CS196267B2

CS196267B2 - Method of producing water-soluble compounds having low-molecular weight,containing diamino pimelic acid

Info

Publication number: CS196267B2
Application number: CS753097A
Authority: CS
Inventors: Pierre Jolles; D Migliore-Samour
Original assignee: Anvar
Priority date: 1974-05-06
Filing date: 1975-05-05
Publication date: 1980-03-31
Also published as: CA1037028A; FR2269961A1; SU727112A3; JPS50155685A; IL47205A; DE2519938A1; CH604725A5; US4013788A; BE828635A; DK194975A; IL47205A0; GB1502320A; FR2269961B1; NL7505246A; SE7505032L

Description

Vynález se týká způsobu výroby ve vodě rozpustných látek o nízké molekulové hmotnosti, obsahujících kyselinu diaminopimelovou, z korynebakteriových buněk.

Způsob Izolace buněk s imunologickými vlastnostmi z buněk mikroorganismu Corynebacterium parvum již byl popsán; lze citovat například sdělení autora Tam-Nguyen-Danga a kol. v Compt. rend. Acad. Sci. Paris 276 (1973). Tyto imunologicky aktivní látky byly získány působením trypsinu na stěny buněk Corynebacterium parvum za přítomnosti rozpouštědel anebo působením formaldehydu na uvedené buňky.

Tímto způsobem izolované látky je však třeba podávat ve formě vodné suspenze vzhledem к tomu, že izolované látky nejsou ve vodě rozpustné.

Nyní bylo nově zjištěno, že z buněk korynebakterií lze získat postupem, který nezahrnuje působení enzymů, látky rozpustné ve vodě, přičemž tyto látky vykazují nearthrogenní adjuvační aktivitu. Ve vodě rozpustné látky, které se z uvedených buněk izolují způsobem podle vynálezu, obsahují kyselinu diaminopimelovou a mají molekulovou hmotnost v rozmezí 1000 ± 200 až 8000 ± 200.

Předmětem vynálezu je způsob výroby ve vodě rozpustných látek o nízké molekulové

6 26 7 hmotností, obsahujících kyselinu diaminopimelovou, z korynebakteriových buněk, jehož podstata spočívá v tom, že se odtučněné bakteriální zbytky z buněk korynebakterií, obsahující kyselinu diaminopimelovou, rozetřou a homogenizují ve vodě, načež se ze směsi, rezultující po homogenizování zbytků ve vodě, izolují extrahované ve vodě rozpustné podíly fysikálně-chemickými metodami, jakými jsou například odstředění, vysolení, dialýza a lyofilizace.

Jako odtučněných zbytků z buněk korynebakterií se s výhodou použije odtučněných zbytků buněk Corynebacterium parvum.

Izolované extrahované ve vodě rozpustné látky se s výhodou v následujícím stupni čistí.

Extrakce ve vodě rozpustných podílů se s výhodou provádí v přítomnosti neiontové povrchově aktivní látky.

Čištění izolovaných extrahovaných ve vodě rozpustných látek se s výhodou provádí adsorpční chromatografií nebo filtrací.

Chromatografie uvedených látek se s výhodou provádí na diethylaminoethylcelulóze nebo na agarovém gelu.

Filtrace uvedených látek se s výhodou provádí na polýakrylamidovém gelu.

Způsob podle vynálezu se s výhodou pro196267 .vádí tak, že po homogenizaci bakteriálních zbytků ve vodě a po odstředění nerozpuštěného podílu provede dvojí vysolení za použití síranu amonného, přičemž se po každém vysolení provede odstředění nerozpustného podílu, dále se kapalina nad sedlinou vždy dialyzuje proti destilované vodě, potom se chromatografií na koloně izoluje extrahovaná ve vodě rozpustná účinná látka.

Jak již bylo uvedeno, provádí se extrakce buněk jejich rozetřením a homogenizací ve vodném prostředí za přítomnosti neiontové povrchově aktivní látky, jakou je například kondenzační produkt ethylenoxidu s isooktylfenolem v molekulárním poměru 9:1 („NP-40“, Nonidet P40), nebo případně bez uvedené povrchově aktivní látky.

Při způsobu podle vynálezu se extrakce provádí s výhodou za teploty okolo 37 °C (fyziologická teplota). Doba extrakce nemá při způsobu podle vynálezu zásadní význam: tato doba však má být samozřejmě dostatečná к zajištění extrakce nejvýše možného množství ve vodě rozpustných látek. Extrakce se může provádět v jediném stupni nebo případně ve více po sobě následujících stupních.

Ve smyslu vynálezu se používají jako korynebakterie mikroorganismy obsahující kyselinu diaminopimelovou.

Některá korynebakteria, odpovídající uvedeným požadavkům, obsahují obvykle kyše-, linu meso-diaminopimelovou a arabinogalaktan. Říká se o nich, že jsou fakultativně anerobní, a jako příklad lze uvést Corynebaoterium diphtheriae.

Další korynebakteria, odpovídající uvedeným požadavkům a potřebám podle tohoto vynálezu, obsahují kyselinu L,L-diaminopimelovou, přičemž neobsahují arabinogalakta>n; Jsou striktně anerobní. Jako příklady korynebakterií,· spadajících do této kategorie; přlchážejí v úvahu C. acenes, C. parvum, C. anaerobium a C. granulosum, kromě jiných.

Se zřetelem na. bibliografické citáty lze uvést článek К.. H. Schleifera a O. Kandlera, Bacteriol. Reviewa 36, č. 4, 407 až 477. (prosinec 1972), kd&^: lze nalézt výčet korynebakterií a jejich: charakteristiky. Tamže uvedené podrobnosti jsou použity, v tomto popise a odkazuje se zde na ně.

Buňky korynebakterií, které jsou zvláště výhodné podle tohoto vynálezu, jsou buňky Corynebacterium parvum.

Buňky korynebakterií, které se použijí při postupu podle, tohoto vynálezu, se nejprve odtuční za použití na^; příklad postupu, který popisuje A. Aebi.a. spol., Bull. soc. chim. biol. 35, 661 (1953).. л

Neiontové povrchově aktivní činidlo, které se popřípadě může použít při postupu podle tohoto vynálezu, dovoluje disociovat lipidní látky, vázané na buňky, pokud se tyto látky neextrahují při odtučnění. Takže použití povrchově aktivní látky umožňuje zlepšit výtěžek extrakce;

Po provedení něžné extrakce se izolují extrahované a ve vodě rozpustné látky odstředěním, vysolením, dialýzou a lyofilizováním.

Vysolení se provádí za použití horní vrstvy po odstředění směsi po provedení něžné extrakce, a. to za. použití minerální soli, jako je síran amonný v roztoku o různých koncentracích. Při provádění vysolení se s výhodou zvýší teplota reakční směsi na dostačující teplotu pro rychlé rozpuštění použité minerální soli a dosažení požadovaného stupně nasycení; posléze se udržuje reakční směs na poměrně nízké teplotě, s výhodou mezi 0 až 6 °C po 6 až 24 hodin. Oddělení nerozpustných podílů se provede podle tohoto vynálezu s výhodou odstředěním za teploty rovněž mezi 0 až 6 °C.

Extrahované a ve vodě rozpustné látky podle tohoto vynálezu se konečně izolují v suchém stavu za použití na příklad lyofilizace, to za použití roztoků ze stupňů, které zde byly popsány, nedialyzovatelných membránou, zadržující látky o molekulové váze nad 1000; používá se na příklad membrána typu „Diaflo UM 2“ .(Amicon).

Podle jedné obměny postupu podle tohoto vynálezu, obměny zvláště výhodné, se mohou extrakty, rozpustné ve vodě, čistit a' dělit na jejich složky kromě jiného za pokých, zvláště adsorpční chromatografií, jako je chromatografování na diethylaminoethylcelulóze, tedy produktu, který je znám . pod označením „DEAE Biogel A“, nebo filtrací na příklad na gelu polyakrylamidu za použití zvláště produktu, který je znám pod označeními „Biogel P1Q“, „Biogel P6“ nebo „Biogel P4“.

Extrahované látky, rozpustné ve vodě, které tvoří kromě jiného předmět tohoto vynálezu, tvoří v podstatě směs fragmentů buněčných stěn, rozpustných ve vodě, popřípadě vázaných na redukující cukry, neobsahující dusík, přičemž uvedené fragmenty jsou obsaženy v řečené směsi v proměnných poměrech; množství fragmentů buněčných stěn, rozpustných ve vodě a obsažených v řečených extraktech podle tohoto vynálezu, se mění ve funkci podmínek, použitých při postupu podle tohoto vynálezu, zvláště v závislosti na době extrakce a počtu vysolení při čištění.

Fragmenty buněčných stěn, rozpustné ve vodě, tvoří v podstatě kombinace disacharid-tetrapeptid, tetrasacharid-heptapeptid a dimery, trimery a tetramery posléze uvedené možnosti.

Kombinace disacharld-tetrapeptid má toto složení: 1 mol N-acetylglukosaminu, 1 mol kyseliny M-acetylmuramové, 2 moly alaninu, 1 mol kyseliny glutamové a 1 mol kyseliny dlaminopimelové, a schéma složení lze vyznačit takto:

NAG—NAM

I

Ala-Glu-DAP-Ala ,

1912 6.7 kde znamená

NAG N-acetylglukosamin,

NAM kyselinu N-acetylmuramovou,

Ala . alanin ~

Glu kyselinu glutamovou

DAP kyselinu diaminopimelovou.

Kombinace tetrasacharid-heptapeptid má toto složení: 2 moly N-acetylglukosaminu, 2 moly kyseliny N-acetylmuramové, 3 . moly alaninu, 2 moly kyseliny ' glutamové, 2. moly kyseliny, diaminopimelové, a systém struktury lze vyznačit schématem:

NAG—NAM—NAF—NAM .

•Ala	: · · Ala’
Glu	· · Glu
DAP .	DAP

' V‘ těchto fragmentech · může být kyselá funkce nebo volná aminofunkce kyseliny diaminopimelové substituována zbytkem kyseliny asparagové a glycinu, což jsou zbytky meziřetězových můstků, které · pochopitelně existují v buněčných stěnách.

Redukujícím cukrem, neobsahujícím dusík, je převážně glukóza, popřípadě mannosa nebo galaktóza. ...

Složení · extrahovaných látek, rozpustných ve vodě, které se takto získávají, lze zjistit za použití postupů, obvyklých při stanovování obsahu aminokyselin, aminocukrů a redukujících cukrů, neobsahujících dusík.

Za použití · stupně čištění lze podle tohoto vynálezu získat extrahované látky, rozpustné ve vodě, obsahující · převážně kombinace tetrasacharid-heptapeptid, · v případné vazbě na redukující cukr bez ’ dusíku. · Rovněž například lze získat ze •surového extraktu, rozpustného ve vodě, · ják · se získá postupem podle · tohoto vynálezu, po · chromatógrafii na _ DEAE-celulóze za použití vhodných eluujících · činidel · skupinu látek, · . obsahujících kombinaci disacharid-tetrapeptid, popřípadě vázaných na redukující · cukr · bez dusíku, a kombinace tetrasacharid-heptapeptid, dále také odpovídající dimer, ťriméř a tetramer, popřípadě ve vazbě na · -redukující cukr bez dusíku. Během chromatografování se. látky, rozpustné ve vodě, izolují · v závislosti· na klesající · molekulové · váze.

Účinnost extrahovaných látek, rozpustných, ve vodě, podle tohoto vynálezu závisí· na přítomnosti · · kyseliny diaminopimelové, a proto ·je zvláště zajímavé izolovat.že· surové směsi látky, které jsou tamže přítomné v .dosťatečne 'důležitých 'množstvíplru.....vyznačují · se vysokým obsahem kyseliny diamino.pimelové. ;

Podle · jedné obměny postupu.podle tohoto vynálezu · .se provádí s výhodou chromatógrafování · tak,.. že... se DEAE-celulóza . · uvede do · rovnovážného · ' stavu s · . pufrujícím. · roztokem· o hodnotě pH řádově 7 s následujícím eluováním kyselým pufrem, například o hodnotě pH řádově · 3. Lze ·· takto izolovat chromatografováním· extrahované · látky, rozpustné ve vodě, obsahující převážně · kombinaci tetrasacharid-heptapeptid v případné vazbě na redukující cukry bez dusíku. Extrahované látky, rozpustné ve vodě, které se · · získávají postupem podle tohoto vynálezu, -se vyznačují pozoruhodnou · účinností jako imunologická adjuvantia, aniž by se · u- nich · projevila · arthrogenní účinnost.

Adjuvační mohutnost se stanoví na; morčatech, kmen Hartley, a to za · použití · postupu, · který popsal R. G. White · a spol., Immunology 7, 158 (1964], účinnost arthrogenní a ochranná podle postupů, které popsal F. Bonhomme, Compt. rend. Acad. Sci., D, 263, 1422 (1966); 265, 2215 (1967).

U morčete způsobují extrakty ·podle tohoto vynálezu, rozpustné ve vodě, zvýšení množství antilátek v dávkách vyšších či rovných 0,1 mg při intradermálním podávání.

Výsledky jsou dále podrobněji · rozvedeny:

I. Účinnost při te-stu podle Whitea (viz výše); adjuvační vliv na hyper sensibilitu retardovaného typu

a) Postup provedení:

Morčata (kmen Dunklin-Hartley) o váze 350 až 400 g dostávají do měkké části tlapek 0,8 ml objemové emulze, · obsahující · celkem 1 mg · · kuřecího ovalbuminu a 500 ^g adjuvačního produktu, který se testuje, v 0,4 ml fyziologického roztoku (0,85% chloridu sodného) a 0,4 ml nekompletního Freudova adjuvans (tedy 0,2 ml emulze na tlapku).

Za 21 dní se · oholí zvířatům boky, a· intradermálně se· injikuje 100· ovalbuminu v objemu 0,1 ml. Za 24 a 48 · hodin se zaznamenají reakce (erythem, ztvrdnutí a nekróza).

Čísla, vyznačující účinnost,· jsou dána poměrem erythematických povrchů léčených zvířátek (3 morčata na 1 látku) při · porovnávání se slepými pokusy, kdy byl podán v nekompletním · Freundově adjuvans pouze ovalbumín.

Viz R. G. White, Immunobiol. Standard. 6, 3 až 11, 49 až · 58 (1967) a I. H. · Hiu a J. L. Amiel, · Experientia 28, 953 (1972).

Výsledky · jsou uvedeny v tabulce:

7	8
Doba po prvé injekci antlgenu, hodin	Dávka produktu 500 <ug	Číslo, označující adjuvační účinnost*). podle vynálezu	Usmrcený Bacillus tuberculosis, . kmen H 37 Ra
24	přidáno do 100 ^g ovalbuminu přidáno do 100 ^g	0,86	1,52
48	ovalbuminu	1,20	6,26

*) Číslo, vyznačující účinnost ve srovnání s testy, kdy se podává pouze ovalbumin a minerální olej

II. 'Sledování .adjuvačního vlivu na produkci antilátek proti Chřipkovému viru .

u králíka

a) Postup

Použitý antigen je lidský chřipkový virus B/Massachusetts(3)66, čištěný a potom desaktivovaný /З-propiolaktonem. Ředí . .se tak, že obsahuje 2000 hemaglutinačních jednotek na 1 ml, a mísí se se stejným objemem minerálního oleje (nekompletní Freundovo adjuvans) a s polovičním objemem roztoku studovaného adjuvans ve fosfátovém pufru o hodnotě pH 7,2 s obsahem 2,5' mg produktu na 1 ml.

Antigen B/Mass. zZeděnÝ 3 ml minerální olej 3 ml vodný roztok testovaného adjuvans (2,5 mg/ml) 1,5 ml

Emulze, jež je stálá po dobu několika týdnů, se připraví rozmícháním směsi na přístroji „Ultra-Turrax“ (21000 otáček za miPoužlté adjuvans nutu). Králíkům (bílý kmen Bouscat, 2 až 3 kg] se vpíchne intramuskulárně . injekce 2 ml emulze do zadní nožičky; ' za 3 týdny po této prvé injekci dostane králík opakovanou injekci téže emulze, a to stejný objem do stejného místa. O 2 týdny později se vyhodnotí z marginální vény z ucha krev na inhibiční antilátky hemaglutlnace titrací v séru proti chřipkovému viru B/Mass. (3)66.

Literatura.·

D. Hobson, Immunobiol. Standard. 6, 269 (1967);

F. M. Davenport a A. V. Hennessy, Immunobiol. Standard. 6, 283 (1967);

G. K. Hirst, J. Exp. Med. ' 75, 49 (1942).

Výsledky

V následující tabulce jsou dosažené sérologické výsledky ve formě titrů antilátkové inhibice hemaglutinace za stanovení v séru vždy za použití 3 králíků, imunizovaných týmž antigenem a za přítomnosti téhož adjuvantia.

Faktor násobení titru antilátkové.. inhibice hemaglutinace (B/Mass.) séra pouze minerální olej1 minerální olej + usmrcené bacily kmene2

H 37 Ra minerální olej + produkt podle vynálezu8

III. Sledování arthrogenní účinnosti

U žádného z produktů se za použití krys nejeví arthrogenní účinnost na ' rozdíl od toho, co bylo pozorováno za použití kompletního Freundova adjuvans (minerální olej + + Bacillus tuberculosis, usmrcené mikroorganismy kmene H ' 37 Ra).

IV. Vyhodnocení

Extrakty z E. coli a C. parvum jako adjuvantia a produkty postupů podle vynálezu se liší od kompletního adjuvans podle Freunda (minerální olej a usmrcené bacily tuberkulosy .kmen H 37 Ra) tím, že zrychlují ihned a často i lépe vznik antilátek (tabulka II), přičemž se vyznačují skutečně značně nižší účinností z hlediska retardované hypersensibility (tabulka I). V některých případech terapeutického využití, zvláště , při použití jako adjuvantia ve vakcinách, by mohlo být stimulování hypersensibility retardovaného typu nežádoucí a představovalo by vážný problém. . Je tedy třebea pokládat přípravu adjuvans, schopného stimulovat tvorbu antilátek se současným slabým vlivem, případně bez vlivu na hypersensibilizaci za skutečný pokrok a pozoruhodné originální řešení.

Produkty podle tohoto vynálezu jsou použitelné v lékařství nebo ve zvěroiékařství k podporování odolnosti proti infekcím virového nebo mikrobiálního původu. Provokují zvýšení tvorby· antilátek, použitelných proti -patogenním organismům, a mohou se přidávat do vakcín k zajištění maximální reakce . antilátek.

Farmaceutické přípravky obsahují extrahované a ve vodě rozpustné látky podle tohoto vynálezu s jedním nebo více ředidly, popřípadě kompatibilní pomocné látky, po1-9 6 2 67 užitelné farmaceuticky, případně spolu s jinými léčivy, jako jsou antibiotika, látky proti překrvení a vakcíny. V přípravku Činí obvykle obsah extrahované a ve vodě rozpustné látky podle tohoto vynálezu váhově nad 0,1 %.

Přípravky je možno podávat orálně, rektálně, parenterálně nebo ve formě aerosolů. V lékařství jsou dávky závislé na potřebném účinku, a mohou se pohybovat v. rozmezí 10 až 50 mg pro dospělého za den. .

Vynález je dále popsán připojenými příklady, jimiž není rozsah vynálezu jakkoli omezován.

Přikladl g odtučněných bakteriálních zbytků, získaných z buněk Corynebacterium parvum za použití postupu A. Aebiho a spol., Bull, soc. chlm. biol. 35,,661 (1953) se rozdrtí a homogenizuje do 250 ml vody, obsahující 0,1 ml povrchově aktivní látky „NP-40“, a to zá použití drtiče typu „Ultra-Turrax“.

Po míchání 48 hodin při 40 °C a odstřeďování 30 minut při 4°C (4000 otáček za minutu) a vrstva nad sedlinou se vyhřeje na 80 °C, a přidá se síran amonný v takovém množství, že se tím dosáhne roztok, nasycený z 40 %. Za 12 hodin při 4°C a odtředování po 30 minut se získá sraženina P40. Do kapaliny nad sedlinou se přidá síran amonný v takovém množství, že se tím dosáhne roztok, nasycený z 70 °/o. Za 12 hodin při 4°C a odstředování po 30 minut se získá sraženina P70.

Sraženiny P40, P70 a poslední kapalina nad sedlinou S70 se odděleně dialyzují proti destilované vodě, a získané roztoky, které již nedialyzují, se lyofilizují. Získá se tím 3,175 gramu frakce P40, 0,750 g frakce P70 a 1,380 gramu frakce S70, což představuje úhrnný podíl extraktu, rozpustného ve vodě.

Příklad 2

Frakce S70, získané v příkladu 1, se Čistí chromatografováním na koloně DEAE-célulózy {výška 92 cm, průměr 2,5 cm), uvedené do rovnovážného stavu veronalovým pufrem 0,05 M o hodnotě pH 7 za eluování pufrem ze sodné soli kyseliny citrónové o koncentraci 0,05 M a hodnotě pH 3, přičemž se jímají frakce po 2,3 ml, označené čísly od 1 až do 500, přičemž eluování je sledováno optickým vyhodnocováním eluovaných frakcí na spektrofotometru při vlnových délkách 280 . a 220 nm. Frakce 150 až 220 se spojí; obsahují, jak je to patrné z výsledků analytických postupů, o kterých zde již byla řeč, kombinaci tetrasacharid—heptapeptid ve vazbě na redukující cukry bez dusíku. Po lyofilizování se získá 0,25 g extrahované látky, rozpustné ve vodě, jež se vyznačuje těmito vlastnostmi:

vzhled: bílý prášek;

složení:

a) aminokyseliny (v molárních poměrech): alanin (3), kyselina glutamová (2), kyselina diiaminopimelová (2), kyselina asparagová (2), glycin (2);

b) aminOcukry (v molárních poměrech): kyselina N-acetylmuramová (2), N-acetylglukosamin (2).

Molekulová váha (počítaná na podkladu 3 alaninových zbytků na molekulu): 4000 ± ± 200.

Obsah aminokyselin činí 21 ± 4 %, a aminocukrů 24,5 ± 3 %, zbytek tvoří redukující cukry, neobsahující dusík. Procentuální podíl kyseliny diaminoplmelové činí 9,5 ± 1.

Claims

1. Způsob výroby ve vodě rozpustných látek o nízké molekulové hmotnosti, obsahující kyselinu diaminopimelovou, z korynebakteriových buněk, vyznačený tím, že se odtučněné bakteriální zbytky z buněk korynebakterií, obsahující kyselinu diaminopimelovou, rozetřou a homogenizují ve vodě, načež se ze směsi, rezultující po homogenizování zbytků ve vodě, izolují extrahované ve vodě rozpustné podíly fyzikálně-chemickými metodami, jakými jsou například odstředění, vysolení, ' dialýza a lyofilizace.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako odtučněných zbytků z buněk korynebakterllí použije odstučněných zbytků buněk Corynebacterium parvum.

3. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačený· tím, . že , se ' izolované extrahované ve vodě rozpustné látky v následujícím _ stupni čistí.

4. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačený tím, že se extrakce ve vodě rozpustných podílů provádí v přítomnosti neiontové povrchově aktivní látky.

5. Způsob podle bodů 1 až 4, vyznačený tím, že se čištění izolovaných extrahovaných ve vodě rozpustných látek provádí adsorpční chromatografií nebo filtrací.

6. Způsob podle bodu 5, vyznačený tím, že se chromatografie uvedených látek provádí na diethylaminoethylcelulóze nebo na agarozovém gelu.

7. Způsob podle bodu 5, vyznačený tím, že se filtrace uvedených látek provádí na polyakrylamidovém gelu.

8. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se po homogenizaci bakteriálních zbytků ve vodě a po odstředění nerozpuštěného podílu provede dvojí vysolení za použití síranu amonného, přičemž se po každém vysolení provede odstředění nerozpustného podílu, načež se kapalina nad sedlinou vždy dialyzuje proti destilované, vodě, načež se chromatografií na koloně izoluje extrahovaná ve vodě rozpustná účinná látka.