DE1617566C - Verfahren zur Herstellung eines physio logisch aktiven Polypeptide - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines physio logisch aktiven PolypeptideInfo
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Description
Die ΙγΓηηΙιιπ^ helrilft ein Verfahren zur Herstellung
eines physiologisch aktiven Polypsplids.
Ls sind nur wenige Polypeptide bekannt, die biologisch
wirksam sind, beispielsweise solche der Hirnanhangdrüse. Der [Gründung liegt die Aufgabe zugrunde,
ein Vcrfaluen zur Herstellung eines physiologisch aktiven Polypeplids zu schaffen, welches zur
Cliolesierinspiegelsenkung sowie zur Steigerung der 17-KcUi-Sieroid-Ausscheidung geeignet ist.
lirliiidiinusgcmäß wird diese Aufgabe bei einem
Verfahren tier eingangs genannten Gattung dadurch gelöst, dall reliculo-endothelialreiche Organe von
Säugetieren bei einer Teniperalur von nicht mehr als
45 C einer vollständigen enzymatischem! Proteolysc
unterworfen werden, dann das Rcaktionsgemisch von den unlöslichen Bestandteilen getrennt und daraufhin
das PoKpeptid durch eine Polypeplidabtrennungsmethode
abgetrennt wird.
Als reticulo-endothelialreiche Organe kommen dabei Mil/, Lymphdrüsen oder Knochenmark in Frage.
Die Abtrennung des Polypeplids kann durch eine der üblichen PoKpeplidablrennungsnielhoden, beispielsweise
(lurch S'al/fällung oder durch Phenolextraktion,
erfolgen. Das so gewonnene Konzentrat kann gegeftcnenfalls noch in üblicher Weise gereinigt werden,
beispielsweise durch isoelektrische Ausfällung von Verunreinigungen, priiparative LUeklrophore.se oder
Sau lenehroinatographie.
DaN nach dem erlindungsgcmäßen Verfahren hergeslellle
physiologisch aktive Polypeplid besteht aus 17 Aminosäuren und ist für parenleralc, orale und
örtliche Anwendung geeignet. Das Polypeptid kann außerdem noch eine braune proslhelische Gruppe
enthalten.
Wenn man das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellte Polypeptid hydrolisiert, werden folgende Aminosäuren frei, wobei in Klammern
Mikroiuol Aminosäure pro IO mg angegeben sind: Lysin (5.1 S) Histidin (3,28), Arginin (4,35), Asparaginsäure
(4,15), Threonin (5,15), Serin (3,29), Glutaminsäure
(fi.lO), Prolin (6,54), Glycin (6,60), Alanin
(5,85). Cystein (O,(>2), Valin (5,56), Methionin (0,70),
Isoleucin (2,87), Leucin (6,02), Tyrosin (2,46), Phenylalanin (4,27).
Das Molekulargewicht des Polypeptids beträgt weniger als 5000. Das physiologisch wirksame PoIypcplid
verhüll sich wie ein reines Polypeplid sowohl bei Chromatographie als auch bei Papierelektrophorese.
Der isoelektrische Punkt liegt bei pH 5,5.
Der Kf-Werl des Polypeplids liegt in Partridge-I.osung
/wischen 0,5 und 0,6. Die spezielle Stolfwethselwirkung
des crfuulungsgcmäßcn Polypeptids besteht in einer Senkung des ( liolesleiinspiegels im
Hint sowie in einer Steigerung der 17-Kelo-Steroid-Ausscheidung.
Das crliiulimgsucmäße Polypeplid ist durch seine
vorgenannten pliysikochemischen Daten und pharmakologischen
Eigenschaften definiert.
Das nach dein erlinJungsgcinäßen Verfahren hergeslellle
Polypeptid eignet sich vorzüglich da/u, den Choleslerinspicgel im menschlichen MIuI /u senken,
der insbesondere bei alleren Menschen häufig überhöhl ist und hierdurch /ur Arteriosklero.se führen
kann. Is wurde gefunden, daß durch orale Anwendung von täglich 100 mg des erliiidungsgemäß hergeslelllen
Polypeplids der Choleslerinspicgel bei einer großen Anzahl von Personen im Mittel um etwa IO
bis 15% gesenkt werden konnte. Der große Vorteil
bei der Anwendung des erfindungsgemäO hergestellten Polypeptids zur Chole.slerinspiegclsenkung besteht
dabei darin, daß es sich bei dem Polypeplid um eine wenig toxische, eine große therapeutische Breite hesitzende
Substanz, handelt, während die bekannten, zur Senkung des Choleslerinspiegels verwendeten
Medikamente häulig zu unerwünschten Nebenwirkungen im Organismus führen können.
Weiterhin hat es .sich überraschenderweise gezeigt,
ίο daß die 17-Keto-Sleroid-Ausscheidung durch Verabreichung
des erliiidungsgemäß hergestellten Polypeptids in signifikanter Weise gesteigert werden kann.
Es wurde gefunden, daß durch orale Verabreichung von täglich 100 mg des crlindungsjjemäß hergestellten
Polypeptids die 17-Keto-Steroid-Aiisseheidung erheblich
gesteigert werden kann, während sie durch Testostcronverabreichung
verringert wird. Damit steht ein Mittel zur Verfügung, mit dem die 17-Kcto-Steroid-Ausschcidung
älterer Menscb.cn in physiologisch unbedenklicher Weise über eine lange Zeit gesteigert
werden kann.
Gemäß einer bevorzugten Ausführuiigsforni des
erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die en/ymatische
Protcolyse durch Pepsin, Trypsin oder Papnin.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß die Proleolysc auch bei Verwendung von Trypsin oder
Papain nicht limitiert zu werden braucht. Die Protcolyse geht auch bei Verwendung dieser Substanzen
nicht bis zur Aminosäure, sondern bleibt bei dem erlindungsgemäßen Polypepiid stehen. Das erlindiingsgemäßc
Polypeptid ist oral anwendbar.
Es wurde gefunden, daß die Proleoly.se· auch durch
tierische Proteinasen, beispielsweise Kathepsine, Chymotrypsine oder Lab; pflanzliche Proteinasen,
beispielsweise Bromeliu oder Pomiferin; oder Hakterienprolc'.inasen,
ζ. Π. Clostridiuinarten oder ba/.illus
sublilis, durchgeführt werden kann.
Das Aussalzen des physiologisch aktiven Polypeptids kann durch Alkalimetall·. Erdalkalimetall-,
Ammonium- oiler Ahimim'iimsalie erfolgen. Auch
andere übliche Tieiinungsgänge, beispielsweise durch
wasserlösliche organische Lösungsmittel oder durch Lösen in einer teilweise wasserlöslichen Substanz,
beispielsweise Phenol, können angewandt werden. Die Jureli Aussalzen gewonnenen Konzentrate eignen sich
vornehmlich /ur oralen Anwendung.
Wenn das physiologisch aktive Polypeptid /ur parcnteralcn Anwendung kommen soll, ist ein weiterer
Reinigungsvorgaiig wünschenswert. Eine Reinigiing
kann in einfacher Weise durch isocleklrische Ausfällung, durch Süulcndiroinalographie mil Anionen-
oder Kationeiiauslauscherhar/en. Dexlr.muel-Anionen-
oder !(!'.!ionenaustauschern, Cellulose, SiIikagel,
Aluminiumoxyd oiler andere Absorbentien, oder durch Elektrophorese erfolgen. Die Reihenfolge
der Rcinigungsvorgänge ist beliebig und in das Ermessen des Fachmannes gestellt.
Zum besseren Verständnis der Erfindung sind im folgenden in 'irere Au.sführungshcispielc angegeben.
He is pi el I
5 kg frisch zerkleinerte Rindermilz wurden bei 40" C 24 Stunden mil 5 g Pepsin I : 1000 der Protcolyse
unterworfen, wobei 5 1 destilliertes Wasser zugefügt wurden und der pH-Wert der Lösung mit
Salzsäure auf 1,7 bis I,') eingestellt wurde. Daraufhin wurde das Reaktionsgemisch durch ein Papierfilter
gefiltert, Zu der klargcfillcrlcn Lösung wurden
32 Gewichtsprozent Natriumchlorid gegeben. Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wurde abgetrennt
und getrocknet und war für orale Anwendung geeignet, vorzugsweise in Form von Tabletten oder
Dragees.
5 kg Lymphdrüsen von Rindern wurden bei 40° C 72 Stunden mit IHg Pepsin 1:1000 der Proteolysc
unterworfen, wobei 5 1 destilliertes Wasser zugefügt wurden und der pH-Wert der Losung mit Salzäure
auf 1,7 eingestellt wurde. Daraufhin wurde das Reaktionsgemiseh zentrifugiert. Zu der klaren Lösung
Wurden dann 20 bis 25 Gewichtsprozciit Phenol ge-{cben.
Die Plienolphasc wurde von der Wasserphasc 11 Scheidetrichter getrennt und das Phenol aus der
Plienolphasc durch Äther extrahiert. Das zurückbleibende Konzentrat, das das physiologisch aktive
Polypeptid enthält, war an sich bereits in dieser Form für parenteral Verwendung geeignet. Zur weiteren ao
Reinigung wurde jedoch das gesamte Konzentrat, das lius der Plienolphasc durch Entfernen des Phenols
gewonnen wurde, mit Wasser auf ein Trockengewicht Von lO°/o verdünnt. Durch Zugabe von 7,472g
NaH2PO1 und 0,7X4 g Na2HPO1 · 2 H2O wurde der
pH-Wert die r Mischung eingestellt, worauf der erhaltene. Niederschlag .lurch Filtration oder Zentrifugieren
entfernt svjr'Je. Nach isotonischer Einstellung War das gereinigte Konzentrat zur parenteralen Anwendung
geeignet.
5 kg frisch zerkleinerte Schweinemilz wurden bei 45° C und einem pH-Wert von 8,0 6 Stunden lang
durch 125g Trypsin (Ig = 40000 Fuld-Gross-Ein-
!leiten) abgebaut, wobei 5 1 destilliertes Wasser zugefügt
wurden und die Einstellung des pH-Wertes durch Natronlauge erfolgte. Die weitere Konzentrierung
erfolgte wie im Beispiel I.
5 kg frisch zerkleinerte Rindermilz wurden bei 4.VC 10 Stunden mit 40 g rohem Papain behandelt,
wobei 5 1 destilliertes Wasser zugefügt wurden unJ der pH-Wert der Lösung mit Natronlauge auf einen
Wert von 7,0 eingestellt wurde. Die weitere Konzentrierung und Reinigung der Mischung erfolgte wie im
Beispiel 2.
Beispiel 5 «0
5 kg Knochenmark von Rindern wurden bei 40"1 C
72 Stunden lang mit 10 g Pepsin der Proteulysc unterworfen,
wobei 5 1 destilliertes Wasser zugefügt wurden und der pH-Wert der Lösung mit Salzsäure auf
1,7 eingestellt wurde. Nach tier Konzentrierung durch
Phcnoiextraktion wie im Beispiel Ί wurde das Konzentrat durch Säulenchromaiographie gereiniul.
Die Aktivität des erlindungsgeinüßen Polypeplids
wurde wie folgt geprüft:
I. die Glykose roter Blutkörperchen von 1 Milliliter Blut wurde während einer Stunde vor uivi
nach Verabreichung des Polypeptide anaerob geprüft. Nach der Zugabe des Polypeptids war
die Glykose vermindert. Dieses Ergebnis wurde auch 24 Stunden nach Verabreichung des Polypeptids
gefunden.
II. Die Glykose zweier Gruppen von Mäuse- oder RatienAcites-Tumorzellen wurde S bis 7 Tage
nach Transplantation verglichen, die eine Gruppe nach Injektion einer isotonischen Salzlösung, die
andere Gruppe nach Injektion einer Lösung des erfindungsgcmäßen Pohpeptids. Nach Behandlung
mit dem Polypeplid war die Glykose vermindert.
Der Nachweis der Eryilinvytcngljko.se kann beispielsweise
nach einem Verfahren erfolgen, wie es in dem Artikel von W. Kuhlmey in Has medizinische
Laboratorium«, 19, Heft I (1('66), angegeben ist.
Weitcrc therapeutische Eigenschaften des eilindungsgcmäßen
Polypeptids können sich aus der oben beschriebenen mctabnlischen Aktivität ergeben.
Das crlindungsgemäßc. physiologisch aktive Polypeplid
kann vorteilhaft mit einem oder mehreren pharmazeutischen Trüger l>/w. Trägern verwendet
werden.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung eines physiologisch aktiven Polypeptids, d .1 d u r c h μ e κ e η η zeichnet,
daß rcticulo-etulolhelialreiche Organe
von Säugetieren bei einer Temperatur von nicht mehr als 45° C einer vollständigen cnzymatischen
Protcolyse unterworfen werden, dann das Rcaktionsgemisch von den unlöslichen Bestandteilen
getrennt und daraufhin das Polypeplid durch eine Polypeptidabtrcnnungsmclhodc abgetrennt
wird.
2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die Proicolyse mit Pepsin,
Trypsin oder Papain erfolgt.
Family
ID=
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3827490A1 (de) * | 1988-08-12 | 1990-02-15 | Hor Fer Vit Pharma Gmbh | Herrichtung und verwendung eines physiologisch aktiven polypeptids zur aids-therapie |
| DE19700535C1 (de) * | 1997-01-10 | 1998-07-02 | Horfervit Pharma Gmbh | Verwendung eines physiologisch aktiven Polypeptids |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3827490A1 (de) * | 1988-08-12 | 1990-02-15 | Hor Fer Vit Pharma Gmbh | Herrichtung und verwendung eines physiologisch aktiven polypeptids zur aids-therapie |
| DE19700535C1 (de) * | 1997-01-10 | 1998-07-02 | Horfervit Pharma Gmbh | Verwendung eines physiologisch aktiven Polypeptids |
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