PL192459B1

PL192459B1 - Sposób utleniania aminy, sposób zahamowania aktywności oksydazy aminowej i sposoby manipulowania wiązaniem limfocytów z komórkami śródbłonka

Info

Publication number: PL192459B1
Application number: PL337004A
Authority: PL
Inventors: Sirpa Jalkanen; Marko Salmi; David John Smith; Petri Bono
Original assignee: Biotie Therapies Corp
Priority date: 1997-05-23
Filing date: 1998-05-22
Publication date: 2006-10-31
Also published as: HUP0002234A2; JP2001507238A; AU742098B2; KR20010012920A; PL337004A1; WO1998053049A1; NO995725L; NZ501118A; HUP0002234A3; KR100533911B1; AU7531498A; CA2289903A1; CN1269829A; NO995725D0; EP0979271A1; RU2204838C2

Abstract

1. Sposób utleniania aminy, znamienny tym, ze obejmuje poddanie aminy reakcji z polipep- tydem bia lka adhezji naczyniowej - 1 (VAP-1) o aktywno sci oksydazy aminowej. 2. Sposób wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze polipeptyd VAP-1 ma sekwencj e aminokwa- sow a przynajmniej w 95% identyczn a z sekwencj a wybran a z grupy obejmuj acej: (a') oczyszczony polipeptyd obejmuj acy sekwencj e aminokwasow a VAP-1 na figurze 1 (Id. Sekw. nr 2); (b') oczyszczony polipeptyd obejmuj acy sekwencj e aminokwasow a VAP-1, kodowan a przez sekwencj e nukleotydow a VAP-1 na figurze 1 (Id. Sekw. nr 1); (c') oczyszczony polipeptyd obejmuj acy sekwencj e aminokwasow a kodowan a przez klon cDNA VAP-1 zawarty w depozycie o numerze dost epu DSM 11536; (d') oczyszczony polipeptyd obejmuj acy sekwencj e aminokwasow a VAP-1, która jest kodo- wana przez sekwencj e nukleotydow a, która hybrydyzuje z sekwencj a komplementarn a DNA kodu- j acego polipeptyd wed lug jednego z (a') do (c') i koduje VAP-1 i ma sekwencj e aminokwasow a, która wykazuje przynajmniej 80% identyczno sci z sekwencj a na figurze 1 (Id. Sekw. nr 2); i (e') oczyszczony polipeptyd obejmuj acy sekwencj e aminokwasow a cz esci nios acej epitop polipeptydu wed lug (a') albo (b'). PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób utleniania aminy, sposób zahamowania aktywności oksydazy aminowej i sposoby manipulowania wiązaniem limfocytów z komórkami śródbłonka.

Ciągła recyrkulacja limfocytów pomiędzy krwią i tkankami jest kluczowa dla działania układu odpornościowego. Proces umożliwia limfocytom patrolowanie wszystkich miejsc w organizmie w poszukiwaniu antygenu, umożliwiając im jednocześnie rozwinięcie i ukształtowanie reakcji na zagrożenie antygenowe w wyspecjalizowanych przedziałach mikrośrodowiska tkankowego. Następnie, limfocyty mogą powrócić do miejsca, w którym napotkały antygen, zwiększając wybiórczość reakcji odpornościowej. Adhezyjne oddziaływanie pomiędzy licznymi receptorami na krążących limfocytach i ich ligandami wyrażanymi na powierzchni komórek śródbłonkowych w żyłkach post-kapilarnych zapewnia zarówno sposób emigracji jak i sposób jej kontrolowania. Jakkolwiek dokonano ostatnio istotnego postępu w opisaniu kaskady zjawisk koniecznych do wniknięcia przez krążące leukocyty z krwiobiegu do tkanek, wiele zjawisk w tym procesie wymaga odkrycia. W szczególności funkcje obecnie znanych cząsteczek adhezyjnych nie są wystarczające do określenia wszystkich poszczególnych szlaków recyrkulacji i swoistości wiązania, które zostały określone w warunkach normalnych i zapalnych.

Obecne hipotezy sugerują wieloetapowy proces adhezji leukocytów do śródbłonka, który polega na kaskadzie kolejnych ale nakładających się oddziaływań cząsteczkowych pomiędzy kilkoma parami receptorów i ligandów (Butcher E.G.i Picker,L. Science 272:60-66 (1996); Springer T.A., Cell 76:301314 (1994)). Początkowe przejściowe i wiążące oddziaływania pomiędzy leukocytem w krwiobiegu i ś cianą naczynia zachodzą głównie przez selektyny i ich ligandy glikoproteinowe. Integryny i inne cząsteczki mogą również odgrywać rolę w tej fazie. Ten etap rolowania i próbowania, w obecności odpowiednich sygnałów, może następować przez ustabilizowane przyleganie za pośrednictwem wiązania przez aktywowane integryny z ich ligandami z nadrodziny immunoglobulinowej. Miejscowo zwiększone poziomy unieruchomionych cytokin i innych chemoatraktantów mogą być związane z początkami tej miejscowej aktywacji, która zachodzi przez odpowiednie receptory, a następnie przekazanie sygnału do komórki. Końcowy etap obejmuje przenikanie związanej komórki przez wyściółkę śródbłonka do tkanek, dzięki mechanizmom, które są słabo poznane. Swoiste tkankowe mechanizmy recyrkulacyjne polegają na regulowanej ekspresji konkretnych kombinacji receptora cząsteczki adhezyjnej-liganda w odpowiednim położeniu.

Uprzednio opisano przeciwciało monoklonalne (mAb), 1B2, które rozpoznaje nową ludzką cząsteczkę adhezyjną i które może blokować wiązanie się limfocytów z żyłkami z wysokim śródbłonkiem (HEV) w migdałkach w teście ze mrożonymi skrawkami (Salmi M., i Jalkanen S., Science 257:14071409 (1992); Patent USA nr 5,512,442 i 5,580,780 oraz zgłoszenie patentowe USA nr 08/447,799, załączone tu jako odnośniki). mAb 1B2 jest swoiste wobec białka adhezji naczyniowej - 1 (VAP-1). W sytuacjach zapalnych indukowana jest ekspresja powierzchniowa VAP-1, zaś cząsteczkę stwierdza się na powierzchni wewnętrznej komórek śródbłonka naczyń (Salmi M. i in., J. Exp. Med., 178:22552260 (1993)). Przez immunoprecypitację tkanki migdałków przy użyciu mAb 1B2 można wykryć dwa rodzaje VAP-1, różniące się ciężarem cząsteczkowym, jedno o ciężarze 90 kDa i drugie o ciężarze 170-180 kDa. Jednakże, po badaniu immunologicznym w warunkach nieredukujących, najczęstszym rodzajem jest białko 170-180 kDa (Salmi M. i Jalkanen, S., J. Exp. Med., 183:569-579 (1996)). Reaktywne immunologicznie białko VAP-1 o nieco zmienionym ciężarze cząsteczkowym można również znaleźć w innych miejscach, szczególnie w innych tkankach zawierających mięśnie gładkie, jakkolwiek funkcja tych komórek pozostaje niewyjaśniona. McNab i in., opisują, że VAP-1 ulega ekspresji na śródbłonku zatok wątroby i może pośredniczyć w wiązaniu limfocytów T (McNab G., i in., Gastroenterology 110:522-528 (1996)). Badania VAP-1 w migdałkach przy użyciu trawienia swoistymi glikozydazami wykazały, że VAP-1 jest sialoglikoproteiną, prawdopodobnie zawierającą cukry przyłączone w położeniu N-, jak i O-, z powszechnie występującymi resztami kwasu sialowego w połączeniu typu α2,3, jak i α2,6. Wykazano również, że VAP-1 pośredniczy w wiązaniu limfocytów z HEV w tkankach limfatycznych w warunkach przepływu, jak i w sposób zależny od kwasu sialowego, ponieważ cząsteczka desialowana nie powoduje wiązania limfocytów w teście z mrożonymi skrawkami (Salmi M. i Jalkanen, S., J. Exp. Med., 183:569-579 (1996)). Czą steczka ulega dodatniej regulacji w pewnych warunkach zapalnych spowodowanych chorobami skóry, jelit, migdałków i maziówki, jakkolwiek mediatory powodujące to zjawisko nie zostały jeszcze zidentyfikowane (Arvillommi A.M. i in., Eur. J. Immunol. 26:825-833 (1996); Salmi M. i in., J. Exp. Med., 178:2255-2260 (1993)). VAP-1 różni się od adresyny PLN (obwodowych węzłów chłonnych) (PNAd) określonej przez przeciwciało monoklonalne

PL 192 459 B1

MECA-79, mimo iż VAP-1 i PNAd mogą pośredniczyć w wiązaniu PLN w warunkach przepływu. Jednakże, w przeciwieństwie do PNAd, VAP-1 może działać w sposób niezależny od selektyny L i podtrzymywać wiązanie selektyny L z limfocytami negatywnymi (Salmi M. i Jalkanen S., J. Exp. Med., 183:569-579 (1996)). Stąd, VAP-1 jest cząsteczką o ważnym działaniu adhezyjnym w nowym szlaku, który działa niezależnie od znanych selektyn i prawdopodobnie pośredniczy we wczesnych oddziaływaniach wiązania limfocytów z PLN w HEV.

Wynalazek dotyczy sposobu utleniania aminy, obejmującego poddanie aminy reakcji z polipeptydem białka adhezji naczyniowej -1 (Vap-1) o aktywności oksydazy aminowej.

Korzystnie amina jest wybrana z grupy obejmującej benzyloaminę i metyloaminę.

Korzystnie polipeptyd VAP-1 ma sekwencję aminokwasową przynajmniej w 95% identyczną z sekwencją wybraną z grupy obejmują cej:

(a') oczyszczony polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową VAP-1 na figurze 1 (Id. Sekw. nr 2);

(b') oczyszczony polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową VAP-1, kodowaną przez sekwencję nukleotydową VAP-1 na figurze 1 (Id. Sekw. nr 1);

(c') oczyszczony polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową kodowaną przez klon cDNA VAP-1 zawarty w depozycie o numerze dostępu DSM 11536;

(d') oczyszczony polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową VAP-1, która jest kodowana przez sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje z sekwencją komplementarną DNA kodującego polipeptyd według jednego z (a') do (c') i koduje VAP-1 i ma sekwencję aminokwasową, która wykazuje przynajmniej 80% identyczności z sekwencją na Figurze 1 (Id. Sekw. nr 2); i (e') oczyszczony polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową części niosącej epitop polipeptydu według (a') albo (b').

Wynalazek dotyczy również sposobu zahamowania aktywności oksydazy aminowej, obejmującego dostarczenie skutecznej ilości inhibitora do próbki wykazującej aktywność oksydazy aminowej.

Korzystnie inhibitor jest wybrany z grupy obejmującej semikarbazyd, hydroksyloaminę, propargiloaminę, izoniazyd, nialamid, hydralazynę, prokarbazynę, monometylohydrazynę, 3,5-etoksy-4-aminometylopirydynę albo MDL72145 ((E)-2-(3,4-dimetylofenylo)-3-fluoroalliloamina).

Wynalazek ponadto dotyczy sposobu manipulowania wiązaniem limfocytów z komórkami śródbłonka za pośrednictwem białka adhezji naczyniowej - 1 (VAP-1), obejmującego hamowanie aktywności enzymatycznej oksydazy aminowej w tych komórkach śródbłonka.

Wynalazek dotyczy również sposobu manipulowania wiązaniem limfocytów z komórkami śródbłonka za pośrednictwem białka adhezji naczyniowej - 1 (VAP-1), obejmującego nasilanie aktywności enzymatycznej oksydazy aminowej w tych komórkach śródbłonka.

Krótki opis figur

Figura 1. Sekwencja cDNA VAP-1 wyizolowanego z biblioteki cDNA ludzkich płuc oraz przewidywana sekwencja białka VAP-1. Peptydy końca N, trawione i V8, które oczyszczono i sekwencjonowano z oczyszczonego przez powinowactwo immunologiczne VAP-1, wzięto w ramki. Reszty aminokwasowe oznaczone kursywą w regionie zaznaczonym ramką wskazują, że do danego cyklu sekwencjonowania peptydu nie można było przypisać aminokwasu. Potencjalne miejsca N-glikozylacji zaznaczono strzałką jako asparaginy i wzięto w kółko, zaś potencjalne miejsca O-glikozylacji zaznaczono strzałką i kwadratem. Domenę śródbłonową między resztami 5 i 27 zaznaczono cieniowaniem. Diagram skali u podstawy figury wskazuje położenie domeny śródbłonowej (pokazanej jako wypełniony region TMD), zaś względne położenie domniemanych miejsc glikozylacji w części zewnątrzkomórkowej cząsteczki zaznaczono przez N i O, w celu zaznaczenia, odpowiednio, cukru przyłączonego N- i O-. Kreska skali oznacza 50 aminokwasów.

Figura 2. Analiza FACS komórek COS-7 transfekowanych VAP-1, w celu określenia orientacji błonowej i położenia komórkowego VAP-1. Schemat przedstawiający budowę dwóch plazmidów ekspresyjnych VAP-1 zastosowanych do transfekcji komórek COS-7 pokazano na szczycie Figury. VAP-1 jest konstruktem wyrażającym natywne VAP-1. VAP-1FLAG jest to VAP-1 oznakowany epitopem FLAG. Kontrolę negatywną dla transfekcji pozornych pokazano jako konstrukt, w którym VAP-1 jest w wektorze ekspresyjnym w orientacji odwrotnej. Kolumna 1: konstrukt ekspresyjny zastosowany do transfekcji. Kolumna 2: brak permeabilizacji (-) albo permeabilizacja (+) komórek transfekowanych. Kolumna 3: kontrola negatywna barwienia mAb. Kolumna 4: znakowanie mAb 1B2 przeciwko VAP-1. Kolumna 5: znakowanie mAb M2 przeciwko FLAG. Rzędy A-F oznaczają konstrukt ekspresyjny albo kontrolę pozorną zastosowaną do transfekcji i powstały wzorzec barwienia komórek transfekowanych.

PL 192 459 B1

Strzałki wskazują populacje komórek barwiących się pozytywnie. Barwienie komórek nie permeabilizowanych obserwowana jest z mAb 1B2 przeciwko VAP-1 (panel FACS rząd B i C, kolumna 4). Komórki transfekowane pozornie były negatywne (panel FACS rząd A, kolumna 4). Nie obserwowano barwienia z użyciem mAb przeciwko FLAG w komórkach transfekowanych VAP-1 FLAG (rząd C, kolumna 5). Jednakże, w komórkach permeabilizowanych, komórki transfekowane VAP-1 były wciąż pozytywne (rząd E, kolumna 4), ale w tym przypadku komórki transfekowane VAP-1 FLAG barwiły się również pozytywnie przy użyciu mAb przeciwko FLAG (rząd F, kolumna 5) co wskazuje, że permeabilizacja komórek dla mAb przeciwko FLAG umożliwiła dostęp do epitopu FLAG, a to oznacza, że epitop znajduje się w komórce.

Figura 3. Wielokrotne przyporządkowanie członków rodziny ssaczych miedziowych oksydaz aminowych, dla których dostępne były sekwencje, w tym VAP-1. Oznaczenia po lewej stronie dotyczą konkretnego białka w każdym rzędzie: BSAO, bydlęca surowicza oksydaza aminowa; VAP-1, ludzkie białko adhezji naczyniowej - 1; PDAO1, ludzka łożyskowa oksydaza diaminowa 1; PDAO2, ludzka łożyskowa oksydaza diaminowa 2; szczurza DAO, szczurza oksydaza diaminowa. Liczby oznaczają pierwszy aminokwas w każdym rzędzie przyrównanego białka. Sekwencje wyciągnięto z większości dostępnych obecnie baz danych i przyrównano stosując GCG Pileup. Reszty identyczne z VAP-1 zaznaczono stosując GCG Boxshade.

Figura 4. Traktowanie sialidazą VAP-1 wyrażonego w komórkach COS-7. Lizaty komórkowe z komórek COS-1 transfekowanych VAP-1 albo transfekowanych pozornie traktowano sialidazą (+) albo nie (-), poczym poddawano SDS-PAGE, przenoszeniu na błonę i sondowaniu mAb 1B2 przeciwko VAP-1 (ścieżki 1-4) albo mAb kontroli negatywnej 3G6 (ścieżki 5-8).

Figura 5. A. Analiza metodą Northern blot mRNA VAP-1 w poli(A)+RNA ekstrahowanego z mięśni gładkich ludzkich jelit i zrębu migdałka, z którego częściowo usunięto limfocyty przez płukanie i wyciskanie. W obu ścieżkach można zaobserwować hybrydyzujący mRNA wielkoś ci około 4,2 kb. B. analiza met. Northern blot mRNA VAP-1 różnych tkanek ludzkich. Membrany do badania Northern otrzymano z Clontech Laboratories i do każdej ścieżki wprowadzono równą ilość mRNA. Wszystkie filtry sondowano sondą cDNA VAP-1, znakowaną ³²P, obejmującą całą sekwencję i płukano w warunkach wysokiej surowości (płukanie po hybrydyzacyjne: 0,1 X SSC, 0,1% SDS w 65°C przez 2 x 45 minut).

Figura 6. Komórki Ax transfekowane cDNA VAP-1 pośredniczą w adhezji limfocytów. A. Ekspresja VAP-1 na powierzchni komórek Ax stabilnie transfekowanych cDNA VAP-1 i transfekowanych pozornie. W histogramach, natężenie barwienia na skali logarytmicznej pokazano na osi x, zaś względną liczbę komórek na osi y. B. Wzrost wiązania limfocytów z transfektantami VAP-1 za pośrednictwem VAP-1. Istotnie więcej PBL (małe okrągłe sfery na powierzchni monowarstwy, których przykłady zaznaczono strzałkami) wiązało się z transfektantami VAP-1 (po lewej), niż z transfektantami pozornymi (po prawej). Mikrofotografie kontrastujące fazy, powiększenie x 100. C. Ocena ilościowa wiązania. Wyniki pięciu niezależnych doświadczeń przedstawiono jako średnią ± SEM.

Oddziaływanie pomiędzy receptorami powierzchniowymi leukocytów i ich ligandami na komórkach śródbłonka naczyń w sposób kluczowy kontroluje przemieszczanie się limfocytów pomiędzy krwiobiegiem i różnymi narządami limfatycznymi, jak również wynaczynienie leukocytów do miejsc zapalnych. Opisano klon cDNA kodujący białko adhezji naczyniowej - 1 (VAP-1), które pośredniczy w reakcji adhezji leukocytów z komórkami ś ródbłonka. Kodowane VAP-1 nieoczekiwanie wykazuje aktywność oksydazy aminowej. U organizmów wyższych, oksydaza aminowa uważana jest za enzym związany z metabolizmem amin biogennych (Mclntire W. i Hartmann C., Principles and Applications of Quinoproteins, Davidson V.L., wyd., Marcel Dekker, Inc., NY., Rozdz. 6 (1992)).

cDNA VAP-1

Na fig. 1 (Id. Sekw. nr 1) przedstawiono sekwencję nukleotydową, którą określono na podstawie sekwencjonowania klonu cDNA polinukleotydu kodującego białko adhezji naczyniowej - 1 (VAP-1) o sekwencji aminokwasowej pokazanej na figurze 1 (Id. Sekw. nr 2) w oczyszczonej cząsteczce kwasu nukleinowego. Klon zawierający sekwencję nukleotydową zdeponowano w oparciu o Traktat Budapeszteński w Międzynarodowym Organie Depozytowym DSMZ - Deutsche Sammlumg von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Niemcy, 7 maja, 1997, i nadano mu numer dostępu DSM 11536. Zdeponowany klon zawiera plazmid pUC19.

Przy użyciu kolumny powinowactwa immunologicznego z przeciwciałem monoklonalnym (mAb) oczyszczono postać 90 i 170 - 180 kDa, odpowiednio monomeryczną i dimeryczną VAP-1, z lizatów detergentowych komórek mięśni gładkich w ilościach wystarczających do otrzymania wewnętrznej

PL 192 459 B1 sekwencji peptydowej po trawieniu trypsyną i proteazą V8. Część VAP-1 90 kDa poddano sekwencjonowaniu końca N i zastosowano do zaprojektowania częściowo zdegenerowanych starterów oligonukleotydowych do RT-PCR na mRNA wyizolowanym z komórek mięśni gładkich ludzkiego jelita.

Pojedynczy fragment cDNA wielkości około 700 bp amplifikowano stosując te startery i klonowano do pUC18 w celu określenia sekwencji. W celu znalezienia dłuższych klonów cDNA, panel 10 bibliotek ludzkich cDNA analizowano przez PCR w celu zidentyfikowania bibliotek zawierających cDNA VAP-1, i biblioteki dające najsilniejszy sygnał badano przesiewowo przy użyciu fragmentu cDNA VAP-1 uzyskanego przez PCR. W ten sposób, wyizolowano wiele nakładających się klonów cDNA z bibliotek cDNA ludzkiego serca i płuc. Z tych klonów otrzymano pojedynczy cDNA wielkości 2501 bp opisany na figurze 1 (Id. Sekw. nr 1) zawierający ciągłą, otwartą ramkę odczytu 2292 bp, rozpoczynającą się kodonem metioniny ATG, po czym klonowano go do pUC19. Oznaczona sekwencja nukleotydowa cDNA VAP-1 zawarta w tym klonie na figurze 1 (Id. Sekw. nr 1) zawierała otwartą ramkę odczytu kodującą białko o 763 resztach aminokwasowych na figurze 1 (Id. Sekw. nr 2) z początkowym kodonem w pozycji 80-82 sekwencji nukleotydowej na figurze 1 (Id. Sekw. nr 1) i ciężarze cząsteczkowym około 84,6 kDa.

VAP-1 ujawniony w wynalazku wykazuje istotną identyczność z rodziną enzymów określanych jako zawierające miedź oksydazy aminowe (EC 1.4.3.6). Białko VAP-1 pokazane na figurze 1 (Id. Sekw. nr 2) jest w około 24% identyczne z Cumonoaminooksydazą E. coli i w około 41-81% identyczne z członkami tej rodziny u ssaków. Najwyższą identyczność stwierdzono z bydlęcą surowiczą oksydazą aminową (81%).

O ile nie zaznaczono inaczej, każ da z podanych tu „sekwencji nukleotydowych” jest przedstawiona jako sekwencja dezoksyrybonukleotydów (w skrócie A, G, C i T). Jednakże, przez określenie „sekwencja nukleotydowa” cząsteczki kwasu nukleinowego albo polinukleotydu rozumie się, dla cząsteczki albo polinukleotydu DNA, sekwencję dezoksyrybonukleotydów. Dla cząsteczki albo polinukleotydu RNA, odpowiednia sekwencja składa się z rybonukleotydów (A, G, C i U), gdzie dezoksyrybonukleotyd tymidynowy (T) w wyszczególnionej sekwencji dezoksyrybonukleotydowej jest zastąpiony przez rybonukleotyd urydynowy (U).

Cząsteczki kwasu nukleinowego ujawnione w wynalazku mogą być w postaci RNA jak np. mRNA, albo w postaci DNA, w tym cDNA albo genomowego DNA, otrzymane przez klonowanie albo wytwarzane syntetycznie. DNA może być dwu- albo jednoniciowy. Jednoniciowy DNA albo RNA może być nicią kodującą, znaną również jako nić sensowna, albo może być nicią niekodującą, określaną również jako nić antysensowna albo komplementarna.

Przez określenie „oczyszczona” cząsteczka kwasu nukleinowego rozumie się cząsteczkę kwasu nukleinowego, DNA albo RNA, którą pobrano z naturalnego otoczenia albo wytworzono syntetycznie. Oczyszczone cząsteczki RNA obejmują transkrypty RNA in vitro cząsteczek DNA ujawnionych w wynalazku.

W wynalazku ujawniono oczyszczone cząsteczki kwasu nukleinowego, kodują ce polipeptyd VAP-1 o sekwencji aminokwasowej kodowanej przez klon cDNA zawarty w plazmidzie zdeponowanym pod numerem dostępu DSM 11536; 7 maja, 1997. W wynalazku ponadto ujawniono oczyszczoną cząsteczkę kwasu nukleinowego o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na figurze 1 (Id. Sekw. nr 1) albo sekwencję nukleotydową cDNA VAP-1 zawartą w opisanym wyżej zdeponowanym klonie, albo cząsteczkę kwasu nukleinowego o sekwencji komplementarnej do jednej z powyższych sekwencji. Takie izolowane cząsteczki, szczególnie cząsteczki DNA, są przydatne jako sondy do mapowania genowego, przez hybrydyzację in situ z chromosomami, oraz do wykrywania ekspresji genu VAP-1 w ludzkiej tkance, przykł adowo analizą metodą Northern blot.

W wynalazku ujawniono ponadto fragmenty opisanego tu oczyszczonego kwasu nukleinowego. Przez określenie „fragment oczyszczonej cząsteczki kwasu nukleinowego o sekwencji nukleotydowej VAP-1, zdeponowanego cDNA albo sekwencji nukleotydowej VAP-1 przedstawionej na figurze 1 (Id. Sekw. nr 1)” rozumie się fragmenty długości przynajmniej 15 nt (nukleotydów), zaś korzystniej przynajmniej około 20 nt, jeszcze korzystniej przynajmniej około 30 nt, zaś jeszcze korzystniej, przynajmniej około 40 nt długości, które są przydatne jako sondy diagnostyczne i startery. Oczywiście, dłuższe fragmenty 50-1500 nt są również przydatne, ponieważ są fragmentami odpowiadającymi większości, o ile nie całości sekwencji nukleotydowej zdeponowanego cDNA albo jak przedstawiony na figurze 1 (Id. Sekw. nr 1). Ponieważ gen VAP-1 został zdeponowany, zaś sekwencja nukleotydowa przedstawiona na figurze 1 (Id. Sekw. nr 1), wytworzenie takich fragmentów DNA jest rutynową czynnością dla przeciętnego specjalisty. Przykładowo, w celu wytworzenia fragmentów różnorodnej długo6

PL 192 459 B1 ści można zastosować cięcie endonukleazami restrykcyjnymi, rozrywanie przez sonikację, albo syntezę oligonukleotydów.

W wynalazku ujawniono oczyszczoną cząsteczkę kwasu nukleinowego obejmują c ą polinukleotyd, który hybrydyzuje w surowych warunkach hybrydyzacji z częścią polinukleotydu w cząsteczce kwasu nukleinowego ujawnionej w wynalazku, opisanej wyżej, przykładowo z klonem cDNA VAP-1 zdeponowanym pod numerem dostępu DSM 11536. Przez określenie „surowe warunki hybrydyzacji” rozumie się całonocną inkubację w 42°C w roztworze zawierającym: 50% formamid, 5X SSC (150 mM NaCl, 15 mM cytrynian trisodu), 50 mM fosforan sodu (pH 7,6), 5X roztwór Denhardta, 10% siarczan dekstranu i 20 g/ml denaturowanego, fragmentowanego DNA spermy łososia, a następnie płukanie filtrów w 0,1X SSC w około 65°C. Przez określenie polinukleotyd, który hybrydyzuje z „częścią” polinukleotydu rozumie się polinukleotyd (DNA albo RNA) hybrydyzujący z przynajmniej około 15 nukleotydami (nt), zaś korzystniej z przynajmniej około 20 nt, jeszcze korzystniej przynajmniej około 30 nt, zaś jeszcze korzystniej około 30-70 nt polinukleotydu odniesienia. Są one przydatne jako sondy diagnostyczne i startery. Oczywiście, polinukleotydy hybrydyzujące z większą częścią polinukleotydu odniesienia (np. zdeponowanego klonu cDNA), przykładowo, częścią długości 50-750 nt, albo nawet z całą długością polinukleotydu odniesienia, są również przydatne jako sondy, podobnie jak polinukleotydy odpowiadające większości, jeżeli nie całości sekwencji nukleotydowej VAP-1 zdeponowanego cDNA albo sekwencji nukleotydowej jak przedstawiona na figurze 1 (Id. Sekw. nr 1). Takie części są przydatne diagnostycznie, jako sonda w konwencjonalnych technikach hybrydyzacji DNA albo jako startery do amplifikacji sekwencji docelowej w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), jak to opisano, przykładowo w Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) załączone tu jako odnośnik.

Oczyszczone cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują cząsteczki DNA obejmujące otwartą ramkę odczytu (ORF) z początkowym kodonem w pozycji 80-82 sekwencji nukleotydowej VAP-1 przedstawionej na figurze 1 (Id. Sekw. nr 1) i cząsteczki DNA, które obejmują sekwencję zasadniczo różniącą się od opisanych wyżej, ale które, z powodu degeneracji kodu genetycznego, wciąż kodują białko VAP-1. Oczywiście, kod genetyczny jest dobrze znany w stanie techniki. Tak więc, dla przeciętnego specjalisty jest rutynowym postępowaniem wytworzenie zdegenerowanych odmian.

W wynalazku ujawniono ponadto odmiany czą steczek kwasu nukleinowego, które koduj ą czę ści, analogi albo pochodne białka VAP-1. Odmiany mogą występować naturalnie, jak np. naturalne odmiany alleliczne albo odmienne produkty składania transkryptu. Przez określenie „odmiana alleliczna” rozumie się jedną spośród kilku alternatywnych postaci genu zajmującego dany locus na chromosomie organizmu. Genes II, Lewin (wyd.) John Willey & Sons, Nowy York (1985). Odmiany nie występujące naturalnie można wytworzyć znanymi technikami mutagenezy.

Odmiany takie obejmują odmiany wytworzone przez substytucje, delecje albo addycje nukleotydów. Substytucje, delecje lub addycje mogą obejmować jeden lub więcej nukleotydów. Odmiany mogą się zmieniać w regionie kodującym, regionie nie kodującym albo w obu. Zmienność w regionach kodujących może dać konserwatywne albo nie-konserwatywne substytucje, delecje albo addycje aminokwasowe. Szczególnie korzystne są nieme substytucje, addycje albo delecje, które nie zmieniają właściwości i aktywności białka VAP-1 albo jego części. Szczególnie korzystne pod tym względem są substytucje konserwatywne.

Oczyszczone cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują także polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej w przynajmniej 90%, zaś korzystnie w przynajmniej 95%, 96%, 97%, 98% albo 99% identyczne z (a) cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową na figurze 1 (Id. Sekw. nr 2); (b) cząsteczką kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję kodującą VAP-1 o sekwencji nukleotydowej na figurze 1 (Id. Sekw. nr 1); (c) cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd VAP-1 obejmujący sekwencję aminokwasową kodowaną przez klon cDNA VAP-1 zawarty w depozycie o numerze dostępu DSM 11536; (d) cząsteczką kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję kodującą sekwencji nukleotydowej VAP-1 zawartej w depozycie o numerze dostępu DSM 11536; (e) cząsteczką kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydową komplementarną do sekwencji nukleotydowych VAP-1 według (a), (b), (c) albo (d); (f) cząsteczką kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydową, która różni się od sekwencji kodującej cząsteczki kwasu nukleinowego według (b) albo (d), z powodu degeneracji kodu genetycznego; i (g) cząsteczką kwasu nukleinowego obejmującej sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje z cząsteczką według (e) i koduje VAP-1, o sekwencji aminokwasowej, która wykazuje przynajmniej 90% identyczność z sekwencją VAP-1 na figurze 1 (Id. Sekw. nr 2). Nieistotne jest czy kodują one polipeptyd o aktywnoPL 192 459 B1 ści VAP-1. Jest tak ponieważ gdy konkretna cząsteczka kwasu nukleinowego nie koduje polipeptydu o aktywności VAP-1, specjalista w dziedzinie mimo to wie jak zastosować cząsteczkę kwasu nukleinowego, przykładowo, jako sondę hybrydyzacyjną albo starter do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Jednakże, korzystne są cząsteczki kwasu nukleinowego w przynajmniej 90%, 95%, 96%, 97%, 98% albo 99% identyczne z sekwencją kwasu nukleinowego VAP-1 przedstawioną na figurze 1 (Id. Sekw. nr 1) albo sekwencją kwasu nukleinowego VAP-1 zdeponowanego cDNA, który w rzeczywistości koduje polipeptyd o aktywności VAP-1.

Przez określenie „polinukleotyd o sekwencji w przynajmniej 90% „identycznej” z sekwencją nukleotydową odniesienia, kodującą polipeptyd VAP-1” rozumie się, że sekwencja nukleotydowa polinukleotydu jest identyczna z sekwencją odniesienia, z wyjątkiem tego, że sekwencja polinukleotydowa może obejmować do dziesięciu mutacji punktowych na 100 nukleotydów sekwencji nukleotydowej odniesienia, kodującej polipeptyd VAP-1. Czy konkretna cząsteczka kwasu nukleinowego jest w 90%, 95%, 96%, 97%, 98% albo 99% identyczna z, przykładowo, sekwencją nukleotydową VAP-1 przedstawioną na figurze 1 (Id. Sekw. Nr 1) lub sekwencji nukleotydowej zdeponowanego cDNA, można określić konwencjonalnie stosując znane programy komputerowe takie jak Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, wersja 8 dla UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711).

Wektory i komórki gospodarza

W wynalazku ujawniono również wektory, które obejmują oczyszczone cząsteczki DNA, komórki gospodarza, które są genetycznie zmienione przy użyciu DNA kodującego VAP-1 oraz sposoby wytwarzania polipeptydów VAP-1 albo ich fragmentów technikami rekombinacji.

Polinukleotydy można połączyć z wektorem zawierającym znacznik umożliwiający selekcję w celu namnoż enia w gospodarzu. Ogólnie, wektor plazmidowy wprowadza się jako precypitat, taki jak precypitat fosforanem wapnia, albo w kompleksie z naładowanym lipidem. Jeżeli wektorem jest wirus, można go spakować in vitro, stosując odpowiednią komórkową linię pakującą, a następnie transdukować do komórek gospodarza. Znaczniki umożliwiające selekcję obejmują reduktazę dihydrofolianu albo oporność na neomycynę dla komórek eukariotycznych i geny oporności na tetracyklinę albo ampicylinę w celu hodowania w E. coli i innych bakteriach.

Korzystne są wektory zawierające regiony kontrolujące działające cis na interesujący polinukleotyd. Odpowiednie czynniki działające trans mogą być dostarczone przez gospodarza, wektor uzupełniający albo dostarczone przez sam wektor po wprowadzeniu do organizmu gospodarza. W konkretnych korzystnych wykonaniach, wektory zapewniają swoistą ekspresję, która może być indukowana i/lub swoista dla typu komórki. Szczególnie korzystne wśród wektorów są takie, które są indukowane przez czynniki środowiskowe, które są łatwe w manipulacji, takie jak temperatura i dodatek substancji odżywczych.

Wektory ekspresyjne przydatne w wynalazku obejmują wektory chromosomalne, episomalne i pochodzące z wirusów, np. wektory pochodzące z plazmidów bakteryjnych, bakteriofagów, episomów drożdży, elementów chromosomów drożdżowych, wirusów takich jak bakulowirusy, wirusy papova, wirusy krowianki, adenowirusy, wirusy ospy kurzej, wirusy rzekomej wścieklizny świń i retrowirusy, oraz wektory pochodzące z ich kombinacji, takie jak kosmidy i fagemidy.

Wstawka DNA powinna być połączona funkcjonalnie z odpowiednim promotorem, takim jak promotor faga lambda PL, promotory E. coli lac, trp i tac, promotor wczesny i późny SV40 i promotory wirusowe LTR. Inne przydatne promotory są znane specjalistom. Konstrukty ekspresyjne dalej zawierają miejsca początku transkrypcji, terminacji i w regionie ulegającym transkrypcji, miejsce wiązania rybosomu w celu translacji. Część kodująca dojrzałych transkryptów wyrażanych przez konstrukty powinna korzystnie obejmować początek translacji na początku i kodon terminacyjny (UAA, UGA albo UAG) w odpowiednim położeniu na końcu sekwencji kodującej.

Taka technologia rekombinowanego DNA obejmuje również sposoby rekombinacji opisane w Treco i in., WO 94/12650 i Treco i in., WO 95/31560, załączone tu jako odnośnik, które można zastosować w celu zmiany ekspresji VAP-1 albo aktywności oksydazy aminowej w komórkach. Konkretnie, regiony regulatorowe (przykładowo, promotory) można wprowadzić do genomu gospodarza w celu zmienienia ekspresji endogennego VAP-1.

Wytwarzanie rekombinowanych komórek gospodarza, w których ekspresja białka adhezji naczyniowej - 1 (VAP-1) jest zmieniona, obejmuje: (a) wprowadzenie do komórki gospodarza konstruktu DNA obejmującego: (i) sekwencję docelową VAP-1; i (ii) sekwencję regulatorową połączoną z se8

PL 192 459 B1 kwencją docelową VAP-1; i (b) utrzymywaniem komórki gospodarza w warunkach odpowiednich do rekombinacji homologicznej pomiędzy konstruktem DNA i endogenną sekwencją VAP-1.

Sposób zmieniania ekspresji genu VAP-1, przykładowo polega na aktywowaniu aekspresji VAP-1 w komórce, która normalnie nie wyraża go, albo normalnie nie wyraża go pod wpływem warunków otoczenia albo hormonalnych. Zmienianie ekspresji VAP-1 może również obejmować zastosowanie sekwencji do inaktywacji ekspresji natywnego genu. Rekombinację homologiczną albo kierowanie stosuje się w celu zastąpienia albo wyłączenia regionu regulatorowego, normalnie związanego z endogennym genem VAP-1, z sekwencją regulatorową, która powoduje ekspresję genu na poziomach wyższych niż występująca w odpowiedniej komórce nietransfekowanej, albo powoduje, że gen wykazuje wzorzec regulacji albo indukcji, który jest inny niż występujący w komórce nietransfekowanej. Stąd, sposób wytwarzania białek polega na aktywowaniu endogennego genu, który koduje pożądany produkt w komórce.

Jeżeli konstrukt DNA ma być nakierowany, musi obejmować przynajmniej sekwencję kierującą, zaś korzystnie również sekwencję regulatorową. Jak to opisano w Treco i in., WO 94/12650 i Treco i in., WO 95/31560, często występują składniki dodatkowe konstruktu, takie jak znaczniki umożliwiające selekcję, znaczniki do amplifikacji albo egzon i niesparowane miejsce donorowe składania transkryptu. DNA w takim konstrukcie można określić jako egzogenny DNA, który jest wprowadzony do komórki gospodarza sposobem według wynalazku. Egzogenny DNA może posiadać sekwencje identyczne, albo różniące się od endogennego DNA występującego w komórce przed transfekcją.

Sekwencja kierująca albo sekwencja konstruktu DNA jest sekwencją, która umożliwia uprawnioną rekombinację homologiczną w genomie wybranej komórki zawierającej gen VAP-1 w locus VAP-1. Sekwencjami kierującymi są, przykładowo, sekwencje DNA, które są homologiczne z sekwencjami DNA VAP-1 normalnie występującymi w genomie komórek i położone zasadniczo, na obu końcach sekwencji regulatorowej. Sekwencje kierujące wybrane są w odniesieniu do miejsca VAP-1, do którego ma być wprowadzony konstrukt DNA.

Sekwencja regulatorowa konstruktu DNA może obejmować jeden albo więcej promotorów, wzmacniaczy, regiony przyłączające się do szkieletu albo miejsca przyłączania się do macierzy, negatywne elementy regulatorowe, miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych albo ich kombinacje.

Miejsce wprowadzenia sekwencji DNA zwykle będą się znajdować w miejscu albo powyżej endogennego genu VAP-1, albo w miejscu które zakłóca działanie VAP-1. Sekwencje DNA, które zmieniają ekspresję endogennego genu VAP-1 można wprowadzać do komórki gospodarzy jako pojedynczy konstrukt DNA albo jako osobne sekwencje DNA, które łączą się fizycznie w genomie transfekowanej komórki. Dalej, DNA można wprowadzać jako liniowy, dwuniciowy DNA, z albo bez jednoniciowych regionów na obu końcach, albo DNA można wprowadzać jako kołowy DNA. Po wprowadzeniu regulatorowego DNA do komórki gospodarza, komórki utrzymuje się w warunkach odpowiednich do homologicznej rekombinacji zachodzącej pomiędzy genomowym DNA oraz częścią wprowadzanego DNA. Rekombinacja homologiczna pomiędzy genomowym DNA i wprowadzanym DNA powoduje powstanie rekombinowanych homologicznie komórek gospodarza, w których sekwencje, które zmieniają ekspresję endogennego genu VAP-1 są połączone funkcjonalnie z genem VAP-1. Powstała komórki gospodarza rekombinowanego homologicznie wytworzone tym sposobem można hodować w warunkach odpowiednich do ekspresji białka VAP-1, tworzą c w ten sposób białko VAP-1 in vitro albo komórki można zastosować do dostarczania białka VAP-1 in vivo (tj. terapia genowa).

Zjawisko kierowania może być prostym wprowadzeniem sekwencji regulatorowej, umieszczenie endogennego genu VAP-1 pod kontrolą nowych sekwencji regulatorowych, (np. wprowadzenie promotora albo wzmacniacze, albo obu, powyżej endogennego genu). Zjawisko kierowania może być prostą delecją elementu regulatorowego, taką jak delecja swoistego dla tkanki elementu negatywnego elementu regulatorowego. Zjawisko kierowania może zastąpić istniejący element; przykładowo, wzmacniacz tkankowo-swoisty można zastąpić wzmacniaczem, który ma szerszą albo inną komórkową swoistość niż elementy występujące naturalnie, albo wykazuje wzorzec regulacji albo indukcji, który jest różny od odpowiednich komórek nietransfekowanych.

Kierowanie do genu można zastosować w celu zastąpienia istniejącego regionu regulatorowego VAP-1 sekwencją regulatorową wyizolowaną z innego genu albo nową sekwencją regulatorową syntetyzowaną metodami inżynierii genetycznej. Według tego sposobu, wprowadzenie egzogennego DNA powoduje rozprzężenie sekwencji endogennych, które kontrolują ekspresję endogennego genu VAP-1, przez zastąpienie całości albo części endogennej (genomowej) sekwencji albo w inny sposób zniszczenie funkcji sekwencji endogennej.

PL 192 459 B1

Konstrukty DNA, które obejmują egzogenny DNA i ewentualnie, DNA kodujący znacznik umożliwiający selekcję, wraz z dodatkowymi sekwencjami koniecznymi do ekspresji egzogennego DNA w komórce gospodarza, stosuje się do transfekowania komórek, w których należy zmienić wytwarzanie VAP-1. Dalsze szczegóły metod rekombinacji homologicznej w celu zmienienia ekspresji genu endogennego dostarczono w Treco i in., WO 94/12650 i Treco i in., WO 95/31560, załączone tu jako odnośnik.

DNA i konstrukty rekombinowane można wprowadzać do komórek różnymi sposobami, w tym przez transformację, transfekcję, elektroporację, mikroiniekcję, transdukcję, precypitację fosforanem wapnia i transfekcję za pośrednictwem liposomów, polibrenu albo dekstranu DEAE. Sposoby takie są opisane w wielu standardowych podręcznikach laboratoryjnych, takich jak Davies i in., Basic Methods in Molecular Biology (1986). Alternatywnie, w celu wprowadzenia konstruktu DNA można zastosować wektory zakaźne, takie jak wektory retrowirusowe, herpes, adenowirusowe, towarzyszące adenowirusom, świnki albo polio.

Reprezentatywne przykłady odpowiednich gospodarzy obejmują, choć nie są ograniczone do komórek bakteryjnych, takich jak E. coli. Streptomyces i Salmonella typhimurium, komórek grzybów, takich jak drożdże, komórek owadów, takich jak Drosophila S2 i Spodoptera Sf9, komórek zwierzęcych takich jak Ax i CRL 1998 (obie komórki śródbłonka), CHO, COS i komórek czerniaka Bowes'a oraz komórek roślinnych. Odpowiednie pożywki hodowlane i warunki dla powyższych komórek są znane w dziedzinie.

Odpowiednie wektory prokariotyczne i eukariotyczne są oczywiste dla specjalisty.

Wśród znanych promotorów bakteryjnych, wektory przydatne do zastosowania obejmują promotory E. coli lacI i lacZ, promotory T3 i T7, promotor gtp, promotory lambda PR i PL oraz promotor trp. Odpowiednie promotory eukariotyczne obejmują promotor bezpośrednio-wczesny CMV, promotor kinazy tymidynowej HSV, wczesny i późny promotor SV40, promotory retrowirusowych LTR, takie jak promotory wirusa mięsaka Rousa (RSV) i promotory metalotioneiny, takie jak promotor mysiej metalotioneiny I.

Transkrypcja DNA kodującego polipeptydy VAP-1 w wyższych eukariontach może być zwiększona przez wprowadzenie sekwencji wzmacniacza do wektora. Wzmacniacze są elementami DNA działającymi cis, zwykle od 10 do 300 bp, które działają bezpośrednio zwiększając aktywność transkrypcyjną promotora w danym rodzaju komórki gospodarza. Przykłady wzmacniaczy obejmują wzmacniacz SV40, który jest położony na późnym końcu początku replikacji pomiędzy 100 i 270 bp, wczesny promotor/wzmacniacz wirusa cytomegalii, wzmacniacz polioma na późnym końcu początku replikacji i wzmacniacze adenowirusowe.

Polipeptyd VAP-1 może być wyrażany w zmodyfikowanej postaci, takiej jak białko fuzyjne, oraz może obejmować nie tylko sygnały wydzielnicze, ale również dodatkowe funkcjonalne regiony heterologiczne. Przykładowo, region dodatkowych aminokwasów, w szczególności naładowanych aminokwasów, można dodać do końca N polipeptydu VAP-1 w celu poprawy stabilności i trwałości w komórce gospodarza, podczas oczyszczania albo podczas późniejszego posługiwania się i przechowywania. Również, do polipeptydu VAP-1 można dodać reszty peptydowe w celu ułatwienia oczyszczania. Regiony takie można usuwać przed końcowym oczyszczaniem polipeptydu. Dodanie reszt peptydowych do polipeptydu w celu ułatwienia wydzielenia albo wydalenia, w celu poprawy stabilności, między innymi, oraz w celu ułatwienia oczyszczania, jest znane i rutynowo stosowane w dziedzinie.

Białko VAP-1 można odzyskiwać i oczyszczać z hodowli komórek rekombinowanych dobrze znanymi sposobami, w tym przez precypitację siarczanem amonu albo etanolem, ekstrakcję kwasem, chromatografię aniono- albo kationowymienną, chromatografię na fosfocelulozie, chromatografię oddziaływań hydrofobowych, chromatografię powinowactwa, chromatografię na hydroksyapatycie i chromatografię lektynową. Polipeptydy obejmują produkty oczyszczone ze środowiska naturalnego, produkty syntezy chemicznej, albo produkty wytworzone technikami rekombinacyjnym i z komórek gospodarzy prokariotycznych albo eukariotycznych, w tym, przykładowo, komórek bakteryjnych, drożdży, wyższych roślin, owadów i ssaków. Zależnie od gospodarza zastosowanego w procedurze wytwarzania rekombinacyjnego, polipeptydy mogą być glikozylowane albo nieglikolizowane.

Polipeptyd i fragmenty VAP-1

Określona sekwencja nukleotydowa cDNA VAP-1 na figurze 1 (Id. Sekw. nr 1) zawiera otwartą ramkę odczytu kodującą białko o 763 aminokwasach z figury 1 (Id. Sekw. nr 2), z kodonem początkowym w pozycji 80-82 sekwencji nukleotydowej na figurze 1 (Id. Sekw. nr 1) o ciężarze cząsteczkowym 84,6 kDa. Białko ma 6 potencjalnych miejsc N-glikozylacji i 3 domniemane miejsca O-glikozylacji

PL 192 459 B1 (co określono za pomocą serwera e-mailowego przewidującego miejsca O-glikozylacji ,NetOglyc@cbs.dtu.sk (Hansen i in., Biochem. J. 308:801-813 (1995)) na monomer (fig. 1).

Określenia „peptyd” albo „oligopeptyd” uważane są za synonimy (jak się powszechnie uważa) i mogą być uż ywane zamiennie, gdy kontekst wskazuje na łańcuch zawierający przynajmniej 2 aminokwasy połączone wiązaniem peptydowym.

W tej dziedzinie wiedzy uznaje się , ż e niektóre sekwencje aminokwasowe polipeptydu VAP-1 można zmieniać bez istotnego wpływu na budowę albo funkcję białka. Tak więc istnieją odmiany polipeptydu VAP-1, które wykazują zasadniczą aktywność polipeptydu VAP-1. Mutanty takie obejmują delecje, insercje, inwersje, powtórzenia i zastąpienia podobnych reszt. Niewielkie zmiany albo „neutralne” zastąpienia aminokwasowe zwykle mają niewielki wpływ na aktywność. Wskazówki dotyczące tego, jakie zmiany aminokwasowe prawdopodobnie będą fenotypowo nieme (tj. prawdopodobnie nie będą wywierać szkodliwego wpływu na funkcję) można znaleźć w Bowie, J.U. i in., Science 247:13061310 (1990). Korzystne są zmiany niewielkiego stopnia, takie jak konserwatywne zastąpienia aminokwasowe, które nie wpływają istotnie na fałdowanie albo aktywność białka VAP-1.

Aminokwasy w białku VAP-1 stosowanym w sposobach według wynalazku, które są istotne dla funkcji, można zidentyfikować sposobami znanymi w dziedzinie, takimi jak kierowana mutageneza albo analiza delecyjna. Powstałe zmutowane cząsteczki bada się na aktywność biologiczną, taką jak aktywność oksydazy aminowej albo funkcje adhezyjne.

Polipeptydy korzystnie są dostarczone w postaci zasadniczo oczyszczonej. Rekombinacyjnie wytworzona wersja polipeptydu VAP-1 może być zasadniczo oczyszczona, przykładowo, jednoetapową metodą opisaną przez Smith i Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

Polipeptydy te obejmują polipeptydy, które są w przynajmniej 90% podobne, korzystnie w przynajmniej 95%, zaś jeszcze korzystniej przynajmniej w 96%, 97%, 98% albo 99% podobne do opisanych wyżej. Dalsze polipeptydy obejmują polipeptydy w przynajmniej 90% identyczne, korzystniej w przynajmniej 95% identyczne, za ś jeszcze korzystniej w przynajmniej 96%, 97%, 98% albo 99% identyczne z polipeptydem VAP-1 kodowanym przez zdeponowany cDNA albo polipeptyd VAP-1 na figurze 1 (Id. Sekw. nr 2) oraz również obejmują części takich polipeptydów o przynajmniej 30 aminokwasach, zaś korzystniej przynajmniej 50 aminokwasach.

Przez określenie „polipeptyd o sekwencji aminokwasowej przynajmniej w 90% „identycznej” z sekwencją aminokwasową odniesienia polipeptydu VAP-1”, rozumie się polipeptyd o sekwencji aminokwasowej identycznej z sekwencją odniesienia, z takim wyjątkiem, że sekwencja polipeptydowa może obejmować do 10 zmian aminokwasowych na 100 aminokwasów polipeptydu VAP-1.

Polipeptydy te można również zastosować do wywołania przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych, które są przydatne w testach wykrywających ekspresję białka VAP-1 albo jako agoniści i antagoniści zdolni do nasilania albo hamowania funkcji białka VAP-1. Szczegóły dotyczące przeciwciał monoklonalnych wywołanych przeciwko VAP-1 są opisane w Salmi, M. i Jalkanen, S., Science 257:1407-1409 (1992); Patent USA nr 5,512,442 i 5,580,780 oraz zgłoszenie patentowe USA nr 08/447,799, załączone tu jako odnośniki. Dalej, takie polipeptydy można zastosować w dwuhybrydowym układzie drożdżowym (Fields i Song, Nature 340:245-246 (1989)) do „wychwytu” białek wiążących białko VAP-1, które są również potencjalnymi agonistami albo antagonistami.

W znaczeniu tu zastosowanym, okreś lenie „przeciwciało” (Ab) albo „przeciwciało monoklonalne” (mAb) ma oznaczać kompletne cząsteczki, jak również fragmenty przeciwciał (takie jak, przykładowo, fragmenty Fab i F(ab')2), które są zdolne do swoistego wiązania białka VAP-1. Fragmenty Fab i F(ab')2 pozbawione fragmentu Fc kompletnego przeciwciała są łatwiej usuwane z krążenia i mogą wykazywać mniej swoiste tkankowe wiązanie niż kompletne przeciwciało (Wahl i in., J. Nucl. Med., 24:316-325 (1983)). Tak więc, fragmenty te są korzystne.

Przeciwciała można wytworzyć dowolną spośród licznych metod. Przykładowo, komórki wyrażające białko VAP-1 albo jego antygenowy fragment można podawać zwierzęciu w celu wywołania wytwarzania surowicy zawierającej przeciwciała poliklonalne. W korzystnym sposobie, preparat białka VAP-1 izoluje się i oczyszcza w celu całkowitego uwolnienia od naturalnych zanieczyszczeń. Taki preparat wprowadza się do organizmu zwierzęcia w celu wytworzenia poliklonalnych surowic odpornościowych o większej swoistej aktywności.

W najkorzystniejszym sposobie, przeciwciał ami są przeciwciał a monoklonalne (albo ich fragmenty wiążące białko VAP-1). Takie przeciwciała monoklonalne można wytworzyć techniką hybrydoma (Kohler i in., Nature 256:495 (1975); Kohler i in., Eur. J. Immunol., 6:511 (1976); Kohler i in., Eur.

PL 192 459 B1

J. Immunol.,6:292 (1976); Hammerling i in., w: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., (1981): 563-681).

Także Fab, F(ab')2 i inne fragmenty tych przeciwciał można zastosować zgodnie z ujawnionymi tu sposobami. Takie fragmenty są zwykle wytwarzane przez cięcie proteolityczne przy użyciu enzymów takich jak papaina (w celu wytworzenia fragmentów Fab) albo pepsyna (w celu wytworzenia fragmentów F(ab')2). Alternatywnie, fragmenty wiążące białko VAP-1 można wytworzyć przez zastosowanie technologii rekombinowanego DNA albo syntezą chemiczną.

„Humanizowane” przeciwciała chimeryczne można wytworzyć stosując konstrukty genetyczne pochodzące z komórek hybrydoma wytwarzających opisane wyżej przeciwciała monoklonalne. Sposoby wytwarzania przeciwciał chimerycznych są znane (patrz, np. Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi i in., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly i in., patent USA nr 4,816,567; Taniguchi i in., EP 171496.

Zastosowania VAP-1

VAP-1 stosowany w sposobach według wynalazku wykazuje zasadniczą identyczność z rodziną enzymów określanych jako zawierające miedź oksydazy aminowe (klasyfikacja Enzyme Commission, EC 1.4.3.6). Białko VAP-1 pokazane na figurze 1 (Id. Sekw. nr 2) jest w około 24% identyczne z Cumonoaminooksydazą E. coli i w około 41-81% identyczne z członkami tej rodziny u ssaków. Najwyższą identyczność stwierdzono z bydlęcą surowiczą oksydazą aminową (81%). Stosując benzyloaminę, substrat oksydazy monoaminowej (MAO), wykryto istotną aktywność enzymatyczną w komórkach CHO wyrażających VAP-1, ale nie w komórkach pozornie transfekowanych. W obecności inhibitorów oksydaz monoaminowych zawierających miedź, semikarbazydu i hydroksyloaminy, VAP-1 nie wykazuje aktywności wobec benzyloaminy.

Tak więc peptydy te kodowane przez DNA można zastosować do enzymatycznego utleniania aminy, przez poddanie jej reakcji z polipeptydem VAP-1 o aktywności oksydazy aminowej. Aminą mogą być, przykładowo, pewne endogenne albo ksenobiotyczne aminy aromatyczne. Aminą mogą być również przykładowo, niektóre endogenne albo ksenobiotyczne aminy alifatyczne, takie jak metylamina. Aminą, korzystnie jest benzyloamina.

Warunki testu oksydazy aminowej z benzyloaminą jako substratem opisane są szczegółowo w sekcji Materiały i Metody, niż ej. W objętości końcowej 0,2-5 ml, korzystnie w objętości 0,5 ml, dodaje się bufor fosforanu sodu w stężeniu końcowym 0,05-0,2 mM, korzystnie 0,1 mM. Nieznakowaną benzyloaminę dodaje się w stężeniu 1-100 nmoli, korzystnie 80 nmoli, oraz ¹⁴C-benzyloaminę tak, że aktywność wynosi 0,1-1,0 uCi, korzystnie 0,4 uCi. Dodaje się 0,05-0,5 ml próbki lizatu komórkowego, korzystnie 0,1 ml. Po inkubacji przez godzinę w 37°C, aldehyd, produkt reakcji oksydazy aminowej, ekstrahuje się toluenem zawierającym 0,1-0,5 g/l, korzystnie 0,35 g/l difenylooksazolu. Dodatkową ekstrakcję można przeprowadzić przy użyciu mieszaniny toluenu/difenylooksazolu. Pierwszą ekstrakcję (i drugą ekstrakcję) bada się w liczniku scyntylacyjnym pod kątem ¹⁴C.

Wynalazek dalej dotyczy sposobu zahamowania aktywności oksydazy aminowej VAP-1 przez dostarczenie skutecznej ilości inhibitoraoksydazy aminowej. Inhibitorem może być, przykładowo, semikarbazyd, hydroksyloamina, propargiloamina, izoniazyd, nialamid, hydralazyna, prokarbazyna, monometylohydrazyna, 3,5-etoksy-4-aminometylopirydyna albo MDL72145 ((E)-2-(3,4-dimetylofenylo)-3-fluoroallilamina), korzystnie semikarbazyd albo hydroksyloamina. Semikarbazyd można dostarczyć w stężeniu 10-1000 μM albo w dowolnym zakresie, takim jak 50-1000 albo 80-500 μM, korzystnie w stężeniu 100 μM. Hydroksyloaminę można dostarczyć w stężeniu 0,1-100 μM albo w dowolnym, takim jak 1-10 albo 2-8 μM, korzystnie w stężeniu 5 μM.

Zgodnie z wynalazkiem, wiązanie komórek śródbłonka z limfocytami, w którym pośredniczy białko adhezji naczyniowej - 1(VAP-1) można modyfikować przez dostarczenie inhibitora albo substancji nasilającej oksydazę aminową u gospodarza. Gospodarzem może być linia komórek ssaczych, zwierzęca albo ludzka. Wynalazek można zastosować do traktowania in vitro albo in vivo.

Poniżej przedstawiono przykłady w celu zilustrowania wynalazku, a nie ograniczenia.

P r z y k ł a d 1

Izolowanie cDNA VAP-1

Mięśnie gładkie ludzkich jelit, w których VAP-1 ulega silnej ekspresji, otrzymano z materiału usuniętego podczas zabiegów chirurgicznych i zastosowano jako źródło z którego oczyszczono białko VAP-1. Stosując kolumnę powinowactwa z mAb, oczyszczono postaci 90 i 170-180 kDa VAP-1 z lizatów detergentowych komórek mięśni gładkich w ilościach wystarczających do otrzymania wewnętrznej sekwencji peptydowej po trawieniu trypsyną i proteazą V8. Oprócz tego, część 90 kDa VAP-1 poddano bezpośrednio sekwencjonowaniu z końca N. Profil elucji peptydów z kolumny HPLC zastosowanej

PL 192 459 B1 do oczyszczania peptydów w obu postaciach VAP-1 był identyczny, podobnie jak sekwencje peptydowe odpowiednich szczytów, co wskazuje, że białko jest dimerem składającym się z dwóch podjednostek 90 kDa.

Część sekwencji peptydowej VAP-1 zastosowano do zaprojektowania częściowo degenerowanych starterów oligonukleotydowych do RT-PCR na mRNA wyizolowanym z mięśni gładkich ludzkiego jelita. Pojedynczy fragment cDNA wielkości około 700 bp amplifikowano stosując te startery i klonowano do pUC18 w celu określenia sekwencji. Sekwencja cDNA zawierała ciągłą otwartą ramkę odczytu, która kodowała białko zawierające te same sekwencje peptydów trawionych trypsyną i V8 oczyszczonego materiału VAP-1, potwierdzając, że amplifikowano prawidłowe fragmenty cDNA. W celu znalezienia dłuższych klonów cDNA, panel 10 bibliotek ludzkich cDNA analizowano przez PCR w celu zidentyfikowania bibliotek zawierających cDNA VAP-1 i bibliotek dających najsilniejszy sygnał badano przesiewowo przy użyciu fragmentu cDNA VAP-1 uzyskanego przez PCR. W ten sposób, wyizolowano wiele nakładających się klonów cDNA z bibliotek cDNA ludzkiego serca i płuc. Z tych klonów otrzymano pojedynczy cDNA wielkości 2501 bp, zawierający ciągłą, otwartą ramkę odczytu 2292 bp, rozpoczynającą się kodonem metioniny ATG, po czym klonowano go do pUC19. Po kodonie startowym następowała sekwencja peptydowa znaleziona na końcu N oczyszczonego białka VAP-1 90 kDa i cią g ł a otwarta ramka odczytu kodują ca wszystkie peptydy powstał e po trawieniu trypsyną i V8, zidentyfikowane przez sekwencjonowanie (fig. 1). W klonie występował nieulegający translacji region 5' wielkości 80 bp i nie ulegający translacji region 3' wielkości 129 bp po kodonie stop TAG. Na końcu 3' cDNA nie stwierdzono sygnału poliadenylacji, ani sekwencji poliA, co wskazuje, że natywny mRNA VAP-1 może być dłuższy niż wskazany przez wyizolowany tu klon cDNA.

Przemijająca ekspresja VAP-1 w komórkach COS-7, wywołana transfekcją wektorem ekspresyjnym zawierającym cDNA spowodowała silne powierzchniowe znakowanie populacji komórek przy użyciu mAb 1B2, przeciwko VAP-1 (fig. 2, panel FACS rząd B, kolumna 4). Komórki transfekowane kontrolnie były negatywne (fig. 2, panel FACS rząd A, kolumna 4). Tak więc, wywnioskowano, że wyizolowano cDNA kodujący immunoreaktywne białko VAP-1, które ulega ekspresji na powierzchni komórek transfekowanych cDNA VAP-1.

Białko VAP-1

Otwarta ramka odczytu zawarta w cDNA VAP-1 kodowała białko długości 763 aminokwasów, o ciężarze czą steczkowym 84,6 kDa. Przeszukiwanie dostę pnych baz danych sekwencji białkowych wykazało, że VAP-1 wykazuje zasadniczą identyczność z rodziną enzymów określanych jako zawierające miedź oksydazy aminowe (klasyfikacja Enzyme Commission, EC 1.4.3.6). Ta identyczność wahała się od około 24% identyczności z Cu-monoaminooksydazą E. coli do około 41 - 81% identyczności z członkami tej rodziny u ssaków. Najwyższą identyczność stwierdzono z bydlęcą surowiczą oksydazą aminową (81%), która wykazywała istotną konserwację na całej długości białka, z wyjątkiem krótkiego regionu na końcu N cząsteczki. Wielokrotne przyrównanie VAP-1 z czterema innymi członkami rodziny ssaczych oksydaz aminowych zawierających miedź, dla których była dostępna sekwencja, pokazano na fig. 3.

VAP-1 nie wykazuje istotnej identyczności z żadną obecnie znaną cząsteczką adhezyjną, i nie zawiera domen białkowych czasami spotykanych w takich białkach, jakkolwiek zauważono występowanie motywu RGD pomiędzy resztami 726-728. Znaczenie funkcjonalne tego powszechnie występującego motywu, jeżeli jest, w odniesieniu do wiązania integryny, jest obecnie nieznane. Białko ma 6 potencjalnych miejsc N-glikozylacji i 3 domniemane miejsca O-glikozylacji (co określono za pomocą serwera e-mail'owego przewidującego miejsca O-glikozylacji Email Server, NetOglyc@cbs.dtu.dk (Hansen i in., Biochem. J. 308:801-813 (1995)) dla monomeru (fig. 1).

Badanie sekwencji białkowej nie wykazało oczywistych obszarów o charakterystyce domen śródbłonowych, z wyjątkiem regionu 23, głównie hydrofobowych aminokwasów, na odległym końcu N (reszty 5-27) cząsteczki pokazanej na fig. 1 (Id. Sekw. nr 2). Region ten można interpretować jako możliwy do odcięcia sygnał wydzielniczy, ponieważ zawiera potencjalne miejsce cięcia w pozycji 19, jak określono metodą von Heijne, Nucl. Acids. Res., 14:4683-4690 (1986) albo jako domena śródbłonowa. Sekwencja końca N białka VAP-1 90 kDa wykazuje, że ten region hydrofobowy nie został odcięty w trakcie oczyszczania, tak więc raczej nie był normalnie odcinaną sekwencją sygnałową dla wydzielania. Oprócz tego, charakterystyka ładunku reszt flankujących region hydrofobowy sugeruje, że może to być domena śródbłonowa białek błonowych typu II (Hartmann E. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5786-5790 (1989)), zawierając domenę zewnątrzkomórkową końca C i domenę cytoplazmatyczną końca N.

PL 192 459 B1

W celu okreś lenia czy region hydrofobowy może działać jako domena ś ródbłonowa i określenia położenia VAP-1 w błonie, wytworzono konstrukt ekspresyjny cDNA VAP-1, w którym epitop FLAG, rozpoznawany przez dostępny w handlu mAb M2 umieszczono w ramce odczytu po początkowym kodonie metioniny w przewidywanym miejscu cytoplazmatycznego końca domeny śródbłonowej. Konstrukt ten, oraz konstrukt kontrolny, w którym cDNA VAP-1 umieszczony został w odwrotnym położeniu w wektorze, transfekowano do komórek COS-7 i analizowano przemijającą ekspresję epitopów FLAG i VAP-1, rozpoznawanych przez, odpowiednio, mAb M2 i 1B2, w badaniu FACS permeabilizowanych i nie permeabilizowanych komórek (fig. 2). Znakowanie mAb FLAG obserwowano wyłącznie w komórkach permeabilizowanych (fig. 2, rzą d F, kolumna 5) podczas gdy znakowanie VAP-1 obserwowano zarówno w populacji komórek permeabilizowanych, jak i nie permeabilizowanych (fig. 2, rząd C i F, kolumna 4). Komórki transfekowane kontrolnie były negatywne pod wzglę dem obu przeciwciał FLAG i VAP-1 (fig. 2, rząd A i D, kolumny 4 i 5). Sugeruje to, że N-końcowy epitop FLAG położony jest po stronie cytoplazmatycznej błony komórkowej, region hydrofobowy obejmuje dwuwarstwę lipidową, oraz, że jest domena zewnątrzkomórkowa końca C, rozpoznawana przez blokujące adhezję mAb 1B2. Wszystkie domniemane miejsca glikozylacji położone są w części zewnątrzkomórkowej cząsteczki.

W celu określenia wielkości i stanu glikozylacji rekombinowanego VAP-1, przejściowo wyraż onego w komórkach COS-7, ekstrakty komórkowe komórek transfekowanych VAP-1 i pozornie transfekowanych, rozdzielono przez SDS-PAGE i przeniesiono na membrany, z i bez uprzedniego trawienia sialidazą (fig. 4), a następnie wykrywano mAb 1B2. Zwiększenie rzeczywistego ciężaru cząsteczkowego VAP-1 ze 170-180 kDa do około 180-190 kDa po traktowaniu sialidazą wskazuje, że rekombinowane VAP-1, podobnie jak natywne VAP-1 jest sialoglikoproteiną, zaś zmniejszenie w sieci ładunku ujemnego z powodu usunięcia ujemnie naładowanych reszt kwasu sialowego powoduje zmniejszenie ruchliwości VAP-1 w SDS-PAGE. Podobny efekt po traktowaniu sialidazą obserwowano w przypadku migdałkowego VAP-1 (Salmi M. i Jalkanen, S. J. Exp. Med., 183:569-579 (1996)).

Ekspresja VAP-1

Analiza metodą Northern blot na mRNA wyizolowanym z mięśni gładkich ludzkiego jelita i zrębu migdałków pozbawionego limfocytów wykazała, że klonowany cDNA VAP-1 hybrydyzuje z mRNA wielkości 4,2 kb w obu tkankach (fig. 5A). Dalsza analiza Northern wykazała, że mRNA VAP-1 4,2 kb ulega ekspresji w wielu ludzkich tkankach. Sygnał nie był wykrywalny w leukocytach krwi obwodowej, ani w mózgu, ale był silny w płucach, jelicie cienkim i wyrostku robaczkowym, w porównaniu z innymi tkankami. Jedynie niewielkie ilości mRNA VAP-1 wykryto w śledzionie, grasicy, jądrze, wątrobie, trzustce, nerkach, szpiku u wątrobie płodowej. Pośredni poziom ekspresji obserwowano w sterczu, jajniku, wyściółce śluzowej okrężnicy, sercu, łożysku, mięśniach szkieletowych i węzłach chłonnych (fig. 5B). Nie wykryto innych wielkości mRNA nawet po długotrwałej autoradiografii.

Materiały i metody

Ab i reagenty. Mysie mAb 1B2 przeciwko VAP-1 i 3G6 przeciwko kurzym limfocytom T, zostały opisane uprzednio przez Salmi M. i Jalkanen S., Science 257:1407-1409 (1992). mAb M2, rozpoznające peptyd FLAG (DYKDDDDK) otrzymano z KEBO Lab, Espoo, Finlandia.

Oczyszczanie i sekwencjonowanie VAP-1. Normalne próbki ludzkich jelit pochodzące z zabiegu chirurgicznego uwolniono od blaszki właściwej. Ścianę mięśni gładkich pocięto na drobne kawałki i poddano przez noc lizie w buforze (150 mM NaCl, 10 mM Tris-base, pH 7,2, 1,5 mM MgCl2, 1% NP-40, 1% aprotyniny i 1 mM PMSF). Po sklarowaniu, nadsącz z lizatu wprowadzano stopniowo do kolumny powinowactwa immunologicznego zawierającej 5 ml perełek Sepharose aktywowanych CnBr, zablokowanych normalna surowicą szczurzą. Nie wiążące mAb i mAb przeciwko VAP-1 (3 mg/ml perełek). Swoistą kolumnę płukano buforem do lizy i eluowano antygeny VAP-1 50 mM trimetyloaminą. Eluat natychmiast zamrożono, a następnie liofilizowano. Następnie, próbkę rozpuszczono w nieredukującym buforze Laemmli i rozdzielono na żelu SDS-PAGE o gradiencie 5-12,5%.

Po przeniesieniu na membranę poliwinylidynodifluorkową (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA) elektrycznie, membranę barwiono błękitem Coomassie i wycięto prążki 90 kDa i 170-180 kDa. Cały prążek 170-180 kDa i część materiału 90 kDa trawiono trypsyną (czystość do sekwencjonowania, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Niemcy) jak to opisano w Fernandez i in. (Fernandez i in., Anal. Biochem., 201:255-262 (1992)). Eluowany peptyd rozdzielono przez HPLC (150 A: Applied Biosystems) na kolumnie Vydac C18 (2,1 x 150 mm). Analizę sekwencji końca N przeprowadzono na sekwenatorze białek (477A; Applied Biosystems) wyposażonym w podłączony szeregowo analizator fenylohydantoino-aminokwasów (120A; Applied Biosystems). Pozostałą część materiału 90 kDa poddano sekwencjonowaniu końca N bez uprzedniego trawienia. Po trawieniu trypsyną, błony

PL 192 459 B1 trawiono proteazą V8 (czystość do sekwencjonowania, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Niemcy), zaś eluowane peptydy oczyszczono i sekwencjonowano jak wyżej. Sekwencje niektórych z peptydów potwierdzono stosuj ą c spektormetrię mas jonizację laserem wspomagana matrycą (ang. Matrix-Assisted Laser Desorption) w celu potwierdzenia przewidywanej masy (Lasermat, Finnigan).

Techniki biologii molekularnej. Izolowanie plazmidów z E. coli na małą i wielką skalę, trawienie enzymem restrykcyjnym, hybrydyzację łysinkową, oczyszczanie fagów lambda i ekstrakcję DNA z fagów, transformacje E. coli, syntezę cDNA i konstruowanie plazmidów przeprowadzono zasadniczo technikami standardowymi (Sambrook J. i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Izolowanie fragmentów DNA z żelów agarozowych przeprowadzono stosując zestaw QIAEX (QIAGEN, Hilden, Niemcy) według instrukcji producenta. Sondy DNA wytworzono stosując zestaw do znakowania DNA Amersham Multiprime i [a-³²P]dCTP o aktywności około 3000 Ci/mMol (Amersham, Bucks, UK). Autoradiografię przeprowadzano stosując ekrany wzmacniające, jeżeli to konieczne, na filmie Amersham Hyperfilm MP.

Fragmenty PCR klonowano „na tępe końce” do pUC18, stosując zestaw SureClone (Pharmacia, Uppsala, Szwecja). Plazmidowy DNA sekwencjonowano stosując zestaw Sequenase version 2,0 (United States Biochemical Corporation, Cleveland, USA) według instrukcji producenta albo w ośrodku sekwencjonowania DNA University of Turku, Department of Medical Genetics. Składanie i analizę sekwencji prowadzono przy użyciu Wisconsin Package version 8.1-UNIX, Genetics Computer Group. Porównanie bazy danych przeprowadzono stosując BLAST Email albo serwer WWW National Center for Biotechnology Information (http//WWW.ncbi.nlm.nih.gov/). Startery oligonukleotydowe do sekwencjonowania i PCR zakupiono w KEBO Lab (Espoo, Finlandia). PCR przeprowadzono stosując polimerazę Dynazyme (Finnzymes, Espoo, Finland) według instrukcji producenta, zmieniając parametry amplifikacji względem cech charakterystycznych starterów PCR. Startery zastosowane do amplifikacji fragmentu cDNA VAP-1 z mRNA mięśni gładkich w PCR miały sekwencję N2: gctgtgatcacmatyttygc (Id. Sekw. nr 3), zaprojektowany na podstawie sekwencji białkowej końca N VAP-1 AVITIFA (Id. Sekw. nr 4) (reszty 13-19 kompletnego białka) i T4: ccggccctgrtagaasac (Id. Sekw. nr 5) opracowany na podstawie sekwencji peptydowej trawionej trypsyną VFYQGR (Id. Sekw. nr 6) (reszty 264-269). Warunki amplifikacji z tymi starterami obejmowały 1 min. w 94°C; 1 min. w 55°C; 2 min. w 72°C przez 30 cykli. Całkowity RNA wytworzono z linii komórkowych i tkanek stosując Ultraspec (Biotecx, Houston, USA) według instrukcji producenta. Membrany do analizy Northern blot z ludzkimi tkankami otrzymano z Clontech Laboratories (Palo Alto, USA) i hybrydyzowano z sondami znakowanymi ³²P, według instrukcji producenta. Panel ludzkich bibliotek cDNA i biblioteka cDNA płuc (nr kat. HL3004a) i serca (nr kat. HL3026a) pochodziły z Clontech Laboratories.

Hodowla komórkowa i ekspresja cDNA VAP-1 w komórkach ssaków

Komórki COS-7 (fibroblasty małpy), CHO (komórki jajnika chomika chińskiego) i CRL 1998 (ludzkie, unieśmiertelnione, komórki śródbłonka żyły pępowinowej) otrzymano z ATCC (Rockville, MD) i zastosowano jako gospodarzy do transfekowania i ekspresji VAP-1. Komórki COS-7 i CRL 1998 hodowano na RPMI 1640 (Gibco BRL) z dodatkiem 10% cielęcej surowicy płodowej (PAA-Linz, Austria), 2 mM glutaminy (Biological Industries, Izrael) i 128 U/ml penicyliny i 128 μg/ml streptomycyny. Komórki CHO hodowano na pożywce alfa-MEM, z dodatkiem nukleozydów CHO z takimi samymi dodatkami. Plazmidy ekspresyjne składające się z cDNA VAP-1 klonowano do wektora ekspresyjnego pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) zastosowano do przemijającej transfekcji komórek COS-7 i wytworzenia stabilnie transfekowanych linii komórkowych CHO. Plazmidy ekspresyjne (20 μg) zastosowano do transfekowania komórek przez elektroporację przy użyciu urządzenia Bio-Rad Gene Pulser (0,3 kV, 960 gF, kuweta 0,4 cm, RPMI z dodatkiem 1 mM pirogronianu sodu, 2 mM L-glutaminy, bez surowicy). Przemijająco transfekowane komórki badano w 3 dni po transfekcji. Stabilnie transfekowane klony selekcjonowano przez hodowanie w obecności 0,5 mg/ml genetycyny (Gibco BRL) przez 4 tygodnie.

P r z y k ł a d 2

Aktywność enzymatyczna VAP-1

Stwierdzenie, że VAP-1 wykazuje istotne podobieństwo z rodziną oksydaz aminowych zawierających miedź i w szczególności podobieństwo z wydzielaną bydlęcą surowiczą oksydazą aminową (BSAO) doprowadziła do zbadania czy VAP-1 posiada aktywność oksydazy aminowej. Oksydazy aminowe zawierające miedź wyróżniają się obecnością niezwykłego kofaktora, chinonu, miedzią związaną z enzymem i aktywnością tylko wobec pierwszorzędowych poliamin i monoamin. Tak więc, różnią się one od wewnątrzkomórkowych (mitochondrialnych) oksydaz aminowych zawierających FAD (MclnPL 192 459 B1 tire W.S. i Hartmann C., Principles and Applications of Quinoproteins, Davidson V. L., wyd., Marcel Dekker, Inc., NY., (1993)).

W celu okreś lenia, który rodzaj aktywnoś ci posiada VAP-1, wytworzono stabilne transfektanty komórek CHO wyrażające białko VAP-1. Sonikowane lizaty tych komórek badano pod względem aktywności oksydazy diaminowej (DAO), stosując jako substrat putrescynę, albo oksydazy monoaminowej (MAO), stosując jako substrat benzyloaminę. Jako kontrolę pozytywną, badano dostępne w handlu DAO i MAO, zaś kontrolę negatywna stanowiły lizaty pozornie transfekowanych CHO. Wyniki pokazują, że VAP-1 wyrażane w komórkach wykazuje pomijalną aktywność względem putrescyny, ale wykryto istotną aktywność stosując substrat MAO, benzyloaminę (tabela 1). Jednakże, stosując benzyloaminę, substrat oksydazy monoaminowej (MAO), stwierdzono istotną aktywność komórek CHO wyrażających VAP-1 oraz pozytywną kontrolę dostępnej w handlu bydlęcej surowiczej MAO (tabela 1).

Lizaty komórek CHO pozornie transfekowanych, wykazywały nieistotną aktywność enzymatyczną.

W obecności 100 μΜ semikarbazydu albo 10 μΜ hydroksyloaminy, swoistych inhibitorów oksydaz monoaminowych zawierających miedź (Lyles, Int. J. Biochem. Cell Biol., 28:254-274 (1996)), VAP-1 nie wykazywało aktywności względem benzyloaminy (tabela 1).

Oprócz tego, wykazano, że zdolne do adhezji VAP-1 wyrażone w komórkach Ax również posiada aktywność MAO wobec benzyloaminy, którą można zahamować semikarbazydem i hydroksyloaminą (tabela 1). Same komórki Ax wydają się posiadać natywną aktywność MAO wobec benzyloaminy, która nie jest możliwa do zahamowania przez semikarbazyd albo hydroksyloaminę, ponieważ wykryto niski poziom aktywności w kontrolnych komórkach transfekowanych pozornie (tabela 1).

W celu potwierdzenia, że stwierdzono aktywność MAO VAP-1 in vivo, oczyszczono przez powinowactwo immunologiczne VAP-1 z migdałków i badano materiał w potrójnym powtórzeniu. Migdałkowe VAP-1, podobnie jak VAP-1 z transfekowanych komórek CHO, wykazywało aktywność wobec benzyloaminy ze wzrostem A490 w ciągu godziny od 0,09 w 37°C w warunkach testu, co wynosiło około 4,5-krotnie więcej niż w próbce gotowanej. Nie było możliwości zmierzenia aktywności właściwej, z powodu bardzo słabego uzysku otrzymanego białka VAP-1 z migdałków.

Benzyloamina, powszechnie stosowana jako substrat do mierzenia aktywności oksydazy aminowej, nie jest spotykana in vivo. Zatem badano aminy endogenne występujące w przyrodzie w celu sprawdzenia, czy mogą być użytkowane przez VAP-1 (tabela 2). Metylamina w stężeniu 1 μM była przetwarzana przez VAP-1, Jednakże, inne badane aminy nie wykazywały aktywności. Niższą aktywność właściwą obserwowano u tych komórek z benzyloaminą, w porównaniu z lizatami komórkowymi badanymi w tabeli 1, co odzwierciedla zmienność ekspresji VAP-1 spotykaną w różnych partiach komórek.

Obecność kofaktora chinonu w VAP-1 wykazano przez rozdzielenie części materiału oczyszczonego przez powinowactwo immunologiczne VAP-1 z migdałków przez SDS-PAGE w warunkach redukujących i przeniesiono materiał na membranę nitrocelulozową. Filtr nitrocelulozowy barwiono barwnikiem błękitem nitotetrazoliowym/glicynianem sodu w cyklicznych warunkach redoks, w których swoiście barwiły się reszty chinonu w białku (Paz, M. A. i in., J. Biol. Chem., 266:689-92 (1991)). Barwnik reagował z monomerycznym 90 kDa i dimerycznym 180 kDa, VAP-1 z migdałków zawiera kofaktor w każdej podjednostce.

Materiały i metody

Testy oksydazy aminowej. Zlewne hodowle komórek CHO albo Ax (10-15x10⁶ komórek na butelkę) transfekowane stabilnie plazmidem ekspresyjnym cDNA VAP-1 zeskrobano z butelki do 10 ml 100 mM buforu fosforanowego, pH 7,2, odwirowano i płukano osad komórkowy dalszymi 10 ml buforu. Osad komórkowy zawieszono w 1,5 ml buforu fosforanowego i poddano komórki lizie na lodzie przez sonikację 2 x 10 sekund sonikatorem Braun ustawionym na średnią moc. Sonikowane lizaty zastosowano bezpośrednio w testach enzymatycznych (50-100 μl na test) albo po przechowywaniu w -20°C. Całkowitą zawartość białka zmierzono standardowym zestawem Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Aktywności oksydazy aminowej mierzono według uprzednio opisanej techniki, stosując jako substraty putrescynę znakowaną ¹⁴C (Amersham) metodą D'Agostino i in., Biochem, Pharmacol. 38:47-49 (1989), (włączone przez odniesienie) ³H-histaminę (New England Nuclear), metodą Baylin S.

B. i Margolis, S., Biochem. Biophys. Acta 397:294-306 (1975) (włączone jako odniesienie) i ¹⁴Cbenzyloaminą (Amersham) badano w sposób podobny do putrescyny z takim wyjątkiem, że używano 0,4 μΏ znacznika na reakcję, która zawierała 80 nmoli nieznakowanego substratu benzyloaminy.), 5 ml objętości reakcyjnej zawierało 100 mM buforu fosforanu sodu, pH 7,2, 0,4 μΏί ¹⁴C-benzyloaminy

PL 192 459 B1 (Amersham), 80 nmoli nieznakowanej benzyloaminy i próbkę do maksimum 100 μΐ surowego lizatu na reakcję. Po inkubacji w 37°C przez godzinę, aldehyd, produkt reakcji, ekstrahowano przez dodanie 900 gl toluenu zawierającego 0,35 g/l difenylooksazolu i gwałtowne wytrząsanie. Po rozdzieleniu się faz, 700 gl warstwy toluenu pobrano i przeprowadzono dodatkową ekstrakcję 700 μl toluenu/difenylooksazolu, z czego pobrano 500 gl, dodano do pierwszego ekstraktu i badano w liczniku scyntylacyjnym na obecność ¹⁴C. Wszystkie testy enzymatyczne przeprowadzano w obecności ślepych prób, zawierających gotowaną próbkę (10 min., 100°C) albo próbkę niewyrażającą ekspresji w podwójnym albo potrójnym powtórzeniu, zaś wyniki podano jako pmole zastosowanego substratu min^-1 mg białka^-1. Kontrole surowej DAO świńskiej nerki i bydlęcej osoczowej MAO pochodziły z Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA).

Dyskusja

Wyraźne znakowanie przy użyciu mAb 1B2, rozpoznającego VAP-1, stwierdzono w komórkach śródbłonka naczyń w kilku miejscach, szczególnie w tkankach limfatycznych typu PLN. Jednakże, ponieważ całkowity poziom VAP-1 stwierdzonego w tych miejscach był względnie niski, okazało się trudne wyizolowanie i oczyszczenie wystarczających ilości śródbłonkowego VAP-1 do zebrania informacji na temat sekwencji. Wśród innych tkanek, w których stwierdzono VAP-1, najobficiej występowało ono w naczyniach i mięśniówce gładkiej jelita (Salmi M. i in., J. Exp. Med., 178:2255-2260 (1993)). VAP-1 z tych źródeł miało minimalnie różny ciężar cząsteczkowy, prawdopodobnie z powodu różnic w glikozylacji, ale pod innymi względami przypominało białko analizowane w migdałkach i tkankach typu PLN.

Stosując informację o sekwencji z VAP-1 oczyszczonego z mięśnówki gładkiej jelit, wyizolowano cDNA kodujący cząsteczkę adhezyjną. Dowody na to opierały się na następujących przesłankach: Sekwencja białka wyizolowanego z oczyszczonego przez powinowactwo immunologiczne VAP-1 odpowiadała przewidywanej sekwencji białka kodowanego przez wyizolowany klon cDNA VAP-1. Po drugie, transfekowane komórki wyrażające cDNA VAP-1 można znakować na powierzchni mAb 1B2, które oryginalnie zastosowano do zdefiniowania VAP-1 (Salmi M. i Jalkanen S., Science 257:14071409 (1992)), zaś precypitowany immunologicznie VAP-1 z tych komórek miał podobny ciężar cząsteczkowy, 170-180 kDa, jak spotykany in vivo.

VAP-1 jest dużym, dimerycznym białkiem błonowym typu II, z regionem śródbłonowym położonym na końcu N cząsteczki. Domena wewnątrzkomórkowa jest wyjątkowo mała, o długości tylko 4 aminokwasów, pozostawiając wielką, glikozylowaną domenę zewnątrzkomórkową osiągającą około 163 kDa na dimer. Wszystkie potencjalne miejsca glikozylacji, 12 N- i 6 O- na dimer, położone są w domenie zewnątrzkomórkowej. Jakkolwiek obecnie nie wiadomo czy wszystkie miejsca glikozylacji są wykorzystywane, uprzednie dane świadczą, że VAP-1 zawiera cukry przyłączone N- jak i O-, oraz liczne reszty kwasu sialowego, które mogą reprezentować reszty końcowe N-węglowodanów, albo część cukrów O-. Ponieważ węglowodany, a zwłaszcza reszty kwasu sialowego uważane są za odgrywające istotną rolę w działaniu adhezyjnym VAP-1 (Salmi M. i Jalkanen S., J. Exp. Med., 183:569579 (1996)) konieczne będzie sprawdzenie, które miejsca glikozylacji są wykorzystywane i jaki węglowodan na nich występuje.

Ponieważ nie obserwowano różnic w wielkości mRNA VAP-1 pomiędzy różnymi tkankami w badaniu Northern, zaś wszystkie klony cDNA VAP-1 i fragmenty PCR zawierały podobną sekwencję nie istnieją dowody na istnienie postaci VAP-1 kodowanych przez odmienne mRNA. Zatem, wydaje się prawdopodobne, że wynalazcy sklonowali cDNA kodujący dominującą postać VAP-1, którą uprzednio badano immunologicznie i przez immunoprecypitację. Jednakże, ponieważ niemal wszystkie badane tkanki zawierały mięśnie gładkie, w postaci tkanki naczyniowej albo z innych źródeł, jak również śródbłonek naczyń, niemożliwe jest rozróżnienie pomiędzy mRNA VAP-1 pochodzącym z mięśni gładkich i śródbłonka, jeżeli w obu rodzajach tkanek występują podobne rodzaje mRNA. Tak więc być może istnieją inne postaci VAP-1 kodowane przez mRNA różniące się nieco od już wyizolowanych.

Co ciekawe, region N-końcowy VAP-1 z regionem śródbłonowym jest częścią cząsteczki, która najbardziej różni się od jej homologa, BSAO. Wiadomo, że BSAO jest białkiem wydzielniczym spotykanym w znacznych ilościach w surowicy i posiada sygnał wydzielniczy na końcu N, który jest usuwany przez obróbkę proteolityczną w szlaku wydzielniczym (Mu D. i in., J. Biol. Chem., 269:9926-9932 (1994)). Zatem, BSAO i VAP-1 mogą nie posiadać podobnych właściwości fizjologicznych. Wstępne dowody sugerują, że mysie VAP-1 posiada domenę śródbłonową podobną do spotykanej w ludzkim VAP-1, a więc może pełnić te same funkcje co cząsteczka ludzka. Domena zewnątrzkomórkowa VAP-1

PL 192 459 B1 posiada aktywność enzymatyczną oksydazy aminowej, a więc VAP-1 może działać jako ektoenzym. Oksydazy aminowe zawierające miedź są zróżnicowaną klasą enzymów, które różnią się swoistościami substratowymi, ale można je podzielić z grubsza na dwie klasy, takie, które wykazują działanie wobec poliamin takich jak putrescyna i histamina, oraz takie, które jak VAP-1 wykazują aktywność oksydazy monoaminowej. Substraty fizjologiczne oksydaz monoaminowych nie są znane, jakkolwiek istnieje kilka potencjalnych substancji.

Inną cechą charakterystyczną tych enzymów jest obecność niezwykłego kofaktora zawierającego resztę karbonylową, którego tożsamość chemiczna jest przedmiotem kontrowersji, ale który stwierdzono w BSAO i oksydazie aminowej grochu jako topachinon (6-hydroksy dopa) oraz w oksydazie lizylowej jako usieciowany lizynotyrozylochinon. U niektórych gatunków ssaków, w tym u ludzi, oksydazy aminowe zawierające miedź spotyka się zarówno w błonie komórkowej, jak i w postaci rozpuszczalnej w surowicy. Aktywność ta jest wrażliwa na zahamowanie przez czynniki reagujące z grupą karbonylową, takie jak semikarbazyd i hydroksyloamina (Lyles G. A., Int. J. Biochem. Cell Biol., 28:259-274 (1996)), zaś enzym odpowiedzialny jest określany jako oksydaza aminowa wrażliwa na semikarbazyd (SSAO). Wykazano, że VAP-1 zawiera kowalencyjnie związany chinon, który na podstawie badań innych oksydaz monoaminowych zawierających miedź, prawdopodobnie wytworzony jest w reakcji samoobróbki, w reakcji z udziałem miedzi związanej z enzymem. Te wyniki oraz wrażliwość aktywności enzymatycznej VAP-1 na czynniki reagujące z grupą karbonylową jak semikarbazyd i hydroksyloamina pokazują , ż e VAP-1 jest zwią zane z bł oną SSAO.

Fizjologiczna rola SSAO jest trudna do określenia, ponieważ niewiele wiadomo o ich substratach in vivo, zaś swoistości substratowe różnią się zasadniczo między gatunkami. Metabolizm endogennych i ksenobiotycznych pierwszorzędowych monoamin wydaje się potencjalnie stanowić jedną z funkcji i mo ż liwe jest, ż e jest to funkcja VAP-1 spotykanej w miejscach poza ś ródbł onkiem, jak mię śnie gładkie.

Czy aktywność SSAO VAP-1 odgrywa rolę według wynalazku właściwościach adhezyjnych obecnie nie jest jasne. Wstępne doświadczenia in vitro przeprowadzone z użyciem komórek CRL 1998 transfekowanych VAP-1 i PBL (limfocyty krwi obwodowej) w obecności semikarbazydu u hydroksyloaminy wskazują, że aktywność enzymatyczna może wywierać negatywny wpływ na adhezyjne oddziaływania międzykomórkowe, podobnie jak w obecności tych inhibitorów, liczba PBL związanych z komórkami VAP-1 zwiększa się. Nie wiadomo, czy jest to efekt pierwotny, spowodowany aktywnością enzymatyczną wywierającą ukierunkowany i swoisty wpływ na mechanizmy adhezyjne stosowane przez te komórki, czy wtórny, w których na stan fizjologiczny komórek niekorzystnie wpływa produkt aktywności oksydazy monoaminowej zmniejszając ich potencjał adhezyjny.

P r z y k ł a d 3

Test adhezji cDNA VAP-1 w pcDNA3 zastosowano do transfekowania komórek Ax, szczurzej linii śródbłonka pochodzącego z HEV, która prawdopodobnie zapewnia najbardziej naturalne otoczenie dla VAP-1 w porównaniu z innymi gospodarzami, takimi jak komórki CHO. Otrzymano stabilne transfektanty, które wyrażały na swojej powierzchni VAP-1, co określono analizą FACS (fig. 6A) i zastosowano je w testach adhezji limfocytów. Analizuj ą c w warunkach rotowania, PBL wią zały się z komórkami Ax transfekowanymi VAP-1 około 25,6-krotnie lepiej niż z komórkami pozornie transfekowanymi (fig. 6B i 6C). Zwiększone wiązanie transfektantów VAP-1 było istotnie statystycznie zahamowane, jakkolwiek nie było całkiem zniesione, przez traktowanie mAb przeciwko VAP-1 (zahamowanie 29,6% ± 10,7%, P = 0,05). Te wyniki badań adhezji zebrano z 5 niezależnych doświadczeń, w których 2-3 równolegle transfekowane monodnowarstwy analizowano za każdym razem stosując trzy niezależnie transfekowane linie komórkowe i PBL od sześciu różnych dawców. Tak więc, dane te wskazują, że cDNA VAP-1 koduje funkcjonalną cząsteczkę adhezyjną, która jest położona na powierzchni komórek transfekowanych i która, po ekspresji w komórkach Ax może pośredniczyć w wiązaniu PBL.

Materiały i metody

Komórki Ax, w których VAP-1 ulegało stabilnej ekspresji oraz komórki transfekowane pozornie wysiano na szkiełkach mikroskopowych pokrytych żelatyną, wewnątrz kółek zakreślonych woskowym ołówkiem (20000 komórek w kółku o średnicy 2 cm). Komórkom pozwolono przylgnąć i wzrosnąć do zlewności i po dwóch płukaniach, dodano do każdego kółka 100 μΐ pożywki RMPI 1640 z dodatkiem 10% FCS i 10 mM HEPES (pożywka testowa) w taki sposób aby równomiernie pokryła monowarstwę komórek. W międzyczasie, ze świeżo pobranej krwi wyizolowano PBL stosując wirowanie w Ficoll'u i zawieszono je w gęstości 40x10⁶ komórek/ml pożywki testowej. Następnie szkiełka umieszczono na

PL 192 459 B1 wytrząsarce obrotowej ustawionej na 60 obr. /min/ w 7°C i do każdego kółka dodano 5 μΐ zawiesiny PBL. Test prowadzono przez 30 minut ze stałym wytrząsaniem. Szkiełka delikatnie dekantowano i zanurzono raz w zimnej RPMI w celu usunięcia nie przylegających komórek. Komórki przylegające utrwalono przez inkubowanie pionowo szkiełek w lodowatym PBS zawierającym 1% aldehyd glutarowy, przez noc. Liczbę komórek przylegających liczono stosując siatkę okularową (powiększenie x200). Siatka pokrywała obszar 0,25 mm². Na każdym szkiełku liczono 9 określonych pól zajmujących środek pola widzenia, gdzie transfektanty tworzyły zlewną warstwę. W każdym z 5 niezależnych doświadczeń liczono pola z dwóch szkiełek na próbkę (całkowity obszar = 4,5 mm²). W niektórych doświadczeniach test adhezji przeprowadzano w obecności mAb przeciwko VAP-1 blokujących funkcję (kombinacja 1B2 i TK8-14, oba w stężeniu 50 μg/ml w pożywce testowej) albo dobranych pod względem klasy kontrolnych mAb (kombinacja 3G6 i 7C7, oba w stężeniu 50 μg/ml). mAb inkubowano z warstwą transfektantów przez 30 minut w 7°C, po czym dodawano znakowane limfocyty. W pięciu niezależnych doświadczeniach liczono liczbę komórek przylegających.

Dyskusja

Testy adhezji przeprowadzone na komórkach AX wyrażających VAP-1 wskazują, że cDNA koduje funkcjonalne VAP-1, które może podtrzymywać oddziaływanie z jego ligandem na PBL i prowadzić do stabilnego wiązania się PBL z komórkami Ax. Jednakże, nie obserwowano całkowitego zahamowania tego zwiększonego przylegania z mAb przeciwko VAP-1 1B2 i TK8-14, co wskazuje, że cząsteczka VAP-1 w komórkach Ax pochodzących od szczura nie działa dokładnie tak, jak powinna w naturalnych warunkach. Możliwe, że modyfikacje węglowodanami białek na komórkach Ax, lokalne środowisko błony albo konformacja VAP-1 jest na tyle różna od ludzkich HEV, że mAb nie mogą dłużej blokować oddziaływania VAP-1 z jego ligandem. Możliwe jest również, że na transfektantach istnieje subpopulacja cząsteczek VAP-1 w postaci pozbawionej jednego albo wielu epitopów rozpoznawanych przez mAb 1B2 i Tk8-14. Na koniec, pozostaje możliwość, że długotrwała ekspresja VAP-1 w stabilnych transformantach zmienia ekspresję innej(ych) cząsteczki(ek) adhezyjnej(ych) na powierzchni komórek Ax. Funkcja tej domniemanej cząsteczki adhezyjnej nie może być hamowana przez mAb przeciwko VAP-1. W testach wiążących HEV przez VAP-1 wykazano działanie niezależne od L-selektyn limfocytów oraz tych, które pośredniczą w wiązaniu PBL CD8+ lepiej niż PBL CD4+. Transfektanty cDNA VAP-1 Ax potwierdzają te obserwacje ponieważ analiza z oczyszczonymi immunomagnetycznie komórkami negatywnymi pod względem L-selektyny i limfocytami CD8+ i CD4+ wykazała, że L-selektyna nie jest potrzebna do skutecznego wiązania z transfektantami Ax, oraz że podtyp CD8+ PBL przylegał kilkakrotnie lepiej do transfektantów VAP-1 niż limfocyty CD4+ (dane nie pokazane).

T a b e l a 1.

Test aktywności oksydazy aminowej w komórkach CHO i Ax wyrażających VAP-1 Aktywność enzymatyczna rodzajów komórek w nmol produktu białkowego min^-1 mg^-1

Substrat	CHO VAP-1	CHO kontrola	Oksydaza diaminowa	Oksydaza monoaminowa	Ax VAP-1	Ax kontrola
putrescyna	0,87±0,17	1,45±0,13	4,87±0,10	0,29±0,00	ND	ND
benzyloamina	26,94±0,70	0,13±0,13	0,57±0,10	8,83±0,00	2,15±0,04	0,80±0,80
benzyloamina+SC	0,61±0,17	1,32±0,26	ND	ND	0,35±0,09	1,00±0,00
benzyloamina+HA	0,35±0,17	1,32±0,26	ND	ND	0,31±0,04	0,90±0,10

Każdy test przeprowadzono w trzykrotnych powtórzeniach i pokazana jest średnia swoista aktywność ± SEM; ND, nie wykonano

PL 192 459 B1

T a b e l a 2.

Aktywność substratu swoistego wobec Oksydazy Aminowej VAP-1

Aktywność enzymatyczna rodzajów komórek w nmol produktu białkowego min^-1 mg^-1
Substrat	CHO VAP-1	CHO kontrola
benzyloamina	4,57±0,29	0,18±0,62
metylamina	4,28±0,22	0,18±0,44
tyramina	0,04±0,10	0,09±0,35
tryptamina	0,07±0,04	0,35±0,62
β-fenyloetyloamina	0,10±0,03	0,26±0,00
histamina	0,05±0,03	0,20±0,00

Doświadczenie przeprowadzono dwukrotnie na różnych próbkach z porównywalnymi wynikami i pokazano wyniki reprezentatywnego doświadczenia. Każdy test przeprowadzono w trzykrotnych powtórzeniach i pokazana jest średnia swoista aktywność ± SEM; ND, nie wykonano

O ile wynalazek opisano w odniesieniu do konkretnych wykonań, należy rozumieć, że istnieje możliwość modyfikacji, zaś niniejsze zgłoszenie ma pokrywać wszystkie odmiany, zastosowania albo adaptacje wynalazku w oparciu o zasady wynalazku, i włączając je do niniejszego ujawnienia, co jest powszechną praktyką w tej dziedzinie, i co można zastosować do zasadniczych cech podanych wyżej, jak również w dołączonych zastrzeżeniach patentowych.

Ujawnienia wszystkich cytowanych odnośników, zgłoszeń patentowych i patentów są włączone w całości jako odnośniki.

PL 192 459 B1

LISTA SEKWENCJI

[1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i)ZGŁASZAJĄCY:(A) NAZWA: BioTie Therapies Ltd.

(B) ULICA: Tykietonkatu 6 (C) MIASTO: Turku (D) KRAJ: Finlandia (F) KOD POCZTOWY: FIN-20S20

I ii) TYTUŁ WYNALAZKU:

(iii) LICZBA SEKWENCJI: 2 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patent Releaee #1.0, Wersja #1.30 |vi) DANE DOTYCZĄCE WCZEŚNIEJSZEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/662,433 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 23-MAJA-1997 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 2501 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:1:

GCCAACAGAG	CCCCCGTCTT	GCTGGCGTGA	GAATACATTG	CTCTCCTTTG	GTTGAATCAG	60
CTGTCCCTCT	TCGTGGGAAA	ATGAACCAGA	AGACAATCCT	CGTGCTCCTC	ATTCTGGCCG	120
TCATCACCAT	CTTTGCCTTG	GTTTGTGTCC	TGCTGGTGGG	CAGGGGTGGA	GATGGGGGTG	180
AACCCAGCCA	GCTTCCCCAT	TGCCCCTCTG	TATCTCCCAG	TGCCCAGCCT	TGGACACACC	240
CTGGCCAGAG	CCAGCTGTTT	GCAGACCTGA	GCCGAGAGGA	GCTGACGGCT	GTGATGCGCT	300
TTCTGACCCA	GCGGCTGGGG	CCAGGGCTGG	TGGATGCAGC	CCAGGCCCGG	CCCTCGGACA	360
ACTGTGTCTT	CTCAGTGGAG	TTGCAGCTGC	CTCCCAAGGC	TGCAGCCCTG	GCTCACTTGG	420
ACAGGGGGAG	CCCCCCACCT	GCCCGGGAGG	CACTGGCCAT	CGTCTTCTTT	GGCAGGCAAC	480
CCCAGCCCAA	CGTGAGTGAG	CTGGTGGTGG	GGCCACTGCC	TCACCCCTCC	TACATGCGGG	540

PL 192 459 B1

ACGTGACTGT	GGAGCGTCAT	GGAGGCCCCC	TGCCCTATCA	CCGACGCCCC	GTGCTGTTCC	600
AAGAGTACCT	GGACATAGAC	CAGATGATCT	TCAACAGAGA	GCTGCCCCAG	GCTTCTGGGC	660
TTCTCCACCA	CTGTTGCTTC	TACAAGCACC	GGGGACGGAA	CCTGGTGACA	ATGACCACGG	720
CTCCCCGTGG	TCTGCAATCA	GGGGACCGGG	CCACCTGGTT	TGGCCTCTAC	TACAACATCT	780
CGGGCGCTGG	GTTCTTCCTG	CACCACGTGG	GCTTGGAGCT	GCTAGTGAAC	CACAAGGCCC	840
TTGACCCTGC	CCGCTGGACT	ATCCAGAAGG	TGTTCTATCA	AGGCCGCTAC	TACGACAGCC	900
TGGCCCAGCT	GGAGGCCCAG	TTTGAGGCCG	GCCTGGTGAA	TGTGGTGCTG	ATCCCAGACA	960
ATGGCACAGG	TGGGTCCTGG	TCCCTGAAGT	CCCCTGTGCC	CCCGGGTCCA	GCTCCCCCTC	1020
TACAGTTCTA	TCCCCAAGGC	CCCCGCTTCA	GTGTCCAGGG	AAGTCGAGTG	GCCTCCTCAC	1080
TGTGGACTTT	CTCCTTTGGC	CTCGGAGCAT	TCAGTGGCCC	AAGGATCTTT	GACGTTCGCT	1140
TCCAAGGAGA	AAGACTAGTT	TATGAGATAA	gcctccaaga	GGCCTTGGCC	ATCTATGGTG	1200
GAAATTCCCC	AGCAGCAATG	ACGACCCGCT	ATGTGGATGG	AGGCTTTGGC	ATGGGCAAGT	1260
ACACCACGCC	CCTGACCCGT	GGGGTGGACT	GCCCCTACTT	GGCCACCTAC	GTGGACTGGC	1320
ACTTCCTTTT	GGAGTCCCAG	GCCCCCAAGA	CAATACGTGA	TGCCTTTTGT	GTGTTTGAAC	1380
AGAACCAGGG	CCTCCCCCTG	CGGCGACACC	ACTCAGATCT	CTACTCGCAC	TACTTTGGGG	1440
gtcttgcgga	AACGGTGCTG	GTCGTCAGAT	CTATGTCCAC	CTTGCTCAAC	TATGACTATG	1500
TGTGGGATAC	GGTCTTCCAC	CCCAGTGGGG	CCATAGAAAT	ACGATTCTAT	GCCACGGGCT	1560
ACATCAGCTC	GGCATTCCTC	TTTGGTGCTA	CTGGGAAGTA	CGGGAACCAA	GTGTCAGAGC	1620
ACACCCTGGG	CACGGTCCAC	ACCCACAGCG	CCCACTTCAA	GGTGGATCTG	GATGTAGCAG	1680
GACTGGAGAA	CTGGGTCTGG	GCCGAGGATA	TGGTCTTTGT	CCCCATGGCT	GTGCCCTGGA	1740
GCCCTGAGCA	CCAGCTGCAG	AGGCTGCAGG	TGACCCGGAA	GCTGCTGGAG	ATGGAGGAGC	1800
AGGCCGCCTT	CCTCGTGGGA	AGCGCCACCC	CTCGCTACCT	GTACCTGGCC	AGCAACCACA	1860
GCAACAAGTG	GGGTCACCCC	CGGGGCTACC	GCATCCAGAT	GCTCAGCTTT	GCTGGAGAGC	1920
CGCTGCCCCA	AAACAGCTCC	ATGGCGAGAG	gcttcagctg	GGAGAGGTAC	CAGCTGGCTG	1980
TGACCCAGCG	GAAGGAGGAG	GAGCCCAGTA	GCAGCAGCGT	TTTCAATCAG	AATGACCCTT	2040
GGGCCCCCAC	TGTGGATTTC	AGTGACTTCA	TCAACAATGA	GACCATTGCT	GGAAAGGATT	2100
TGGTGGCCTG	GGTGACAGCT	GGTTTTCTGC	ATATCCCACA	TGCAGAGGAC	ATTCCTAACA	2160
CAGTGACTGT	GGGGAACGGC	GTGGGCTTCT	TCCTCCGACC	CTATAACTTC	TTTGACGAAG	2220
ACCCCTCCTT	CTACTCTGCC	GACTCCATCT	ACTTCCGAGG	GGACCAGGAT	GCTGGGGCCT	2280
GCGAGGTCAA	CCCCCTAGCT	TGC.CTGCCCC	AGGCTGCTGC	CTGTGCCCCC	GACCTCCCTG	2340
CCTTCTCCCA	CGGGGGCTTC	TCTCACAACT	AGGCGGTCCT	GGGATGGGGC	ATGTGGCCAA	2400

PL 192 459 B1

GGGCTCCAGG GCCAGGGTGT GAGGGATGGG GAGCAGCTGG GCACTGGGCC GGCAGCCTGG 2460 TTCCCTCTTT CCTGTGCCAG GACTCTCTTT CTTCCACTAC C 2501

(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR : 2 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 7 63 aminokwasy

(B) TYP: aminokwas

(C) NICIOWOŚĆ: oieznanna

(D! TOPOLOGIA: liniowa

(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd.

(xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:2:

Met Asn Gin Lys Thr Ile Len Val Leu Leu Ile Leu Ala Val Ile Thr

15 10 15

Ile Phe Ala Leu Val Cys Val Leu Leu Val Gly Arg Gly Gly Asp Gly

20 25 30

Gly Glu Pro Ser Gin Leu Pro His Cys Pro Ser Val Ser Pro Ser Ala

35 40 45

Gin Pro Trp Thr His Pro Gly Gin Ser Gin Leu Phe Ala Asp Leu Ser

50 55 60

Arg Glu Glu Leu Thr Ala Val Met Arg Phe Leu Thr Gin Arg Leu Gly

65 70 75 BO

Pro Gly Leu Val Asp Ala Ala Gin Ala Arg Pro Ser Asp Asn Cys Val

85 90 95

Phe Ser Val Glu Leu Gin Leu Pro Pro Lys Ala Ala Ala Leu Ala His

100 105 110

Leu Asp Arg Gly Ser Pro Pro Pro Ala Arg Glu Ala Leu Ala Ile Val

115 120 125

Phe Phe Gly Arg Gin Pro Gin Pro Asn Val Ser Glu Leu Val Val Gly

130 135 140

Pro Leu Pro His Pro Ser Tyr Met Arg Asp Val Thr Val Glu Arg His

145 150 155 160

Gly Gly Pro Leu Pro Tyr His Arg Arg Pro Val Leu Phe Gin Glu Tyr

165 170 175

Leu Asp Ile Asp Gin Met Ile Phe Asn Arg Glu Leu Pro Gin Ala Ser

180 185 190

Gly Leu Leu His His Cys Cys Phe Tyr Lys His Arg Gly Arg Asn Leu

195 200 205

Val Thr Met Thr Thr Ala Pro Arg Gly Leu Gin Ser Gly Asp Arg Ala

210 215 220

PL 192 459 B1

Thr 225

Trp

Phe

Gly

Leu

Tyr 230

Tyr

Asn

Ile

Ser

Gly 235

Ala

Gly

Phe

Leu 240

His

Val

Gly

Leu 245

Glu

Leu

Val

Asn 250

His

Lys

Ala

Leu

Asp 255

Pro

Ala

Arg

Trp

Thr 260

Ile

Gin

Lys

Val

Phe 265

Tyr

Gin

Gly

Arg

Tyr 270

Tyr

Asp

Ser

Leu

Ala 275

Gin

Leu

Glu

Ala

Gin 280

Phe

Glu

Ala

Gly

Leu 285

Val

Asn

Val

Leu 290

Ile

Pro

Asp

Asn

Gly 295

Thr

Gly

Ser

Trp 300

Ser

Leu

Lys

Ser

Pro 305

Val

Pro

Gly

Pro 310

Ala

Pro

Leu

Gin 315

Phe

Tyr

Pro

Gin

Gly 320

Pro

Arg

Phe

Ser

Val 325

Gin

Gly

Ser

Arg

Val 330

Ala

Ser

Leu

Trp 335

Thr

Phe

Ser

Phe

Gly 340

Leu

Gly

Ala

Phe

Ser 345

Gly

Pro

Arg

Ile

Phe 350

Asp

Val

Arg

Phe

Gin 355

Gly

Glu

Arg

Leu

Val 360

Tyr

Glu

Ile

Ser

Leu 365

Gin

Glu

Ala

Leu

Ala 370

Ile

Tyr

Gly

Asn 375

Ser

Pro

Ala

Met 380

Thr

Arg

Tyr

Val 385

Asp

Gly

Phe

Gly 390

Met

Gly

Lys

Tyr

Thr 395

Thr

Pro

Leu

Thr

Arg 400

Gly

Val

Asp

Cys

Pro 405

Tyr

Leu

Ala

Thr

Tyr 410

Val

Asp

Trp

His

Phe 415

Leu

Glu

Ser

Gin 420

Ala

Pro

Lys

Thr

Ile 425

Arg

Asp

Ala

Phe

Cys 430

Val

Phe

Glu

Gin

Asn 435

Gin

Gly

Leu

Pro

Leu 440

Arg

His

Ser 445

Asp

Leu

Tyr

Ser

His 450

Tyr

Phe

Gly

Leu 455

Ala

Glu

Thr

Val

Leu 460

Val

Arg

Ser

Met 465

Ser

Thr

Leu

Asn 470

Tyr

Asp

Tyr

Val

Trp 475

Asp

Thr

Val

Phe

His 480

Pro

Ser

Gly

Ala

Ile 485

Glu

Ile

Arg

Phe

Tyr 490

Ala

Thr

Gly

Tyr

Ile 495

Ser

Ala

Phe

Leu 500

Phe

Gly

Ala

Thr

Gly 505

Lys

Tyr

Gly

Asn

Gin 510

Val

Ser

Glu

His

Thr 515

Leu

Gly

Thr

Val

His 520

Thr

His

Ser

Ala

His 525

Phe

Lys

Val

Asp

Leu 530

Asp

Val

Ala

Gly

Leu 535

Glu

Asn

Trp

Val

Trp 540

Ala

Glu

Asp

Met

PL 192 459 B1

Val 545

Phe Val

Pro Met Ala 550

Val

Pro

Trp

Ser

Pro Glu 555

His

Gin

Leu

Gin 560

Arg

Leu

Gin

Val

Thr

Arg

Lys

Leu

Glu

Met

Glu

Gin

Ala

565

570

575

Phe

Leu

Val

Gly

Ser

Ala

Thr

Pro

Arg

Tyr

Leu

Tyr

Leu

Ala

Ser

Asn

580

585

590

His

Ser

Asn

Lys

Trp

Gly

His

Pro

Arg

Gly

Tyr

Arg

Ile

Gin

Met

Leu

595

600

605

Ser

Phe

Ala

Gly

Glu

Pro

Leu

Pro

Gin

Asn

Ser

Met

Ala

Arg

Gly

610

615

620

Phe

Ser

Trp

Glu

Arg

Tyr

Gin

Leu

Ala

Val

Thr

Gin

Arg

Lys

Glu

625

630

635

640

Glu

Pro

Ser

Val

Phe

Asn

Gin

Asn

Asp

Pro

Trp

Ala

Pro

645

650

655

Thr

Val

Asp

Phe

Ser

Asp

Phe

Ile

Asn

Glu

Thr

Ile

Ala

Gly

Lys

660

665

670

Asp

Leu

Val

Ala

Trp

Val

Thr

Ala

Gly

Phe

Leu

His

Ile

Pro

His

Ala

675

680

685

Glu

Asp

Ile

Pro

Asn

Thr

Val

Thr

Val

Gly

Asn

Gly

Val

Gly

Phe

690

695

700

Leu

Arg

Pro

Tyr

Asn

Phe

Asp

Glu

Asp

Pro

Ser

Phe

Tyr

Ser

Ala

705

710

715

720

Asp

Ser

Ile

Tyr

Phe

Arg

Gly

Asp

Gin

Asp

Ala

Gly

Ala

Cys

Glu

Val

725

730

735

Asn

Pro

Leu

Ala

Cys

Leu

Pro

Gin

Ala

Cys

Ala

Pro

Asp

Leu

740

745

750

Pro

Ala

Phe

Ser

His

Gly

Phe

Ser

His

Asn

755 760

PL 192 459 B1

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób utleniania aminy, znamienny tym, że obejmuje poddanie aminy reakcji z polipeptydem białka adhezji naczyniowej - 1 (VAP-1) o aktywności oksydazy aminowej.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że polipeptyd VAP-1 ma sekwencję aminokwasową przynajmniej w 95% identyczną z sekwencją wybraną z grupy obejmującej:

(a') oczyszczony polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową VAP-1 na figurze 1 (Id. Sekw. nr 2);

(b') oczyszczony polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową VAP-1, kodowaną przez sekwencję nukleotydową VAP-1 na figurze 1 (Id. Sekw. nr 1);

(c') oczyszczony polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową kodowaną przez klon cDNA VAP-1 zawarty w depozycie o numerze dostępu DSM 11536;

(d') oczyszczony polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową VAP-1, która jest kodowana przez sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje z sekwencją komplementarną DNA kodującego polipeptyd według jednego z (a') do (c') i koduje VAP-1 i ma sekwencję aminokwasową, która wykazuje przynajmniej 80% identyczności z sekwencją na figurze 1 (Id. Sekw. nr 2); i (e') oczyszczony polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową części niosącej epitop polipeptydu według (a') albo (b').
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że amina jest wybrana z grupy obejmującej benzyloaminę i metyloaminę.
4. Sposób zahamowania aktywności oksydazy aminowej, znamienny tym, że obejmuje dostarczenie do próbki posiadającej aktywność oksydazy aminowej odpowiedniej ilości inhibitora.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że inhibitor jest wybrany z grupy obejmującej semikarbazyd, hydroksyloaminę, propargiloaminę, izoniazyd, nialamid, hydralazynę, prokarbazynę, monometylohydrazynę, 3,5-etoksy-4-aminometylopirydynę i MDL72145((E)-2-(3,4-dimetylofenylo)-3-fluoroalliloaminę).
6. Sposób manipulowania wiązaniem limfocytów z komórkami śródbłonka za pośrednictwem białka adhezji naczyniowej - 1 (VAP-1), znamienny tym, że obejmuje hamowanie aktywności enzymatycznej oksydazy aminowej w tych komórkach śródbłonka.
7. Sposób manipulowania wiązaniem limfocytów z komórkami śródbłonka za pośrednictwem białka adhezji naczyniowej - 1 (VAP-1), znamienny tym, że obejmuje nasilanie aktywności enzymatycznej oksydazy aminowej w tych komórkach śródbłonka.