DE3752307T2 - Verfahren zum Sammeln von Insekten-Körperflussigkeiten - Google Patents

Verfahren zum Sammeln von Insekten-Körperflussigkeiten

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Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Die Körperflüssigkeit von Insekten kann beispielsweise nach dem Verfahren gesammelt werden, das von M. Ashida (Insect Biochem., 11, 57... 65 (1981)) offenbart wurde. Bei dem genannten Verfahren werden Insekten, z. B. Larven von Seidenraupen ((auch "Maulbeer-Seidenspinner", d. Übers.)), auf Eis narkotisiert und in das Hämozöl (Körperhohlraum) physiologische Kochsalzlösung injiziert, die entweder Zucker enthält, einschliesslich als eine Verunreinigung Rohrzuckerfaktor (in Zuckerrohr enthaltende polymere Substanzen, die beispielsweise Glucose und Aminosäuren umfassen), oder es wird Rohrzuckerfaktor selbst in das Hämozöl injiziert. Danach wird der Larvenkörper mit einem feinen Faden gehalten, um Exsudation der injizierten Kochsalzlösung zu vermeiden. Nach dem Stehenlassen bei Raumtemperatur für etwa 20 Minuten wird in einem Bein ein Schnitt gemacht und die Körperflüssigkeit gesammelt. Die gesammelte Flüssigkeit wird zur Entfernung von Blutzellen zentrifugiert und danach dialysiert und das Insektenplasma erhalten.
  • In Insect Biochemistry, 16, Nr. 3, (1968) S. 539, "Microbial activation of two serine enzymes and phenoloxidase in the plasma fraction of haemolymph of the silkworm, Bombyx mori" (Yoshida et al.) wird ein Verfahren zur Gewinnung von Insekten-Köperflüssigkeit offenbart, das den Schritt des Kontaktieren der Hämolymphe mit einer Kochsalzlösung umfasst, die Zucker und Rohrzuckerfaktor enthält, wonach die Dialyse der Hämolymphe erfolgt.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • In einer der Ausführungsformen gewährt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Sammeln einer Körperflüssigkeit von einem Insekt, welches Verfahren umfasst: Zusetzen einer Insekten-Körperflüssigkeit zu einer für das zu verwendende Insekt isotonischen Lösung, die eine Substanz enthält, die irreversibel Serinproteasen inhibiert, sowie Entfernen einer überschüssigen Menge der inhibierenden Substanz.
  • In einer alternativen Ausführungsform gewährt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Sammeln einer Körperflüssigkeit von einem Insekt, welches Verfahren umfasst:
  • Injizieren einer für das zu verwendende Insekt isotonischen Lösung in das Insekt, die eine Substanz enthält, die Serinproteasen irreversibel inhibiert; Einschneiden in einen Teil des Insektenkörpers; Sammeln der Körperflüssigkeit, die austritt; und Entfernen einer überschüssigen Menge der inhibierenden Substanz.
    • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Hinsichtlich der in dem erfindungsgemässen Verfahren zu verwendenden Insekten gibt es keine Beschränkung, jedoch sind grössere Vertreter mit bekannten Aufzuchtverfahren bevorzugt. Beispiele für derartige Insekten sind Manduca serta, Galleria malonella, Hyalphoma ceropia und Bombyx mori (Seidenraupe), die zur Ordnung der Lepidoptera gehören; Sarcophaga peregrina und Musca, die zur Ordnung der Diptera gehören, Locusta und migratoria Telogryllus, die zur Ordnung der Orthoptera gehören; sowie Cerambyx, die zur Ordnung der Coleoptera gehören.
  • Hämolymphe, bei der es sich um Körperflüssigkeit handelt, die aus dem Körperhohlraum erhalten wird, lässt sich am leichtesten gewinnen und wird daher üblicherweise verwendet.
  • Die Körperflüssikgeit von Insekten kann nach den nachfolgend beschriebenen Verfahren der vorliegenden Erfindung gesammelt werden. In einer der Ausführungsformen wird zu einer Lösung, die für die zu sammelnde Insekten-Körperflüssigkeit isotonisch ist und Serinproteasen (nachfolgend bezeichnet als "SP")-Inhibitor (nachfolgend bezeichnet als "SPI") enthält, bei dem es sich um eine SP irreversibel inhibierende Substanz handelt, eine Insekten-Körperflüssigkeit zugesetzt und das überschüssige SPI entfernt.
  • In einer alternativen Ausführungsform wird ein Verfahren beschrieben, umfassend die Schritte: Injizieren einer für das zu verwendende Insekt isotonischen Lösung in das Insekt, die eine Substanz enthält, die Serinproteasen irre versibel inhibiert; Einschneiden in einen Teil des Insektenkörpers; Sammeln der Körperflüssigkeit, die austritt; und Entfernen einer überschüssigen Menge der inhibierenden Substanz.
  • Hinsichtlich des SPI gibt es solange keine spezielle Beschränkung, wie er SP irreversibel inhibieren kann, und solange, wie er von der erhaltenen Fraktion der Insekten- Körperflüssigkeit abgetrennt werden kann.
  • Unter den SPI's sind vom Standpunkt der Handhabung solche bevorzugt, die verhältnismässig kleine relative Molekülmassen haben, z. B. 2.000 oder weniger, und die durch Dialyse entfernt werden können. Da Rohrzuckerfaktor (CSF) durch Dialyse nicht entfernt werden kann und in vitro keine unterdrückende Wirkung hat, ist CSF kein irreversibel wirkender SPI. Bevorzugte Beispiele des SPI sind p- (Aminizinophenyl)-methansulfonylfluorid (p-APMSF), Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), Diisopropylfluorphosphorsäure (DFP), p-Nitrophenyl-p'-guanidinobenzoesäure (NPGB) und Dihydroxychlormethylcumalin.
  • Es ist ausreichend, den SPI zu der vorgenannten isotonischen Lösung in einer Menge zuzusetzen, die mindestens erforderlich ist, um SP zu inaktivieren, der während des Sammelns der Körperflüssigkeit inaktiviert werden soll. Die bevorzugte Menge SPI in der isotonischen Lösung beträgt 0,1 10 mMol und mehr bevorzugt 0,5... 5 mMol.
  • Das Verfahren kann beispielsweise folgendermassen ausgeführt werden:
  • Aus einem verletzten Teil des Insekts austretende Körperflüssigkeit wird direkt in eine Lösung tropfen gelassen, die SPI enthält und in Bezug auf die zu sammelnde Insekten-Körperflüssigkeit isotonisch ist. Alternativ wird die nach Injizieren einer Lösung aus dem verletzten Teil des Insekt austretende Körperflüssigkeit gesammelt, die SPI enthält und in Bezug auf die zu sammelnde Insekten-Körperflüssigkeit eines Insekts isotonisch ist. Danach wird die gesammelte Flüssigkeit zur Entfernung der Blutzellen zentrifugiert. Ausserdem wird überschüssiges SPI, das in der resultierenden, die Körperflüssigkeit enthaltenden Lösung vorhanden ist, nach einem oder mehreren geeigneten Verfahren entfernt, die auf dem Gebiet der Biochemie für die Abtrennung und Reinigung je nach der Beschaffenheit des verwendeten SPI angewendet werden. Beispiele für derartige Verfahren sind ein Dialyse-Verfahren, ein Gel-Filtrationsverfahren, ein Ionenaustauschverfahren oder die Hochleistungsflüssigchromatographie. Als Ergebnis kann die angestrebte, Insektenplasma enthaltende Lösung erhalten werden. Darüber hinaus kann der Schritt der SPI-Entfernung ausgeführt werden, nachdem die zentrifugierte Lösung bis zu einem gewissen Masse nach einem konventionellen Verfahren einem Einengen und einer Reinigung unterzogen wurde, wie beispielsweise der Fraktionierung mit Ammoniumsulfat.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht, auf die sie jedoch nicht beschränkt ist.
    • Referenzbeispiel 1
  • Präparieren von Seidenraupen-Plasma
  • Es wurde Seidenraupen-Plasma nach der Ashida-Methode (Insect. Biochem., Bd.11, S. 57...65 (1981)) folgendermassen präpariert:
  • Es wurden Seidenraupen-Larven des fünften Stadiums für 10 Minuten auf Eis narkotisiert. Es wurde physiologische Kochsalzlösung in der Menge der Hälfte des Körpergewichts und mit einem Gehalt von 20 mM Rohrzucker oder 6 ug/ml Rohrzuckerfaktor von Rohrzucker gereinigt in das Hämozöl durch eine Nadel zur subkutanen Injektion injiziert, die an der Verbindung der fünften und sechsten Abdominalsegmente eingesetzt war. Nach der Injektion wurde der Larvenkörper mit einem feinen Faden an dem Hinterende des fünften Abdominalsegments befestigt, um eine Exsudation der injizierten Kochsalzlösung zu vermeiden. Nach dem Stehenlassen bei Raumtemperatur für etwa 20 Minuten wurde in einem Bein ein Schnitt gemacht, um ein Bluten an dem dritten Abdominalsegment zu ermöglichen. Die gesammelte Flüssigkeit wurde zur Entfernung von Hämatozyten bei 1.500 g für 5 Minuten bei einer niedrigen Temperatur (etwa 4ºC) zentrifugiert. Der Überstand wurde in einer Menge von 100 ml als die erhaltene Lösung einer Dialyse bei niedriger Temperatur für zwei Tage gegen 3 Liter 0,01 M Tris-Malat-Buffer (pH 6,5 mit einem Gehalt von 0,15 M KCl) unterzogen, um das gewünschte Seidenraupen-Plasma zu ergeben.
    • Beispiel 1
  • Es wurden Seidenraupen-Larven (Bombyx mori) des fünften Stadiums für 10 Minuten auf Eis narkotisiert. Es wurde am dritten Abdominalsegment in einem Bein ein Schnitt gemacht und austretende Hämolymphe in 10 ml einer 0,9%-igen NaCl- Lösung mit einem Gehalt von 2 mM p-APMSF tropfen gelassen und gesammelt. Aus 25 Seidenraupen-Larven wurden etwa 15 ml Hämolymphe erhalten. Daraus wurden etwa 25 ml einer verdünnten Lösung Hämolymphe erhalten. Die verdünnte Lösung Hämolymphe wurde bei 1.500 g für fünf Minuten zu Entfernung der Hämatozyten zentrifugiert. Zu 25 ml des resultierenden Überstands wurden 37,5 ml gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung zugesetzt, um eine 60%-ige gesättigte Ammoniumsulfat-Suspension zu ergeben, die bei 1.000 g für 20 Minuten zentrifugiert wurde, um einen Niederschlag zu ergeben. Dieser Niederschlag wurde 27 ml. 0,01 M Tris-Malat-Puffer (pH 6,5 mit einem Gehalt von 0,15 M NaCl), aufgelöst, wozu 0,1 ml einer 200 mM Lösung von p-APMSF zugesetzt und 4 mal gegen 1 Liter 0,01 M Tris-Malat-Puffer (pH 6,5 mit einem Gehalt von 0,15 M NaCl) dialysiert wurde. Die dialysierte Lösung wurde bei 1.000 g für 20 Minuten bei niedrigen Temperaturen zentrifugiert, um das gewünschte Seidenraupen-Plasma zu ergeben.
  • Die gleichen Ergebnisse wurden auch erhalten, wenn NPGB anstelle von p-APMSF verwendet wurde.
    • Beispiel 2
  • Es wurden Seidenraupen-Larven (Bombyx mori) des fünften Stadiums für 10 Minuten auf Eis narkotisiert. Es wurde eine 0,9%-igen NaCl-Lösung mit einem Gehalt von 2 mM p-APMSF in das Hämozöl an der Verbindung der fünften und sechsten Abdominalsegmente injiziert. Nach der Injektion wurden die Larven mit einem feinen Faden an dem Hinterende des fünften Abdominalsegments befestigt, um Exsudation der injizierten Kochsalzlösung zu verhindern. Danach wurde am dritten Abdominalsegment in einem Bein ein Schnitt gemacht, um austretende Körperflüssigkeit (Hämolymphe) zu sammeln. Die gesammelte Hämolymphe wurde bei 1.500 g für 5 Minuten bei niedrigen Temperaturen zur Entfernung der Hämatozyten zentrifugiert. Zu 10 ml des erhaltenen Überstands wurden 0, 05 ml einer Lösung mit 200 mM p-APMSF zugesetzt und die erhaltene Lösung bei 10.000 g für 20 Minuten bei niedrigen Temperaturen zentrifugiert. Der Überstand wurde durch eine Sephadex G-25-Säule (2, 5 cm Durchmesser und 25 cm Länge) geschickt und mit 0,01 mM Tris-Malat-Puffer (pH 6,5 mit einem Gehalt von 0,15 M NaCl) equilibriert. Nach dem Aufnehmen von Peaks von Protein, die in das Porenvolumen der Säure eluiert wurden, wurde das gewünschte Seidenraupen- Plasma erhalten.

Claims (2)

1. Verfahren zum Sammeln von Körperflüssigkeit von einem Insekt, welches Verfahren umfasst:
Zusetzen einer Insekten-Körperflüssigkeit zu einer Lösung, die in Bezug auf die Körperflüssigkeit des Insekts isotonisch ist, wobei die Lösung eine Substanz enthält, die irreversibel Serinproteasen inhibiert, sowie
Entfernen einer überschüssigen Menge der inhibierenden Substanz.
2. Verfahren zum Sammeln von Körperflüssigkeit von einem Insekt, welches Verfahren umfasst:
Injizieren einer für das zu verwendende Insekt isotonischen Lösung in das Insekt, die eine Substanz enthält, die Serinproteasen irreversibel inhibiert; Einschneiden in einen Teil des Insektenkörpers; Sammeln der austretenden Körperflüssigkeit; und Entfernen einer überschüssigen Menge der inhibierenden Substanz.
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