DE69230887T2

DE69230887T2 - Escharase enthaltene proteolytische mischung und methode seiner isolierung

Info

Publication number: DE69230887T2
Application number: DE69230887T
Authority: DE
Inventors: C. Houck; K. Klein
Original assignee: Individual
Current assignee: KLEIN, MARK C., BRUNSWICK, ME., US
Priority date: 1991-12-03
Filing date: 1992-12-02
Publication date: 2000-10-12
Anticipated expiration: 2012-12-03
Also published as: AU676464B2; FI942603A; HU9401684D0; JPH08508635A; CA2125158C; EP0618811B1; FI109766B; HU214641B; HUT71383A; EP0618811A1; EP0618811A4; JP3255643B2; DE69230887D1; ES2146607T3; AU3234293A; CA2125158A1; FI942603A0; WO1993010811A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Escharase ist ein hydrolytisches Enzymmaterial, das frei von einer caseinolytischen Aktivität ist, mit einem isoelektrischen Punkt von ungefähr sechs. Sie weist ein Molekulargewicht von ca. 45.000 Dalton auf und ist aus drei Untereinheiten zusammengesetzt, von welchen angenommen wird, daß diese identisch sind, welche jeweils ca. 15.000 Dalton wiegen.
Escharase und Mischungen, welche Escharase enthalten, sind nützlich für die Wundreinigung von totem Gewebe von einem Säugetierwirt. Sie sind besonders nützlich für die Entfernung von totem Gewebe von menschlichen Verbrennungsopfern.
Das Produkt, Verfahren zur Isolierung und Verfahren der Anwendung sind wohlbekannt und werden beispielsweise von Houck, Chang und Klein in Int. J. Tiss. Reac. V(2) 125-134 (1983) und in den U.S.-Patenten 4,197,291, erteilt am 8. April 1980; 4,226,854, erteilt am 7. Oktober 1980 und 4,307,081, erteilt am 22. Dezember 1981, beschrieben.
Die Veröffentlichung von Houck et al. und die Patente beschreiben Verfahren der Isolierung von Escharase selbst sowie einer proteolytischen Mischung, welche Escharase enthält, durch die Vorgänge, welche allgemein in Fig. 1 hiervon dargestellt sind.
Die proteolytische Mischung, welche die Escharase enthält, und natürlich die Escharase selbst sind nützlich für die Wundreinigung von totem Gewebe von Säugetieren.
Wie man aus der Figur sieht, ist der erste Schritt in dem Isolierungsprozeß, im Handel erhältliches Bromelain mit einem Acetatpuffer zu extrahieren, welcher Thioglycolsäure enthält, und dann zu filtrieren. Insbesondere wird das im Handel erhältliche Bromelain in einem Acetatpuffer 0,1 M, pH 5,5, welcher mit bis zu 1% an Thioglycolsäure versetzt wurde, extrahiert (10 Gramm pro 200 ml). Der pH dieser Lösung beträgt ungefähr 4. Die Lösung wird durch einen XM 50-Amicon-Diaflo-Ultrafilter (Amicon Corp., Boston, Mass.) gepreßt und über PM 30-Diaflo-Filtern konzentriert. Die aktive Lösung, welche eine Mischung von proteolytischen Enzymen mit Molekulargewichten von 30.000 bis 50.000 Dalton enthält, kann entweder bei 2º bis 6ºC gegen deionisiertes, destilliertes Wasser (200 Volumina) dialysiert werden, durch Zentrifugation aufgeklart werden und der klare Überstand gefriergetrocknet werden; oder die aktive Fraktion kann mit 70% Aceton gefällt werden. Beide Verfahren produzieren nützliche proteolytische Mischungen.
Wie in Fig. 1 gezeigt ist, kann Escharase wie oben beschrieben aus der proteolytischen Enzymmischung isoliert werden, die nach dem Durchpressen durch den XM 50-Amicon- Diaflo-Ultrafilter erhalten wurde.
In einem Isolierungsverfahren wird die Enzymmischung einer molekularen Ausschlußchromatographie als ein Phenylquecksilbersalz [hergestellt durch das Vereinigen der Mischung mit einem wäßrigen 0,2 M Citratpuffer, der mit dem Salz gesättigt ist, gemäß dem Verfahren von Ota et al. in Biochem. 3: 180 (1960)] auf einer Säule mit Sephadex G 75 unterzogen. Die Elution des Escharaseprodukts von dieser Säule ging der Elution des reinen Stamm-Bromelains voraus, und daher muß Escharase ein Molekulargewicht oberhalb von Bromelain, z. B. 32.000, aufweisen.
Sephadex G 75 ist ein Polysaccharidgel, das bei Pharmacia in Upsala, Schweden, erhältlich ist. Es wird gemäß Verfahren, die in der Technik wohlbekannt sind, für die molekulare Ausschlußchromatographie eingesetzt.
Die Mischung, welche durch Ausschlußchromatographie erhalten wurde, wird dann durch isoelektrische Fokussierung fraktioniert und einer analytischen Elektrophorese auf Polyacrylamidgel in 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) unterzogen.
Zur isoelektrischen Fokussierung wurde die Mischung in einem Sucrosegradienten mit LKB-Ampholin-Ampholyten, anfangs von pH 3 bis 10 und anschließend bei pH 5 bis 8, gemischt. Das aktive Material wurde in einem Peak bei einem isoelektrischen Punkt von pH 6,04, in einem Bereich von 5,85 bis 6,12, konzentriert. Dieser isoelektrische Punkt ist deutlich verschieden von dem, was für Bromelain beschrieben wurde (pH 4,7 und 9,9). Siehe Vestberg Acta. Chem. Scand. 20: 820 (1966).
LKB-Ampholin ist bei der LKB Company in Schweden für eine isoelektrische Fokussierung erhältlich. Es wird angenommen, daß es eine Mischung aus kleinen Ampholyten ist.
Die Produkte, welche durch isoelektrische Fokussierung isoliert wurden, weisen einen extrem hohen Grad an Escharaseaktivität auf.
Zur weiteren Reinigung kann das isoelektrisch fokussierte, aktive Material einer Polyacrylamidgelelektrophorese bei pH 9 in 1% (SDS) unterzogen werden (Weber et al., J. Viol. Chem. 244: 4406 (1969). Nur eine angefärbte Proteinbande kann mit einer gemessenen elektrophoretischen Mobili tät sichtbar gemacht werden, welche, wenn sie mit Standardproteinen mit bekanntem Molekulargewicht verglichen wird, von einem Molekulargewicht zwischen 14.300 und 15.000 Dalton zeugt. Da von SDS bekannt ist, daß es Proteine in ihre verschiedenen Untereinheiten dissoziiert, sofern solche vorliegen, ist es ersichtlich, daß das Escharaseprodukt dieser Erfindung wenigstens zwei, und wahrscheinlicher drei Untereinheiten mit im wesentlichen demselben Molekulargewicht umfaßt.
Das Verfahren dieser Erfindung stellt eine verbesserte proteolytische Mischung zur Verfügung, welche eine viel höhere Konzentration an Escharase enthält. Ein besonderer Vorteil des Verfahrens der Erfindung ist, daß es im Maßstab vergrößert werden kann, so daß viel größere Mengen des Bromelainausgangsmaterials verwendet werden können. Darüber hinaus wird es beständig dieselben hohen Ausbeuten produzieren. Zusätzlich ist es aufgrund der höheren Ausbeuten und der Tatsache, daß das Verfahren selbst billiger ist, ökonomischer als das vorherige Verfahren.
Wie in dieser Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, bezieht sich der Begriff "Bromelain" oder "Bromelainausgangsmaterial" auf irgendeine aus einer Anzahl von derzeit verfügbaren Bromelainpräparationen wie z. B. TMBC-Bromelain, das im Handel von Taiwan McKay erhältlich ist. Das Bromelain wird aus dem Stamm der Ananaspflanze hergestellt. Bei dem derzeit bevorzugten Verfahren zum Erhalt von Bromelain zur Verwendung in dieser Erfindung wird der Saft aus dem Stamm zuerst mit Phosphorsäure auf einen pH von ca. 3 oder 4 eingestellt, wie in den oben angegebenen Patenten und der Veröffentlichung beschrieben wird, Natriumhydrid oder Natriumsulfhydrid wird zugegeben, um vor einer Sulfhydryloxidation zu schützen. Das inerte Material wird bei ca. 30% Aceton gefällt (Zugabe von genügend Aceton, so daß die Lösung 30% Aceton aufweist) und, nach Filtration, wird die aufgeklarte Flüssigkeit mit 70% Aceton gefällt. Dieser Nie derschlag wird durch Zentrifugation gesammelt und entweder wieder in Wasser gelöst, welches Natriumhydrid oder Natriumsulfhydrid enthält, das mit Phosphorsäure angesäuert wurde, und wieder gefällt, oder direkt in einem Vakuumofen getrocknet. Wenn das Material erneut gefällt wird, wird 70% Aceton verwendet. Das getrocknete Material aus jedem Verfahren ist als ein Ausgangsmaterial geeignet, um die Produkte dieser Erfindung zu erhalten.
Verdünnte wäßrige Antioxidanzlösungen wie z. B. Ascorbinsäure beziehen sich auf wäßrige Lösungen, die von ca. 0,5 bis 2 Gew.-%, vorzugsweise 0,75 bis 1,25%, am meisten bevorzugt 1% Ascorbinsäure enthalten.
Verdünnte wäßrige Ascorbinsäurelösungen werden in dem Verfahren dieser Erfindung eingesetzt, um das Bromelainausgangsmaterial zu extrahieren. Der Extrakt wird z. B. durch eine Filtration aufgeklart, und die proteolytische Mischung, welche die Escharase enthält, wird durch die Zugabe eines Proteinfällungsmittels wie z. B. Ammoniumsulfat gefällt. Typischerweise wird, um eine effiziente Fällung mit Ammoniumsulfat zu erreichen, eine Menge dieses Reagenzes zugegeben, die ausreicht, um wenigstens eine Lösung mit 30 Gew.-% zu bilden, obwohl die eingesetzte Menge ausreichen kann, um eine gesättigte Lösung zu bilden. Typischerweise wird die Lösung von ca. 35 Gew.-% bis 45 Gew.-% an Ammoniumsulfat enthalten. Vergleichbare Mengen von anderen Fällungsmitteln können eingesetzt werden.
Die Escharase enthaltende proteolytische Mischung dieser Erfindung kann aus dem oben beschriebenen Bromelainausgangsmaterial durch eine Extraktion mit einem wäßrigen Medium, das ein nicht-flüchtiges Antioxidationsmittel enthält, erhalten werden. Sie wird aus dem Extrakt isoliert und kann weiter gereinigt werden. Bei dem derzeit bevorzugten Verfahren wird das Bromelainausgangsmaterial mit einer wäßrigen Lösung der Ascorbinsäure bei einem pH von ca. 3 bis 4 extrahiert, und das gewünschte Produkt wird aus dem Extrakt mit einem Fällungsmittel wie z. B. Ammoniumsulfat ausgefällt. Die ausgefällte proteolytische Mischung kann als solche verwendet werden, es ist aber bevorzugt, die Mischung weiter zu reinigen und ihren Escharasegehalt zu konzentrieren.
Obwohl Ascorbinsäure, da sie leicht verfügbar ist, das bevorzugte Antioxidationsmittel ist, können physiologisch verträgliche und extrem effiziente andere Antioxidationsmittel eingesetzt werden. Diese schließen z. B. Dihydrochinon, butyliertes Hydroxtoluol und Dithiothreitol ein.
In ähnlicher Weise können andere Proteinfällungsmittel eingesetzt werden, obwohl wie bei allen solchen Fällungen Ammoniumsulfat bei weitem das am meisten bevorzugte ist. Diese schließen sowohl organische als auch anorganische Fällungsmittel einschließlich niederer Alkohole wie z. B. Methanol und Ethanol; Aceton; Polyethylenglycol; Sulfate wie z. B. Magnesium-, Kalium- und Natriumsulfat; und Halogenide wie z. B. Natrium- und Kaliumchlorid ein.
Das ausgewählte Antioxidationsmittel und das Fällungsmittel sollten in der Reaktion inert sein und sollten das Protein nicht denaturieren.
Ein typisches Verfahren für die Isolierung einer proteolytischen Mischung dieser Erfindung ist wie folgt:
1. 1 Kilo an Bromelain wird bei 4-10ºC für 60 Sekunden in 10 Litern 1% Ascorbinsäure (10 mg/ml) in destilliertem Wasser gemischt (Waring-Mischer).
2. Diese Suspension wird mit 4 N HCl auf pH 3,5-3,9 eingestellt.
3. Die Suspension wird für 18 Stunden bei 4-10ºC gerührt.
4. Nach dem Abtrennen der unlöslichen (20-25%) Materialien aus der löslichen Fraktion durch Filtration oder Zentrifugation in der Kälte (4-10ºC) wird die lösliche Fraktion mit Ammoniumsulfat auf eine 40%ige Sättigung gebracht (2842 g/10 l) und über Nacht bei 4-10ºC stehen gelassen.
5. Nach dem Sammeln des Niederschlags über eine Zentrifugation oder Filtration in der Kälte wird der Niederschlag in der Kälte in 10 Litern 0,3 M Essigsäure gelöst (pH 3,0), welche 0,1% Ascorbinsäure (1 mg/ml) enthält.
6. Dieser Extrakt wird dann mit 40 Litern destilliertem Wasser über einem 10.000 Dalton-Hohlfaser-Ultrafilter gewaschen, wobei ein Amicon DC-30 A-System mit einer Filtermembrankartusche vom Typ H10P1020, DF-40, verwendet wird. Eine Flußgeschwindigkeit von 300 bis 400 ml/min bei 19-23 psi bei 10ºC wird für ca. zwei Stunden beibehalten, und das Endvolumen wird auf ca. 4,5 bis 5,0 Liter verringert.
7. Die resultierende Lösung wird dann lyophilisiert und gewogen, wobei sich gewöhnlich eine Ausbeute von ca. 250 g ergibt.
Das Verfahren dieser Erfindung liefert im Vergleich zu der proteolytischen Mischung, die durch das Verfahren der oben angegebenen Patente und der Veröffentlichung erhalten wurde, eine stark verbesserte Escharase enthaltende proteolytische Mischung. Die proteolytische Mischung wird in stark verbesserten Ausbeuten erhalten, z. B. ca. 25% Ausbeute verglichen mit ca. 10% Ausbeute durch die früheren Verfahren.
Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, daß die proteolytische Mischung der Erfindung von ca. 1% bis 1,5% Escharase pro Gewicht bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung enthält. Die vorher beschriebenen Verfahren lie ferten proteolytische Mischungen, welche, im Durchschnitt, viel kleinere Mengen an Escharase enthielten. Darüber hinaus ist die Mischung über einen längeren Zeitraum stabil und scheint durchweg bessere transplantationsbereite Betten für die Aufnahme neuer Haut zu erzeugen, als durch die vorher beschriebenen Verfahren erhalten werden konnte.
Die Mischung kann dadurch gekennzeichnet werden, daß sie von ca. 1% bis 1,5% Escharase zusammen mit proteolytischen Enzymen aus Bromelain enthält, die mit verdünnter wäßriger Ascorbinsäure extrahierbar sind.
Wenn gewünscht, kann Escharase aus der proteolytischen Mischung der Erfindung durch das folgende Verfahren isoliert werden:

1. Säulenchromatographie mit G-75-Sephadex

Man löse 4 bis 7 g der proteolytischen Mischung in 50 ml 0,3 M Essigsäure, die 1 mg/ml Ascorbinsäure enthält. Nach einer Zentrifugation bei 1200-1500 g wird die klare Flüssigkeit einer Ausschlußsäulenchromatographie (G-75) unterzogen, und die biologisch aktive (durch Bioassay) Fraktion nach dem Ausschlußvolumen der Säule und vor dem Hauptpeak, welcher reich an einer allgemeinen Proteaseaktivität ist (getestet mit dem denaturierten Hämoglobin), wird gepoolt, dialysiert und lyophilisiert. Diese Fraktion eluiert ungefähr dort, wo Ovalbumin eluiert, d. h. bei 45.000 Dalton, und enthält ca. 15-20% der aufgetragenen proteolytischen Mischung.

2. Isoelektrische Fokussierung

Das gepoolte, biologisch aktive Produkt aus wiederholten Läufen über die G75-Säule wird dann einer isoelektrischen Fokussierung unterzogen, wobei ein 0-40%iger Sucrosegradient, welcher 1% LKB-Ampholin enthält, in der LKB-8102- Vorrichtung von pH 5 bis 8 bei 4ºC verwendet wird, wie in den oben angegebenen Patenten beschrieben wird. Während der Elution wird die Extinktion der verschiedenen Fraktionen bei 280 nm bestimmt, und die verschiedenen Fraktionen wurden gepoolt, dialysiert und getestet. Nur die Fraktion bei pH 6,4 zeigte die Trennungsaktivität (dissecting activity) (d. h. ein Trennen von denaturiertem von nativem Gewebe). Wenn die G-75-Fraktion in 4 M Harnstoff als einem Lösungsmittel gelöst wird, verschiebt sich ihr isoelektrischer Punkt von 6,4 auf 6,8.
Eine wiederholte isoelektrische Fokussierung dieser Fraktion ergab ein Material, welches UV-Licht bei einem Peak von 280 nm absorbierte, das totes von lebendem verbranntem Gewebe trennen konnte, um ein transplantationsbereites Bett zu erzeugen. Es wurde gefunden, daß diese Fraktion bei zwei verschiedenen pH-Niveaus in einer Acrylamidgel-Scheibenelektrophorese elektrophoretisch homogen ist.
Es ist natürlich dieselbe Escharase, die durch die vorher beschriebenen Verfahren isoliert wurde. Sie kann die Fläche zwischen lebendem und totem Gewebe präparieren, hat aber keine allgemeine proteolytische Aktivität gegenüber denaturiertem Hämoglobin, Gelatine oder Casein. Sie hat ebenfalls keine hydrolytische Aktivität gegenüber Hyaluronsäure oder Dermatansulfat, welche saure Mucopolysaccharide der Haut sind.
Escharase wird von der G-75 bei einem Molekulargewicht von ca. 45.000 Dalton ausgeschlossen. Nach der isoelektrischen Fokussierung scheint sie ein Molekulargewicht bei der SDS-PAGE-Elektrophorese von ca. 15.000 und bei der Sephadex G-50-Ausschlußchromatographie von ca. 14.000 Dalton aufzuweisen. Es scheint daher, daß Escharase ein Komplex aus drei identischen Untereinheiten von ca. 15.000 Dalton ist, welche während der isoelektrischen Fokussierung dissoziieren.
Die Aminosäureanalyse der reinen Escharase ist wie folgt:

Nanomole/Nanomol an Escharase (14.000 D)

Alanin 16
Arginin 7
Asparaginsäure 12
Cystin/2 6,6
Glutaminsäure 10,6
Glycin 16,8
Histidin keines
Isoleucin 6,4
Leucin 6,4
Lysin 5,6
Phenylalanin 3,4
Prolin Spuren
Serin 14
Threonin 7
Tyrosin Spuren
Valin 7,6
Methionin keines
Insgesamt 115 Nanomole Molekulargewicht von 13.800
Escharase ist im wesentlichen frei von Methionin, Histidin, Prolin und Tyrosin. Dass Fehlen von Prolin und Tyrosin zeigt, daß Escharase ein außergewöhnliches Protein ist.
Die ausgefällte Escharase enthaltende proteolytische Mischung wird z. B. durch Zentrifugation gewonnen und kann gereinigt und durch Lyophilisation konzentriert werden, wenn dieses gewünscht wird. Für diesen Reinigungsvorgang wird die ausgefällte proteolytische Mischung in Essigsäure gelöst und bis zu beispielsweise fünfmal lyophilisiert.
Die proteolytische Mischung dieser Erfindung und die Escharase, die daraus stammt, werden für die Entfernung von Verbrennungsschorf benutzt, wobei dieselben Verfahren benutzt werden, die in den oben angegebenen Patenten und in der Veröffentlichung beschrieben sind.
Variationen der beschriebenen Verfahren, Reagenzien und Instrumente, die spezifisch beschrieben wurden, werden den Fachleuten ersichtlich sein. Andere Filtertypen können eingesetzt werden. Beliebige aus einer Vielzahl an Proteinen können als Standards bei der Elektrophorese eingesetzt werden. Sucrose ist nicht der einzige Gradient, welcher bei den Verfahren der isoelektrischen Fokussierung eingesetzt werden kann. Die genauen Details dieser Verfahren können von den entsprechenden Verfahren, die oben beschrieben wurden, abweichen.

BEISPIEL 1

Eine Gesamtmenge von 250 Gramm Bromelain wurde für 60 Sekunden bei 4ºC mit 2,5 Litern 1%iger wäßriger Ascorbinsäure homogenisiert, und einige wenige Tropfen Octanol wurden zugegeben, um ein Schäumen zu verhindern. Der pH wurde mit 4 N HCl auf 3,5 eingestellt. Die Mischung wurde dann für ca. 15 Stunden bei 4ºC leicht gerührt und bei derselben Temperatur für 30 Minuten bei 10.000 Upm zentrifugiert. Der Überstand (2,525 Liter) wurde gesammelt, und 742,4 Gramm Ammoniumsulfat wurden über einen Zeitraum von ca. 4 Minuten unter schnellem Rühren zugegeben, das für weitere 10 Minuten fortgesetzt wurde. Die Mischung wurde bei leichtem Rühren bei ca. 4ºC für ca. 15 Stunden stehen gelassen. Sie wurde dann durch Zentrifugation für 30 Minuten bei 10.000 Upm und 4ºC getrennt.
Der Niederschlag wurde in 0,3 molarer Essigsäure, welche 0,1 Gew.-% Ascorbinsäure enthielt, gelöst. Der pH wurde mit 4 N HCl auf 3 eingestellt, und das Volumen wurde durch die Zugabe von mehr wäßriger Essigsäure/Ascorbinsäure- Mischung auf 2500 ml gebracht und bei 4ºC für 2 Stunden gerührt.
Nach einem Stehen für ca. 15 Stunden bei 4ºC wurde die Lösung auf dem CH2RS-Amicon-Konzentrator mit einer Spiralmembran mit einem Cutoff-Molekulargewicht von 10.000 konzentriert und dialysiert. 10 bis 1.2 Liter kalte 0,3 molare Essigsäure wurden bei einem pH von 3 über einen Zeitraum von einigen wenigen Stunden zugegeben. Das Endkonzentrat wurde auf das halbe Volumen (1,25 Liter) gebracht, und es wurde mit EMI-Tauchstäben (Nessler's Reaktion) gefunden, daß der Gehalt an Ammoniumionen vernachlässigbar war. Das Konzentrat wurde bei 4ºC für 30 Minuten bei 10.000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde für ca. 15 Stunden bei -70ºC gelagert und bei ca. 25ºC und bei 7 mm Hg lyophilisiert. Die Ausbeute des Produkts, bezogen auf das Gewicht des ursprünglichen Ausgangsmaterials, betrug 29%.

BEISPIEL 2

Standardverbrennungswunden wurden auf einem betäubten Ferkel erzeugt, indem für 45 Sekunden eine Hitze von 360º auf Hautflächen von 4,4 cm angewendet wurde. Das mit Blasen bedeckte Keratin wurde entfernt, indem es mit trockenem Mull abgewischt wurde. Die Verbrennungen wurden durch Tränkungen mit Normaler Salzlösung feucht gehalten, bis sie behandelt wurden.
Die Verbrennungsfläche wurde von der unverbrannten Fläche durch einen Rahmen abgesondert, welcher an seinem Platz fixiert wurde. Die Verbrennung wurde mit Normaler Salzlösung getränkt, und 200 mg eines Pulvers, das im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, wurde gleichmäßig über die Oberfläche der Verbrennung gespritzt. Das Pulver wurde durch die tropfenweise Zugabe von Normaler Salzlösung gelöst und geschützt, indem mit einem sterilen Gel beschichtet wurde. Das Gel wurde dann mit einem weiteren Kunststoffnetz abgedeckt, und es wurde mehr Gel zugegeben. Die Auftragung wurde dann mit Saran-Folie abgedichtet, um anaerobe Bedingungen aufrecht zu erhalten.
Die Fläche wurde mit einer Heizlampe aufgewärmt, um eine Temperatur von ca. 102ºF beizubehalten.
Nach vier Stunden wurde die Abdeckung entfernt und der Verbrennungsschorf mit einem mit Normaler Salzlösung getränkten Mull abgewischt. Es resultierte eine ausgezeichneter Verdauung und Abtrennung des Verbrennungsschorfes. Ein Abtupfen entfernte das meiste des proteolysierten Verbrennungsschorfes, wobei nur einige wenige Flecke von restlichem Verbrennungsschorf zurückblieben, wobei eine starke basale Zirkulation sichtbar war. Nach 20mal Abwischen mit trockenem Mull war fast alles von dem Verbrennungsschorf entfernt, wobei erhöhte Mengen an punktierten blutenden Punkten sichtbar waren. Der gesamte Verbrennungsschorf wurde durch weitere 20mal Abwischen mit mit Normaler Salzlösung getränktem Mull entfernt, wobei, außer einigen wenigen Streifen von zurückbleibendem Verbrennungsschorf, ein sauberes Bett zurückblieb. Nach einem Waschen für zehn Minuten mit warmer Normaler Salzlösung schien das Wundbett sauber und sichtbar transplantationsbereit zu sein. Einige wenige Streifen von basalem Verbrennungsschorf waren an diesem Punkt noch sichtbar, jedoch nicht genug, um eine Transplantataufnahme zu verhindern.
Die Transplantationsbereitschaft des Bettes wurde durch eine standardmäßige histologische Untersuchung festgestellt, welche weniger als 0,1 mm restlichen zentralen Verbrennungsschorf und eine ausgezeichnete Wundreinigung bestätigte.
Das Experiment wurde mit der proteolytischen Mischung wiederholt, die durch das Verfahren der oben angegebenen U.S.-Patente erhalten wurde. Es wurde beobachtet, daß, obwohl das Bett immer noch transplantationsbereit war, die Menge an zentralem Verbrennungsschorf, welche zurückblieb, von 0,1 bis 0,2 mm betrug.

Claims

1. Ein Verfahren zur Herstellung einer proteolytischen Mischung, welche Escharase enthält, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Extrahieren einer Bromelain-Präparation mit einer verdünnten wäßrigen Lösung eines Antioxidationsmittels bei einem pH von 3 bis 4; und

(b) Fällen der gewünschten proteolytischen Mischung aus dem sauren Extrakt, welcher in Schritt (a) gebildet wurde, durch Hinzugeben eines Proteinfällungsmittels.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Antioxidationsmittel Ascorbinsäure ist.

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Proteinfällungsmittel Ammoniumsulfat ist.

4. Eine proteolytische Mischung, welche Escharase enthält, die erhältlich ist durch das:

5. Proteolytische Mischung gemäß Anspruch 4, wobei das Antioxidationsmittel aus Schritt (a) Ascorbinsäure ist.

6. Proteolytische Mischung gemäß einem der Ansprüche 4 oder 5, wobei das Proteinfällungsmittel aus Schritt (b) Ammoniumsulfat ist.

7. Proteolytische Mischung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, welche von 1% bis 1,5% Escharase enthält.