JPH07114706B2 - 新規測定試薬 - Google Patents
新規測定試薬Info
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- JPH07114706B2 JPH07114706B2 JP28824486A JP28824486A JPH07114706B2 JP H07114706 B2 JPH07114706 B2 JP H07114706B2 JP 28824486 A JP28824486 A JP 28824486A JP 28824486 A JP28824486 A JP 28824486A JP H07114706 B2 JPH07114706 B2 JP H07114706B2
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- glucan
- reagent
- component
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- enzyme
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、β−1,3−グルカンに特異的に反応する成分
を含んで成る試薬及びそれを用いたβ−1,3−グルカン
の定量方法に関する。
を含んで成る試薬及びそれを用いたβ−1,3−グルカン
の定量方法に関する。
β−1,3−グルカン（以下、β−Ｇと略称する。）は、
自然界には、酵母やカビの細胞壁の骨格構成物として、
また多くの担子菌子実体（キノコ）の主要な多糖成分と
して存在している。β−Ｇがガブトガニ血球成分を用い
たエンドトキシン検出方法である所謂リムルステストに
於て陽性を示すことはよく知られており、その性質を利
用して、カブトガニ血球成分から精製された試薬を用い
てβ−Ｇを特異的に定量する方法が発表されているが
（臨床病理，33 639−644,1985）、未だ実用化には到っ
ていない。また、本発明者の一部らは、蚕から得られた
体液が、エンドキシンとは反応しないが、β−Ｇまたは
ペプチドグリカン（以下、PGと略称する。）と反応し、
それにより少なくとも３種の酵素、即ち、Ｎ−α−ベン
ゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル分解酵素（以
下、BAEEaseと略称する。）、プロ−フェノールオキシ
ダーゼ活性化酵素（以下、PPAEと略称する。）及びフェ
ノールオキシダーゼ（以下、POと略称する。）が活性化
されることを先に見出した（Insect Biochem.,16,539〜
545,1986）が、特異性に問題があるため、これをβ−Ｇ
の定量に応用する迄には到らなかった。
自然界には、酵母やカビの細胞壁の骨格構成物として、
また多くの担子菌子実体（キノコ）の主要な多糖成分と
して存在している。β−Ｇがガブトガニ血球成分を用い
たエンドトキシン検出方法である所謂リムルステストに
於て陽性を示すことはよく知られており、その性質を利
用して、カブトガニ血球成分から精製された試薬を用い
てβ−Ｇを特異的に定量する方法が発表されているが
（臨床病理，33 639−644,1985）、未だ実用化には到っ
ていない。また、本発明者の一部らは、蚕から得られた
体液が、エンドキシンとは反応しないが、β−Ｇまたは
ペプチドグリカン（以下、PGと略称する。）と反応し、
それにより少なくとも３種の酵素、即ち、Ｎ−α−ベン
ゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル分解酵素（以
下、BAEEaseと略称する。）、プロ−フェノールオキシ
ダーゼ活性化酵素（以下、PPAEと略称する。）及びフェ
ノールオキシダーゼ（以下、POと略称する。）が活性化
されることを先に見出した（Insect Biochem.,16,539〜
545,1986）が、特異性に問題があるため、これをβ−Ｇ
の定量に応用する迄には到らなかった。
このように、定量方法が未だ確立していないためもあっ
て、β−Ｇの人体への影響についてはいまのところ不明
な点が多いが、最近では、セルロース系血液透析膜使用
時に起こるショックの一因であるとの疑いや、真菌感染
症の患者の体液中に存在するという示唆等もあり、β−
Ｇの定量は、医学、薬学、微生物学の分野で今後ますま
す重要となると考えられている。
て、β−Ｇの人体への影響についてはいまのところ不明
な点が多いが、最近では、セルロース系血液透析膜使用
時に起こるショックの一因であるとの疑いや、真菌感染
症の患者の体液中に存在するという示唆等もあり、β−
Ｇの定量は、医学、薬学、微生物学の分野で今後ますま
す重要となると考えられている。
本発明は上記した如き状況に鑑みなされたもので、PGと
は反応すぜにβ−Ｇと特異的に反応して酵素活性を発現
する成分を含ませて成るβ−Ｇ測定用試薬とそれを用い
たβ−Ｇの定量方法を提供することを目的とする。
は反応すぜにβ−Ｇと特異的に反応して酵素活性を発現
する成分を含ませて成るβ−Ｇ測定用試薬とそれを用い
たβ−Ｇの定量方法を提供することを目的とする。
本発明は、昆虫の体液からPGと反応して酵素活性を発現
する成分を除去して得られる、PGとは反応せずにβ−Ｇ
と特異的に反応して酵素活性を発現する成分を含ませて
成るβ−Ｇ測定用試薬及び該試薬を用いることを特徴と
するβ−1,3−グルカンの定量方法の発明である。
する成分を除去して得られる、PGとは反応せずにβ−Ｇ
と特異的に反応して酵素活性を発現する成分を含ませて
成るβ−Ｇ測定用試薬及び該試薬を用いることを特徴と
するβ−1,3−グルカンの定量方法の発明である。
即ち、本発明者らは昆虫の体液からPGとは反応せずにβ
−G5特異的に反応して酵素活性を発現する物質をとり出
すべく鋭意研究を重ねた結果、これの分離精製に成功
し、これをβ−Ｇを含む検体と反応させ、発現するBAEE
ase,PPAE,PO等の酵素活性を測定することにより、或
は、これらの酵素活性の発現時間を測定することによ
り、β−Ｇの定量が可能となることを見出し本発明を完
成するに到った。
−G5特異的に反応して酵素活性を発現する物質をとり出
すべく鋭意研究を重ねた結果、これの分離精製に成功
し、これをβ−Ｇを含む検体と反応させ、発現するBAEE
ase,PPAE,PO等の酵素活性を測定することにより、或
は、これらの酵素活性の発現時間を測定することによ
り、β−Ｇの定量が可能となることを見出し本発明を完
成するに到った。
本発明に用いることのできる体液の得られる昆虫として
は、特に制限はないが、なるべく大型のもので飼育方法
の確立しているものが望ましく、例えば、タバコスズメ
ガ，カイコガ等の鱗翅類、センチニクバエ，イエバエ等
の双翅類、トノサマバッタ，エンマコオロギ等の直翅
類、センノキカミキリ等の甲虫類等が挙げられるが、こ
れらに限定されるものではない。
は、特に制限はないが、なるべく大型のもので飼育方法
の確立しているものが望ましく、例えば、タバコスズメ
ガ，カイコガ等の鱗翅類、センチニクバエ，イエバエ等
の双翅類、トノサマバッタ，エンマコオロギ等の直翅
類、センノキカミキリ等の甲虫類等が挙げられるが、こ
れらに限定されるものではない。
体液としては、体腔から得られるヘモリンパ（hemolymp
h）が最も得られやすくより一般的である。
h）が最も得られやすくより一般的である。
体液を得る方法としては、例えば、本発明者の一部らが
行った方法（Insect Biochem.,11,57〜65,1981）があ
る。即ち、昆虫を氷上に置き動きを止めた後、トウキビ
因子（サトウキビに含まれるグルコース，アミノ酸など
かろ成る高分子物質）を不純物として含む蔗糖、または
トウキビ因子そのものを含む生理食塩水を体腔に注射
し、その後しばらく放置して、体腔よりヘモリンパを集
める。集めた液を遠心分離器にかけ血球を除いた後透析
すれば血漿が得られる。
行った方法（Insect Biochem.,11,57〜65,1981）があ
る。即ち、昆虫を氷上に置き動きを止めた後、トウキビ
因子（サトウキビに含まれるグルコース，アミノ酸など
かろ成る高分子物質）を不純物として含む蔗糖、または
トウキビ因子そのものを含む生理食塩水を体腔に注射
し、その後しばらく放置して、体腔よりヘモリンパを集
める。集めた液を遠心分離器にかけ血球を除いた後透析
すれば血漿が得られる。
このようにして得られた血漿中には、エンドトキシンと
は反応しないがβ−Ｇと特異的に反応して酵素活性を発
現する物質（或は発現を誘引する物質）と、PGと特異的
に反応して酵素活性を発現する物質（或は発現を誘引す
る物質）と、β−G,PGのいずれとも反応して酵素活性を
発現する物質（或は発現を誘引する物質）とが共存して
いるので、このうちPGと反応して酵素活性を発現する
（或は発現を誘引する）成分を除去すれば、これをPGと
は反応せずにβ−Ｇと特異的に反応して酵素活性を発現
する成分とすることができる。
は反応しないがβ−Ｇと特異的に反応して酵素活性を発
現する物質（或は発現を誘引する物質）と、PGと特異的
に反応して酵素活性を発現する物質（或は発現を誘引す
る物質）と、β−G,PGのいずれとも反応して酵素活性を
発現する物質（或は発現を誘引する物質）とが共存して
いるので、このうちPGと反応して酵素活性を発現する
（或は発現を誘引する）成分を除去すれば、これをPGと
は反応せずにβ−Ｇと特異的に反応して酵素活性を発現
する成分とすることができる。
昆虫の血漿から、PGと反応して酵素活性を発現する（或
は発現を誘引する）成分を除去する方法としては、ゲル
過法、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー法、
アフィニティークロマトグラフィー法等、一般に生化学
の分野で用いられている分離精製法がいずれも挙げられ
るが、PGを結合させた担体を用いたアフィニティークロ
マトグラフィーによりこれを行えば、極めて容易に且つ
効率よくこれを行うことができるので、特に好ましい。
以下、この方法について述べる。
は発現を誘引する）成分を除去する方法としては、ゲル
過法、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー法、
アフィニティークロマトグラフィー法等、一般に生化学
の分野で用いられている分離精製法がいずれも挙げられ
るが、PGを結合させた担体を用いたアフィニティークロ
マトグラフィーによりこれを行えば、極めて容易に且つ
効率よくこれを行うことができるので、特に好ましい。
以下、この方法について述べる。
PGを結合させる担体としては、セルロース、アガロー
ス、デキストラン、ポリアクリルアミド、多孔性ガラス
等、アフィニティークロマトグラフィーに於て通常用い
られている担体は、いずれも使用可能であるが、中でも
アガロースが特に好ましい。アガロース系担体の具体的
商品としては、セファロース（ファルマシア社）、バイ
オゲルＡ（BIO−RAD社）等があり、デキストラン系のも
のとしては、セファデックス（ファルマシア社）、セフ
ァクリル（ファルマシア社）が、また、ポリアクリルア
ミド系のものとしては、エンザフィックスＰ（和光純薬
工業（株））、バイオゲルＰ（BIO−RAD社）等が夫々市
販されているが、これらに限定されるものではない。こ
れらの担体にPGを結合させる為には担体を活性化させる
必要があることは言うまでもない。担体の活性化法は種
々あり、特に限定されるものではないが、例えば、アガ
ロース系担体の場合には、CNBrによる活性化が最も一般
的でよく用いられる。また、活性化アガロースとして
は、他にエポキシ活性化アガロース等もあるが、同様に
使用可能であることは言うまでもない。
ス、デキストラン、ポリアクリルアミド、多孔性ガラス
等、アフィニティークロマトグラフィーに於て通常用い
られている担体は、いずれも使用可能であるが、中でも
アガロースが特に好ましい。アガロース系担体の具体的
商品としては、セファロース（ファルマシア社）、バイ
オゲルＡ（BIO−RAD社）等があり、デキストラン系のも
のとしては、セファデックス（ファルマシア社）、セフ
ァクリル（ファルマシア社）が、また、ポリアクリルア
ミド系のものとしては、エンザフィックスＰ（和光純薬
工業（株））、バイオゲルＰ（BIO−RAD社）等が夫々市
販されているが、これらに限定されるものではない。こ
れらの担体にPGを結合させる為には担体を活性化させる
必要があることは言うまでもない。担体の活性化法は種
々あり、特に限定されるものではないが、例えば、アガ
ロース系担体の場合には、CNBrによる活性化が最も一般
的でよく用いられる。また、活性化アガロースとして
は、他にエポキシ活性化アガロース等もあるが、同様に
使用可能であることは言うまでもない。
担体に結合させるPGとしては、各種細菌（例えば、Micr
ococcus属,Streptococcus属,Mycobacterium属,Bacillus
属,Staphylococcus属等）の細胞壁から得られる天然の
それでもよいし、また、卵白リゾチーム等適当な酵素で
或る程度分解（消化）したものでも良い。
ococcus属,Streptococcus属,Mycobacterium属,Bacillus
属,Staphylococcus属等）の細胞壁から得られる天然の
それでもよいし、また、卵白リゾチーム等適当な酵素で
或る程度分解（消化）したものでも良い。
尚、PGを上記した如き担体に結合して用いる代りに、PG
そのものを担体として用いてアフィニティークロマトグ
ラフィーを行うことも勿論可能である。
そのものを担体として用いてアフィニティークロマトグ
ラフィーを行うことも勿論可能である。
アフィニティークロマトグラフィーをより効果的に行う
には、予め血漿中にキレート剤等を添加して体液中に存
在するCa2+、Mg2+等２価の陽イオンの影響を除いた状態
にした後これを行うことが望ましい。この目的で用いら
れるキレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四
酢酸ナトリウム（EDTA）、エチレングリコールビス（β
−アミノエチルエーテル）−N,N,N′,N′−四酢酸ナト
リウム（EGTA）等が挙げられるが、これらに限定される
ものではない。キレート剤の使用量は特に限定されるも
のではないが、通常、血漿中の濃度が1mM〜10mM程度に
なるように用いられる。
には、予め血漿中にキレート剤等を添加して体液中に存
在するCa2+、Mg2+等２価の陽イオンの影響を除いた状態
にした後これを行うことが望ましい。この目的で用いら
れるキレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四
酢酸ナトリウム（EDTA）、エチレングリコールビス（β
−アミノエチルエーテル）−N,N,N′,N′−四酢酸ナト
リウム（EGTA）等が挙げられるが、これらに限定される
ものではない。キレート剤の使用量は特に限定されるも
のではないが、通常、血漿中の濃度が1mM〜10mM程度に
なるように用いられる。
アフィニティークロマトグラフィーの操作法自体は自体
公知なアフィニティークロマトグラフィーの操作法に従
ってこれを行えば足りる。
公知なアフィニティークロマトグラフィーの操作法に従
ってこれを行えば足りる。
このようにして、昆虫の血漿をPGを結合させた担体（若
しくはPGからなる担体）を用いたアフィニティークロマ
トグラフィーにより処理すれば、PGとは反応せずにβ−
Ｇと特異的に反応して酵素活性を発現する成分が容易に
得られるので、これをβ−Ｇ測定用試薬として用いてβ
−Ｇの定量を行えばよい。
しくはPGからなる担体）を用いたアフィニティークロマ
トグラフィーにより処理すれば、PGとは反応せずにβ−
Ｇと特異的に反応して酵素活性を発現する成分が容易に
得られるので、これをβ−Ｇ測定用試薬として用いてβ
−Ｇの定量を行えばよい。
β−Ｇの定量を行うには、β−Ｇを含む検体と、上記PG
とは反応せずにβ−Ｇと特異的に反応して酵素活性を発
現する成分を含ませて成る試薬（以下、β−Ｇ試薬と略
称する。）とをよく混合して反応液とし、一定時間後の
反応液中の酵素活性、例えば、BAEEase、PPAE、PO等の
活性を自体公知の測定方法に従って測定し、予め、濃度
既知のβ−Ｇの標準液を用いて同様の操作により作成し
た検量線からβ−Ｇの定量を行ってもよいし（以下、本
法をエンド法と略称する。）、また、POの活性化に要す
る時間が検体中のβ−Ｇ濃度に依存する現象を利用し
て、β−Ｇ試薬と検体とを混合した後、POによる反応生
成物の量がある一定値となるまでの時間を測定する方法
（本発明者らが見出した方法。以下、タイム法と略称す
る。）によってこれを行ってもよい。
とは反応せずにβ−Ｇと特異的に反応して酵素活性を発
現する成分を含ませて成る試薬（以下、β−Ｇ試薬と略
称する。）とをよく混合して反応液とし、一定時間後の
反応液中の酵素活性、例えば、BAEEase、PPAE、PO等の
活性を自体公知の測定方法に従って測定し、予め、濃度
既知のβ−Ｇの標準液を用いて同様の操作により作成し
た検量線からβ−Ｇの定量を行ってもよいし（以下、本
法をエンド法と略称する。）、また、POの活性化に要す
る時間が検体中のβ−Ｇ濃度に依存する現象を利用し
て、β−Ｇ試薬と検体とを混合した後、POによる反応生
成物の量がある一定値となるまでの時間を測定する方法
（本発明者らが見出した方法。以下、タイム法と略称す
る。）によってこれを行ってもよい。
これらのいずれの方法で行うにせよ、この定量を行う際
には、先にPGとは反応せずにβ−Ｇと特異的に反応して
酵素活性を発現する成分を取り出す際に除去した２価の
金属イオン、例えば、Ca2+、Mg2+等を反応液中に改めて
添加してやる必要がある。その濃度としては、反応液中
の最終濃度として、4mM〜10mM程度が好ましく用いられ
る。
には、先にPGとは反応せずにβ−Ｇと特異的に反応して
酵素活性を発現する成分を取り出す際に除去した２価の
金属イオン、例えば、Ca2+、Mg2+等を反応液中に改めて
添加してやる必要がある。その濃度としては、反応液中
の最終濃度として、4mM〜10mM程度が好ましく用いられ
る。
酵素活性測定に必要な、基質、緩衝剤、共役酵素、補酵
素等、更には、要すれば、発色剤、酵素賦活剤、酵素や
色素の安定化剤、界面活性剤等、目的とする酵素活性の
測定法として自体公知の方法に於て使用されるものは当
然のことながら本発明に於てもそれに準じて使用される
が、これらは予めβ−Ｇ試薬中に溶解しておいてもよい
し、また、エンド法で行う場には、別に酵素活性測定用
の試液を準備しておき、反応液の一部を採取しそれを試
料として改めて酵素活性を測定してもよい。
素等、更には、要すれば、発色剤、酵素賦活剤、酵素や
色素の安定化剤、界面活性剤等、目的とする酵素活性の
測定法として自体公知の方法に於て使用されるものは当
然のことながら本発明に於てもそれに準じて使用される
が、これらは予めβ−Ｇ試薬中に溶解しておいてもよい
し、また、エンド法で行う場には、別に酵素活性測定用
の試液を準備しておき、反応液の一部を採取しそれを試
料として改めて酵素活性を測定してもよい。
これらの方法によりβ−Ｇの定量を行う際、β−Ｇを含
む検体とβ−Ｇ試薬との反応温度は、反応が進行する温
度であれば特に限定はされないが、通常、20〜40℃が好
ましく用いられる。
む検体とβ−Ｇ試薬との反応温度は、反応が進行する温
度であれば特に限定はされないが、通常、20〜40℃が好
ましく用いられる。
反応pHは、測定する酵素の種類によって当然異ってくる
が、通常、pH6〜10が好ましく用いられる。またこの反
応pHを維持する為、通常緩衝剤が用いられるが、この緩
衝剤としては反応に影響を与えないものであれば種類及
び使用濃度に特に制約はなく、例えば、リン酸塩、ホウ
酸塩、酢酸塩、トリス緩衝液、グッズ（Good's）緩衝液
等がいずれも挙げられる。
が、通常、pH6〜10が好ましく用いられる。またこの反
応pHを維持する為、通常緩衝剤が用いられるが、この緩
衝剤としては反応に影響を与えないものであれば種類及
び使用濃度に特に制約はなく、例えば、リン酸塩、ホウ
酸塩、酢酸塩、トリス緩衝液、グッズ（Good's）緩衝液
等がいずれも挙げられる。
本発明の方法により測定可能なβ−Ｇとしては、例え
ば、ザイモサン、カードラン、パキマン等の所謂β−Ｇ
の他、β−1,3−結合を有するグルコースポリマーやそ
の誘導体、例えばスクレロタン、レンチナン、シゾフィ
ラン、コリオラン、ラミナラン、リケナンなども挙げら
れる。
ば、ザイモサン、カードラン、パキマン等の所謂β−Ｇ
の他、β−1,3−結合を有するグルコースポリマーやそ
の誘導体、例えばスクレロタン、レンチナン、シゾフィ
ラン、コリオラン、ラミナラン、リケナンなども挙げら
れる。
以下に実施例及び参考例を挙げ、本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもの
ではない。
説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもの
ではない。
参考例 1.蚕血漿の調製法 芦田法（Insect Biochem.,11,57〜65,1981）に従って以
下のように行った。
下のように行った。
第五齢の蚕幼虫を氷上に10分間置き動きを止めた後、20
mMのサトウキビから精製された蔗糖、または６μg/mlの
トウキビ因子を含む生理食塩水を蚕の体重の半量分、蚕
の第５及び第６腹部節の間より注射した。注射した液が
漏れないように細い糸で第５腹部節の前で縛り、20分室
温放置後、第３腹部節の足を切ってヘモリンパ（hemoly
mph）を集めた。集めたヘモリンパを1,500×ｇで５分
間、低温で遠心し血漿を除いた。上清約100mlを0.01M−
トリス−リンゴ酸緩衝液（0.15MのKClを含有、pH6.5）
３中で、２日間、低温下透析を行い目的の蚕血漿とし
た。
mMのサトウキビから精製された蔗糖、または６μg/mlの
トウキビ因子を含む生理食塩水を蚕の体重の半量分、蚕
の第５及び第６腹部節の間より注射した。注射した液が
漏れないように細い糸で第５腹部節の前で縛り、20分室
温放置後、第３腹部節の足を切ってヘモリンパ（hemoly
mph）を集めた。集めたヘモリンパを1,500×ｇで５分
間、低温で遠心し血漿を除いた。上清約100mlを0.01M−
トリス−リンゴ酸緩衝液（0.15MのKClを含有、pH6.5）
３中で、２日間、低温下透析を行い目的の蚕血漿とし
た。
参考例 2.PGの調製 ミクロコッカス ルテウス（Micrococcus luteus）ATCC
4698の菌体を冷水150ml中に懸濁し、直径0.1mmのガラ
スビーズを0.6g/ml添加したのち０℃で超音波処理を行
って菌体を破砕した。ガラスビーズを除去した後、2,20
0×ｇで10分間遠心分離して沈澱を除去し、さらに上清
を20,000×ｇで45分間遠心分離した。得られた沈澱を1M
NaCl溶液150mlに懸濁し、遠心分離により2,200×ｇ〜2
0,000×ｇの分画を集め粗細胞壁標品とした。
4698の菌体を冷水150ml中に懸濁し、直径0.1mmのガラ
スビーズを0.6g/ml添加したのち０℃で超音波処理を行
って菌体を破砕した。ガラスビーズを除去した後、2,20
0×ｇで10分間遠心分離して沈澱を除去し、さらに上清
を20,000×ｇで45分間遠心分離した。得られた沈澱を1M
NaCl溶液150mlに懸濁し、遠心分離により2,200×ｇ〜2
0,000×ｇの分画を集め粗細胞壁標品とした。
得られた粗細胞壁標品を80mlの水に懸濁し、100℃で20
分間加温したのち冷却し、2M酢酸−酢酸ナトリウム緩衝
液（pH5.9）140ml及びRNA分解酵素10mgを加え37℃で３
時間反応させた。その後20,000×ｇで１時間遠心分離
し、得られた沈澱を50mMトリス−塩酸緩衝液（20mM MgC
l2、1mM CaCl2及び7mgのDNaseI（Sigma社製）を含む。p
H7.5）に懸濁し37℃で３時間反応させた。その後、20,0
00×ｇで１時間遠心分離し、得られた沈澱を0.4％ドデ
シル硫酸ナトリウム溶液100mlに懸濁して室温で１時間
放置した。その後沈澱を蒸留水で６回洗浄し、凍結乾燥
して精製細胞壁標品とした。
分間加温したのち冷却し、2M酢酸−酢酸ナトリウム緩衝
液（pH5.9）140ml及びRNA分解酵素10mgを加え37℃で３
時間反応させた。その後20,000×ｇで１時間遠心分離
し、得られた沈澱を50mMトリス−塩酸緩衝液（20mM MgC
l2、1mM CaCl2及び7mgのDNaseI（Sigma社製）を含む。p
H7.5）に懸濁し37℃で３時間反応させた。その後、20,0
00×ｇで１時間遠心分離し、得られた沈澱を0.4％ドデ
シル硫酸ナトリウム溶液100mlに懸濁して室温で１時間
放置した。その後沈澱を蒸留水で６回洗浄し、凍結乾燥
して精製細胞壁標品とした。
得られた精製細胞壁標品を0.1N塩酸中に懸濁し60℃で24
時間放置後、20,000×ｇで１時間遠心分離し、得られた
沈澱を蒸留水で洗浄した後、凍結乾燥してPGを得た。
時間放置後、20,000×ｇで１時間遠心分離し、得られた
沈澱を蒸留水で洗浄した後、凍結乾燥してPGを得た。
実施例 1. （１）PG固定化セファロース4Bカラムの調製 参考例２で得られた精製PG153mgを80mM酢酸アンモニウ
ム153mlに懸濁し、卵白リゾチーム1.5mgを加えて45℃で
４分間撹拌加温後、37℃で２時間消化した。ミリポアフ
ィルター（HAWPO 4700）で過し、液を凍結乾燥し
た。凍結乾燥品を蒸留水6mlで溶解し、その5.5mlをセフ
ァデックスＧ−50SFのカラム（溶出液:50mM炭酸アンモ
ニウム溶液、2.5×90cm、溶出速度:15ml/hr）でゲル
過を行った。消化された結果生ずる還元糖の活性のある
分画の中心部を集めて凍結乾燥し、その凍結乾燥品を0.
1M炭酸ナトリウム緩衝液（pH10）6.3mlに溶解してPG溶
液とした。このPG溶液とCNBr活性化セファロース4B（フ
ァルマシア社製）2.7gを常法に従って反応させ、PG固定
化セファロース4Bとした。
ム153mlに懸濁し、卵白リゾチーム1.5mgを加えて45℃で
４分間撹拌加温後、37℃で２時間消化した。ミリポアフ
ィルター（HAWPO 4700）で過し、液を凍結乾燥し
た。凍結乾燥品を蒸留水6mlで溶解し、その5.5mlをセフ
ァデックスＧ−50SFのカラム（溶出液:50mM炭酸アンモ
ニウム溶液、2.5×90cm、溶出速度:15ml/hr）でゲル
過を行った。消化された結果生ずる還元糖の活性のある
分画の中心部を集めて凍結乾燥し、その凍結乾燥品を0.
1M炭酸ナトリウム緩衝液（pH10）6.3mlに溶解してPG溶
液とした。このPG溶液とCNBr活性化セファロース4B（フ
ァルマシア社製）2.7gを常法に従って反応させ、PG固定
化セファロース4Bとした。
この様にして得られた、PG固定化セファロース4Bをカラ
ム（0.6×1.7cm）に充填し、0.01Mトリス−リンゴ酸緩
衝液（0.15M KCl及び1mM EDTAを含む。pH6.5）で平衡化
し、PGカラムとした。
ム（0.6×1.7cm）に充填し、0.01Mトリス−リンゴ酸緩
衝液（0.15M KCl及び1mM EDTAを含む。pH6.5）で平衡化
し、PGカラムとした。
（２）β−Ｇ試薬の調製 参考例１で得られた蚕血漿に100mM EDTA溶液（pH6.5）
をEDTAの終濃度が1mMとなるように添加し、その溶液15m
lを（１）で得られたPGカラムで処理した（溶出液:0.15
M KCl及び1mM EDTA含有0.01Mトリス−リンゴ酸緩衝液、
pH6.5。溶出速度:6ml/hr）。試料を注入した直後から12
mlの溶出液を集めβ−Ｇ試薬とした。
をEDTAの終濃度が1mMとなるように添加し、その溶液15m
lを（１）で得られたPGカラムで処理した（溶出液:0.15
M KCl及び1mM EDTA含有0.01Mトリス−リンゴ酸緩衝液、
pH6.5。溶出速度:6ml/hr）。試料を注入した直後から12
mlの溶出液を集めβ−Ｇ試薬とした。
（３）β−Ｇ試薬及び蚕体液中の不活性酵素のザイモサ
ン（β−Ｇ）又はPGによる活性化度の測定 （測定操作法） 参考例１で得られた蚕血漿又は（２）で得られたβ−Ｇ
試薬200μｌに80mM CaCl2溶液20μｌを添加し、更に1mg
/mlのザイモサン溶液あるいは1mg/mlのPG溶液を20μｌ
加えてよく混合し、25℃で反応させた。所定の時間に所
定量の反応液を採取し、POの活性化度あるいはBAEEase
の活性値を測定した。
ン（β−Ｇ）又はPGによる活性化度の測定 （測定操作法） 参考例１で得られた蚕血漿又は（２）で得られたβ−Ｇ
試薬200μｌに80mM CaCl2溶液20μｌを添加し、更に1mg
/mlのザイモサン溶液あるいは1mg/mlのPG溶液を20μｌ
加えてよく混合し、25℃で反応させた。所定の時間に所
定量の反応液を採取し、POの活性化度あるいはBAEEase
の活性値を測定した。
PO活性化度の測定 基質溶液（4mM 4−メチルカテコール及び8mM 4−ヒドロ
キシプロリンエチルエステル含有0.1Mリン酸緩衝液、pH
6.0）1mlに試料（前記反応液）10μｌを加え30℃で10分
間反応させた後、生成するキノン色素の520nmの吸光度
を測定してPOの活性化度を求めた。
キシプロリンエチルエステル含有0.1Mリン酸緩衝液、pH
6.0）1mlに試料（前記反応液）10μｌを加え30℃で10分
間反応させた後、生成するキノン色素の520nmの吸光度
を測定してPOの活性化度を求めた。
第１図に各種試料を基質溶液と反応させたときの反応時
間による520nmに於ける吸光度の変化を示す。但し、−
●−はザイモサンとβ−Ｇ試薬とを、−▲−はPGとβ−
Ｇ試薬とを、−○−はザイモサンと蚕血漿とを、また、
−△−はPGと蚕血漿とを夫々反応させて得られた試料を
用いたときの吸光度変化を夫々示す。
間による520nmに於ける吸光度の変化を示す。但し、−
●−はザイモサンとβ−Ｇ試薬とを、−▲−はPGとβ−
Ｇ試薬とを、−○−はザイモサンと蚕血漿とを、また、
−△−はPGと蚕血漿とを夫々反応させて得られた試料を
用いたときの吸光度変化を夫々示す。
BAEEase活性の測定 予め25℃に保温した基質溶液（2mM N−α−ベンゾイル
−Ｌ−アルギニンエチルエステル、1mM NAD（ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド）、0.1mg/mlアルコール
デヒドロゲナーゼ、0.25Mトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン及び0.2Mセミカルバジド含有、pH8.5、at2
5℃）1mlに試料30μｌを加えよく混合し、25℃で反応さ
せて生ずるNADH（還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド）の340nmの吸光度の増加を測定した。
−Ｌ−アルギニンエチルエステル、1mM NAD（ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド）、0.1mg/mlアルコール
デヒドロゲナーゼ、0.25Mトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン及び0.2Mセミカルバジド含有、pH8.5、at2
5℃）1mlに試料30μｌを加えよく混合し、25℃で反応さ
せて生ずるNADH（還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド）の340nmの吸光度の増加を測定した。
尚、BAEEaseの１単位（Ｕ）は上記反応条件下で１分間
に1n molのエタノールを生成する量とした。
に1n molのエタノールを生成する量とした。
結果を表１に示す。
これらの結果から明らかなように、蚕体液中の酵素はザ
イモサン及びPGによって活性化されるが、β−Ｇ試薬中
の酵素はザイモサンによってのみ活性化され、PGによて
は活性化されないことがわかる。
イモサン及びPGによって活性化されるが、β−Ｇ試薬中
の酵素はザイモサンによってのみ活性化され、PGによて
は活性化されないことがわかる。
実施例 2. カードランによる検量線の作成 （測定操作） 実施例１で得られたβ−Ｇ試薬2mlに80mM CaCl2溶液200
μｌを添加しよく混合した。この10μｌに所定濃度のカ
ードラン溶液10μｌを加え30℃で60分間加温後、実施例
１で用いたPO活性測定用基質溶液1mlを加え、更に30℃
で10分間反応させた後、520nmの吸光度を測定した（測
定値;ES）。カードラン溶液の代りに精製水を用いて同
様に操作して盲検値（EBl）を得た。
μｌを添加しよく混合した。この10μｌに所定濃度のカ
ードラン溶液10μｌを加え30℃で60分間加温後、実施例
１で用いたPO活性測定用基質溶液1mlを加え、更に30℃
で10分間反応させた後、520nmの吸光度を測定した（測
定値;ES）。カードラン溶液の代りに精製水を用いて同
様に操作して盲検値（EBl）を得た。
（結 果） 第２図に、カードラン濃度と（ES−EBl）値の関係を横
軸、縦軸共に対数軸を用いて示した。
軸、縦軸共に対数軸を用いて示した。
この結果から明らかな如く、良好な直線性が得られた。
実施例 3. カードランによる検量線の作成 （測定操作） 実施例１で得られたβ−Ｇ試薬2mlに80mM CaCl2 200μ
ｌを添加しよく混合した。この70μｌに、0.1Mリン酸緩
衝液（20mM L−ドーパ含有、pH6.0）70μｌ及び所定濃
度のカードラン溶液70μｌを加えてよく混合し、25℃
で、トキシノメーター（和光純薬工業（株）製）を用い
て透過光量が15％減少するまでの時間（Δｔ）を測定し
た。
ｌを添加しよく混合した。この70μｌに、0.1Mリン酸緩
衝液（20mM L−ドーパ含有、pH6.0）70μｌ及び所定濃
度のカードラン溶液70μｌを加えてよく混合し、25℃
で、トキシノメーター（和光純薬工業（株）製）を用い
て透過光量が15％減少するまでの時間（Δｔ）を測定し
た。
（結 果） 第３図に、Δｔとカードラン濃度の関係を横軸、縦軸共
に対数軸を用いて示した。
に対数軸を用いて示した。
この結果から明らかな如く、良好な直線性が得られた。
以上述べた如く、本発明はPGとは反応せずにβ−Ｇと特
異的に反応して酵素活性を発現する成分を含ませて成る
β−Ｇ測定用試薬、及び該試薬を用いた、β−Ｇの定量
方法を提供するものであり、本発明の定量法を用いるこ
とにより、真菌汚染の検出、セルロース系血液透析膜の
製品検査、エンドトキシン以外のリムルステスト反応物
質の検査等が可能となり、しかも、極めて容易に且つ精
度よくこれを行うことができる点に甚だ顕著な効果を奏
するものであり、斯業に貢献するところ大なるものであ
る。
異的に反応して酵素活性を発現する成分を含ませて成る
β−Ｇ測定用試薬、及び該試薬を用いた、β−Ｇの定量
方法を提供するものであり、本発明の定量法を用いるこ
とにより、真菌汚染の検出、セルロース系血液透析膜の
製品検査、エンドトキシン以外のリムルステスト反応物
質の検査等が可能となり、しかも、極めて容易に且つ精
度よくこれを行うことができる点に甚だ顕著な効果を奏
するものであり、斯業に貢献するところ大なるものであ
る。
第１図は実施例１に於て得られた各種試料と基質溶液と
を反応させたときの、反応時間による520nmに於ける吸
光度の変化を示し、横軸の各時間（分）について得られ
た520nmの吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結ん
だものである。但し、−●−は試料としてβ−Ｇ試薬と
ザイモサンとの反応液を、−▲−はβ−Ｇ試薬とPGとの
反応液を、−○−は蚕血漿とザイモサンとの反応液を、
また、−△−は蚕血漿とPGとの反応液を夫々用いた時の
結果を示す。 第２図は、実施例２に於て得られた検量線を示し、横軸
はカードラン濃度（ng/ml）を、また、縦軸は520nmに於
ける吸光度を夫々示す。 第３図は、実施例３に於て得られた検量線を示し、横軸
はカードラン濃度（ng/ml）を、また、縦軸は透過光量
が15％減少するまでの時間（分）を夫々示す。
を反応させたときの、反応時間による520nmに於ける吸
光度の変化を示し、横軸の各時間（分）について得られ
た520nmの吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結ん
だものである。但し、−●−は試料としてβ−Ｇ試薬と
ザイモサンとの反応液を、−▲−はβ−Ｇ試薬とPGとの
反応液を、−○−は蚕血漿とザイモサンとの反応液を、
また、−△−は蚕血漿とPGとの反応液を夫々用いた時の
結果を示す。 第２図は、実施例２に於て得られた検量線を示し、横軸
はカードラン濃度（ng/ml）を、また、縦軸は520nmに於
ける吸光度を夫々示す。 第３図は、実施例３に於て得られた検量線を示し、横軸
はカードラン濃度（ng/ml）を、また、縦軸は透過光量
が15％減少するまでの時間（分）を夫々示す。
Claims (3)
- 【請求項１】昆虫の体液からペプチドグリカンと反応し
て酵素活性を発現する成分を除去して得られる、ペプチ
ドグリカンとは反応せずにβ−1,3−グルカンと特異的
に反応して酵素活性を発現する成分を含ませて成るβ−
1,3−グルカン測定用試薬。 - 【請求項２】検体と、昆虫の体液からペプチドグリカン
と反応して酵素活性を発現する成分を除去して得られ
る、ペプチドグリカンとは反応せずにβ−1,3−グルカ
ンと特異的に反応して酵素活性を発現する成分を含ませ
て成るβ−1,3−グルカン測定用試薬とを混合し、その
結果活性化される酵素の活性を測定することにより検体
中のβ−1,3−グルカンの定量を行うことを特徴とする
β−1,3−グルカンの定量方法。 - 【請求項３】検体と、昆虫の体液からペプチドグリカン
と反応して酵素活性を発現する成分を除去して得られ
る、ペプチドグリカンとは反応せずにβ−1,3−グルカ
ンと特異的に反応して酵素活性を発現する成分を含ませ
て成るβ−1,3−グルカン測定用試薬とを混合し、その
結果活性化される酵素の活性の発現時間を測定すること
により検体中のβ−1,3−グルカンの定量を行うことを
特徴とするβ−1,3−グルカンの定量方法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28824486A JPH07114706B2 (ja) | 1986-12-03 | 1986-12-03 | 新規測定試薬 |
| DE3751109T DE3751109T2 (de) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Reagenzien zur Bestimmung von Peptidoglykan und beta-1,3-Glukan. |
| EP87117621A EP0270039B1 (en) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Reagents for determining peptidoglycan and beta-1,3-glucan |
| ES87117621T ES2068180T3 (es) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Reactivos para determinar peptidoglicano y beta-1,3-glucano. |
| AT87117621T ATE119204T1 (de) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Reagenzien zur bestimmung von peptidoglykan und beta-1,3-glukan. |
| EP94111388A EP0634656B1 (en) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Processes for collecting body fluid from insects |
| DE3752307T DE3752307T2 (de) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Verfahren zum Sammeln von Insekten-Körperflussigkeiten |
| AT94111388T ATE188777T1 (de) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Verfahren zum sammeln von insekten- körperflussigkeiten |
| US07/127,315 US4970152A (en) | 1986-12-03 | 1987-12-02 | Reagents for determining peptidoglycan and β-1,3-glucan |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28824486A JPH07114706B2 (ja) | 1986-12-03 | 1986-12-03 | 新規測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63141598A JPS63141598A (ja) | 1988-06-14 |
| JPH07114706B2 true JPH07114706B2 (ja) | 1995-12-13 |
Family
ID=17727700
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28824486A Expired - Fee Related JPH07114706B2 (ja) | 1986-12-03 | 1986-12-03 | 新規測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07114706B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2891401A (en) | 2000-01-20 | 2001-07-31 | Samyang Genex Corporation | Composition for detecting beta-1,3-glucan, preparation method thereof and diagnostic kit detecting beta-1,3-glucan |
-
1986
- 1986-12-03 JP JP28824486A patent/JPH07114706B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63141598A (ja) | 1988-06-14 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |