JP2008522640A - グラム陽性菌夾雑物の検出および/または定量化のための方法ならびに組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2004年12月2日出願の米国特許出願第60/632,785号(その全体は、本明細書中に参考として援用される)に基づく利益および優先権を主張する。
本発明は、一部、National Aeronautics and Space Administrationからの助成金番号NAG 2−1263に基づく政府支援によってなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、一般に、サンプル中のグラム陽性菌検出および/または定量化するための方法ならびに組成物に関する。より具体的には、本発明は、サンプル中のグラム陽性菌検出および/または定量化するのに有用な、血液細胞ベースの調製物、ならびにこのような調製物を作製および使用する方法に関する。
例えば、グラム陽性菌、グラム陰性菌、酵母、真菌、および糸状菌による微生物汚染は、重篤な疾患を引き起こし得、いくつかの場合では、ヒトに死すらも引き起こす。特定の産業(例えば、製薬産業、医療デバイス産業、および食品産業)における製造業者は、厳しい基準を満たして、彼らの製品があるレベルの微生物夾雑物を含まない(さもなければ、レシピエントの健康状態を損なう)ことを確認しなければならない。これらの産業は、特定の基準(例えば、米国食品医薬品局(USFDA)または環境保護局によって課される基準)を満たすために、このような微生物夾雑物の存在に関して、頻度が高く、正確で、かつ感度の高い試験を要する。例えば、USFDAは、医薬品および侵襲性医療デバイスの特定の製造業者に、彼らの製品が、検出可能なレベルのグラム陰性菌のエンドトキシンを含まないことを確証するように求めている。
本発明は、一般に、リポテイコ酸(グラム陽性菌の細胞壁内に見出される分子)の存在および/または量を検出するのに有用な方法および組成物を提供する。この情報は、グラム陽性菌が試験サンプル中に存在するか否かを決定するために使用され得、そしてまた、試験サンプルにおける汚染の程度を測定するために使用され得る。
本発明は、一部、陽性菌中またはグラム陽性菌上に存在するリポテイコ酸と反応する血液細胞ベースの調製物を生成することが可能であるという知見に基づく。結果として、本発明の血液細胞調製物は、試験サンプル中のグラム陽性菌の存在を検出および/または定量化するために使用され得る。
考察された通り、上記血液細胞は、Cancer属に属するカニ(例えば、Cancer borealis、Cancer irratus、Carcinus maenas、Hemigrapsus sanguineus(イソガニ(Japanese Shore Crab)))、Limulus属に属するカニ(例えば、Limulus polyphemus)、Tachypleus属に属するカニ(例えば、Tachypleus gigas、例えば、Tachypleus tridentatus)、およびCarcinoscorpius属に属するカニ(例えば、Carcinoscorpius rotundicauda)より選択される種々の異なる甲殻類動物から回収され得る。
試験サンプル中のグラム陽性菌の存在を検出することに特異的なアッセイは、本発明の血液細胞ベースの調製物を用いて用意され得る。種々の型のアッセイが、上記調製物を用いて行われ得るが、下で考察される通り、本発明のアッセイの各々は、一般に、フェノールオキシダーゼの基質の存在下において、その調製物と、試験サンプルとを接触させる工程を包含する。フェノールオキシダーゼ基質としては、例えば、硫酸イソプレナリン(I0261、TCI−GR、Tokyo、Japan)、イソプロテレノールヘミ硫酸塩(isoproternol hemisulfate salt)(I−5752、Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)、カテコール(C−9510、Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)、4−メチルカテコール(M3,420−0 Aldrich Chemical Company Inc.、Milwaukee、WI)、L−ドーパ(D−9628、Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)、ドパミン(H−8502、Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)、および2’,7’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(D−399、Molecular probes、Eugene、OR)が挙げられる。
本発明の実施に有用な例示のカートリッジは、図4A〜4Dにおいて概略的に示される。一般に、上記カートリッジは、血液細胞調製物ベースのアッセイに使用するための固定化された血液細胞調製物を含む光学カートリッジである。これらのカートリッジは、単独で使用されてもよいし、光学検出器(例えば、携帯型光学検出器)と一緒に使用されてもよい。本発明の方法は、上記カートリッジを使用せずに実施され得るが、本発明の方法は、迅速な試験結果を提供するために現場で使用され得るシステムを提供するために、上記カートリッジに合わせられる場合に特に有効である。このことは、微生物汚染のより迅速な排除および/または処置を促進する。
例示のカートリッジを製造するにあたって、その血液細胞調製物を固体支持体の上で乾燥させる前に、その血液細胞調製物およびフェノールオキシダーゼ基質を、少なくとも1種の再可溶化剤(例えば、糖または塩)および少なくとも1種の剥離防止剤(例えば、ポリマー)と組み合わせることは、助けになる。
そのカートリッジは、流体(例えば、哺乳動物に、局所的または全身に(例えば、非経口的に)投与されるべき流体)、または感染について試験される体液(例えば、血液、リンパ液、尿、血清、血漿、腹水、肺吸引液などが挙げられる)における微生物汚染のレベルを決定するために使用され得る。さらに、そのカートリッジは、上水道(例えば、飲料水の供給)における微生物汚染のレベルを決定するために使用され得る。さらに、そのカートリッジは、食品、医薬品または医療デバイスにおける微生物汚染のレベルを決定するために使用され得る。さらに、そのカートリッジは、表面上の微生物汚染のレベルを決定するために使用され得る。例えば、目的の表面は、拭かれ、次いでそのスワブは、液体に導入されるか、または溶解される。次いでその液体は、通常通りにアッセイされ得る。
種々の血液細胞調製物ベースのアッセイが、本発明のカートリッジにおいて使用され得ることが予測される(例えば、エンドポイント色素形成アッセイ、1工程動的アッセイ、および多工程動的アッセイ)。
エンドポイント色素形成アッセイは、Prior(1990)前出,pp.28−34ならびに米国特許第4,301,245号および同第4,717,658号に記載される。簡潔には、そのエンドポイント色素形成アッセイは、以下の工程を包含する:(i)血液細胞調製物を分析されるべきサンプルで可溶化する工程、(ii)その得られた混合物を、約0〜約40℃、好ましくは約25〜約40℃の温度で、所定の時間範囲にわたってインキュベートする工程、(iii)基質(例えば、フェノールオキシダーゼ基質)を含む試験デバイスと、そのインキュベートされたサンプル−血液細胞調製物混合物とを接触させる工程、(iv)反応インヒビターを添加する工程、および(v)酵素活性によってその基質から生成された物質を、例えば、比色変化によって測定する工程。
1工程動的アッセイ(例えば、1工程色素形成アッセイ)は、米国特許第5,310,657号に記載される。簡潔には、その動的色素形成アッセイは、以下の工程を包含する:(i)血液細胞調製物を、分析されるべきサンプルおよび基質(例えば、フェノールオキシダーゼ基質)で同時に可溶化する工程、(ii)その得られた混合物を、約0〜約40℃、好ましくは約25〜約40℃の温度で、所定の時間範囲にわたってインキュベートする工程、および(iii)従来の分光光度計を使用して、所定の値または比色読み取り値の変化の比率のいずれかに達するために、比色変化に要した時間を測定する工程。
より詳細に議論されるように、そのカートリッジはまた、多工程動的アッセイを行うために使用され得る。その多工程動的アッセイに関連する種々の工程は、図6に概略的に示される。そのアッセイは、その試験されるべきサンプルとある容量の血液細胞調製物とを合わせて、サンプル−血液細胞調製物混合物を生成することによって、開始される。次いで、その混合物は、所定の期間にわたってインキュベートされる。そのサンプル−溶解物混合物は、次いで、基質(例えば、フェノールオキシダーゼ基質)と接触させて、サンプル−血液細胞調製物−基質混合物を生成する。その後、光学特性の所定の変化(例えば、吸光度値における特定の変化または透過率値における特定の変化)が生じる時間が測定される。微生物夾雑物の存在および/または量は、次いで、予め較正された標準曲線(例えば、光学特性(吸光度または透過率)における所定の変化を起こす時間をY軸上に、対してリポテイコ酸濃度をX軸上に示す標準曲線)に対して、その測定された時間を内挿することによって、決定され得る。
リポテイコ酸反応性材料の調製を、以下の方法によってCancer borealis血液細胞から作製した。
このアッセイにおいて、1工程動的アッセイを、マイクロタイタープレートにおいて行った。このアッセイにおいて、リポテイコ酸(LTA)(L2515、Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)を、標準曲線を与えるように希釈した。その標準曲線は、0.2MのTris緩衝液(pH7.4)における、60μg/mLから始まり0.74μg/mLまでの3倍連続希釈物を含んだ。Tris緩衝液(0.2M、pH7.4)を、ネガティブコントロールとして使用した。比較可能な標準曲線もまた、ペプチドグリカン(77140、Fluka、Switzerland)、グルカン(グルカン標準、Charles River Endosafe、Charleston、SC)およびリポ多糖類(L−2637、Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)を使用して作成した。
この実施例において、実施例1に従って生成したCancer borealis調製物を、試験サンプル中のグラム陽性菌の存在を検出するために使用した。具体的には、この実施例において、その調製物の反応性を、種々のグラム陽性菌(Staphylococcus.epidermidis、Bacillus subtilis、Bacillus pumilus、Bacillus megateriumおよびDeinococcus radioduransを含む)、グラム陰性菌(Escherichia coli、Pseudomonas stutzeri、Sphingomonas subarcticaを含む)、放線菌属(Nocardiopsis antarticaを含む)、および真菌(Aureobasidium pullulans)に対して試験した。
この実施例は、Limulus polyphemus血液細胞が、グラム陽性菌の存在を検出し得るリポテイコ酸反応性材料を含むことを示す。血液を、Limulus polyphemusから収集し、そして上記リポテイコ酸反応性材料を、実施例1に記載した通りに生成した。
この実施例において、実施例1に由来するCancer borealis調製物を、カートリッジに組み込み、そして2工程動的アッセイにおいて使用した。異なる濃度のリポテイコ酸(LTA)(L2515、Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)(0μg/mL、5.6μg/mL、16.7μg/mLおよび50μg/mL)に対するC.borealis調製物の反応性を、Endosafe−PTS(Portable Test System)(Charles River Laboratories、Charleston、SC)を使用するカートリッジにおいて試験した。
実施例1の教示に従って作製したCancer borealis調製物は、グラム陽性菌の存在を検出し得るが、グラム陰性菌、酵母および糸状菌を検出しない。グラム陽性菌、グラム陰性菌、ならびに酵母および糸状菌を検出し得る調製物が望ましい限り、このような調製物を、実施例1のCancer borealis調製物(グラム陽性菌と反応性である)と粗Limulusアメーバ様細胞溶解物(グラム陰性菌ならびに酵母および糸状菌と反応性である)とを合わせることによって作製することが、可能である。
この実施例は、蛍光フェノールオキシダーゼ基質がウェル型の様式における1工程動的アッセイに使用され得ることを示す。
実施例4は、リポテイコ酸反応性材料がカルシウムイオノフォアによって透過可能にしたLimulus polyphemus血液細胞から回収され得ることを示す。この実施例は、リポテイコ酸反応性材料がまた粗Limulus polyphemus血液細胞溶解物に存在することを示す。
本発明は、その趣旨および本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態において具現化され得る。前述の実施形態は、従って、全ての点において、本明細書に記載される発明を限定するのではなく、例示であるとみなされるべきである。よって、本発明の範囲は、前述の説明によって示されるのではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味および均等の範囲内に入る全ての変化は、その範囲内に包含されると解釈される。
本願において列挙される全ての出版物および特許文書は、あたかもそれぞれ個々の出版物または特許文書の内容全体が本明細書中に援用されることと同じ範囲に対する全ての目的のために、その全体が参考として援用される。
Claims (75)
- サンプル中のリポテイコ酸の存在および/または量を検出するための調製物を生成するための方法であって、該方法は、
(a)Cancer borealis、Cancer irroratus、Hemigrapsus sanguineus、およびLimulus polyphemusからなる群より選択される甲殻類動物から回収される血液細胞調製物を提供する工程であって、該血液細胞が、その中に配置されたリポテイコ酸反応性材料を含む、工程;
(b)該血液細胞から該リポテイコ酸反応性材料を放出させる工程;および
(c)該血液細胞から放出された該リポテイコ酸反応性材料を回収する工程;
を包含する、方法。 - 前記リポテイコ酸反応性材料は、工程(b)において、前記血液細胞の溶解によって放出される、請求項1に記載の方法。
- 前記リポテイコ酸反応性材料は、工程(b)において、前記血液細胞が、リポテイコ酸反応性に対する透過性にされて、放出される、請求項1に記載の方法。
- 前記血液細胞は、膜透過因子に対する曝露によって、透過性にされる、請求項3に記載の方法。
- 前記透過因子は、イオノフォアである、請求項4に記載の方法。
- 前記イオノフォアは、カルシウムイオノフォアである、請求項5に記載の方法。
- 前記イオノフォアは、約0.1μM〜約100μMの範囲の最終濃度になるように前記血液細胞調製物と混合される、請求項5に記載の方法。
- 前記イオノフォアは、約1μM〜約10μMの範囲の最終濃度になるように前記血液細胞調製物と混合される、請求項7に記載の方法。
- 前記膜は、二価カチオンの存在下において、前記イオノフォアに該膜を曝露することによって透過性にされる、請求項5に記載の方法。
- 前記カチオンは、カルシウムイオンである、請求項9に記載の方法。
- 前記甲殻類動物は、Limulus polyphemusである、請求項1に記載の方法。
- 前記リポテイコ酸反応性材料は、プロフェノールオキシダーゼを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記リポテイコ酸反応性材料は、前記血液細胞から放出されるときに、活性化されないが、後に活性化されて、プロフェノールオキシダーゼをフェノールオキシダーゼに変換する酵素を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記回収されたリポテイコ酸反応性材料と、フェノールオキシダーゼの基質とを合わせるさらなる工程を、工程(c)の後に包含する、請求項1に記載の方法。
- サンプル中のリポテイコ酸の存在および/または量を検出するための調製物を生成する方法であって、該方法は、
(a)血液細胞調製物を提供する工程であって、該調製物中の血液細胞は、(i)外膜を有し、かつ(ii)その中に配置されたリポテイコ酸反応性材料を含む、工程;
(b)該血液細胞調製物中の血液細胞の該外膜の少なくとも一部に、該リポテイコ酸反応性材料が該血液細胞から放出されるように、該リポテイコ酸反応性材料に対して透過性にする工程;および
(c)該血液細胞から放出された該リポテイコ酸反応性材料を回収する工程;
を包含する、方法。 - 前記外膜は、工程(b)において、膜透過因子に対する曝露によって選択的に透過性にされる、請求項15に記載の方法。
- 前記透過因子は、イオノフォアである、請求項16に記載の方法。
- 前記イオノフォアは、カルシウムイオノフォアである、請求項17に記載の方法。
- 前記イオノフォアは、約0.1μM〜約100μMの範囲の最終濃度になるように前記血液細胞調製物と混合される、請求項17または18に記載の方法。
- 前記イオノフォアは、約1μM〜約10μMの範囲の最終濃度になるように前記血液細胞調製物と混合される、請求項19に記載の方法。
- 前記外膜は、二価カチオンの存在下において、前記イオノフォアに該膜を曝露することによって選択的に透過性にされる、請求項17または18に記載の方法。
- 前記カチオンは、カルシウムイオンである、請求項21に記載の方法。
- 前記血液細胞は、甲殻類動物に由来する、請求項15に記載の方法。
- 前記甲殻類動物は、Cancer borealis、Cancer irroratus、Carcinus maenas、Hemigrapsus sanguineus、およびLimulus polyphemusからなる群より選択される、請求項23に記載の方法。
- 前記甲殻類動物は、Cancer borealisまたはLimulus polyphemusである、請求項23に記載の方法。
- 前記リポテイコ酸反応性材料は、プロフェノールオキシダーゼを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記リポテイコ酸反応性材料は、活性化されたときにプロフェノールオキシダーゼをフェノールオキシダーゼに変換する酵素を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記回収されたリポテイコ酸の反応性材料と、フェノールオキシダーゼの基質とを合わせるさらなる工程を、工程(c)の後に包含する、請求項15に記載の方法。
- リポテイコ酸反応性材料の調製物を生成する方法であって、該方法は、
(a)血液細胞調製物を提供する工程であって、該調製物中の血液細胞は、(i)外膜を有し、かつ(ii)その中に配置されたリポテイコ酸反応性材料を含む、工程;
(b)該血液細胞と膜透過因子とを混合して、該血液細胞の少なくとも一部から該リポテイコ酸反応性材料を放出させる工程;および
(c)該血液細胞から放出された該リポテイコ酸反応性材料を回収する工程;
を包含する、方法。 - 前記透過因子は、選択的に、前記外膜を前記リポテイコ酸反応性材料に対して透過性にする、請求項29に記載の方法。
- 前記透過因子は、イオノフォアである、請求項30に記載の方法。
- 前記イオノフォアは、カルシウムイオノフォアである、請求項31に記載の方法。
- 前記イオノフォアは、約0.1μM〜約100μMの範囲の最終濃度になるように前記血液細胞調製物と混合される、請求項31または32に記載の方法。
- 前記イオノフォアは、約1μM〜約10μMの範囲の最終濃度になるように前記血液細胞調製物と混合される、請求項33に記載の方法。
- 前記外膜は、二価カチオンの存在下において、前記イオノフォアに該外膜を曝露することによって選択的に透過性にされる、請求項31または32に記載の方法。
- 前記カチオンは、カルシウムイオンである、請求項35に記載の方法。
- 前記血液細胞は、甲殻類動物に由来する、請求項29に記載の方法。
- 前記甲殻類動物は、Cancer borealis、Cancer irroratus、Carcinus maenas、Hemigrapsus sanguineus、およびLimulus polyphemusからなる群より選択される、請求項37に記載の方法。
- 前記甲殻類動物は、Cancer borealisである、請求項37に記載の方法。
- 前記リポテイコ酸反応性材料は、プロフェノールオキシダーゼを含む、請求項29に記載の方法。
- 前記リポテイコ酸反応性材料は、活性化されたときにプロフェノールオキシダーゼをフェノールオキシダーゼに変換する酵素を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記回収されたリポテイコ酸の反応性材料と、フェノールオキシダーゼの基質とを合わせるさらなる工程を、工程(c)の後に包含する、請求項29に記載の方法。
- リポテイコ酸反応性材料の調製物を生成する方法であって、該方法は、
(a)血液細胞調製物を提供する工程であって、該調製物中の血液細胞は、(i)外膜を有し、かつ(ii)その中に配置されたリポテイコ酸反応性材料を含む、工程;
(b)該血液細胞とイオノフォアとを混合して、該血液細胞から該リポテイコ酸反応性材料を放出させる工程;および
(c)該血液細胞から放出された該リポテイコ酸反応性材料を回収する工程;
を包含する、方法。 - 前記イオノフォアは、カルシウムイオノフォアである、請求項43に記載の方法。
- 前記イオノフォアは、約0.1μM〜約100μMの範囲の最終濃度になるように前記血液細胞調製物と混合される、請求項43または44に記載の方法。
- 前記イオノフォアは、約1μM〜約10μMの範囲の最終濃度になるように前記血液細胞調製物と混合される、請求項45に記載の方法。
- 前記外膜は、二価カチオンの存在下において、前記イオノフォアに該外膜を曝露することによって選択的に透過性にされる、請求項43または44に記載の方法。
- 前記カチオンは、カルシウムイオンである、請求項47に記載の方法。
- 前記イオノフォアは、選択的に、前記外膜を前記リポテイコ酸反応性材料に対して透過性にする、請求項43または44に記載の方法。
- 前記血液細胞は、甲殻類動物に由来する、請求項43または44に記載の方法。
- 前記甲殻類動物は、Cancer borealis、Cancer irroratus、Carcinus maenas、Hemigrapsus sanguineus、およびLimulus polyphemusからなる群より選択される、請求項50に記載の方法。
- 前記甲殻類動物は、Cancer borealisである、請求項50に記載の方法。
- 前記リポテイコ酸反応性材料は、プロフェノールオキシダーゼを含む、請求項43に記載の方法。
- 前記リポテイコ酸反応性材料は、活性化されたときにプロフェノールオキシダーゼをフェノールオキシダーゼに変換する酵素を含む、請求項43に記載の方法。
- 前記リポテイコ酸の反応性材料と、フェノールオキシダーゼの基質とを合わせるさらなる工程を、工程(c)の後に包含する、請求項43に記載の方法。
- 請求項1、15、29、または43の方法によって生成されるリポテイコ酸反応性材料の調製物。
- 前記リポテイコ酸反応性材料は、プロフェノールオキシダーゼを含む、請求項56に記載の調製物。
- 前記リポテイコ酸反応性材料は、活性化されたときにプロフェノールオキシダーゼをフェノールオキシダーゼに変換する酵素を含む、請求項56に記載の調製物。
- フェノールオキシダーゼの基質をさらに含む、請求項56に記載の調製物。
- 甲殻類動物の血液細胞に由来する単離された酵素調製物を含む組成物であって、該酵素調製物は、該酵素調製物がリポテイコ酸と接触させられるときにフェノールオキシダーゼに変換されるプロフェノールオキシダーゼを含む、組成物。
- 前記酵素調製物は、外膜が、選択的に、プロフェノールオキシダーゼに対して透過性にされている血液細胞に由来する、請求項60に記載の組成物。
- 前記甲殻類動物は、Cancer borealis、Cancer irroratus、Carcinus maenas、Hemigrapsus sanguineus、およびLimulus polyphemusからなる群より選択される、請求項60に記載の組成物。
- 前記甲殻類動物は、Cancer borealisである、請求項60に記載の組成物。
- 前記酵素調製物は、ファクターC活性、ファクターG活性、もしくはファクターC活性およびファクターG活性の両方を実質的に含まない、請求項60、61、または63に記載の組成物。
- 前記酵素調製物は、(1→3)−β−Dグルカン、リポ多糖類、もしくはプロテオグリカンの存在下において実質的に不活化されたままである、請求項60、61、または63に記載の組成物。
- 前記酵素調製物は、リポテイコ酸の存在下においてプロフェノールオキシダーゼをフェノールオキシダーゼに変換する酵素を含む、請求項60に記載の組成物。
- プロフェノールオキシダーゼを含む甲殻類動物の血液細胞溶解物であって、該プロフェノールオキシダーゼは、該血液細胞溶解物がリポテイコ酸と接触させられるときに、フェノールオキシダーゼに変換される、血液細胞溶解物。
- 前記甲殻類動物は、Cancer borealis、Cancer irroratus、Carcinus maenas、Hemigrapsus sanguineus、およびLimulus polyphemusからなる群より選択される、請求項66に記載の血液細胞溶解物。
- フェノールオキシダーゼの基質をさらに含む、請求項60または67に記載の組成物。
- サンプル中のグラム陽性菌の存在を検出する方法であって、該方法は、該サンプルと請求項56に記載の調製物とを接触させる工程を包含する、方法。
- 前記サンプルは、液体サンプルである、請求項70に記載の方法。
- 前記調製物は、前記サンプル中のグラム陽性菌の存在を検出するために2工程動的アッセイにおいて使用される、請求項70に記載の方法。
- サンプル中のグラム陽性菌の存在を検出する方法であって、該方法は、該サンプルと請求項60または67に記載の組成物とを接触させる工程を包含する、方法。
- 前記サンプルは、液体サンプルである、請求項73に記載の方法。
- 前記調製物は、前記サンプル中のグラム陽性菌の存在を検出するために2工程動的アッセイにおいて使用される、請求項73に記載の方法。
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