序列是容许真正同源重组进入在VAP-1座位含VAP-1基因的被选细胞之基因组中的DNA序列。例如，导向序列是与正常存在于所获得细胞之基因组中的VAP-1基因同源的DNA序列，并一般位于调节序列的两端。所述导向序列或被使用的序列根据所述DNA构建物被插入的VAP-1位点进行筛选。
所述DNA构建物的调节序列可以包括一个或多个启动子，增强子，支架附着区或基质附着位点，副调节元件，转录因子结合位点，或其组合物。
引入所述DNA序列的位点一般在内源性VAP-1基因内部或上游或位于影响所述VAP-1基因功能的位点。改变内源性VAP-1基因之表达的DNA序列可作为单一DNA构建物被引入到宿主细胞，或作为分离的DNA序列物理连接在被转染细胞基因组中。而且，DNA可作为线形，双链DNA(在一端或两端有或无单链区)引入，或DNA可以环型DNA形式引入。在所述调节DNA被引入到宿主细胞后，仍在适合于基因组DNA与一部分引入的DNA之间发生同源重组的条件下维持所述细胞。基因组DNA与被引入DNA之间的同源重组导致同源重组宿主细胞，其中改变内源性VAP-1基因表达的序列与VAP-1基因进行有效连接。通过这种方法产生的同源重组宿主细胞可用于VAP-1蛋白的体内传递(即基因治疗)。
导向事件可以是调节序列的简单插入，从而使内源性VAP-1基因置于新型调节序列的控制下(例如通过插入所述内源性基因上游的启动子或增强子，两者都有)。导向事件可以是调节元件的简单缺失，如组织特异性负调节元件的缺失。导向序列可置换现有元件；例如组织特异性增强子可被含比天然元件更宽或不同细胞特异性的增强子替换，或表现不同于相应非转染细胞之调节或诱导作用的类型。
基因导向可用于由带有分离自不同基因的调节序列或基因工程方法合成的新型调节序列置换现有VAP-1调节区。按照这种方法，引入外源DNA致使控制内源性VAP-1基因表达的内源性序列不能发挥作用，其方法是取代所述内源性(基因组)序列的全部或部分或另外的办法是阻断内源性序列的功能。
DNA构建物(包括外源性DNA和任选的编码选择性标记之DNA)与在宿主细胞中表达所述外源性DNA所必须的附加序列一起用于转染VAP-1生产被改变的细胞。改变内源性基因表达的同源重组方法的进一步详述在Treco等，WO 94/12650，和Treco等，WO 95/31560中提供，两者本文引用为参考。
所述DNA或重组子构建物可通过各种方法引入到细胞中，包括转化，转染，电穿孔，显微注射，转导，磷酸钙沉淀，和脂质体-，1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物-，或DEAE葡聚糖介导的转染。这些方法在许多标准实验室手册中有描述，如Davis等，分子生物学基本方法(1986)。也可选用感染性载体，如逆转录病毒，疱疹病毒，腺病毒，伴随性腺病毒，腮腺炎病毒和脊髓灰质炎病毒载体，可用于引入所述DNA构建物。
适当宿主的代表性实例包括，但不限于细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌属鼠伤寒沙门氏杆菌细胞，真菌细胞如酵母细胞，昆虫细胞如果蝇S2和草地夜蛾Sf9细胞，动物细胞如Ax和CRL1998细胞(两者均是内皮细胞)，CHO，COS和Bowes黑素瘤细胞，和植物细胞。适合上述宿主细胞的培养基和条件是专业人员所熟悉的。
适当的原核与真核载体对熟练的技术人员来说是显而易见的。
在已知细菌启动子中，适合于本发明使用的包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子，T3和T7启动子，gpt启动子，λPR与PL启动子以及trp启动子。适合的真核生物启动子包括CMV立即早启动子，HSV胸腺激酶启动子，早与晚SV40启动子，逆转录病毒LTRs，如劳氏肉瘤病毒(RSV)的启动子，以及金属硫蛋白启动子，如小鼠金属硫蛋白-I启动子。
由高等真核细胞转录编码本发明VAP-1多肽的DNA可通过插入一个增强子序列到所述载体中而增加。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约从10到300bp，其起增强一给定宿主细胞型中启动子转录活性的作用。增强子的实例包括SV40增强子，其位于100bp到270bp处的复制起点的后侧。巨细胞病毒早启动子增强子，位于复制起点后侧的多瘤增强子，和腺病毒增强子。
VAP-1多肽可以被修饰的形式表达，如融合蛋白，并可不仅包括分泌信号，而且包括附加的异源功能区。例如，附加氨基酸，特别是带电荷氨基酸的区域可被加入到VAP-1多肽的N端以增强纯化期间或随后的处理及保存期间在宿主细胞内的稳定性和持久性。肽的部分还可被加入到VAP-1多肽以便利纯化。此类区域可在最终制备所述多肽前除去。将肽部分加入到多肽以实现分泌或外排，促进稳定性以及便利从其他成分中纯化是本领域所熟知的常规技术。
VAP-1蛋白质可通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收，包括硫酸铵或乙醇沉淀法，酸提取法，阴离子或阳离子交换层析法，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲合层析，羟基磷灰石层析和凝集素层析。本发明多肽包括自然纯化的产物，化学合成方法的产物，和通过重组技术从原核或真核宿主，例如包括细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞产生的产物。根据在重组生产方法中使用的宿主，本发明多肽可以是糖基化或非糖基化的。VAP-1多肽和片段
图1(SEQ ID NO：1)的VAP-1 cDNA之确定的核苷酸序列含编码图1(SEQ ID NO：2)的763个氨基酸残基之蛋白质的一个开放读框，其起始密码在图1(SEQ ID NO：1)中所述核苷酸序列的80-82位，其分子量为84.6KD。该蛋白质的每个单体含6个潜在N-糖基化位点和3个推测的O糖基化位点(使用O糖基化位点预测电子信箱服务器，NetOglyc@cbs.dtu.dk(Hansen等Biochem.J.308：801-813(1995)确定)。
因此，本发明进一步提供一种纯化VAP-1多肽，该多肽含由所述保存的DNA编码的氨基酸序列或含图1(SEQ ID NO：2)中的氨基酸序列，或包含上述多肽的一部分的肽或多肽。术语“肽”和“寡肽”被认为是同义词(通常是如此认为的)，而每个术语可根据上下文需要而交互使用以指明肽键连接的至少两个氨基酸。
本领域认为VAP-1多肽的某些氨基酸序列可被改变而无蛋白质构建物或功能的明显效应。因此，本发明进一步包括VAP-1多肽的改变，其基本上具有VAP-1多肽活性。此类突变包括缺失，插入，倒位，重复和类似碱基的替换。小的改变或诸如“中性”氨基酸替换对活性没有什么影响。关于氨基酸改变可能是表型静默的(即不可能产生对功能的明显有害的影响)可以参见Bowie等(科学247：1306-1310(1990))。改变优选次要性质的，如保守性氨基酸替换，其不明显影响VAP-1蛋白质的折叠或活性。
本发明的VAP-1蛋白质中对功能上是必须的氨基酸可通过本领域已知的方法鉴定，如定点诱变和缺失分析。然后，检测产生的突变分子生物活性，如胺氧化酶活性或粘着功能。
本发明多肽优选以基本纯化的形式提供。重组产生的VAP-1多肽可能基本上是纯化的，例如通过Smith和Johnson描述的一步法产生的，Gene 67：31-40(1988)。
本发明多肽包括与上述多肽有至少90％类似性，更优选至少95％类似性，和更加优选至少96％，97％，98％或99％类似性。本发明的其他多肽包括与所保存的cDNA编码的VAP-1多肽或图1(SEQ ID NO：2)的VAP-1多肽有至少90％同一性，更优选至少90％或95％同一性，更加优选至少96％，97％，98％或99％同一性的多肽，并且还包括此类多肽的至少有30个氨基酸的部分，并更优选至少50个氨基酸。
例如含与VAP-1多肽参考氨基酸序列至少90％“一致”的氨基酸序列的多肽是指所述多肽的氨基酸序列与参考序列的同一性，除非该多肽序列可包括直到VAP-1多肽氨基酸中每100个氨基酸有10个氨基酸替换。
本发明多肽还可用于产生多克隆与单克隆抗体，它们对检测VAP-1蛋白质表达的测试是有用的，或作为能增强或抑制VAP-1蛋白质功能的激动剂和抗激动剂。产生抗VAP-1单克隆抗体的详细资料在Salmi.M.，和Jalkanen，S.，Science 257：1407-1409(1992)，美国专利号5,512,442和5,580,780，以及美国专利号08/447,799中描述，全部引用为参考。而且，此类多肽可用于酵母双杂交系统(Fields和Song，Nature 340：245-246(1989))以“捕获”VAP-1蛋白质结合蛋白，它们也是本发明的激动剂和抗激动剂。
如本文所使用的，术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(MAb)意指包括完整分子及抗体片段(例如Fab和F(ab’)2片段)，它们能与VAP-1蛋白质专一结合。Fab与F(ab’)2片段缺少了完整抗体的Fc段，更快速的从循环中清除，并可比完整抗体有更少的非特异性组织结合(Wahl等，J.Nucl.Med.24：316-325(1983))。因此，这些片段是优选的。
本发明的抗体可通过各种方法的任何一种来制备。例如表达VAP-1蛋白质或其抗原性片段的细胞可施用于动物以产生含多克隆抗体的血清。在一种优选的方法中，VAP-1蛋白质制剂被制备并纯化以使其基本上无自然污染物。然后将此类制剂引入到动物以产生较强专一活性的多克隆抗血清。
在大多数优选方法中，本发明抗体是单克隆抗体(或结合VAP-1蛋白质的其片段)。此类单克隆抗体可用杂交瘤技术制备(Kohler等，Nature 256：495(1975)；Kohler等.，Eur.J.Immunol.6：511(1976)；Kohler等，Eur.J.Immunol.6：292(1976)；Hammerling等，在分子克隆的抗体与T细胞杂交瘤一书中，Elsevier，N.Y.(1981)563-681页)。
应意识到，Fab，F(ab’)2和本发明其他抗体片段可按照本文公开的方法使用。此类片段一般通过蛋白酶解而产生，使用的酶如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(为产生F(ab’)2片段)。或者，结合VAP-1蛋白质的片段可通过应用重组DNA技术或通过合成化学法产生。
“人化”嵌合单克隆抗体可用从产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞获得的基因构建物产生。产生嵌合抗体的方法是本领域所知的。评论见Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等BioTechniques4：214(1986)；Cabilly等，美国专利号4,816,567；Taniguchi等，EP171496。VAP-1的用途
本发明的VAP-1与称为含铜胺氧化酶的酶系(酶学委员会分类，EC1.4.3.6)有明显同一性。在图1(SEQ ID NO：2)中给出的VAP-1蛋白质与大肠杆菌铜单胺氧化酶有24％同一性并与哺乳动物的该酶系成员有约41-81％相类似。所发现的最高同一性是与牛血清胺氧化酶的同一性(81％)。使用苄胺(一种单胺氧化酶(MAO)底物)，在表达VAP-1的CHO细胞中检测出明显胺氧化酶活性，但在模拟转染细胞中却没有。在含铜单胺氧化酶抑制剂，氨基脲和羟胺存在时，VAP-1没有对苯胺的活性。
因此，本发明DNA编码的肽可用于通过胺与有胺氧化酶活性的VAP-1多肽反应而酶促氧化胺。例如，所述胺可以含内源性和外源性芳香族胺。例如所述胺也可含内源性和外源性脂肪族胺，如甲胺。所述胺优选是苄胺。
苄胺的胺氧化酶检测条件与胺氧化酶底物一样在下面材料与方法的部分详细描述。在0.2-5毫升终体积中(优选终体积为0.5毫升)，加入0.05-0.2mM终浓度(优选0.1mM)的磷酸钠缓冲液。加入未标记的苄胺到1-100nmol浓度(优选80nmol)并加入14C苄胺使其活性为0.1-1.0微居，优选0.4微居。为进行检测，可加入0.05-0.5毫升的细胞裂解样品，优选0.1毫升。在37℃温孵1小时后，用含0.1-0.5g/l(优选0.35g/l)二苯基噁唑的甲苯提取胺氧化酶反应的醛产物。用甲苯/二苯基噁唑混合物可进行另外的提取。第一次提取(和第二次提取)用14C在液闪计数器中计数。
本发明进一步涉及通过提供有效量胺氧化酶抑制剂而抑制VAP-1胺氧化酶活性的方法。例如抑制剂可包括氨基脲，羟胺，炔丙胺，异烟肼，丙酰苄胺异烟肼，hydrallazine，丙卡巴肼，单甲基肼，3，5-乙氧基-4-氨甲基-吡啶，或MDL72145((E)-2-(3，4-二甲氧苯基)-3-氟代烯丙胺)，优选氨基脲和羟胺。氨基脲可以10-1000μM浓度提供，或其中任何范围，如50-1000或80-500μM，优选100μM浓度。羟胺可以0.1-100μM浓度提供或其中任何范围，如1-10或2-8μM，优选5μM浓度。
按照本发明，血管粘着蛋白-1(VAP-1)-介导的内皮细胞与淋巴细胞的结合可通过向宿主细胞提供胺氧化酶抑制剂或增效剂进行修饰。所述宿主可以是哺乳动物细胞系、动物或人，本发明可用于体外或体内处理。
一般性描述之后，同样的内容通过参考下面实施例会更容易理解，所述实施例以解释的方式提供而非限制性的。
实施例
实施例1VAP-1 cDNA的分离
人肠平滑肌(VAP-1在其中强表达)从外科手术移出的材料中获得并用做纯化VAP-1蛋白质的来源。用MAb亲合层析柱，从足量平滑肌的去污剂裂解物中纯化90和170-180KD形式的VAP-1，以便在用胰蛋白酶和V8蛋白酶消化后获得内肽序列。此外，90KDVAP-1的一部分直接进行N端测序。用于纯化两种形式的VAP-1肽的HPLC柱的肽洗脱曲线是一致的，它们是对应于峰值的肽序列，表明该蛋白质是由两个90KD亚基组成的二聚体。
VAP-1肽序列中的一些被用于设计部分变性的寡核苷酸引物以进行从人肠平滑肌制备mRNA的RT-PCR实验。用这些引物进行约700bp的单一cDNA片段的扩增并克隆到pUC18中以确定其序列。所述cDNA序列含一个连续的开放读框，其编码含某些免疫纯化VAP-1物质的胰蛋白酶和V8肽序列之蛋白质，由此确认正确的cDNA片段被扩增。为了分离较长的cDNA克隆，通过PCR分析了一组10个人的cDNA库以鉴定含VAP-1 cDNA的克隆并用PCR产生的VAP-1 cDNA片段筛选给出最强信号的库。以这种方式，从人肺和心脏cDNA库分离出许多交叠的cDNA克隆。含有2292bp连续阅读框的以ATG甲硫氨酸密码子起始的一个2501bp cDNA从这些克隆中获得，并亚克隆到pUC19中，所述起始密码子后面跟随纯化的90KD VAP-1蛋白质N端发现的肽序列和蛋白质测序(图1)鉴定的编码全部VAP-1胰蛋白酶和V8肽之连续开放读框。一个80bp的5’非翻译区和一个129bp的3’非翻译区后随TAG终止密码子存在于所述克隆中。在所述cDNA3’端既没发现聚腺苷酸信号亦未发现多A序列，由此提示天然的VAP-1 mRNA可能比由此处分离的cDNA表现的长。
通过用含所述cDNA的表达载体转染的COS7-细胞中VAP-1的瞬时表达导致有VAP-1 MAb，1B2(图2，FACS图B行，第4列)的细胞群的强表面染色。对照转染细胞是阴性的(图2，FACS图，A行，第4列)。因此，得出结论，分离到一个cDNA，其编码在VAP-1 cDNA转染细胞表面表达的免疫反应性VAP-1。VAP-1蛋白质
在VAP-1 cDNA中的开放读框编码一个84.6KD的763个氨基酸的蛋白质。检索现有的蛋白质序列数据库表明VAP-1与称为含铜胺氧化酶(酶学委员会分类，EC1.4.3.6)的酶系有明显的同一性。这种同一性变动从大肠杆菌铜单胺氧化酶的24％到该酶系哺乳动物成员的41-81％。所发现的最高的同一性是牛血清胺氧化酶(81％)，其呈现除了一小段分子N端之外的明显保守的全长蛋白质。将VAP-1与现有序列资料的含铜胺氧化酶系的四个其他哺乳动物成员进行多重排比在图3中给出。
虽然我们注意到726-728残基之间的RGD基序的存在，VAP-1与任何目前已知的粘着分子没有明显的同一性并且不含有时在此类蛋白质中发现的蛋白质区。这种通常存在的基序，即使有与整联蛋白结合有关的功能意义也尚属未知。所述蛋白质每单体有6个潜在的N糖基化位点和3个推测的O糖基化位点(用O糖基化位点预测电子信箱服务器，NetOglyc@cbs.dtu.dk(Hansen等，Biochem.J.308：801-813(1995)确认的)(图1)。
对蛋白质序列的检测显示除在图1中表示的分子(SEQ ID NO：2)的最N端的23个氨基酸(残基5到27)的区域(主要是疏水的)之外，没有明显的跨膜功能域特征区域。这个区域既可被描述为可切割的分泌信号(因通过von Heijne方法测定其在19位含一个潜在的切割位点，G.，Nucl.Acids Res.14：4683-4690(1986))也可描述为一个跨膜功能域。该90KD VAP-1蛋白质的N端蛋白质序列显示该疏水区没有从我们纯化的材料中切去而因此不大可能起正常的分泌切割信号序列的作用。此外，疏水区侧翼残基的电荷特征提示它可能是有一个细胞质N端和一个C端细胞外域的II型膜蛋白的跨膜功能域(Hartmann，E.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5786-5790(1989))。
为确定该疏水区是否能起跨膜功能域的作用以及弄清VAP-1在膜中的取向，我们制作了VAP-1 cDNA表达构建物，其中由市售MAb M2识别的FLAG表位在推测的跨膜通道功能域之预期细胞质位点上的起始甲硫氨酸密码子之后被框架内取代。这种构建物以及在所述载体中以反方向被取代了VAP-1 cDNA的控制构建物被转染到COS-7细胞而分别由MAbs M2和1B2识别的FLAG与VAP-1表位的瞬时表达通过被透化的和未被透化的细胞的FACS分析而进行分析(图2)。用FLAG MAb进行的染色只在被透化的细胞上被观察到(图2，F行，5列)，而VAP-1染色在透化的和未透化的细胞群中均被观察到(图2，行C和F，列4)。用FLAG和VAP-1 MAbs的对照转染细胞是阴性的(图，A与D行，4和5列)。这提示N端FLAG表位位于细胞膜的细胞质位点，所述疏水区跨脂质双层，并提示存在一个大的由粘着封闭MAb 1B2识别的C端细胞外域。全部推定的糖基化位点位于所述分子的细胞外部分。
为确定在COS-7细胞内瞬时表达的重组VAP-1的大小和糖基化状态，我们免疫印迹了SDS-PAGE分离的VAP-1细胞提取物并用和不用事先唾液酸酶的消化进行了模拟转染细胞。在唾液酸酶处理时VAP-1的分子质量明显从170-180KD增加到约180-190KD表明和天然VAP-1类似，重组VAP-1是唾液酸糖蛋白，而由于移除带负电的唾液酸而致的负电荷减少引起SDS-PAGE中VAP-1的迁移率的降低。唾液酸酶的处理的类似作用已用扁桃体VAP-1观察到(Salmi，M.，和Jalkanen，S.，Exp.Med.183：569-579(1996)).VAP-1的表达
从人肠平滑肌和淋巴细胞除尽的扁桃体基质分离的mRNA的Northern印迹分析显示，克隆的VAP-1 cDNA与两种组织中的一个4.2kb mRNA均杂交(图5A)。进一步Northern印迹分析显示4.2kb的VAP-1 mRNA在广泛的人组织中表达。在外周血白细胞或脑中没有检测到这种信息，与其他组织相比，该信息在肺，小肠和阑尾中强表达。在脾，胸腺，睾丸，肝，胰，肾，骨髓和胎肝中只有少量VAP-1mRNA表达。中间水平的表达在前列腺，卵巢，结肠黏膜内衬，心脏，胎盘，骨骼肌和淋巴结中(图5B)。没有其他mRNA种类被检测到，甚至在延长放射自显影亦如此。材料与方法
Ab’s与试剂。抗VAP-1小鼠MAbs 1B2和抗鸡T细胞3G6已由Salmi，M.，和Jalkanen，S.，Science 257：1407-09(1992))描述。MAbM2识别FLAG肽(DYKDDDDK)从KEBO实验室，Espoo，芬兰获得。
VAP-1的纯化与测序。从腹部手术获得的正常肠样品与基底感受器(1amina propria)解剖分离。将平滑肌壁切成碎片并在溶解缓冲液中溶解(150mM NaCl，10mM Tris碱，pH7.2，1.5mM MgCl2，1％NP-40，1％抑蛋白酶肽和imM PMSF)过夜。在澄清之后，溶解悬液被随后上免疫亲合层析柱，该柱含5毫升挂有正常大鼠血清的CnBr活化琼脂糖凝胶珠，未结合的MAbs以及抗VAP-1MAb(3毫克/毫升珠)。所述特异性柱用溶解缓冲液和50mM三乙胺洗脱的VAP-1抗原洗。洗脱液被立即冷冻并随后冻干。然后将所述样品溶解在未还原的Laemmli’s样品缓冲液中并在5-12.5％的SDS-PAGE凝胶上分离。
通过电印迹转移到聚偏氟乙烯膜(应用生物系统公司，FosterCity，CA，USA)后，用考马斯蓝染色该膜并剪下90和170-180KD的带。按照Fernandez等(Fernandez，J.等Anal Biochem.201：255-262(1992))描述的方法，用胰蛋白酶消化全部170-180KD带和部分90KD物质。用HPLC(150A；Applied Biosystems)在Vydac C18柱(2.1×150mm)上分离洗脱的带。在装备有联机乙内酰苯硫脲氨基酸分析仪(120A；Applied Biosystems)的蛋白质测序仪(477A；Applid Biosystems)上进行N端序列分析。90KD物质的其余部分不经事先消化而进行分析。在胰酶消化后，用V8蛋白酶(序列分析级，Boehringer Mannheim)消化该膜，而洗脱的肽按照上述方法纯化和测序。其中某些肽的序列用激光辅助的基质解吸质谱法证实以确认它们的预期质量(Lasermat，Finnigan)。
分子生物学技术。按照标准技术(Sambrook，J.，等，分子克隆：实验室手册，第二版，Cold Speing Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989))进行大肠杆菌的小规模和大规模分离质粒，限制酶消化，噬斑杂交，λ噬菌体纯化和噬菌体DNA提取，大肠杆菌转化，cDNA合成以及质粒构建。从琼脂糖分离DNA片段用QIAEX试剂盒(QIAEGEN，Hilden，Germany)按照厂家提供的指导进行。用Amersham Multiprime DNA标记试剂盒和[α-32P]dCTP以Ci/mMol(Amersham，Bucks，UK)制备DNA探针。放射自显影用增感屏进行，若需要，用Amersham Hyperfilm MP。用SureClone试剂盒(Pharmacia，Uppsala，Sweden)将PCR片段平端克隆到pUC18中。质粒DNA用测序酶2.0版试剂盒(United States Biochemical Corporation，Cleveland，OH，USA)按照厂商的指导或在Turku大学医学遗传系的DNA测序装置中进行测序。用Genetics Computer Group的WisconsinPackage 8.1-UNIX版进行序列汇集与分析。用BLAST电子邮件或国家生物技术信息中心的WWW服务器(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行数据库比较。测序和PCR所用的寡核苷酸引物从Kebo实验室(Espoo，Finland)购得。用Dynazyme聚合酶(Finnzymes，Espoo，Finland)在厂商推荐的条件下进行PCR并选择所述PCR引物的特征有关的各种扩增参数。用于通过RT-PCR从平滑肌mRNA扩增VAP-1 cDNA片段所使用的引物是N2；从VAP-1 N-端蛋白质序列AVITIFA(SEQ ID NO：4)(完全蛋白质的残基13到19)和T4设计而来的gctgtgatcacmatyttygc(SEQ ID N0：3)；从胰蛋白酶解肽序列VFYQGR(SEQ ID NO：6)(残基264到269)设计的ccggccctgrtagaasac(SEQ ID NO：5)。这些引物扩增的条件是94℃，1分钟；55℃，1分钟；72℃，2分钟共30个循环。总RNA从细胞系和组织用Ultraspec(Biotecs，Houston，TX，USA)按照厂商的指导制备。人多重组织Northern印迹从ClontechLaboratories(Palo Alto，CA，USA)获得并按照厂商推荐的方法与32P标记的探针杂交。人cDNA库图和肺(目录号HL3004a)和心脏(目录号HL3026a)的cDNA库来自Clontech Laboratories.
哺乳动物细胞中VAP-1 cDNAs的细胞培养与表达。从ATCC(Rockville，MD)获得的COS-7(猴成纤维细胞)，CHO-(中国仓鼠卵巢细胞)和CRL1998(人永生化脐静脉内皮细胞)被用做VAP-1转染与表达的宿主。COS-7和CRL 1998细胞在补充有10％胎牛血清(PAA-Linz，奥地利)，2mM谷氨酰胺(Biological Industries，Israel)，和128U/毫升青霉素及128微克/毫升的链霉素的RPMI 1640(Gibco BRL)中生长。CHO细胞在α-MEM加CHO核苷酸中用同样的补料培养。亚克隆到表达载体pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)的包括VAP-1 cDNAs的表达质粒用于瞬时COS-7细胞转染和产生稳定的转染CHO细胞系。表达质粒(20微克)被用于通过用Bio-Rad基因脉冲仪进行电穿孔而转染细胞(0.3kV，960μF，0.4厘米样品池，在RPMI中加1mM丙酮酸钠，2mM L-谷氨酰胺，无血清)。瞬时转染的细胞转染后被检测3天。通过在0.5毫克/毫升Geneticin(GibcoBRL)存在时筛选稳定转染的细胞共4周。
实施例2VAP-1酶活性
VAP-1与含铜胺氧化酶系，特别是与分泌的牛血清胺氧化酶(BSAO)有明显同一性的发现使我们检测是否VAP-1具有胺氧化酶活性。由不寻常的醌辅助因子，酶结合铜以及仅针对多胺或单胺的存在来区分含铜胺氧化酶。因此，它们区别于含FAD细胞内(线粒体)单胺氧化酶(McIntire，W.S.和Hartmann，C.，醌蛋白的原理与应用，97页(V.l.Davidson编辑，Dekker，New York(1993))。
为确定VAP-1具有何种类型的活性，我们产生了表达VAP-1蛋白质的稳定的CHO细胞转染子。用腐胺作为底物检测这些细胞之超声裂解物的二胺氧化酶(DAO)活性，或用苄胺做底物检测单胺氧化酶(MAO)活性。市售DAO和MAO可作为阳性对照进行检测，而模拟质粒转染的CHO细胞裂解物提供了阴性对照。这些结果显示，VAP-1表达细胞具有对腐胺的微不足道的活性，但用MAO底物苄胺则检测出明显活性(表1)。然而，用苄胺(一种单胺氧化酶(MAO)底物)，在VAP-1表达CHO细胞和市售牛血浆MAO(表1)阳性对照中检测到明显活性。模拟CHO细胞裂解物显示了明显的酶活性。在100μM氨基脲和10μM羟胺(含铜单胺氧化酶专一抑制因子)存在时(Lyles，Intl.J.Biochem.Cell Biol.28：254-274(1996))，VAP-1没有对苄胺的活性(表1)。
此外，我们证明了在Ax细胞中表达的有粘着活性的VAP-1还具有对苄胺的MAO活性，所述活性不受氨基脲或羟胺的抑制，因为可在模拟对照细胞中检测到低水平的活性(表1)。
为确认MAO活性是在体内VAP-1中发现的，我们以一式三份免疫纯化了扁桃体的VAP-1并检测了所述材料。扁桃体VAP-1，如来自转染的CHO细胞的VAP-1，在所使用的检测检测条件下被证明的对苄胺的活性在37℃时每小时A490增加0.09，这比煮沸样品高4.5倍。由于获得的VAP-1蛋白质的产率十分低，不可能测出比活性。
苄胺尽管通常用作为测量胺氧化酶活性的底物，仍未在被体内发现。因此对许多生物学上存在的内源性胺进行了检测以观察是否它们能被VAP-1所利用(表2)。1mM的甲胺似乎易于被VAP-1利用，然而其他被测胺没有证明出有反应性。在这些细胞裂解物中与表1中检测的裂解物相比用苄胺所观察的比活性要低，这反应出不同批细胞中所发现的VAP-1的表达不同。
VAP-1中的醌辅助因子的存在通过在还原条件下经SDS-PAGE分离一部分免疫纯化的扁桃体VAP-1物质并转移该物质到硝酸纤维素而显示出来。然后将硝酸纤维素滤膜用氮蓝四唑/甘氨酸钠在氧化还原循环条件下染色，专门染蛋白质的醌部分(Paz，M.A.等J.Biol.Chem.266：689-92(1991))。与单体90KD和二聚体180KDVAP-1反应显示扁桃体VAP-1的染色在每个亚单位中有一个醌因子。材料与方法
胺氧化酶活性。用VAP-1 cDNA表达质粒稳定转染的铺满的CHO或Ax细胞(每瓶10-15×106)从培养瓶中刮入10毫升100mM磷酸缓冲液中，pH7.2，离心并用另外10毫升缓冲液洗细胞沉淀。所述细胞沉淀最终悬浮在1.5毫升磷酸缓冲液中并通过2×10秒中等功率超声(Braun超声仪)在冰上裂解细胞。超声裂解物被直接用于酶检测(每次检测50-100微升)或以后保存在-20℃。总蛋白质浓度通过Bradford方法用牛γ球蛋白作为标准和Bio-Rad蛋白质检测试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)进行检测。
胺氧化酶活性按照先前描述的技术使用如底物，14C标记的腐胺(Amersham)通过D’Agostino方法，L.等，Biochem.Pharmacol.38：47-49(1989)(本文引用为参考)，3H组胺(New England Nuclear)通过Baylin，S.B.和Margolis，S.的方法，Biochem.Biophys.Acta 397：294-306(1975)(本文引用为参考)，和14C苄胺(Amersham)以除每反应使用0.4微居的标记之外类似于腐胺的方式检测，所述反应液含80nmol的未标记苄胺底物。0.5毫升反应体积含100mM磷酸钠缓冲液，pH7.2，0.4微居14C苄胺(Amersham)，80nmol未标记苄胺和样品，直到最大体积为每反应液100微升粗细胞裂解物。在37℃温孵1小时，反应液的醛产物通过加入含0.35g/l的二苯噁唑的900微升甲苯进行提取并剧烈震荡。在分相后，移除500微升的甲苯层并加入700微升甲苯/二苯噁唑进行提取，移除其500微升，加入第一提取液并在液体闪烁计数器中进行14C计数。全部酶检测在含煮沸样品(10分钟，100℃)的空白或未表达样品存在时以一式双份或一式三份进行，而其结果被表达为每分钟每毫克蛋白质所表达的pmol底物。粗猪肾DAO和牛血浆MAO的对照从Sigma化学公司获得(St.Louis，MO，USA)。
讨论
用MAb 1B2识别的VAP-1进行的明显的染色在数个位点，特别是在PLN型淋巴组织内的血管内皮细胞中被发现。然而，由于在这些位点发现的VAP-1总水平相对低，证实难于分离和纯化从中获得蛋白质序列信息的足量内皮VAP-1。在发现VAP-1的其他组织中，血管类和肠相关平滑肌中是最丰富的(Salmi，M.等，J.Exp.Med.178：2255-2260(1993))。这些来源的VAP-1具有勉强称得上差异的分子质量(可能是由于糖基化的差异)，但其他则类似于先前在扁桃体和PLN型组织中分析的形式。
利用从肠平滑肌纯化的VAP-1获得的蛋白质序列信息，分离出编码这种粘着分子的cDNA。这方面的证据基于如下内容：首先，从免疫纯化VAP-1获得的蛋白质在随后分离出的VAP-1 cDNA预期蛋白质序列中被发现。其次，被转染的表达VAP-1 cDNA的细胞可被MAb 1B2在其表面染色，后者原先是用于定义VAP-1(Salmi，M.，和Jalkanen，S.，Science257：1407-1409(1992)，并且从这些细胞免疫纯化的VAP-1有类似于体内所发现的170-180KD分子质量。
VAP-1是大的，二聚体的II型跨膜蛋白，有位于分子N端的跨膜功能域。细胞内功能域特别小，仅4个氨基酸长度，其余是每二聚体163KD左右的大的糖基化细胞外域。每个二聚体的全部潜在的糖基化位点，12个N连接的和6个推定的O连接位于所述细胞外域。虽然目前未知是否这些均被利用，先前的资料提示VAP-1既含N-又含O连接的糖和一些存在于N连接的碳水化合物末端残基上或作为O连接的糖之部分的唾液酸残基。由于碳水化合物(并特别是唾液酸)被认为在VAP-1蛋白质粘着功能中起重要作用(Salmi，M.，和Jalkanen，S.，J.Exp.Med.183：569-579(1996))，有必要确定那些糖基化位点被利用和什么碳水化合物在其上出现。
由于在Northern印迹检查的任何组织中没有观察到明显不同大小的VAP-1 mRNA种类，并且所有被分析的VAP-1 cDNA克隆和PCR片段含类似的序列，没有结论性证据表明存在着突变mRNA编码的VAP-1之不同形式。因此，似乎很可能发明者们已经克隆了先前已通过免疫印迹和免疫沉淀研究过的编码VAP-1主要形式的cDNA。然而，由于所有这些被测组织含平滑肌(来自血管组织或其他来源)以及血管内皮层，如果极类似的mRNA类型存在于这些组织中，则不可能区别平滑肌和内皮细胞VAP-1的mRNA。因此，可以想象，可能有其他形式的VAP-1由略微不同于已经分离的mRNA所编码。
有趣的是，有这种跨膜区的VAP-1之N端区是与其同源BSAO大不相同的分子部分。BSAO已知是在血清中发现的高水平分泌蛋白并在其N端有一个分泌信号序列，所述N端通过蛋白水解过程在分泌途径中被移除(Mu，D.，等J.Biol.Chem.269：9926-9932(1994))。因此，BSAO与VAP-1可能没有类似的生理学性质。初步证据提示小鼠VAP-1有类似于在人VAP-1中发现的跨膜功能域，并因此可能有如人类分子同样的功能。VAP-1的细胞外域含胺氧化酶活性，并因此VAP-1可起胞外酶的功能。含铜胺氧化酶是有广泛区别于底物特异性的多种类酶，但它们可被主要分为两类，对多胺如腐胺和组胺有活性的那些酶和如VAP-1有单胺氧化酶活性的那些酶。所述单胺氧化酶的底物是不清楚的，尽管有数个候选底物。
这些酶的另一特征是存在不常见的含羰基辅助因子，其化学特性一直颇有争论，但其已在BSAO和大豆胺氧化酶中被鉴定为多巴醌(六羟基多巴)而在赖氨酰氧化酶中被鉴定为交联赖氨酸酪氨酰醌。在几个哺乳动物物种中，包括人类，在细胞膜和在血清的可溶性形式中发现的含铜单胺氧化酶已被鉴定。这个活性对通过羰基反应试剂如氨基脲和羟胺的抑制是敏感的(Lyles，G.A.，Intl.J.Biochem.Cell Biol.28：259-274(1996))而有关的酶通常被认作为氨基脲敏感性胺氧化酶(SSAO)。我们已证实VAP-1含一个共价键醌，根据对其他含铜单胺氧化酶的研究，其可能由自发过程在一个含酶结合铜的反应中形成。这些结果，以及VAP-1酶活性对羰基反应试剂氨基脲和羟胺的敏感性证实VAP-1是膜结合的SSAO。
SSAOs的生理作用一直难于定义，因为对它们在体内底物知之甚少而且它们的底物特异性在不同物种之间差异很大。内源的和异生的主要单胺的代谢似乎是一种可认定的功能，并且这很可能是在非内皮位点如平滑肌中发现的VAP-1的功能。
目前对VAP-1的SSAO活性在其粘着性质中是否起任何作用尚不清楚。在氨基脲和羟胺存在时，用VAP-1转染的CRL1998细胞和PBL(外周血淋巴细胞)进行的初步体外实验提示，所述酶活性可具有对这些细胞之间的粘着相互作用有负影响，因为在这些抑制因子存在时，PBL与VAP-1转染细胞结合的数目增加。尚不知道是否这种影响是主要的(通过对由所述细胞利用的粘着机制有直接和间接影响而引起的)，还是次要的(在其中，所述细胞的生理学状态受单胺氧化酶活性的多种影响而减弱其粘着潜力)。
实施例3粘着检测
pcDNA3中的VAP-1 cDNA被用于转染Ax细胞，一种大鼠HEV衍生的内皮细胞系，所述细胞系可能为VAP-1提供比其他潜在宿主如CHO细胞更自然的功能环境。获得的稳定的转染子在其细胞表面表达VAP-1如通过FACS分析所测定的(图6A)，并被用于淋巴细胞粘着检测。当在回旋条件下分析时，PBL与VAP-1转染的Ax细胞的结合比与模拟转染细胞的结合好25.6倍(图6B，与6C)。与VAP-1转染子的结合的促进统计上明显受抗VAP-1mAb处理的抑制(尽管没有完全被消除)(29.6％±10.7％，P＝0.05)。这些粘着结果从5个独立的实验中汇集，其中2-3个平行转染子单层每次用3个独立转染细胞系和来自6个不同供体的PBL进行分析。因此，这些资料显示VAP-1 cDNA编码有功能的粘着分子，其位于转染细胞的表面，并且当在Ax细胞中表达时能直接调节PBL的结合。材料与方法
稳定表达VAP-1的Ax细胞或模拟转染子被放在凝胶包被的显微镜载片上用蜡笔画出的圈内(每2厘米直径圈20,000细胞)。使所述细胞生长到铺满并在洗涤两次后，加入100微升含10％FCS和10mMHEPES(检测培养基)的RPMI1640培养基到每个蜡笔圈内以均匀覆盖粘着细胞单层。同时，用Ficoll离心从新抽的血中分离PBL，并在检测培养基中调整到40×106细胞/毫升的浓度。此后，，所述载片被转移到定轨摇床在7℃每分钟60转下运行，并施加5微升PBL悬液到每个蜡笔圈上。该检测用恒定转速继续30分钟。所述载片被小心倒去上面的清液并浸入冷RPMI一次以移除未粘着的细胞。通过使载片竖直立在冰冷的含1％戊二醛中孵浴过夜使粘着细胞固定到切片上。用目镜格(200倍放大)计数粘着细胞。所述格覆盖0.25平方毫米的面积。每个格计数9个预选的位于中心圆圈0.25平方毫米的面积，其中转化子形成铺满的单层。每个样品(总面积＝4.5平方毫米)的两个载片在五个独立实验中的每个进行计数。在某些实验中粘着检测在封闭功能的抗VAP-1mAbs(1B2与TK8-14的组合，两者均以50微克/毫升稀释稀释于检测培养基)或类型匹配阴性对照mAbs(3G6与7C7均以50微克/毫升组合)存在时进行。在加入标记的淋巴细胞之前，所述mAbs用转染子单层7℃的载片上预温孵30分钟。如上述对5个独立实验的粘着细胞数目进行计数。讨论
对VAP-1表达Ax细胞进行粘着检测表明所述cDNA编码可支持与其配体在PBL上相互作用的功能性VAP-1并导致所述PBL与Ax细胞的稳定结合。然而，未观察到与抗VAP-1 mAbs 1B2和TK8-14的这种增加的粘着的完全抑制，从而提示大鼠获得的Ax细胞中VAP-1分子功能上并非恰好如其在其天然环境中表现的那样。很可能，Ax细胞中蛋白质的碳水化合物的修饰局部细胞膜环境或VAP-1构像完全不同于人HEV中的，以至所述mAb可不再阻断所有VAP-1与其配体的相互作用。还可能VAP-1分子亚群可以缺少一种或其他mAbs 1B2和TK8-14识别的表位的形式出现在转染子上。最后，我们留有在稳定的转化子中长期超表达VAP-1而改变Ax细胞表面上的其他粘着分子的表达的可能性。当然，这种其他推定的粘着分子将不受抗VAP-1 mAb的抑制。在HEV结合检测中VAP-1一直表现独立起淋巴细胞L-选择蛋白的功能，并且它调节CD8+PBL的结合比CD4+PBL好的多。Ax VAP-1 cDNA转化子重现这些观察结果因为免疫磁纯化的L-选择蛋白阴性细胞和CD8+和CD4+细胞的分析显示L选择蛋白不是有效结合Ax转化子所必须的并且显示PBL的CD8+亚群对VAP-1转染子的粘着比CD4+细胞(数据未显示)高数倍。
表1.表达VAP-1的CHO和Ax细胞中胺氧化酶的活性分析
以每分钟每毫克蛋白质nmol产物表示的细胞型酶活性底物 CHO CHO模拟 二胺氧化酶 单胺氧化酶 Ax VAP-1 Ax模拟
VAP-1腐胺 0.87±0.17 1.45±0.13 4.87±0.10 0.29±0.00 ND ND苄胺 26.94±0.70 0.13±0.13 0.57±0.10 8.83±0.00 2.15±0.04 0.80±0.80苄胺+SC 0.61±0.17 1.32±0.26 ND ND 0.35±0.09 1.00±0.00苄胺+HA 0.35±0.17 1.32±0.26 ND ND 0.31±0.04 0.90±0.10
每个检测重复三次而平均比活性±SEM被给出，ND未做检测。
表2.VAP-1胺氧化酶活性的底物比活性
以每分钟每毫克nmol产物表示的蛋白质的细胞型酶活性底物 CHO VAP-1 CHO模拟苄胺 4.57±0.29 0.18±0.62甲胺 4.28±0.22 0.18±0.44酪胺 0.04±0.10 0.09±0.35色胺 0.074±0.04 0.35±0.62β-苯乙酰胺 0.10±0.03 0.26±0.00组胺 0.05±0.03 0.20±0.00对不同样品以可比性结果进行实验两次，一次代表性的实验结果被给出。每个检测重复三次并给出平均比活性±SEM。
尽管本发明已经结合其具体实施方案进行了描述，应能理解它可进一步修改，并且其应用将包含(一般而言)遵循本发明的原理和包括本发明的任何改变，应用或修改方法并包括诸如已知范围内的本公开或本发明有关的领域内的常规实践相背离方面，并且其可应用于上下文提出的基本性质和如下所附权利要求的范围。
全部参考文献，专利申请以及本文所引用的专利的公开以其完整性在此引用为参考。
序列表
(1)一般资料：
(i)申请人：
(A) 名称：BioTie Therapies Ltd.
(B) 街道：Tykistonkatu 6
(C) 城市：Turku
(D) 国家：芬兰
(E) 邮编(ZIP)：FIN-20520
(ii)发明题目：有胺氧化酶活性的血管粘着蛋白-1
(iii)序列号：2
(iv)计算机可读形式：
(A) 介质类型：软盘
(B) 计算机：IBM PC兼容
(C) 操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D) 软件：PatentIn Release #1.0，1.30版(EPO)
(vi)在先申请资料：
(A) 申请号：US 08/862,433
(B) 提交日期：1997年5月23日
(2) SEQ ID NO：1资料：
(i)序列特征：
(A) 长度：2501碱基对
(B) 类型：核酸
(C) 链型：单链
(D) 拓扑结构：线形
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GCCAACAGAG CCCCCGTCTT GCTGGCGTGA GAATACATTG CTCTCCTTTG GTTGAATCAG 60CTGTCCCTCT TCGTGGGAAA ATGAACCAGA AGACAATCCT CGTGCTCCTC ATTCTGGCCG 120TCATCACCAT CTTTGCCTTG GTTTGTGTCC TGCTGGTGGG CAGGGGTGGA GATGGGGGTG 180AACCCAGCCA GCTTCCCCAT TGCCCCTCTG TATCTCCCAG TGCCCAGCCT TGGACACACC 240CTGGCCAGAG CCAGCTGTTT GCAGACCTGA GCCGAGAGGA GCTGACGGCT GTGATGCGCT 300TTCTGACCCA GCGGCTGGGG CCAGGGCTGG TGGATGCAGC CCAGGCCCGG CCCTCGGACA 360ACTGTGTCTT CTCAGTGGAG TTGCAGCTGC CTCCCAAGGC TGCAGCCCTG GCTCACTTGG 420ACAGGGGGAG CCCCCCACCT GCCCGGGAGG CACTGGCCAT CGTCTTCTTT GGCAGGCAAC 480CCCAGCCCAA CGTGAGTGAG CTGGTGGTGG GGCCACTGCC TCACCCCTCC TACATGCGGG 540ACGTGACTGT GGAGCGTCAT GGAGGCCCCC TGCCCTATCA CCGACGCCCC GTGCTGTTCC 600AAGAGTACCT GGACATAGAC CAGATGATCT TCAACAGAGA GCTGCCCCAG GCTTCTGGGC 660TTCTCCACCA CTGTTGCTTC TACAAGCACC GGGGACGGAA CCTGGTGACA ATGACCACGG 720CTCCCCGTGG TCTGCAATCA GGGGACCGGG CCACCTGGTT TGGCCTCTAC TACAACATCT 780CGGGCGCTGG GTTCTTCCTG CACCACGTGG GCTTGGAGCT GCTAGTGAAC CACAAGGCCC 840TTGACCCTGC CCGCTGGACT ATCCAGAAGG TGTTCTATCA AGGCCGCTAC TACGACAGCC 900TGGCCCAGCT GGAGGCCCAG TTTGAGGCCG GCCTGGTGAA TGTGGTGCTG ATCCCAGACA 960ATGGCACAGG TGGGTCCTGG TCCCTGAAGT CCCCTGTGCC CCCGGGTCCA GCTCCCCCTC 1020TACAGTTCTA TCCCCAAGGC CCCCGCTTCA GTGTCCAGGG AAGTCGAGTG GCCTCCTCAC 1080TGTGGACTTT CTCCTTTGGC CTCGGAGCAT TCAGTGGCCC AAGGATCTTT GACGTTCGCT 1140TCCAAGGAGA AAGACTAGTT TATGAGATAA GCCTCCAAGA GGCCTTGGCC ATCTATGGTG 1200GAAATTCCCC AGCAGCAATG ACGACCCGCT ATGTGGATGG AGGCTTTGGC ATGGGCAAGT 1260ACACCACGCC CCTGACCCGT GGGGTGGACT GCCCCTACTT GGCCACCTAC GTGGACTGGC 1320ACTTCCTTTT GGAGTCCCAG GCCCCCAAGA CAATACGTGA TGCCTTTTGT GTGTTTGAAC 1380AGAACCAGGG CCTCCCCCTG CGGCGACACC ACTCAGATCT CTACTCGCAC TACTTTGGGG 1440GTCTTGCGGA AACGGTGCTG GTCGTCAGAT CTATGTCCAC CTTGCTCAAC TATGACTATG 1500TGTGGGATAC GGTCTTCCAC CCCAGTGGGG CCATAGAAAT ACGATTCTAT GCCACGGGCT 1560ACATCAGCTC GGCATTCCTC TTTGGTGCTA CTGGGAAGTA CGGGAACCAA GTGTCAGAGC 1620ACACCCTGGG CACGGTCCAC ACCCACAGCG CCCACTTCAA GGTGGATCTG GATGTAGCAG 1680GACTGGAGAA CTGGGTCTGG GCCGAGGATA TGGTCTTTGT CCCCATGGCT GTGCCCTGGA 1740GCCCTGAGCA CCAGCTGCAG AGGCTGCAGG TGACCCGGAA GCTGCTGGAG ATGGAGGAGC 1800AGGCCGCCTT CCTCGTGGGA AGCGCCACCC CTCGCTACCT GTACCTGGCC AGCAACCACA 1860GCAACAAGTG GGGTCACCCC CGGGGCTACC GCATCCAGAT GCTCAGCTTT GCTGGAGAGC 1920CGCTGCCCCA AAACAGCTCC ATGGCGAGAG GCTTCAGCTG GGAGAGGTAC CAGCTGGCTG 1980TGACCCAGCG GAAGGAGGAG GAGCCCAGTA GCAGCAGCGT TTTCAATCAG AATGACCCTT 2040GGGCCCCCAC TGTGGATTTC AGTGACTTCA TCAACAATGA GACCATTGCT GGAAAGGATT 2100TGGTGGCCTG GGTGACAGCT GGTTTTCTGC ATATCCCACA TGCAGAGGAC ATTCCTAACA 2160CAGTGACTGT GGGGAACGGC GTGGGCTTCT TCCTCCGACC CTATAACTTC TTTGACGAAG 2220ACCCCTCCTT CTACTCTGCC GACTCCATCT ACTTCCGAGG GGACCAGGAT GCTGGGGCCT 2280GCGAGGTCAA CCCCCTAGCT TGCCTGCCCC AGGCTGCTGC CTGTGCCCCC GACCTCCCTG 2340CCTTCTCCCA CGGGGGCTTC TCTCACAACT AGGCGGTCCT GGGATGGGGC ATGTGGCCAA 2400GGGCTCCAGG GCCAGGGTGT GAGGGATGGG GAGCAGCTGG GCACTGGGCC GGCAGCCTGG 2460TTCCCTCTTT CCTGTGCCAG GACTCTCTTT CTTCCACTAC C 2501
(2)SEQ ID NO：2资料：
(i)序列特征：
(A) 长度：763氨基酸
(B) 类型：氨基酸
(C) 链型：未知
(D) 拓扑结构：线形
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Asn Gln Lys Thr Ile Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Val Ile Thr1 5 10 15Ile Phe Ala Leu Val Cys Val Leu Leu Val Gly Arg Gly Gly Asp Gly
20 25 30Gly Glu Pro Ser Gln Leu Pro His Cys Pro Ser val Ser Pro Ser Ala
35 40 45Gln Pro Trp Thr His Pro Gly Gln Ser Gln Leu Phe Ala Asp Leu Ser
50 55 60Arg Glu Glu Leu Thr Ala Val Met Arg Phe Leu Thr Gln Arg Leu Gly65 70 75 80Pro Gly Leu Val Asp Ala Ala Gln Ala Arg Pro Ser Asp Asn Cys Val
85 90 95Phe Ser Val Glu Leu Gln Leu Pro Pro Lys Ala Ala Ala Leu Ala His
100 105 110Leu Asp Arg Gly Ser Pro Pro Pro Ala Arg Glu Ala Leu Ala Ile Val
115 120 125Phe Phe Gly Arg Gln Pro Gln Pro Asn Val Ser Glu Leu Val Val Gly
130 135 140Pro Leu Pro His Pro Ser Tyr Met Arg Asp Val Thr Val Glu Arg His145 150 155 160Gly Gly Pro Leu Pro Tyr His Arg Arg Pro Val Leu Phe Gln Glu Tyr
165 170 175Leu Asp Ile Asp Gln Met Ile Phe Asn Arg Glu Leu Pro Gln Ala Ser
180 185 190Gly Leu Leu His His Cys Cys Phe Tyr Lys His Arg Gly Arg Asn Leu
195 200 205Val Thr Met Thr Thr Ala Pro Arg Gly Leu Gln Ser Gly Asp Arg Ala
210 215 220Thr Trp Phe Gly Leu Tyr Tyr Asn Ile Ser Gly Ala Gly Phe Phe Leu225 230 235 240His His Val Gly Leu Glu Leu Leu Val Asn His Lys Ala Leu Asp Pro
245 250 255Ala Arg Trp Thr Ile Gln Lys Val Phe Tyr Gln Gly Arg Tyr Tyr Asp
260 265 270Ser Leu Ala Gln Leu Glu Ala Gln Phe Glu Ala Gly Leu Val Asn Val
275 280 285Val Leu Ile Pro Asp Asn Gly Thr Gly Gly Ser Trp Ser Leu Lys Ser
290 295 300Pro Val Pro Pro Gly Pro Ala Pro Pro Leu Gln Phe Tyr Pro Gln Gly305 310 315 320Pro Arg Phe Ser Val Gln Gly Ser Arg Val Ala Ser Ser Leu Trp Thr
325 330 335Phe Ser Phe Gly Leu Gly Ala Phe Ser Gly Pro Arg Ile Phe Asp Val
340 345 350Arg Phe Gln Gly Glu Arg Leu Val Tyr Glu Ile Ser Leu Gln Glu Ala
355 360 365Leu Ala Ile Tyr Gly Gly Asn Ser Pro Ala Ala Met Thr Thr Arg Tyr
370 375 380Val Asp Gly Gly Phe Gly Met Gly Lys Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Arg385 390 395 400Gly Val Asp Cys Pro Tyr Leu Ala Thr Tyr Val Asp Trp His Phe Leu
405 410 415Leu Glu Ser Gln Ala Pro Lys Thr Ile Arg Asp Ala Phe Cys Val Phe
420 425 430Glu Gln Asn Gln Gly Leu Pro Leu Arg Arg His His Ser Asp Leu Tyr
435 440 445Ser His Tyr Phe Gly Gly Leu Ala Glu Thr Val Leu Val Val Arg Ser
450 455 460Met Ser Thr Leu Leu Asn Tyr Asp Tyr Val Trp Asp Thr Val Phe His465 470 475 480Pro Ser Gly Ala Ile Glu Ile Arg Phe Tyr Ala Thr Gly Tyr Ile Ser
485 490 495Ser Ala Phe Leu Phe Gly Ala Thr Gly Lys Tyr Gly Asn Gln Val Ser
500 505 510Glu His Thr Leu Gly Thr Val His Thr His Ser Ala His Phe Lys Val
515 520 525Asp Leu Asp Val Ala Gly Leu Glu Asn Trp Val Trp Ala Glu Asp Met
530 535 540Val Phe Val Pro Met Ala Val Pro Trp Ser Pro Glu His Gln Leu Gln545 550 555 560Arg Leu Gln Val Thr Arg Lys Leu Leu Glu Met Glu Glu Gln Ala Ala
565 570 575Phe Leu Val Gly Ser Ala Thr Pro Arg Tyr Leu Tyr Leu Ala Ser ASn
580 585 590His Ser Asn Lys Trp Gly His Pro Arg Gly Tyr Arg Ile Gln Met Leu
595 600 605Ser Phe Ala Gly Glu Pro Leu Pro Gln Asn Ser Ser Met Ala Arg Gly
610 615 620Phe Ser Trp Glu Arg Tyr Gln Leu Ala Val Thr Gln Arg Lys Glu Glu625 630 635 640Glu Pro Ser Ser Ser Ser Val Phe Asn Gln Ash Asp Pro Trp Ala Pro
645 650 655Thr Val Asp Phe Ser Asp Phe Ile Asn Asn Glu Thr Ile Ala Gly Lys
660 665 670Asp Leu Val Ala Trp Val Thr Ala Gly Phe Leu His Ile Pro His Ala
675 680 685Glu Asp Ile Pro Asn Thr Val Thr Val Gly Asn Gly Val Gly Phe Phe
690 695 700Leu Arg Pro Tyr Asn Phe Phe Asp Glu Asp Pro Ser Phe Tyr Ser Ala705 710 715 720Asp Ser Ile Tyr Phe Arg Gly Asp Gln Asp Ala Gly Ala Cys Glu Val
725 730 735Asn Pro Leu Ala Cys Leu Pro Gln Ala Ala Ala Cys Ala Pro Asp Leu
740 745 750Pro Ala Phe Ser His Gly Gly Phe Ser His Asn
755 760
Claims (25)
1.纯化的编码血管粘着蛋白-1(VAP-1)的核酸分子，选自：
(a)编码含图1氨基酸序列(SEQ ID NO：2)之多肽的纯化核酸分子；
(b)含图1VAP-1核苷酸序列(SEQ ID NO：1)之VAP-1编码序列的纯化核酸分子；
(c)编码VAP-1多肽的纯化核酸分子，其中含保藏物登录号DSM11536所包含的VAP-1 cDNA克隆编码的氨基酸序列；
(d)含VAP-1核苷酸序列之编码序列的纯化核酸分子，其中核苷酸序列包含于保藏物登录号DSM11536；
(e)含与(a)，(b)，(c)或(d)中VAP-1核苷酸序列互补的核苷酸序列之纯化的核酸分子；
(f)含由于遗传密码的简并性而不同于(b)或(d)的核酸分子之编码序列的核苷酸序列之纯化的核酸分子；
(g)含与(e)的分子杂交并编码VAP-1的核苷酸序列之纯化的核酸分子，该VAP-1含有表现与图1中VAP-1序列(SEQ ID NO：2)至少有80％同一性的氨基酸序列。
2.权利要求1的核酸分子，其中被编码的VAP-1含胺氧化酶活性。
3.权利要求1的核酸分子，其含有图1(SEQ ID NO：1)的VAP-1核苷酸序列。
4.权利要求1的核酸分子，其含有图1(SEQ ID NO：1)中VAP-1的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码含图1中氨基酸序列的(SEQ IDNO：2)VAP-1多肽。
5.权利要求1的核酸序列分子，其含有包含在保藏物登录号DSM11536中的VAP-1 cDNA的核苷酸序列。
6.权利要求1的核酸分子，其含有编码VAP-1多肽的核苷酸序列，所述多肽含保藏物登录号DSM11536中包含的VAP-1 cDNA克隆编码的氨基酸序列。
7.权利要求1的核酸分子，其是一种cDNA分子。
8.权利要求1的核酸分子，其是一种RNA分子
9.制造重组载体的方法，包括向一个载体中插入权利要求1的纯化核酸分子。
10.权利要求9的方法产生的重组载体
11.为宿主细胞提供VAP-1的方法，包括引入权利要求1的纯化的核酸分子到所述宿主细胞中。
12.含权利要求1的纯化核酸分子的重组宿主细胞。
13.产生血管粘着蛋白-1(VAP-1)多肽的方法，包括在能使所述VAP-1多肽表达的条件下培养权利要求12的重组宿主细胞，并回收所述VAP-1多肽。
14.通过引入权利要求2的核酸到所述宿主细胞中而为宿主细胞提供胺氧化酶活性的方法。
15.改变血管粘着蛋白-1(VAP-1)表达的方法，包括：
(a)将DNA结构引入宿主细胞，该构建物包括：
(i)VAP-1导向序列；和
(ii)与所述VAP-1导向序列连接的调节序列；和
(b)在适合于所述DNA结构与内源性VAP-1 DNA序列之间同源重组的条件下维持所述宿主细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述调节序列在所要求的条件下防止所述VAP-1的表达。
17.权利要求15的方法，其中所述调节序列在所要求的条件下增加所述VAP-1的表达。
18.重组宿主细胞，包含：
(a)VAP-1导向序列；和
(b)与所述VAP-1导向序列连接的调节序列。
19.氧化胺的方法，包括用有胺氧化酶活性的血管粘着蛋白-1(VAP-1)多肽与所述胺反应。
20.权利要求19的方法，其中所述VAP-1多肽的氨基酸序列与选自下列一组的序列有至少95％同一性：
(a’)含图1中VAP-1氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的纯化多肽；
(b’)含图1中VAP-1核苷酸序列(SEQ ID NO：1)编码的VAP-1氨基酸序列的纯化多肽；
(c’)含在保藏物登录号DSM11536中包含的VAP-1 cDNA克隆所编码的氨基酸序列的纯化多肽；
(d’)含与编码(a’)到(c’)任何之一的多肽的DNA之互补序列杂交的核苷酸序列所编码的VAP-1氨基酸序列的纯化多肽，并且所述核苷酸序列编码VAP-1并含有一个表现与图1中序列(SEQ ID NO：2)有至少80％同一性的氨基酸序列；
(e’)含(a’)或(b’)的多肽之表位携带部分的氨基酸序列的纯化多肽。
21.权利要求19的方法，其中所述胺选自苄胺和甲胺。
22.抑制胺氧化酶活性的方法，包括向有所述胺氧化酶活性的样品提供有效量的抑制剂。
23.权利要求22的方法，其中所述抑制因子选自下列一组，包括氨基脲，羟胺，炔丙胺，异烟肼，丙酰苄胺异烟肼，hydrallazine，甲基苄肼，一甲基肼，3，5-乙氧基-4-氨甲基-吡啶，或MDL72145((E)-2-(3，4-二甲氧苯基)-3-氟烯丙胺)。
24.处理血管粘着蛋白-1(VAP-1)介导的内皮细胞与淋巴细胞结合的方法，包括抑制所述内皮细胞中的胺氧化酶之酶活性。
25.处理血管粘着蛋白-1(VAP-1)介导的内皮细胞与淋巴细胞结合的方法，包括加强所述内皮细胞中的胺氧化酶之酶活性。
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