DE2447050C2

DE2447050C2 - Verfahren zur Gewinnung von Proteasenhemmstoff

Info

Publication number: DE2447050C2
Application number: DE2447050A
Authority: DE
Inventors: Des Erfinders Auf Nennung Verzicht
Original assignee: LABORATORI DERIVATI ORGANICI SpA MILANO IT
Current assignee: LABORATORI DERIVATI ORGANICI SpA MILANO IT
Priority date: 1973-10-05
Filing date: 1974-10-02
Publication date: 1983-07-28
Also published as: ES430685A1; DK139913B; NL7413127A; US4216293A; DK139913C; DK522174A; CH617963A5; AR200699A1; SU611595A3; DD118654A1; JPS5063186A; FR2246567A1; FR2246567B1; CA1034495A; DE2447050A1; JPS619286B2

Description

dadurch gekennzeichnet, daß zur Lysis gemäß Stufe a) die tierischen Organe ganz oder in Form von Pulver oder Extrakt mittels Papain, Ficin, Bromelin oder Pankreatin in wäßriger Lösung bebandelt werden, and daß in Stufe c) durch Zusatz einer quaternärea Ammoniumverbindung zunächst Heparin und Mucopolysaccharide ausgefällt und abgetrennt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch qekennzeichnet, daß als quaternäre Ammoniumverbindung ein Cetylpyridiniumsalz bzw. GEtyltrimethylammoniumbromid verwendet wird

Die Erfindung betrifft die Gewinnung von Hemmstoff der Proteasen aus tierischen Organen durch Lysis des tierischen Rohmaterials, Proteinentziehung und Gewinnung aus der verbleibenden Flüssigkeit

Bekanntlich wurde der Proteasenhemmstoff in inehreren tierischen Organen bzw. Geweben festgestellt, wie Bauchspeicheldrüse, Leber, Lunge, Lymphknoten, Ohrspeicheldrüsen, Milz, Blut, Samendrüse u.a. ai. (Kraut,H. und KoII.Z. physiol. ehem. 192,1 — M. Kunitz und J. H. Northrop, J. Gen. physiol. 19391 — Werle, E. und KoIl, Z. Naturforsch. 14b, 385 — Astrup, T. Acta physiol. scan. 26.243); es wurden auch zahlreiche Techniken entwickelt, um ihn aus diesen Geweben zu extrahieren; diese beruhen meistens auf der selektiv extrahierenden Wirkung wäßriger, saurer oder alkalischer Gemische, Fraktionierungen mit Salz und/oder wäßrig-alkoholischer Medien und auf chromatographischen Verfahren (vgl. deutsche Patente 10 84 433, 11 48 352, 1011 576, 9 56 907, 9 50 959, 9 54 284, britisches Patent 9 65 352, französisches Patent 15 66 777, japanische Patente 43-7 328 und 44-8 563). Alle erwähnten Verfahren weisen — neben einer großen Kompliziertheit und der hohen Anzahl an erforderlichen Stufen — den vom Standpunkt der Industrie aus stark ins Gewicht fallenden Nachteil auf, daß die Ausbeute bei unverhältnismäßig hohem Aufwand ziemlich klein ist.

Des weiteren isii aui der UdSSR-Patentschrift 3 77 159 ein Verfahren zur Herstellung von Proteaseinhibitor bekannt, bei dem entsprechende tierische Organe in zerkleinerer Form einer Autolyse unterworfen werden, worauf sich eine Extraktion, Zugabe von Alkalien, eine Behandlung des Extraktes mit Ammoniumsulfat, ein Erhitzen, die erneute Zugabe von Alkalien sowie eine Filtrations- und Trockenstufe anschließen. Durch besondere Maßnahmen kann bei diesem bekannten Verfahren auch gleichzeitig Heparin gewonnen werden.

Da man sich zum damaligen Zeitpunkt aufgrund erwarteter Schwierigikeiten und Komplikationen offensichtlich davor gescheut hat, bei einem Verfahren zur Herstellung von Proteasenhemmstoff proteolytische Enzyme anzuwenden, wurden die tierischen Ausgangsstoffe bei diesem bekannten Verfahren einer Autolyse unterworfen, bei der es notwendig ist, die Organe einige Stunden bei Zimmertemperatur stehen zu lassen. Unter diesen Bedingungen findet aber zwangsläufig eine bakterielle Verunreinigung statt, welche zu einer dramatischen Erhöhung des Gehaltes an toxischen Substanzen führen kann. Des weiteren läßt auch bei diesem bekannten Verfahren die Ausbeute an Proteasenhemmstoff zu wünschen übrig. Zur Herstellung von Heparin wird in der US-Patent schrift 3451996 ein Verfahren beschrieben, bei dem entsprechendes tierisches Gewebe einer Lysis durch Einwirkung von Pankreatin unterworfen und die Polysaccharide aus dem Gewebe unter bestimmten Bedingungen ausgefällt, abgetrennt und mit zunehmend

is konzentrierten Eluierungslösungen behandelt werden. Die Möglichkeit der Gewinnung von Proteasenhemmstoffen wird bei diesem Verfahren nicht erwartet.

Heparin ist also bereits aus tierischen Org^aen unter Zuhilfenahme der lösbarmachenden Wirkung einiger proteolytischer Enzyme und nachträglicher Fällung des Heparins gewonnen worden. Allgemein kann jedoch gesagt werden, daß entsprechende Verfahren in den meisten Fällen durch andere Herstellungsmethoden nach und nach verdrängt wurden, die auf anderen Quellen beruhten und industriemäßig lohnender waren. Erwähnenswert ist auch die Tatsache, daß die Abfallrückstände aus der Heparinherstellung als Flüssigkeit, die bei der Fällung übrig bleibt, in die Abwasserleitung entleert wurden, was eine nicht

μ unbeträchtliche Umweltverunreinigung verursachte.

Hauptzweck der Erfindung ist die Schaffung eines neuen Verfahrens zur Herstellung eines Proteasenhemmstoffes, insbesondere Kallikrein und Trypsin, welches vom Gesichtspunkt der Industrieherstellung aus gesehen in bezug auf Ausbeute und Kalkulation gegenüber den herkömmlichen Methoden günstig liegt.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Proteasenhemmstoff aus tierischen Organen durch

a) Lysis des tierischen Rohmaterials,

b) Proteinentziehung und

c) Gewinnung aus der verbleibenden Flüssigkeit,

daß dadurch gekennzeichnet ist, daß zur Lysis gemäß Stufe a) die tierischen Organe ganz oder in Form von Pulver oder Extrakt mittels Papain, Ficin, Bromelin oder Pankreatin in wäßriger Lösung behandelt werden, um daß in Stufe c) durch Zusatz einer quaternären

so Ammoniumverbindung zunächst Hepfc>in und Mucopolysaccharide ausgefällt und abgetrennt werden.

Zuerst muß hervorgehoben werden, daß der Proteasenhemmstoff van zahlreichen proteolytischen Enzymen nicht angegriffen wird, wie etwa Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Kallikrein, Plasmin, Elastase, Kollagenase, Carboxy-Peptidasen A und B, Ficin, Papain und Bromelin (B. Kassell und KoIL, J. Biol. Chem. 219,203 -H. Kraut und KoII. Z. physiol. chem. 334, 235 und 348, 1498). Außerdem wurde von den angeführten Verfas sern sowie von der Anmelderin festgestellt, daß insbesondere Pepsin, Papain und Ficin durch den Proteasenhemmstoff nicht inhibiert werden. Es ist nun bekannt, daß einige dieser proteolytischen Enzyme bei der Gewinnung des Heparins aus Geweben und

Organen, wo es enthalten ist, Verwendung finden.

Ferner wurde beobachtet, daß die Löslichkeit des Hemmstoffes in den verschiedenen, proteinentziehenden Gemischen zwar gegeben ist, aber in veränderli-

chem Maß durch dieselben Proteine beeinflußt wird, die in den normalen Rohextrakten vorhanden sind und bei der Reinigung entfernt werden müssen, um mögliche anaphylaktogene Folgen auf ein Mindestmaß herabzusetzen. Bei der Extraktion des Pepäds aus den dieses enthaltenden Organen bestand daher das Problem, die Beeinflussung der Löslichkeit des in Rede stehenden Hemmstoffes durch Proteine zu beseitigen und gleichzeitig die Gefahr von Anaphylaxis einzuschränken.

Schließlich konnte die Anmelderin feststellen, daß die Anwendung von quaternären Ammoniumbasen als kationische Detergentien unter bestimmten Bedingungen die Befreiung des Hemmstoffes von polyanionischen Verunreinigungen wie Mucopolysaccharide, Nukleinsäuren und zahlreichen Stoffen pyrogenetischer Art erlaubt; demnach kann sich die Anwendung derartiger Detergentien als nützlich erweisen, nicht nur zur Reinigung sondern auch zur Einschränkung der Pyrogenizität des Produktes.

Es besteht die Möglichkeit der simultanen Gewinnung des Heparins WI des Proteasenhemmstoffes in nur einem Verfahren, wobei man von der nach der Ausfällung von Heparin, Mucopolysacchariden und/ oder pyretogenen Stoffen erhaltenen Fraktion, weiche bisher verworfen wurde, ausgeht und den Hemmstoff konzentriert und reinigt.

Wie die Anmelderin außerdem feststellen konnte und nachstehende Beispiele bestätigen es, ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur deswegen vorteilhaft, weil es ermöglicht, bisher unausgenutzt ausscheidende Ausschußrückstände unter bestimmten Bedingungen zu verwerten, und ein fast aufgegebenes Verfahren zur Herstellung des Heparins und der Muk&polysaccharide vom Standpunkt der Industrie aus wieder brauchbar zu machen, sondern auch weil die Ausbeute a.. Hemmstoff wesentlich höher ist als bei den bekannten Verfahren, und schließlich weil sich dadurch zugleich Verbesserungen bei der Reinigung und bei der Ausscheidung verunreinigender Stoffe erzielen lassen.

Es wird auch noch darauf hingev/iesen, daß ein umfangreicheres Verzeichnis der für die Anwendung im erfindungsgemäßen Verfahren infrage kommenden proteolytischen Enzyme aus z. B. Kassell, »Methods Enzymology« Vol. 19, S. 848—850 entnommen werden kann.

Hinsichtlich der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sei auf folgende Punkte hingewiesen:

1. Das in der Extraktions- und Lösbarmachungsstufe verwendete proteolytische Enzym ist ein solches, das durch den betreffenden Hemmstoff nicht unaktiv gemacht wird, nämlich Papain, Ficin, Bromelin bzw. Pankreatin.

2. Bei der Unterbrechung der Lysis greift man auf die üblichen proteinentziehenden Agenzien und/oder auf Wärmezufuhr zurück.

3. Was die quaternären Ammoniumverbindungen anbelangt, so hat sich die Verwendung von Cetylpyridiniumsalzen und Cetyl-trimethyl-ammoniumbromid als besonders vorteilhaft erwiesen.

4. Für die Isolierung und Reinigung des Hemmstoffes nach der Trennung des Heparins und der Mucopolysaccharide wird vorzugsweise folgende Arbeitsweise angewendet: nach dem Ansäuern mit Trichloressigsäure (Endkonzentration: 2—5%) erfolgt eine Fraktionierung mittels Zusatz von Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration, die zwischen 0,45 und 0,9 der Sättigungskonzentratiön liegt Die weitere Reinigung des Hemmstoffes kann durch Alkohol- und/oder Acetonfraktionierung und Gelffltrierung oder Gelchromatographie erfolgen.

Als tierische Rohmaterialien können z.B. Lunge, Ohrspeicheldrüse, Bauchspeicheldrüse und Leber verwendet werden. Nachstehend angeführte Beispkie ίο soien das erfindungsgemäße Verfahren näher erklären, -stellen aber keine Einschränkung desselben dar.

Beispiel 1 IO kg gemahlene Ochsenkinqe werden in 161

is destilliertem Wasser suspendiert Nach vorsichtiger Erwärmung der Suspension bis 40⁰C wurde derselben eine Suspension von 20 g Papain in 41 Zitratpufferlösung (0,25 M) mit einem pH-Wert von 54 zugesetzt, wobei letztere 200 g Magnesiumsulfat enthielt Die Temperatur wurde auf 55° C eingestellt und die Masse 4 Std. lang bei diesen Bedingungen gelassen. Darauf wurde der pH-Wert durch Zusatz konzentrierten Ammoniaks auf 6,2 gebracht und die Masse auf 90⁰C erhitzt Das Ganze wurde dann unter Druck filtriert und der Rückstand abgetrennt. Die klare Flüssigkeit wurde bis zur restlosen Ausflockung der Polyanionen mit Cetylpyridiniumsalz behandelt. Dann wurde abfiltriert um das Heparin enthaltende Präzipitat zu sammeln, wobei der Flüssigkeit Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 3% zugesetzt wurde. Nach 30 Min. wird wieder unter Druck filtriert und der FilHerrückstand mit 41 Trichloressigsäure (3%) gewaschen. Dabei erhielt man 32 I einer klaren Flüssigkeit mit 610 wirksamen Hemmstoffeinheiten je ml (hinsichtlich »Hemmstoffeinheit« vgl. Z. Physiol. Chem. 182,1 — 1930), was einer Ausbeute von 135 - 10⁶ Wirkstoffeinheiten je kg des Ausgangsorgans entspricht. Diese Lösung wurde dann einer Fraktionierung mit Ammoniumsulfat in einer Menge von 04 ^is 0,9 der Sättigungskonzentration unterzogen und das Präzipitat wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Dabei wurden 85 g Präzipitat mit 1,9 · 10⁷ Hemmstoffeinheiten (ca. 98% der gesamten durch Lysis erhaltenen Aktivität) erhalten, während der Gehalt an Proteinmaterial 364% beträgt, was einem Reinheitsgrad von 146 μπι Protein je Hemmstoffeinheit gleichkommt. Weitere Reinigungen dieses Präzipitats nach den bekannten Methoden der einschlägigen Technik führen zu 465 ml einer apyrogenen Lösung mit einer Aktivität von 32 000

so Henrmstoffeinheiten je ml, das sind insgesamt 1,49 · 10⁷ Hemmstoffeinheiten, was einer Ausbeute von 76% gegenüber der Anfangsaktivität gleichkommt Der bei der Analyse des Proteinmaterials festgestellte Reinheitsgrad betrug 0,143 μπι Protein je Hemmstoffeinheit.

Ein Vergleichsversuch mit einer entsprechenden Menge desselben zerkleinerten Organs unter Extraktion mit Äthylalkohol (70%) in Gegenwart von Kalziumchlorid (vgl. deutsche Patentschrift 10 84 433) ergab eine Ausbeute von 0,875 · 10⁶ Hemmstoffeinhei ten je kg des Organs im Rohzustand und 0322 · 10⁶ Hemmstoffeinheiten je kg des Organs in gereinigtem Zustand bei einem Reinheitsgrade von 0,14 ug Protein je Hemmstoffeinheit. Ein Vergleich mit den Ergebnissen der Papainlysis ergibt eine Ausbeute von 21,7% des gereinigten Produktes bzw. 46% des Rohproduktes. Ein weiterer Versuch, der mit einer entsprechenden Menge desselben zerkleinerten Organs unter Anwendung des Verfahrens nach B. Kassel »Methods Enzymology«

Bd. 19, S. 845, vorgenommen wurde, ergab eine Ausbeute an Rohprodukt von 1.,02O · 10⁶ Hemmstoffeinheiten je kg des Organs, bzw. 0,418 · ΙΟ⁵ Hemmstoffeinheiten je kg des Organs an gereinigtem Produkt Ein Vergleich mit den Ergebnissen der Papainlysis ergibt eine Ausbeute von 53,6% an Rohprodukt bzw. 28% an gereinigtem Produkt

Beispiel 2

Es wurde wie bei Beispiel 1 verfahren, wobei Hein anstatt Papain verwendet wurde. Die Ausbeute betrug 2,0a · 10⁶ Hemmstoffeinheiten je kg Lunge an Rohprodukt bzw. 1,64 · 10⁶ je kg Lunge an gereinigtem Produkt

to

Beispiel 3

5 kg Ochsenlunge wurden in 81 Wasser suspendiert und 21 einer Suspension mit 10 g Bromelin in einer Phosphatpufferlösung (0,1 M) mit einem pH-Wert von 6 zugesetzt, die 1% Äthylendiamin-tetraessigsäure enthielt Die Masse wurde bis 37° C vorsichtig erwärmt und 4 Std. lang auf dieser Temperatur gehalten. Nach dieser Zeit wurde die Temperatur 10 Min. lang bis auf 90° C erhöht Anschließend wurde unter Druck filtriert und der Filterrückstand mit 21 destilliertem Wasser gewaschen. Nach der Abkühlung wurde das Filtrat mit Cetyltrimethylammoniumbromid bis zur restlosen Ausflockung der Polyanionen behandelt, die zur Abtrennung des Heparins auf dem Filter gesammelt wurden. Die klar filtrierte Flüssigkeit ergab 161 mit einer Aktivität von 540 Hemmstoffeinheiten je ml, was einer Ausbeute von 1,735 · 10* Hemmstoffeinheiten je kg des Ausgangsorgans entspricht Daraufhin wurde die Reinigung wie unter Beispiel 1 vorgenommen. Die Endausbeute an gereinigtem Produkt betrug 1,18 - 10⁶ Hemmstoffeinheiten je kg der Lunge. Ein Vergleichsversuch unter Extraktion und Fraktionierung mit Ammoniumsulfat, wie es in der französischen Patentschrift 15 β6 777 beschrieben ist, ergab eine Endausbeute an gereinigtem Produkt von 0,68 · 10⁶ Hemmstoffeinheiten je kg des Ausgangsorgans, was einer Ausbeute von 57,7% entspricht.

Beispiel 4

2,5 kg trockenes Ochsenlungenpulver wurden nach dem unter Beispiel 1 beschriebenen Verfahren extrahiert. Die Endausbeute betrug 12 ■ 10⁶ Hemmstoffeinheiten je kg Pulver.

Beispiel 5

2$ kg Ochsenlungenpulver wurden in 23,51 destilliertem Wasser suspendiert Nach vorsichtigem Erwännen bis 40° C wurde unter Rühren eine Suspension von 40 g Pankreatin in 41 Triäthanolamin-Pufferlösung (0,2 M) mit einem pH-Wert von 8 mit 30 g Kalziumchlorid zugesetzt Die Temperatur wurde 24 Std. lang auf 40°-C gehalten und dann auf 90° C erhöht worauf die Masse unter Druck filtriert wurde. Dann wurde das Filtrat wie unter Beispiel 1 beschrieben, behandelt Die Endausbeute betrug 4,2 - 10⁶ Hemmstoffeinheiten je kg vom Lungenpulver an Rohprodukt und 2,8 - ^Hemmstoffeinheiten je kg Lunge an Reinprodukt

Beispiel 6

10 kg Ochsenlunge wurde in 161 zweifach destilliertem Wasser suspendiert Nach vorsichtigem Erwärmen auf 40° C wurde 500 g frische zerkleinerte Ochsenbauch-Speicheldrüse in 4 ί Tnäthanolamin-Pufferlösung (02 M) mit einem pH-Wert von 8, die 30 g Kalziumchlorid enthielt, zugesetzt Dann wurcL, wie in Beispiel 5 beschrieben, verfahren. Die End^isbeute betrug 1,25 - 10⁵ Hemmstoffeinheiten je kg vom Organ an Rohprodukt bzw. 0,780 - 10⁶ je kg vom Organ an Reinprodukt

Beispiel 7

20 I flüssiger Lungenextrakt als Rückstand aus der Abtrennung von Heparin mittels quaternären Ammoniumbasen werden mit Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 3% angesäuert Nach 60 Min. wird unter Druck filtriert und über den Filter mit 5 I Trichloressigsäure 3% gespült Somit wurden 23,21 einer klaren Flüssigkeit gewonnen, die 352 Hemmstoffeinheiten je ml enthielt Die Flüssigkeit wurde dann durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat bei 0,45 bis 0,9 der Sättigungskonzentration fraktioniert und das Präzipitat mittels Zentrifugieren gesammelt. Es wurden somit 41 g Präzipitat mit einer Gesamtaktivität von 7.9 · 10⁶ Hemmstoffeinheiten und einem Gehalt an Proteinstoffen von 31,5% gewonnen, was einer spezifischen Aktivität von ca. 1,63 μg Protein je Hemmstoffeinheit entspricht Weitere, mit diesem Präzipitat vorgenommene Reinigungen ermöglichten die Gewinnung einer apyrogenen Lösung, die 36 000 Hemmstoffeinheiten je ml enthielt, bei einer Endausbeute von 5,7 · 10⁶ Hemmstoffeinheiten, d.h. 70% der im Ausgangsstoff insgesamt enthaltenen Aktivität. Es wurde eine spezifische Aktivität von 0,141 μΐη Protein je Hemmstoffeinheit gefunden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Proteasenhemmstoff aus tierischen Organen durch

a) Lysis des tierischen Rohmaterials,

b) Proteinentziehung und

c) Gewinnung aus der verbleibenden Flüssigkeit,