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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von
endoproteolytischen Schlupfenzymen (Zonasen) im Abwasser von Brutanstalten, die
Larven des Atlantischen Lachses produzieren, und weiterhin etabliert
sie ein einfaches Verfahren, um Reinheit dieser speziellen Endoproteasen
bis zur Eignung zur Sequenzierung zu erlangen, von denen sich herausgestellt
hat, dass sie einige recht einzigartige proteolytische Eigenschaften
besitzen.
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Proteasen
im gereinigten Zustand werden in der Forschung, in Labor- und Klinikanalysen
und in Verfahren der Nahrungsmittelherstellung zunehmend verwendet.
Die Nachfrage steigt, insbesondere nach Enzymen mit für spezifische
Anwendungen angemessenen Eigenschaften. Dies hat die Suche nach neuen
Quellen von Proteasen, die sichere, nachhaltige und wirtschaftliche
Herstellungsverfahren erlauben, stimuliert.
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Hier
beuten wir eine neue, reiche Endoproteasenquelle aus, die mit der
Aquakultur des Atlantischen Lachses verbunden ist. Ein essentieller
Aspekt dieser Industrie ist die Produktion sich entwickelnder Eier,
die ausschlüpfen
und Larven hervorbringen, in Brutanstalten. Der Schlupf wird dadurch
erreicht, dass die Embryonen Endoproteasen bilden, die, wenn sie
sezerniert werden, die Eierschale effizient und spezifisch aufbrechen,
um es der Larve zu ermöglichen,
hinauszuschwimmen und ihr eigenes Leben zu beginnen (Referenzen:
Yamagami 1988; Walther 1993).
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Die
kritischen Enzyme hinter dem Schlupf von Fischen sind nur bei einigen
wenigen Fischarten charakterisiert worden, und in fast allen Fällen wurden
diese Zonasen als Metalloproteasen interpretiert (Referenzen: Hagenmaier
1974; Ohzu & Kasuya 1979;
Schoots & Denucé 1981;
DiMichele et al. 1981; Yasumasu et al. 1989 a, b; Araki & Onozato 1990; Hung
et al 1997). Die Genstruktur einiger Enzyme vom Zonasentyp ist erst
in letzter Zeit verfügbar
geworden (Ref.: Yasumasu et al. 1992). Luberda et al. (1994, Arch.
Hydrobiol. 131(4), S. 505–511)
beschreiben die teilweise Reinigung einer Metalloprotease aus der
Schlupfflüssigkeit
mehrerer Salmonidenarten. Rong und Walther (1994, 3. International
Marine Biotechnology Conference: Programm, Zusammenfassung und Liste
der Teilnehmer, „Endoproteolytic Hatching
Enzyme from Atlantic Salmon (Salmo salar) Embryos"; Universität von Tromsø, Norwegen,
S. 127) beschreiben die Reinigung von Choriolysin von 20 kDa aus
dem Schlüpffluid
von Lachsen ohne synchronisiertes Ausschlüpfen. Araki et al. (1996, Can. J.
Fish. Aquat. Sci., 53, S. 509–512)
beschreiben die Isolation eines Schlupfenzyms vom Choriolysintyp aus
dem Schlüpffluid
des Masu-Lachses, ohne synchronisiertes Ausschlüpfen gewonnen.
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Mutmaßliche Schlupfenzyme
wurden auch bei Wirbellosen beschrieben, wo wiederum die meisten
solcher Enzyme als Metalloproteasen interpretiert wurden (z. B.
Barrett & Edward
1976; Lepage & Gache
1989, Roe & Lennarz
1990). Jedoch wurden einige starke Argumente für serinproteasenartige Zonasen
vorgebracht (z. B. Post et al 1988). Umgekehrt wurden mutmaßliche Schlupfenzyme
auch bei höheren
Wirbeltieren als Fischen beschrieben. Z. B. beschrieben sowohl Urch & Hedrick (1981;
mit Bezug auf Amphibien) als auch Yamazaki et al. (1994; mit Bezug
auf die Maus) Zonasen, die Serinproteasen zu sein schienen. Der
biologische und biochemische Sinn zweier verschiedener Zonasetypen
bei ausschlüpfenden
Tieren ist gegenwärtig
nicht vollständig verstanden.
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Wir
fanden, dass die hauptsächlichen
Zonasen beim Atlantischen Lachs Serinproteasen sind. Sie kommen
in großen
Mengen in den Abwässern und
Schlüpffluiden
von Lachseiern vor. In diesem rohen wässrigen Zustand können Lachszonasen
wirksam auf die Reinigung durch herkömmliche Techniken vorbereitet
werden. Diese Zonasenquelle bietet im Vergleich zur Isolation von
Enzymen aus ganzen Embryonen einen großen Vorteil, da sie wirksam Komplikationen
mit überschüssigem Biomaterial
(Eischalen, Embryonen und Larven) vermeidet. Auf diese Weise wird
die Enzymaufreinigung erheblich vereinfacht.
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Ein
weiterer Vorteil ist, dass die auf eine Entwicklungsstufe eingestellten
Lachseier vor dem Ausschlüpfen
in minimale Wasservolumina übertragen werden
können.
Wenn in hohem Maße
synchrones Ausschlüpfen
durch erhöhte
Temperaturen (Zimmertemperatur) oder durch Sauerstoffmangel (Oppen-Berntsen
et al., 1990) induziert wird, ergibt dies ein kleines Volumen einer
hochkonzentrierten Präparation
roher Zonasen.
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Ein
weiterer essentieller Aspekt dieses Verfahrens ist, dass trotz der
zunehmenden Konzentration der proteolytischen Zonasen beobachtet
wurde, dass die Stabilität
der enthaltenden Zonasen intakt blieb. Weiterhin ist es von Bedeutung,
dass dieses Verfahren Zonaseenzyme in einem Medium aus beinahe reinem
Wasser liefert, das höchstens
1 mM NaCl enthält,
in dem die Zonasen aber dennoch volle enzymatische Integrität besitzen
und sie über
die Zeit hinweg behalten. Diese Präparation ist daher ein wertvolles
Ausgangsmaterial für
nachfolgende Präparationen
proteolytischer Zonasen mit verschiedenen Reinheitsgraden bis zur
sequenzierungsgeeigneten Reinheit.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Präparation, die ein als Zonase
bezeichnetes Enzym enthält,
wobei die Präparation
bei SDS-PAGE-Analyse eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht
von etwa 28 kDa aufweist und erhältlich
ist durch ein Verfahren, das folgende Schritte umfasst:
- a) Suspendieren von Lachseiern in einem minimalen Volumen Wasser;
- b) Induzieren des synchronisierten raschen Ausschlüpfens der
Lachseier;
- c) Filtrieren der ausgeschlüpften
Lachseier, um Schlüpffluid
zu erhalten;
- d) Zugabe festen Harnstoffs zum Schlüpffluid, um die Lachseierschalenfragmente
dissoziieren zu lassen, und Zentrifugieren des Fluids bei niedriger Geschwindigkeit;
- e) weiteres Aufreinigen der Zonase durch Gelfiltration des Zentrifugationsüberstandes;
und
- f) weiteres Aufreinigen der Zonase durch Affinitätschromatographie
auf einer Benzamidin-modifizierten Superose 6B®-Säule, wobei
die Affinitätschromatographie durchgeführt wird,
indem man mit konzentrierten Salzlösungen wäscht, anschließend mit
Dioxan in konzentrierter Salzlösung
eluiert, um an die Chromatographiematrix oder an die makromolekularen
Strukturen gebundene Zonasen zu extrahieren;
wobei die
Zonase folgende Eigenschaften besitzt: - a) sie
spaltet Chromozym X;
- b) sie wird durch Benzamidin gehemmt;
- c) sie spaltet Peptidbindungen mit Arginin;
- d) sie bleibt in Gegenwart von 8 M Harnstoff, molaren Salzkonzentrationen,
destilliertem Wasser und organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Dioxan
oder Propanol, aktiv; und
- e) sie behält
in Lösung
bei Raumtemperatur 50 Tage lang ihre enzymatische Aktivität.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung
einer Präparation,
die ein als Zonase bezeichnetes Enzym enthält, bereit, das folgende Schritte
umfasst:
- a) Suspendieren von Lachseiern in
einem minimalen Volumen Wasser;
- b) Induzieren des synchronisierten raschen Ausschlüpfens der
Lachseier;
- c) Filtrieren der ausgeschlüpften
Lachseier, um Schlüpffluid
zu erhalten;
- d) Zugabe festen Harnstoffs zum Schlüpffluid, um die Lachseierschalenfragmente
dissoziieren zu lassen, und Zentrifugieren des Fluids bei niedriger Geschwindigkeit;
- e) weiteres Aufreinigen der Zonasen durch Gelfiltration des
Zentrifugationsüberstandes;
und
- f) weiteres Aufreinigen der Zonase durch Affinitätschromatographie,
wobei die Affinitätschromatographie
durchgeführt
wird, indem man mit konzentrierten Salzlösungen wäscht, anschließend mit
organischen Lösungsmitteln
in konzentrierter Salzlösung
eluiert, um an die Chromatographiematrix oder an die makromolekularen
Strukturen gebundene Zonasen zu extrahieren.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
solcher Präparationen
und Verfahren sind in den Ansprüchen
beschrieben.
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Die
Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Inhibition der Proteolyse
durch eine Lachszonase in einer erfindungsgemäßen Präparation, umfassend die Verwendung
kleiner Mengen β-Mercaptoethanol und
die Entfernung des Inhibitors durch Abdampfen, bereit. In einem
noch weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung
einer erfindungsgemäßen Präparation
zur Proteolyse oder reversen Proteolyse (Synthese) von Proteinen
in reinem Wasser oder nicht-wässrigen
organischen Lösungsmitteln
bereit.
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Beispiel 1: Konzentrierte
Präparation
roher Zonase des Atlantischen Lachses
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Die
anfängliche
Reinigung der Zonasen umfasst nur die Filtration der ausgeschlüpften Lachseier durch
Käseleinentuch.
Ein solches Filtrat kann jahrelang ohne signifikanten Abbau der
Zonase eingefroren sein, bevor es aufgetaut und für die weitere
Aufreinigung der Zonase verwendet wird. Dieser Umstand erleichtert
die Produktion eines Startmaterials zur Reinigung von Lachszonasen
erheblich.
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Der
nächste
Schritt umfasst die Einstellung der „Rohzonase" auf üblicherweise 4 M Harnstoff, was
die Fragmente der Lachseierschale dissoziieren lässt und es erlaubt, sie zusammen
mit anderem Schutt durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit
(15000 g; 2 × 15
Minuten) zu entfernen. Dieses Material zeigt keine Anzeichen für das Verstopfen
von Säulen,
was für
auf andere Weise als oben beschrieben hergestellte Rohmaterialien
charakteristisch ist. Es ist somit eine „Rohzonase"-Präparation verfügbar, die
zur Reinigung durch herkömmliche chromatographische
Techniken geeignet ist. Es sollte erwähnt werden, dass die Lachszonasen
bei 4 oder sogar 8 M Harnstoff stabil und katalytisch aktiv sind. Überdies
wird diese Lachszonasen-Präparation
nur durch Inhibitoren für
Proteasen vom Serinproteasentyp inhibiert.
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Beispiel 2: Gereinigte
Zonasen des Atlantischen Lachses
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Das
aus der „Rohzonase"-Präparation
extrahierte Produkt kann in verschiedenen Reinigungsstufen ausgewählt werden.
Jedoch sind die Zonasen bereits nach einer Runder der Gelfiltation
von den höhermolekularen
Bestandteilen in dem Filtrat mit einer 12-fachen Anreicherung mit
mehr als 50 % Ausbeute abgetrennt. In der „Rohzonase" vorliegende größere Bestandteile scheinen
größtenteils
lösliche
Eierschalenfragmente zu sein, an die einige Zonasen fest gebunden
sind. Es ist von zentraler Bedeutung, dass die Verunreinigung mit
hohem Molekulargewicht in diesem frühen Reinigungsschritt entfernt
werden, da ihre Gegenwart ansonsten mit dem Erfolg der nachfolgenden
Reinigungsschritte interferiert und ihn blockiert. In anderen Worten
ist die Reihenfolge, in der die herkömmlichen Reinigungsverfahren
angewandt werden, ein wesentlicher Aspekt des Verfahrens.
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Die
verwendete Matrix kann variieren, aber Sephacryl SR-200®ist
unsere übliche
Wahl. Der Puffer war Tris-HCl pH 8,0 oder pH 8,5 (0,05 M) oder Tris-Acetat
(0,025 M, gleiche pH-Werte).
Die nach den Gelfiltrationsverfahren erhaltenen Zonasen stellen
die vorherrschenden Zonasen in der „Rohzonase" dar, und die enzymatische Aktivität wurde
durch Benzamidin katalytisch inhibiert.
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Was
die Proteine betrifft, stellen die Zonasen bereits auf dieser Stufe
etwa 10 % des Materials dar. Diese teilweise gereinigte Lachszonase
wird abermals nur durch Inhibitoren für Serinproteasen inhibiert.
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Beispiel 3: Zonase als
homogenes Proteinprodukt
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Infolge
der Zonaseinhibition durch Benzamidin können die auf Gelfiltrationssäulen zurückgehaltenen
Enzymfraktionen ohne weiteres durch Affinitätschromatographie auf kommerziell
verfügbaren Benzamidinsepharose-6B®-Säulen weiter
gereinigt werden. Dieser Schritt erlaubt eine 7,5-fache Anreicherung
für eine
insgesamt 94-fache Anreicherung gegenüber der „Rohzonase", mit einer Ausbeute von 37 % Aktivität.
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Die
verwendeten spezifischen Bedingungen (mit Säulen von 25 oder 125 ml Volumen)
bestanden wiederum aus einem 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH 8 oder 8,5),
der zur Entfernung unspezifisch gebundenen Materials von den Säulen auf
1 M NaCl eingestellt wurde. Die Zonasen werden durch diesen Schritt
nicht entfernt, da sie fest an die Säule gebunden bleiben. Der Erfolg
dieses Schrittes ist kritisch, da die Zonasen unter Verwendung eines
10–33
%-Dioxangradienten
in 1 M NaCl im gleichen Tris-HCl-Puffer von der Säule eluiert
werden. Dieses Verfahren beruht auf der ungewöhnlichen Stabilität von Lachszonasen
in organischen Lösungsmitteln.
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Nach
der Affinitätsreinigung
weist die Zonasenpräparation
bei SDS-PAGE-Analyse eine Proteinbande mit einem Gewicht von etwa
28 kDa auf. Dieser Zonaseteil war stark antigen, was die Herstellung polyklonaler
Antikörper
erlaubte, die spezifisch Lachszonasen erkennen, aber keine anderen Lachs-Serinproteasen
wie z. B. Lachstrypsine. Umgekehrt erkennen polyklonale Antikörper gegen Lachstrypsine
die Lachszonasen nicht, was die Lachszonase als eigenständiges Produkt
des embryonalen Lachses etabliert. Jedoch hat dieses Zonaseprodukt
keine zur Sequenzierung geeignete Reinheit, wie durch Edman-Verfahren
zur Ermittlung seiner N-terminalen
Sequenz gezeigt. Jedoch wurde gezeigt, dass jenseits der üblichen
12 N-terminalen Sequenzierungsschritte die gesamte Aminosäurensequenz
dieses Proteins reinen Zonasen ähnlich
war. Diese hoch gereinigte Lachszonasenpräparation wird ebenfalls nur
durch Inhibitoren für
Serinproteasen spezifisch inhibiert.
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Beispiel 4: Zonase mit
zur Sequenzierung geeigneter Reinheit
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Durch
Gelfiltration und Affinität
gereinigte Lachszonasen können
durch ein letztes chromatographisches Verfahren bis zur sequenzierungsgeeigneten
Reinheit weiter gereinigt werden. Dieses Verfahren setzt eine PBE94®-Säule mit
einem Tris-Acetat-Puffer (10 mM, pH 9,0) ein, wobei die nachfolgende
Elution mit einem Salzgradienten (bis 1 M NaCl-Salz) in diesem Puffer erfolgt.
Dieser Schritt als solcher erhöht
die katalytische Aktivität
der Zonasen um einen weiteren Faktor von 7,6 und damit die gesamte
Anreicherung auf das 714-fache bei einer Ausbeute von 28 % des Startmaterials.
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Dieser
Reinigungsschritt lässt
die Proteinidentität
der Zonasen als 28 kDa-Teil unverändert. Somit entfernt dieser
Schritt keine unverwandten, wesentlichen Proteinverunreinigungen
aus der Zonasepräparation,
wie es bei der Proteinreinigung üblich
ist und auch in den Beispielen 2 und 3 illustriert ist. Das Molekulargewicht
der gereinigten Zonasen ist das gleiche, wie es durch Western Blotting-Techniken
für die
im Schlüpffluid
und in der „Rohzonase" vorliegenden Zonaseteile
beobachtet wird.
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Was
im dritten und letzten Chromatographieschritt offensichtlich stattfindet,
ist, dass kleine, verunreinigende Peptide entfernt werden. Diese
Peptide scheinen Oligopeptide mit ungefähr einem Dutzend Resten zu
sein, die wahrscheinlich aus der Eierschale und/oder dem Lachsembryo
stammen. Diese Peptidverunreinigungen scheinen inhibitorische Wirkungen
auf die Zonase-Katalyse auszuüben,
da ihre Entfernung die katalytische Aktivität der Zonase steigert. Ihre
Gegenwart interferiert auch mit den ersten Schritten der Edman-Sequenzierung
dieses Zonaseprodukts. Die in diesem dritten Reinigungsschritt beobachteten
beiden Zonaseformen binden etwas unterschiedlich an die Säulenmatrix.
Jedoch haben beide Formen in ihren N-terminalen Teilen ähnliche Aminosäuresequenzen.
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Die
teilweisen Aminosäuresequenzen
der CNBr-erzeugten Peptide etablierten die Zonasen als eigenständige Proteine.
Die Strukturanalyse ergab Hinweise, dass die Zonasen möglicherweise
getrennte katalytische und substratbindende Domänen besitzen, was für ihre Empfindlichkeit
gegenüber
Calcium-chelierenden Mitteln, wenn sie auf makromolekulare (physiologische)
Substrate einwirken (die Bindung wird inhibiert, und hierdurch wird
die Katalyse indirekt inhibiert) und auch für ihre Empfindlichkeit gegenüber Serinprotease-Inhibitoren,
wenn sie auf kleine Substrate einwirken (die Katalyse wird direkt inhibiert),
verantwortlich sein könnte.
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Beispiel 5: Chemische
Eigenschaften von Lachszonasen
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Die
katalytische Wirkung der Zonasen wird durch die Gegenwart von Salz
in molaren Konzentrationen nicht beeinflusst, sie sind in destilliertem
Wasser ebenso effektiv wie in 6 M Salz. Das Enzym ist zwischen pH
7 und 9 im Wesentlichen gleichermaßen aktiv. Jedoch wird die
Zonase unterhalb von pH 4 inaktiviert und ist bei pH 6 nur schwach
aktiv. Die Zonase wird durch die Gegenwart von 8 M Harnstoff nicht
beeinträchtigt.
Die Zonase kann bei Raumtemperatur (mit und ohne Harnstoff) mit
nur minimalen Verlusten enzymatischer Aktivität 50 Tage lang gelagert werden.
Die enzymatische Aktivität
wird auch durch 40 Vol.-% organischer Lösungsmittel wie Dioxan oder
Propanol nicht behindert. Im Gegensatz hierzu wird das Enzym durch
10 Vol.-% 2-Mercaptoethanol,
das nachfolgend durch Abdampfen bei 50 °C entfernt werden kann, ohne weiteres
inaktiviert. Die Katalyse ist bei 42 °C maximal (bei Verwendung des
kommerziellen Substrates Chromozym X (von Boehringer)), wobei oberhalb
von 65 °C
eine geringe, aber signifikante katalytische Wirkung beobachtet wird,
ebenso nach 5-minütiger
Erhitzung auf 90 °C und
nachfolgender Abkühlung
auf und Messung bei Raumtemperatur.
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Beispiel 6: Katalytische
Eigenschaften von Lachszonasen
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Die
fraglichen Lachszonasen spalten eine ganze Reihe von Chromozym-Substraten,
wobei sie für
Peptidbindungen mit basischen Aminosäuren (vorzugsweise Arginin)
eine maximale Avidität
zeigen. Auf diese kleinen künstlichen
Substrate sind die Zonasen so wirksam wie andere Serinproteasen, aber
der KM-Wert = 14 μM ist niedriger. Der Vmax-Wert
beträgt
1,3 μM/min,
und Kcat/KM beträgt 57 (/mM sec), im Vergleich
zu einem Wert von ungefähr
1 für Rinder-
und Schweine-Trypsine (kationische Trypsine). Der hohe Grad der
Spezifität
bei der Spaltung von Peptidbindungen im Vergleich zu anderen Serinproteasen
wie Trypsin wird durch die Verwendung von Eierschalen-zr-Proteinen
(siehe Walther 1993) als Substrat gezeigt: Trypsin spaltet diese Proteine
in viele kleine Fragmente, während
bei den Zonasen beobachtet wird, dass sie das, was ihr physiologisches
Substrat ist, kaum abbauen.
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Die
beobachtete Spezifität
der Lachszonasewirkung reflektiert natürlich genau das, was von einer Zonase
verlangt wird: solche Enzyme müssen
die mechanische, aber nicht die chemische Integrität der Eierschalenproteine
rasch zerstören,
so dass der Embryo das Ei verlassen kann. Um dies in Gegenwart außerordentlich
hoher Mengen des Eierschalensubstrates auf schnelle Weise zu schaffen,
ist es notwendig, dass nur eine minimale Anzahl von Peptidbindungen
spezifisch angegriffen werden. Bei verlängertem Kontakt mit ihrem Substrat
spalten die Zonasen schließlich
jedoch auch andere Peptidbindungen. Diese proteolytische Sequenzspezifität wurde beobachtet,
aber noch nicht im chemischen Detail charakterisiert. Dennoch scheinen
die Zonasen hervorragende Aussichten zu besitzen, wenn es darum geht,
spezifische Spaltungen an verschiedenen Kandidatenproteinen durchzuführen, wie
sie heute unter Verwendung anderer kommerzieller Enzympräparationen
von Enzymen erreicht werden, die (andere) ortsspezifische Eigenschaften
besitzen, z. B. die Boehringer-Produkte Asp-N und Glu-C. Somit nehmen die
Zonasen einen gleichwertigen Rang ein wie die kommerziellen Enzyme,
die Anwendung bei analytischer Arbeit in den Vorbereitungen zur
Proteinsequenzierung gefunden haben, indem sie aus den zu sequenzierenden
großen
Proteinen definierte Peptide erzeugen. Somit ist dieses Merkmal
der Enzymologie reiner Lachszonasen kommerziell wertvoll.
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Referenzen auf verwandte
Arbeiten (Kategorie A)
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