JP2000509605A - テイコ酸酵素および検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はＴＡＰ酵素に対する新規基質および検定法を開示する。加えて、細菌のテイコ酸生合成経路に関連する遺伝子およびタンパク質、詳しくは、ｒｏｄＣ遺伝子およびタンパク質からの新規ＤＮＡ、タンパク質およびペプチドおよびそれらの変異体を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 テイコ酸酵素および検定法 発明の分野 本発明は細胞生物学、より詳しくは、テイコ酸経路の分野に関する。この経路 に関連する遺伝子およびタンパク質は、テイコ酸ポリメラーゼ（ＴＡＰ）および ＣＤＰ‐グリセロール：ポリ（グリセロホスフェート）グリセロホスホトランス フェラーゼを含む。 情報の開示 A.L.Honeyman,G.C.Stewart,"Identification of the protein encoded by rodCa cell division gene from Bacillus subtilis"Mol.Microbiol.(1988)2:7 35-741. A.L.Honeyman,G.C.Stewart,"The nucleotide sequence of the rodC oper on of Bacillus subtilis．Mol.Microbiol.(1989)3:1257-1268. C.Mauel,M.Young,P.Margot,D.Karamata"The essential nature of teicho ic acids in Bacillus subtilis as revealed by insertional mutagenesis"Mol .Gen.Genet．(1991)215:388-394. C.Mauel,M.Young,D.Karamata,"Genes concerned with synthesis of poly (glycerol phosphate),the essential teichoic acid in Bacillus subtilis st rain 168,are organized in two divergent transcription units"J.Gen.Microb iol.(1991)137:929-941. Y.S.Park,T.D.Sweitzer,J.E.Kison,C.Kent."Expression,purification,an d characterization of CTP:Glycerol-3-phosphate cytidyltransferase from B acillus subtilis."J.Biol.Chem.(1993)268:16648-16654. 発明の背景 グラム陽性病原菌における抗生物質耐性の広がりは、深刻な問題であり、それ は診療施設において記録され始めたばかりである。薬物耐性の発生は、特に、ス タフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス ・ニュモニエ（Streptococcus pneumoniae）および腸球菌において増大しつつあ る。 メチシリン耐性エス・アウレウス(ＭＲＳＡ)、ペニシリン耐性エス・ニュモニエ およびバンコマイシン耐性腸球菌は疑いのある患者に深刻な脅威を引き起こす。 バンコマイシンはＭＲＳＡに対して唯一抗生物質効果がある。[C.T.Walsh,”Van comycin resistance：decoding The molecular logick”Science(1993)261:308 ‐309;I.R.Friedland，”Therapy of penicillin-and cephalosporin-resistant pneumococcal infections”Trends Clinic Pract.（1993）25：451‐455 and S ．Dutka‐Malen,and P．Courvalin，”Update on glycopeptideresistance in enterococci”Antimicrob News（1990）7:81‐88]を参照。 細胞壁テイコ酸経路は大多数のグラム陽性菌において発見されており、バシラ ス・ズブチリス（Bacillus subtilis）での研究は、それが細胞の生存に必須で あることを明かにしている。[C.Mauel，M.Young，P.Margot，D.Karamata，”The essential nature of teichoic acids in Bacillus subtilis asreve aled by insertional mutagenesis”Mol Gen Genet(1991)215:388‐394]を 参照。細胞壁テイコ酸の本質は、ペプチドグリカンとで形成する共有結合にある であろう。 細胞壁テイコ酸は、ペプチドグリカンのように細胞膜の外表面において、ヌク レオチド前駆体（ＣＤＰグリセロール）を構成単位として用いて合成される。テ イコ酸は、グラム陽性菌のペプチドグリカンに共有結合するポリグリセロールホ スフェートのポリマーである。酵素ＣＤＰ−グリセロール：ポリ（グリセロホス フェート）グリセロホスホトランスフェラーゼは、ＣＤＰ−グリセロール由来の グリセロールホスフェートモノマーを１，３−ホスホジエステル結合により連結 したポリグリセロールホスフェート鎖への重合を触媒する。リポテイコ酸は、細 胞膜には固定されているが、ペプチドグリカンには結合されていないポリグリセ ロールホスフェートの関連ポリマーである。 新規な標的を阻害する新しい抗微生物剤に対して明かな臨床的要求がある。独 特の阻害剤をスクリーニングするためには、細胞壁テイコ酸経路のごときグラム 陽性病原菌の必須代謝経路を同定すべきであり、新規抗微生物剤を同定するため には、それら各々の酵素を研究し、クローン化し、有用な検定法およびスクリー ニング法にするべきである。 発明の概要 本発明はＴＡＰ酵素活性の測定法および検定法を開示する。本発明は、従来は 評価に利用できる基質を持たなかった重要な生物学的反応に対する基質として、 通常の市販物質をいかに使用できるかということを例示する。本発明は、研究者 および臨床医に、リポテイコ酸がＴＡＰ酵素の存在および活性をも解明するため の基質として使用し得ることを教示する。本発明の具体例は、ＴＡＰ酵素活性の 監視を可能とする検定法を作成するための本教示の適用である。 本発明は、初めて、活性ＴＡＰ酵素の配列およびこの配列をコードするＤＮＡ の核酸配列も開示する。 本発明は以下の配列を含む：配列チャート１および配列番号１に示した全ＤＮ Ａ配列および残基４ないし２２７４の該ＤＮＡ、最初から最後までの制限サイト 、および残基２４ないし２２６４の該ＤＮＡ。配列チャート１に示され、別名” ｒｏｄＣ遺伝子”であるコードＤＮＡ配列。１８７２位の残基がシトシンの代わ りにチロシンである配列チャート１に示した配列に対応するＤＮＡ配列。 （７５、８０、８５、９０、９５パーセント以上を含む）約７０パーセント以 上の相同性にするための標準的ストリンジェント条件下、配列チャート１のＤＮ Ａ配列とハイブリダイズすることができ、ＣＤＰ‐グリセロールに加えてＨ₂Ｏ をテイコ酸またはリポテイコ酸にする反応を触媒する能力を有する細菌性ＤＮＡ 。 配列チャート１および２によって記載された関連フラグメントに対して少なく とも７０％の相同性を有するスタフィロコッカス・アウレウス由来のタンパク質 またはタンパク質配列フラグメントをコードし、ＥｃｏＲＩ消化後、７．０ｋｂ 、５ｋｂおよび４．２ｋｂのフラグメントを供する、あるいはＨｉｎｄＩＩＩ消 化後、４．５、３．３、２．８ｋｂのフラグメントを供するスタフィロコッカス ・アウレウス由来のＤＮＡ配列。 該ＤＮＡ配列に加えて、本発明は以下のものを含む種々の突然変異体を開示す る： 無作為に変異したｒｏｄＣ遺伝子のコレクション。１以上の無作為に変異したｒ ｏｄＣ遺伝子のセレクション。無作為に変異したｒｏｄＣ遺伝子を有する細菌の コレクション。細菌のコレクションから選択された無作為変異を有する１以上の 細菌のセレクション。ビー・ズブチリスまたはエス・アウレウスの変異体から選 択された突然変異細菌。 該発現ＤＮＡ由来の種々のタンパク質およびペプチドフラグメントも開示する 。 (配列チャート１および２に示す全タンパク質配列(配列番号２)、残基１−７４ ６のタンパク質配列、および６１６位のアミノ酸がアラニンに代わりバリンであ る配列チャート１および２に示すタンパク質配列)。配列チャート１および２に よって記載された関連フラグメントに対して少なくとも７０％の相同性を有し、 ＥｃｏＲＩ消化後、７．０ｋｂ、５ｋｂおよび４．２ｋｂのフラグメントを供す るスタフィロコッカス・アウレウス由来のタンパク質配列フラグメント；および 配列チャート１および２によって記載された関連フラグメントに対して少なくと も７０％の相同性を有し、ＨｉｎｄＩＩＩ消化後、４．５、３．３、２．８ｋｂ のフラグメントを供するスタフィロコッカス・アウレウス由来のタンパク質配列 フラグメントも開示する。図２に示すサザンブロットに開示したタンパク質も同 様に記載する。 本明細書に開示したＤＮＡおよびタンパク質に加えて、本発明は種々の中間体 、中間体ベクター、プラスミドおよび形質転換または突然変異した細胞株を含む 。 本発明はクローニングベクター、シャトルベクターまたは発現ベクターから選択 されたベクターに組み込まれた配列チャート１に開示した配列のＤＮＡを含み、 これらのベクターのいずれもプラスミドベクターであり得る。クローニングベク ターまたはプラスミドは、広く入手可能な、または市販のプラスミドのいずれか から選択し得る。該プラスミドは、ｐＵＣまたはｐＵＣ１９のごときいずれの適 切なｐｕＣタイプまたはｐＢＲタイプのプラスミド、あるいはｐＢＲ３２２のご ときいずれの他の適切なプラスミドでもあり得る。該ベクターは典型的なシャト ルベクターであり得る。該シャトルベクターはｐＭＫ４またはｐＹＬ１１２Δ１ １９のごときプラスミドであり得る。発現ベクターも使用することができ、該発 現ベクターは、以下の非常に強力なプロモーター：ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＤＲ５４ ０またはｐＥＴ−２１(＋)のごとき超強力プロモーターを持つプラスミドである 。 この命名法において、ｐＴＲＣ９９Ａは該プラスミドの名前となろう。タンパク 質の発現に使用される各プラスミドは以下の独特のプロモーターを有する： ｐＴＲＣ９９Ａ(ｔｒｃプロモーター)、ｐＤＲ５４０(ｔａｃプロモーター)、ｐ ＥＴ−２１(＋)(Ｔ７プロモーター)。 プラスミドの例は、該クローニングベクターｐＵＣ１８に配置されたクローン 化ｒｏｄＣ遺伝子を含み、ｐＲＯＤＣＡＰ１８と名付けられたプラスミド、該シ ャトルベクターｐＭＫ４に配置されたクローン化ｒｏｄＣ遺伝子を含み、ｐＭＫ ＲＯＤＣと名付けられたプラスミド、該プラスミドがｐＲＯＤＣＡＰ１８プラス ミドから切り出されたｒｏｄＣ遺伝子から産生されたプラスミド、ｐＴｒｃ９９ Ａである強カプロモーターを持つ発現ベクターに配置されたｒｏｄＣ遺伝子を含 み、ｐＢＳＲＲＯＤＣ１と名付けられたプラスミドまたはｐＲＯＤＣＡＰ１８か ら選択されたプラスミド、およびｒｏｄＣ遺伝子がｐＭＫＲＯＤＣプラスミドか ら切り出されて産生されたプラスミドである。 これらのプラスミドを使用して、形質転換細菌細胞を作成することができ、突 然変異細胞およびプラスミドのコレクションを容易に作成することができる。そ れで、種々の開示したプラスミドで形質転換した細菌細胞およびイー・コリであ る細菌細胞、およびタイプＤＨ１０Ｂである様々に形質転換したイー・コリ細胞 のさらなる説明がある。 新しく新規な検定法も開示し、本明細書に開示した最も重要な検定法はいくつ かの具体例において必要ではあるが、該新規に発見したＤＮＡおよびタンパク質 を要求しない。本発明は：ＣＤＰ−グリセロールに加えてＨ₂Ｏ(または水)、加 えてＴＡＰ酵素、加えてリポテイコ酸を合わせ、次いでリポテイコ酸の生成量を 測定することを含むＴＡＰ酵素活性の測定法を含む。ある具体例では、該ＣＤＰ −グリセロールが放射性ＣＤＰ−グリセロールであり、ある具体例では、ＴＡＰ 酵素活性が、放射性ＣＤＰ−グリセロールに加えてＨ₂Ｏ、加えてＴＡＰ酵素、 加えてリポテイコ酸、加えてストレパビジン（strepavidin）ＳＰＡビーズおよ び コムギ胚芽アグルチニンのごとき適切なレクチンを合せ、次いで放射性リポテイ コ酸の生成量をＳＰＡビーズに結合したレクチンを測定することによって測定す ることを含む。これら全ての具体例において、放射性ＣＤＰ−グリセロールを[³ Ｈ]グリセロール３−ホスフェート（[³Ｈ]グリセロールホスフェートとしても公 知）から作成し得る。これらの検定法のいずれかを実施する好ましい方法は、該 リポテイコ酸を処理して、本検定に使用する前にアラニン残基を除去すること、 すなわち、他の成分と結合する前にリポテイコ酸を処理して、アラニンを除去す ることである。これらの検定法を使用して、ＴＡＰ酵素が不純な調製物由来であ る場合、その活性を測定することができ、該ＴＡＰ酵素が配列チャート１または ２、あるいは配列番号２に開示した酵素である場合、該方法を使用することがで きる。本明細書の検定法をキットに構成して、適用を容易にすることができる。 リポテイコ酸を該ＴＡＰタンパク質によって触媒される酵素反応に対する基質 として使用する方法も開示する。リポテイコ酸は、テイコ酸と異なり、市販され ており、かくして、優れた基質となる。該リポテイコ酸はＣＤＰ[³Ｈ]グリセロ ールのアクセプターとして働き得る。該ＴＡＰタンパク質は未精製の起源または 抽出物から得ることができ、好ましくは、該リポテイコ酸をビー・ズブチリス、 エス・アウレウスまたはイー・フェカリスから調製し、あるいは、それは配列チ ャート１および２または配列番号２に記載のＴＡＰタンパク質またはそのタンパ ク質に少なくとも７０％相同であるタンパク質であり得る。 該ＴＡＰ酵素およびＣＤＰグリセロールを用いてグラム陽性菌により引き起こ される病気を検出し、監視する診断キットを、本明細書に開示した情報を用いて 作成し得る。その様なキットの適当な説明書に従い、リポテイコ酸を含有すると 思われる生体サンプルの部分をＴＡＰおよびＣＤＰグリセロールに添加し、１時 間ほどインキュベートすることができるであろうし、ＣＤＰグリセロール由来の グリセロール３−ホスフェートから該サンプル中に存在するリポテイコ酸への転 移を、以下の”沈殿法”に記載した沈殿法を用いて検出することができるであろ う。図面の簡単な説明 図１． ＴＡＰ精製スキームのＳＤＳＰＡＧＥである。レーン１および７は分 子量マーカーであり；レーン２は過剰発現ＴＡＰを含有する細胞由来の可溶性タ ンパク質画分であり；レーン３はベクターｐＴｒｃ９９Ａ対照由来の膜であり； レーン４はＴＡＰを過剰発現する細胞由来の２Ｍ ＮａＣｌ膜抽出物であり；レ ーン５はＨｉｇｈＱで精製したＴＡＰであり；レーン６はＳｕｐｅｒｏｓｅ１２ で精製したＴＡＰである。 図２． ＤＮＡ配列が細菌スタフィロコッカス・アウレウスのみに由来する配 列チャート１に開示した配列に相同すると確認したことを示すサザンブロットで ある。 発明のさらなる説明 本発明は、ＣＤＣ−グリセロール：ポリ（グリセロホスフェート）グリセロー ルホスホトランスフェラーゼとしても知られている、テイコ酸ポリメラーゼ（ま たはＴＡＰ）の組換え体、そのアミノ酸配列およびこの酵素をコードするＤＮＡ を開示する。さらに、この酵素を発現するベクター、プラスミド、プローブおよ び細胞ならびに該酵素および本明細書に開示したものを配合する検定法、および 新しい抗生物質の発見のいくつかの段階において有用な全てのもの、または病状 のモニタリングを開示する。 ビー・ズブチリスにおける細胞壁テイコ酸合成を担う遺伝子は染色体上のオペ ロンに位置付けられている[C.Manuel,M.Young,D.Karamata，”Genes concerned with synthesis of poly(glycerol phosphate)，The essential teichoicacid i n Bacillus subtilis strain 168，are organized in two divergenttranscript ion units”J.Gen.Mcrobiol．（1991）137:929‐941]。ｔａｇ遺伝子、Ａ−Ｆ、 は全て配列決定なされているが[同書]、唯一ｔａｇＤ遺伝子タンパク質産物のみ が精製され、特性評価されている[Y.S.Park,T.D.Sweitzer,J.E.Kison,C.Kent． ”Expression，purification，and characterization of CTP：Glycerol-３-pho sphate cytidyltransferase from Bacillus subtilis.”J.Biol．Chem．（1993 ）268:16648‐16654]。 ＲｏｄＣまたはｒｏｄｃは、ＴａｇＦ、Ｔａｇｆ、ｔａｇfまたはｔａｇＦと も呼ばれ、テイコ酸ポリメラーゼ、あるいは本明細書においてはより頻繁にＴＡ Ｐと呼ばれるＣＤＣ−グリセロール：ポリ（グリセロホスフェート）グリセロホ スホトランスフェラーゼをコードする。この酵素、ＴＡＰは、ＣＤＰ−グリセロ ールのグリセロールホスフェート部分を１，３ホスホジエステル結合に一緒に連 結することによってテイコ酸のポリグリセロールホスフェート骨格の重合を触媒 する。ｒｏｄＣの欠失突然変異体を単離する試みは成功していないが([C.Mauel, M．Young，P．Margot，D．Karamata”The essential nature of teichoicacids in Bacillus subtilis as revealed by insertional mutagenesis”Mol ．Gen．Genet．（1991）215：388‐394]および［A．L．Honeyman，G．C．Stewar t”Identification of the protein encoded by rodC，a celldivision gene from Bacillus subtilis”Mol．Microbiol．（1988）２:735-741］を参照) 、研究に役立つ１つの温度感受性突然変異体ＲＯＤＣ１１３が存在する。この株 はｒｏｄＣ遺伝子において点変異を有し、それは酵素活性を５５℃において充分 に低減して、増殖を停止させる。［Honeyman AL，StewartGC.”The nucleotide sequence of the rodC operon of Bacillus subtilis”Mol．Microbiol．（198 9）vol.3 pp.1257‐1268]を参照。 ｒｏｄＣの欠失突然変異体は生存能がないことおよびＴＡＰがビー・ズブチリ スの生存に必須である事実は、本明細書に記載の温度感受性ｒｏｄＣ酵素および 突然変異体が、特に、役立つことを示唆している。以下に、新規形態のＴＡＰの クローニング、配列決定および部分的精製を説明する。 クローニング理論 以前の研究者らは、該ｒｏｄＣ遺伝子およびタンパク質を同定し、クローン化 しようと試みてきた。[A．L．Honeyman，G．C．Stewart,”Identification of T he encoded by rodC，a cell division gene from Bacillus subtilis”Mol．M icrobiol．(1988)2：735‐741]および［A．L．Honeyman,G．C．Stewart,”The n ucleotide sequence of The rodC operon of Bacillus subtilis”Mol．Microbi ol．（1989）３：1257‐1268］を参照。バチルス・ズブチリスとして 知られている桿菌を用いたこれらの以前の研究は、該ＴＡＰ酵素生産の成功をも たらさなかった。以前の研究は、本明細書に開示したｒｏｄｃ遺伝子のオープン リーディングフレームとは異なる配列を開示した。以前の研究は別のタンパク質 を開示し、それは非常に異なるサイズを有しており、推定タンパク質配列の構造 解析が１度もされていないものである。本明細書に開示したｃＤＮＡから産出さ れた酵素は、以前には決して発現ｃＤＮＡから産生されたこともないし、本明細 書に開示した短鎖化したｃＤＮＡ配列が全ＴＡＰを担うものと報告されたことも ない。以前の開示では、別のより大きなＤＮＡ配列および別の純理論的なタンパ ク質が報告された。活性ＴＡＰ酵素の配列は未だかって報告されていない。しか しながら、以前報告された情報はプローブの作成に関して有用であり、次いで、 それを使用して、該ＤＮＡを発見し生成した。 バチラス・ズブチリスから配列を生成することに加えて、本発明者らは、ｔａ ｇＦビー・ズブチリス残基に相同のＤＮＡ配列をスタフィロコッカス・アウレウ スから今や単離した。 クローニングおよび配列決定 ＴＡＰをコードするビー・ズブチリスｒｏｄＣ遺伝子を、ＰＣＲを用いて染色 体ＤＮＡから増幅した。配列決定は、Ｔａｑポリメラーゼがヌクレオチドの誤ま った組込みを起こしており、ｂｐ１８７１においてＣからＴへの塩基転位をもた らしたことを明かにした。しかしながら、該発現タンパク質における得られたア ラニンからバリンへの変化は、該クローン化遺伝子がビー・ズブチリス株ＲＯＤ Ｃ１１３のｒｏｄＣ遺伝子における温度感受性の欠損を補完することを妨げなか った。 配列チャート１は、ｐＵＣ１８（ｐＲＯＤＣＡＰ１８）へクローン化したＰＣ Ｒ産物のＤＮＡ配列が、ｂｐ１８７１におけるＣからＴへの塩基転位以外は、公 表されたｒｏｄＣ配列に正確に一致したことを示している。該得られた点変異は 野生型ＴＡＰにおけるアラニンをバリンに変化させた。この突然変異体ｒｏｄＣ 遺伝子は、許容されない５５℃の温度において増殖させることによって該温度感 受性ビー・ズブチリス株ＲＯＤＣ１１３におけるｒｏｄＣ欠損を補完することが できた。 該突然変異体ｒｏｄＣ遺伝子（ｒｏｄＣＣＴ）をｐＭＫＲＯＤＣから２．３ｋ ｂＢａｍＨＩフラグメントとして切り出し、該発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａにク ローン化して、ｐＢＳＲＯＤＣ１を形成した。イー・コリＤＨ１０Ｂ／ｐＢＳＲ ＯＤＣ１細胞を５ｍＭ ＩＰＴＧで誘発すると、該細胞膜調製物中、約８５ｋｄ のバンドが現れた(図１、レーン４)。該ベクター対照（ｐＴｒｃ９９Ａ）膜調製 物はこのバンドを含まないが(図１、レーン３)、ｐＢＳＲＯＤＣ１由来の１００ ，０００×ｇ細胞抽出物上清は、該膜調製物よりも若干少ない８５ｋｂタンパク 質を示した(図１のレーン２およびレーン４を比較)。ブロッティングしたタンパ ク質のＮ-末端配列解析は、該８５ｋｄポリペプチドアミノ酸配列がＭＩＥＮＴ ＶＩＫＣで始まることを明かにした。配列チャート１は、この配列がｂｐ１００ においてＡＴＧで始まり、ｂｐ２２６３においてＴＡＡで終わる２１３６ｂｐの オープンリーディングフレームに対応することを示す。 スタフィロコッカス・アウレウス由来の相同配列のクローニング エス・アウレウス由来の染色体ＤＮＡを単離し、制限酵素で消化した。該切断 ＤＮＡを、該ビー・ズブチリスｔａｇＦ遺伝子（ＴＡＰプロデューサー）をＤＮ Ａプローブとして用いるサザンに付した。この実験は、エス・アウレウスがビー ・ズブチリスｔａｇＦ遺伝子に高度に相同するＤＮＡ配列を有することを示した 。 エス・アウレウス由来の染色体ＤＮＡ（参照＝American Type Culture Col lection［ATCC］29213）を単離し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで 消化した。該ＤＮＡ消化物を１％ アガロースゲル上の電気泳動によって分離し 、略サザン法に準じてナイロン膜にブロットした([Southern,E.M．1975．”Dete ction of specific sequences among DNA fragments separatedby gel electr ophoresis”，J.Mol．Biol．vol．98，pp．503]、出典明示して本明細書に含ま れる)。ＤＮＡプローブを、ニックトランスレーションおよびビー・ズブチリス 由来のクローン化ｔａｇＦ遺伝子の２．３ｋｂセグメントを用いて調製した。該 エス・アウレウス消化物をｔａｇＦプローブにハイブリダイズし、クローン化ビ ー・ズブチリスｔａｇＦ遺伝子に相同するいくつかのバンドを確認 した。例えば、エス・アウレウス染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化は、サイズが７ ．０ｋｂ、５ｋｂ、および４．２ｋｂであって、該ビー・ズブチリスｔａｇＦ遺 伝子に良くハイブリダイズしたＤＮＡフラグメントを供した。さらに、同一のエ ス・アウレウス染色体ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化は、それぞれ、４．５ｋｂ、 ３．３ｋｂおよび２．８ｋｂに泳動した３つの相同バンドを供した。オートラジ オグラムの視覚検査によって判断されたごとく、４．５ｋｂＨｉｎｄＩＩＩフラ グメントは３．３または２．８ｋｂのバンドのいずれよりも非常に低い相同性で あった。このサザン解析は、ビー・ズブチリスのｔａｇＦ遺伝子にハイブリダイ ズするエス・アウレウスにおけるｔａｇＦ相同体を確認した。これらのエス・ア ウレウス相同体配列はテイコ酸合成をコードする遺伝子を表す。 ＴＡＰ酵素の産生および精製 ＴＡＰを、イー・コリＤＨ１０Ｂ細胞においてｔｒｃプロモーターの制御下で 過剰産生させた。該タンパク質を先ず細胞膜に配置し、塩抽出を用いて精製を開 始した。ＴＡＰはビー・ズブチリスにおいて膜に結合するが、該アミノ酸配列は 膜スパニング領域を示さなかった。ＴＡＰは該細胞膜と緩く結合しているようで ある。 ＴＡＰの精製は、ＤＮＡと該酵素調製物との結合によって妨げられた。ゲルろ 過クロマトグラフィーは精製を向上させず、そのことは核酸およびタンパク質が 強い複合体を形成していることを示している。この調製物をベンゾナーゼと共に インキュベーションすると、核酸フラグメントを放出したが、該複合体のサイズ を顕著に変化させなかった。今後、複合体の形成を妨げるためには、精製の早い うちにベンゾナーゼを添加することが必要となるであろう。 核酸の問題にも関わらず、ＴＡＰを膜調製物から４倍の活性に精製した。該酵 素は、氷冷して貯蔵した場合、２週間安定であった。ＴＡＰは細胞壁テイコ酸を ｉｎ ｓｉｔｕで合成するが、ビー・ズブチリス、エス・アウレウスまたはイー ・フェカリスのいずれか由来のリポテイコ酸はＣＤＰ[₃Ｈ]グリセロールのアク セプターとして働き得るであろう。リポテイコ酸が市販源で入手可能であること は、ＴＡＰ阻害剤の発見に結び付くであろう大容量スクリーニング用のＴＡＰ検 定の 開発を可能とするであろう。ＴＡＰは細胞壁テイコ酸またはリポテイコ酸のいず れかのポリグリセロールホスフェート骨格を認識し、いずれのポリマーの基部部 分もほとんど認識しないようである。 テイコ酸生合成経路は何年もかかって確立されてきたが、未だにこのアニオン 性ポリマーの正確な機能は決定されていない。環境のホスフェートレベルが低い 時にグラム陽性菌が該グリセロールホスフェートを必要とする場合の予備ホスフ ェート源としてのテイコ酸の使用を記載した報告がある([Grant WD．”Cell wal l teichoic acid as a reserve phosphate source in Bacillus subtilis”J Bacteriol(1979)vol．137，pp．35‐43]、出典明示して本明細書に含まれる)。 テイコ酸に関するこの役割は疑いもないが、高ホスフェートレベル条件下、テイ コ酸合成の不存在下ではビー・ズブチリスが生存できないという事実は([Mauel C,Young M,Margot P，Karamata D．”The essential nature of teichoic ac ids in Bacillus subtilis as revealed by insertinal mutagenesis” Mol Gen Genet（1991）vol.215，pp．388‐394]、出典明示して本明細書に含 まれる)、より本質的な役割がありそうなことを示唆している。 いくつかの報告書は、テイコ酸が２価カチオンをキレートする能力を指摘してい るが（[Fischer，W．”Lipoteichoic acid and lipids in the membrane of Sta phylococcus aureus”Med．Microbiol．Immunol．（1994）vol．183，pp.61-76] 、出典明示して本明細書に含まれる)、リポテイコ酸はおそらく細胞壁テイコ酸 の不存在下でキレートするのであろう。テイコ酸の本質は、ペプチドグリカンへ の共有結合（テクニカルチャート １）のおかげで細胞壁の構造の完全性を保つ ことにあるというのがよりもっともらしい。本明細書に開示した情報を考慮する と、当業者が、無作為にクローン化ｒｏｄＣ遺伝子を変異し、該突然変異遺伝子 を染色体に戻して組込み、ＴＡＰ突然変異体のプールを得、グラム陽性菌の細胞 壁の補完に対するテイコ酸の効果を研究するために使用し得ることは、当業者に 明白であろう。 ＴＡＰの部分精製 ＣＤＰ[³Ｈ]グリセロールをグリセロールホスフェートドナーとして、および ビー・ズブチリスリポテイコ酸をアクセプターとして用いて、ＴＡＰの酵素活性 を検定した。活性であれば、組換えＴＡＰ酵素はリポテイコ酸を放射性グリセロ ールホスフェート単量体で延長し、酸性で沈殿する放射性物を生成するはずであ る。予備実験が過剰発現ＴＡＰが活性であることを示したので、精製法を開始し た。イー・コリ膜から２Ｍ ＮａＣｌで１ＴＡＰを抽出して、活性ＴＡＰ調製物 を生成し、それを超遠心によって細胞膜から分離することができた。ＴＡＰ膜抽 出物をバッファーＡ（材料および方法を参照）に対して透析して、図１、レーン ４に示したタンパク質パターンを作成した。 １０ｍｇの透析した膜抽出物をイオン交換カラムに入れた。５０ｍＭ ＮａＣ ｌを含有するバッファーＡでカラムを平衡化して、画分２−４でカラムを通過す る少量のＴＡＰ活性を生じたが、活性の大部分は０．０５Ｍから０．５Ｍ Ｎａ Ｃｌ勾配の終わりに流出した。表１は、ＨｉｇｈＱクロマトグラフィーがＴＡＰ の純度を４倍にしたことを示し、これらプールした画分のＳＤＳＰＡＧＥ解析は ＴＡＰが富化されたことを示した(図１、レーン４)。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２上の ゲルろ過は該酵素の特異的活性を増強せず(データ示さず)、この結果は、図１の レーン５において明かな精製の欠如によって支持される。ＴＡＰはＳｕｐｅｒｏ ｓｅ１２カラムにおいてボイド容量にて流出し(分子量＞２００ｋｄ)、ＴＳＫ− ４００ゲルろ過カラムを用いると、それは約４００−６００ｋｄタンパク質とし て移動した。分光光度波長走査は、該サンプルが、ＴＡＰを含み、サンプル中に おいて該タンパク質と高分子量の複合体をおそらく形成する核酸を大量に含有し ていることを明らかにした。 ＴＡＰ酵素、基質としてのリポテイコ酸および発現クローン化ｃＤＮＡ配列の 適用および使用 ポリグリセロールホスフェート（テイコ酸）のＴＡＰによる酸素合成およびＴ ＡＰ酵素の代替基質 ＴＡＰはビー・ズブチリスにおいて細胞壁テイコ酸のポリグリセロールホス フェート骨格の合成を触媒し、このポリマーはペプチドグリカンに共有結合する (テクニカルチャート１)。リポテイコ酸は、グラム陽性菌の細胞膜にリン脂質部 位 の脂肪アシル側鎖によって固定されている（テクニカルチャート２）構造的に関 連するポリマーである。リポテイコ酸および脂肪壁テイコ酸は共に、同一のポリ グリセロールホスフェート骨格を有するが、ＴＡＰはリポテイコ酸をｉｎ ｓｉ ｔｕでは合成しないという証拠がある[Fischer W．”Lipoteichoic acid and lipids in the membrane of Staphylococcus aureus”Med.Microbiol． Immnunol．（1994）vol．183，pp．61‐76]。ここに、本発明者らは、リポテイ コ酸がＴＡＰに対する代替基質として働き得ることを示すデータを提供する。こ のことは重大な発見である。というのは、リポテイコ酸は商業的に入手可能であ って、細胞壁テイコ酸は入手可能ではなく、また試験は、可溶性テイコ酸がＴＡ Ｐに対して適切な基質として働かないことを示唆しているという両方の理由から である。本発見は今や、ＴＡＰ阻害剤の機械的スクリーニングの開発を可能とす る。 検定条件 いくつかの検定を該ＴＡＰ酵素を用いて構築することができる。沈殿およびＳ ＰＡが２つの例である。リポテイコ酸の修飾（アラニン除去）は該組換えＴＡＰ 酵素活性の向上をもたらした。１ｍｇを０．１Ｍ トリス‐ＨＣＬバッファー( ｐＨ８．０）中に３７℃において２４時間再懸濁することによって、アラニンエ ステルをリポテイコ酸から除去した。遊離アラニンを、３５００ダルトンカット オフ膜中で脱イオン水に対して透析することによって除去した([Fischer，W．， H．U．Koch，P．Rosel，and F．Fiedler”Alanine ester-containing native Li poteichoic acids do not act as Lipoteichoic acid carrier”J.Biol ．Chem．,(1980)vol．255，pp．4557-4562]、出典明示して本明細書に含まれる) 。沈殿法 一般的には、ＢｕｒｇｅｒおよびＧｌａｓｅｒの方法に準じる。[Burger MM, Glaser L．”The synthesis of teicoic acids”J．Biol．Chem．(1964)vol．23 9，pp．3168‐3177]、出典明示して本明細書に含まれる。典型的な検定は、１‐ １００μｌの酵素、１０μｌのリポテイコ酸（水中、１ｍｇ／ｍｌ ビ ー・ズブチリス リポテイコ酸[Sigma])、２５μｌのＣＤＰ[³Ｈ]グリセロール( １０ｍＭ ＣＤＰグリセロール特異的活性 ８．８μＣｉ／μＭｏｌｅ)、およ び全容量を２５０μｌにする充分量のバッファーＡを含有する。該反応物を３７ ℃において１時間インキュベートし、８０μｌの３Ｎ 過塩素酸と混合し、氷上 に５分間置く。該酸処理サンプルをＧＦ／Ｃフィルター上にスポットし、４×５ ｍｌの０．１５Ｎ 過塩素酸で洗浄した後、液体シンチレーション計数を行った 。リポテイコ酸またはＣＤＰ[³Ｈ]グリセロールのいずれかを欠く対照反応物を 陰性対照として含ませた。 予備実験は、リポテイコ酸およびＣＤＰ[³Ｈ]グリセロールのＴＡＰとのイン キュベーションが酸沈殿物の形成をもたらすことを示した。この物質をセルロー ス薄層クロマトグラフィーによって分析すると、その物質は原点に残り、該ＴＡ Ｐ検定法において高分子量化合物が形成していたことが示唆された。この生成物 を１００℃において１Ｎ ＨＣｌの存在下で加水分解すると、グリセロールおよ びグリセロール３−ホスフェートと共泳動する分解生成物が生成した。クロマト グラフィープロフィールは、ポリグリセロールホスフェートの酸触媒分解に関し て報告されたもの（[Burger MM,Glaser L．”The synthesis of teicoicac ids”J.Biol．Chem．（1964）vol.239，pp.3168-3177]、出典明示して本明細書 に含まれる）と一致する。データは、リボテイコ酸がTＡP触媒反応において[³Ｈ ]グリセロール３−ホスフェートのＣＤＰ[³Ｈ]グリセロールからの転移につきア クセプターとして働き得ることを示し、それによって、ポリグリセロールホスフ エート鎖を延長する。表２は、エス・アウレウスおよびエス・フェカリス由来の 市販リポテイコ酸調製物も［³Ｈ]グリセロール３−ホスフェートのＣＤＰ［³Ｈ] グリセロールからの転移につきアクセプターとして働き得ることを示す。シンチレーションプロキシミティー(Scintillation Proximity)法（またはＳ ＰＡ） この検定法は、コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）およびコンカナバリン Ａ （concanavalin A;conA）のごときレクチンが種々のグラム陽性菌から単離され たリポテイコ酸上に存在する糖部位に結合する能力に基づく。例えば、該酵素を 、バッファー、[³Ｈ]ＣＤＰグリセロールおよび１０μｌのエンテロコッカス・ フェカリス（Enterococcus faecalis）リポテイコ酸と上記沈殿法につき記載し たごとく混合し得る。３７℃において１時間インキュベートした後、ビオチン化 コンカナビリンＡ（concanavilin A）を含有するストレパビジンＳＰＡビーズ （Amersham）を該検定物に添加し、全混合物を室温において３０分間、９６ウェ ルプレート中でインキュベートする。ｃｏｎＡ::ＳＰＡビーズコンジュゲートは この検定において形成された放射性リポテイコ酸と結合し、該酵素の活性をＰａ ｃｋａｒｄ Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔｅｒのごとき計数器を用いて定量することがで きる。種々のテイコ酸が基質として働き得、適当なレクチンはＳＰＡビーズに結 合し得る。例えば、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシ ウム（Enterococcus faecium）およびエンテロコッカス．ヒレ（Enterococcus h irae）はｃｏｎＡを含有するＳＰＡビーズに結合し得る。Ｎ−アセチルグルコサ ミン残基を含有する、スタフィロコッカス・アウレウスの細胞壁テイコ酸および リポテイコ酸はＷＧＡビーズに結合し得る。 リポテイコ酸がＴＡＰ酵素の基質として使用し得るという発見の別の使用 リポテイコ酸がＴＡＰ酵素の基質として使用し得るという発見は、他の実用的 な活用を示唆する。本発見の１つの明らかな活用は、グラム陽性菌によって引き 起こされまたは影響された病状の監視および管理に有用なキットおよび診断デバ イスの作成であろう。 リポテイコ酸はＴＡＰの基質として働き得、ＴＡＰは、ＣＤＰグリセロール由 来のグリセロール３−ホスフェート残基を付加することによって該リポテイコ酸 鎖を延長するであろうことを特徴とするから、ＴＡＰを使用して、血液および他 の体液を含む生体サンプルにおいてリポテイコ酸の存在を検出することができた 。 例えば、リポテイコ酸を含有すると考えられる生体サンプルの部分をＴＡＰおよ びＣＤＰグリセロールに添加し、１時間程度インキュベートすることができ、グ リセロール３−ホスフェートのＣＤＰグリセロールからサンプル中に存在するリ ポテイコ酸への転移は、”沈殿法”に記載された沈殿法によって検出することが で きるであろう。 したがって、ＴＡＰの可能性のある使用は、細菌がリポテイコ酸を体液中に放 出する細菌感染の診断を含むことができるであろう。ＴＡＰを使用して、体液中 のリポテイコ酸を検出し得る。現在、リポテイコ酸を標的する抗体を臨床サンプ ルにおけるリポテイコ酸の検出に使用しているが、本明細書に開示した発見は、 該ＴＡＰ酵素を使用して、同一の機能を果たすことを可能にする。 材料および方法 当業者ならば、上に提供した情報で本発明を再現し、実施できるであろうし、 以下に材料および方法を提供して、さらに本発明を例示するが、それらは断じて 限定するものと考慮すべきではない。 ビー・ズブチリスからのｒｏｄＣのクローニング ｒｏｄＣの公表された配列を使用して、ビー・ズブチリス染色体由来の遺伝子 をＰＣＲを用いて以下に従ってクローン化した； プライマー： および は、それぞれ、推定翻訳開始サイトの上流−３５ないし−８塩基および停止サイ トから−１５ないし＋９の配列にハイブリダイズした。プライマー配列を配列チ ャート３の配列番号３および４に再掲してある。９５℃において４５秒間／４８ ℃において４５秒間／および７２℃において２分間（３０サイクル）のプログラ ムを用いた増幅は、ｒｏｄＣの特徴である、１．５ｋｂおよび０．８ｋｂのＥｃ ｏＲＩフラグメントを供する２．３ｋｂ産物の生成をもたらした。プライマーＣ １ＡおよびＣ２Ａに設計したＢａｍＨＩサイトはｐＵＣ１８へのｒｏｄＣのクロ ーニングを可能にし、ｐＲＯＤＣＡＰ１８を供した。ｐＵＣの代わりに、他のい ずれの通常入手可能なクローニングベクターを使用することもできるであろう。 それには、ｐＵＣ系、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２および他の多くの 普通に入手可能なプラスミドのごときベクターを含む。ビー・ズブチリスｒｏｄＣ突然変異ＲＯＤＣ１１３の補完 ｐＲＯＤＣＡＰ１８由来のｒｏｄＣ遺伝子を２．３ｋｂのＢａｍＨＩフラグメ ントとして切り出し、イー・コリ／グラム陽性シャトルベクターｐＭＫ４のＢａ ｍＨＩサイトにライゲートしてｐＭＫＲＯＤＣを生成した。ｐＭＫ４プラスミド を選択したのは、イー・コリの様なグラム陰性菌においても、ビー・ズブチリス の様なグラム陽性菌においても増殖するからである。このタイプのいずれのシャ トルベクターも適切であろう。ｐＭＫＲＯＤＣを、標準的な方法を用いて温度感 受性ビー・ズブチリスｒｏｄＣ突然変異ＲＯＤＣ１１３にエレクトロポレートし た。該細胞をＬＢ／クロラムフェニコールにプレートし、５５℃においてインキ ュベートした。 配列決定 および[³⁵Ｓ]ｄＡＴＰ直接取込みを用いて、ｐＲＯＤＣＡＰ１８中に存在するｒ ｏｄＣ遺伝子を配列決定した。 ＴＡＰの過剰発現 ＴＡＰの過剰発現を達成するために、該ｒｏｄＣ遺伝子をｐＭＫＲＯＤＣから ２．３ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントとして切り出し、発現ベクターｐＴｒｃ９ ９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＢａｍＨＩサイトにライゲートして、ｐＢＳＲＯ ＤＣ１を形成した。本明細書においては、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａを選んだ が、ｐＴｃｒ９９Ａ、ｐＤＲ５４０、またはｐＥＴ−２１(＋)のごとき非常に強 力なプロモーターを持ついずれのプラスミドも適切な発現ベクターとなるであろ う。反対方向にｒｏｄＣを含有するもう１つの単離体は、ｐＢＳＲＯＤＣ２と称 された。これらの例において、ｐＴＲＣ９９Ａは該プラスミドの名前となろう。 タンパク質の発現に使用された各プラスミドは、以下の様な独特のプロモーター を有している：ｐＴＲＣ９９Ａ(ｔｒｃ プロモーター)、ｐＤＲ５４０(ｔａｃ プロモーター)、ｐＥＴ−２１(＋)(Ｔ７ プロモーター)。 エシェリキア・コリ（Escherichia coli）からのＴＡＰの過剰発現および部分 的精製 Ａ．細胞増殖および溶解 ｐＢＳＲＯＤＣ１で形質転換したＤＨ１０Ｂ（イー・コリ）細胞を２リットル の２Ｘ ＬＢ中で３時間増殖させ、ＩＰＴＧ（５ｍＭ）で４時間誘発し、遠心に より収穫し、−７０℃において貯蔵した。該細胞ペレットを５ｍｌのバッファー Ａ（５０ｍＭ トリス‐ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に再懸濁し、１０，０００ｐｓｉにおいてＦｒｅ- ｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｅｌｌに２回通すことによって溶解した。特記す べきは、２Ｘ ＬＢは２倍強度のＬｅｎｎｏｘ Ｂｒｏｔｈと言い換えることが できる。ＩＰＴＧはイソプロピルチオ−ベータ−Ｄ‐ガラクトシドの略である。 Ｂ．細胞膜からのＴＡＰの抽出 細胞溶解物を５，０００×ｇにおいて１５分間遠心して、未破砕細胞を除去し 、該上清を、１００，０００×ｇにおいて１時間遠心した。得られた膜ペレット を、２Ｍ ＮａＣｌを含有する２５ｍｌのバッファーＡに再懸濁し、ロータリー シェーカーで４℃にて２時間抽出した。次いで、サンプルを、１００，０００× ｇにおいて１時間遠心して、該膜をペレット状にし、該上清を、４リットルのバ ッファーＢ（５０ｍＭ ＮａＣｌを含有するバッファーＡ）に対して一晩透析し た。Ｃ．ＨｉｇｈＱ陰イオン交換クロマトグラフィー Ｅｃｏｎｏｓｙｓｔｅｍ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ− バッファーＢで平衡化した。全タンパク質が１０ｍｇである細胞膜の２Ｍ Ｎａ Ｃｌ抽出物の部分を該カラムに負荷し、非結合タンパク質を同一のバッファーで 洗い流した０．０５ないし０．５Ｍ ＮａＣｌ勾配を用いてＴＡＰをカラムから 流出し、ＴＡＰ活性を含有する画分を貯め、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３０限外ろ のバッファーＡに対して一晩透析した。 ＴＡＰ酵素検定 一般的には、ＢｕｒｇｅｒおよびＧｌａｓｅｒの方法に準じる。[Burger MM, Glaser L．”The synthesis of teicoic acids”J.Biol．Chem．(1964) vol．239，pp．3168‐3177]、出典明示して本明細書に含まれる。典型的な検定 は、１‐１００μｌの酵素、１０μｌのリポテイコ酸（水中、１ｍｇ／ｍｌ ビ ー・ズブチリス リポテイコ酸[Sigma])、２５μｌのＣＤＰ[³Ｈ]グリセロール( １０ｍＭ ＣＤＰグリセロール特異的活性 ８．８μＣｉ／μＭｏｌｅ)、およ び全容量を２５０μｌにする充分量のバッファーＡを含有する。該反応物を３７ ℃において１時間インキュベートし、８０μｌの３Ｎ 過塩素酸と混合し、氷上 に５分間置いた。該酸処理サンプルをＧＦ／Ｃフィルター上にスポットし、４× ５ｍｌの０．１５Ｎ 過塩素酸で洗浄した後、液体シンチレーション計数を行っ た。リポテイコ酸またはＣＤＰ[³Ｈ]グリセロールのいずれかを欠く対照反応物 を陰性対照として含ませた。 ＴＡＰ産物がポリグリセロールホスフェートであることの確認 適当な試薬をスケールアップすることによって全容１ｍｌ中で上記のごとく、 ＴＡＰ検定を行った。３７℃において１時間後、反応産物を３Ｎ 過塩素酸で沈 殿し、１４，０００×ｇにおいて１５分間遠心した。ペレットを０．５ｍｌの０ ．１５Ｎ 過塩素酸で２回洗浄し、急速真空器（ｓｐｅｅｄ ｖａｃ）中で乾燥 した後、０．１ｍｌの０．３Ｍ ＮＨ₄ＯＨに再懸濁した。この時点で、可溶性 物質は５．３×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌであった。約０．０９ｍｌのこの物質を急速 真空器中で乾燥し、続いて、０．１ｍｌの１Ｎ ＨＣｌに再懸濁した。この物質 を密封バイアル中、１００℃において還流し、１６時間加水分解した後、サンプ ルを取り出し、セルロースプレートおよび以下の溶媒系を用いる薄層クロマトグ ラフィーによって分析した：エタノール−ＮＨ₄アセテート、ｐＨ７．５（７． ５：３）およびｎ-プロパノール−アンモニア-水(６：３：１)。該溶媒でプレー トを展開した後、それらを室温において乾燥し、液体シンチレーション計数用に １×２ｃｍ切片にカットした。 発明のさらなる開示した具体例 ＴＡＰ配列の本開示で、クローン化ｒｏｄＣ遺伝子の無作為突然変異を構築し 、該染色体に戻して組込み、かくして、テイコ酸がグラム陽性菌の細胞壁の完全 性に与える効果を研究するために使用し得るＴＡＰ突然変異体のプールを生成し た。定義 本書類中の用語には、それらの用語につき当業者が用いている意味を付与すべ きである。以下は、いくつかの例である。 前である。 である。 ｈまたはｈｒは、時間である。 相同性および相同配列ならびに残基が本書類中で引用される。概して、これら の用語は、当業者に一般に認められている意味を有している。以下の定義も供さ れ、該用語の意味に関するいずれの科学的不一致も統制し、説明するであろう。 ここに、相同性の定義には２つあり、１つは、ＤＮＡまたは核酸配列に関したも ので、１つは、ペプチドまたはタンパク質配列に関したものである。 核酸相同性の定義：ある生体に由来する核酸配列が第２の生体に由来する核酸配 列にＸ％相同であるとは、第２の生体の遺伝子が、配列内のいずれの点において も、第１の生体の類似した遺伝子のヌクレオチド残基と同一のヌクレオチド残基 を１００個中にＸ個含有している時である。例えば、ビー・ズブチリスｒｏｄＣ 遺伝子の核酸配列に７０％相同であるエス・アウレウスからの核酸配列は、配列 内のいずれの点においても、１０個中７個のビー・ズブチリスｒｏｄＣ遺伝子の 核酸配列に同一のヌクレオチド残基を含有しているであろう。 ペプチドまたはタンパク質相同性の定義：ペプチドまたはタンパク質がもう１つ のペプチドまたはタンパク質にＸ％相同である場合、そのアミノ酸配列内のいず れの点においても、第１のアミノ酸配列のアミノ酸に同一であるかまたは類似で あるいずれかのアミノ酸残基を１００個中にＸ個含有しているであろう。 ＩＰＴＧは、イソプロピルチオ−ベータ−Ｄ-ガラクトシドの略である。 ｍ．またはｍｉｎ．は、分である。 クローニングベクターは、ｐＵＣ系、ｐＵＣ１８．ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２ 、および他の多くの普通に入手可能なプラスミドである。 シャトルベクターは、グラム陰性または陽性菌のいずれかにおいて増殖するプ ラスミドである。シャトルベクターの例は、ｐＭＫ４およびｐＹＬ１１２Δ１１ ９である。 発現ベクターは、ｐＴｃｒ９９Ａ、ｐＤＲ５４０、またはｐＥＴ−２１(＋)の ごとき、非常に強力なプロモーターを持つプラスミドである。 表１ 精製手法におけるＴＡＰ酵素活性 表２ ＴＡＰ活性に対するリポテイコ酸起源の影響 テクニカルチャート １ ビー・ズブチリスにおけるテイコ酸経路である。ビー・ズブチリスにおける細 胞壁テイコ酸合成の生合成経路である。テイコ酸のポリグリセロールホスフェー トポリマーはグラム陽性菌においてペプチドグリカンに連結している。 テクニカルチャート ２ スタフィロコッカス・アウレウスにおけるリポテイコ酸の生合成である。リポ テイコ酸合成の生合成経路である。リポテイコ酸の脂肪アシル鎖は細胞膜に埋め 込まれ、ポリグリセロールホスフェート骨格は細胞表面に向けて配向される。 テクニカルチャート ３ ビー・ズブチリステイコ酸生合成オペロンであり、テイコ酸ポリメラーゼをコ ードするｒｏｄＣ（ｔａｇＦ）遺伝子の位置を示している。 配列チャート １ ビー・ズブチリス由来のｒｏｄＣ遺伝子のＤＮＡ配列である。制限サイトを示 す。翻訳タンパク質配列も提供されている。このチャートは１８７１位における 突然変異も示し、その突然変異は、”Ｃの代わりにＴ”ＤＮＡ置換であり、”Ａ の代わりにＶ”アミノ酸置換をもたらす。この配列チャート１からのＤＮＡを配 列番号１として記載する(配列番号１は１８７１位に突然変異の無い配列)。この 配列チャート１からのタンパク質を配列チャート２に記載し、配列番号２として 記載する。下のチャートの左マージンの数字は核酸残基を示す。下記のＡＴＧは 、単離したＴＡＰ酵素の実際の第１番目のアミノ酸に対する正確な開始コドンで ある。実際には、上流リボソーム結合サイトも必要である。該プラスミドに挿入 さされた実際のＤＮＡ配列を配列チャート４に記載示す。ここに、このタンパク 質、下記の配列、配列番号２および配列チャート２は、実際にイー・コリにおい てプラスミドｐＢＳＲＯＤＣ１を用いて発現された。 配列チャート ２ 配列チャート１からのアミノ酸、またはタンパク質であって、下に示した単一 アミノ酸の変異を含む。この配列チャート２からのアミノ酸を配列番号２として 記載する(配列番号２は６１６位に突然変異の無い配列)。 配列チャート ３ 以下の２つのプライマーを使用して、ビー・ズブチリス由来のｒｏｄＣをクロ ーン化した。 Ｃ１Ａは、5'-TTCAGGATCCTTCTCTTGGAGG GTCACGGAAATAAAAG-3', であり、これは配列番号３である。 Ｃ２Ａは、5'-ATTTGGATCCCCTAAATTATTCAGCTTTAAATAC-3', であり、これは配列番号４である。 配列チャート ４ ビー・ズブチリス由来のｒｏｄＣ遺伝子のＤＮＡ配列である。制限サイトを示 す。翻訳タンパク質配列も提供されている。このチャートは１８７１位における 突然変異も示し、その突然変異は、”Ｃの代わりにＴ”ＤＮ置換であり、”Ａの 代わりにＶ”アミノ酸置換をもたらす。この配列チャート４からのＤＮＡを配列 番号５として記載する(配列番号５は１８７１位に突然変異の無い配列)。この配 列チャート４のみからのタンパク質を配列チャート５に記載し、配列番号６とし て記載する。下のチャートの左マージンの数字は核酸残基を示す。核酸残基２５ −２７のＡＴＧは、ＨｏｎｅｙｍａｎおよびＳｔｅｗａｒｔを引用したコンピュ ータ解析により予想したメチオニン翻訳開始サイトに対応する。核酸残基１００ ‐１０２において下線をしたＡＴＧは、該単離ＴＡＰ酵素の事実上一番目のアミ ノ酸であるメチオニン(下線をした太字のＭ)に対応する。特記すべきは、該プラ スミドに挿入された、(特記した制限サイトを持つ)実際のＤＮＡ配列をここに示 し、それは２５−２７位の該推定開始コドンの下流にある上流リボソーム結合サ イトを含む。実際のリボソーム結合サイトは８３−８７位にある。該実際のリボ ソーム結合サイトは明かにＡＧＧＡＧであり、他のリボソーム結合サイトをＡＧ ＧＡＧサイト中にあるごとく、設計し得るであろう。 配列チャート ５ 配列チャート４からの推定アミノ酸、またはタンパク質であって、下に示した 単一アミノ酸の変異を含む。この配列チャート５からのアミノ酸を配列番号６と して別個に記載する(配列番号６は６１６位に変異の無い配列)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 イーガン，サラ・イー アメリカ合衆国49083ミシガン州リッチラ ンド、ノース・サーティセカンド・ストリ ート10177番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （基質および検定法） １^*． ＴＡＰタンパク質によって触媒される酵素反応に対する基質としての リポテイコ酸の使用。 ２． 該リポテイコ酸がビー・ズブチリス、エス・アウレウスまたはイー・フ ェカリスから単離精製されるか、または市販の起源から得られる請求項１記載の リポテイコ酸の使用。 ３． 該リポテイコ酸がビー・ズブチリス、エス・アウレウスまたはイー・フ ェカリスから調製される請求項１記載のリポテイコ酸の使用。 ４． 該リポテイコ酸がＣＤＰ[³Ｈ]グリセロールのアクセプターとして働く 請求項３記載のリポテイコ酸の使用。 ５． 該ＴＡＰタンパク質がクローン化細胞から発現されたペプチドまたはタ ンパク質であって、該ペプチドまたはタンパク質がチャート２または配列番号２ のアミノ酸残基に少なくとも約７０％相同なペプチドまたはタンパク質を含むこ とを特徴とする請求項１記載のリポテイコ酸の使用。 ６． 該ＴＡＰタンパク質がチャート２または配列番号２のアミノ酸残基と実 質的に同一のアミノ酸残基を含むペプチドまたはタンパク質である請求項５記載 のリポテイコ酸の使用。 ７． （グリセロール３−ホスフェートを含有する）ＣＤＰ−グリセロールに 加えてＨ₂Ｏ、加えてＴＡＰ酵素、加えてリポテイコ酸を合わせ、次いで、リポ テイコ酸に転移したグリセロール３−ホスフェートの量を測定することを特徴と するＴＡＰ酵素活性の測定方法。 ８． 該ＣＤＰ‐グリセロールが放射性ＣＤＰ−グリセロールである請求項７ 記載の方法。 ９． 該放射性ＣＤＰ−グリセロールが[³Ｈ]グリセロール３−ホスフェート （[³Ｈ]グリセロールホスフェートとしても公知）から作成される請求項８記載 の方法。 １０． 該リポテイコ酸を処理して、他の成分と合わせる前にアラニンを除去す る請求項７記載の方法。 １１． 放射性ＣＤＰ‐グリセロールに加えてＨ₂Ｏ、加えてＴＡＰ酵素、加え てリポテイコ酸、加えてストレパビジンＳＰＡビーズおよびコムギ胚芽アグルチ ニンのごとき適切なレクチンを合わせ、リポテイコ酸に転移したグリセロール− ３−ホスフェートの量を該ＳＰＡビーズに結合したレクチンを測定することによ って測定することを特徴とする請求項８記載の方法。 １２． 該ＴＡＰ酵素がいずれかの不純調製物由来である請求項７記載の方法。 １３． 該ＴＡＰ酵素がクローン化細胞から発現されたペプチドまたはタンパク 質であって、該ペプチドまたはタンパク質が配列番号２の最初の２０個のＮ−末 端アミノ残基に対して少なくとも約９０％の同一性を有し、かつ、チャート２ま たは配列番号２の全アミノ酸残基に少なくとも約７０％相同なペプチドまたはタ ンパク質を含むことを特徴とする請求項７記載の方法。 １４． 該ＴＡＰ酵素が配列番号２に開示したタンパク質と実質的に同一である 請求項７記載の方法。 （タンパク質） １５^*． クローン化細胞から発現されたペプチドまたはタンパク質であって、 配列番号２の最初の２０個のＮ−末端アミノ残基に対して少なくとも約９０％の 相同性を有し、かつ、チャート２または配列番号２の全アミノ酸残基に少なくと も約７０％相同な該ペプチドまたはタンパク質。 １６． チャート２または配列番号２の全タンパク質に少なくとも約８０％相同 である請求項１５記載のペプチドまたはタンパク質。 １７． チャート２または配列番号２の全タンパク質に少なくとも約９０％相同 である請求項１６記載のペプチドまたはタンパク質。 １８． チャート２または配列番号２の全タンパク質に少なくとも約９５％相同 である請求項１７記載のペプチドまたはタンパク質。 １９． チャート２または配列番号２のそれらに実質的に同一か、あるいは類似 する残基を含む請求項１８記載のペプチドまたはタンパク質。 ２０． チャート２または配列番号２に開示した残基を含む請求項１９のペプチ ドまたはタンパク質。 ２１． アラニンの代わりにバリンが６１６位のアミノ酸である請求項１９のペ プチドまたはタンパク質。 （ＤＮＡ） ２２^*. クローン化核酸残基配列であって、ＣＤＰ‐グリセロールに加えてＨ₂ Ｏをテイコ酸またはリポテイコ酸にする反応を触媒する能力を有し、配列番号１ の最初の２０個の核酸残基（５’末端）に対して少なくとも約９０％の相同性を 有し、約７０パーセント以上の相同性にする標準的ストリンジェント条件下で配 列番号１のＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる核酸残基配列を含む該 クローン化核酸残基配列。 ２３． 約８０％以上の相同性にするストリンジェント条件下、配列番号１のＤ ＮＡ配列にハイブリダイズ可能な請求項２２記載のクローン化核酸残基配列。 ２４． 約９０％以上の相同性にするストリンジェント条件下、配列番号１のＤ ＮＡ配列にハイブリダイズ可能な請求項２３記載のクローン化核酸残基配列。 ２５． 約９５％以上の相同性にするストリンジェント条件下、配列番号１のＤ ＮＡ配列にハイブリダイズできる請求項２４記載のクローン化核酸残基配列。 ２６． 配列番号１のＤＮＡ配列中の残基と実質的に同一か、または類似する残 基を含む請求項２５記載のクローン化核酸残基配列。 ２７． 配列番号１のＤＮＡ配列に示した残基を含む請求項２６記載のクローン 化核酸残基配列。 ２８． チャート２に示すごとく、残基４から２２７４まで、または最初の制限 サイトから最後の制限サイトまでの該残基を含む請求項２７記載の核酸残基配列 のフラグメント。 ２９． チャート２に示されるごとく、残基２４から２２６４まで、または最初 の開始コドンから最後の停止コドンまでの該残基を含む請求項２７記載の核酸残 基配列のフラグメント。 ３０． 配列番号２に開示したタンパク質をコードする核酸を含む請求項２６記 載の核酸。 ３１． 請求項２６記載のクローン化核酸残基配列であって、ここに、１８７２ 位の残基がシスチンの代わりにチロシンであり、ここに、この配列から発現した タンパク質が、該発現ペプチドの６１６位のアラニンの代わりにバリンを発現す る請求項２６記載のクローン化核酸残基配列。 ３２^*． 当該配列フラグメントが約７．０、５．０または４．２Ｋベースであ るスタフィロコッカス・アウレウス由来の単離核酸残基配列フラグメントであっ て、ここに、該配列フラグメントがスタフィロコッカス・アウレウスゲノムのＥ ｃｏＲＩ消化物から産生され、ここに、該配列フラグメントの配列が配列番号２ の関連残基に少なくとも約７０％相同する該単離核酸残基配列フラグメント。 ３３^*． 当該配列フラグメントが約４．５、３．３または２．８Ｋベースであ るスタフィロコッカス・アウレウス由来の単離核酸残基配列フラグメントであっ て、ここに、該配列フラグメントがスタフィロコッカス・アウレウスゲノムのＨ ｉｎｄＩＩＩ消化物から産生され、ここに、該配列フラグメントの配列が配列番 号２の関連残基に少なくとも約７０％相同する該単離核酸残基配列フラグメント 。 （ベクター） ３４^*． ベクターであって、クローニングベクター、シャトルベクターまたは 発現ベクターのいずれかを含み、ＣＤＰ‐グリセロールに加えてＨ₂Ｏをテイコ 酸またはリポテイコ酸にする反応を触媒する能力を有し、配列番号１の最初の２ ０個の核酸残基（５’末端）に対して少なくとも約９０％の相同性を有し、約７ ０パーセント以上の相同性にする標準的ストリンジェント条件下で配列番号１の ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる核酸残基配列を含むクローン化核 酸残基配列を有する該ベクター。 ３５． クローニングベクターとして適切ないずれかのプラスミドから選択され たプラスミドを含む請求項３４記載のプラスミド。 ３６． いずれかの適切な、広く入手可能であるか、または市販のプラスミドか ら選択された請求項３５記載のプラスミド。 ３７． いずれかの適切なｐＵＣまたは適切なｐＢＲプラスミドから選択された 請求項３６記載のプラスミド。 ３８． ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９またはｐＢＲ３２２から選択された請求項３７ 記載のプラスミド。 ３９． 当該ベクターが適切なシャトルベクターである請求項３４記載のベクタ ー。 ４０． ｐＭＫ４またはｐＹＬ１１２Δ１１９から選択された請求項３９記載の シャトルベクター。 ４１． 当該発現プラスミドが強力プロモーターを有するプラスミドである請求 項３４記載の発現ベクター。 ４２． 該強力プロモーターを有する該プラスミドがｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＤＲ５ ４０またはｐＥＴ‐２１(＋)から選択される請求項４１記載の発現ベクター。 ４３． クローニングプラスミド、ｐＵＣ１８に配置され、配列番号１のＤＮＡ 配列と実質的に同一であるＤＮＡ配列を含有するクローニングプラスミドを含み 、ｐＲＯＤＣＡＰ１８と名付けられた請求項３５記載のプラスミド。 ４４． シャトルベクター、ｐＭＫ４に配置され、配列番号１のＤＮＡ配列と実 質的に同一であるＤＮＡ配列を含有するシャトルプラスミドを含み、ｐＭＫＲＯ ＤＣと名付けられた請求項３９記載のプラスミド。 ４５． 当該プラスミドが、配列番号２に記載されたタンパク質をコードする配 列番号１の核酸を含む核酸を、請求項４３記載のｐＲＯＤＣＡＰ１８プラスミド から切り出す工程の産物として産生された請求項３５記載のプラスミド。 ４６． 当該プラスミドが、配列番号２に記載されたタンパク質をコードする配 列番号１の核酸を含む核酸を、請求項４３記載のｐＲＯＤＣＡＰ１８プラスミド ４から切り出す工程の産物として産生され、次いで強力プロモーターを持つ発現 ベクターに配置され、ｐＢＳＲＯＤＣ１またはｐＢＳＲＯＤＣ１と名付けられた 請 求項４１記載のプラスミド。 ４７． 該強力プロモーターを有する発現ベクターがｐＴｒｃ９９Ａである請求 項４６記載のプラスミド。 ４８． 当該プラスミドが、配列番号２に記載されたタンパク質をコードする配 列番号１の核酸を含む核酸を、請求項４４記載のｐＭＫＲＯＤＣプラスミドから 切り出す工程の産物として産生され、次いで強力プロモーターを持つ発現ベクタ ーに配置された請求項４１記載のプラスミド。 ４９． 該強力プロモーターを有する発現ベクターがｐＴｒｃ９９Ａである請求 項４８記載のプラスミド。 ５０． 該ＴＡＰ酵素およびＣＤＰグリセロールを使用して、グラム陽性菌によ って引き起こされた疾患を検出および監視するための診断キット。 （細胞） ５１． 請求項３４記載のベクターで形質転換した細菌細胞。 ５２． 該細菌細胞がイー・コリ細胞である請求項５１記載の細菌細胞。 ５３． 該イー・コリがタイプＤＨ１０Ｂである請求項５２記載の細菌細胞。 ５４． 請求項３４‐４９いずれか１項記載のベクターに組み込まれた請求項２ ２−２３記載のいずれかのＤＮＡ。 ５５． 請求項３４−４９いずれか１項記載のプラスミドで形質転換した請求項 ５１記載の細菌細胞。 ５６． イー・コリ細胞である請求項５５記載の細菌細胞。 ５７． タイプＤＨ１０Ｂである請求項５６記載の細菌性イー・コリ細胞。 ５８． 図２に示したサザンブロットに開示したタンパク質。 ５９． 該リポテイコ酸を適切な試薬で処理して、他の成分と合わせる前にアラ ニンを除去する請求項７−１４いずれか１項記載の方法。 ６０． 本出願に開示した発明および発見。