SE431228B - Sett att bestemma bakteriella endotoxin medelst profenoloxidashaltigt blodkroppslysat fran kreftdjur eller insekter och reagens herfor - Google Patents

Description

l0 15 20 25 30 35 8107599-6 2 svampar. Även om den biokemiska mekanismen inte är helt klarlagd, så aktiverar lipopolysackariderna resp. ß-lß-glukanerna ett serinproteas, som förutom att omvandla koagulogen till koagulin, överför profenoloxidas till det aktiva enzymet fenoloxidas. Bildningen av fenoloxidas vid den senare aktiveringen kan enligt uppfinningen utnyttjas för att påverka en lämplig detektorförening till en förening som kan påvisas fysikaliskt eller kemiskt.

Enligt uppfinningen kan således en bakterieinfektion snabbt och enkelt påvisas genom att man för ett prov som skall undersökas i kontakt med dels ett buffrat profenoloxidashaltigt blodkroppslysat från någon av artropodklasserna kräftdjur eller insekter, och dels en detektorsubstans i form av åtminstone en fenolförening med förmåga att oxideras av enzymet fenoloxidas till en fysikaliskt eller kemiskt, t.ex. spektrofotometriskt eller kolorimetriskt, pâvisbar förening.

Ett motsvarande reagens eller reagenssats för påvisande av bakterieinfektioner innefattar därför dels ett sådant blodkroppslysat från kräftdjur eller insekter och dels en sådan detektorsubstans. _ Även om generellt sett blodkroppslysat från alla kräftdjur och insekter skulle kunna användas enligt uppfinningen, så är bland kräftdjuren (Crustacea) de tiofotade kräftdjuren eller de s.k. dekapoderna föredragna. Såväl sötvattens- dekapoder som marina sådana kan användas. Som exempel på sötvattenskräftor kan nämnas Astacus astacus (flodkräfta), Pacifastacus leniusculus (signalkräfta), Astacus leptodactylus, Cambarus affinis (nordamerikansk flodkräfta), Procam- barus clarkii. Bland lämpliga marina dekapoder kan nämnas Cancer pagurus (krabbtaska), Carcinusmaenas (strandkrabba), l-lomarus vulgaris (hummer), Palinurus vulgaris (langust), Nephrops norvegicus (kejsarhummer). Bland dessa kräftdjur är flera direkt lämpade för odling i akvakultur, t.ex. flodkräfta och signalkräíta, men även hummer och krabba, och är därför att föredra för uppfinningens syfte.

Bland insekterna kan särskilt nämnas sådana tillhörande Orthoptera och Lepídoptera (fjärilar). Exempel på den förstnämnda ordningen är Schistocerca gregaria (ökengräshoppa) och Locusta migratoria (sträckgräshoppa). Bland fjäri- larna kan nämnas Galleria melonella (vaxmott), l-lyalphora cecropia och Bombyx mori (silkesfjärll). Även om insekterna inte torde vara lika aktuella för lysatframställning som kräftdjuren, så skulle man mycket väl kunna tänka sig odling av exempelvis silkesfjärilar för detta ändamål.

Lämpliga fenolföreningar för användning som detektorföreningar är t.ex. kinonföreningar med karakteristisk färg, särskilt dihydroxibensenföreningar eller föreningar, som innefattar en sådan dihydroxisubstituerad 'ienylgrupp. En speciellt lämplig förening är dihydroxifenylalanin (DOPA), som efter oxidation 10 15 20 25 30 35 8107599-6 med fenoloxidas ger en kraftigt röd färg vid 490 nm, som är stabil i ungefär 5 - 6 timmar. Denna substans finns kommersiellt tillgänglig till relativt låg kostnad och kan för uppfinningens ändamål användas i tämligen oren form. Ett annat exempel är ß-metylkatekol, som ger en lila färg vid 520 nm. Den bildade kinonen är dock relativt instabil och stabiliseras därför lämpligtvis genom närvaro av hydroxiprolinester.

Ett hemocytlysat, dvs. blodkroppslysat, från kräftdjur och insekter enligt uppfinningen kan framställas principiellt på samma sätt som det välkända limuluslysatet från hästskokrabban. Denna metod finns väl beskriven tidigare i litteraturen och behöver därför inte redovisas närmare här. Sålunda kan ett partiellt renat hemocytlysat från exempelvis kräftdjur framställas genom att man först tappar djuret på blod, varvid man ser till att förorening av blodet undviks. Det bör här framhållas, att ett kräftdjur, som kan odlas i akvakultur, som t.ex. flodkräfta, signalkräfta etc. inte behöver avlivas vid blodtappningen, utan att man kan tappa samma djur ett flertal gånger med jämna mellanrum i likhet med en mänsklig blodgivare. Detta är givetvis en stor fördel, eftersom då utvinning av blod för hemocytlysatframställning enligt uppfinningen kan kom- bineras med kräftodling för livsmedelsändamål. Därefter isoleras hemocyterna eller blodkropparna genom centrifugering och tvättning på konventionellt sätt.

Man homogeniserar sedan i buffert med hög kalciumjonkoncentration, centri- fugerar vid ca 70.000 g och tar till vara supernatanten. Det erhållna lysatet håller sig stabilt i ca l dygn. Företrädesvis frystorkas emellertid den erhållna supernatanten för att vid användningstillfället spädas med vatten eller lämplig buffert (prio/ß). Eventuellt kan lösningen stabiliseras med 0,5 - 1,5 NaCl, varigenom en stabilitet på flera dagar kan uppnås.

Ett reagens eller en reagenssats enligt uppfinningen för att påvisa bakterieinfektioner innehåller ett blodkroppslysat framställt enligt ovan och en fenolförening enligt den tidigare definitionen. Företrädesvis föreligger lysatet och detektorsubstansen i pulverform. Vid användning för att testa ett extrakt med misstänkt bakterieinfektion löser man testreagenset i lämplig buffert (pH/IX), varefter man tillsätter det extrakt som skall testas. Reagenslösningen studeras därefter exempelvis spektrofotometriskt eller kolorimetriskt beroende på den använda detektorsubstansen.

Uppfinningen kommer nu att beskrivas närmare med hjälp av några speciella utföringsexempel, som dock inte på något sätt är begränsande för uppfinningen. _5 10 15 20 25 8107599-6 4 Exempel l Framställning av hemocytlysat l-lemocyter från flodkräfta, Astacus astacus, uppsamlades såsom beskrivs i Söderhäll, K., Häll, L., Unestam, T., och Nyhlen, L. (1979) J. Invertebr. Pathol. fi, 285-294, med undantag av att 0,1 M natriumcitrat inte användes. Hemocy- terna homogeniserades i 10 mM natriumkakodylatbuffert, pH 7,0, med 100 mM CaClz, och homogenatet centrifugerades sedan 20 minuter vid 70.000 g. Den erhållna supernatanten som innehåller ungefär 2 mg protein/ml, kan användas antingen direkt eller frystorkas i alikvoter om 4 ml. För användning löses den i 2,9 ml destillerat vatten till en slutlig proteinkoncentration på 2 mg/ml.

Exempel 2 Två volymer kräfthemocytlysat enligt Exempel 1 inkuberades med en volym Zymosan-supernatant (supernatanten från l96-ig suspension av jäst- cellväggar, Sigma) vid 20°C. Omedelbart efter tillsatsen bestämdes aktiviteten av serinproteas resp. fenoloxidas med jämna mellanrum under ca 60 minuter.

Serinproteasaktiviteten analyserades genom att man inkuberade 100 pl av reaktionsblandningen, 600 pi 0,1 M-tris-HCl-buffert, pH 8,0, och 100 pl med den syntetiska peptiden Bz-Ile-Glu-(Y-O-piperidyD-Gly-Arg-PNA-l-ICI (AB Kabi Pep- tidforskning). Reaktionen avslutades efter inkubering i 20 minuter vid 37°C genom tillsats av 100 pl 5096-ig ättiksyra. Enzymaktiviteten visas i den bifogade figuren som förändringen i absorbans vid 1405 nm.

Fenoloxidasaktiviteten bestämdes genom att man inkuberade 100 pl av reaktionsblandningen med 30 pl L-dopa (4 g/1) i 5 minuter vid 490 nm. Enzym- aktiviteten uttrycks i figuren som förändringen i absorbans vid 490 nm.

"X-x" i Figuren avser kontroll med buffert (0,01 M natriumacetat, pH 5,2) stället för B-lß-glukantillsats.

Ur figuren framgår klart den stabilare nfenoloxidasaktiviteten.

Claims (8)

1. l0 15 20 25 30 8107599-6 5 PATENTKRAV l. Sätt att bestämma bakteriellt endotoxin, k ä n n e t e c k n a t av att man för det prov som skall undersökas i kontakt med (A) ett buffrat profenoloxidashaltigt blodkroppslysat från ett djur till- hörande någon av artropodklasserna kräftdjur (Crustacea) och insekter (lnsecta), och (B) en detektorsubstans i form av åtminstone en fenolförening med förmåga att oxideras av enzymet fenoloxidas till en förening som kan påvisas fysikaliskt eller kemiskt, t.ex. spektrofotometriskt eller kolorimetriskt.

2. Sätt enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a t av att íenolföreningen är en dihydroxibensenförening.

3. Sätt enligt patentkravet 2, k ä n n e t e c k n a t av att fenolföreningen är dihydroxifenylalanin eller 4- metylkatekol.

4. Sätt enligt något av patentkraven 1-3, k ä n n e t e c k n a t av att detektorsubstansen innefattar ett stabiliserings- medel för den oxiderade föreningen.

5. Sätt enligt patentkravet 4, k ä n n e t e c k n a t av att fenolföreningen är lß-metylkatekol och att stabili- seringsmedlet är hydroxiprolinester.

6. Sätt enligt något av patentkraven 1-5, k ä n n e t e c k n a t av att blodkroppslysatet är ett hemocytlysat från ett djur tillhörande ordningen dekapoder.

7. Sätt enligt patentkravet 6, k ä n n e t e c k n a t av att hemocytlysatet härrör från en sötvattenskräfta, särskilt flodkräfta.

8. Reagens för bestämning av bakteriellt endotoxin, k ä n n e t e c k n a t av att det innefattar (A) ett buffrat profenoloxidashaltigt blodkroppslysat från ett djur tillhörande någon av artropodklasserna kräftdjur (Crustacea) och insekter (Insecta), och (B) en detektorsubstans i form av åtminstone en fenolförening med förmåga att oxideras av enzymet fenoloxidas till en förening som kan påvisas fysikaliskt eller kemiskt, t.ex. spektro- fotometriskt eller kolorimetriskt.