DE69230887T2 - Escharase enthaltene proteolytische mischung und methode seiner isolierung - Google Patents
Escharase enthaltene proteolytische mischung und methode seiner isolierungInfo
- Publication number
- DE69230887T2 DE69230887T2 DE69230887T DE69230887T DE69230887T2 DE 69230887 T2 DE69230887 T2 DE 69230887T2 DE 69230887 T DE69230887 T DE 69230887T DE 69230887 T DE69230887 T DE 69230887T DE 69230887 T2 DE69230887 T2 DE 69230887T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- escharase
- proteolytic
- proteolytic mixture
- mixture
- bromelain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 43
- 108010001587 escharase Proteins 0.000 title claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 34
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 title claims description 29
- 238000009413 insulation Methods 0.000 title 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 28
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 21
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 claims description 20
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 claims description 20
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 14
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 14
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical group N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 9
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 claims description 9
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 206010051814 Eschar Diseases 0.000 description 11
- 231100000333 eschar Toxicity 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001804 debridement Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 244000099147 Ananas comosus Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 239000004322 Butylated hydroxytoluene Substances 0.000 description 1
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 235000010354 butylated hydroxytoluene Nutrition 0.000 description 1
- 229940095259 butylated hydroxytoluene Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000963 caseinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 description 1
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 229920006298 saran Polymers 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- DEIKGXRMQUHZJD-UHFFFAOYSA-N trimethylpyrocatechol Natural products CC1=CC(O)=C(O)C(C)=C1C DEIKGXRMQUHZJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/63—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
- Escharase ist ein hydrolytisches Enzymmaterial, das frei von einer caseinolytischen Aktivität ist, mit einem isoelektrischen Punkt von ungefähr sechs. Sie weist ein Molekulargewicht von ca. 45.000 Dalton auf und ist aus drei Untereinheiten zusammengesetzt, von welchen angenommen wird, daß diese identisch sind, welche jeweils ca. 15.000 Dalton wiegen.
- Escharase und Mischungen, welche Escharase enthalten, sind nützlich für die Wundreinigung von totem Gewebe von einem Säugetierwirt. Sie sind besonders nützlich für die Entfernung von totem Gewebe von menschlichen Verbrennungsopfern.
- Das Produkt, Verfahren zur Isolierung und Verfahren der Anwendung sind wohlbekannt und werden beispielsweise von Houck, Chang und Klein in Int. J. Tiss. Reac. V(2) 125-134 (1983) und in den U.S.-Patenten 4,197,291, erteilt am 8. April 1980; 4,226,854, erteilt am 7. Oktober 1980 und 4,307,081, erteilt am 22. Dezember 1981, beschrieben.
- Die Veröffentlichung von Houck et al. und die Patente beschreiben Verfahren der Isolierung von Escharase selbst sowie einer proteolytischen Mischung, welche Escharase enthält, durch die Vorgänge, welche allgemein in Fig. 1 hiervon dargestellt sind.
- Die proteolytische Mischung, welche die Escharase enthält, und natürlich die Escharase selbst sind nützlich für die Wundreinigung von totem Gewebe von Säugetieren.
- Wie man aus der Figur sieht, ist der erste Schritt in dem Isolierungsprozeß, im Handel erhältliches Bromelain mit einem Acetatpuffer zu extrahieren, welcher Thioglycolsäure enthält, und dann zu filtrieren. Insbesondere wird das im Handel erhältliche Bromelain in einem Acetatpuffer 0,1 M, pH 5,5, welcher mit bis zu 1% an Thioglycolsäure versetzt wurde, extrahiert (10 Gramm pro 200 ml). Der pH dieser Lösung beträgt ungefähr 4. Die Lösung wird durch einen XM 50-Amicon-Diaflo-Ultrafilter (Amicon Corp., Boston, Mass.) gepreßt und über PM 30-Diaflo-Filtern konzentriert. Die aktive Lösung, welche eine Mischung von proteolytischen Enzymen mit Molekulargewichten von 30.000 bis 50.000 Dalton enthält, kann entweder bei 2º bis 6ºC gegen deionisiertes, destilliertes Wasser (200 Volumina) dialysiert werden, durch Zentrifugation aufgeklart werden und der klare Überstand gefriergetrocknet werden; oder die aktive Fraktion kann mit 70% Aceton gefällt werden. Beide Verfahren produzieren nützliche proteolytische Mischungen.
- Wie in Fig. 1 gezeigt ist, kann Escharase wie oben beschrieben aus der proteolytischen Enzymmischung isoliert werden, die nach dem Durchpressen durch den XM 50-Amicon- Diaflo-Ultrafilter erhalten wurde.
- In einem Isolierungsverfahren wird die Enzymmischung einer molekularen Ausschlußchromatographie als ein Phenylquecksilbersalz [hergestellt durch das Vereinigen der Mischung mit einem wäßrigen 0,2 M Citratpuffer, der mit dem Salz gesättigt ist, gemäß dem Verfahren von Ota et al. in Biochem. 3: 180 (1960)] auf einer Säule mit Sephadex G 75 unterzogen. Die Elution des Escharaseprodukts von dieser Säule ging der Elution des reinen Stamm-Bromelains voraus, und daher muß Escharase ein Molekulargewicht oberhalb von Bromelain, z. B. 32.000, aufweisen.
- Sephadex G 75 ist ein Polysaccharidgel, das bei Pharmacia in Upsala, Schweden, erhältlich ist. Es wird gemäß Verfahren, die in der Technik wohlbekannt sind, für die molekulare Ausschlußchromatographie eingesetzt.
- Die Mischung, welche durch Ausschlußchromatographie erhalten wurde, wird dann durch isoelektrische Fokussierung fraktioniert und einer analytischen Elektrophorese auf Polyacrylamidgel in 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) unterzogen.
- Zur isoelektrischen Fokussierung wurde die Mischung in einem Sucrosegradienten mit LKB-Ampholin-Ampholyten, anfangs von pH 3 bis 10 und anschließend bei pH 5 bis 8, gemischt. Das aktive Material wurde in einem Peak bei einem isoelektrischen Punkt von pH 6,04, in einem Bereich von 5,85 bis 6,12, konzentriert. Dieser isoelektrische Punkt ist deutlich verschieden von dem, was für Bromelain beschrieben wurde (pH 4,7 und 9,9). Siehe Vestberg Acta. Chem. Scand. 20: 820 (1966).
- LKB-Ampholin ist bei der LKB Company in Schweden für eine isoelektrische Fokussierung erhältlich. Es wird angenommen, daß es eine Mischung aus kleinen Ampholyten ist.
- Die Produkte, welche durch isoelektrische Fokussierung isoliert wurden, weisen einen extrem hohen Grad an Escharaseaktivität auf.
- Zur weiteren Reinigung kann das isoelektrisch fokussierte, aktive Material einer Polyacrylamidgelelektrophorese bei pH 9 in 1% (SDS) unterzogen werden (Weber et al., J. Viol. Chem. 244: 4406 (1969). Nur eine angefärbte Proteinbande kann mit einer gemessenen elektrophoretischen Mobili tät sichtbar gemacht werden, welche, wenn sie mit Standardproteinen mit bekanntem Molekulargewicht verglichen wird, von einem Molekulargewicht zwischen 14.300 und 15.000 Dalton zeugt. Da von SDS bekannt ist, daß es Proteine in ihre verschiedenen Untereinheiten dissoziiert, sofern solche vorliegen, ist es ersichtlich, daß das Escharaseprodukt dieser Erfindung wenigstens zwei, und wahrscheinlicher drei Untereinheiten mit im wesentlichen demselben Molekulargewicht umfaßt.
- Das Verfahren dieser Erfindung stellt eine verbesserte proteolytische Mischung zur Verfügung, welche eine viel höhere Konzentration an Escharase enthält. Ein besonderer Vorteil des Verfahrens der Erfindung ist, daß es im Maßstab vergrößert werden kann, so daß viel größere Mengen des Bromelainausgangsmaterials verwendet werden können. Darüber hinaus wird es beständig dieselben hohen Ausbeuten produzieren. Zusätzlich ist es aufgrund der höheren Ausbeuten und der Tatsache, daß das Verfahren selbst billiger ist, ökonomischer als das vorherige Verfahren.
- Wie in dieser Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, bezieht sich der Begriff "Bromelain" oder "Bromelainausgangsmaterial" auf irgendeine aus einer Anzahl von derzeit verfügbaren Bromelainpräparationen wie z. B. TMBC-Bromelain, das im Handel von Taiwan McKay erhältlich ist. Das Bromelain wird aus dem Stamm der Ananaspflanze hergestellt. Bei dem derzeit bevorzugten Verfahren zum Erhalt von Bromelain zur Verwendung in dieser Erfindung wird der Saft aus dem Stamm zuerst mit Phosphorsäure auf einen pH von ca. 3 oder 4 eingestellt, wie in den oben angegebenen Patenten und der Veröffentlichung beschrieben wird, Natriumhydrid oder Natriumsulfhydrid wird zugegeben, um vor einer Sulfhydryloxidation zu schützen. Das inerte Material wird bei ca. 30% Aceton gefällt (Zugabe von genügend Aceton, so daß die Lösung 30% Aceton aufweist) und, nach Filtration, wird die aufgeklarte Flüssigkeit mit 70% Aceton gefällt. Dieser Nie derschlag wird durch Zentrifugation gesammelt und entweder wieder in Wasser gelöst, welches Natriumhydrid oder Natriumsulfhydrid enthält, das mit Phosphorsäure angesäuert wurde, und wieder gefällt, oder direkt in einem Vakuumofen getrocknet. Wenn das Material erneut gefällt wird, wird 70% Aceton verwendet. Das getrocknete Material aus jedem Verfahren ist als ein Ausgangsmaterial geeignet, um die Produkte dieser Erfindung zu erhalten.
- Verdünnte wäßrige Antioxidanzlösungen wie z. B. Ascorbinsäure beziehen sich auf wäßrige Lösungen, die von ca. 0,5 bis 2 Gew.-%, vorzugsweise 0,75 bis 1,25%, am meisten bevorzugt 1% Ascorbinsäure enthalten.
- Verdünnte wäßrige Ascorbinsäurelösungen werden in dem Verfahren dieser Erfindung eingesetzt, um das Bromelainausgangsmaterial zu extrahieren. Der Extrakt wird z. B. durch eine Filtration aufgeklart, und die proteolytische Mischung, welche die Escharase enthält, wird durch die Zugabe eines Proteinfällungsmittels wie z. B. Ammoniumsulfat gefällt. Typischerweise wird, um eine effiziente Fällung mit Ammoniumsulfat zu erreichen, eine Menge dieses Reagenzes zugegeben, die ausreicht, um wenigstens eine Lösung mit 30 Gew.-% zu bilden, obwohl die eingesetzte Menge ausreichen kann, um eine gesättigte Lösung zu bilden. Typischerweise wird die Lösung von ca. 35 Gew.-% bis 45 Gew.-% an Ammoniumsulfat enthalten. Vergleichbare Mengen von anderen Fällungsmitteln können eingesetzt werden.
- Die Escharase enthaltende proteolytische Mischung dieser Erfindung kann aus dem oben beschriebenen Bromelainausgangsmaterial durch eine Extraktion mit einem wäßrigen Medium, das ein nicht-flüchtiges Antioxidationsmittel enthält, erhalten werden. Sie wird aus dem Extrakt isoliert und kann weiter gereinigt werden. Bei dem derzeit bevorzugten Verfahren wird das Bromelainausgangsmaterial mit einer wäßrigen Lösung der Ascorbinsäure bei einem pH von ca. 3 bis 4 extrahiert, und das gewünschte Produkt wird aus dem Extrakt mit einem Fällungsmittel wie z. B. Ammoniumsulfat ausgefällt. Die ausgefällte proteolytische Mischung kann als solche verwendet werden, es ist aber bevorzugt, die Mischung weiter zu reinigen und ihren Escharasegehalt zu konzentrieren.
- Obwohl Ascorbinsäure, da sie leicht verfügbar ist, das bevorzugte Antioxidationsmittel ist, können physiologisch verträgliche und extrem effiziente andere Antioxidationsmittel eingesetzt werden. Diese schließen z. B. Dihydrochinon, butyliertes Hydroxtoluol und Dithiothreitol ein.
- In ähnlicher Weise können andere Proteinfällungsmittel eingesetzt werden, obwohl wie bei allen solchen Fällungen Ammoniumsulfat bei weitem das am meisten bevorzugte ist. Diese schließen sowohl organische als auch anorganische Fällungsmittel einschließlich niederer Alkohole wie z. B. Methanol und Ethanol; Aceton; Polyethylenglycol; Sulfate wie z. B. Magnesium-, Kalium- und Natriumsulfat; und Halogenide wie z. B. Natrium- und Kaliumchlorid ein.
- Das ausgewählte Antioxidationsmittel und das Fällungsmittel sollten in der Reaktion inert sein und sollten das Protein nicht denaturieren.
- Ein typisches Verfahren für die Isolierung einer proteolytischen Mischung dieser Erfindung ist wie folgt:
- 1. 1 Kilo an Bromelain wird bei 4-10ºC für 60 Sekunden in 10 Litern 1% Ascorbinsäure (10 mg/ml) in destilliertem Wasser gemischt (Waring-Mischer).
- 2. Diese Suspension wird mit 4 N HCl auf pH 3,5-3,9 eingestellt.
- 3. Die Suspension wird für 18 Stunden bei 4-10ºC gerührt.
- 4. Nach dem Abtrennen der unlöslichen (20-25%) Materialien aus der löslichen Fraktion durch Filtration oder Zentrifugation in der Kälte (4-10ºC) wird die lösliche Fraktion mit Ammoniumsulfat auf eine 40%ige Sättigung gebracht (2842 g/10 l) und über Nacht bei 4-10ºC stehen gelassen.
- 5. Nach dem Sammeln des Niederschlags über eine Zentrifugation oder Filtration in der Kälte wird der Niederschlag in der Kälte in 10 Litern 0,3 M Essigsäure gelöst (pH 3,0), welche 0,1% Ascorbinsäure (1 mg/ml) enthält.
- 6. Dieser Extrakt wird dann mit 40 Litern destilliertem Wasser über einem 10.000 Dalton-Hohlfaser-Ultrafilter gewaschen, wobei ein Amicon DC-30 A-System mit einer Filtermembrankartusche vom Typ H10P1020, DF-40, verwendet wird. Eine Flußgeschwindigkeit von 300 bis 400 ml/min bei 19-23 psi bei 10ºC wird für ca. zwei Stunden beibehalten, und das Endvolumen wird auf ca. 4,5 bis 5,0 Liter verringert.
- 7. Die resultierende Lösung wird dann lyophilisiert und gewogen, wobei sich gewöhnlich eine Ausbeute von ca. 250 g ergibt.
- Das Verfahren dieser Erfindung liefert im Vergleich zu der proteolytischen Mischung, die durch das Verfahren der oben angegebenen Patente und der Veröffentlichung erhalten wurde, eine stark verbesserte Escharase enthaltende proteolytische Mischung. Die proteolytische Mischung wird in stark verbesserten Ausbeuten erhalten, z. B. ca. 25% Ausbeute verglichen mit ca. 10% Ausbeute durch die früheren Verfahren.
- Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, daß die proteolytische Mischung der Erfindung von ca. 1% bis 1,5% Escharase pro Gewicht bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung enthält. Die vorher beschriebenen Verfahren lie ferten proteolytische Mischungen, welche, im Durchschnitt, viel kleinere Mengen an Escharase enthielten. Darüber hinaus ist die Mischung über einen längeren Zeitraum stabil und scheint durchweg bessere transplantationsbereite Betten für die Aufnahme neuer Haut zu erzeugen, als durch die vorher beschriebenen Verfahren erhalten werden konnte.
- Die Mischung kann dadurch gekennzeichnet werden, daß sie von ca. 1% bis 1,5% Escharase zusammen mit proteolytischen Enzymen aus Bromelain enthält, die mit verdünnter wäßriger Ascorbinsäure extrahierbar sind.
- Wenn gewünscht, kann Escharase aus der proteolytischen Mischung der Erfindung durch das folgende Verfahren isoliert werden:
- Man löse 4 bis 7 g der proteolytischen Mischung in 50 ml 0,3 M Essigsäure, die 1 mg/ml Ascorbinsäure enthält. Nach einer Zentrifugation bei 1200-1500 g wird die klare Flüssigkeit einer Ausschlußsäulenchromatographie (G-75) unterzogen, und die biologisch aktive (durch Bioassay) Fraktion nach dem Ausschlußvolumen der Säule und vor dem Hauptpeak, welcher reich an einer allgemeinen Proteaseaktivität ist (getestet mit dem denaturierten Hämoglobin), wird gepoolt, dialysiert und lyophilisiert. Diese Fraktion eluiert ungefähr dort, wo Ovalbumin eluiert, d. h. bei 45.000 Dalton, und enthält ca. 15-20% der aufgetragenen proteolytischen Mischung.
- Das gepoolte, biologisch aktive Produkt aus wiederholten Läufen über die G75-Säule wird dann einer isoelektrischen Fokussierung unterzogen, wobei ein 0-40%iger Sucrosegradient, welcher 1% LKB-Ampholin enthält, in der LKB-8102- Vorrichtung von pH 5 bis 8 bei 4ºC verwendet wird, wie in den oben angegebenen Patenten beschrieben wird. Während der Elution wird die Extinktion der verschiedenen Fraktionen bei 280 nm bestimmt, und die verschiedenen Fraktionen wurden gepoolt, dialysiert und getestet. Nur die Fraktion bei pH 6,4 zeigte die Trennungsaktivität (dissecting activity) (d. h. ein Trennen von denaturiertem von nativem Gewebe). Wenn die G-75-Fraktion in 4 M Harnstoff als einem Lösungsmittel gelöst wird, verschiebt sich ihr isoelektrischer Punkt von 6,4 auf 6,8.
- Eine wiederholte isoelektrische Fokussierung dieser Fraktion ergab ein Material, welches UV-Licht bei einem Peak von 280 nm absorbierte, das totes von lebendem verbranntem Gewebe trennen konnte, um ein transplantationsbereites Bett zu erzeugen. Es wurde gefunden, daß diese Fraktion bei zwei verschiedenen pH-Niveaus in einer Acrylamidgel-Scheibenelektrophorese elektrophoretisch homogen ist.
- Es ist natürlich dieselbe Escharase, die durch die vorher beschriebenen Verfahren isoliert wurde. Sie kann die Fläche zwischen lebendem und totem Gewebe präparieren, hat aber keine allgemeine proteolytische Aktivität gegenüber denaturiertem Hämoglobin, Gelatine oder Casein. Sie hat ebenfalls keine hydrolytische Aktivität gegenüber Hyaluronsäure oder Dermatansulfat, welche saure Mucopolysaccharide der Haut sind.
- Escharase wird von der G-75 bei einem Molekulargewicht von ca. 45.000 Dalton ausgeschlossen. Nach der isoelektrischen Fokussierung scheint sie ein Molekulargewicht bei der SDS-PAGE-Elektrophorese von ca. 15.000 und bei der Sephadex G-50-Ausschlußchromatographie von ca. 14.000 Dalton aufzuweisen. Es scheint daher, daß Escharase ein Komplex aus drei identischen Untereinheiten von ca. 15.000 Dalton ist, welche während der isoelektrischen Fokussierung dissoziieren.
- Die Aminosäureanalyse der reinen Escharase ist wie folgt:
- Alanin 16
- Arginin 7
- Asparaginsäure 12
- Cystin/2 6,6
- Glutaminsäure 10,6
- Glycin 16,8
- Histidin keines
- Isoleucin 6,4
- Leucin 6,4
- Lysin 5,6
- Phenylalanin 3,4
- Prolin Spuren
- Serin 14
- Threonin 7
- Tyrosin Spuren
- Valin 7,6
- Methionin keines
- Insgesamt 115 Nanomole Molekulargewicht von 13.800
- Escharase ist im wesentlichen frei von Methionin, Histidin, Prolin und Tyrosin. Dass Fehlen von Prolin und Tyrosin zeigt, daß Escharase ein außergewöhnliches Protein ist.
- Die ausgefällte Escharase enthaltende proteolytische Mischung wird z. B. durch Zentrifugation gewonnen und kann gereinigt und durch Lyophilisation konzentriert werden, wenn dieses gewünscht wird. Für diesen Reinigungsvorgang wird die ausgefällte proteolytische Mischung in Essigsäure gelöst und bis zu beispielsweise fünfmal lyophilisiert.
- Die proteolytische Mischung dieser Erfindung und die Escharase, die daraus stammt, werden für die Entfernung von Verbrennungsschorf benutzt, wobei dieselben Verfahren benutzt werden, die in den oben angegebenen Patenten und in der Veröffentlichung beschrieben sind.
- Variationen der beschriebenen Verfahren, Reagenzien und Instrumente, die spezifisch beschrieben wurden, werden den Fachleuten ersichtlich sein. Andere Filtertypen können eingesetzt werden. Beliebige aus einer Vielzahl an Proteinen können als Standards bei der Elektrophorese eingesetzt werden. Sucrose ist nicht der einzige Gradient, welcher bei den Verfahren der isoelektrischen Fokussierung eingesetzt werden kann. Die genauen Details dieser Verfahren können von den entsprechenden Verfahren, die oben beschrieben wurden, abweichen.
- Eine Gesamtmenge von 250 Gramm Bromelain wurde für 60 Sekunden bei 4ºC mit 2,5 Litern 1%iger wäßriger Ascorbinsäure homogenisiert, und einige wenige Tropfen Octanol wurden zugegeben, um ein Schäumen zu verhindern. Der pH wurde mit 4 N HCl auf 3,5 eingestellt. Die Mischung wurde dann für ca. 15 Stunden bei 4ºC leicht gerührt und bei derselben Temperatur für 30 Minuten bei 10.000 Upm zentrifugiert. Der Überstand (2,525 Liter) wurde gesammelt, und 742,4 Gramm Ammoniumsulfat wurden über einen Zeitraum von ca. 4 Minuten unter schnellem Rühren zugegeben, das für weitere 10 Minuten fortgesetzt wurde. Die Mischung wurde bei leichtem Rühren bei ca. 4ºC für ca. 15 Stunden stehen gelassen. Sie wurde dann durch Zentrifugation für 30 Minuten bei 10.000 Upm und 4ºC getrennt.
- Der Niederschlag wurde in 0,3 molarer Essigsäure, welche 0,1 Gew.-% Ascorbinsäure enthielt, gelöst. Der pH wurde mit 4 N HCl auf 3 eingestellt, und das Volumen wurde durch die Zugabe von mehr wäßriger Essigsäure/Ascorbinsäure- Mischung auf 2500 ml gebracht und bei 4ºC für 2 Stunden gerührt.
- Nach einem Stehen für ca. 15 Stunden bei 4ºC wurde die Lösung auf dem CH2RS-Amicon-Konzentrator mit einer Spiralmembran mit einem Cutoff-Molekulargewicht von 10.000 konzentriert und dialysiert. 10 bis 1.2 Liter kalte 0,3 molare Essigsäure wurden bei einem pH von 3 über einen Zeitraum von einigen wenigen Stunden zugegeben. Das Endkonzentrat wurde auf das halbe Volumen (1,25 Liter) gebracht, und es wurde mit EMI-Tauchstäben (Nessler's Reaktion) gefunden, daß der Gehalt an Ammoniumionen vernachlässigbar war. Das Konzentrat wurde bei 4ºC für 30 Minuten bei 10.000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde für ca. 15 Stunden bei -70ºC gelagert und bei ca. 25ºC und bei 7 mm Hg lyophilisiert. Die Ausbeute des Produkts, bezogen auf das Gewicht des ursprünglichen Ausgangsmaterials, betrug 29%.
- Standardverbrennungswunden wurden auf einem betäubten Ferkel erzeugt, indem für 45 Sekunden eine Hitze von 360º auf Hautflächen von 4,4 cm angewendet wurde. Das mit Blasen bedeckte Keratin wurde entfernt, indem es mit trockenem Mull abgewischt wurde. Die Verbrennungen wurden durch Tränkungen mit Normaler Salzlösung feucht gehalten, bis sie behandelt wurden.
- Die Verbrennungsfläche wurde von der unverbrannten Fläche durch einen Rahmen abgesondert, welcher an seinem Platz fixiert wurde. Die Verbrennung wurde mit Normaler Salzlösung getränkt, und 200 mg eines Pulvers, das im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, wurde gleichmäßig über die Oberfläche der Verbrennung gespritzt. Das Pulver wurde durch die tropfenweise Zugabe von Normaler Salzlösung gelöst und geschützt, indem mit einem sterilen Gel beschichtet wurde. Das Gel wurde dann mit einem weiteren Kunststoffnetz abgedeckt, und es wurde mehr Gel zugegeben. Die Auftragung wurde dann mit Saran-Folie abgedichtet, um anaerobe Bedingungen aufrecht zu erhalten.
- Die Fläche wurde mit einer Heizlampe aufgewärmt, um eine Temperatur von ca. 102ºF beizubehalten.
- Nach vier Stunden wurde die Abdeckung entfernt und der Verbrennungsschorf mit einem mit Normaler Salzlösung getränkten Mull abgewischt. Es resultierte eine ausgezeichneter Verdauung und Abtrennung des Verbrennungsschorfes. Ein Abtupfen entfernte das meiste des proteolysierten Verbrennungsschorfes, wobei nur einige wenige Flecke von restlichem Verbrennungsschorf zurückblieben, wobei eine starke basale Zirkulation sichtbar war. Nach 20mal Abwischen mit trockenem Mull war fast alles von dem Verbrennungsschorf entfernt, wobei erhöhte Mengen an punktierten blutenden Punkten sichtbar waren. Der gesamte Verbrennungsschorf wurde durch weitere 20mal Abwischen mit mit Normaler Salzlösung getränktem Mull entfernt, wobei, außer einigen wenigen Streifen von zurückbleibendem Verbrennungsschorf, ein sauberes Bett zurückblieb. Nach einem Waschen für zehn Minuten mit warmer Normaler Salzlösung schien das Wundbett sauber und sichtbar transplantationsbereit zu sein. Einige wenige Streifen von basalem Verbrennungsschorf waren an diesem Punkt noch sichtbar, jedoch nicht genug, um eine Transplantataufnahme zu verhindern.
- Die Transplantationsbereitschaft des Bettes wurde durch eine standardmäßige histologische Untersuchung festgestellt, welche weniger als 0,1 mm restlichen zentralen Verbrennungsschorf und eine ausgezeichnete Wundreinigung bestätigte.
- Das Experiment wurde mit der proteolytischen Mischung wiederholt, die durch das Verfahren der oben angegebenen U.S.-Patente erhalten wurde. Es wurde beobachtet, daß, obwohl das Bett immer noch transplantationsbereit war, die Menge an zentralem Verbrennungsschorf, welche zurückblieb, von 0,1 bis 0,2 mm betrug.
Claims (7)
1. Ein Verfahren zur Herstellung einer proteolytischen
Mischung, welche Escharase enthält, wobei das Verfahren
die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Extrahieren einer Bromelain-Präparation mit einer
verdünnten wäßrigen Lösung eines Antioxidationsmittels bei
einem pH von 3 bis 4; und
(b) Fällen der gewünschten proteolytischen Mischung aus dem
sauren Extrakt, welcher in Schritt (a) gebildet wurde,
durch Hinzugeben eines Proteinfällungsmittels.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das
Antioxidationsmittel Ascorbinsäure ist.
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das
Proteinfällungsmittel Ammoniumsulfat ist.
4. Eine proteolytische Mischung, welche Escharase enthält,
die erhältlich ist durch das:
(a) Extrahieren einer Bromelain-Präparation mit einer
verdünnten wäßrigen Lösung eines Antioxidationsmittels bei
einem pH von 3 bis 4; und
(b) Fällen der gewünschten proteolytischen Mischung aus dem
sauren Extrakt, welcher in Schritt (a) gebildet wurde,
durch Hinzugeben eines Proteinfällungsmittels.
5. Proteolytische Mischung gemäß Anspruch 4, wobei das
Antioxidationsmittel aus Schritt (a) Ascorbinsäure ist.
6. Proteolytische Mischung gemäß einem der Ansprüche 4
oder 5, wobei das Proteinfällungsmittel aus Schritt (b)
Ammoniumsulfat ist.
7. Proteolytische Mischung gemäß einem der Ansprüche 4 bis
6, welche von 1% bis 1,5% Escharase enthält.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US80196891A | 1991-12-03 | 1991-12-03 | |
PCT/US1992/010395 WO1993010811A1 (en) | 1991-12-03 | 1992-12-02 | Proteolytic mixture containing escharase and method of isolating same |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE69230887D1 DE69230887D1 (de) | 2000-05-11 |
DE69230887T2 true DE69230887T2 (de) | 2000-10-12 |
Family
ID=25182476
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE69230887T Expired - Lifetime DE69230887T2 (de) | 1991-12-03 | 1992-12-02 | Escharase enthaltene proteolytische mischung und methode seiner isolierung |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0618811B1 (de) |
JP (1) | JP3255643B2 (de) |
AU (1) | AU676464B2 (de) |
CA (1) | CA2125158C (de) |
DE (1) | DE69230887T2 (de) |
ES (1) | ES2146607T3 (de) |
FI (1) | FI109766B (de) |
HU (1) | HU214641B (de) |
WO (1) | WO1993010811A1 (de) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL165334A0 (en) * | 2004-11-22 | 2006-01-15 | Mediwound Ltd | Debriding composition from bromelain and methods of producing same |
KR102376345B1 (ko) | 2016-01-31 | 2022-03-18 | 메디운드 리미티드 | 상처 치료용 괴사조직제거 조성물 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3817834A (en) * | 1970-09-02 | 1974-06-18 | C Wilson | Recovery of salted-out proteins |
FR2423476A1 (fr) * | 1978-04-06 | 1979-11-16 | Oreal | Nouvelles dihydroxy-2,4 diphenylamines et compositions tinctoriales pour cheveux les contenant |
US4329430A (en) * | 1979-06-04 | 1982-05-11 | Klein Gerold K V | Enzyme mixture |
LU83177A1 (fr) * | 1981-02-27 | 1982-09-10 | Oreal | Utilisation d'hydroxyanthraquinones pour la coloration des fibres keratiniques humaines,procede et composition les mettant en oeuvre |
-
1992
- 1992-12-02 WO PCT/US1992/010395 patent/WO1993010811A1/en active IP Right Grant
- 1992-12-02 ES ES93900778T patent/ES2146607T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-02 HU HU9401684A patent/HU214641B/hu unknown
- 1992-12-02 EP EP93900778A patent/EP0618811B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-02 CA CA002125158A patent/CA2125158C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-02 AU AU32342/93A patent/AU676464B2/en not_active Expired
- 1992-12-02 JP JP51032893A patent/JP3255643B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-12-02 DE DE69230887T patent/DE69230887T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-06-02 FI FI942603A patent/FI109766B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0618811B1 (de) | 2000-04-05 |
FI942603A (fi) | 1994-08-02 |
HU9401684D0 (en) | 1994-09-28 |
CA2125158C (en) | 2007-09-18 |
ES2146607T3 (es) | 2000-08-16 |
EP0618811A1 (de) | 1994-10-12 |
AU3234293A (en) | 1993-06-28 |
AU676464B2 (en) | 1997-03-13 |
DE69230887D1 (de) | 2000-05-11 |
FI942603A0 (fi) | 1994-06-02 |
WO1993010811A1 (en) | 1993-06-10 |
JP3255643B2 (ja) | 2002-02-12 |
FI109766B (fi) | 2002-10-15 |
HU214641B (hu) | 1998-04-28 |
HUT71383A (en) | 1995-11-28 |
CA2125158A1 (en) | 1993-06-10 |
EP0618811A4 (en) | 1996-05-29 |
JPH08508635A (ja) | 1996-09-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5436135A (en) | New preparation of placenta collagen, their extraction method and their applications | |
DE69221872T2 (de) | Verwendung der nichtpigmentierten fischhaut, insbesondere von plattfischen als industrielle herkunft für kollagen. verfahren zur extrahierung, kollagen und biomaterial so erhalten. | |
DE3485945T2 (de) | Gereinigter transformierender wachstum-beta-faktor aus humanen plaketten und plazenten stammend. | |
DE3689191T2 (de) | Gereinigtes protein mit angiogenischer wirkung und dessen herstellung. | |
DE3886175T2 (de) | Trigramin, ein Polypeptid, das die Aggregation der Blutplättchen hemmt. | |
DE3402647A1 (de) | Verfahren zur gewinnung von koloniestimulierendem faktor und kallikrein aus menschlichem urin | |
EP0457370B1 (de) | Verfahren zur Pasteurisierung des Gewebeproteins PP4 | |
EP0101063A2 (de) | Neues Polypeptid mit Wirkung auf das Immunsystem, Verfahren zu seiner Isolierung und Reinigung, seine Verwendung und dieses enthaltende Mittel | |
DE69520693T2 (de) | Hydroxyprolin reiche proteine und sie enthaltende pharmazeutische und kosmetische zubereitungen | |
DE69424690T2 (de) | Methode zur herstellung von kollagen aus cnidarians und entsprechende kosmetische zusammensetzungen | |
DE69230887T2 (de) | Escharase enthaltene proteolytische mischung und methode seiner isolierung | |
DE3937076A1 (de) | Kollagene, verfahren zu ihrer herstellung und kosmetische mittel | |
DE3306944C2 (de) | ||
US5830739A (en) | Proteolytic mixture containing escharase and method of isolating same | |
DE2558537C2 (de) | Verfahren zum Isolieren von Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit aus Blut oder Blutbestandteilen von Kälbern oder Schweinen | |
AT392003B (de) | Verfahren zur herstellung eines insbesondere zur wundheilung oder zur behandlung in der geriatrie verwendbaren wirkstoffes aus saeugetierblut durch papainhydrolyse und ein einen solchen wirkstoff enthaltendes praeparat | |
DE2720041A1 (de) | Herzstaerkendes mittel | |
JP3433989B2 (ja) | 化粧品原料及びその製造方法 | |
DE69012958T2 (de) | Fibrinolytisches Protein und Herstellungsweise dafür. | |
DE2024251C3 (de) | Verfahren zur Isolierung eines fibrinolytischen Enzyms und dieses Enzym | |
DE1767099B1 (de) | Verfahren zur Gewinnung eines Glykoproteins mit einer Hemmwirkung gegenueber Magensaeureabsonderung und einer Antiaktivitaet gegenueber Ulcus-Bildung | |
DE2063069B2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit fibrinstabilisierender Wirkung | |
DE1802386A1 (de) | Verfahren zur Gewinnung von cytobiotischen Globulinen aus tierischen Organen | |
DE1617566C (de) | Verfahren zur Herstellung eines physio logisch aktiven Polypeptide | |
DE1767099C (de) | Verfahren zur Gewinnung eines Glykoproteins mit einer Hemmwirkung gegenüber Magensäureabsonderung und einer Antiaktivität gegenüber Ulcus-Bildung |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: KLEIN, MARK C., BRUNSWICK, ME., US |