CN1030138A - 一种测定样品中内毒素存在的方法 - Google Patents

一种测定样品中内毒素存在的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1030138A
CN1030138A CN88102960A CN88102960A CN1030138A CN 1030138 A CN1030138 A CN 1030138A CN 88102960 A CN88102960 A CN 88102960A CN 88102960 A CN88102960 A CN 88102960A CN 1030138 A CN1030138 A CN 1030138A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
endotoxin
coaguin
sample
former
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN88102960A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1018674B (zh
Inventor
雷夫·贝克
克罗斯·科施
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of CN1030138A publication Critical patent/CN1030138A/zh
Publication of CN1018674B publication Critical patent/CN1018674B/zh
Expired legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及一种测定样品中内毒素或内毒素样 物质存在的方法，它包括a)将样品与变形细胞溶 胞产物或血淋巴成分或其免度决定基共保温，b)将 得自步骤a)的样品与成分或类似物的保温混合物与 抗成分或其类似物或抗步骤a)的保温反应产物的抗 体相反应，c)通过检测步骤b)的反应混合物中结合 抗体来测定样品中内毒素或内毒素样物质的存在。 在该方法中，成分或其类似物，或抗体，或内毒素或内 毒素样物质，被偶联到固相上。

Description

本发明涉及一种测定样品中内毒素或内毒素样物质存在的方法，以及对于该方法有用的一种单克隆抗体和测试药盒。
鲎属大眼虱（Limulus    polyphemus）、中国鲎（Tachypleus    tridentatus）、巨型鲎（Tachypleus    gigas）和Carcinoscospius    sotundicauda都是在过去三亿年中系统发育没有发生明显进化的原始海洋节肢动物（1）。
鲎具有一种含有兰血淋巴的开放循环系统，且在该血淋巴中形成的唯一成分是一种被称为变形细胞的细胞（2）。
用于内毒素体外试验的鲎属变形细胞溶胞产物（LAL）的使用直接产生于Bang的重要观察（3）。他观察到当与海洋革兰氏阴性细菌发生一般化感染时鲎要经历一种传播血管内凝固（DIC）。后来发现通过加入活的革兰氏阴性细菌或加入从革兰氏阴性细菌的细胞壁中纯化的内毒素，也可以在体外导致鲎属血淋巴的凝固（2），从而使得最初的观察结果进一步扩大。同一些研究人员也发现变形细胞是血淋巴凝固所必需的各种因子的来源（1）。
作为体外检测内毒素的试验的本应用是以下例事实为基础的;对通过离心从血淋巴中分离出来的变形细胞进行机械破碎，产生含有凝固成分的悬浮液（LAL），而这些凝固成分只被细菌内毒素活化。
这一原理的应用使得LAL试验成为可用于检测革兰氏阴性细菌、内毒素和脂多糖（LPS）的最灵敏方法。用现在的纯化方法制备的LAL可以可靠地测定0.1毫微克/毫升的纯化大肠杆菌标准内毒素。LAL已被用于检测整合在实际上各种革兰氏阴性细菌的细胞壁中的结合内毒素（与细胞相连）或游离内毒素（4）。但是，采用不同的提取方法从不同种制备的内毒素在反应性上的变化是很大的（5，6）。由于这些原因，美国食物和药品管理局（USFDA）已制备出一种参照标准内毒素（RSE），以作为一种LAL和兔热原性试验的标准化措施（美国药典xx）（7）。
对于内毒素具有相似反应性的变形细胞溶胞产物可从所有四个鲎种制备。
在鲎中的凝固过程
现在已知的在鲎中的凝固过程总结如表1。
表1
在鲎中的凝固过程
LPS或ET    或    （1～3）-β-D-葡聚糖
↓
变形细胞上ET结合膜蛋白
↓
未知因子（？）
↓
细胞凝固素原：凝固素原由带有内部二硫键的多肽链组成，而这些二硫键对于聚合形式的分子的稳定性是非常重要的（8）。在Limulus    polyphema中，已发现其凝固素原由带有十八个半胱氨酸残基的220个氨基酸组成（9）。未测出自由SH基;甘氨酸出现在唯一的N-末端残基上，而丝氨酸只出现在其C-末端残基上（9）。凝固素原总是被丝氨酸蛋白酶转化。凝固后，凝胶蛋白在电子显微镜中显示出一种螺旋结构（10）。在中国鲎中，凝固素原由132-135个氨基酸组成，其中包括高水平的基本氨基酸，且含有N-末端丙氨酸和C-末端苯丙氨酸。在Limulus中，凝块形成过程似乎涉及在凝固素原上的单个精氨酸-赖氨酸肽键的断裂（11，9）。N-肽以非共价方式相互反应，形成不可溶凝块。在Tachyplus中，凝胶的酶促形成涉及位于凝固素原N-末端部分的精氨酸-甘氨酸和精氨酸-苏氨酸肽连接的有限蛋白水解，从而释放出肽（12，13）。Limulus的C-片段主要含有谷氨酸和精氨酸（14）。鉴于Liu等（9）测得在这一种中一个C-肽含有45个氨基酸，Nakamura等（13）和Shishikura等（15）声称C-肽中有28个氨基酸是以种特异性顺序排列。
凝固酶：凝固酶是一种丝氨酸蛋白酶的酶。它以分子量分别为78，000和40，000的两种活性形式存在，且氨基酸组成非常相似，这表明它们是单聚体与二聚体的关系。在中国鲎中，还未被减少的凝固酶是一种分子量为42，000的糖蛋白，它聚集形成一种分子量为350，000的蛋白质。凝固酶来源于一种非活性的凝固酶原。凝固酶原可以通过两种独立的途经被活化（表1）：被革兰氏阴性细菌的LPS或被某些真菌或藻类的细胞壁上的（1-3）β-D-葡聚糖。
脂多糖介导的凝固：首先，已证明是内毒素或脂多糖活化了丝氨酸蛋白酶型的凝固酶原。接着，发现附加因子B或前活化因子也与脂多糖诱导的LAL凝固过程有关，因为其活化凝固酶原（17，18）。这一活化可能涉及有限的蛋白水解，即凝固酶原的精氨酰或赖氨酰-X键的水解（18）。最后，这一前活化因子已被发现是由另一种叫做蛋白酶N（在中国鲎中为因子C）的蛋白水解酶转化成活性因子B或活化因子（即色氨酸型丝氨酸蛋白酶），而它又似乎是依赖脂多糖的（18，19）。这些成功的发现表明，这一凝固过程代表了一个复杂的酶级联，也许还包括许多其它未知因子（表1）。
抗凝固因子：特异性地与内毒素或脂多糖结合的变形细胞膜上的一种80kd的蛋白质（9，20）。按照作者们的观点，这一受体蛋白可以在鲎血液中识别和固定少量的脂多糖，而没有大量的血管内凝固。另外，一种抑制脂多糖诱导的凝固的抗凝固剂（抗脂多糖因子）也存在于来自中国鲎和Limalus    polyphemus的血淋巴的变形细胞中（21）。这一抗凝固剂抑制的是因子B的活化，而不是它的活性。另一因子介导的凝固途经不受抗脂多糖因子的影响（21）。
（1-3）-β-D-葡聚糖介导的凝固：抗肿瘤剂-（1-3）-β-D葡聚糖以及其它的抗肿瘤多糖都具有通过活化因子G而导致LAL胶凝的潜能（22），因子G作用于凝固酶原（23）。
通过LAL测定内毒素的不同方法
至今最常使用的方法是凝块试验。这一方法的根据是，在LAL中与内毒素发生反应时级联反应的最终结果是一不透明凝胶或凝块。这一试验是这样进行的：在一试管中将0.1毫升的LAL与0.1毫升的试验溶液混合。混合物在37℃的热水浴中保温1小时。形成凝块且当试管插入180℃处凝块仍然稳定时，试验被认为是阳性的。发现反应不太剧烈时，其表明粘度增加，可见淀粉样颗粒粘附试管壁上，常常伴随着混浊度的增加。主观地把还未到完全胶凝的状态当作终点一直是实施该试验方法的不足之处。尤其当试验受各种物质干扰的临床样品时更是如此。
根据以上提到的在LAL中反应机制的研究，已建立起其它各种经过改进的LAL试验。其中包括浊度计法（24）、产色法（25）、比色法（26）、比浊法（27）、动力法（28-30）、不同玻片法（31-36）、毛细管法（38，39）、微稀释法（40）、LAL珠法（41）、凝固素原的放射性同位素称记法（42）和免疫电泳法，它是测定当凝固素原被脂多糖活化的酶打断时其抗原性的丢失（43）。在所有这些方法中，除了免疫电泳法（43）以外，其试验结果都是靠视觉或利用某种设备间接地读出。
LAL对于内毒素的特异性。
已有几位研究人员对LAL与内毒素或脂多糖反应的特异性提出疑问。已报道，凝血酶、组织促凝血酶原激酶和某些合成多核苷酸都可产生LAL试验阳性反应（44）。从革兰氏阳性细菌得来的肽聚糖、从A组链球菌衍生得来的外毒素（46）、包括酵母甘露聚糖和细菌葡聚糖在内的几种简单多糖（47）、合成的葡聚糖衍生物（48）以及二硫杂环戊二烯（49）都可以引起LAL的胶凝。
LAL试验已被用于测定从各种生物的膜材料纯化出的内毒素样分子的生物活性。利用得自粪链球菌（Streptococcus    faecalis）的脂磷壁酸质（50）、得自枝原体（Mycoplasma）的不同株的脂聚糖（51，52）、得自干草小多孢菌（Micropolyspora    faeni）（53）和鹦鹉热衣原体（Chlamydia    psittaci）（54）和伯氏疟原虫（Plasmodium    berghei）细胞壁部分的纯制品（55）以及单核细胞增生利斯特氏菌（Listeria    monocytogenes）的热酚一水提取液（56）都可获得阳性LAL试验。
最近，LAL试验的临床应用性已引起争论。Elin（57）完成了用LAL和血液对人进行的17种不同研究的统计分析，从而得出结论：利用LAL试验诊断革兰氏阴性败血症的临床利用性是勉强的。由Tubbs（58）和Gallouay等（59）分别进行的进一步研究表明，从被恶性疟原虫（Plasmodium    falciparum）感染的病人得到的血浆以及从被回归热疏螺旋体（Borrelia    recurentis）感染的病人得到的血浆都发生LAL试验阳性反应。
在上面提到的几乎所有研究中，都是使用主观方法来观察LAL试验，阳性试验被定义为胶凝或浊度增加。
最困难的一点一直是血液或血浆中内毒素的测定。首先，由于在肝中的迅速清除，因此在血液中循环的内毒素的浓度通常很低。其次，血浆中含有LAL抑制剂，内毒素灭活物质以及内毒素结合蛋白。
已利用各种方法从血浆中提取内毒素。其最佳结果是结合稀释和加热血浆而获得的（43）。
与其它几种方法相比，利用火箭免疫电泳方法来测定LAL与内毒素的反应性的实验（43）具有更高的精确度和灵敏性，且适合于诊断目的。
对LAL与来自铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抗原的相互反应的免疫电泳研究表明LAL能够与脂多糖发生高度反应，但同时它也能够与来自革兰氏阳性细菌的其它抗原发生反应（60）。
制药工业中的LAL试验
应用LAL试验最多的是制药业，它每年要在各种大量或小量的肠液上，生物化学上和医学仪器上进行成千上万的试验。LAL试验正普遍用于许多可注射液和全世界制药业生产的侵袭医疗仪器的进行过程中和最终释放试验。
LAL试验的临床应用
Jorgensen（61）已对LAL试验的临床应用进行了详细的讨论。从这一对于LAL试验的临床应用的回顾可以得出的结论就是，自六十年代后期这一试验被介绍以来已记载了大量的具有潜在成功性的利用。它们都是得益于LAL试验对于细菌内毒素的反应速度，敏感性以及总的特异性，而不管这种细菌内毒素是来自活的革兰氏阴性细菌的结合内毒素还是细菌生长前或周期性细菌生长的残留证据的游离内毒素。在所有这些应用中，LAL试验在某些方面显得比常规的诊断细菌内毒素的方法优越。但是，所有这些应用中还没有一种取代了常规方法，以让LAL试验单独应用于诊断。实际上，LAL试验是一种在各种临床情况下测定革兰氏阴性细菌存在的强有力附助手段。它具有有效的诊断用途（脑膜炎、眼感染、菌尿），并且实际上可能导致对于内毒素的其它病理生理结果（内毒素血症）的更好理解。
本发明人现已发展了一种新型的测定Limulus或Tachypleus变形细胞溶胞产物与内毒素的反应的方法。该方法与火箭免疫电泳法（43）显示出同样的灵敏性和特异性，但是它不需要非常特殊的设备或者是非常有技术的人员来操作它，因此，它可以在通常的任何一个临床实验室中完成。它也比较简单，即，花时较少，且由于完成它只需要少量的变形细胞溶胞试剂，它更加经济。因此，该新方法与已知方法相比，具有一个非常重要的经济优点。相应地，本发明涉及一种测定样品中内毒素或内毒素样物质的存在的方法，它包括
a）将样品与鲎变形细胞溶胞溶液或血淋巴成分或其合成类似物一起保温。如果样品中存在任何内毒素或内毒素样物质，将导致所说成分的特性改变，从而使得不会有任何与抗体的反应发生，该抗体是指抗或实际只对准所说成分或其类似物或其免疫决定基的抗体;或者是使得所说成分或其类似物与样品中的内毒素或内毒素样物质的反应的反应产物与一种抗体发生反应，而这种抗体是抗或实际只对准所说的反应产物或其免疫决定基的抗体。
b）将从步骤a）得来的所说样品和所说成分或其类似物的保温混合物与一种抗或实际上只对准所说成分或其类似物或其免疫决定基的抗体反应，该反应是通过该抗体与混合物中存在的任何一种所说成分或其类似物的结合而完成的;或者是将该保温混合物与一种抗或实际上只对准所说反应产物或其免疫决定基的抗体反应，该反应是通过该抗体与混合物中存在的任何一种反应产物结合而完成的，
c）通过检测步骤b）产生的反应混合物中的任何结合抗体来测定样品中任何内毒素或内毒素样物质的存在，如果抗体是一种抗或实际上只对准所说成分或其类似物或其一免疫决定基的抗体，那么结合抗体量的减少表明样品中存在内毒素或内毒素样物质;如果抗体是一种抗或实际上只对准所说反应产物或其免疫决定基的抗体，那么结合抗体量的增加表明样品中存在内毒素或内毒素样物质。这一方法是以下列条件为基础的：经过样品与成分或其类似物在步骤a）的保温后存在的任何一种所说成分或其类似物或其反应产物偶联到一固体支持物上;或者是所说抗体偶联到一固体支持物上或偶联到一已偶联到固体支持物上的桥连分子上;或者是存在样品中的任何内毒素或内毒素样物质偶联到一固体支持物上。
在本文中，“内毒素或内毒素样物质”是指这样一种物质，它通常是细菌细胞膜外表面的成分，且通常是一种热原（即引起发热）。已证明革兰氏阴性细菌内毒素的生物活性部分是脂多糖，它的脂质部分（脂质A）直接与脂多糖的热原性和内毒性相关。但是也已证明（45，46，60）其它的表面抗原也可能与LAL反应，其中包括革兰氏阳性细菌的表面抗原，因此，这一表述包括来自细菌或其它微生物如真菌、酵母或藻类的能够与LAL反应的任何物质或成分（22，23，47，48）。
术语“鲎变形细胞溶胞产物或血淋巴成分”包括整个溶胞产物或血淋巴以及其中的各种反应成分，因为整个溶胞产物或血淋巴包括这些与内毒素或内毒素样物质反应的反应成分。在本发明的方法中现在比较受欢迎的是凝固素原（存在于溶胞产物中）。溶胞产物或血淋巴可得自所有四个鲎种，现在更喜欢使用的是Limulus和Tachyplus。
术语“合成类似物”被理解为指显示了对于内毒素或内毒素样物质具有如同自然存在于变形细胞溶胞产物或血淋巴中的成分一样的反应性或实际上同样反应性的物质。这样一种类似物可以采用化学合成法（如常规的肽合成法）制备，最好是固相肽合成法，或者是采用重组DNA技术制备，它包括将编码所说成分的基因克隆到一合适的表达载体上，将产生的重组载体转化到一合适的微生物中，在合适的培养基中培养该微生物以表达所说基因，以及从培养基中分离这样产生的成分。本发明的方法中所使用的具体成分可选自凝固因子（如因子B、因子C、因子G、因子N、凝固酶原、活化的凝固酶、抗脂多糖因子或凝固素原）和凝集素（如limulin或polyphemin等外源凝集素），凝固因子通常在变形细胞中被发现，而凝集素通常在血淋巴中被发现。
术语“所说成分或其类似物与样品中内毒素或内毒素样物质发生反应的反应产物”被理解为指通过对底物进行酶促断裂或其它由酶促产生的变化（如在蛋白质三级结构中）而产生的任何产物，该底物是通过样品中存在的内毒素或内毒素样物质在上述的酶级联中被活化。反应产物可选自凝固素，C-肽，活化凝固酶，活化因子B、C、G或N，或者是这些因子或凝固酶原的断裂产物。
术语“样品”被定义为要检测其内毒素的存在的任何物质。该术语最好包括通常经过热原试验的任何物质。因此，样品可选自医药制品，如肠胃外液或可注射液，即包含活性物质（如药物或营养物）的制品，以及用于插入病人体内的医学装置，如小管或导管等侵入装置。其它通常经过热原试验的物质包括促细胞分裂剂，生物化学试剂（包括营养培养基及其缓冲液），食料，饮料以及制药业所使用的水。而且，样品也可选自体液，如尿，脑脊髓液，血液，血清，血浆或从血液或淋巴制备的任何产物，这样就使得利用本发明的方法来诊断由内毒素引起的疾病成为可能。已知的测定临床样品中的热原的方法的一个弊端就是，当在体液样品（主要是血浆和血清）中进行试验时，没有显示出精确诊断菌血症和败血病所要求的特异性和灵敏性。而令人惊奇的是，已发现本发明的方法可用于血浆和血清中甚至是微量（微微克水平）的内毒素的测定。
在本文中，术语“免疫决定基”是指能够引起具有本发明试验方法中所需要的特性的抗体的产生的所说成分或其类似物的亚序列，或者是一种将与抗体发生反应的所说成分或其类似物的亚序列。因此，作为一例，免疫决定基可能是一种横跨在上述酶级联中成分或其类似物被打断的断裂点的序列。术语“抗体”是指动物或动物细胞作为对于暴露到所说成分或其类似物或其反应产物中的应答而形成的物质。为了保证痉⒚骷煅榉椒ǖ氖实弊ㄒ恍院土槊粜裕固遄詈檬侵欢增妆湫蜗赴馨锘蜓馨偷牡ヒ怀煞窒允咎匾煨缘牡ヒ惶匾煨钥固澹皇嵌杂诩钢殖煞只蛘鋈馨锘蜓馨拖允咎匾煨缘目固濉６杂谀承┠康模固蹇梢允嵌嗫寺】固澹话阕詈檬堑タ寺】固澹蛭庋芄槐Ｖじ眉煅榫哂懈叩奶匾煨院土槊粜裕佣芄惶峁┍瘸９娴腖AL试验方法更加精确的内毒素或其类似物测定，同时，它需要的试验成分或类似物的量更少，从而使得本发明的方法使用起来更加经济。
按照本发明，内毒素或内毒素样物质的存在既可被测定为阳性也可被测定为阴性。阴性测定是由于对样品和成分或类似物的保温混合物的反应中使用抗所说成分或类似物的抗体，利用了该抗体不能与样品和成分或类似物保温的反应产物结合的特点。如果反应后测定出很少或根本没有结合抗体，或者至少测得的结合抗体量与无内毒素对照相比明显减少，这就表明样品中存在内毒素或内毒素样物质，因为它表明由于内毒素的存在而使得成分或其类似物被酶促断裂或发生了其它结构性变化，从而导致了抗这种成分或其类似物的抗体不再能够与其结合。另一方面，如果所用的抗体是抗反应产物的抗体，那么在本发明的步骤b）加入的该抗体将在试验中结合（或者至少是，与无内毒素对照相比，将结合的抗体量增加了），从而提供了测定样品中的内毒素或内毒素样物质的阳性结果。
本发明方法既适合于内毒素的定性测定又适合于其定量测定，对于定量测定，可以采用一种已知方式通过样品的系列稀释来测定在试验中结合的抗体量。
按照本发明，当将样品与成分或类似物在上述方法的步骤a）保温后剩下的任何所说成分或类似物或任何反应产物偶联到一固体支持物上时，接着就可以将抗该成分或类似物或抗反应产物的抗体加到上述固体支持物上。在前一种情况下，没有结合抗体，或与无内毒素对照比只有较少量的结合抗体则表明样品中存在内毒素，在后一种情况下，结合抗体的存在则表明样品中内毒素的存在。
或者，将抗体偶联到一固体支持物上或是偶联到一已偶联到固体支持物上的桥连分子上，然后将经过本发明的步骤a）样品与成分或类似物混合保温后剩下的任何所说成分结合到该抗体上，与一定量的抗体进一步反应。
或者，将样品中存在的任何内毒素或内毒素样物质偶联到固体支持物上。然后将成分或类似物加到固体支持物，让它们一起保温。接着加入抗成分或类似物或抗成分或类似物与样品一起保温后产生的反应产物的标记抗体。在这种情况下，成分（或类似物）应该是整个溶胞产物或血淋巴，或者是溶胞产物中的一种内毒素与其反应而诱导上述的酶级联的化合物。
另一方面，本发明也涉及一种在本发明方法中使用的单克隆抗体，这种抗体是用来抗或实际上仅抗鲎变形细胞溶胞产物或血淋巴成分的抗体，或者是抗其合成类似物或其免疫决定基的抗体。
另外，本发明也涉及一种用于测定样品中的内毒素或内毒素样物质存在的试验药盒，它包括
a）一种用于抗或实际上仅抗鲎变形细胞溶胞产物或血淋巴成分或其合成类似物或其免疫决定基的抗体，或者是一种用于抗或实际上仅抗所说成分或类似物与内毒素或内毒素样物质或其免疫决定基反应的反应产物的抗体;
b）鲎变形细胞溶胞产物或血淋巴成分，或其合成类似物。
如上所述，与所说成分或其类似物结合或者是与反应产物结合的抗体最好是抗鲎变形细胞溶胞产物或血淋巴（或其合成类似物）的特定成分的单一特异性抗体。这种单一特异性抗体可以这样制备：用所讨论的成分或其类似物的实际纯品注射进适当的动物中，接着在适当的时间间隔（如两周到一月）进行一次或多次辅助剂注射，直至第一次抽血前六个月。然后，在继续这一已建立起来的免疫系统的同时，于每次辅助剂免疫后约一周对动物抽血，再按常规方法（如Harboe和Ingild，Scand.J.Immun.2（Suppl.1），1973，pp161-164）从其血清中分离抗体。
对于某些不需要高度特异性的用途，该抗体可以是多克隆抗体。多克隆抗体实际上可以按照已提到的Harboe和Ingild所述的方法得到。但是在大多数情况下，在本发明方法中所使用的抗体最好是单克隆抗体，因为它一般能够使得该检测具有更高的特异性和精确性，且所需时间较少。而且，还可使用两种或多种不同单克隆抗体的混合物，蛭庋梢栽黾硬舛ǚ段Ш褪匝榈牧槊粜浴５タ寺】固蹇砂聪率龇椒ɑ竦谩?
本方法中所使用的抗体最好是实际纯品，以利提高检测的精确性。
在某些情况下，如当抗体偶联到固体颗粒（如下所述）上，而这些颗粒在抗体与它所对准的物质（即成分或类似物或反应产物）反应时发生凝集，抗体可以未经修饰的形式使用。但是，在大多数情况下，为了检测结合抗体，最好给抗体提供一种标记，或者（如在双抗体检测中），将标记抗体与非标记抗体结合使用。用作标记的物质可以是本身可测的或与另一种物质反应产生出可测的终产物的任何物质。因此，标记物可选自酶，荧光或化学发光物质，发色团，放射活性同位素和复合剂。
可用作标记物的酶的例子有过氧化物酶（如辣根过化氧物酶），磷酸酶（如酸性磷酸酶），半乳糖苷酶，脲酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，苹果酸脱氢酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和核糖核酸酶。
酶本身并不是可测的，但它必须与一种底物结合来催化反应，产生可测的终产物。因此，可将一种底物加入到由上述步骤b）产生的反应混合物中，产生出有色的，荧光或化学发光产物，或者是导致颜色变化，或者是导致颜色、荧光或化学发光强度的变化。可作为上面提到的本发明的酶的底物的例子有H2O2，对-硝基苯磷酸，乳糖，尿素，β-D-葡萄糖，CO2，胆碱酯，淀粉，溶壁微球菌（M.lysodeikticus），苹果酸，葡萄糖-6-磷酸和RNA。也有将底物与发色团等物质（它既可是供体也可是受体）结合。
作为结合抗体的直接检测的标记物的荧光物质可选自4-甲基伞形基-D-吡喃半乳糖苷，4-甲基伞形基-磷酸和3-（对-羟基-苯基）丙酸。利用分光光度计可对这些物质本身进行测定，包括荧光的定性与定量测定。
作为抗体结合的直接检测标记物的化学发光物质可选自异鲁米诺/EDTA/H2O2，过氧化物酶/曙红/EDTA和虫荧光素酶及其底物。利用分光光度计可对这些物质本身进行测定，它既可对化学发光进行定性测定，也可进行定量测定。
用于结合抗体的直接检测的发色团可选自5-氨基水杨酸，2，2′-连氮基-二-（3-乙基苯基噻唑啉-6-磺酸，邻-苯二胺，邻-diaminicidin，3-甲基-2-苯并噻唑啉腙，3-（二甲基胺）-苯甲酸，邻-甲苯胺，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，邻-硝基-苯基-β-D-半乳糖苷和对-硝基苯基磷酸。利用分光光度计可以测定这些物质本身，且用于颜色的定性及定量测定。例如颜色强度或颜色变化。
可用于结合抗体的直接检测的放射性同位素可选自125I，3H，35P，131I和14C。由同位素放出的放射活性可通过
Figure 881029602_IMG2
-计数器或闪烁计数器进行测定，它既可对结合放射活性进行定性测定，也可对其进行定量测定。
用于结合抗体的直接检测的复合剂可选自生物素（它形成一种抗生物素蛋白与链霉抗生物素蛋白的复合物），蛋白A（它形成一种免疫球蛋白的复合物）和外源凝集素（它形成一种带有糖决定基的复合物，如受体）。在这种情况下，复合物本身是不能直接被检测的，需要对那种复合剂与其形成复合物的物质进行标记。其标记可采用上面所说的用于抗体标记的物质来完成，即利用荧光或化学发光物质，生色团，酶或放射性物质。
当本发明的方法中的抗体是与已偶联到一固体支持物上的桥连分子相偶联时，作为固体支持物与抗体间的连接的桥连分子可选自戊二醛，碳化二亚胺，赖氨酸，蛋白A和酰肼。抗体可以是被标记的，也可以是未被标记的，在本发明的一个实施方案中，可将未标记抗体偶联到固体支持物上，然后依次加入成分或其类似物与样品的保温混合物以及标记抗体。
在本发明的方法所使用的固体支持物最好包括一多聚体。既可以是支持物本身由多聚体组成，也可以是支持物由多聚体覆盖的基质组成。基质可以是适合于本用途的任何固体物质，如玻璃，纸或塑料。本身构成固体支持物或使用到基质上去的多聚体可选自塑料，纤维素（如硝基纤维素纸，溴化氰活化的纸，1-（3-硝基苄氧甲基）吡啶氯纸，重氮基苄氧甲基纸，硝基苄氧甲基纸或氨基苄氧甲基纸），硅氧烷多聚体和硅石或硅酸盐。合适的塑料有胶乳，聚苯乙烯，聚氯乙烯，聚氨基甲酸酯，聚丙酰胺，聚乙烯乙酸和其任何合适的共聚体。硅石多聚体的例子有硅氧烷;硅酸盐的例子有玻璃。可给多聚体任意提供功能基团，以促进组成上述酶级联一部分的特定试剂的结合，作为上面提到的桥连分子的这些基团任意偶联到一固体支持物上。
虽然对于某些特殊用途来说，某些形状可能比其它形状更便于使用，但固体支持物的物理形状并不非常重要。因此，固体支持物形式可以是平板（如一薄层，或最好为一微滴定平板），条纹，薄膜，固体颗粒（包括蛋白A覆盖的细菌）或纸。用于本发明的固体颗粒的大小通常在约1～10微米的范围内。
在一个实施方案中，本发明方法包括
a）将抗或实际上只对准凝固素原或其免疫决定基的抗体，或者是抗或实际上只对准凝固素或C-肽或其免疫决定基的抗体，偶联到一固体支持物上，或偶联到-已偶联到固体支持物上的桥连分子上，
b）将样品与含有凝固素原的物质一起保温，如果样品中存在内毒素或内毒素样物质的话将导致凝固素原断裂为凝固素和C-肽，
c）将步骤b）产生的保温混合物加到固体支持物上，如果偶联到固体支持物上的抗体是一种抗或实际上只对准凝固素原或其免疫决定基的抗体，将导致结合样品中存在的任何凝固素原，或者，如果偶联到固体支持物上去的抗体是一种抗或实际只对准凝固素或C-肽或其免疫决定基的抗体，将导致结合样品中存在的任何凝固素或C-肽，
d）将抗或实际只对准凝固素原或其免疫决定基的标记抗体加到固体支持物上，以便于结合到存在于固体支持物上的任何结合凝固素原上，或者，将抗或实际上只对准凝固素或C-肽或其免疫决定基的抗体加到固体支持物上，以便于与任何结合凝固素原结合或与固体支持物上存在的任何结合凝固素或C-肽结合。
e）通过检测结合到步骤d）的固体支持物上的任何标记抗体来测定样品中任何内毒素或内毒素样物质的存在。如果抗体是一种抗或实际上只对准凝固素原或其免疫决定基的抗体，则结合抗体量的减少表明样品中存在内毒素或内毒素样物质;如果抗体是一种抗或实际上只对准凝固素或C-肽或其免疫决定基的抗体，则结合抗体量的增加表明样品中存在内毒素或内毒素样物质。
在另一实施方案中，本发明方法包括
a）将样品与含有凝固素原的物质一起保温，如果样品中存在任何内毒素或内毒素样物质，将导致凝固素原断裂为凝固素和C-肽，
b）将步骤a）的保温混合物加到固体支持物上，以结合混合物中存在的任何凝固素原，或结合样品中存在的任何凝固素或C-肽，
c）将抗或实际只对准凝固素原或其免疫决定基的标记抗体加到固体支持物上，以结合到与固体支持物结合的任何凝固素原上。或者，将抗或实际只对准凝固素或C-肽或其免疫决定基的标记抗体加到固体支持物上，以让它与已结合到固体支持物上的任何凝固素或C-肽结合，
d）通过检测结合到步骤c）的固体支持物上的任何标记抗体的存在，来测定样品中任何内毒素或内毒素样物质的存在。如果抗体是一种抗或实际只对准凝固素原或其免疫决定基的抗体，则结合抗体量的减少表明样品中存在内毒素或内毒素样物质;如果抗体是一种抗或实际只对准凝固素或C-肽或其免疫决定基的抗体，则结合抗体量的增加表明样品中存在内毒素或内毒素样物质。
在这两个实施方案中，为了除去未结合抗体，在保温混合物与抗体反应后用水冲洗固体支持物（至少一次，也可能达到几次）可能是有好处（应该注意，上面总结的两种实施方案分别密切相应于直接和双酶联免疫吸附测定法（ELISA））。这些ELISA方法尤其有利，因为已发现与常规的凝胶块试验相比，它们所需要使用的单一成分（即LAL中存在的凝固素原）要少40倍。而且，完成几百种试验所需要的时间约为4小时，比已知试验方法具有重要改进。除了这些优点以外，利用本方法从临床样品（尤其是血液或血浆）获得的结果不受血液中存在的干扰物质的影响，因此该方法可用于试验各种临床样品。ELISA方法已完善地建立起来了，且可以用现有的实验室设备来完成，也可进行自动化处理。因此，本方法具有广泛的应用，它可在临床实验室中用于诊断，也可以在制药业中用于检测原材匣蛞揭┲破分械奈廴疚铩?
在另一实施方案中，本发明方法包括
a）将抗或实际只对准凝固素原或其免疫决定基的抗体，或者是抗或实际上只对准凝固素或C-肽或其免疫决定基的抗体，偶联到固体颗粒表面，
b）将样品与含有凝固素原的物质一起保温，以便于当样品中存在有任何内毒素或内毒素样物质时将凝固素原断裂为凝固素和C-肽，
c）将步骤b）的保温混合物加入到步骤a）的抗体中，以便于在凝固素原存在的情况下，当抗体是一种抗或实际上只对准凝固素原或其免疫决定基的抗体时，引起固体颗粒的凝集，或者是在凝固素或C-肽存在的情况下，当抗体是一种抗或实际只对准凝固素或C-肽或其免疫决定基的抗体时，引起固体颗粒的凝集，
d）通过一种抗或实际只对准凝固素原或其免疫决定基的抗体偶联到其上的固体颗粒的凝集，或者一种抗或实际只对准凝固素或C-肽或其免疫决定基的抗体偶联到其上的固体颗粒的凝集，来测定样品中内毒素或内毒素样物质的存在。
在这一实施方案中，可以通过测定抗体与其结合的固体颗粒的凝集而直接检测内毒素的存在（看得见地）。换句话说，在本方法的这一实施方案中一般无需使用标记抗体。
由于上述原因而发现在本发明使用起来非常有利的单克隆抗体，可能显示上述的抗体一般特性。其制备方法之一如下：
a）用基本上由鲎变形细胞溶胞产物或血淋巴成分或其合成类似物组成的抗原，或基本上由所说成分或类似物与内毒素或内毒素样物质或其免疫决定基反应的反应产物组成的抗原，来免疫适当的动物或动物细胞，以获得产生针对所说抗原的抗体的细胞，
b）将产生针对于所说抗原的抗体的细胞与合适细胞系的骨髓瘤细胞融合，
c）选择和克隆那些产生所说抗体的杂交瘤细胞，
d）在合适培养基中培养杂交瘤细胞，以产生所说抗体，
e）从培养物中回收产生的抗体。
动物免疫最好利用所说成分、类似物或反应产物的溶液或佐剂来进行，而该溶液是存在于一种合适的溶剂如水溶性缓冲液（如磷酸盐缓冲液）之中的溶液。合适佐剂的例子有弗氏完全或不完全佐剂以及氢氧化铝。用于免疫的合适的动物可选自兔，山羊，马，绵羊，小鼠，鸡以及豚鼠。动物的抽出以及（多克隆）抗体的分离均可按已知方式完成。
用于与骨髓瘤细胞融合的产抗体细胞最好是脾或淋巴节细胞。如果来自一个种的细胞可能与来自另一个种的细胞融合的话（如小鼠细胞与大鼠细胞，大鼠细胞与人细胞，或小鼠细胞与人细胞），那么骨髓瘤细胞和产抗体细胞就不必来自同一个种属。但是，最好还是使用同一来源的骨髓瘤和产抗体细胞。一个用于本发明的较好杂交瘤系可以通过小鼠骨髓瘤细胞与注入抗原的小鼠脾细胞的融合而构建。
细胞融合可以按照经过改进的Kohler和Mlistein所述的方法（Nature256，1975，p495）进行。因此，产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞的融合最好在融合促进剂（如聚乙二醇）存在的情况下进行。产抗体细胞与骨髓瘤细胞的比例最好是十比一。所用的骨髓瘤细胞系最好是所谓的抗药型，以便于在选择培养基中让未能融合的骨髓瘤细胞死掉，而让融合了的杂交细胞存活。在通常情况下，最常用于细胞融合的是那些缺少次黄嘌呤鸟嘌呤转磷核糖基酶而对8-氮鸟嘌呤有抗性从而不能在GAT培养基（含有次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷）中生长的细胞系。而且，骨髓瘤细胞系最好为“非分泌”型，这意味着它本身不形成抗体或重或轻免疫球蛋白链。
产生抗所说成分、其类似物或反应产物的抗体的杂交瘤细胞可这样选择：在容器内的选择性培养基中培养未融合骨髓瘤细胞，未融合的产抗体细胞以及融合细胞，在这种选择培养基中，未融合骨髓瘤细胞不能分裂，因此约1～2周后它们就会死掉。未融合的产抗体细胞只能存活有限的分裂周期，接着它们也都死掉（1～2周）。而同时，成功融合的细胞却继续分裂，因为它们从母本骨髓瘤细胞遗传下永久生长特性，并且从母本产抗体细胞获得了合成次黄嘌呤转磷酸核糖基酶的能力，从而使得它们能够在选择培养基中生长（in    casu    HAT培养基）。
应该注意，由融合细胞产生的单克隆抗体，虽然是抗同一抗原的，但依据诱导它们形成的特定决定基，可能无论如何是有区别的。但是，对于任何给定的杂交瘤克隆来说，所有由该克隆产生的抗体，对于抗原分子的特定决定基，都是单一特异性的。产生所需抗体的杂交瘤可采用有限稀释或另一种方法进行选择，且采用再次克隆法（如按本身已知方法使用有限稀释系统）进行克隆。并且可以通过在合适培养基（如Dulbeuo的微量基本培养基）中进行培养而获得高纯度的已克隆单克隆抗体。通过这一体外技术，可生产出只被生长培养中存在的少量异源血清（如牛胎血清）蛋白污染的单克隆抗体。
为了生产显著高浓度的单克隆抗体，而其纯度与体外产生的抗体相比又只有轻微降下，也可以让所选择的杂交瘤细胞在动物体腔中生长。按照这一方法，将所需的杂交瘤克隆注入动物，如小鼠（最好是同基因型或半同基因型小鼠），导致一种腹水瘤的形成，它在动物的血液和腹水液中释放出高浓度的抗体（约2～10毫克/毫升）。即使动物也产生正常的免疫球蛋白，这些也只占单克隆抗体量的5%。
由于本发明单克隆抗体一般被从细胞分泌，因此可以采用分离细胞外产物的标准方法将其从细胞上清液中收回，这些方法包括离心，过滤，沉淀，抽提和/或层析。
本发明的试验药盒的各个试剂a）和b）可分别显示出上面所述的对于抗体和变形细胞溶胞产物成分的任何性质。除这以外，药盒还可以是一种包括标记和非标记抗体（尤其是使用双抗测定时）的药盒。本发明的药盒中的其它成分还可以有内毒素标准品，它尤其对于定量测定有用，能够测定比标准对照高或低水平的抗体结合，以及用于稀释本发明方法中和药盒中使用的试剂的无热原水（以避免由于使用热原污染的水而产生的错误结果）。
本发明的试验药盒可用于因各种病原体感染而导致的临床/病理状态的诊断，这些病原体包括革兰氏阴性菌（如大肠杆菌等肠杆菌科，痢疾志贺氏菌，假单胞菌属，沙门氏菌属，奈瑟氏球菌属，梭菌属，霍乱弧菌，巴氏杆菌属）和革兰氏阳性菌（如单核细胞增生利斯特氏菌和链球菌属），枝原体属，衣原体属，苍白密螺旋体，真菌（如白假丝酵母）以及原生动物（如恶性疟原虫，Plasomdium    falsiparum）。该药盒也可用于药物原材料、制品和医疗设备的污染测定，而这种污染或者是由这些病原体引起的，或者是由这些病原体所产生的残存热原内毒素或其它表面抗原引起的。
图1显示鲎变形细胞溶胞产物与内毒素反应后凝固素原带的消失，表明凝固素原丧失与抗体的反应性。
图2显示通过ELISA试验测得的残存凝固素原与内毒素的浓度成反比。
图3～6显示由保温时间和LAL稀释的不同组合所产生的LAL-内毒素反应曲线。
图7显示用10倍稀释的血浆处理，接着于75℃保温10分钟，导致内毒素几乎100%的回收，而用其它两种处理方法时只达到约50%。
图8和9显示了从各种革兰氏阴性细菌株得来的8种脂多糖（图8）和（1-3）-β-D-葡聚糖（图9）的LAL-ELISA曲线，脂多糖来自肠炎沙门氏菌（▲），大肠杆菌J5（
Figure 881029602_IMG3
），铜绿假单胞菌（ ），马流产沙门氏菌（△），大肠杆菌0.55∶B5（O），鼠伤寒沙门氏菌（■），大肠杆菌0111∶B4（●）和明尼阿波利斯沙门氏菌（□）。图8中的符号（+）代表在无内毒素水中测得的LAL吸收值所占据的位置。
图10显示了稀释对于人血清（□）、人血浆（■）、多粘菌素B（●）和鲎血浆（O）的EIA50的影响。人血清和血浆是从一志愿者制备的。鲎血浆是通过对12只limulus    polyphars的集中血液以5000xg的转速离心30分钟而制得的无细胞上清液。
通过下面的非限制性实例对本发明作进一步阐述。
实例1
抗凝固素原（LAL）的单克隆抗体的制备
1.凝固素原的制备和纯化
利用Tvede    M和Baek    L所公开的常规方法（Acta    Pathol.Microbiol.Immunol.Scand.Sect.B91，1983，pp9-15），从limulus    polyphemus制备鲎变形细胞溶胞产物（LAL）。
将10毫升溶胞产物透析后与等量的0.05M Tris-盐酸缓冲液（pH7.9，含有2mM Ca Cl2）混合。将混合物装到用同样缓冲液平衡过的DEAE-Sepharose
Figure 881029602_IMG5
CL-6B柱（15×1.5厘米）上。将未被吸附到柱上的部分进一步上到用同样Tris缓冲液平衡过的Heparin-Sepharose
Figure 881029602_IMG6
CL-6B柱中。在这些条件下，凝固素原被结合到Heparin-Sepharose 柱上，但能够被含有0.15M Na Cl和2mM Ca Cl2的0.05M Tris-盐酸缓冲液（pH7.9）洗脱。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测出，被洗脱的物质中含有90%以上的纯凝固素原。
2.用凝固素原免疫Balb/C小鼠
将上述步骤1得到的纯化凝固素原以200微克凝固素原/毫克Al（OH）3的比例吸附到氢氧化铝（Al（OH）3）凝胶上，且将悬浮液调至1毫克Al（OH）3/毫升。
对于初次免疫，用被0.5毫升弗氏不完全佐剂乳化的0.5毫升凝固素原悬浮液对每个小鼠进行腹膜内注射（对应于100毫克凝固素原/小鼠）。两周后，用不含有任何弗氏佐剂的0.5毫升凝固素原悬浮液对每个小鼠进行腹膜内加强免疫。
在第28天进行类似剂量的注射。接着，4天之后取出脾脏，通过充分破碎制备脾细胞悬浮液。产生的脾细胞用于下述步骤中的细胞融合。
3.细胞融合和细胞的培养
将上面得到的脾细胞与骨髓瘤细胞（x63Ag8.653）以10∶1的比率混合，然后与一种聚乙二醇溶液[50% w/w PEG1500，7%w/v DMSO（二甲亚砜）存在于磷酸盐缓冲盐水中]于37℃一起保温90秒，以促进细胞融合。加入20毫升Dulbecco微量基本培养基（DMEM），然后以1000xg的转速离心细胞。将细胞沉淀重新悬浮于含有10%牛胎血清的100毫升HAT培养基中（含有次黄嘌呤，氨基碟呤和胸苷），分散到10个96孔微滴定平板（NUNC，Denmark）上。来自正常小鼠的细胞作为喂养细胞以104个/孔的量加入孔中，以促进细胞生长和抑制微生物污染。培养基每周更换两次。
4.选择产生抗凝固素原抗体的杂交瘤细胞
利用酶联免疫吸附测定（ELISA）筛选阳性克隆用上面所述的已纯化的凝固素原覆盖96孔微滴定平板（Immuroplates，NUNC，Denmark）。凝固素原在碳酸盐缓冲液（pH9.0）中稀释至2微克/毫升，然后将100微升含有凝固素原的缓冲液加到孔中。于4℃保温过夜后，用含有0.05%    Tween20的磷酸盐缓冲过的盐水（PBS）洗涤各孔4次。
将各孔与来自步骤3制备的细胞融合平板的100微升培养物上清液（以1∶10稀释在含有0.02% Tween20的PBS中）一起保温一小时，洗涤后再与过氧化物酶结合的兔抗-小鼠Ig（Dakopatts，Copenhagen，编码p260，1∶1000稀释）一起保温一小时。过氧化物酶与存在于10毫升柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液（每1000毫升蒸馏水有7.3克柠檬酸·H2O和11.86克Na2HPO4·2H2O）中的5微升35%的H2O2发生反应，该缓冲液的pH为5.0，含有8毫克的邻苯二胺。用1M H2SO4终止反应。于492nm处读出吸收值。
培养两周后，17个孔中的杂交瘤上清液显示出强烈的阳性反应。从这些孔中的10个选择杂交瘤细胞，采用有限稀释进行克隆和再克隆。建立了7个稳定的克隆。在温度为37℃，CO2浓度为5%，湿度为90%的条件下，于细胞培养瓶内补充有90%牛胎血清的DMEM培养基中培养产生的杂交瘤细胞克隆，注入Pristane处理过的小鼠（两周前用1毫升Pristane腹膜内注射的小鼠）中。经过一段时间的培养后导致小鼠中形成肿瘤，在其血液和腹水液中释放出高浓度的抗体（2-3毫克/毫升）。
5.单克隆抗体的纯化
培养物上消液浓缩到Millipore超级过滤系统上。加入Na    Cl和甘氨酸，至其浓度分别为3.3M和1.65M，且用0.2M    Na    OH将其pH调至8.85。然后将抗体通过一蛋白A柱。用0.1M柠檬酸盐-磷酸盐（pH2.8）洗脱结合抗体。用Tris-HCl将其pH调至8.0。假定A280/1%＝14，在分光光度计上A280处测定抗体量。对于更精确的测定，使用只能测定小鼠抗体的ELISA方法。用在PBS中1∶500稀释的兔抗小鼠免疫球蛋白（Dakopatts，编码2109）覆盖微滴定板。加入已知小鼠Ig标准品的稀释系列（20微克小鼠IG/毫升）和未知样品的稀释物。用1∶1000稀释的过氧化物酶结合的兔抗小鼠Ig（Dakopatts编码p260）测定结合小鼠Ig。从标准曲线上可计算出小鼠Ig的未知浓度。
以基本相同的方式纯化来自腹水液的抗体。但在将其装到蛋白A柱上之前，腹水液被Na    Cl/甘氨酸/Na    OH缓冲液按1∶1稀释。
6.单克隆抗体的鉴定
利用生物标记的组/亚组单一兔抗小鼠Ig（Zymed    Corporation，USA）抗体，通过ELISA方法来试验由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体组和亚组。该方法与上述测定小鼠Ig量的方法基本相似，只是检测抗体为生物素标记的兔抗小鼠Ig    G1，Ig    G2a，Ig    G3，Ig    M或Ig    A的抗体。最后用过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白测定结合。所有抗体都为Ig    G1亚组，且具有轻链K。
实例2
单克隆与鲎变形细胞溶胞产物中凝固素原的反应性以及与内毒素处理过的鲎变形细胞溶胞产物的无反应性
将鲎变形细胞溶胞产物（LAL）和脂多糖（LPS）反应过的LAL各3微升加到（1%）琼脂凝胶中，电泳两小时（20v/cm）。电泳之后将一块硝酸纤维素纸放到琼脂凝胶顶端，维持5千克的压力约20分钟，以让琼脂凝胶中的蛋白质结合到硝酸纤维素纸上。硝酸纤维素纸上的过量结合位点用0.05%的Tween20阻断。
然后将硝酸纤维素纸与按实例1所述产生的单克隆抗体一起保温。将200微升含有抗体的培养物上清液加到50毫升含有0.02%Tween20的PBS中。过夜保温后加入按1∶1000稀释的次级抗体（过氧化物酶结合的兔抗小鼠，Dakopatts，Copenhagen）。最后加入四甲基联苯胺和H2O2（将24毫克四甲基联苯胺与80毫克的十二烷基磺胺琥珀酸钠溶于10毫升乙醇后加到30毫升柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液（pH5.0）中，再加入20微升30%的H2O2，最后用蒸馏水加至50毫升）。由于有很强的兰色染料而使得结合抗体可见。从图1可看出，在非反应的LAL中单克隆抗体与凝固素原发生反应，但它不与脂多糖处理过的LAL反应。使用免疫吸印法则不是这样，如同C.Koch等公开的那样（J.Immunological Methods 84，1985，pp271-278）。
实例3
在酶联免疫吸附检测（ELISA）中内毒素的测定
将已被重组且以1∶4稀释在无热原Tris-Mg＋＋缓冲液中的10微升商业LAL制品（可从Association of Cape Cod，Woodshole，MA，USA购买）加到一定数量的小玻璃试管中。将包括各种浓度（参见图2）的USP参考标准内毒素（大肠杆菌055：B5，Whittakes M.A.Bioproducts，lnc.，Walkersville，USA）在内的试验样品（包括无内毒素缓冲液的阴性对照）10微升加到每一试管中。混合物在37℃保温1小时。向每管中加入0.5毫升碳酸盐缓冲液（pH9.6，每1000毫升蒸馏水中含有1.59克Na2CO3和2.93克Na HCO3）。每管以1∶50稀释在碳酸盐缓冲液中。
将100微升稀释的保温混合物加到96孔微滴定板（NUNC，Denmark）的每孔中。室温保温1小时后，用PBS（每1000毫升蒸馏水中含有29.2克Na Cl，0.2克KCl2，0.2克KH2PO4，1.15克Na2HPO4·2H2O和10毫升Triton X）冲洗平板四次。按照与Wilson和Nakane（62）所述基本相同的高碘酸法，将辣根过氧化物酶与按实例1制备的抗凝固素原单克隆抗体结合。因此，将溶于蒸馏水中的4毫克HRP与新鲜制备的0.1毫升100mM Na IO4混合，室温下搅拌30分钟。于4℃将这一溶液对1mM乙酸钠缓冲液（pH4.4）过夜透析后与8毫克单克隆抗体（溶于1毫升50mM碳酸盐缓冲液，pH9.5）混合，室温下搅拌两小时后加入0.1毫升新鲜Na BH4溶液（4毫克/毫升），4℃保温2小时。将产生的结合物于4℃对磷酸盐缓冲过的盐水（PBS，pH7.3）过夜透析。然后加到等体积的甘油（87%）中，于-20℃保存。将100微升以1∶20，000稀释在稀释缓冲液（10克牛血清清蛋白存在于1000毫升洗涤缓冲液中，pH7.2）中的过氧化物酶结合的单克隆抗体加到孔中，保温1小时后用PBS洗涤平板四次。再加入100微升染液（每1000毫升蒸馏水中含有7.3克柠檬酸H2O，11.86克Na2HPO4·2H2O，其中加进了过氧化物酶的底物（40毫克邻苯二胺溶于已加进40微升强双氧水的100毫升染色缓冲液））。30分钟之后用1M H2SO4终止反应，测定492纳米处的吸收值。
图2是一标准曲线，它显示了向样品中加入各种量的内毒素后产生的结果。从曲线可以看出，本发明方法的灵敏性在10-0.75微微克内毒素/毫升的范围之内。
在这一实例所述的试验中，从保温混合物得到的凝固素原是直接偶联到微滴板上，如果存在任何内毒素的话，将存在低量的凝固素原，导致可测出与无内毒素对照相比结合抗体的减少。
图3-6显示在不同保温时间和LAL稀释条件下LAL（凝固素原）与内毒素反应的反应曲线。从曲线可以看出（1）在各种LAL稀释情况下，随着保温时间的增加，内毒素的可测性也增加。在较高的稀释度下增加得更迅速;（2）保温30分钟以后，1∶4及其以下的稀释情况下具有相同的可测性，且随着保温时间的增加，所有稀释的可测性的差别减少了;（3）在使用较高LAL稀释度的可测范围较宽。
将本发明的ELISA方法与火箭免疫电泳法（在43中所述）和常规的凝胶块法（在该方法中，将重组在无热原Tris-Mg＋＋冲液中的0.1毫升LAL与0.1毫升内毒素溶液在玻璃试管（10×75毫米）中混合。当形成的薄胶在试管倒置时仍然能够完整存在时，读作阳性，所有其它结果为阴性）进行了比较。其结果见表Ⅱ。
表Ⅱ
三种内毒素测定方法的比较
内毒素    LAL-ELISA    LAL-RIE    CLOT-GEL
（pg/ml）    A492纳米    火箭（厘米）    +或-
0    2.02    4.7    -
0.78    1.96    4.2    -
1.56    1.64    3.0    -
3.12    1.00    1.5    -
6.25    0.15    0    +
12.5    0.07    0    +
25    0.07    0    +
LAL的相对消耗    1/40    1/2    /
所需时间（小时）    4    6    /
定量    可以    可以    ？
对血浆的可应用性    可以    可以    ？
从表Ⅱ可以看出，新方法与火箭免疫电泳法相比更加优越，并且它能够检测出比用凝胶块法所能够检测出的要低8倍的内毒素浓度。
LAL-ELISA的优点之一就是，通过调整LAL的稀释度和保温时间，可以从一批商业LAL获得具有所需要的灵敏性的标准曲线。其灵敏性已达到0.1微微克（图6）。
随着LAL试验作为热原试验被正式采用，已证明了对于LAL试剂的大量需求。由于LAL的唯一来源是鲎（一种正在逐渐灭绝的无脊锥动物），因此发展一种将LAL的消耗降低到最低限度的敏感性LAL试验是非常重要的。高度灵敏的测定凝固素原的ELISA法（即使当最初的LAL稀释一万倍时其A492也达到2.0）提供了这种可能性，即在这一方法中可以使用极少量的LAL。据计算，考虑到LAL的量和稀释度，使用LAL-ELISA法所需要使用的LAL的量只是在凝胶块法中达到同样灵敏度所需要使用的LAL的量的1/160。通常，LAL-ELISA的灵敏性要比凝胶块法高出10倍，而它所需要的LAL只是后者的1/40。
除了对于LAL试剂的微量消耗外，LAL-ELISA也只需要非常少量的样品。完成一次试验，10微升样品就已足够，而其它LAL测定则通常需要100微升。在只能得到非常少量的样品的情况下，这一优点变得尤其显著。
实例4
临床样品中内毒素的测定
为了证明本发明方法能够测定血清样品中内毒素存在，且具有与在缓冲液中同样高的测定限度的能力，将USP参照标准内毒素（参见实例3）加到在水中10倍稀释的无脂多糖人血浆中，至其最终浓度为200微微克/毫升。对照是在无热原水中的内毒素。
加入脂多糖之后，对于三个不同样品分别进行65℃，15分钟，75℃、10分钟，100℃、5分钟的热处理。
利用相同稀释和加热过的无脂多糖血浆作为稀释剂，通过制备上面所得到的每种血浆溶液的系列稀释物，按照实际上与实例3中所述相同的方式完成试验。结果如图7所示，从它可以看出，对于脂多糖的定量测定来说，于75℃将血浆加热10分钟是最佳处理。在无内毒素水对照中观察到的A492值与在血浆样品中观察到的没有明显不同（在LAL-ELISA的变化范围之内），它表明这些样品中的内毒素水平低于4微微克内毒素/毫升（测定限度）并且LAL-ELISA不被血浆的颜色和浊度所干扰。获得的结果表明，本发明方法也可作为测定临床样品中内毒素存在的灵敏方法使用。
实例5
抗凝固素原的单克隆抗体的纯化
使用的方法与实例1所述的基本相同，只是用中国鲎变形细胞溶胞产物（TAL）代替LAL作为起始物，从TAL制备抗凝固素原的单克隆。抗体在实例3所述的ELISA试验中是有反应性的。
实例6
制备生物素-抗凝固素原单克隆抗体结合物
按下列方法将生物素与按实例1制得的抗凝固素原单克隆抗体结合：
将1毫升纯化单克隆抗体溶液（1毫克IgG/毫升）于4℃对100mM Na HCO3（pH8.0）过夜透析，然后与5微升N-羟基-琥珀酰胺生物素（40毫克/毫升;Sigma Chemical CO）混合。于室温下搅拌2小时后，将混合物在4℃对PBS（pH7.3）过夜透析。将结合物加到等量的甘油（87%）中，于-20℃保存。
这一结合物在ELISA方法中是这样使用的：向96孔微滴板的每孔加进100微升经稀释的LAL和标准内毒素的保温混合物（其制备如实例3所述），于室温下保温1小时。用实例3所述的洗涤缓冲液洗涤4次之后，加进100微升以1∶2000稀释在稀释缓冲液中的单克隆抗体一生物素结合物。保温1小时之后，冲洗平板4次。然后加进100微升1∶2000稀释在稀释缓冲液中的单克隆抗体-生物素结合物。保温1小时之后，冲洗平板4次。然后加进100微升1∶4000稀释在缓冲液中的抗生物蛋白-HRP结合物（Sigma Chemsieal Co.），保温1小时。洗涤平板4次后加入100微升底物溶液（如实例3所述）。保温10分钟之后，加入150微升1M H2SO4终止反应。测定A492处的吸收值。
使用HRP-单克隆抗体结合物的ELISA要比使用单克隆抗体-生物素结合物的ELISA少一个步骤（使用HRP-抗生物素蛋白），但生产生物素-单克隆抗体结合物要比生产HRP-单克隆抗体结合物容易得多，结合物保持在0℃以下时是稳定的。由于1毫克单克隆抗体充分完成2000个单个试验，所以单克隆抗体的使用并不造成LAL-ELISA花费过大。
实例7
利用ELISA测试各种不同的内毒素和（1-3）-β-D-葡聚糖
参照标准内毒素购于Whittaker    M.A.Bioproducts    Inc.（10毫微克/瓶）。来自明尼苏达沙门氏菌、大肠埃希氏菌0111∶B4、大肠埃希氏菌055∶B5、马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的纯化脂多糖（W）购于Difco    Laboratories（Detroit，Michigan）.大肠埃希氏菌J5和铜绿假单胞菌的高度纯化的脂多糖由Anders    Fomsgaard博士（Dept.Infectious    Diseases，Rigshospitalet    Cogenhagen）友好提供。
重建所有这些脂多糖，且稀释至浓度为1毫克/毫升，使用前一直于-20℃冰冻保存。准备检测之前，将脂多糖在无内毒素水中配成各种稀释度。所有的脂多糖检测完成两次，除非另有指示外，均取其平均值。
无内毒素的来自粪产碱菌（Alcaligenes    faecalis    var.myxogenes    IFO    13140）的（1-3）-β-葡聚糖（Curdlan，Wako    Pure    Chemical    lndustries，Ltd.，Osaka，Japan）按Obayashi等所述方法制备。其浓缩溶液于4℃保存，直至使用。
利用HRP-单克隆抗体结合物，按实例3所述的方法进行LAL-ELISA。
图8和9显示了8种纯化脂多糖和（1-3）-β-D-葡聚糖的LAL-ELISA的曲线。脂多糖曲线都显示出一陡斜面，且彼此平行，它暗示了虽然存在潜能的很大差别，但它们与LAL的反应具有内在的相似性。（1-3）-β-D-葡聚糖的潜能至少要低1000倍，且其反应曲线的斜面要比脂多糖的平得多，表明它与LAL的反应速度要慢得多。
已报道除内毒素的其它几种物质在高浓度时引起阳性反应（60，47）。已证明（1-3）-β-D-葡聚糖在1毫微克/毫升的浓度下能够与LAL反应，是接近内毒素的最有效物质（23）。但是，这一研究结果经常引起疑问，因为在被试验的物质中有可能存在内毒素的污染。在本研究中，利用LAL-ELISA对（1-3）-β-D-葡聚糖进行了选择性检查，且其反应性至少比内毒素低1000倍。而且，（1-3）-β-D-葡聚糖似乎是以一种本质上不同于内毒素的方式来行事，其证据为它与LAL的反应速度要低得多。这可能被Morita等（23）的发现所解释，即（1-3）-β-D-葡聚糖是以一种不同于内毒素的途经活化LAL。据信两种途经有一步是共同的，即凝固素原的活化。因此，两种途经中任何一种的活化都将导致凝固素原的断裂以及其抗原性的丧失。LAL-ELISA可能是一种进一步研究能够与LAL反应的物质的有用工具，因为内毒素和（1-3）-β-D-葡聚糖与LAL的反应能够被有力地区分。
实例8
血浆中内毒素的测定
将从被怀疑是患脓毒症的病人身上得来的静脉血吸入含有肝素（10IU/毫升血）的无内毒素玻璃管。将通过2000转/分离心15分钟制得的血浆在无内毒素水中稀释10倍，然后将其于75℃加热10分钟。接着按实例3所述方法进行LAL-ELISA，只是LAL是按生产者的需要重建。对于血浆中的内毒素，LAL-ELISA的测定限度为4微微克内毒素/毫升。扣除稀释因素，从标准曲线中计算出样品中内毒素浓度。
表Ⅲ显示了10个病人的血浆样品中内毒素的测定结果。这些脓毒性病人中的内毒素水平通常较低，且不总是与血液或脑脊髓液（CSF）的细菌培养物的结果相关。
1号病人有淋病感染史，且住院后被怀疑是脓毒症。无细菌生长，但发现血液中特定淋病抗体明显增加。4号病人血液和CSF中有革兰氏阳性细菌，且在住院4天后死于脓毒性休克。8号病人被怀疑是尿脓毒病，且有明显菌毒症。9号病人被怀疑是脑膜炎双球菌脓毒病，但是，因为服用前进行了青霉素处理，所以无细菌生长。
脓毒病人血液中存在非常低浓度的内毒素（表Ⅲ）表明需要灵敏的LAL试验，有趣的是，还没有发现正常血浆样品中含有的内毒素高于LAL-ELISA的测定限度（4微微克内毒素/毫升）。
总之，由于它的高灵敏性、受血浆干扰少、最小量地消耗LAL试剂和试验样品、良好的重复性以及容易完成，LAL-ELISA正成为用于内毒素临床测定的最有前途的LAL试验。
表Ⅲ
脓毒症病人血浆样品中内毒素的测定
病人    临床    血液培    CSF    LAL-ELISA    其它诊断标准
号    诊断    养物    培养物    微微克CSF/ml
1    淋病    无    无    200    发热、关节炎
脉管炎、
GAT    升高
2    骨髓瘤    铜绿假单    无    24
胞菌
3    脑膜炎    无    脑膜炎奈    28    皮肤有瘀斑，
化脓    氏球菌    脓毒
4    脑膜炎    肺炎链球    肺炎链球    20    肺中出现肺炎
化脓    菌    菌    克雷伯氏菌
5    脑膜炎    无    脑膜炎奈    8    皮肤中出现瘀
化脓    氏球菌    斑，脓毒
6    发热伤    S.typhosa    无    9
寒
表Ⅲ-续-
病人    临床    血液培    CSF    LAL-ELISA    其它诊断标准
号    诊断    养物    培养物    微微克CSF/ml
7    脑膜炎    脑膜炎奈    无    8    皮肤中出现瘀
化脓    氏球菌    斑、败血症
8    脑膜炎    无    无    8    皮肤中出现瘀
斑，脓毒
9    败血症    无    无    11    尿中大肠杆菌
＞10
10    脑膜炎    无    脑膜炎奈    9    皮肤中出现瘀
氏球菌    斑，脓毒
+淋症抗体滴度
实例9
人血浆内毒素灭活活性的检测
通过实例3所述的LAL-ELISA证明了人血清和血浆，鲎血浆，LAL和粘多菌素B能够对脂多糖进行剂量依赖性灭活。
将50微升每种试验样品（人血清和血浆，鲎血浆，LAL和多粘菌素B和50微升不同稀释在无菌水中的脂多糖（大肠杆菌0111∶B4）相继加到每个无内毒素的玻璃试管中。将每支试管中的成分充分混合后，于37℃保温1小时。上述溶液在无内毒素水中至少稀释1000倍，以达到脂多糖检测范围（1-100微微克/毫升），以及消除试验样品对后来的LAL试验可能产生的干扰。利用实例3所述的LAL与ELISA结合的凝固素原测定法完成残存脂多糖的定量测定。
所有检测至少独立进行两次，且取其平均值。
利用实例3所述的抗凝固素原单克隆抗体，通过LAL-ELISA测得，LAL与脂多糖的反应在吸收值与脂多糖浓度之间形成一线性曲线。即使血清样品稀释100倍，它对于反应的抑制也是明显的。但是，当血清稀释到250倍以上时，抑制作用完全消失。
图10显示了人血清、血浆、粘多菌素B和鲎血浆对于脂多糖的剂量依赖性灭活。未观察到人血和血浆的EIA50的不同。鲎血浆表现出比人血浆高得多的灭活脂多糖能力。
这些结果表明，实例3所述的LAL-ELISA可用于试验血浆对于内毒素的灭活作用。可给脓毒性病人服用这一检测中发现的具有高度中和内毒素能力的血浆，以促进恢复。
指导
通过按照Nahamura等（64）所公开的方法制备纯化的因子C，有可能测定内毒素对因子C的活化作用。然后按照实例1所述方法制备抗纯化因子C的单克隆抗体。再将这一单克隆抗体按实例1或6所述进行结合，且用于实例3所述的LAL-ELISA方法。
这一方法基本上与实例3所述的方法一致，只是测得的是因子C丧失抗原性而不是凝固素原，因为在与内毒素反应时，因子C转化为活性因子C。
通过按照Morita等（23）公开的方法制备纯化因子G，以及按照实例1或6所述方法制备和结合抗因子G的单克隆抗体，也有可能测出（1-3）-β-D-葡聚糖对因子G的活化作用。结合的单克隆抗体然后就可用在实例3所述的LAL-ELISA方法中。
期待着一旦抗因子C和G的单克隆抗体被制出，则就可以用三种不同的方法来测定在溶胞物中是否存在因子G，因子C和凝固素原。再者，还期待着用同样的微滴定板来进行这些试验，从而加块确定脓毒症患者的病因。
参考文献
1.Levin    J，Bang    F    B（1968）：的可凝固蛋白质：它的定位以及由内毒素引起的其凝固动力学。《Thromb.Diath.Haemorrh》19，186-197。
2.Levin    J，Bang    F    B（1964）：属细胞凝固素原的描述。《Bull.Johns.Hopkins    Hosp.》，115，337-345。
3.Bang    F    B（1958）：一种Limulas    Polyphermus的细菌性疾病。《Bull.Johns.Hopkins    Hosp.》，98，325-351。
4.Jorgensen    JH，Smith    RF（1974）：利用属检测测定结合和游离内毒素，《Proc.Soc.Exp.Biol.Med.》，146，1024-1031。
5.Fleishmen    J，Fowlkes    F（1982）：通过LAL试验测得的各种革兰氏阴性细菌细菌性内毒素热原性的比较。《Prog.Clin.Biol.Res.》，93，131-140。
6.Weary    ME、Donohue    G、Pearson    FC.Stony    k（1980）：通过变形细胞溶胞产物和USR兔热原试验测得的四种参照内毒素标准品的相对潜能。《Appl.Environ.Microbiol》40，1148-1151。
7.仪器和药物管理局1983：作为人和动物非肠道药物、生物产物和医学设备终产物内毒素试验的变形细胞溶胞产物试验合法性指导草案。《Pharmacopeial    Forum》9，3012-3021。
8.Solum    No（1973）：Limulus    polyphemus血细胞的凝固作用。该分子的凝固和未凝固形式的比较。《Thromb.Res.》2，55-70。
9.Lin    TY，Seid    RC    Jr，Tai    JY，Liang    S-M，Sakmar    TP，Robbins    JB（1979）：溶胞产物凝固系统研究。《Biomedical    Applications    of    the    Horseshoe    Crab（Limulidae）》（E.Copen编）147-158页，Alan    R.Liss，New    York。
10.Holme    R，Solum    No（1973）：通过limulus    polyphemus血细胞提取物的凝固形成的凝胶蛋白的电子显微学。《J.Ultrastructure    Res.》44，329-338。
11.Tai    JY，Seid    RC，Hukn    RD，Lui    TY（1977）鲎变形细胞溶胞产物研究。Ⅱ.凝固素原的纯化及其凝固机制。《J.Biol.Chem.》252，4773-4776。
12.Nakamura    S.Takagi    T，Twanaga    S，Niwa    M.Takahashi    K（1976a）：凝胶形成过程中产生于鲎凝固素原的片段的氨基酸序列研究：初级血纤维蛋白肽的同系物。《B.Biochem.and    Biophys.Res.Commun.》72，902-908。
13.Nakamura    S，Takagi    T，Iwanaga    S，Niwa    M，Takahashi    K（1976b）：来自鲎变形细胞的可凝固蛋白质（凝固素原）。其多肽链在凝胶形成过程中的结构变化。《J.Biochem》80，649-652。
14.Gaffin    SL（1976）：内毒素诱导的鲎溶解白细胞的凝固。I.凝块形成蛋白质的制备和鉴定。《Biorheologi》13，273-280。
15.Shishikura    F，Nakamura    S，Takahashi    K，SegiguchiK（1982）：基于血纤维蛋白肽样肽氨基改序列的鲎系统发育。《J.Exp    Zool.》223，89-91。
16.Tai    JY，Liu    TY（1977）：鲎变形细胞溶胞产物研究。I.凝固酶原的分离。《J.Biol.Chem》252，2178-2181。
17.Ohki    M，Nakamura    T，Morita    T，Iwanaga    S（1980）：一种与鲎血淋巴凝固系统相关的内毒素敏感新因子。《FEBS  Letters》120，217-220。
18.Nakamura    S，Levin    J（1982a）：鲎变形细胞溶胞产物的分级分离。凝固敏原被内毒素介导的活化因子活化的鉴定。《Biochim.Biophys.Acta.》707，217-225。
19.Nakamura    S，Levin    J（1982b）：内毒素介导的鲎凝固素原活化因子和以前未叙述的蛋白酶（蛋白酶N）的测定。《Biochem.Biophys.Res.Commun》108，1619-1623。
20.Liang    SM，Sakmar    TP，Lin    TY（1980）：鲎变形细胞溶胞产物研究、Ⅲ.来自鲎变形细胞细胞膜的内毒素结合蛋白质的纯化。《J.Biol.Chem》255，5586-5590。
21.Tanaka    S，Nakamura    T，Morita    T，Iwanaga    S（1982）：鲎抗脂多糖因子：一种抑制内毒素介导的鲎凝固系统活化的抗凝固剂。《Biochem.Biophys.Res.Commun》105，717-723。
22.Kakinuma    A，Asano    T，Torh    H，Sugino    Y（1981）：抗肿瘤（1-3）-β-D-葡聚糖对鲎变形细胞的胶凝作用。《Biochem.Bcophys.Res.Commun》101，434-439。
23.Morita    T，Tanaka    S，Nakamura    T，Iwanaga    S（1981）：在鲎变形细胞中新发现的一种（1-3）-β-D-葡聚糖介导的凝固途径。《FEBS    Letters》129，318-321。
24.Albaugh    BR，Chandler    CB（1982）：利用multiskan微平板读数器进行鲎变形细胞溶胞产物（LAL）检测的自动化方法学，183-194页，见Watson.Leuin    J.Novitsky    TJ（编），《内毒素及其用鲎溶胞产物试验对其检测》，Alan    R    ciss    Inc.，New    York。
25.Fujita    Y，Nakaharac（1982）：利用产色底物制备和应用新型内毒素测定药盒Purodich，172-182页，见Watson    S，Levin    J，Novitsky    TJ（编）《内毒素及其用鲎溶胞产物试验对其检测》Alan    R.Liss，lnc.New    York。
26.Nandan    R，Brown    DR（1977）：一种改进的体外热原试验：利用鲎变形细胞溶胞产物测定静脉液中内毒素污染的微微克。《J.Lab.Clin.Med.》89，910-918。
27.Dunczak    JA，Cotter    R.Dastoli    FR（1979）：利用比浊法定量测定内毒素，403-414页，见E.Cohen编《鲎的生物医学应用》.Alan    R.Liss，lnc，New    York。
28.Jorgenssn    JH，Reichler    AS（1982）：鲎变形细胞溶胞产物热原试验的自动化，《J.Parenter.Sci.Technol.》36，11-16。
29.Nowitsky    TJ，Ryther    SS，Case    M    J，Watson（1982）：Abbot    MS-2中非肠道药物的自动化LAL试验。《J.Parenter.Sci.Technol.》36，11-16。
30.Ditter    VB，Becker    K    P，Urbascheck    R，Urbascheck    B（1982）：在微滴定平板中完成光度鉴定的LAL反应动力学估计的血液和其它样品中内毒素的测定。《Prog.Clin.Biol    Res》93，385-392。
31.Frauch    P（1974）：作为改进的鲎内毒素试验的微方法的玻片试验，《J.Pharm.Scj》63，808-809。
32.Goto    H，Watanabe    M，Nakamura    S（1977）：单个鲎试验的研究，玻片法。《Jpn.J.Exp.Med.》47，523-524。
33.Goto    H，Nakamura    S（1979）：用于除去凝胶抑制剂的作为经过改进的具有新技术的鲎试验的干燥法。《Jpn.J.Exp.Med.》49，19-25。
34.Melvaer    KL，Fystro    D（1980）。经过改进的用于检测内毒素的鲎变形细胞溶胞产物微方法。《Sppl.Environ.Microbiol》43，493-494。
35.Flowers    D    J（1979）：利用鲎溶胞产物对内毒素进行检测的微技术。《Med.Lab.Sci》36，171-176。
36.Okuguchi    S（1978）：用于鲎溶胞产物试验的微方法的改进。《Microbiol    lmmunol.》22，113-121。
38.Kreeftenberg    JG，Loggen    F    IG，Van    Ramshorst    JD，Beuvery    EC（1977）：鲎变形细胞溶胞产物试验微方法及其在控制血清和疫苗中的应用。《Dev.Biol.Standard》34，15-20。
39.Gardi    A，Arpagaus    GR（1980）：经过改进的通过鲎变形细胞溶胞产物试验检测内毒素的微技术。《Anal.Biochem》109，382-385。
40.Prion    RB，Spagna    VA（1979）：一种微稀释方法对于内毒素的鲎溶胞产物检测法的适应。《J.Chin.Microbiol》10，394-395。
41.Harris    NS，Feinsteir    R（1979）：内毒素的LAL-珠检测，265-274页，见E.Cohen编《鲎的生物医学应用》，Alan    R.Liss，lnc.，New    York。
42.Munford    RS（1978）：内毒素活性的定量鲎溶胞产物检测：放射碘化凝固素原单体的凝集。《Anal.Biochem》91，509-515。
43.Beak    L（1983）：用于测定内毒素与鲎变形细胞产物之间反应的新的灵敏火箭免疫电泳检测。《J.Clin.Microbiol》17，1013-1020。
44.Elin    R    J，Wolff    SM（1973）：鲎变形细胞溶胞产物试验的非特异性：与多核苷酸和蛋白质的阳性反应。《J.Infect.Dis》128，349-352。
45.Wildfeuer    A，Heymer    B，Schleifer    KH，Haferkamp    O（1974）：用于测定内毒素的鲎试验的特异性研究。《Appl.Microbiol》28，867-871。
46.Brumson    KW，Watson    DW（1976）：鲎变形细胞溶胞产物与链球菌热原性外毒素的反应。禝nfect.lmmun.》14，1256-1258。
47.Mikami    T，Nagase    T，Matsumoto    T，Suzuki    S，Suzuki    M（1982）：被简单多糖胶凝的鲎变形细胞溶胞产物。《Microbiol    lmmunol》26，403-409。
48.Suzuki    M，Mikami    T，Matsumoto    T，Suzuki    S（1977）：被合成葡聚糖衍生物胶凝的鲎溶胞产物。《Microbiol.lmmunol.》21，419-425。
49.Platica    M，Harding    W，Hollander    VP（1978）：在鲎反应中模拟内毒素。《Expercentia》34，1154-1155。
50.Fine    DH，Kessler    RE，Tabak    LA，Shockman    GD（1977）：鲎溶胞产物的脂磷壁质的活性。《J.Dent.Res.》56，1500。
51.Seid    RC    Jr.，Smith    PF，Guevarra    G，Hochstein    HD，Barile    MF（1980）：支原体脂多糖（脂聚糖）的类内毒素活性。《lnfect.lmmun.》29，990-994。
52.Weinberg    JB，Smith    PF，Kahane    I（198）：细菌脂多糖和支原体脂聚糖：它们的诱导巨噬细胞介导的杀死肿瘤细胞能力和鲎变形细胞溶胞产物凝固能力的比较。《Biochem.Biophys.Res.Commun.》97，493-499。
53.Smith    SM，Hill    JO，Snyder    IS，Burrel    R（1978）：Muropolyspora    faeni的细胞壁部分的促有丝分裂能力。《Ann.Allergy》40，12-14。
54.Lewis    VJ，Thacher    L，Mitchell    SH（1979）：护被内毒素样活性的证明。《J.Gen.Microbiol》144，215-216。
55.Felton    SC，Prion    RB，Spagna    VA，Kreier    JP（1980）：利用鲎溶胞产物检测对伯氏疟原虫内毒素进行估计。《J.Parasitol》66，846-847。
56.Wexler    H，Oppenheim（1979）：来自的革兰氏阳性细菌单核细胞增生利斯特氏菌的内毒素样物质的分离、鉴定及其生物学特性。《lnfect.lmmun.》23，845-857。
57.Elin    R    J（1979）：鲎试验对于血液、CSF和滑液的临床利用，279-292页，见E.Cohen编《鲎的生物医学应用》。Alan    R.Liss，lnc.，New    York）。
58.Tubbs    H（1980）：人和鼠疟疾中的内毒素。《Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.》74，121-123。
59.Galloway    RE，Levin    J，Butler    T，Naff    GB，Golds    mith    GH，Saito    H，Awoke    S，Wallace    CK（1977）：炎症的蛋白质介质的活化以及回归热疏螺旋体感染中的内毒素血症症据。《Am.J.Med》63，933-938。
60.Bae    K    L，Hoiby    N，Hertz    JB，Espersen    F（1985）：经过定量免疫电泳研究的来自铜绿假单胞菌和今黄色葡萄球菌的可溶性抗原与鲎变形细胞产物间的相互反应。《J.Clin.Microbiol》22，229-237。
61.Jorgensen    JH（1986）：鲎变形细胞溶包产物的临床应用。见Proctor    RA编《内毒素手册4：内毒素休克的临床方面》。Elsevier，Sciencc    Publisher    B.V.，Amsterdem。
62.Wilson    MB和PK    Nakane，《免疫荧光及有关技术》（W.Knapp，H.Holubar和G.Wick编），Elsevier/North    Holland，Amsterdam，1978，215-221页。
63.Obayashi    T等：《Clinica    Chimica    Acta》149，1985，55-65页。
64.Nakamura    T，Morita    T和Iwanaga    S.：在鲎血细胞中发现的脂多糖敏感性丝氨酸蛋白酶酶原（因子C）。分离和鉴定。《Eur.J.Biochem》154，1986，511-521页。

Claims (26)

1、一种测定样品中内毒素或内毒素样物质存在的方法，它包括
a)将样品与鲎变形细胞溶胞产物或血淋巴成分或其合成类似物一起保温，如果样品中存在有任何内毒素或内毒素样物质，那么所说成分的性质将发生改变，从而不会发生与产生抗或实际只对准所说成分或其类似物或其免疫决定基的抗体的反应，或者是所说成分或其类似物与样品中的内毒素或内毒素样物质的反应产物将与产生抗或实际只对准所说反应产物或其免疫决定基的抗体发生反应，
b)将步骤a)产生的所说样品和所说成分或其类似物的保温混合物与一种产生抗或实际只对准所说成分或其类似物或其免疫决定基的抗体反应，从而使得抗体与混合物存在的任何所说成分或其类似物结合；或者是与一种产生抗或实际只对准所说反应产物或其免疫决定基的抗体反应，从而使抗体与混合物中存在的任何所说反应产物结合，
c)通过检测得自步骤b)的反应混合物中的任何结合抗体，来测定样品中任何内毒素或内毒素样物质的存在，如果抗体是一种产生抗或实际只对准所说成分或其类似物或其免疫决定基的抗体，则所测得的结合抗体量的减少表明样品中存在内毒素或内毒素样物质；如果抗体是一种产生抗或实际只对准所说反应产物或其免疫决定基的抗体，则所测得的结合抗体的增加表明样品中存在内毒素或内毒素样物质，
其条件是，步骤a)的样品与成分或其类似物保温后存在的任何所说成分或其类似或任何所说反应产物被偶联到固体支持物上，或所说抗体被偶联到一固体支持物上或偶联一已偶联固体支持物上的桥连分子上，或样品中存在的任何内毒素或内毒素样物质被偶联到固体支持物上。
2、如权利要求1所述的方法，其中鲎变形细胞溶胞产物或血淋巴的成分选自凝固因子（如因子C，因子G，因子N，凝固酶原，活化凝固酶，抗脂多糖因子或凝固素）和凝集素（或如limulin或polyphemin等外源凝集素），或其中所说成分或其类似物与所说样品中所说内毒素或内毒素样物质的反应产物选自凝固素，C-肽，活化凝固酶，活化因子B、C、G或N以及这些因子和凝固酶原的断裂产物。
3、如权利要求1所述的方法，其中内毒素或内毒素样物质是选自革兰氏阳性或阴性细菌、真菌、酵母和藻类等微生物的内毒素或表面抗原。
4、如权利要求1所述的方法，其中抗体是单一特异性抗体，多克隆抗体，单克隆抗体或两种或多种单克隆抗体的混合物。
5、如权利要求1所述的方法，其中抗体被提供了一种标记物，如选自酶，荧光或化学发光物质，发色团，放射性同位素和复合剂。
6、如权利要求1所述的方法，其中抗体被偶联到固体支持物上，或偶联到一已偶联到固体支持物上的桥连分子上，且在权利要求1的方法步骤a）样品与成分或类似物保温后剩下的任何所说成分被结合到抗体上，以与进一步量的抗体进行进一步反应。
7、如权利要求6所述的方法，其中固体支持物包括多聚体或被多聚体覆盖的基质。
8、如权利要求1所述的方法，它包括
a）将一种抗或实际只对准凝固素原或其免疫决定基的抗体，或抗或实际只抗凝固素或C-肽或免疫决定基的抗体，偶联到固体支持物上或偶联到一已偶联到固体支持物上的桥连分子上，
b）将含有凝固素原物质与样品一起保温，以便样品中存在内毒素或内毒素样物质时将凝固素原断裂为凝固素和C-肽，
c）将步骤b）的保温混合物加到固体支持物上，以便当偶联到固体支持物上的抗体是一种抗或实际上只对准凝固素原或其免疫决定基的抗体时与样品中存在的任何凝固素原结合，或当偶联到固体支持物上的抗体是一种抗或实际只对准凝固素或C-肽或其免疫决定的抗体时与样品中存在的任何凝固素或C-肽结合，
d）向固体支持物上加进一种抗或实际只对准凝固素原或其免疫决定基的标记抗体，以便于结合到固体支持物上存在的结合凝固素原上，或加进一种抗或实际只对准凝固素或C-肽或其免疫决定基的抗体，以便于结合到存在于固体支持物上任何结合凝固素原上，或结合到任何结合凝固素或C-肽上。
e）通过测定结合到步骤d）的固体支持物上的任何标记抗体来测定样品中任何内毒素或内毒素样物质的存在，如果抗体是一种抗或实际只对准凝固素原或其免疫决定基的抗体，则所测得的结合抗体的减少表明样品中存在内毒素或内毒素样物质;如果抗体是一种抗或实际只对准凝固素或C-肽或其免疫决定基的抗体，则所测得的结合抗体的增加表明样品中存在内毒素或内毒素样物质。
9、如权利要求1所述的方法，它包括
a）将样品与含有凝固素原的物质一起保温，以便样品中存在任何内毒素或内毒素样物质时将凝固素原断裂成凝固素和C-肽，
b）将步骤a）的保温混合物加到固体支持物上，以便于与混合物中存在的任何凝固素原结合，或与混合物中存在的任何凝固素或C-肽结合，
c）向固体支持物上加进一种抗或实际只对准凝固素原或其免疫决定基的抗体，让其与已结合到固体支持物上任何凝固素原结合，或加进一种抗或实际只对准凝固素或C-肽或其免疫决定基的抗体，让其与已结合到固体支持物上的任何凝固素或C-肽结合，
d）通过检测结合到步骤c）的固体支持物上的任何标记抗体的存在测定出样品中存在的任何内毒素或内毒素样物质，如果抗体是一种抗或实际只对准凝固素原或其免疫决定基的抗体，则测得的结合抗体量的减少表明样品中存在内毒素或内毒素样物质;如果抗体是一种抗或实际只对准凝固素或C-肽或其免疫决定基的抗体，则测得的结合抗体的增加表明样品中存在内毒素或内毒素样物质。
10、如权利要求1所述的方法，它包括
a）将抗或实际只对准凝固素原或其免疫决定基的抗体，或抗或实际只对准凝固素或C-肽或其免疫决定基的抗体，偶联到固体颗粒的表面，
b）将样品与含有凝固素原的物质一起保温，以便样品中存在任何内毒素或内毒素样物质时，将凝固素原断裂为凝固素和C-肽，
c）将步骤b）的保温混合物加到步骤a）的抗体中，以便当抗体是一种抗或实际只对准凝固素原或其免疫决定基的抗体时在凝固素原存在的情况下引起固体颗粒的凝集，或当抗体是一种抗或实际只对准凝固素或C-肽或其免疫决定基的抗体时，在凝固素或C-肽存在的情况下引起固体颗粒的凝集，
d）通过抗或实际只对准凝固素原或其免疫决定基的抗体偶联到其上的固体颗粒的凝集作用的存在，测定出样品中内毒素或内毒素样物质的存在，或者，通过抗或实际上只对准凝固素或C-肽或其免疫决定基的抗体偶联到其上的固体颗粒的凝集，测定样品中内毒素或内毒素样物质的存在。
11、一种抗或实际只对准鲎变形细胞溶胞产物或血淋巴成分或其合成类似物或其免疫决定基的单克隆抗体。
12、如权利要求11所述的单克隆抗体，其中鲎变形细胞产物或血淋巴成分选自凝固因子（如因子B，因子C，因子N，凝固酶原，活化凝固酶，抗脂多糖因子或凝固素原）和凝集素（如limulin或polyphemin等外源凝集素）。
13、一种单克隆抗体，它是一种抗或实际只对准鲎变形细胞溶胞产物或血淋巴成分或其合成类似物与内毒素或内毒素样物质反应的反应产物的抗体，或是一种抗所说反应产物的免疫决定基的抗体。
14、如权利要求13所述的单克隆抗体，其中所说的反应产物选自凝固素，C-肽，活化凝固酶，活化因子B、C、G或N或这些因子和凝固酶原的断裂产物。
15、如权利要求11或13所述的单克隆抗体，其中给抗体提供了一种标记物，如选自酶，荧光或化学发光物质，发色团，放射性同位素和复合剂。
16、如权利要求11或13所述的单克隆抗体，其中抗体被偶联到固体支持物上，或被偶联到已偶联到固体支持物上的桥连分子上。
17、产生如权利要求11～16中任何一项所述的单克隆抗体的方法，包括
a）用基本上由鲎变形细胞溶胞产物或血淋巴成分或其合成类似物或其免疫决定基组成的抗原，或者是基本上由所说成分或类似物与内毒素或内毒素样物质或其免疫决定基反应的反应产物组成的抗原，免疫合适动物或合适动物细胞，以获得产生抗所说抗原的抗体的细胞，
b）将产生抗所说抗原的抗体的细胞与合适细胞系的骨髓瘤细胞融合，
c）选择和克隆所得的产抗体杂交瘤细胞，
d）在合适的培养基中培养杂交瘤细胞，以产生所说抗体。
18、一种测定样品中内毒素或内毒素样物质存在的试验药盒，该药盒包括
a）一种抗或实际只对准鲎变形细胞溶胞产物或血淋巴成分或其合成类似物或其免疫决定基的抗体，或者是一种抗或实际只对准所说成分或类似物与内毒素或内毒素样物质的反应的反应产物的或其免疫决定基的抗体，
b）鲎变形细胞溶胞产物或血淋巴成分，或其合成类似物。
19、如权利要求18所述的药盒，其中鲎变形细胞溶胞产物或血淋巴成分选自凝固因子（如因子B，因子C，因子N，凝固酶原，活化凝固酶，抗脂多糖因子或凝固素）和凝集素（如limulin或polyphemin等外源凝集素）。
20、如权利要求18所述的药盒，其中抗体是单一特异性抗体，多克隆抗体，单克隆抗体，或两种或多种单克隆抗体的混合物。
21、如权利要求18所述的药盒，其中抗体被提供了一种标记物，如选自酶，荧光或化学发光物，发色团，放射性同位素和复合剂。
22、如权利要求18所述的药盒，它包括一固体支持物。
23、如权利要求22所述的药盒，其中固体支持物包括一多聚体或多聚体结合到其上的基质。
24、如权利要求18所述的药盒，它包括标记和未标记两种抗体。
25、如权利要求18所述的药盒，它进一步包括一内毒素标准品。
26、如权利要求18所述的药盒，它进一步包括无热原水。
CN88102960A 1987-05-20 1988-05-20 一种测定样品中内毒素存在的方法 Expired CN1018674B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK255887A DK255887D0 (da) 1987-05-20 1987-05-20 Immunoassay
DK2558/87 1987-05-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1030138A true CN1030138A (zh) 1989-01-04
CN1018674B CN1018674B (zh) 1992-10-14

Family

ID=8113187

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN88102960A Expired CN1018674B (zh) 1987-05-20 1988-05-20 一种测定样品中内毒素存在的方法

Country Status (14)

Country Link
US (2) US5316911A (zh)
EP (1) EP0291856B1 (zh)
JP (1) JP2667695B2 (zh)
CN (1) CN1018674B (zh)
AT (1) ATE116444T1 (zh)
AU (1) AU611456B2 (zh)
CA (1) CA1340436C (zh)
DE (1) DE3852568T2 (zh)
DK (1) DK255887D0 (zh)
ES (1) ES2069535T3 (zh)
FI (1) FI95627C (zh)
IL (1) IL86375A (zh)
PT (1) PT87524B (zh)
WO (1) WO1988009507A1 (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1063489C (zh) * 1993-06-29 2001-03-21 生化学工业株式会社 新多肽及编码该多肽的dna
CN102124124A (zh) * 2008-08-18 2011-07-13 拜奥泰克公司 增强的内毒素检测
CN102590514A (zh) * 2012-01-10 2012-07-18 广州市疾病预防控制中心 一种检测地沟油的方法及试纸与应用
CN103562724A (zh) * 2011-02-28 2014-02-05 生化学工业株式会社 用于测量内毒素的试剂
US9040254B2 (en) 2006-07-07 2015-05-26 Seikagaku Corporation Methods for detecting an endotoxin using a horseshoe crab clotting enzyme
CN107727863A (zh) * 2017-09-14 2018-02-23 三峡大学 酵母浸出物中内毒素含量的检测方法
CN110068692A (zh) * 2014-06-12 2019-07-30 海格罗斯投资有限责任公司 解蔽溶液中的内毒素
CN111638346A (zh) * 2015-07-28 2020-09-08 博斯特尔莱布尼茨林根岑特鲁姆研究中心 用于测定内毒素的改善的细菌内毒素测试

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5594113A (en) * 1988-06-23 1997-01-14 Associates Of Cape Cod, Inc. Endotoxin binding and neutralizing protein and uses thereof
GB9009761D0 (en) * 1990-05-01 1990-06-20 Secr Defence Substrate regenerating biosensor
JP2944709B2 (ja) * 1990-06-21 1999-09-06 生化学工業株式会社 （１→３）―β―Ｄ―グルカンの測定剤
US5198339A (en) * 1990-07-13 1993-03-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Method for detection of gram-negative bacterial lipopolysaccharides in biological fluids
JP2944721B2 (ja) * 1990-08-22 1999-09-06 生化学工業株式会社 エンドトキシンの測定剤
DE69129365T2 (de) * 1990-08-22 1998-10-08 Seikagaku Kogyo K K Seikagaku Testagens für endotoxin
JP3322700B2 (ja) * 1992-09-14 2002-09-09 生化学工業株式会社 固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤
CA2112776C (en) * 1993-01-21 2002-11-12 Masakazu Tsuchiya Process for inhibiting activity of endotoxin
JP3242733B2 (ja) * 1993-02-26 2001-12-25 生化学工業株式会社 エンドトキシン特異的測定剤
US5496700A (en) * 1993-08-06 1996-03-05 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Optical immunoassay for microbial analytes using non-specific dyes
SG107125A1 (en) * 1994-08-19 2004-11-29 Univ Singapore Expression of carcinoscorpius rotundicauda factor c in eukaryotes
SG107124A1 (en) * 1994-08-19 2004-11-29 Univ Singapore Expression of carcinoscorpius rotundicauda factor c in eukaryotes
US5716834A (en) * 1994-08-19 1998-02-10 National University Of Singapore Cloned factor C cDNA of the Singapore horseshoe crab, Carcinoscorpius rotundicauda and purification of factor C proenzyme
US5610075A (en) * 1995-01-17 1997-03-11 Stahl-Rees; Marianne Competitive electrochemiluminescence assays for endotoxins using a ruthenium label
US5610023A (en) * 1995-03-31 1997-03-11 Lee Laboratories, Inc. Method of purification of clostridium difficile toxin A and production of mono-specific antibodies
EP0739981A1 (en) * 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
US5773306A (en) * 1996-05-24 1998-06-30 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and kits for the detection of endotoxin
US6270982B1 (en) 1997-10-09 2001-08-07 Charles River Laboratories Methods and compositions for the detection of bacterial endotoxins
US5965374A (en) * 1997-10-16 1999-10-12 Biowhittaker Technologies, Inc. Glucan-specific assay
GB9807814D0 (en) * 1998-04-09 1998-06-10 Allied Therapeutics Limited Solid phase test for endoxin
US7078224B1 (en) * 1999-05-14 2006-07-18 Promega Corporation Cell concentration and lysate clearance using paramagnetic particles
US6194562B1 (en) 1998-04-22 2001-02-27 Promega Corporation Endotoxin reduction in nucleic acid purification
DE19931276C2 (de) * 1999-07-07 2002-10-24 Hans-Martin Seipp Verfahren zur Herstellung von Probenkörpern mit Biofilmbeladung und Verfahren zur Quantifizierung der Beladung von Probenkörpern mit Biofilm sowie die Verwendung der mit dem Herstellverfahren geschaffenen Probenkörpern
JP3096737B1 (ja) * 1999-07-19 2000-10-10 工業技術院長 ヒト・動物細胞培養液
US20020199218A1 (en) * 1999-08-19 2002-12-26 Daphne Goring Proline-rich extensin-like receptor kinases
US20090087450A1 (en) * 2000-01-11 2009-04-02 Greenville Hospital System Combination therapy of hybrid cells with BCG injection for treating Cancer Patients
CA2364983A1 (en) * 2000-12-13 2002-06-13 John R. Coleman Nucleic acid molecules and polypeptides for catabolism of abscisic acid
US7597895B2 (en) * 2001-02-20 2009-10-06 The Governing Council Of The University Of Toronto Signal peptides, nucleic acid molecules and methods for treatment of caries
US7556807B2 (en) 2001-02-20 2009-07-07 Kane Biotech, Inc. Signal peptides, nucleic acid molecules and methods for treatment of caries
US20020173042A1 (en) * 2001-03-16 2002-11-21 Timothy Oolman Method of tagging agricultural products
US7329538B2 (en) 2003-03-17 2008-02-12 Charles River Laboratories, Inc. Methods and compositions for the detection of microbial contaminants
US20050026239A1 (en) * 2003-04-18 2005-02-03 Associates Of Cape Cod, Inc. Kit for detecting endotoxin in aqueous solutions
US20050048655A1 (en) * 2003-04-18 2005-03-03 Novitsky Thomas J. Kit for detecting endotoxin
US8450079B2 (en) * 2003-10-31 2013-05-28 Immunetics, Inc. Method for detecting bacteria
CN1327227C (zh) * 2003-11-28 2007-07-18 凌沛学 一种检测玻璃酸钠原料的细菌内毒素含量的方法
JP2008522640A (ja) * 2004-12-02 2008-07-03 チャールズ リバー ラボラトリーズ， インコーポレイテッド グラム陽性菌夾雑物の検出および／または定量化のための方法ならびに組成物
DE602006004553D1 (de) 2005-01-13 2009-02-12 Charles River Lab Inc Verfahren zur klassifizierung von mikroben in einer biologischen probe
JP2009500019A (ja) * 2005-07-01 2009-01-08 プロメガ・コーポレーション 生体分子の精製のための浮遊性粒子のネットワーク、及び生体分子の精製のための浮遊性粒子又は浮遊性粒子のネットワークの使用
EP1963526A4 (en) * 2005-12-09 2009-11-18 Promega Corp PURIFICATION OF NUCLEIC ACID WITH A BINDING MATRIX
WO2009048350A1 (fr) 2007-10-12 2009-04-16 Gosudarstvennoe Uchrezhdenie Nauchny Tsentr Serdechno-Sosudistoi Khirurgii Im. A.N. Bakuleva Rossiiskoi Academii Meditsinskikh Nauk Agent de diagnostic pour déterminer la présence d'une endotoxine générale (lipolysaccharide lps) de bactéries gram négatif et du genre et type de bactéries gram négatif produisant des endotoxines, procédé de fabrication de cet agent de diagnostic et kit correspondant
WO2009063840A1 (ja) * 2007-11-12 2009-05-22 Hiroshima University エンドトキシンの濃度測定方法および濃度測定用キット
JP5249576B2 (ja) * 2007-12-19 2013-07-31 興和株式会社 エンドトキシンの測定方法及びエンドトキシンの測定用試薬キット
WO2009137244A1 (en) * 2008-04-15 2009-11-12 Charles River Laboratories, Inc. Cartridge and method for sample analysis
JP2009294113A (ja) * 2008-06-05 2009-12-17 Kowa Co エンドトキシン測定方法、エンドトキシン測定用キット及び、エンドトキシン測定装置。
JP5437660B2 (ja) 2009-02-19 2014-03-12 興和株式会社 コアギュロゲン原料及びその製造方法、それを用いた生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置
CA2766272C (en) 2009-06-26 2021-02-09 Soricimed Biopharma Inc. Soricidin derived peptides and methods for the detection of trpv-6 cancers and drug delivery
US8039613B2 (en) 2009-08-28 2011-10-18 Promega Corporation Methods of purifying a nucleic acid and formulation and kit for use in performing such methods
US8222397B2 (en) * 2009-08-28 2012-07-17 Promega Corporation Methods of optimal purification of nucleic acids and kit for use in performing such methods
JP5629306B2 (ja) * 2010-02-26 2014-11-19 興和株式会社 生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定用試薬キット
JP5620257B2 (ja) * 2010-12-24 2014-11-05 積水化学工業株式会社 微生物夾雑物検出容器、微生物夾雑物検出システム、並びに、微生物夾雑物の検出方法
GB201312635D0 (en) * 2013-07-15 2013-08-28 Univ Plymouth Water testing

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4281061A (en) * 1979-07-27 1981-07-28 Syva Company Double antibody for enhanced sensitivity in immunoassay
US4414336A (en) * 1981-01-28 1983-11-08 The Green Cross Corporation Method for preparing sample for use in endotoxin test
JPS5885162A (ja) * 1981-11-16 1983-05-21 Seikagaku Kogyo Co Ltd エンドトキシン測定法
US4520111A (en) * 1982-03-08 1985-05-28 Research Corporation Diagnostic method for determining content of sialic acid or sialoprotein
CA1236396A (en) * 1983-04-01 1988-05-10 Ryozo Numazawa Endotoxin-detecting device
US4717658A (en) * 1985-12-03 1988-01-05 Miles Inc. Gram negative bacteria screening method with horseshoe crab amebocyte lysate (LAL)
DE68925275T2 (de) * 1988-06-23 1996-08-22 Ass Cape Cod Inc Endotoxin-bindeprotein und dessen verwendung

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1063489C (zh) * 1993-06-29 2001-03-21 生化学工业株式会社 新多肽及编码该多肽的dna
US9040254B2 (en) 2006-07-07 2015-05-26 Seikagaku Corporation Methods for detecting an endotoxin using a horseshoe crab clotting enzyme
CN102124124B (zh) * 2008-08-18 2014-09-03 拜奥泰克公司 增强的内毒素检测
CN102124124A (zh) * 2008-08-18 2011-07-13 拜奥泰克公司 增强的内毒素检测
CN103562724A (zh) * 2011-02-28 2014-02-05 生化学工业株式会社 用于测量内毒素的试剂
CN103562724B (zh) * 2011-02-28 2016-10-05 生化学工业株式会社 用于测量内毒素的试剂
CN106432457A (zh) * 2011-02-28 2017-02-22 生化学工业株式会社 用于测量内毒素的试剂
CN102590514B (zh) * 2012-01-10 2014-06-04 广州市疾病预防控制中心 一种检测地沟油的方法及试纸与应用
CN102590514A (zh) * 2012-01-10 2012-07-18 广州市疾病预防控制中心 一种检测地沟油的方法及试纸与应用
CN110068692A (zh) * 2014-06-12 2019-07-30 海格罗斯投资有限责任公司 解蔽溶液中的内毒素
CN110068692B (zh) * 2014-06-12 2023-04-14 海格罗斯投资有限责任公司 解蔽溶液中的内毒素
CN111638346A (zh) * 2015-07-28 2020-09-08 博斯特尔莱布尼茨林根岑特鲁姆研究中心 用于测定内毒素的改善的细菌内毒素测试
CN107727863A (zh) * 2017-09-14 2018-02-23 三峡大学 酵母浸出物中内毒素含量的检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPH02504308A (ja) 1990-12-06
ATE116444T1 (de) 1995-01-15
ES2069535T3 (es) 1995-05-16
WO1988009507A1 (en) 1988-12-01
EP0291856B1 (en) 1994-12-28
IL86375A (en) 1992-06-21
FI895505A0 (fi) 1989-11-17
PT87524B (pt) 1992-09-30
AU611456B2 (en) 1991-06-13
US5316911A (en) 1994-05-31
PT87524A (pt) 1989-05-31
DE3852568T2 (de) 1995-08-03
CA1340436C (en) 1999-03-16
IL86375A0 (en) 1988-11-15
DE3852568D1 (de) 1995-02-09
EP0291856A2 (en) 1988-11-23
FI95627C (fi) 1996-02-26
EP0291856A3 (en) 1990-10-10
FI95627B (fi) 1995-11-15
US5591628A (en) 1997-01-07
JP2667695B2 (ja) 1997-10-27
CN1018674B (zh) 1992-10-14
AU1943488A (en) 1988-12-21
DK255887D0 (da) 1987-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1030138A (zh) 一种测定样品中内毒素存在的方法
CN1268637C (zh) 衣原体蛋白、其基因序列及用途
CN86103610A (zh) 免疫复合物的检测方法和步骤
CN1129984A (zh) 可溶性纤维蛋白多聚体的免疫测定
CN1646910A (zh) 白血病、前白血病或非白血病性恶性血液疾病的判定方法以及诊断药
CN1685236A (zh) N－11端截短的β－淀粉样蛋白的单克隆抗体、组合物、方法和用途
CN1806053A (zh) 对蛋白的结构同工型特异的配体的鉴定方法
CN1811447A (zh) 核酸薄膜层析快速检测方法及其试纸条及其用途
CN1646152A (zh) 甘露糖结合凝集素及其应用
CN1274424A (zh) 丙型肝炎病毒的测定方法
CN101076730A (zh) 通过筛选人或动物组织、血液或体液中的海帕西啶来诊断疾病的方法,以及该方法的治疗性用途
CN1590409A (zh) 针对sars冠状病毒n蛋白抗原的抗体及其在sars冠状病毒或者其抗原检测中的用途
CN1144047C (zh) 检测或确定丙型肝炎病毒核心蛋白的方法及其中应用的用于检测或确定的试剂
CN102964435B (zh) 截短型溶血链球菌溶菌素o及利用其的检测试剂盒
Arribas et al. Autoantibodies against the multicatalytic proteinase in patients with systemic lupus erythematosus.
CN101031581A (zh) 克隆氏病抗体表位肽和检测克隆氏病的试剂
CN1167796C (zh) 来自角蝇的抗凝血酶核苷酸和蛋白质
Krywienczyk et al. Serological relationship of viruses from some lepidopterous insects
CN101039693A (zh) 鉴定病毒感染和疫苗接种的生物
CN1833168A (zh) 用于检测饲料酶的试剂、方法和试剂盒
CN1158623A (zh) 新的免疫避孕肽
JP5330294B2 (ja) 抗ｌｃａｔ抗体及びｌｃａｔの測定方法
CN1134552A (zh) 淋病快速诊断药盒及其生产工艺
CN1168176A (zh) 以蛋白质a对癌症的诊断
CN1910197A (zh) 用于诊断和治疗利什曼病的多肽

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C13 Decision
GR02 Examined patent application
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C15 Extension of patent right duration from 15 to 20 years for appl. with date before 31.12.1992 and still valid on 11.12.2001 (patent law change 1993)
OR01 Other related matters
C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee