DE2519938A1 - Extrakte von corynebakterien, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in arzneimittelzubereitungen - Google Patents

Extrakte von corynebakterien, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in arzneimittelzubereitungen

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DE2519938A1 DE19752519938 DE2519938A DE2519938A1 DE 2519938 A1 DE2519938 A1 DE 2519938A1 DE 19752519938 DE19752519938 DE 19752519938 DE 2519938 A DE2519938 A DE 2519938A DE 2519938 A1 DE2519938 A1 DE 2519938A1
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Description

VON KREISLER SCHUNWAlD MEYfcR EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING
PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler "f" 1973
Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln· Dipl.-Ing. G. Seltiny, Köln
AvK/Ax
5 Köln ι 3- Mai 1975
DEICHMANNHAUS Ai/ HAUPTBAIiNHOF
Agence Nationale de Valorisation de la Recherche (A N V A R) , 13, Rue Madeleine Michelis,_ Neuilly sur Seine (Hauts-de-Seine) (Frankreich).
Extrakte von Corynebakterien, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in Arzneimittelzubereitungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen niedrigmolekularen Extrakten von Zellen von Corynebakterien, die hierbei erhaltenen .wasserlöslichen Extrakte und sie enthaltende Arzneimittelzuberei- -tungen, die als immunologische Adjuvantia wertvoll sind.
Ein Verfahren zur Isolierung von Substanzen mit immunologischen Eigenschaften aus Zellen von Corynebacterium parvum wurde bereits beschrieben. Als Beispiel ist die Veröffentlichung von Tarn NGUYEN-DANG und Mitarbeitern in CR. Acad. Sc. Paris, 6, 2Γ(β, 13.6.1973* zu nennen. Bei diesem Verfahren werden die immunologischen Substanzen durch Behandlung der Zellwände von Corynebacterium parvum mit Trypsin in Gegenwart von Lösungsmitteln oder mit Formol erhalten. Die in dieser V/eise gewonnenen Substanzen werden in Form einer wäßrigen Suspension verabreicht. Dies bedeutet, daß diese Substanzen nicht wasserlöslich sind.
509848/0955
Telefon: (0221) 234541-4 · Telex: 8682307 dopa d · Telegramm: Dornpatent Kalo
Gemäß der Erfindung wurde nun gefunden, daß aus Zeilen von Corynebakterien durch Behandlungen, die nicht die Verwendung von Enzymen erfordern, wasserlösliche Produkte, die Aktivität als Adjuvantia aufweisen und nicht arthrogen sind, erhalten werden können.
Die wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung enthalten Diaminopimelinsäure und haben ein Molekulargewicht zwischen 1000 + 200 und 8000 + 200.
Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung von wasserlöslichen, Diaminopimelinsäure (DAP) enthaltenden Extrakten von niedrigem Molekulargewicht aus Zellen von Corynebakterien ist dadurch gekennzeichnet, daß man die von Lipiden befreiten Bakterienreste der DAP enthaltenden Zellen von Corynebakterien einer milden Extraktion unterwirft und die wasserlöslichen Extrakte auf physikalisch-chemischem Wege isoliert.
Die wasserlöslichen Extrakte werden anschließend vorzugsweise nach bekannten Reinigungsverfahren gereinigt. Die wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung werden \ vorteilhaft in Pulverform gehandhabt und aufbewahrt. : Der hier gebrauchte Ausdruck "milde Extraktion"·bedeutet eine Homogenisierung in einem wäßrigen Medium unter Anwendung der Autolyse der Bakterienzellen und nicht die Durchführung chemischer Modifikationen oder Extraktionen.
Die milde Extraktion der Zellen erfolgt durch Mahlen und Homogenisieren in einem wäßrigen__Mediurn gegebenenfalls in Gegenwart eines nichtionogenen oberflächenaktiven Mittels, z.B. des Produkts der Handelsbezeichnung "NP-40".
Gemäß der Erfindung wird die Extraktion vorteilhaft bei ; einer Temperatur von etwa 37°C, einer physiologischen ; Temperatur, durchgeführt. Die Extraktionsdauer im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung ist nicht entscheidend wichtig, sollte jedoch ausreichend sein, um die wasser-
5098/, 8/095 b ORiGiNALiNSPEOTED
2 5 1 ° P ? 8
löslichen Substanzen maximal zu extrahieren und auf
diese Weise wasserlösliche Extrakte mit guten Ausbeuten
zu erhalten. Die Extraktion kann in einer einzigen Stufe oder in mehreren aufeinanderfolgenden Stufen durchgeführt werden.
Wie bereits erwähnt, werden für das Verfahren gernäß der Erfindung Corynebakterien verwendet, die Diaminopimelinsäure (DAP) enthalten. Gewisse Corynebakterien., für die
diese allgemeine Definition zutrifft, enthalten Meso-DAP und Arabinogalactan. Sie sind sog. fakultative Anaerob!er. Als Beispiel dieser Corynebakterien ist C. diphteriae
zu nennen.
Die anderen Corynebakterien, auf die die Definition
zutrifft und die für die Zwecke der Erfindung geeignet
sind, enthalten LL DAP und kein Arabinogalactan. Sie
sind sog. obligate Anaerobier. Zu dieser Kategorie von
Corynebakterien gehören beispielsweise C. aenes, i C. parvum, C. anaerobium und C. granulosum. '
Als einschlägige Fachliteratur ist die Veröffentlichung
von Karl-Heinz Schleifer und Otto Kandier in ι
Bacteriological Reviews ;56, Nr. 4, Dezember 1972, J
S. 407-477, zu nennen. Diese Veröffentlichung enthält
insbesondere eine Übersicht über Corynebakterien und ihre Merkmale und kann im Rahmen der Erfindungsbeschreibung
berücksichtigt werden. '■
Für die Zwecke der Erfindung werden als Zellen von j Corynebakterien die Zellen von Corynebacterium parvum
besonders bevorzugt. |
Den in das Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzten
Zellen von Corynebakterien werden vorher die Lipide
entzogen. Dies geschieht beispielsweise nach dem Ver- '·,
i fahren, das von A. Aebi und Mitarbeitern in Bull. Soc. ;
Chim. Biol. 35 (1955) 661 beschrieben wird. i
.. ORIGINAL INSPECTED j
5 O 9 O U B / Π ίϊ!) b
Die nichtionogene oberflächenaktive Verbindung, die beim Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden kann, ermöglicht die Dissoziation der Lipidsubstanzen, die an Zellen gebunden sind, die durch den Lipidentzug nicht extrahiert worden sind. Die Verwendung der oberflächenaktiven Verbindung ermöglicht somit eine Verbesserung der Ausbeute der Extraktion.
Nach der milden Extraktion werden die wasserlöslichen Extrakte durch Zentrifugieren, Aussalzen, Dialyse und Gefriertrocknung isoliert.
Das Aussalzen erfolgt an der überstehenden Schicht, die nach dem Zentrifugieren des bei der milden Extraktion erhaltenen Gemisches erhalten wird, mit Hilfe von Lösungen eines Mineralsalzes, z.B. Ammoniumsulfat, mit verschiedenen Konzentrationen'. Zur Durchführung der Aussalzungen wird vorzugsweise die Temperatur des Reaktionsgemisches auf eine genügende Höhe gebracht, um schnelle Auflösung des verwendeten Mineralsalzen und die gewünschte Sättigung zu erreichen. Anschließend wird das Gemisch 6 bis 24 Stunden bei einer verhältnismäßig niedrigen Temperatur, vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 0° und 6°C gehalten. Die unlöslichen Teile werden bei der bevorzugten Arbeitsweise durch Zentrifugieren : bei einer ebenfalls zwischen etwa 0° und 6°C liegenden Temperatur entfernt. ' j
Die wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung werden anschließend beispielsweise durch Gefriertrocknen aus den aus den vorstehend beschriebenen Stufen erhaltenen Lösungen, die bei der Dialyse nicht durch eine Membran hindurchtreten, die die Substanzen mit einem Molekulargewicht oberhalb von 1000 zurückhält, in den trockenen Zustand überführt. Beispielsweise wird eine Membran des Typs "Diaflo UM 2" (Amicon) verwendet.
509848/0955
Gemäß einer besonders bevorzugten AusfUhrungsform der Erfindung können die wasserlöslichen Extrakte außerdem nach geeigneten physikalisch-chemischen Verfahren, insbesondere durch Chromatographie an Adsorptionsmitteln, z.B. DEAE-Cellulose, dem unter der Bezeichnung "DEAE Biogel A" bekannten Produkt, oder durch Filtration * beispielsweise durch Polyacrylamidgel,insbesondere unter Verwendung der unter den Handelsbezeichnungen "Biogel PlO","Biogel P6" oder "Biogel P4" bekannten Produkte, gereinigt und in ihre Bestandteile getrennt werden.
Die in dieser Weise erhaltenen wasserlöslichen Extrakte, die einen weiteren Gegenstand der Erfindung darstellen, bestehen im wesentlichen aus einem Gemisch von wasserlöslichen Zellwandtrümmern in unterschiedlichen Mengenanteilen gegebenenfalls zusammen mit nicht-aminierten reduzierenden Zuckern. Die Menge der in den Extrakten gemäß der Erfindung enthaltenen wasserlöslichen Fragmente der Zellwand ist verschieden in Abhängigkeit von den jeweiligen Bedingungen der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung, insbesondere der Extraktionszeit und der Zahl der Aussalzungen bei der Reinigung.
Die wasserlöslichen Fragmente der Zellwand bestehen im wesentlichen aus einem Disaccharid-Tetrapeptid, einem Tetrasaccharid-Heptapeptid und aus dem Dimeren, Trimeren
und Tetrameren des letzteren. ;
i Das Disaccharid-Tetrapeptid hat die folgende molekulare Zusammensetzung: N-Acetylglucosamin (1), N-Acetylmuraminsäure (1), Alanin (2), Glutaminsäure (1), Diaminopimelinsäure (1), und sein Gerüst kann durch das folgende Schema dargestellt werden:
NAG-NAM !
Ala-Glu-DAP-Ala
4 8/0955 ORIGINAL INSPECTED
Hierin bedeuten:
NAG = N-Acetylglucosamin
NAM = N-Acetylmuraminsäure (acide N-acetylmuramique) AIa = Alanin
GIu = Glutaminsäure
DAP = Diaminopimelinsäure
Das Tetrasaccharid-Heptapeptid hat die folgende molekulare Zusammensetzung: N-Acetylglucosamin (2), N-Acetylmuraminsäure (2), Alanin (3), Glutaminsäure (2), Diaminopimelinsäure (2), und sein Gerüst kann durch das folgende Schema dargestellt werden:
NAG - NAM - NAG - NAM
Ala AIa
I I
GIu GIu
In gewissen Fragmenten kann die freie Säure- oder Aminfunktion von DAP durch Reste von Asparaginsäure und Glycin, d.h. durch Reste von natürlich in der Zellwand vorliegenden Brücken zwischen den Ketten substituiert sein.
Die nicht-aminierten reduzierenden Zucker bestehen im wesentlichen aus Glucose und gegebenenfalls Mannose und Galactose.
Die Konstitution der in der beschriebenen Weise erhaltenen wasserlöslichen Extrakte kann nach üblichen Methoden zur Bestimmung des Gehalts an Aminosäuren, Aminozuckern und nicht-aminierten reduzierenden Zuckern : nachgewiesen werden. j
Mit Hilfe der Reinigungsstufe können erfindungsgemäß wasserlösliche Extrakte erhalten werden, die hauptsächlich das Tetrasaccharid-Heptapeptid gegebenenfalls in Verbindung mit nicht-aminierten reduzierenden Zuckern
509848/0 9 55
enthalten. Beispielsweise ergibt der nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltene rohe wasserlösliche Extrakt nach Chromatographie an DEAE-Cellulose mit Hilfe geeigneter Elutionsmittel eine Gruppe von Substanzen, die das Disaccharid-Tetrapciptid gegebenenfalls in Verbindung mit nicht-aminierten reduzierenden Zuckern und das Tetrasaccharid-Heptapeptid sowie sein Dimeres, Trimeres und Tetrameres gegebenenfalls in Verbindung mit nicht-arninierten reduzierenden Zuckern umfasst. Im Verlauf der Chromatographie v/erden die wasserlöslichen Substanzen in der Reihenfolge des abnehmenden Molekulargewichts isoliert.
Da die Aktivität der wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung an die Anwesenheit der Diaminopimelinsäure gebunden ist, ist es besonders zweckmäßig, aus dem rohen Gemisch die Substanzen zu isolieren, die in genügend großen Mengen vorhanden sind und einen hohen Gehalt an Diaminopimelinsäure haben. ;
Gemäß einer Variante der Erfindung führt man die Chromatographie vorteilhaft durch, indem man die DEAE-Cellulose mit einer Pufferlösung, die einen pH-Wert von etwa 7 hat, ins Gleichgewicht bringt und mit einem sauren Puffer, der beispielsweise einen pH-Wert von etwa 3 hat, eluiert. Auf diese Weise können durch Chromatographie wasserlösliche Extrakte isoliert v/erden, die hauptsächlich das Tetrasaccharid-Heptapeptid gegebenenfalls in Verbindung mit nicht-aminierten reduzierenden Zuckern enthalten.
Die gemäß der Erfindung hergestellten wasserlöslichen Extrakte weisen eine interessante Aktivität als immuno- !
ι logische Adjuvantia auf, ohne arthrogene Aktivität zu
zeigen.
Die Wirksamkeit als Adjuvans wird am Meerschweinchen, Hartley-Stamm, nach der Methode von R.G. White und Mit-
50984 8/095"$
arbeitern, Immunology 7 (1964) I58 bestimmt. Die arthrogene Wirkung und die Schutzwirkung werden nach den Methoden bestimmt, die von F. Bonhomme in CR. Acad. Sei., Serie D, 26j5 (1966) 1422 und CR. Acad. Sei. Serie D, 265 (196?) 2115 beschrieben werden.
Beim Meerschweinchen bewirken die wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung eine Verstärkung der Antikörperbildung bei intrakutaner Verabreichung von Dosen von 0,1 mg oder höheren Dosen.
Die Produkte gemäß der Erfindung können in der Humanoder Veterinärmedizin verwendet werden, um die Widerstandskraft gegen Infektionen durch Viren oder Bakterien zu steigern. Sie bewirken eine Verstärkung der Bildung von Antikörpern, die gegen pathogene Mikroorganismen wirksam sind, und können in Verbindung mit Impfstoffen verabreicht werden, um eine maximale Antikörperreaktion
sicherzustellen. !
Die Erfindung umfasst ferner Arzneimitcelzubereitungen, die die wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung in Verbindung mit einem oder mehreren verträglichen und pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln oder Hilfsstoffen und gegebenenfalls mit anderen Arzneimitteln, z.B. Antibiotika, Mitteln gegen Hyperämie und Impfstoffen, enthalten. In diesen Zubereitungen sind die wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung im allgemeinen in Mengen von mehr als 0,1 Gew.-% enthalten.
Die Zubereitungen können oral, rektal, parenteral oder in Form von Aerosolen verabreicht werden. In der Humantherapie hängen die Dosen von der gewünschten Wirkung ab. Sie können beim Erwachsenen zwischen 10 und 50 mg
I pro Tag liegen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
509848/0955 original inspects
2519 3 _ 9 -
Beispiel 1
50 g Bakterienreste, die von Lipiden befreit und aus Zellen von Corynebacteriurn parvum nach der Methode von A. Aebi und Mitarbeitern, Bull. Soc. Chem. Biol. 35 (1953) 661, erhalten worden sind, werden in 250 ml V/asser, das 0,1 ml des Tensids "NP-40" enthält, in einer Mühle der, Typs "Ultra-Turrax" gemahlen und homogenisiert. Das Gemisch wird 48 Stunden bei 40°C gerührt und 30 Minuten bei 4 0C zentrifugiert (4000 U/Min.)· Der Überstand wird auf 8θ C erhitzt. Dann wird Amrnoniumsulfat in einer solchen Menge zugesetzt, daß eine zu 4c$ gesättigte Lösung erhalten wird. Nach 12 Stunden bei 40C und Zentrifugierung für 30 Minuten wird eine Fällung P^0 erhalten. Dem Überstand wird Animoniumsulfat in einer solchen Menge zugesetzt, daß eine Lösung mit 10% Sättigimg erhalten vird. Nach 12 Stunden bei 4 C und Zentrifugation für 30 Minuten wird eine Fällung P70 erhalten.
Die Fällungen ?},Q und P und der letzte erhaltene Überstand S,, werden anschließend getrennt gegen destilliertes Wasser diaüysiert. Die verschiedenen Lösungen, die nicht durch die Membran hindurchtreten, werden gefriergetrocknet. Hierbei werden 3,175 g der Fraktion Ph0, 0,750 g der Fraktion P70 und 1,380 g der Fraktion S70, die den rohen wasserlöslichen Extrakt darstellt, erhalten.
Beispiel 2 j
Die gemäß Beispiel 1 erhaltene Fraktion S70 wird durch Säulenchromatographie an DEAE-Cellulose (Höhe '"<2 cm, Durchmesser 2,5 cm), die mit einem 0,05-molarc. Verona1-puffer von pH 7 ins· Gleichgewicht gebracht woi . η ist, gereinigt, wobei mit einem 0,05-molaren Natriu.„eitratpuff er von pH 7j eluiert wird und Fraktio en von je 2,3 cra^ aufgefangen werden, die mit 1 bis 500 numeriert werden. Die Elution wird durch optische Ablesung der Eluate am Spektrophotometer bei 280 und 220 rau verfolgt.
ORIGINAL INSPECTED 5 0 9 8 Lö/0 95h
2513938 - ίο -■
Die Fraktionen Nr. I50 bis 220 werden vereinigt. Wie die nachstehenden Analysenergebnisse zeigen, enthalten sie Tetrasaccharid-Heptapeptid in Verbindung mit nichtarninierten reduzierenden Zuckern. Nach der Gefriertrocknung werden 0,125 ß eines wasserlöslichen Extrakts erhalten, der die folgenden Merkmale und Eigenschaften hat:
Aussehen: weißes Pulver
Zusammensetzung:
a) Aminosäuren
(Molverhältnis): Alanin (3)> Glutaminsäure (2), Diaminopimelinsäure (DAP) (2), Asparaginsäure (2), Glycin (2).
b) Aminozucker
(Molverhältnis): N-Acefylmuraminsäure (2), N-Acetylglucosamin (2).
Molekulargewicht (berechnet auf Basis von 3 Alaninresten im Molekül): 4000 + 200. *j
Der Gehalt an Aminosäuren beträgt 21 _+ Kf0 und der Gehalt an Aminozuckern 24,5 ± ~5%· Der Rest besteht aus nichtaminierten reduzierenden Zuckern. Der Anteil an DAP beträgt somit 9,5 + 1 %. 1
OW-SiMAL iNSPcCTED ;
5098 A 8/ 0955

Claims (13)

2 51 -ι °> 3 8 Pate _n_t_aL__n α ρ r ü c h e
1) Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen. Diaminopimelinsäure (DAP) enthaltenden Extrakten von niedrigem Molekulargewicht aus Zellen von Corynebakterien, dadurch gekennzeichnet, daß man die von Lipiden befreiten Bakterienreste der DAP enthaltenden Zellen von Corynebakterien einer milden Extraktion unterwirft und die wasserlöslichen Extrakte auf physikalisch-chemischem 'Wege isoliert.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen von Corynebacterium parvum verwendet,
3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die wasserlöslichen Extrakte einer Reinigung unterwirft.
4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die milde Extraktion durch Mahlen und Homogenisieren in einem wässrigen Medium durchführt.
5) Verfahren nach Anspruch 1 bis A, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion in Gegenwart einer nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung durchführt. " !
6) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß man die wasserlöslichen Extrakte durch mehrmaliges Zentrifugieren, Aussalzen, Dialyeieren und durch Gefriertrocknen des in der Stufe der milden Extraktion erhaltenen Gemisches isoliert.
7) Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reinigung der wasserlöslichen Extrakte durch Chromatographie an Adsorptionsmitteln oder durch Filtration vornimmt. ι
.QBIGlNAL INSPECTED
5098/.8/0955
8) Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Chromatographie an DEAE-Cellulose oder an dem Produkt der Handelsbezeichnung "DEAE-Biogel A" vornimmt.
9) Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Filtration mit einem PoIyacrylamidgel durchführt.
10) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Homogenisierung in einem wäasrigen Medium und nach dem Zentrifugieren zweimal mit Ammoniumsulfat aussalzt, nach jedem Aussalzen zentrifugiert, den erhaltenen Überstand gegen destilliertes Wasser dialysiert, an einer Säule Chromatographiert und den aktiven wasserlöslichen Extrakt isoliert.
11) Wasserlösliche, Diaminopimelinsäure enthaltende Extrakte mit niedrigem Molekulargewicht, dadurch j gekennzeichnet, daß sie ein Molekulargewicht zwischen 1000 + 200 und 8000 +"200 haben und im wesent-j liehen aus wasserlöslichen Fragmenten der Zellwand von Corynebacterium parvum gegebenenfalls in Verbindung mit nicht-aminierten reduzierenden Zuckern bestehen.
12) Wasserlösliche Extrakte nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die wasserlöslichen Fragmente aus einem Gemisch eines Disaccharid-Tetrapeptids, eines Tetrasaccharid-Heptapeptids, des Dimeren, Trimeren und Tetrameren des letzteren gegebenenfalls in Verbindung mit nicht-aminierten reduzierenden Zuckern bestehen.
13) Arzneimittelzubereitungen, enthaltend eine wirksame Menge eines wasserlöslichen Extrakts nach Anspruch 1' und 12 und einen verträglichen und pharmazeutisch
509848/0955
unbedenklichen Träger oder Hilfastoff.
509848/0955
DE19752519938 1974-05-06 1975-05-05 Extrakte von corynebakterien, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in arzneimittelzubereitungen Pending DE2519938A1 (de)

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