JPH07114707B2 - 新規な測定試薬 - Google Patents
新規な測定試薬Info
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- JPH07114707B2 JPH07114707B2 JP28824586A JP28824586A JPH07114707B2 JP H07114707 B2 JPH07114707 B2 JP H07114707B2 JP 28824586 A JP28824586 A JP 28824586A JP 28824586 A JP28824586 A JP 28824586A JP H07114707 B2 JPH07114707 B2 JP H07114707B2
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- peptidoglycan
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- enzyme
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ペプチドグリカンに特異的に反応する成分を
含んで成る試薬及びそれを用いたペプチドグリカンの定
量方法に関する。
含んで成る試薬及びそれを用いたペプチドグリカンの定
量方法に関する。
ペプチドグリカン（以下、PGと略称する。）は一般細菌
類の細胞壁成分をなす糖ペプチドのポリマーで、一般的
にはＮ−アセチルまたはＮ−グリコリルムラミン酸とＤ
−アミノ酸を含むことを特徴としている。PGは発熱性、
肝臓腎臓機能低下性、エンドトキシンの活性増大作用、
アジュバント活性（免疫機能の増強効果）等多くの生物
活性を有しており、医学、薬学、微生物学等の分野で盛
んに研究されているにもかかわらず、その特異的な定量
法はいまのところ見出されていない。
類の細胞壁成分をなす糖ペプチドのポリマーで、一般的
にはＮ−アセチルまたはＮ−グリコリルムラミン酸とＤ
−アミノ酸を含むことを特徴としている。PGは発熱性、
肝臓腎臓機能低下性、エンドトキシンの活性増大作用、
アジュバント活性（免疫機能の増強効果）等多くの生物
活性を有しており、医学、薬学、微生物学等の分野で盛
んに研究されているにもかかわらず、その特異的な定量
法はいまのところ見出されていない。
一方、本発明者らの一部らは、蚕から得られた体液が、
エンドトキシンとは反応しないが、PGまたはβ−1,3−
グルカン（以下、β−Ｇと略称する。）と反応し、それ
により少なくとも３種の酵素、即ち、Ｎ−α−ベンゾイ
ル−Ｌ−アルギニンエチルエステル分解酵素（以下、BA
EEaseと略称する。）、プロ−フェノールオキシダーゼ
活性化酵素（以下、PPAEと略称する。）及びフェノール
オキシダーゼ（以下、POと略称する。）が活性化される
ことを先に見出した（Insect Biochem.,16,539〜545,19
86）が、特異性に問題があるため、これをPGの定量に応
用する迄には到らなかった。
エンドトキシンとは反応しないが、PGまたはβ−1,3−
グルカン（以下、β−Ｇと略称する。）と反応し、それ
により少なくとも３種の酵素、即ち、Ｎ−α−ベンゾイ
ル−Ｌ−アルギニンエチルエステル分解酵素（以下、BA
EEaseと略称する。）、プロ−フェノールオキシダーゼ
活性化酵素（以下、PPAEと略称する。）及びフェノール
オキシダーゼ（以下、POと略称する。）が活性化される
ことを先に見出した（Insect Biochem.,16,539〜545,19
86）が、特異性に問題があるため、これをPGの定量に応
用する迄には到らなかった。
本発明は上記した如き状況に鑑みなされたもので、β−
Ｇとは反応せずにPGと特異的に反応して酵素活性を発現
する成分を含ませて成るPG測定用試薬とそれを用いたPG
の定量方法を提供することを目的とする。
Ｇとは反応せずにPGと特異的に反応して酵素活性を発現
する成分を含ませて成るPG測定用試薬とそれを用いたPG
の定量方法を提供することを目的とする。
本発明は、昆虫の体液からβ−Ｇと反応して酵素活性を
発現する成分を除去して得られる、β−Ｇとは反応せず
にPGと特異的に反応して酵素活性を発現する成分を含ま
せて成るPG測定用試薬及び該試薬を用いることを特徴と
するペプチドグリカンの定量方法の発明である。
発現する成分を除去して得られる、β−Ｇとは反応せず
にPGと特異的に反応して酵素活性を発現する成分を含ま
せて成るPG測定用試薬及び該試薬を用いることを特徴と
するペプチドグリカンの定量方法の発明である。
即ち、本発明者らは昆虫の体液からβ−Ｇとは反応せず
にPGの特異的に反応して酵素活性を発現する物質をとり
出すべく鋭意研究を重ねた結果、これの分離精製に成功
し、これをPGを含む検体と反応させ、発現するBAEEase,
PPAE,PO等の酵素活性を測定することにより、或は、こ
れらの酵素活性の発現時間を測定することにより、PGの
定量が可能となることを見出し本発明を完成するに到っ
た。
にPGの特異的に反応して酵素活性を発現する物質をとり
出すべく鋭意研究を重ねた結果、これの分離精製に成功
し、これをPGを含む検体と反応させ、発現するBAEEase,
PPAE,PO等の酵素活性を測定することにより、或は、こ
れらの酵素活性の発現時間を測定することにより、PGの
定量が可能となることを見出し本発明を完成するに到っ
た。
本発明に用いることのできる体液の得られる昆虫として
は、特に制限はないが、なるべく大型のもので飼育方法
の確立しているものが望ましく、例えば、タバコスズメ
ガ，カイコガ等の鱗翅類、センチニクバエ，イエバエ等
の双翅類、トノサマバッタ，エンマコオロギ等の直翅
類、センノキカミキリ等の甲虫類等が挙げられるが、こ
れらに限定されるものではない。
は、特に制限はないが、なるべく大型のもので飼育方法
の確立しているものが望ましく、例えば、タバコスズメ
ガ，カイコガ等の鱗翅類、センチニクバエ，イエバエ等
の双翅類、トノサマバッタ，エンマコオロギ等の直翅
類、センノキカミキリ等の甲虫類等が挙げられるが、こ
れらに限定されるものではない。
体液としては、体腔から得られるヘモリンパ（hemolymp
h）が最も得られやすくより一般的である。
h）が最も得られやすくより一般的である。
体液を得る方法としては、例えば、本発明者の一部らが
行った方法（Insect Biochem.,11,57〜65,1981）があ
る。即ち、昆虫を氷上に置き動きを止めた後、トウキビ
因子（サトウキビに含まれるグルコース，アミノ酸など
から成る高分子物質）を不純物として含む蔗糖、または
トウキビ因子そのものを含む生理食塩水を体腔に注射
し、その後しばらく放置して、体腔よりヘモリンパを集
める。集めた液を遠心分離器にかけ血球を除いた後透析
すれば体液の血漿成分が得られる。
行った方法（Insect Biochem.,11,57〜65,1981）があ
る。即ち、昆虫を氷上に置き動きを止めた後、トウキビ
因子（サトウキビに含まれるグルコース，アミノ酸など
から成る高分子物質）を不純物として含む蔗糖、または
トウキビ因子そのものを含む生理食塩水を体腔に注射
し、その後しばらく放置して、体腔よりヘモリンパを集
める。集めた液を遠心分離器にかけ血球を除いた後透析
すれば体液の血漿成分が得られる。
このようにして得られた血漿中には、エンドトキシンと
は反応しないがβ−Ｇと特異的に反応して酵素活性を発
現する物質（或は発現を誘引する物質）と、PGと特異的
に反応して酵素活性を発現する物質（或は発現を誘引す
る物質）と、β−G,PGのいずれとも反応して酵素活性を
発現する物質（或は発現を誘引する物質）とが共存して
いるので、このうちβ−Ｇと反応して酵素活性を発現す
る（或は発現を誘引する）成分を除去すれば、これをβ
−Ｇとは反応せずにPGと特異的に反応して酵素活性を発
現する成分とすることができる。
は反応しないがβ−Ｇと特異的に反応して酵素活性を発
現する物質（或は発現を誘引する物質）と、PGと特異的
に反応して酵素活性を発現する物質（或は発現を誘引す
る物質）と、β−G,PGのいずれとも反応して酵素活性を
発現する物質（或は発現を誘引する物質）とが共存して
いるので、このうちβ−Ｇと反応して酵素活性を発現す
る（或は発現を誘引する）成分を除去すれば、これをβ
−Ｇとは反応せずにPGと特異的に反応して酵素活性を発
現する成分とすることができる。
昆虫の血漿から、β−Ｇと反応して酵素活性を発現する
（或は発現を誘引する）成分を除去する方法としては、
ゲル過法、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー
法、アフィニティークロマトグラフィー法等、一般に生
化学の分野で用いられている分離精製法がいずれも挙げ
られるが、β−Ｇを結合させた担体を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーによりこれを行えば、極めて容
易に且つ効率よくこれを行うことができるので、特に好
ましい。以下、この方法について述べる。
（或は発現を誘引する）成分を除去する方法としては、
ゲル過法、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー
法、アフィニティークロマトグラフィー法等、一般に生
化学の分野で用いられている分離精製法がいずれも挙げ
られるが、β−Ｇを結合させた担体を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーによりこれを行えば、極めて容
易に且つ効率よくこれを行うことができるので、特に好
ましい。以下、この方法について述べる。
β−Ｇを結合させる担体としては、セルロース、アガロ
ース、デキストラン、ポリアクリルアミド、多孔性ガラ
ス等、アフィニティークロマトグラフィーに於て通常用
いられる担体は、いずれも使用可能であるが、中でもア
ガロースが特に好ましい。アガロース系担体の具体的商
品としては、セファロース（ファルマシア社）、バイオ
ゲルＡ（BIO−RAD社）等があり、デキストラン系のもの
としては、セファデックス（ファルマシア社）、セファ
クリル（ファルマシア社）が、また、ポリアクリルアミ
ド系のものとしては、エンザフィックスＰ（和光純薬工
業（株））、バイオゲルＰ（BIO−RAD社）等が夫々市販
されているが、これらに限定されるものではない。これ
らの担体にβ−Ｇを結合させる為には担体を活性化させ
る必要があることは言うまでもない。担体の活性化法は
種々あり、特に限定されるものではないが、例えば、エ
ピクロルピドリンで活性化する方法等が適応なものとし
て挙げることができる。
ース、デキストラン、ポリアクリルアミド、多孔性ガラ
ス等、アフィニティークロマトグラフィーに於て通常用
いられる担体は、いずれも使用可能であるが、中でもア
ガロースが特に好ましい。アガロース系担体の具体的商
品としては、セファロース（ファルマシア社）、バイオ
ゲルＡ（BIO−RAD社）等があり、デキストラン系のもの
としては、セファデックス（ファルマシア社）、セファ
クリル（ファルマシア社）が、また、ポリアクリルアミ
ド系のものとしては、エンザフィックスＰ（和光純薬工
業（株））、バイオゲルＰ（BIO−RAD社）等が夫々市販
されているが、これらに限定されるものではない。これ
らの担体にβ−Ｇを結合させる為には担体を活性化させ
る必要があることは言うまでもない。担体の活性化法は
種々あり、特に限定されるものではないが、例えば、エ
ピクロルピドリンで活性化する方法等が適応なものとし
て挙げることができる。
担体に結合させるβ−Ｇとしては、各種細菌類（例え
ば、Alcaligenes属,Laminaria属,Agrobacterium属
等）、酵母類（例えば、Saccharomyces属等）及びキノ
コ類（例えば、シイタケ，スエヒロタケ，カワラタケ
等）の細胞壁から得られる天然のそれでもよいし、藻
類、例えば、褐藻，ユーグレナ，ケイ藻等の貯蔵性多糖
を用いてもよい。
ば、Alcaligenes属,Laminaria属,Agrobacterium属
等）、酵母類（例えば、Saccharomyces属等）及びキノ
コ類（例えば、シイタケ，スエヒロタケ，カワラタケ
等）の細胞壁から得られる天然のそれでもよいし、藻
類、例えば、褐藻，ユーグレナ，ケイ藻等の貯蔵性多糖
を用いてもよい。
尚、β−Ｇを上記した如き担体に結合して用いる代り
に、例えばカードランの如く、それ自体不溶性の担体に
加工できる（例えばビーズ等として）ものについては、
他の担体に結合させることなく、それ自体を担体として
用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことも
勿論可能である。このような目的に使用し得るカードラ
ンビーズは、例えば特開昭52−50352号に記載の方法に
従って容易にこれを作製し得るので、そのようにして作
製したものを用いることで足りる。
に、例えばカードランの如く、それ自体不溶性の担体に
加工できる（例えばビーズ等として）ものについては、
他の担体に結合させることなく、それ自体を担体として
用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことも
勿論可能である。このような目的に使用し得るカードラ
ンビーズは、例えば特開昭52−50352号に記載の方法に
従って容易にこれを作製し得るので、そのようにして作
製したものを用いることで足りる。
アフィニティークロマトグラフィーをより効果的に行う
には、予め血漿中にキレート剤等を添加して体液中に存
在するCa2+、Mg2+等２価の陽イオンの影響を除いた状態
にした後これを行うことが望ましい。この目的で用いら
れるキレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四
酢酸ナトリウム（EDTA）、エチレングリコールビス（β
−アミノエチルエーテル）−N,N,N′,N′−四酢酸ナト
リウム（EGTA）等が挙げられるが、これらに限定される
ものではない。キレート剤の使用量は特に限定されるも
のではないが、通常、血漿中の濃度が1mM〜10mM程度に
なるように用いられる。
には、予め血漿中にキレート剤等を添加して体液中に存
在するCa2+、Mg2+等２価の陽イオンの影響を除いた状態
にした後これを行うことが望ましい。この目的で用いら
れるキレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四
酢酸ナトリウム（EDTA）、エチレングリコールビス（β
−アミノエチルエーテル）−N,N,N′,N′−四酢酸ナト
リウム（EGTA）等が挙げられるが、これらに限定される
ものではない。キレート剤の使用量は特に限定されるも
のではないが、通常、血漿中の濃度が1mM〜10mM程度に
なるように用いられる。
アフィニティークロマトグラフィーの操作法自体は自体
公知のアフィニティークロマトグラフィーの操作法に従
ってこれを行えば足りる。
公知のアフィニティークロマトグラフィーの操作法に従
ってこれを行えば足りる。
このようにして、昆虫の血漿をβ−Ｇを結合させた担体
（若しくはβ−Ｇからなる担体）を用いたアフィニティ
ークロマトグラフィーにより処理すれば、β−Ｇとは反
応せずにPGと特異的に反応して酵素活性を発現する成分
が容易に得られるので、これをPG測定用試薬として用い
てPGの定量を行えばよい。
（若しくはβ−Ｇからなる担体）を用いたアフィニティ
ークロマトグラフィーにより処理すれば、β−Ｇとは反
応せずにPGと特異的に反応して酵素活性を発現する成分
が容易に得られるので、これをPG測定用試薬として用い
てPGの定量を行えばよい。
PGの定量を行うには、PGを含む検体と、上記β−Ｇとは
反応せずにPGと特異的に反応して酵素活性を発現する成
分を含ませて成る試薬（以下、PG試薬と略称する。）と
をよく混合して反応液とし、一定時間後の反応液中の酵
素活性、例えば、BAEEase、PPAE、PO等の活性を自体公
知の測定方法に従って測定し、予め、濃度既知のPGの標
準液を用いて同様の操作により作成した検量線からPGの
定量を行ってもよいし（以下、本法をエンド法と略称す
る。）、また、POの活性化に要する時間が検体中のPG濃
度に依存する現象を利用して、PG試薬と検体とを混合し
た後、POによる反応生成物の量がある一定値となるまで
の時間を測定する方法（本発明者らが見出した方法。以
下、タイム法と略称する。）によってこれを行ってもよ
い。
反応せずにPGと特異的に反応して酵素活性を発現する成
分を含ませて成る試薬（以下、PG試薬と略称する。）と
をよく混合して反応液とし、一定時間後の反応液中の酵
素活性、例えば、BAEEase、PPAE、PO等の活性を自体公
知の測定方法に従って測定し、予め、濃度既知のPGの標
準液を用いて同様の操作により作成した検量線からPGの
定量を行ってもよいし（以下、本法をエンド法と略称す
る。）、また、POの活性化に要する時間が検体中のPG濃
度に依存する現象を利用して、PG試薬と検体とを混合し
た後、POによる反応生成物の量がある一定値となるまで
の時間を測定する方法（本発明者らが見出した方法。以
下、タイム法と略称する。）によってこれを行ってもよ
い。
これらいずれの方法で行うにせよ、この定量を行う際に
は、先にβ−Ｇとは反応せずにPGと特異的に反応して酵
素活性を発現する成分を取り出す際に除去した２価の金
属イオン、例えば、Co2+、Mg2+等を反応液中に改めて添
加してやる必要がある。その濃度としては、反応液中の
最終濃度として、4mM〜10mM程度が好ましく用いられ
る。
は、先にβ−Ｇとは反応せずにPGと特異的に反応して酵
素活性を発現する成分を取り出す際に除去した２価の金
属イオン、例えば、Co2+、Mg2+等を反応液中に改めて添
加してやる必要がある。その濃度としては、反応液中の
最終濃度として、4mM〜10mM程度が好ましく用いられ
る。
酵素活性測定に必要な、基質、緩衝剤、共役酵素、補酵
素等、更には、要すれば、発色剤、酵素賦活剤、酵素や
色素の安定化剤、界面活性剤等、目的とする酵素活性の
測定法として自体公知の方法に於て使用されるものは当
然のことながら本発明に於てもそれに準じて使用される
が、これらは予めPG試薬中に溶解しておいてもよいし、
また、エンド法で行う場合には、別に酵素活性測定用の
試液を準備しておき、反応液の一部を採取しそれを試料
として改めて酵素活性を測定してもよい。
素等、更には、要すれば、発色剤、酵素賦活剤、酵素や
色素の安定化剤、界面活性剤等、目的とする酵素活性の
測定法として自体公知の方法に於て使用されるものは当
然のことながら本発明に於てもそれに準じて使用される
が、これらは予めPG試薬中に溶解しておいてもよいし、
また、エンド法で行う場合には、別に酵素活性測定用の
試液を準備しておき、反応液の一部を採取しそれを試料
として改めて酵素活性を測定してもよい。
これらの方法によりPGの定量を行う際、PGを含む検体と
PG試薬との反応温度は、反応が進行する温度であれば特
に限定はされないが、通常、20〜40℃が好ましく用いら
れる。
PG試薬との反応温度は、反応が進行する温度であれば特
に限定はされないが、通常、20〜40℃が好ましく用いら
れる。
反応pHは、測定する酵素の種類によって当然異ってくる
が、通常、pH6〜10が好ましく用いられる。またこの反
応pHを維持する為、通常緩衝剤が用いられるが、この緩
衝剤としては反応に影響を与えないものであれば種類及
び使用濃度に特に制約はなく、例えば、リン酸塩、ホウ
酸塩、酢酸塩、トリス緩衝液、グッズ（Good's）緩衝液
等がいずれも挙げられる。
が、通常、pH6〜10が好ましく用いられる。またこの反
応pHを維持する為、通常緩衝剤が用いられるが、この緩
衝剤としては反応に影響を与えないものであれば種類及
び使用濃度に特に制約はなく、例えば、リン酸塩、ホウ
酸塩、酢酸塩、トリス緩衝液、グッズ（Good's）緩衝液
等がいずれも挙げられる。
以下に実施例及び参考例を挙げ、本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもの
ではない。
説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもの
ではない。
参考例 1. 蚕血漿の調製法 芦田法（Insect Biochem.,11,57〜65,1981）に従って以
下のように行った。
下のように行った。
第五齢の蚕幼虫を氷上に10分間置き動きを止めた後、20
mMのサトウキビから精製された蔗糖、または６μg/mlの
トウキビ因子を含む生理食塩水を蚕の体重の半量分、蚕
の第５及び第６腹部節の間より注射した。注射した液が
漏れないように細い糸で第５腹部節の前で縛り、20分室
温放置後、第３腹部節の足を切ってヘモリンパ（hemoly
mph）を集めた。集めたヘモリンパを1,500×ｇで５分
間、低温で遠心し血球を除いた。上清約100mlを0.01M−
トリス−リンゴ酸緩衝液（0.15MのKClを含有、pH6.5）
３中で、２日間、低温下透析を行い目的の蚕血漿とし
た。
mMのサトウキビから精製された蔗糖、または６μg/mlの
トウキビ因子を含む生理食塩水を蚕の体重の半量分、蚕
の第５及び第６腹部節の間より注射した。注射した液が
漏れないように細い糸で第５腹部節の前で縛り、20分室
温放置後、第３腹部節の足を切ってヘモリンパ（hemoly
mph）を集めた。集めたヘモリンパを1,500×ｇで５分
間、低温で遠心し血球を除いた。上清約100mlを0.01M−
トリス−リンゴ酸緩衝液（0.15MのKClを含有、pH6.5）
３中で、２日間、低温下透析を行い目的の蚕血漿とし
た。
参考例 2. PGの調製 ミクロコッカス ルテウス（Micrococcus luteus）ATCC
4698の菌体を冷水150ml中に懸濁し、直径0.1mmのガラ
スビーズを0.6g/ml添加したのち０℃で超音波処理を行
って菌体を破砕した。ガラスビーズを除去した後、2,20
0×ｇで10分間遠心分離して沈澱を除去し、さらに上清
を20,000×ｇで45分間遠心分離した。得られた沈澱を1M
NaCl溶液150mlに懸濁し、遠心分離により2,200×ｇ〜2
0,000×ｇの分画を集め粗細胞壁標品とした。
4698の菌体を冷水150ml中に懸濁し、直径0.1mmのガラ
スビーズを0.6g/ml添加したのち０℃で超音波処理を行
って菌体を破砕した。ガラスビーズを除去した後、2,20
0×ｇで10分間遠心分離して沈澱を除去し、さらに上清
を20,000×ｇで45分間遠心分離した。得られた沈澱を1M
NaCl溶液150mlに懸濁し、遠心分離により2,200×ｇ〜2
0,000×ｇの分画を集め粗細胞壁標品とした。
得られた粗細胞壁標品を80mlの水に懸濁し、100℃で20
分間加温したのち冷却し、2M酢酸−酢酸ナトリウム緩衝
液（pH5.9）140ml及びRNA分解酵素10mgを加え37℃で３
時間反応させた。その後20,000×ｇで１時間遠心分離
し、得られた沈澱を50mMトリス−塩酸緩衝液（20mM MgC
l2、1mM CaCl2及び7mgのDNase I（Sigma社製）を含む。
pH7.5）に懸濁し37℃で３時間反応させた。その後、20,
000×ｇで１時間遠心分離し、得られた沈澱を0.4％ドデ
シル硫酸ナトリウム溶液100mlに懸濁して室温で１時間
放置した。その後沈澱を蒸留水で６回洗浄し、凍結乾燥
して精製細胞壁標品とした。
分間加温したのち冷却し、2M酢酸−酢酸ナトリウム緩衝
液（pH5.9）140ml及びRNA分解酵素10mgを加え37℃で３
時間反応させた。その後20,000×ｇで１時間遠心分離
し、得られた沈澱を50mMトリス−塩酸緩衝液（20mM MgC
l2、1mM CaCl2及び7mgのDNase I（Sigma社製）を含む。
pH7.5）に懸濁し37℃で３時間反応させた。その後、20,
000×ｇで１時間遠心分離し、得られた沈澱を0.4％ドデ
シル硫酸ナトリウム溶液100mlに懸濁して室温で１時間
放置した。その後沈澱を蒸留水で６回洗浄し、凍結乾燥
して精製細胞壁標品とした。
得られた精製細胞壁標品を0.1N塩酸中に懸濁し60℃で24
時間放置後、20,000×ｇで１時間遠心分離し、得られた
沈澱を蒸留水で洗浄した後、凍結乾燥をしてPGを得た。
時間放置後、20,000×ｇで１時間遠心分離し、得られた
沈澱を蒸留水で洗浄した後、凍結乾燥をしてPGを得た。
参考例 3. カードランビーズカラムの調製 カードラン（和光純薬工業（株）製）粉末9gに純水270m
lを加え撹拌しスラリーを得た。これに1N−NaOH30mlを
加えるとカードランは溶解し、カードランの水酸化ナト
リウム水溶液が得られた。８容のビーカーに、トルエ
ン1,200ml、界面活性剤エマレックスHC−80 6g（日本
エマルジョン製，ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導
体）を加え、スクリュー型撹拌翼にて800rpmの速度で撹
拌下に上記カードランの水酸化ナトリウム水溶液を室温
にて滴下した。このようにして得られたカードラン分散
液をトルエン2.000mlおよび酢酸1,000mlからなる液に80
0rpmの速度で撹拌しながら加え、約１時間撹拌を続け
た。約８時間静置することにより生成したビーズは沈澱
した。デカンテーションによって溶媒を除去し、得られ
た沈澱を純水８にて５回洗浄するとpHは中性となり、
また有機溶媒は完全に除去され、カードランビーズ240m
lを得た。
lを加え撹拌しスラリーを得た。これに1N−NaOH30mlを
加えるとカードランは溶解し、カードランの水酸化ナト
リウム水溶液が得られた。８容のビーカーに、トルエ
ン1,200ml、界面活性剤エマレックスHC−80 6g（日本
エマルジョン製，ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導
体）を加え、スクリュー型撹拌翼にて800rpmの速度で撹
拌下に上記カードランの水酸化ナトリウム水溶液を室温
にて滴下した。このようにして得られたカードラン分散
液をトルエン2.000mlおよび酢酸1,000mlからなる液に80
0rpmの速度で撹拌しながら加え、約１時間撹拌を続け
た。約８時間静置することにより生成したビーズは沈澱
した。デカンテーションによって溶媒を除去し、得られ
た沈澱を純水８にて５回洗浄するとpHは中性となり、
また有機溶媒は完全に除去され、カードランビーズ240m
lを得た。
これを分級し、50〜100μｍの粒径のもの（平均粒径約8
0μｍ）を0.01Mトリス−リンゴ酸緩衝液（0.15M KCl及
び1mM EDTAを含む。pH6.5）が平衡化し、カラム（1.3×
2.3cm）に充填してカードランビーズカラムとした。
0μｍ）を0.01Mトリス−リンゴ酸緩衝液（0.15M KCl及
び1mM EDTAを含む。pH6.5）が平衡化し、カラム（1.3×
2.3cm）に充填してカードランビーズカラムとした。
実施例 1. （１）PG試薬の調製 参考例１で得られた蚕血漿5mlに0.01Mトリス−リンゴ酸
緩衝液（1mM EDTA、0.15M KCl含有、pH6.5。以下TMBと
略称する。）20mlを加えてよく混合したものを試料と
し、参考例３により得られたカードランビーズカラムで
処理した。素通りの蛋白質分画約25mlを、225mlの飽和
硫酸アンモニウム溶液中へ滴下したのち、１晩撹拌し
た。遠心分離（16,000×ｇ、20分間）して沈澱を集め、
沈澱を4mlのTMBに溶解し、TMB500mlを外液として透析し
た。これを再び遠心分離（16,000×ｇ、20分間）し、上
清をTMBで全量5mlとして、PG試薬とした。
緩衝液（1mM EDTA、0.15M KCl含有、pH6.5。以下TMBと
略称する。）20mlを加えてよく混合したものを試料と
し、参考例３により得られたカードランビーズカラムで
処理した。素通りの蛋白質分画約25mlを、225mlの飽和
硫酸アンモニウム溶液中へ滴下したのち、１晩撹拌し
た。遠心分離（16,000×ｇ、20分間）して沈澱を集め、
沈澱を4mlのTMBに溶解し、TMB500mlを外液として透析し
た。これを再び遠心分離（16,000×ｇ、20分間）し、上
清をTMBで全量5mlとして、PG試薬とした。
（２）PG試薬及び蚕体液中の不活性酵素のザイモサン
（β−Ｇ）又はPGによる活性化度の測定 （測定操作法） 参考例１で得られた蚕血漿又は（１）で得られたPG試薬
200μｌに80mM CaCl2溶液20μｌを添加し、更に1mg/ml
のザイモサン溶液あるいは1mg/mlのPG溶液（参考例２で
得られたものを使用して調製した。）20μｇ加えてよく
混合し、25℃で反応させた。所定の時間に所定量の反応
液を採取し、POの活性化度あるいはBAEEaseの活性値を
測定した。
（β−Ｇ）又はPGによる活性化度の測定 （測定操作法） 参考例１で得られた蚕血漿又は（１）で得られたPG試薬
200μｌに80mM CaCl2溶液20μｌを添加し、更に1mg/ml
のザイモサン溶液あるいは1mg/mlのPG溶液（参考例２で
得られたものを使用して調製した。）20μｇ加えてよく
混合し、25℃で反応させた。所定の時間に所定量の反応
液を採取し、POの活性化度あるいはBAEEaseの活性値を
測定した。
PO活性化度の測定 基質溶液（4mM 4−メチルカテコール及び8mM4−ヒドロ
キシプロリンエチルエステル含有0.1Mリン酸緩衝液、pH
6.0）1mlに試料（前記反応液）10μｌを加え30℃で10分
間反応させた後、生成するキノン色素の520nmの吸光度
を測定してPOの活性化度を求めた。
キシプロリンエチルエステル含有0.1Mリン酸緩衝液、pH
6.0）1mlに試料（前記反応液）10μｌを加え30℃で10分
間反応させた後、生成するキノン色素の520nmの吸光度
を測定してPOの活性化度を求めた。
第１図に各種試料を基質溶液と反応させたときの反応時
間による520nmに於ける吸光度の変化を示す。但し、−
●−はザイモサンとPG試薬とを、−▲−はPGとPG試薬と
を、−○−はザイモサンと蚕血漿とを、また、−△−は
PGと蚕血漿とを夫々反応させて得られた試料を用いたと
きの吸光度変化を夫々示す。
間による520nmに於ける吸光度の変化を示す。但し、−
●−はザイモサンとPG試薬とを、−▲−はPGとPG試薬と
を、−○−はザイモサンと蚕血漿とを、また、−△−は
PGと蚕血漿とを夫々反応させて得られた試料を用いたと
きの吸光度変化を夫々示す。
BAEEase活性の測定 予め25℃に保温した基質溶液（2mM N−α−ベンゾイル
−Ｌ−アルギニンエチルエステル、1mM NAD（ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド）、0.1mg/mlアルコール
デヒドロゲナーゼ、0.25Mトリス（ヒトロキシメチル）
アミノメタン及び0.2Mセミカルバジド含有、pH8.5、at2
5℃）1mlに試料30μｌを加えてよく混合し、25℃で反応
させて生ずるNADH（還元型ニコチンアミドアデンジヌク
レオチド）の340nmの吸光度の増加を測定した。
−Ｌ−アルギニンエチルエステル、1mM NAD（ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド）、0.1mg/mlアルコール
デヒドロゲナーゼ、0.25Mトリス（ヒトロキシメチル）
アミノメタン及び0.2Mセミカルバジド含有、pH8.5、at2
5℃）1mlに試料30μｌを加えてよく混合し、25℃で反応
させて生ずるNADH（還元型ニコチンアミドアデンジヌク
レオチド）の340nmの吸光度の増加を測定した。
尚、BAEEaseの１単位（Ｕ）は上記反応条件下で１分間
に1n molのエタノールを生成する量とした。
に1n molのエタノールを生成する量とした。
結果を表１に示す。
これらの結果から明らかなように、蚕血漿中の酵素はザ
イモサン及びPGによって活性化されるが、PG試薬中の酵
素はPGによってのみ活性化され、ザイモサンによっては
活性化されないことがわかる。
イモサン及びPGによって活性化されるが、PG試薬中の酵
素はPGによってのみ活性化され、ザイモサンによっては
活性化されないことがわかる。
実施例 2. PGによる検量線の作成 （測定操作） 実施例１で得られたPG試薬2mlに80mM CaCl2溶液200μｌ
を添加しよく混合した。この10μｌに所定濃度のPG溶液
10μｌを加え30℃で60分間加温後、実施例１で用いたPO
活性測定用基質溶液1mlを加え、更に30℃で10分間反応
させた後、520nmの吸光度を測定した（測定値;ES）。PG
溶液の代りに精製水を用いて同様に操作して盲検値（E
Bl）を得た。
を添加しよく混合した。この10μｌに所定濃度のPG溶液
10μｌを加え30℃で60分間加温後、実施例１で用いたPO
活性測定用基質溶液1mlを加え、更に30℃で10分間反応
させた後、520nmの吸光度を測定した（測定値;ES）。PG
溶液の代りに精製水を用いて同様に操作して盲検値（E
Bl）を得た。
（結 果） 第２図に、PG濃度と（ES−EBl）値の関係を横軸、縦軸
共に対数軸を用いて示した。
共に対数軸を用いて示した。
この結果から明らかな如く、良好な直線性が得られた。
実施例 3. PGによる検量線の作成 （測定操作） 実施例１で得られたPG試薬2mlに80mM CaCl2200μｌを添
加しよく混合した。この70μｌに、0.1Mリン酸緩衝液
（20mM L−ドーパ含有、pH6.0）70μｌ及び所定濃度のP
G溶液70μｌを加えてよく混合し、25℃で、トキシノメ
ーター（和光純薬工業（株）製）を用いて透過光量が15
％減少するまでの時間（Δｔ）を測定した。
加しよく混合した。この70μｌに、0.1Mリン酸緩衝液
（20mM L−ドーパ含有、pH6.0）70μｌ及び所定濃度のP
G溶液70μｌを加えてよく混合し、25℃で、トキシノメ
ーター（和光純薬工業（株）製）を用いて透過光量が15
％減少するまでの時間（Δｔ）を測定した。
（結 果） 第３図に、ΔｔとPG濃度の関係を横軸、縦軸共に対数軸
を用いて示した。
を用いて示した。
この結果から明らかな如く、良好な直線性が得られた。
以上述べた如く、本発明はβ−Ｇとは反応せずにPGと特
異的に反応して酵素活性を発現する成分を含ませて成る
PG測定用試薬、及び該試薬を用いた、PGの定量方法を提
供するものであり、本発明の定量法を用いることによ
り、極めて容易に且つ精度よくPGの定量を行うことがで
きる点に甚だ顕著な効果を奏するものであり、斯業に貢
献するところ大なるものである。
異的に反応して酵素活性を発現する成分を含ませて成る
PG測定用試薬、及び該試薬を用いた、PGの定量方法を提
供するものであり、本発明の定量法を用いることによ
り、極めて容易に且つ精度よくPGの定量を行うことがで
きる点に甚だ顕著な効果を奏するものであり、斯業に貢
献するところ大なるものである。
第１図は実施例１に於て得られた、各種試料と基質溶液
とを反応させたときの、反応時間による520nmに於ける
吸光度の変化を示し、横軸の各時間（分）について得ら
れた520nmの吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結
んだものである。但し、−●−は試料としてPG試薬とザ
イモサンとの反応液を、−▲−はPG試薬とPGとの反応液
を、−○−は蚕血漿とザイモサンとの反応液を、また、
−△−は蚕血漿とPGとの反応液を夫々用いた時の結果を
示す。 第２図は、実施例２に於て得られた検量線を示し、横軸
はPG濃度（ng/ml）を、また、縦軸は520nmに於ける吸光
度を夫々示す。 第３図は、実施例３に於て得られた検量線を示し、横軸
はPG濃度（ng/ml）を、また、縦軸は透過光量が15％減
少するまでの時間（分）を夫々示す。
とを反応させたときの、反応時間による520nmに於ける
吸光度の変化を示し、横軸の各時間（分）について得ら
れた520nmの吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結
んだものである。但し、−●−は試料としてPG試薬とザ
イモサンとの反応液を、−▲−はPG試薬とPGとの反応液
を、−○−は蚕血漿とザイモサンとの反応液を、また、
−△−は蚕血漿とPGとの反応液を夫々用いた時の結果を
示す。 第２図は、実施例２に於て得られた検量線を示し、横軸
はPG濃度（ng/ml）を、また、縦軸は520nmに於ける吸光
度を夫々示す。 第３図は、実施例３に於て得られた検量線を示し、横軸
はPG濃度（ng/ml）を、また、縦軸は透過光量が15％減
少するまでの時間（分）を夫々示す。
Claims (3)
- 【請求項１】昆虫の体液からβ−1,3−グルカンと反応
して酵素活性を発現する成分を除去して得られる、β−
1,3−グルカンとは反応せずにペプチドグリカンと特異
的に反応して酵素活性を発現する成分を含ませて成るペ
プチドグリカン測定用試薬。 - 【請求項２】検体と、昆虫の体液からβ−1,3−グルカ
ンと反応して酵素活性を発現する成分を除去して得られ
る、β−1,3−グルカンとは反応せずにペプチドグリカ
ンと特異的に反応して酵素活性を発現する成分を含ませ
て成るペプチドグリカン測定用試薬とを混合し、その結
果活性化される酵素の活性を測定することにより検体中
のペプチドグリカンの定量を行うことを特徴とするペプ
チドグリカンの定量方法。 - 【請求項３】検体と、昆虫の体液からβ−1,3−グルカ
ンと反応して酵素活性を発現する成分を除去して得られ
る、β−1,3−グルカンとは反応せずにペプチドグリカ
ンと特異的に反応して酵素活性を発現する成分を含ませ
て成るペプチドグリカン測定用試薬とを混合し、その結
果活性化される酵素の活性の発現時間を測定することに
より検体中のペプチドグリカンの定量を行うことを特徴
とするペプチドグリカンの定量方法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28824586A JPH07114707B2 (ja) | 1986-12-03 | 1986-12-03 | 新規な測定試薬 |
| DE3751109T DE3751109T2 (de) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Reagenzien zur Bestimmung von Peptidoglykan und beta-1,3-Glukan. |
| EP87117621A EP0270039B1 (en) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Reagents for determining peptidoglycan and beta-1,3-glucan |
| ES87117621T ES2068180T3 (es) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Reactivos para determinar peptidoglicano y beta-1,3-glucano. |
| AT87117621T ATE119204T1 (de) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Reagenzien zur bestimmung von peptidoglykan und beta-1,3-glukan. |
| EP94111388A EP0634656B1 (en) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Processes for collecting body fluid from insects |
| DE3752307T DE3752307T2 (de) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Verfahren zum Sammeln von Insekten-Körperflussigkeiten |
| AT94111388T ATE188777T1 (de) | 1986-12-03 | 1987-11-27 | Verfahren zum sammeln von insekten- körperflussigkeiten |
| US07/127,315 US4970152A (en) | 1986-12-03 | 1987-12-02 | Reagents for determining peptidoglycan and β-1,3-glucan |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28824586A JPH07114707B2 (ja) | 1986-12-03 | 1986-12-03 | 新規な測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63141599A JPS63141599A (ja) | 1988-06-14 |
| JPH07114707B2 true JPH07114707B2 (ja) | 1995-12-13 |
Family
ID=17727712
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28824586A Expired - Fee Related JPH07114707B2 (ja) | 1986-12-03 | 1986-12-03 | 新規な測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07114707B2 (ja) |
-
1986
- 1986-12-03 JP JP28824586A patent/JPH07114707B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63141599A (ja) | 1988-06-14 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |