DE3650082T3

DE3650082T3 - Orale impfstoffe.

Info

Publication number: DE3650082T3
Application number: DE3650082T
Authority: DE
Inventors: Henry De Aizpurua; Peter Howe; Keith Rand; Gregory Russell-Jones
Original assignee: Biotech Australia Pty Ltd
Current assignee: Biotech Australia Pty Ltd
Priority date: 1985-05-15
Filing date: 1986-05-14
Publication date: 2000-12-21
Anticipated expiration: 2006-05-15
Also published as: CA1340555C; EP0222835B2; AU5861286A; DK16487D0; ES8900006A1; EP0222835A4; NZ216162A; JP2761849B2; HK29896A; IL78775A0; DK171846B1; EP0222835B1; CN86103835A; DK16487A; ES554969A0; DE3650082T2; JPH07213290A; IL78775A; DE3650082D1; WO1986006635A1

Description

Die Erfindung betrifft die spezifische Stimulierung von Serumantikörpern und von sekretorischen Antikörpern durch Präsentation von Antigenen auf der Schleimhaut.

Stand der Technik

Eine Anzahl von Infektionen in Säugern weist derart gesundheitsschädliche Nebenwirkungen auf den Säuger auf, daß eine Vakzinierung gegen das für die Infektion verantwortliche spezielle Antigen gerechtfertigt ist. Deshalb werden Vakzinierungsprogamme aufgestellt, wodurch der Säuger einem Antigen ausgesetzt wird, so daß eine dem Säuger Immunität verleihende Immunantwort bewirkt wird.
Die Verabreichung des Antigens an den Säuger kann über eine Anzahl von Wegen erfolgen, die eine intramuskuläre Injektion (i. m.), eine subkutane Injektion (s. c.) oder eine orale Verabreichung (per os) umfassen. I. m.- oder s. c.-Injektionen eines Antigens weisen unter anderem die nachfolgenden Nachteile auf: es sind relativ spezialisierte Fachleute erforderlich, es ist schwierig, die Injektionen in einem großen Maßstab duchzuführen, die Injektion ist teuer und es kann eine Anzahl von Nebenwirkungen, entweder auf das Immunisierungsantigen oder auf den Emulgator, in dem das Antigen präsentiert wird, auftreten. Die orale Verabreichung von Vakzinen ist im Gegensatz dazu relativ problemfrei, mit der Ausnahme, daß eine orale Zufuhr einer Anzahl von Antigenen relativ große Antigenmengen erforderlich macht, da die Menge des Materials, die tatsächlich absorbiert und zur Stimulation einer wirksamen Immunantwort in der Lage ist, im allgemeinen gering ist. Demnach überschreitet die zur oralen Immunisierung erforderliche Antigenmenge im allgemeinen diejenige, die zur systemischen Induktion einer Immunität erforderlich ist. Es gibt weiterhin einen großen Nachteil bei der oralen Präsentation der großen Antigenmengen, die zur Produktion einer Antikörperantwort erforderlich sind; dieser Nachteil liegt darin, daß eine Zufuhr dieser großen Antigenmengen häufig zur Induktion einer systemischen Toleranz führt (Tomasi, 1980; Mowat, 1985; Mowat und Parrot, 1983; Ngan & Kind, 1978; Hanson et al., 1979; Richman et al., 1978; Rothberg et al., 1973).
Die bis heute vorliegenden Erkenntnisse deuten darauf hin, daß der Mechanismus, durch den das Antigen nach der oralen Aufnahme durch den Dünndarm aufgenommen wird, im allgemeinen vor allem über eine unspezifische Prüfung des Inhalts des Eingeweidelumens durch die "M"- Zellen, die über den Peyer-Plaques liegen, und durch andere lymphoide Kluster des GALT (gutassociated-lymphoid tissue = mit Eingeweide verbundenes Lymphgewebe) (Bland und Britton, 1984) erfolgt. Die nachfolgende Sensibilisierung lokaler Lymphozytenpopulationen führt zur Erzeugung lokaler IgA-Immunantworten und zur Sensibilisierung von IgG-Suppressorzellen mit einer gleichzeitigen Suppression der Serum-IgG-Antworten (Tomasi, 1980; Mowat, 1985; Mowat und Parrot, 1983; Ngan & Kind, 1978; Hanson et al., 1979; Richman et al., 1978; Rothberg et al., 1973).
Es ist weiterhin offensichtlich, daß die Stelle der Antigenaufnahme, ob sie über die Peyer- Plaques oder das villöse Epithel erfolgt, und ziemlich wahrscheinlich die verabreichte Antigenmenge die Art der Immunantwort, die durch orale Verabreichung des Antigens bewirkt wird, diktiert. Es stellt sich dann die Frage, ob es neben dem Choleratoxin andere Antigene gibt, die die Fähigkeit aufweisen, das Schleimhaut-Immunsystem nach oraler Herausforderung spezifisch zu aktivieren und/oder die humorale Immunantwort in dosisabhängiger Weise ohne Induktion einer systemischen Toleranz und ohne Notwendigkeit übermäßiger Antigendosen zu stimulieren.
Unter Berücksichtigung dieser Überlegungen wurde erfindungsgemäß beschlossen, das mögliche Potential bestimmter Adhäsionsmoleküle zu untersuchen, die mit der Erstanlagerung einer Anzahl von Intestinalpathogenen in Verbindung gebracht wurden, um die Immunantwort nach oraler Verabreichung zu stimulieren. Diese Oberflächenantigene mit Adhäsionseigenschaften für eine Anzahl von Stämmen des enterotoxigenen E. coli (ETEC) wurden als nicht-flagellare, filamentöse proteinhaltige Anhängsel oder Pili identifiziert (Gaastra & de Graaf, 1982). Beispiele umfassen die CFA I- und CFA II-Antigene der humanen ETEC-Stämme und die K88-, K99-, F41- und 987P-Pili tierischer ETEC-Stämme (Gibbons et al., 1978; Evans & Evans, 1978; Levine et al., 1980; Morgan et al., 1978; de Graaf & Roorda, 1982). Weiterhin wurde die Fähigkeit einer Anzahl anderer Proteine, die bei der Koloniebildung keine offensichtliche Rolle spielen, zur Aktivierung des Immunsystems nach oraler Verabreichung überprüft. Die Antigene umfassen eine Anzahl von Lektinen eines serotypischen Antigens von S. typhimurium (Flagellen vom Typ "i"), inaktivierten Influenzavirus und Endotoxin von S. typhimurium (LPS). Die orale Aktivierung wurde mit der Antwort auf eine intramuskuläre Gesamtanregung (i. m.) verglichen.
Die Aufgabe dieser Untersuchungen lag damit in der Bereitstellung eines Verfahrens, wodurch die Aufnahme eines Immunogens oder eines Antigens durch die Schleimhaut des Gastrointestinaltrakts derart verbessert wird, daß die Erzeugung von Serumantikörpern und sekretorischen Antikörpern durch orale Verabreichung niedriger Dosen des Immunogens ohne die Induktion einer oralen Toleranz möglich wird.
Erfindungsgemäß wird eine Gruppe von Molekülen (Schleimhautimmunogenen) beschrieben, die bei Aufnahme zu einer Produktion von Serumantikörpern gegen diese Proteine mit vergleichbaren Spiegeln zu denen, die durch intramuskuläre Injektion dieser Moleküle erhalten werden, führen. Wenn größere Mengen dieser Antigene zugeführt werden, gibt es weiterhin eine gleichzeitige Stimulierung der Produktion von Schleimhautantikörpern gegen die Immunisierungsmoleküle.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren beschrieben, wodurch die gegen die oral zugeführten Moleküle erzeugte Antikörperantwort durch Cozufuhr einer Anzahl von Nahrungsmolekülen (dietary molecules) gesteigert oder verändert wird.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren beschrieben, wodurch ein Hapten oder ein Protein an ein Schleimhaut-Immunogen gekoppelt werden kann und in dem der Komplex bei Zufuhr zur Produktion von Antikörpern gegen das Hapten oder das gekoppelte Protein führt.

ABKÜRZUNGEN

1. Ab - Antikörper
2. BSA - Rinderserumalbumin
3. ConA - Conconavalin A
4. DNP - Dinitrophenyl
5. ELISA- Enzym-gekoppelter Immunosorbensassay
6. ETEC - enterotoxigenes E. coli
7. GALT - mit dem Eingeweide verbundenes Lymphgewebe
8. HA - Hydroxylapatit
9. im - intramuskulär
10. LHRH - Luteinisierungshormon- Releasing Hormon
11. LPS - Lipopolysaccharid
12. LT-B - hitzelabiles Toxin des enterotoxigenen E. coli
13. O/N - über Nacht
14. per os - orale Verabreichung
15. ps - Polysaccharid
16. RT - Raumtemperatur
17. sc - subkutan
18. SDS-PAGE - SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese
19. TCA - Trichloressigsäure

Offenbarung der Erfindung

In einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird eine orale Vakzine bereitgestellt, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Immunogen umfaßt, das kovalent an ein Trägermolekül gebunden ist, welches zur spezifischen Bindung an die epitheliale Schleimhaut eines Wirbeltierwirts geeignet ist, worin sowohl die immunologische Aktivität des Immunogens als auch die Eignung des Trägermoleküls, spezifisch an das Schleimhautepithel des Wirbeltierwirts zu binden im wesentlichen aufrechterhalten wird und das Trägermolekül ein zur Bindung an das Schleimhautepithel geeignetes Molekül ist, ausgewählt aus dem Ganzen, einem Teil, einem Analogon, einem Homologen, einem Derivat oder einer Kombination hiervon eines bakteriellen Adhesins, eines viralen Hämagglutinins, eines Toxins oder einer Bindungsuntereinheit eines Toxins oder eines Lectins, wobei jedoch Immunogen-Trägerkomplexe ausgenommen sind, worin das Immunogen natürlicherweise an das Trägermolekül gebunden ist, Immunogen-Trägerkomplexe, worin das Trägermolekül CTB, ist Immunogen-Trägerkomplexe, worin das Trägermolekül ein Teil von CTB ist, welches die Fähigkeit zur Schleimhautbindung aufweist, und Immunogen- Trägerkomplexe, wobei das Immunogen ST und das Trägermolekül LTB ist.
Bevorzugte erfindungsgemäße Immunogene umfassen: ein Antigen oder Hapten oder den gesamten Teil, einen Teil, Analoga, Homologe, Derivate oder Kombinationen des Hormons oder eines Therapeutikums. Diese Immunogene umfassen Hormone wie LHRH (luteinisierendes Hormon-Releasing Hormon), FSH, HGH und Inhibin; Allergene wie Gräserpollen (beispielsweise Gerste und gemeine Quecke), Unkrautpollen (beispielsweise Klee, Ampfer), Baumpollen (z. B. Esche, Zypresse), Pflanzenpollen (z. B. Ginster), Epithelgewebe (z. B. Katzenhaar, Hundehaar, Schweinehaar) und Hausstaub, Weizenspreu und Kapok; Immunogene für Vakzinen gegen Erreger wie Influenza, Masern, Rubella, Pocken, Gelbfieber, Diphtherie, Tetanus, Cholera, Pest, Typhus, BCG, Haemophilus influenzae, Neisseria catarrhalis, Klebstella pneumonia, Pneumococcen und Streptococcen, insbesondere S. mutans; und Pili einschließlich Pili, die aus E. coli, N. gonorrhoeae, N. meningitis, N. catarrhalis, Yersinia spp, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp. Moraxella bovis, Bacteroides nodo sus, Staphylococci spp, Streptococci spp und Bordetella spp.
Bevorzugte Trägermoleküle umfassen bakterielle Adhäsine wie 987P, K99, CFAI, CFAII, K88 oder F41; virale Hämagglutinine, beispielsweise aus Influenza-, Masern-, Rubella-, Pocken- oder Gelbfieberviren; Toxine oder Bindungsuntereinheiten hiervon, beispielsweise LTB-Ricin, Abrin, Diphtherie-Toxin, Modecin, Tetanus-Toxin und andere ähnliche Strukturen; und Lektine, gleichgültig, ob sie aus Pflanzen stammen oder einen anderen Ursprung aufweisen. Lektine umfassen beispielsweise Conconavalin A, Pokeweed-Mitogen oder Lektine aus Lens culinaris, Helix pomatia, Glycine max, Arachis hypogea oder Ulex europeus oder Abrin, Asparagus pea, Saubohne, Kamelfuß-Baum, Castorbohne, Favabohne, grüne Meeresalgen, haarige Wicke, Pferdekichererbse, Pferdeschuhkrabbe, Jackbohne, japanische Glycine, Jequirity, schottischer Goldregen, Limabohne, Limulin, Lotus, europäische Mistel, Mungbohne, Osage-Orange, Pagodenbaum, Gartenerbse, Kartoffel, rote Kidneybohne, rote Meeresalgen, sibirischer Erbsenbaum, eßbare Schnecke, Gartenschnecke, Spindelbaum, Süßerbse, Tomate, Weizenkeim oder Flügelerbse.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Komplex bereitgestellt, der das luteinisierende Hormon-Releasing Hormon und LTB umfaßt.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer oben beschriebenen oralen Vakzine bereitgestellt, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte umfaßt:
(a) Umsetzen des Immunogens mit dem Trägermolekül zur Bildung eines Komplexes;
(b) chemisches Modifizieren des Immunogens zur Bereitstellung wenigstens einer funktionellen Gruppe, die zur Bildung einer chemischen Bindung befähigt ist, und Umsetzen des Immunogens und des Trägermoleküls zur Komplexbildung; oder
(c) chemisches Modifizieren des Trägermoleküls zur Bereitstellung wenigstens einer funktionellen Gruppe, die zur Bildung einer chemischen Bindung befähigt ist, und Umsetzen des Immunogens und des Trägermoleküls zur Komplexbildung;
(d) chemisches Modifizieren des Immunogens und des Trägermoleküls zur Bereitstellung von funktionellen Gruppen, die zur Bildung einer chemischen Bindung in der Lage sind, und Umsetzen des Immunogens und des Trägermoleküls zur Komplexbildung;
(e) Umsetzen des Immunogens mit wenigstens einem Bindungsmittel, und Umsetzen des Immunogens und des Trägermoleküls zur Komplexbildung;
(f) Umsetzen des Trägermoleküls mit wenigstens einem Bindungsmittel, und Umsetzen des Immunogens und des Trägermoleküls zur Komplexbildung;
(g) Umsetzen des Immunogens und des Trägermoleküls mit wenigstens einem Bindungsmittel, und Umsetzen des Immunogens und des Trägermoleküls zur Komplexbildung; oder
(h) eine Kombination beliebiger, oben genannter Verfahrensschritte.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, das das Bereitstellen eines rekombinanten DNA-Moleküls umfaßt, das eine erste DNA-Sequenz umfaßt, die bei Expression für die Aminosäure-Sequenz des Immunogens kodiert, eine zweite DNA- Sequenz, die bei Expression für die Aminosäure-Sequenz des Trägermoleküls kodiert, und eine Vektor-DNA; Transformieren des Wirts mit dem rekombinanten DNA-Molekül, so daß der Wirt zur Expression eines Hybrid-Proteinprodukts, das den Komplex umfaßt, befähigt wird; Kultivieren des Wirts zur Expression und Sammeln des Hybrid-Proteinprodukts.
Alternativ hierzu wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung einer oralen Vakzine bereitgestellt, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte umfaßt:
(a) chemisches Synthetisieren des Immunogens und/oder des Trägermoleküls, und Ausbilden des Komplexes durch chemische Reaktion; oder
(b) Synthetisieren eines Hybridpeptids mit Aminosäure-Sequenzen des Immunogens und des Trägermoleküls. Bevorzugt wird das Peptid durch Festphasen-, enzymatische oder manuelle Peptidsynthese hergestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das synthetisierte Immunogen oder Trägermolekül, während es an das Harz der Festphasen-Peptidsynthesevorrichtung gebunden ist, an das Trägermolekül bzw. das Immunogen gekoppelt.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtstransformante bereitgestellt, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, das eine erste DNA- Sequenz, die bei Expression für die Aminosäure-Sequenzen des gesamten, eines Teils, eine Analogons, eines Homologen, eines Derivats oder einer Kombination hiervon des Immunogens kodiert, eine zweite DNA-Sequenz, die bei Expression für die Aminosäure-Sequenz des gesamten, eines Teils, eines Analogons, eines Homologen, eines Derivats oder einer Kombination hiervon des Trägersmoleküls kodiert und eine Vektor-DNA umfaßt, wobei jedoch Wirtstransformanten ausgeschlossen sind, die mit rekombinanten DNA-Molekülen transformiert sind, die Immunogen-Trägerkomplexe kodieren, worin das Immunogen natürlich an das Trägermolekül gebunden ist, Immunogen-Trägerkomplexe, worin das Trägermolekül CTB ist, Immunogen- Trägerkomplexe, worin das Trägermolekül ein Teil von CTB ist, das zur Bindung an die Schleimhaut geeignet ist und Immunogen-Trägerkomplexe, bei denen das Immunogen ST ist und das Trägermolekül CTB ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtstransformante ein Gramnegatives oder Gram-positives Bakterium, eine Hefe, ein Pilz oder eine höhere Eukaryontenzelle. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Wirt E. coli.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein rekombinantes DNA-Molekül mit einer ersten DNA-Sequenz, die bei Expression für die Aminosäure-Sequenz des Immunogens kodiert, einer zweiten DNA-Sequenz, die bei Expression für die Aminosäure-Sequenz des Trägermoleküls kodiert, und einer Vektor-DNA bereitgestellt, wobei jedoch rekombinante DNA- Moleküle ausgeschlossen sind, die für Immunogen-Trägerkomplexe kodieren, worin das Immunogen natürlich an das Trägermolekül gebunden ist, Immunogen-Trägerkomplexe, worin das Trägermolekül CTB ist, Immunogen-Trägerkomplexe, worin das Trägermolekül ein Teil von CTB ist, das zur Bindung an die Schleimhaut geeignet ist, und Immunogen-Trägerkomplexe, worin das Immunogen ST ist und das Trägermolekül CTB ist. In einer bevorzugten Ausgestaltung dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform handelt es sich bei der Vektor-DNA um eine Plasmid-DNA; andere Vektoren sind jedoch vom Schutzumfang der vorliegenden Refunding mitumfaßt, und diese umfassen Viren, Bakteriophagen und Cosmide. In einer bevorzugten Ausführungsform der Refunding wird das Plasmid pBTAK66 bereitgestellt, das bei Transformation einer Wirtszelle mit diesem Plasmid ein Proteinprodukt ergeben wird, das ein in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallendes Polypeptid umfaßt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Polynukleotid-Sequenz bereitgestellt, die eine erste Hybrid-Polynukleotid-Sequenz umfaßt, die als kodierende Sequenz für ein Fusionsprodukt wirkt, das eine an eine Aminosäure-Sequenz eines Trägermoleküls fusionierte Aminosäure-Sequenz eines Immunogens, eine Polynukleotid-Sequenz, die zur ersten Hybrid- Polynukleotid-Sequenz derart ausreichend verwandt ist, daß sie mit der ersten Hybrid- Polynukleotid-Sequenz hybridisieren kann, eine Polynukleotid-Sequenz, die durch Mutation, einschließlich Einzel- oder Mehrfach-Basensubstitutionen, Deletionen, insertionen und Inversionen, mit der ersten Hybrid-Polynukleotid-Sequenz oder hybridisierenden Sequenz verwandt ist oder eine Polynukleotid-Sequenz, die bei Expression für ein Polypeptid kodiert, das eine ähnliche biologische oder immunologische Aktivität zum Fusionsprodukt aufweist, umfaßt.
Bevorzugt handelt es sich bei der Polynukleotid-Sequenz um eine solche Sequenz, bei der die erste Hybrid-Polynukleotid-Sequenz als kodierende Sequenz für die Aminosäure-Sequenz des gesamten, eines Teils, eines Analogons, eines Homologen, eines Derivats oder einer Kombination hiervon von LHRH, fusioniert an die Aminosäure-Sequenz eines Trägermoleküls, bevorzugter LTB, wirkt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Arzneimittel bereitgestellt, das einen erfindungsgemäßen Komplex zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt. Beispiele für pharmazeutisch verträgliche Träger und Verdünnungsmittel umfassen typische Träger und Verdünnungsmittel, wie Tabletten, wäßrige Lösungen, Natriumbicarbonatlösungen und ähnliche Verdünnungsmittel, die Magensäure neutralisieren oder eine ähnliche Pufferkapazität aufweisen, Glykole, Öle, Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl- Emulsionen, und sie umfassen Arzneimittel in Form von Emulsionen, Gelen, Pasten und viskosen kolloidalen Dispersionen. Das Arzneimittel kann in Form einer Kapsel, einer Tablette, einer Retardform oder einer Elixierform oder als Gel, Paste oder als Nasenspray vorliegen, und in dieser Form kann es als Aerosol vorliegen. Weiterhin kann das Arzneimittel in Form eines zum menschlichen Verzehr geeigneten Lebendkulturnahrung oder als Nahrungsmittel vorliegen.
Erfindungsgemäß wurde weiterhin gefunden, daß die Co-Verabreichung bestimmter Nahrungsmoleküle mit einem erfindungsgemäßen Komplex den Umfang und/oder die Art der Immunantwort auf das Immunogen des Komplexes selektiv modulieren kann.
Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Arzneimittel bereitgestellt, das den erfindungsgemäßen Komplex zusammen mit einem Nahrungsmolekül umfaßt, wobei das Nahrungsmolekül selektiv den Umfang und/oder die Art der Immunantwort auf das Immunogen des Komplexes modulieren kann.
Das erfindungsgemäß einsetzbare Nahrungsmolekül umfaßt basische, neutrale und saure Aminosäuren, beispielsweise Arginin, Histidin, Lysin, Alanin, Cystein, Cystin, Glycin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, Asparaginsäure, Glutaminsäure; wasserlösliche und -unlösliche Vitamime, beispielsweise Thiamin. Riboflavin, Pyridoxal, Cyanocobalamin (Vit. B&sub1;&sub2;), Ascorbinsäure (Vit. C), Vit. D&sub2; usw. - Ergosterol, Vit. E, Vit. A, Vit. K usw.; Zucker einschließlich Monosaccharide, z. B. Galactose, Mannose, Marmitol, Sorbitol, Glukose, Xylose, Allose, Altrose, Arabinose, Digitoxose, Erythrose, Fructose, Lyxose, Muraminsäure, Mannose, Pyruvinsäure, Ribose, Tagatose, Talose und die amidierten und N-acetylierten Derivate hiervon; Oligosaccharide, z. B. Lactose, Maltose, Melibiose, Sucrose, Cellubiose, N,N-Diacetylchitobiose, Gentobiose, Isomaltose, Lactobionsäure, Trehalose, Turanose; und Nahrungsmineralien und -Kofaktoren wie Mangan, Magnesium, Zink, Calcium und Eisen.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Bereitstellung eines Komplexes der vorliegenden Refunding bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schleimhaut-Verabreichung eines erfindungsgemäßen Komplexes zusammen mit einem Nahrungsmolekül umfaßt, das zum Modulieren des Umfangs und/oder der Art der Immunantwort des Immunogens in der Lage ist.
Die Erfindung stellt weiterhin die orale Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittel bereit, um eine Antwort auf das aktive Molekül im Wirt hervorzurufen. Eine derartige Antwort kann dann, wenn das aktive Molekül ein Antigen oder Hapten ist, eine systemische und/oder Schleimhaut-Immunantwort sein. Falls das aktive Molekül LHRH oder ein Derivat, Analogon, Homolog, Teil oder Kombination hiervon von LHRH ist, wird die Antwort eine Hemmung der Gonadenfunktion im Wirt sein. Wenn das orale Arzneimittel ein Nahrungsmolekül gemäß der Erfindung enthält, stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verstärkung der Antwort des Wirts auf das aktive Molekül bereit, wobei das Verfahren die Verabreichung eines derartigen oralen Arzneimittels an den Wirt umfaßt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1 zeigt die N-terminale Aminosäure-Sequenz der 987P-Pilin-Untereinheit im Vergleich mit der N-terminalen Aminosäure-Sequenz anderer Pilinproteine.

Möglichkeiten zur Durchführung der Erfindung

Materialien

Lektine wurden von der Firma Sigma Chemical Co. bezogen. Inaktivierte Influenza-Vakzine wurde von den Commonwealth Serum Labs. (Australien) bezogen. Zucker und Vitamine wurden von den nachfolgenden Quellen bezogen: Lactose (AR-Qualität) - Ajax Chemicals, Sydney, Australien; Fructose D(-), Mannose D(+), Sorbitol und Xylose D(+) (alle AR-Qualität) - B. D. H. Chemicals Ltd. Poole, England; Melibiose D(+) - Sigma Chemicals Co., St. Louis, Miss.; Retinal (Vit. A-Aldehyd) - Fluka AG, Chemicals, Fabrik Buchs, Schweiz; Thiannin - HCl (Vit. B1), Riboflavin (Vit. C), Pyridoxal (Vit. B6), Cyanocobalamin (Vit. B12), L-Ascorbinsäure (Vit. C), Ergosterol (Pro Vit. D) und dl-a-Tocopherol (Vit. E) - Sigma Chemical Co., St. Louis, Miss.

Bakterienstämme und Medien

Die in diesen Versuchen verwendeten Stämme E. coli K99, 987P und LIB sind in der Tabelle 1 angegeben und wurden von Dr. Susan Clark (Molecular Biology Laboratory Biotechnology Australia) freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Die Kulturen wurden bei 37ºC (falls nicht anders angegeben) unter Schütteln in Luria-Nährlösung (LB) oder ohne 1 mM Isopropylthio-n- D-galacto- pyranosid (IPTG) in der angegebenen Weise gezogen (Tabelle 1). Salmonella typhimurium wurde bei 37ºC unter Schütteln in LB plus 0,2% Glycerin gezogen. Tabelle 1

+ einschließlich c 1 mM IPTG

Reinigung von Antigenen

Pili-Präparation

E. coli, die die klonierten Pili, die unter Verwendung von radioaktiv markiertem Antiserum nachgewiesen wurden, exprimieren, wurden während der logarithmischen Phase des Wachstums abgeerntet. Die Kulturen wurden 30 Minuten lang bei 60ºC erhitzt, wonach die Organismen durch Zentrifugation pelletiert wurden (3.000 · g, 30 Min., 4ºC). Der Überstand wurde auf seinen Pili-Gehalt durch 12,5% SDS-PAGE unter Verwendung einer Modifikation des Verfahrens von Laemmli (Laemmli, 1970; Salit et al., 1980) überprüft.
K99-Reinigung: Der Kulturüberstand wurde auf einen pH-Wert von 9,7 mit 10 N NaOH eingestellt und bei Raumtemperatur (R. T.) 10 Minuten lang gerührt. Das die Pili enthaltende entstandene Präzipität wurde durch Zentrifugation (3.000 · g, 30 Min., 4ºC) wiedergewonnen und in 100 ml destilliertem H&sub2;O (dH&sub2;O), pH 7,2, resuspendiert. Dieses Verfahren wurde zwei Mal wiederholt.
987P-Reinigung: Die verwendeten Verfahren entsprachen den oben beschriebenen Verfahren, mit der Ausnahme, daß die Pili-Präzipitation durch Einstellung des pH-Werts auf 3,9 mit Eisessig durchgeführt wurde.

Hydroxylapatit-Chromatographie

Hydroxylapatit (HA) (DNA-Gütequalität Bio-Gel HTP, Bio-Rad) wurde in einem Überschuß von dH&sub2;O vorsichtig gequollen, und nach kurzer Zeit (< 2 Min.) wurden die feinen Teilchen vorsichtig dekantiert. Frisches dH&sub2;O wurde zugegeben und zur vorsichtigen Resuspension des Gels verwendet, wonach die feinen Teilchen wiederum dekantiert wurden. Dieses Verfahren wurde mehrmals wiederholt. Eine Säule (30 · 5 cm) wurde mit einer Aufschlämmung aus etwa 30% HA gefüllt und durch die Schwerkraft absetzen gelassen. Durch Hindurchleiten von dH&sub2;O durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 16 ml/h, bis die Gelbettdichte stationär war, wurde eine dichte Packung erreicht. Proben (100 ml), entweder von K99 oder 987P, wurden mit Fließgeschwindigkeit von nicht über 30 ml/h aufgetragen. Die Säule wurde dann mit dH&sub2;O gewaschen, bis im Durchfluß bei 280 nm kein Protein mehr nachweisbar war. Die Pili wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/h unter Verwendung eines linearen Gradienten aus 15 bis 250 mM Natriumphosphat, pH 7,5, eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt und durch SDS- PAGE geprüft. Der Pili-Peak wurde gewonnen und vereinigt.

Ionenaustausch-Chromatographie

Die vereinigten Fraktionen der K99- und 987P-Pili (aus der HA-Chromatographie) wurden mit NaOH (pH 9,7) bzw. Eisessig (pH 3,9) repräzipitiert. Nach Zentrifugation (3.000 · g, 10 Min.) wurden die die Pili enthaltenden Pellets in SO mM Citrat-Puffer, pH 5, 5 (K99) und 50 mM Tris- HCl, pH 8,5 (987P) vor dem Aufladen auf die mit den gleichen Puffern äquilibrierten Ionenaustausch-Säulen resuspendiert. K99 und 987P wurden auf cm- bzw. DEAE-Säulen mit einer Fließgeschwindigkeit von 1.000 ml/h geladen, mit 2 Volumina Ladepuffer gewaschen, und die Pili wurden unter Verwendung eines linearen Gradienten von 10 mM bis 0,5 M NaCl in den Äquilibrierungspuffern eluiert. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE auf ihren Proteingehalt und auf LPS-Kontamination gemäß dem Verfahren von Tsai und Frasch (1982) überprüft.

LTB-Reinigung

Drei Liter LTB-Überstand wurden mit dH&sub2;O auf 61 verdünnt. Der pH-Wert wurde mit Eisessig auf 6,5 eingestellt, und der Überstand wurde auf eine 5 · 30 cm-Säule mit Fastflow-CM- Sepharose, äquilibriert mit 10 mM Phosphatpuffer, pH 6,5, mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,21/h aufgeladen. Die Säule wurde dann mit 400 ml 10 mM Phosphatpuffer, pH 6,5, gewaschen, und das gebundene Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 10-500 mM NaCl in 10 mM Phosphat, pH 6,5, eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt und durch SDS- PAGE analysiert; der LTB-Peak wurde vereinigt.

Flagellen-Isolierung

Bakterienkulturen in der späten logarithmischen Phase wurden durch Zentrifugation (3.000 · g, 15 Min., 4ºC) pelletiert. Die Zellen wurden dann in Kochsalzlösung resuspendiert und 30 Minuten lang bei 60ºC erhitzt, worauf sich ein Zentrifugationsschritt (3.000 · g, 10 Min., 4ºC) anschloß. Der Überstand wurde durch Zugabe einer 100% TCA (w/v)-Lösung präzipitiert, um eine Endkonzentration von 10% (w/v) zu erhalten und 10 Minuten lang bei 1.500 · g, 4ºC, zentrifugiert. Das Pellet wurde in einem kleinen Volumen von 1 mM Tris, pH 8,8, resuspendiert und bis zur Lösung mit Ultraschall behandelt. Ethanol wurde auf eine Endkonzentration von 80% (v/v) zugegeben, und die Flagellen wurden bei 2.000 · g, 10 Minuten bei 4ºC abzentrifugiert. Das Pellet wurde in Aceton resuspendiert, in Suspension ultraschallbehandelt und durch Zentrifugation repräzipitiert (5.000 · g). Schließlich wurde das Pellet durch Kochen in 10% SDS und 50 mM EDTA in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, vor der Sephacryl S-200-Chromatographie in Lösung gebracht.

Flagellen-Reinigung

Nach 15 minütigem Kochen wurden die Flagellen durch 5 minütige Zentrifugation in einer Beckman-Berichtop-Mikrofuge zur Entfernung nichtlöslichen Materials; geklärt. Der Überstand wurde auf eine 2,5 · 80 cm Sephacryl-5200-Säule (Pharmacia, Fine Chemicals), äquilibriert, mit 20 mM Tris, pH 8,8, 0,1% SDS und 10 mM EDTA, aufgetragen und unter Verwendung des gleichen Puffers eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt und durch SDS-PAGE analysiert. Schließlich wurde der Flagellen-Peak vereinigt und mit 10% (Endkonzentration) TCA präzipitiert, worauf sich Zentrifugation, Ethanol- und Acetonwaschungen, wie oben beschrieben, anschlossen. Das so erhaltene Pellet wurde in dH&sub2;O resuspendiert.

Lipopolysaccharid (LPS)-Reinigung

Übernachtkulturen von S. typhimurium wurden mit 0,5 M CaCl&sub2; in 100 mM Citrat, ph 3,0, und 5% Zwittergent 3,12 (w/v) (Calbiochem.) enthaltendem 20% Ethanol (v/v) extrahiert (30 Min., Raumtemperatur). Die Bakterien wurden durch Zentrifugation (3.000 · g, 10 Min., 4ºC) pelletiert, und das Pellet wurde in 50 mM EDTA, pH 8,0, resuspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gründlich gerührt. Nach Entfernen der Bakterien durch Zentrifugation wurde zum Überstand Ethanol auf eine Endkonzentration von 75% zugegeben. Das Proteinmaterial wurde pelletiert, und der Überstand wurde auf 90% Ethanol eingestellt. Das gebildete Präzipitat wurde pelletiert und mit Aceton gewaschen, repräzipitiert und schließlich in dH&sub2;O resuspendiert. Die Präparation wurde auf ihren Zuckergehalt unter Verwendung des Anthron-Reagenz (Herbert et al., 1985) geprüft und auf das Vorliegen kontaminierender Proteine unter Verwendung von SDS-PAGE geprüft. Kommerzielles E. coli LPS (Sigma Chemical Co.) wurde als Standard in beiden Tests verwendet. Gele wurden auf LPS unter Verwendung einer Silberfärbung gemäß dem Verfahren von Tsai und Frasch (1982) gefärbt.

Präparation von Polysaccharid (PS)

Lipid A wurde aus der S. typhimurium LPS-Präparation durch Inkubieren des LPS mit 1 M Eisessig und Erhitzen bei 100ºC für 2-5 h gespalten. Lipid A wurde dann durch Zentrifugation bei 3.000 · g 14 Min. bei 4ºC entfernt.

Beschreibung gereinigter Antigene

SDS-PAGE-Analyse gereinigter K99- und 987P-Pilizubereitungen ergab das Vorliegen einer einzelnen Bande, die bei 17.500 bzw. 20.000 Mol.-Gew. unter reduzierenden Bedingungen lief (Fig. 1). Dies stimmt mit den veröffentlichten Daten von Isaacson und anderen Autoren (Isaacson & Richter, 1981; Morris et al., 1980; de Graafet al., 1981; Fusco et al., 1978) überein. Die Leichtigkeit der Präzipitation dieser Proteine bei pH-Werten von 9,7 und 3,9 (für K99 bzw. 987P) legt es nahe, daß sich der pl-Wert dieser zwei Proteine in diesem Bereich bewegt (vergleiche Isaacson & Richter, 1981; de Graafet al., 1981). Eine Silberfärbung dieser Zubereitungen zeigte, daß sie nur wenig (< 1 ug / 100 ug Protein) oder keine LPS-Kontamination enthielten.

Bestimmung der aminoterminalen Sequenz von 987P

Die aminoterminale Mikrosequenzierung wurde für die Anmelder von der Firma Biotechnology Research Enterprises S. A. Pty. Ltd., Adelaide, Süd-Australien, durchgeführt. Eine 100 nMol Probe von wie oben beschrieben gereinigtem 987P wurde getestet. Die aminoterminale Sequenz von 987P wird mit der veröffentlichten K99-Sequenz verglichen und ergibt keine Homologie zwischen diesen beiden Molekülen (Fig. 1) (Gaastra und de Graaf, 1982).
Es wurde weiterhin gefunden, daß gereinigtes LTB und S. typhimurium-Flagellen keine LPS- Kontaminationen enthielten und daß sie als Monomere mit scheinbaren Molekulargewichten von 12.500 bzw. 52.000 wanderten, wenn sie durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen geprüft wurden.
Silber-gefärbte SDS-PAGE-Gele aus gereinigtem LPS ergaben keine nachweisbare Proteinkontamination. Der Komplex-Zuckergehalt, getestet durch Anthron-Reaktion, betrug 2 mg/ml. Es wurde weiterhin gefunden, daß das Lipid A-freie Polysaccharid 2 mg/ml Polysaccharid enthält, und daß es keine Lipid-Kontamination enthielt, konnte dadurch gezeigt werden, daß es auf SDS- PAGE nicht wanderte (gezeigt in silbergefärbten Gelen).

Dinitrophenylierung von Antigenen

K99, LTB und Lektine wurden nach dem Verfahren von Little und Eisen (1967) dinitrophenyliert. Kurz gesagt wurden Träger (in 0,1 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,5) mit einer 0,1 M DNFB-Lösung (in Aceton) über Nacht bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Proteine wurden dann gründlich gegen den Kupplungspuffer dialysiert. Die vorherigen Untersuchungen zeigen, daß 987P keine freien, zur Kupplung freiliegenden Aminogruppen aufweist; deshalb wurde ein Diamino-Spacer zuerst an die freien Carboxylreste des Proteins wie folgt gebunden: 10 mg an gereinigtem 987P wurden bei pH 3,9 durch Zugabe von Eisessig präzipitiert. Die Pili wurden dann durch Zentrifugation bei 3.000 · g, 10 Minuten bei 4ºC entfernt. Das Pellet wurde in dH&sub2;O resuspendiert, und der pH-Wert wurde mit 1 N NaOH auf 6,5 erhöht. Die Pililösung wurde dann mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-HCl (EDAC, Bio Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien) auf eine Endkonzentration von 0,5 mM in Gegenwart von 20 mM 1,2- Diaminoethan (BDH Chemicals Litd., Poole, England) über Nacht bei Raumtemperatur (20 bis 23ºC) umgesetzt. Das amino-substituierte 987P wurde 24 Stunden lang gegen zwei Mal gewechselten 0,1 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,5, dialysiert, bevor es in den nachfolgenden Konjugationsschritten verwendet wurde. Die Lectin-Bindungsstellen wurden während ihrer Reaktion mit DNFB durch die Zugabe der Lectin-spezifischen Zucker geschützt. Demnach wurden 50 mM Lösungen von D-Glucose, D-Mannose, D-Glucose, N-Acetyl-D-galactosamin, D- Galactose, N-Acetyl-D-galactosamin, D-Gal(1-3)-D-galN-Ac und L-Fucose wurden zu den nachfolgenden Lectinen zugegeben: Concanavalin A, Pokeweed-Mitogen, Lens culinaris, Helix pomatia, Phaseolus vulgaris, Glycine max, Arachis hypogea bzw. Ulex europeus.

Antigengabe

Weibliche C57BL/6J-Mäuse (18-22 g) wurden vom Animal Resources Centre (Perth, West- Australien) gezogen. Alle Mäuse wurden 3 bis 4 Stunden vor der oralen oder intramuskulären (i. m.) Verabreichung von Antigenen hungern gelassen. Den Mäusen wurde Antigen in den entsprechenden Konzentrationen in 0,5 ml 0,1 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,5, unter Verwendung einer speziell hergestellten Verabreichungsnadel zugeführt. Parallele Antigendosen wurden i. m. in 0,1 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung in das linke hintere Bein injiziert. Gruppen von 5 Mäusen, die entweder oral oder i. m. Antigen erhielten, wurden zwei identische Antigendosen am Tag 0 und am Tag 14 verabreicht. Aus dem retro-orbitalen Plexus wurde am Tag 14 und am Tag 21 je eine Blutprobe entnommen (ungefähr 0,5 ml). Die Mäuse wurden dann durch Bruch der Halswirbelsäule getötet, und Waschungen des Eingeweides wurden am Dünndarm in der nachfolgenden Weise durchgeführt. Der Dünndarm wurde sorgfältig entfernt, und eine kleine Menge Waschpuffer (1,0 ml/30 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,9% NaCl, 50 mM EDTA plus 1,0% Tween 20) wurden in das Lumen des Eingeweides über eine stumpfendige Zufuhrnadel eingeführt. Nach vorsichtigem Kneten des Darms wurde der Inhalt durch Zeigefinger und Daumen herausgepreßt. Die so erhaltenen Eingeweidewaschlösungen wurden zur Entfernung der Festbestandteile zentrifugiert und bis zum Testen bei -20ºC gelagert. Man ließ die Blutproben bei 4ºC vor Entfernen des Serums bei 4ºC gerinnen, und das ganze wurde bei -20ºC gelagert.
Enzym-gekoppelter Immunosorbensassay (ELISA)
Der ELISA zur Bestimmung der Antikörpertiter wurde wie vorher von Russel-Jones et al., (1984), beschrieben, durchgeführt.

Beispiel 1

Identifizierung von Molekülen, die als Schleimhautimmunogene wirken

Das mögliche Potential einer Anzahl von Molekülen, von denen bekannt ist, daß sie zur Bindung der Intestinalschleimhaut und zur Stimulierung der Produktion einer Immunantwort nach oraler Verabreichung dieser Moleküle befähigt sind, wurde überprüft. Die von diesen Molekülen hervorgerufene Antwort wurde mit der nach einer ähnlichen Zufuhr anderer Moleküle ohne Schleimhautbindungsfunktion verglichen.
Wie aus der Tabelle 1.1 hervorgeht, wurden drei breite Proteinklassen in diesen Versuchen nachgewiesen: solche, die eine Serum- und eine Intestinalantwort erzeugten, K99, 987P, LTB, Influenza-Vakzine und die verschiedenen Lektine (Klasse 1) (diese werden nachfolgend als Schleimhaut-Immunogene bezeichnet), solche, die nur eine Serumantwort hervorriefen (LPS) (Klasse II) und solche, die weder eine Serum- noch eine Intestinalantwort bei den untersuchten Dosen hervorriefen (Flagellen, BSA und P. S.) (Klasse III). Bei den Klasse I-Antigenen war 987P ein signifikant überlegener Stimulator eines IgA-Antikörpers (ab) (48,5 + 1,8) im Vergleich zu LTB (12,2 ± 4,4) oder K99 (3,2 ± 4,9). Weiterhin stimulierte 987P ebenfalls gastrointestinales IgG (10,8 ± 1,76) in einem größeren Ausmaß als entweder K99 (3,0 ± 5,3) oder LTB (1,0), und 987P war zur Stimulation von Serum-IgA (10,8 + 8, 8) in der Lage. Alle vier Klasse I-Antigene stimulierten Serum-IgG zu ähnlichen Graden (Tabelle 1.1).
Das Klasse II-Antigen, LPS, stimulierte eine geringe Serum-IgG-Antwort (12,1 ± 1,0) ohne gleichzeitige IgA- oder Gastrointestinal-Reaktivität. Schließlich induzierten BSA, Flagellen und der Polysaccharidrest von LPS - Klasse III-Antigene - weder Serum noch Intestinal-IgG oder - IgA. Repräsentative Proben aus allen drei Klassen, K99, 987P, LTB, LPS und Flagellen, wurden intramuskulär verabreicht und sowohl auf ihre Serum- als auch Intestinalantwort gescreent (Ta belle 1.2). Die Klasse I- und II-Antigene ergaben ähnliche Serum-IgG-Antworten, produzierten jedoch weder Serum-IgA- oder Intestinal-IgG/IgA-Antikörperantworten. Nur die Anti-LPS- Serum-IgG-Antwort schien durch i.m.-Immunisierung signifikant verbessert zu sein.
987P, K99 und LTB wurde je weiterhin in Dosisantwortstudien sowohl nach oraler als auch i. m.- Verabreichung untersucht. Wie aus den Tabellen 1.3 und 1.4 zu ersehen ist, ergab 987P konsistent höhere Titer als entweder K99 oder LTB, und zwar ohne Rücksicht auf den Verabreichungsweg. Interssanterweise wies das Klasse I-Antigen - LTB - eine glockenförmige Dosisantwort mit einem Plateaumaximum zwischen 10 und 50 ug auf. Keine der anderen Klasse I-Antigene produzierte diese Wirkung, auch nicht LTB, wenn es i. m. verabreicht wurde. Eine orale Verabreichung aller Klasse I-Antigene (Ag) ergab höhere Intestinal-IgA-Ab (S-IgA)-Spiegel über den breiten Bereich an getesteten Dosen. Ein Vergleich zwischen den zwei Verabreichungswegen legt nahe, daß, obwohl eine i. m.-Injektion durchweg höhere Titer ergab, eine orale Verabreichung von Schleimhautantigenen in vergleichbaren Antikörperproduktionsspiegeln resultierte zu solchen, die über den i. m.-Weg zwischen 10 und 100 ug Antigen für die Klasse I- und II-Antigene erhalten wurden. Tabelle 1.1 Immunreaktionen auf oral präsentierte Antigene
* Der reziproke Wert der Antiserumverdünnung, der eine ELISA-Ablesung von 0,5 nach 45 Minuten bei 37ºC ergab. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert, der aus 5 Mäusen ± 1 Standardabweichung erhalten wurde.
** Jedes Lectin war mit 4 DNP-Molekülen/Mol Lectin substituiert. Der ELISA-Titer repräsentiert die Anti-DNP-Antwort, bestimmt gegen DNP-BSA. Tabelle 1.2 Immunreaktionen auf intramuskulär präsentierte Antigene
* siehe Tabelle 1.1 Tabelle 1.3 Dosisantwort auf oral präsentierte Antigene
* vergleiche Tabelle 1.1 Tabelle 1.4 Dosisantwort auf intramuskulär präsentierte Antigene
* vergleiche Tabelle 1.1

Beispiel 2

Die Wirkung von Nahrungsmolekülen auf die Immunantwort gegen Schleimhautimmunogene bei oraler Präsentation.
Erste Untersuchungen im Labor unter Verwendung männlicher Swiss-Auszuchtstamm-Mäuse legten nahe, daß es möglich war, die Immunantwort auf oral präsentierte Antigene durch Koverabreichung bestimmter Nahrungsmoleküle zu verändern. Demnach wurden die Schleimhautimmunogene K99, 987P und LTB an Mäuse in Gegenwart einer Anzahl von Nahrungszuckern und -vitaminen verfüttert. Da von den verschiedenen Antigenen bekannt war, daß sie an verschiedene Moleküle auf der Oberfläche des Intestinalepithels binden, und da bekannt ist, daß über die Länge des Darms eine Veränderung in der Verteilung der Proteine und der Glykolipide und eine Veränderung in der Verteilung der Absorptionszellen vorliegt, wurde die Überlegung angestellt, ob es möglich wäre, die Aufnahme von an diese Zellen gebundene Moleküle durch Präsentieren der Antigene in Gegenwart des spezifischen, normalerweise von diesen Zellen aufgenommenen Nahrungsmoleküls zu stimulieren. Eine Erweiterung für dieses Argument würde sein, daß das Profil stimulierender Moleküle von Antigen zu Antigen wechseln würde.
Die in den Tabellen 2.1, 2.2 und 2.3 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß, obwohl die meisten der Vitamine und Zucker einen gewissen Einfluß bei der Modulation der Immunantwort auf K99, 987P und LTB aufwiesen, einige Nahrungsmoleküle bezüglich ihres Einflusses auf die Art des Schleimhautimmunogens selektiv erscheinen, jedoch auch dahingehend, ob sie hauptsächlich eine sekretorische oder Serumantwort induzierten. Demnach war die Serumantikörperantwort auf K99 durch Koverabreichung von Vit. B12 oder Melibiose signifikant erhöht (p< 0,05), unverändert bei Verabreichung mit Vit. B2, Vit. D, Vit. E, Fructose oder Mannose und in unterschiedlichem Ausmaß erniedrigt mit Vit. A, Vit. B1, Vit. B6, Vit. C, Lactose, Sorbitol und Xylose (Tabelle 2.1).
Im Gegensatz dazu war die Serumantikörper-Antwort auf orale Verabreichung von 987P (Tabelle 2.2) erhöht, wenn 987P mit Vit. B6, Vit. B12, Vit. C, Vit. E, Fructose oder Mannose verabreicht wurde, sie war unverändert bei Koverabreichung mit Vit. A, Vit. B1, Vit. B2, Lactose, Melibiose, Sorbitol und Xylose, und sie war erniedrigt in Gegenwart von Vit.D. LTB wies andererseits ein einheitliches Profil bezüglich des Einflusses der Kozufuhr von Nahrungsmolekülen auf die Serum-Antikörperspiegel auf. Die Ergebnisse in der Tabelle 2.3 zeigen deutlich einen erhöhten Serumtiter auf LTB in Gegenwart von Vit. A, Vit. B2, Vit. D, Fructose, Mannose und Xylose. Keine oder nur geringe Veränderungen wurden mit Vit. B1, Vit. B12, Vit. C oder Melibiose gefunden, und mit Vit. B6, Vit. E, Lactose, Melibiose und Sorbitol wurde eine fast vollständige Hemmung gefunden. Die Hemmung einer Immunantwort, die mit Vit. B6, Lactose, Melibiose und Sorbitol gefunden wird, wird wohl auf die Strukturähnlichkeiten dieser Verbindungen zu Galactose zurückzuführen sein, von der beansprucht wird, daß sie die spezifische Zuckerdeterminante auf dem GMl-Gangliosid ist, an das LTB bekannterweise bindet. Diese Ergebnisse legen es sehr nahe, daß K99, 987P und LTB an einzelne Zellen des Mikrovillus- Epithels binden und aufgenommen werden.
Dosisantwort-Versuche (Tabellen 2.4, 2.5 und 2.6) zeigen, daß es möglich ist, den sekretorischen Teil des Immunsystems ohne gleichzeitige Stimulierung von Serumantilkörpern zu stimulieren, oder umgekehrt die Serumantwort ohne Beeinflussung des sekretorischen Antikörperspiegels durch einfache Zugabe von Nahrungsmolekülen zu den oral präsentierten Schleimhautimmunogenen zu erhöhen. Diese Kozufuhr großer Vit. B12- oder Melibiose-Dosen mit K99 führt jeweils zu einer zwei- bis achtfachen Erhöhung des Serumantikörperspiegels mit einer geringen gleichzeitigen Zunahme im sekretorischen Antikörperspiegel. Im Gegensatz dazu wird eine Kozufuhr von Vit. D in zunehmenden Dosen zu einer Verminderung der Serumantikörper und zu einer Erhöhung des sekretorischen Antikörpers führen. Bestimmte Nahrungsmoleküle ergeben andererseits ebenfalls eine Stimulierung sowohl der sekretorischen als auch der Serumantikörpertiter, was durch eine achtfache Zunahme der Serumantikörper und eine tausendfache Zunahme von S-IgA bei Kozufuhr von Vit. C mit 987P gezeigt wurde.
Versuche, bei denen die Schleimhautimmunogene i. m. zusammen mit Vitaminen oder Zuckern injiziert wurden, zeigten, falls überhaupt, nur einen geringen Einfluß auf die Immunantwort, wodurch gezeigt wurde, daß die Veränderung in der Antwort aufgrund der Kozufuhr dieser Moleküle mit den Schleimhautimmunogenen an oder nahe an der Absorptionsstelle dieser Moleküle stattfinden muß und nicht so sehr direkt am Immunsystem (Tabelle 2.7). Tabelle 2.1 Einflüsse von Nahrungsmolekülen auf die Immunantwort von oral verabreichtem K99 (20 ug)*
* Der reziproke Wert der Antiserumverdünnung, der eine ELISA-Ablesung von 0,5 nach 45 Minuten bei 37ºC am Tag 21 nach Immunisierung ergab. Jeder Wert ist der Mittelwert von fünf Mäusen ± 1 Standardabweichung.
** Jeder Wert ist der Mittelwert von 15 Mäusen ± 1 Standardabweichung. Diese Moleküle wurden ebenfalls in Dosisantwortversuchen getestet. Tabelle 2.2 Einflüsse von Nahrungsmolekülen auf die Immunantwort auf oral verabreichtes 987P (20 ug)*
* vergleiche Tabelle 2.1
** vergleiche Tabelle 2.1 Tabelle 2.3 Einflüsse von Nahrungsmolekülen auf die Immunantwort bei oraler LTB-Gabe (20 ug)*
* vergleiche Tabelle 2.1
** vergleiche Tabelle 2.1 Tabelle 2.4 Einfluß von oral verabreichten Nahrungsmolekülen auf die Immunantwort gegen ein orales Antigen (K99) *
~, Dosis in ug, Vitamine; +, Dosis in mM, Zucker.
* vergleiche Tabelle 2.1 Tabelle 2.5 Einfluß von oral verabreichten Nahrungsmolekülen auf die Immunantwort gegen ein orales Antigen (987P)
~, Dosis in ug, Vitamine; +, Dosis in mM, Zucker.
* vergleiche Tabelle 2.1 Tabelle 2.6 Einfluß von oral verabreichten Nahrungsmolekülen auf die Immunantwort gegen ein orales Antigen (LTB) *
~, Dosis in ug, Vitamine; +, Dosis in mM, Zucker.
* vergleiche Tabelle 2.1 Tabelle 2.7 Einfluß der Dosisveränderung von koverabreichten Nahrungsmolekülen auf die Immunantwort gegen intramuskulär präsentiertes Antigen K99, 987P*
+, kein Serum IgA, Intestinal-IgG oder Intestinal-IgA wurde nachgewiesen
* vergleiche Tabelle 2.1

Beispiel 3

Die zwei vorher dargestellten Beispiele zeigen, daß geringe Dosen oral verabreichter Schleimhaut-Antigene die Fähigkeit aufweisen, signifikante IgG-Serumtiter mit oder ohne parallele Erhöhung der sekretorischen IgA-Antikörperspiegel zu induzieren. Weiterhin wurde gezeigt, daß die Immunantwort durch die Koverabreichung von Nahrungsmolekülen angepaßt werden kann. Die Erkenntnis, daß die in der ersten Untersuchung verwendeten Lectine als Träger wirksam waren, um eine Anti-DNP-Antwort vorzubereiten, legt nahe, daß die M< iglichkeit für wenigstens einige dieser Schleimhaut-Antigene besteht, als "Träger" für andere Antigene zu wirken, um hierdurch die relativ schwache Aufnahme der meisten Antigene über dass Intestinal-Epithel zu verbessern.
Die nachfolgende Untersuchung wurde vorgenommen, um zu untersuchen, ob dieses Trägerpotential existiert und um einige der verschiedenen Parameter für seine erfolgreiche Verwendung als Mittel zur Formulierung neuer und effizienterer oraler Vakzinen und/oder oral verabreichter Arzneimittel zu etablieren.

Material und Methoden

Konjugation von Antigenen an die Schleimhaut-Immunogene Dinitrophenylierung von Trägern

DNFB wurde mit Lectinen und einem Träger in der oben beschriebenen Weise umgesetzt (vergleiche allgemeine Methoden).

Lipopolysaccharid (LPS)- und Polysaccharid (PS)-Konjugation

LPS und PS von S. typhimurium wurden in der oben beschriebenen Weise gereinigt (beiliegende Beispiele). LPS und PS wurden an das MI unter Verwendung des Periodat-Verfahrens gekoppelt (Avrameus und Ternynck, 1971).

Glutaraldehyd-Kupplung

Das Luteinisierende Hormon-Releasing Hormon (LHRH), Rinderserumalbumin (BSA) (von der Firma Sigma Chemical Co., St. Louis, Miss.) und Flagellen von 5. typhimurium wurden einzeln an MI unter Verwendung des zweistufigen Glutaraldehyd-Verfahrens von Arameus et al. (1978) gekoppelt. Kurz gesagt wurde das erforderliche Protein mit 0,2% Glutaraldehyd 2 Stunden lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Proteine wurden übernacht gegen Carbonat/Bicarbonat- Puffer, pH 9,5, dialysiert, und dann wurde MI in einem Molverhältnis von 5, 10, 20 und 40 : 1, Antigen : MI, in der erforderlichen Menge zugegeben und 24 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Schließlich wurde Ethanolamin (Sigma) auf eine Endkonzentration von 0,1 M (1 Stunde, Raumtemperatur) zugegeben und anschließend übernacht bei 4ºC gegen 0,1 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,5, dialysiert.

Peroxidase-konjugierte Lectine

Kommerzielle Zubereitungen von Peroxidase, konjugiert an die Lectine von Glycine max, Arachis hypogea, Tetragonolobus purpureas und Concanavalin A, wurden von der Firma Sigma bezogen.

Chemische Synthese von LHRH-Konjugaten

LHRH wurde an LTB unter Verwendung des oben beschriebenen Glutaraldehyd-Verfahrens konjugiert. Glutaraldehyd-aktiviertes LHRH wurde zu LTB in einem Verhältnis von 20 : 1, LHRH : LTB, zugegeben, und man ließ die Kopplung übernacht bei Raumtemperatur geschehen. Das entstandene Konjugat wurde gründlich gegen 0,1 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,5, vor der Verabreichung dialysiert. Die Kontrollen bestanden aus LHRH oder LTB, die mit Glutaraldehyd allein behandelt worden waren. Tabelle 3.1 Antikörperantwort gegen DNP-modifizierte Schleimhautimmunogene.
* Das Reziproke der Antiserumverdünnung, das eine ELISA-Ablesung von 0,5 nach 45 Minuten bei 37ºC ergab. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert von 5 Mäusen ± 1 Standardabweichung.
** Jedes Lectin wurde mit 4 DNP-Gruppen substituiert. Tabelle 3.2 Trägerpotential von K99 für verschiedene Antigene
* vergleiche Tabelle 3.1
** Gewichtsverhältnis. Tabelle 3.3 Trägerpotential von 987P für verschiedene Antigene
* vergleiche Tabelle 3.1
** Gewichtsverhältnis Tabelle 3.4 Einflüsse von Dosisänderungen eines substituierten Trägers auf die Immunantwort
* vergleiche Tabelle 2.1 Tabelle 3.5 Einfluß von chemisch konjugiertem LHRH-LTB auf die Fortpflanzungsorgane der weiblichen Maus*
* Die Tiere erhielten das Antigen an den Tagen 0 und 14. Am Tag 28 wurden die Mäuse getötet, und ihre Reproduktionstrakte wurden gewogen. Tabelle 3.6 Einfluß genetisch konstruierter LHRH-Konjugate auf die Reproduktionsorgane der weiblichen Maus
Für alle intramuskulären Injektionen wurden die Antigene in Montanid verabreicht. Im/im- Kontrollen erhielten Montanid/Saline-Mischungen.
* Die Tiere erhielten das Antigen an den Tagen 0 und 14. Am Tag 28 wurden die Mäuse getötet, und ihre Reproduktionstrakte wurden gewogen.

Genetische Fusion von LHRH an β-Galactosidase und LTB

KONSTRUKTION EINES PLASMID-VEKTORS;

DER EIN LTB/LHRH-HYBRID-FUSIONSPOLYPEPTID EXPRIMIERT

1. LTB-kodierende Sequenzen enthaltendes DNA-Fragment

Ein Hind III-Fragment wurde aus einem auf pBR322 basierenden Plasmid erhalten, das das klonierte LTB-Gen enthält (Leong et al., 1985), aus dem Plasmid NP307 im E. coli-Stamm RC411 (Dallus et al., 1979), der unter Verwendung einer Spe I-Stelle nahe am Stop-Codon für LTB und anschließendem Mungbohnen-Nuklease-Verdauung unter Verwendung von Standardbedingungen modifiziert wurde. (Falls nicht anders angegeben, wurden für die rekombinanten DNA- Standardtechniken und für die Nukleinsäure modifizierenden Enzyme die Bedingungen verwendet, die in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch und Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, beschrieben wurden). Hierdurch wurde das normalerweise nach der Aminosäure 123 in LTB zu findende Stop-Codon eliminiert, wobei 9 Basenpaare der DNA entfernt und zufällig wie unten gezeigt eine Hind III-Stelle erzeugt wurde:
Größe = 573 Basenpaare
Dieses Fragment wurde in den Vektor pUC13 (Messing, 1983) nach Hind III-Verdau und Phosphatase-Behandlung des Plasmids unter Standardbedingungen ligiert. Dies diente zum Ersetzen des verbliebenen Polylinkerabschnitts von pUC13, einschließlich von F'stI-, SaII-, XbaI-, BamHI-, SmaI-, SstI- und EcoRI-Stellen stromabwärts von der ein DNA-Insert enthaltenden LTB-Sequenz.

2. Bildung synthetischer, für LHRH kodierender Oligonukleotide

Zwei Oligonukleotide mit einer Länge von 30 Basen mit unten in A und B beschriebenen Sequenzen wurden entworfen, um überlappende Hybridduplexe, gezeigt in C, zu bilden, was einen Duplex ergibt, der für lineare End- zu End-Repeats der 10 Aminosäuren kodiert, die für das Peptidhormon LHRH kodieren (Schally und Coy, 1983), Role of Peptides and Proteins in Control of Reproduction, McCann und Dhindsa Hsg., Elsevier Science Publishing Co., Inc., Seiten 89-110). In dieser Sequenz ersetzt die Glutaminsäure die normale N-terminale Pyroglutaminsäure.
Die Oligonukleotide wurden 1 h lang bei 40ºC in 50 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, zusammen aneliert, das Ende mit Klenow aufgefüllt, und dann wurde die Mischung in mit SmaI geschnittenem M13 mp18 unter Verwendung von Standardverfahren ligiert. M13-Phagen enthaltende Inserts wurden isoliert, und die DNA-Sequenzen der Inserts wurden durch die Didesoxy-Technik bestimmt. Für das fusionierte Konstrukt wurde eine mit P29 bezeichnete Rekombinante ausgewählt. Ihre DNA-Sequenz ist zusammen mit den Aminosäure-Sequenzen, für die sie kodiert, im Bereich des Inserts an der SmaI-Stelle angegeben. N-Terminus der β-Galactosidase, α-Fragment
Die DNA-Sequenz bestätigte die Insertion von DNA aus den synthetischen Oligonukleotiden, um eine im Leseraster stehende Fusion von ungefähr dreieinhalb Repeats der LHRHkodierenden Sequenz (34 Aminosäuren) einzuführen. Die vollständigen, für LHRH kodierenden Blocks sind durch Pfeile angegeben.
Die replikative Form der DNA von P29 wurde mit EcoRI und HincII (Stellen, die in der obigen DNA-Sequenz angegebenen sind) verdaut, und die Enden wurden unter Verwendung von Standardbedingungen aufgefüllt. Das kleine 140 Basenpaare große Fragment wurde aus einem Polyacrylamidgel isoliert.

3. Konstruktion des LTB/LHRH-Fusionsvektors

Das pUC13-Plasmid, das die LTB-kodierende Sequenz in die HindIII-Stelle insertiert enthält (vergleiche obigen Abschnitt 1), wurde mit SaII verdaut, die Enden wurden aufgefüllt und mit Phosphatase behandelt, wobei je Standardbedingungen verwendet wurden. Die Vektor-DNA wurde dann an das EcoRI/HincII-Fragment aus P29 (obiger Abschnitt 2), dessen Enden aufgefüllt waren, ligiert. Die Fusion sollte die unten gezeigte Aminosäure-Sequenz aufweisen.
aal - 122(lys)-ala-trp-ala-ala-gly-arg-asn-ser-ser-ser-val-pro-LTB-kodierende Sequenz.
leu-arg-pro-gly-[glu-his-trp-ser-tyr-gly-leu-arg-pro-gly]&sub3;-
LHRH
gly-asp-pro-leu-glu-ser-arg-leu
24 Basen nach der LHRH-Sequenz, die die Produktion eines 176 Aminosäure langen Polypeptids mit 122 Aminosäuren von LTB, 34 Aminosäuren, die für den LHRH-Repeat kodieren, und zusätzlichen, aus den benachbarten Bereichen stammenden 20 Aminosäuren definiert, ist ein Stop-Codon angeordnet.
Das korrekte Konstrukt wurde durch Verdau von DNA aus Minipreps mit EcoRI und Suchen nach Plasmiden mit dem entsprechend größeren EcoRI-Fragment gescreent. Die möglicherweise positiven Klone wurden weiterhin auf die Expression dieses Polypeptids, die vom Lac-Promotor von pUC13 gesteuert wird, untersucht. Die Bakterienextrakte wurden auf Polyacrylamidgelen und nachfolgender Übertragung auf Nitrocellulosepapier und Western-Blotting mit gegen ein LTB- und LHRH-Konjugat gerichteten Kaninchen-Antiseren analysiert. Von beiden Antiseren wurde ein Peptid der erwarteten Größe nachgewiesen.

4. Konstruktion des Expressionsplasmids K66 und des Expressionsstammes BTA1185

Ein 573 Basenpaar großes EcoRI-Fragment des pUC13-LTB-LHRH-Fusionsplasmids, das in 3 beschrieben wird, das den kodierenden Abschnitt der LTB-LHRH-Fusion in seiner Gesamtheit enthält, wurde aus einem Agarosegel isoliert und in einen mit EcoRI geschnittenen, phosphatasebehandelten Expressionsvektor pKK223-3 (von Pharmacia) ligiert. Das erhaltene Expressionsplasmid PBTA K66 setzte die Expression des Fusionsproteins unter die Kontrolle des Tac- Promotors, bei dem die Expression mit IPTG induziert wird. Das Plasmid wurde in den E. coli- Wirtsstamm JM101 (SupE, thi, (lac-pro AB) [F' traD36, pro AB lacIq Z M 15) transformiert, um das Wirtsvektor-Expressionssystem BTA1185 zu erhalten.

5. Produktion und Reinigung von LTB/LHRH-Fusionsprotein für Tierversuche

Der LTB(LHRH)3.5 produzierende Stamm wurde wie oben beschrieben wachsengelassen. Nach Induktion mit IPTG für 2 Stunden wurden die Bakterien durch Zentrifugation (3.000 · g, 10 Min. bei 4ºC) pelletiert. Die Bakterien wurden dann in dH&sub2;O resuspendiert und in einer French- Presse lysiert. Nach Entfernen der Bakterientrümmer durch Zentrifugation (18.000 · g, 10 Min. bei 4ºC) wurde der Überstand auf eine Agthio-Galactose-Säule (Sigma) geladen. Das Fusionsprotein wurde dann mit 0,5 M Galactose eluiert und gegen 0,1 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,5, dialysiert.

Antigenverabreichung und Bestimmung der Immunantwort

Alle oralen Präsentationsverfahren, Antikörpersammlungen und ELISA-Bestimmungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt.

Ergebnisse

Demonstration des Trägerpotentials der Schleimhautimmunogene

Alle getesteten Schleimhautimmunogene zeigten die Fähigkeit, das kovalent angelagerte Hapten DNP durch die Intestinal-Schleimhaut effizient zu transportieren und eine Serum-Anti-DNP- Antikörperantwort nach Verabreichung des dinitrophenylierten MIs auszulösen. DNPmodifiziertes BSA war jedoch beim Auslösen einer Anti-DNP- oder Anti-BSA-Antwort vollständig unwirksam, wenn es bei den getesteten Konzentrationen zugeführt wurde (Tabelle 3.1). Die ersten Versuche, bei denen K99 und 987P zu wesentlich größeren Molekülen als DNP komplexiert wurden, waren bei der Erzeugung von Immunantworten entweder auf das Schleimhautimmunogen oder das damit verbundene Molekül nicht erfolgreich (Tabellen 3.2 und 3.3), möglicherweise aufgrund der sterischen Beeinflussung der Bindung der Pili an das Schleimhaut- Epithel. Es wurde deshalb entschieden, das Verhältnis von Antigen zu MI zu variieren. Beim Austesten verschiedener BSA : Pili-Verhältnisse wurde gefunden, daß es bei Zufuhr von Verhältnissen von mehr als 1 : 20 BSA : Pili nicht möglich war, entweder Anti-BSA- oder Anti-Pili- Antworten zu erzeugen, auch nicht mit einer Dosis von 500 ug, was zeigt, daß es für die Komplexe nicht möglich war, sich wirksam mit ihrem Schleimhaut-Epithel zu verbinden und deshalb eine Immunantwort zu erzeugen. Wenn jedoch Verhältnisse von 1 : 20 oder 1 : 40 verwendet wurden, wurden gute Antworten sowohl auf BSA als auch auf die Pili erhalten (Tabellen 3.2 und 3.3). Die Höhe der Antwort wurde durch Veränderung der Dosen des zugeführten Komplexes einfach variiert (Tabelle 3.4).
Die orale Verabreichung von an LTB gekoppeltem LHRH führt zu einer signifikanten Verringerung in den vereinigten Uterus- und Ovariengewichten weiblicher Mäuse, die entweder 20 oder 50 ug LHRH-LTB (P 0,05) (Tabelle 3.5, 3.6) erhielten. Weder mit LHRH noch mit LTB, alleine oder zusammen zugeführt, oder bei intramuskulärer Injektion von LHRH-β- Galactosidase, LHRH-LTB oder freiem LHRH wurde ein derartiger Gewichtsverlust beobachtet.
Der Einfluß des Gewichtsverlusts wurde ebenfalls entwicklungsmäßig beobachtet, da in den Ovarien reife Follikel vollständig fehlten, wodurch die Tiere wirksam "kastriert" waren. Es wurde eine leichte Verringerung der Gewichte des Reproduktionstrakts festgestellt, wenn an die Mäuse das genetisch konstruierte LTB-(LHRH)3.5-Fusionsprotein verfüttert wurde (Tabelle 3.6); in diesem Experiment war jedoch die Verringerung bei den angewandten Dosen nicht signifikant.

Beispiel 4

Induktion einer zell-vermittelten Immunität nach oraler Antigenverabreichung

Es wurde gezeigt, daß die Verabreichung von Schleimhautimmunogenen bei der Auslösung humoraler Antworten wirksam ist, bestimmt durch die Produktion von Serum- und Intestinal- Antikörpern. Es war jedoch unbekannt, ob eine gleichzeitige Stimulierung einer zell-vermittelten Immunantwort (CMI-Antwort) auf die Schleimhautimmunogene stattfand.
Die nachfolgende Untersuchung wird durchgeführt, um die durch die orale Präsentation eines Schleimhautimmunogens erzeugte zell-vermittelte Immunantwort mit derjenigen zu vergleichen, die durch eine klassische subkutane (s. c.) Injektion eines Antigens in vollständigem Freunds Adjuvans (CFA) erzeugt wird.

Verfahren

Männliche C57B1/6J-Mäuse wurden durch Zufuhr von 20 ug Antigen in 0,1 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,65, oder durch Injektion von 20 ug Antigen in CFA s. c. immunisiert. Die Kontrollen erhielten nur Puffer oder Adjuvans. Sieben Tage nach der Immunisierung wurde den Mäusen in die linke hintere Fußpfote 10 ug Antigen in 20 ul Saline injiziert, und in die rechte Hinterpfote nur 20 ul Saline injiziert. Nach weiteren 24 Stunden wurde der Unterschied in der Dicke zwischen den linken und rechten Fußpfoten unter Verwendung eines Mikrometers bestimmt.

Ergebnisse

Die in der Tabelle 4.1 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß bei oraler Zufuhr von entweder 987P- oder LTB-Schleimhautimmunogenen eine gute zelluläre Immunantwort erzeugt wird. Tatsächlich war die Antwort überraschenderweise hoch, da sie nur geringfügig kleiner war als diejenige, die durch subkutane Injektion dieser Antigene in CFA erzeugt wurde. Tabelle 4.1 Erzeugung einer zellvermittelten Immunantwort bei oraler Präsentation von Schleimhautimmunogenen
* Die Ergebnisse repräsentieren die Zunahme in der Größe der Fußpfote nach Immunisierung mit dem Antigen. Die Ergebnisse sind Mittelwerte von 5 Mäusen ± Standardabweichung.

Gewerbliche Anwendbarkeit

Die gewerblichen Anwendungen der Erfindung umfassen die Herstellung von oral verabreichbaren Arzneimitteln zur Verabreichung an Wirbeltierwirte.

Potentielle Vakzine-Kandidaten für eine orale Vakzine

Allergene: Verschiedene Gräserpollen: Gerste, gemeine
Quecke,
Unkrautpollen: Klee, Ampfer
Baumpollen: Esche, Zypresse
Pflanzenpollen: Ginster
Epithilien: Katzenhaare, Hundehaare,
Schweinehaare,
Verschiedenes: Hausstaub, Weizenkleie,
Kapok.
Hormone: LHRH, FSH, HGH, Inhibin

Vakzinen: Hämagglutinine von

Influenza, Masern, Rubella, Pocken, Gelbfieber, Diphtherie, Tetanus, Cholera, Pest, Typhus, BCG, Haemophilus influenzae,
Neisseria catarrhalis, Klebstella pneumoniae,
Pneumococcen, Streptococcen, insb. 8. mutans.
Pili von: E. coli, N. gonorrhoeae, N. meningitis,
N. catarrhalis, Yersinia spp., Pseudomonas
aeruginosa, Pseudomonas spp., Moraxella
bovis, Bacteroides nodosus, Bordetella spp.

Claims

1. Orale Vakzine,

dadurch gekennzeichnet, daß

sie ein Immunogen umfaßt, das kovalent an ein Trägermolekül gebunden ist, welches zur spezifischen Bindung an die epitheliale Schleimhaut eines Wirbeltierwirts geeignet ist, worin sowohl die immunologische Aktivität des Immunogens als auch die Eignung des Trägers, spezifisch an das Schleimhautepithel zu binden, im wesentlichen erhalten bleibt, und das Trägermolekül ein zur Bindung an das Schleimhautepithel geeignetes Molekül ist, ausgewählt aus dem Ganzen, einem Teil, einem Analogon, einem Homologen, einem Derivat oder einer Kombination hiervon eines bakteriellen Adhesins, eines viralen Hämagglutinins, eines Toxins oder einer Bindungsuntereinheit eines Toxins oder eines Lectins, wobei jedoch Immunogen-Trägerkomplexe ausgenommen sind, worin das Immunogen natürlicherweise an das Trägermolekül gebunden ist, Immunogen-Trägerkomplexe, worin das Trägermolekül CTB ist (eine Choleratoxin-Untereinheit), Immunogen- Trägerkomplexe, worin das Trägermolekül ein Teil von CTB ist, welches die Fähigkeit zur Schleimhautbindung aufweist, und Immunogen-Trägerkomplexe, wobei das Immunogen ST (E. coli hitzestabiles Toxin) und das Trägermolekül LTB (E. coli labiles Toxin) ist.

2. Orale Vakzine nach Anspruch 1, worin das Immunogen ausgewählt ist aus einem Antigen oder Hapten, oder dem Ganzen, Teil(en), einem Analogon, einem Homologen, einem Derivat oder einer Kombination hiervon eines Hormons oder eines therapeutischen Mittels.

3. Orale Vakzine nach Anspruch 2, wobei das Immunogen das Ganze, ein Teil, ein Analogen, ein Homologes, ein Derivat oder eine Kombination hiervon eines Hormons ist, ausgewählt aus FSH, HGH, LHRH oder Inhibin.

4. Orale Vakzine nach Anspruch 1 oder 2, worin das Immunogen ein Allergen ist.

5. Orale Vakzine nach Anspruch 4, worin das Allergen von Gräserpollen, Unkrautpollen, Baumpollen, Pflanzenpollen, Katzenhaar, Hundehaar, Schweinehaar oder anderen Epithelien oder Hausstaub, Weizenspreu oder Kapok stammt.

6. Orale Vakzine nach Anspruch 1 oder 2, worin das Immunogen ein Oberflächenprotein ist, welches aus einem Influenza, Masern, Rubella, Pocken, Gelbfieber, Diphtherie, Tetanus, Cholera, Pest, Typhus oder BCG verursachenden Mittel, Haemophilus influenza, Neisseria catarrhalis, Klebstella pneumoniae, einem Pneumococcus oder einem Streptococcus stammt; oder es aus einem Pilus stammt E. coli, N. gonorrheae, N. meningitidis, N. catarrhalis, einer Yersinia-Art, Pseudomonas aeruginosa, einer Pseudomonas-Art, Moraxella bovis, Bacteroides nodosus, einer Staphylokokken-Art, einer Streptokokken-Art oder einer Bordetella-Art.

7. Orale Vakzine nach Anspruch 1 oder 2, worin das Immunogen ein Oberflächenpolysaccharid ist, das aus einem Diphtherie, Tetanus, Cholera, Pest, Typhus oder BCG verursachenden Mittel, Haemophilus influenza, Neisseria catarrhalis, Klebstella pneumoniae, einem Pneumococcus oder einem Streptococcus stammt.

8. Orale Vakzine nach Anspruch 1 oder 2, worin das Immunogen ein sekretorisches Produkt ist, das aus einem Diphtherie, Tetanus, Cholera, Pest, Typhus oder BCG verursachenden Mittel, Haemophilus influenza, Neisseria catarrhalis, Klebstella pneumoniae, einem Pneumococcus oder einem Streptococcus stammt.

9. Orale Vakzine nach einem der Ansprüche 6 bis 8, worin das Oberflächenprotein, das Oberflächenpolysaccharid oder das sekretorische Produkt aus Streptococcus mutans stammt,

10. Orale Vakzine nach Anspruch 1, worin das Trägermolekül ein hitzelabiles Toxin des enterotoxigenen E. coli ist.

11. Orale Vakzine nach Anspruch 1, worin das bakterielle Adhesin der K99- oder 987P-Pilus von E. coli ist.

12. Orale Vakzine nach Anspruch 1, worin das bakterielle Adhesin CFAI, CFAII, K88 oder F41 ist.

13. Orale Vakzine nach Anspruch 1, worin das Lectin Concanavalin A, Pokeweed Mitogen oder das Lectin aus Lens culinaris, Helix pomatia, Glycine max, Arachis hypogea oder Ulex europeus ist.

14. Orale Vakzine nach Anspruch 1, worin das Lectin-Abrin-, Asparagus-Erbsen-, Saubohnen-, Kamelfußbaum-, Caster-Bohnen-, Fava-Bohnen-, marine Grünalgen-, haarige Wicken-, Pferdekichererbsen- (horse gram), Hufeisenkrabben-, Jack-Bohnen-, Japanische Glyzinen-, Jequirity-Bohnen-, Schottischer Goldregen-, Lima-Bohnen-, Limulin-, Lotus-, Europäische Mistel-, Mungbohnen-, Osage-Orange-, Pagodenbaum-, Gartenbohnen-, Kartoffel-, Rote Kidney-Bohnen-, marine Rotalgen-, Sibirischer Erbsenbaum-, eßbare Schnecken-, Gartenschnecken-, Spindelbaum-, süße Erbsen-, Tomaten-, Weizenkeim- oder Wingederbsen-Lectin ist.

15. S. Orale Vakzine nach Anspruch 1, worin das virale Hämagglutinin ein Hämagglutinin ist, das aus Influenza-, Masern-, Rubella-, Pocken- oder Gelbfiebervirus stammt.

16. Orale Vakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Immunogen das Ganze, ein Teil, ein Analogon, ein Homologes, ein Derivat, oder eine Kombination hiervon des Luteinisierungshormon-freisetzenden Hormons und das Trägermolekül das Ganze, ein Teil, Analogon, ein Homologes, ein Derivat oder eine Kombination hiervon von LTB ist.

17. Verfahren zur Herstellung einer oralen Vakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:

(a) Umsetzung des Immunogens mit dem Trägermolekül, wodurch die Vakzine gebildet wird;

(b) chemische Modifikation des Immunogens, um wenigstens eine funktionelle Gruppe bereitzustellen, die in der Lage ist, eine chemische Bindung auszubilden, und Umsetzung des Immunogens und des Trägermoleküls, um die Vakzine zu bilden;

(c) chemische Modifikation des Trägermoleküls, um wenigstens eine funktionelle Gruppe bereitzustellen, die in der Lage ist, eine chemische Bindung auszubilden, und Umsetzung des Immunogens und des Trägermoleküls, um die Vakzine auszubilden;

(d) chemische Modifikation des Immunogens und des Trägermoleküls, um funktionelle Gruppen bereitzustellen, die in der Lage sind, eine chemische Bindung auszubilden, und Umsetzung des Immunogens und des Trägermoleküls, um die Vakzine auszubilden;

(e) Umsetzung des Immunogens mit wenigstens einem Bindungsmittel, und Umsetzung des Immunogens und des Trägermoleküls, um die Vakzine auszubilden;

(f) Umsetzung des Trägermoleküls mit wenigstens einem Bindungsmittel, und Umsetzung des Immunogens und des Trägermoleküls, um die Vakzine auszubilden;

(g) Umsetzung des Immunogens und des Trägermoleküls mit wenigstens einem Bindungsmittel, und Umsetzung des Immunogens und des Trägermoleküls, um die Vakzine auszubilden; oder

(h) eine Kombination aus einem der oben genannten Verfahrensschritte.

18. Verfahren zur Herstellung einer oralen Vakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Verfahren die nachfolgenden Verfahrensschritte aufweist:

Bereitstellen eines rekombinanten DNA-Moleküls, das eine erste DNA-Sequenz aufweist, die bei Expression für die Aminosäuresequenz des Immunogens codiert, eine zweite DNA-Sequenz, die bei Expression für die Aminosäuresequenz des Trägermoleküls codiert und eine Vektor-DNA; Transformation eines Wirts mit dem rekombinanten DNA-Molekül, so daß der Wirt in der Lage ist, ein Hybrid-Proteinprodukt zu exprimieren, das die Vakzine umfaßt; Kultivierung des Wirts, um die Expression zu erhalten und Sammeln des Hybrid Proteinprodukts.

19. Verfahren zur Herstellung einer oralen Vakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Verfahren die nachfolgenden Verfahrensschritte aufweist:

(a) chemische Synthese des Immunogens und/oder des Trägermoleküls und Ausbildung der Vakzine durch Reaktionen nach dem Verfahren des Anspruchs 17; oder

(b) Synthese eines Hybridpeptids, das Aminosäuresequenzen des Immunogens und des Trägermoleküls aufweist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin das Peptid durch Festphasen-, enzymatische oder manuelle Peptidsynthese hergestellt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, worin das synthetisierte Immunogen oder Trägermolekül an das Trägermolekül oder Immunogen gekoppelt ist, während es an ein Harz eines Festphasen-Peptidsyntheseapparats gebunden ist.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, worin das Immunogen das Ganze, ein Teil, ein Analogon, ein Homologes, ein Derivat oder eine Kombination hiervon des Luteinisierungshormon-freisetzenden Hormons (LHRH) ist.

23. Verfahren nach Anspruch 17, worin das Trägermolekül LTB und das Verbindungsmittel Isoglutaraldehyd ist.

24. Orale Vakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 3, hergestellt durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21.

25. Expressionsprodukt eines transformierten Wirts, dessen Produkt eine orale Vakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfaßt.

26. Wirt, transformiert mit einem rekombinanten DNA-Molekül, das eine erste DNA-Sequenz umfaßt, die bei Expressionen für die Aminosäuresequenz eines für orale Vakzinezwecke geeigneten Immunogens codiert und eine zweite DNA-Sequenz, die bei Expression für die Aminosäuresequenz eines Trägermolekuls codiert, das zur Bindung an die epitheliale Schleimhaut in der Lage ist, wobei das Trägermolekül ein zur Bindung an die epitheliale Schleimhaut geeignetes Molekül ist, ausgewählt aus dem Ganzen, einem Teil, einem Analogon, einem Homologen, einem Derivat oder einer Kombination hiervon eines bakteriellen Adhesins, eines viralen Hämagglutinins, eines Toxins oder einer Bindungsuntereinheit eines Toxins, oder eines Lectins, worin das Immunogen und das Trägermolekül ein Fusionspolypeptid bilden, ausgenommen Immunogen-Trägerkomplexe, worin das Immunogen an das Trägermolekül natürlicherweise gebunden ist, Immunogen-Trägerkomplexe, worin das Trägermolekül CTB ist, Immunogen-Trägerkomplexe, worin das Trägermolekül ein Teil von CTB ist, welches die Fähigkeit zur Schleimhautbindung aufweist, und Immunogen-Trägerkomplexe, wobei das Immunogen ST und das Trägermolekül LTB ist.

27. Transformierter Wirt nach Anspruch 26, worin der Wirt ein Gramnegatives oder ein Gram-positives Bakterium, eine Hefe, ein Pilz oder eine höhere eukaryontische Zelle ist.

28. Transformierter Wirt nach Anspruch 26 oder 27, worin der Wirt E. coli ist.

29. Rekombinantes DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz aufweist, die bei Expression für ein Fusionspolypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz eines für orale Vakzinezwecke geeigneten Immunogens umfaßt, und die Aminosäuresequenz eines zur Bindung an die epitheliale Schleimhaut geeigneten Trägermoleküls, wobei das Trägermolekül ein zur Bindung an die epitheliale Schleimhaut geeignetes Molekül ist, ausgewählt aus dem Ganzen, einem Teil, einem Analogon, einem Homologen, einem Derivat oder einer Kombination hiervon, eines bakteriellen Adhesins, eines viralen Hämagglutinins, eines Toxins oder einer Bindungsuntereinheit eines Toxins oder eines Lectins, ausgenommen Immunogen- Trägerkomplexe worin das Immunogen an das Trägermolekül natürlicherweise gebunden ist, Immunogen-Trägerkomplexe, worin das Trägermolekül CTB ist, Immunogen- Trägerkomplexe, worin das Trägermolekül ein Teil von CTB ist, welches die Fähigkeit zur Schleimhautbindung aufweist, und Immunogen-Trägerkomplexe, wobei das Immunogen ST und das Trägermolekül LTB ist.

30. Rekombinantes DNA Molekül nach Anspruch 29, das ebenfalls eine Vektor-DNA aufweist.

31. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 30, worin die Vektor-DNA aus Plasmid-, Virus-, Bakteriophagen- oder Cosmid-DNA ausgewählt ist.

32. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 29, worin die DNA-Sequenz als eine codierende Sequenz für ein Antigen oder ein Hapten wirkt, das mit der Aminosäuresequenz des Trägermoleküls fusioniert ist.

33. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 29, worin die DNA-Sequenz als codierende Sequenz des Ganzen, eines Teils, eines Analogons, eines Homologen, eines Derivats von LHRH wirkt, fusioniert mit der Aminosäuresequenz des Trägermoleküls.

34. Arzneimittel, welches ein für orale Vakzinezwecke geeignetes Immunogen umfaßt, das an ein Trägermolekül gebunden ist, welches zur spezifischen Bindung an die epitheliale Schleimhaut eines Wirbeltierwirts in der Lage ist, worin sowohl die immunologische Aktivität des Immunogens als auch die Fähigkeit des Trägers, spezifisch an das Schleimhautepithel zu binden, im wesentlichen beibehalten wird, und das Trägermolekül ein zur Bindung an die epitheliale Schleimhaut geeignetes Molekül ist, ausgewählt aus dem Ganzen, einem Teil, einem Analogon, einem Homologen, einem Derivat oder einer Kombination hiervon eines bakteriellen Adhesins, eines viralen Hämagglutinins, eines Toxins oder einer Bindungsuntereinheit eines Toxins, oder eines Lectins, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder einem Streckmittel, ausgenommen Immunogen- Trägerkomplexe, worin das Immunogen an das Trägermolekül natürlicherweise gebunden vorliegt, Immunogen-Trägerkomplexe, worin das Trägermolekül CTB ist, Immunogen- Trägerkomplexe, worin das Trägermolekül ein Teil von CTB ist, welches die Fähigkeit zur Schleimhautbindung aufweist, und Immunogen-Trägerkomplexe, wobei das Immunogen ST und das Trägermolekül LTB ist.

35. Arzneimittel nach Anspruch 34, das zur oralen Verabreichung ausgelegt ist.

36. Arzneimittel nach Anspruch 34, das zur nasalen Administration ausgelegt ist.

37. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 34 bis 36, worin das Arzneimittel in Kapsel-, Tabletten-, Retard-, Elixier-, Gel-, Pasten- oder Nasensprayform vorliegt.

38. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 34 bis 37, das zusätzlich ein Nahrungsmolekül aufweist, um die Größenordnung und/oder die Art der Immunantwort auf das Immunogen des Arzneimittels selektiv zu modulieren.

39. Arzneimittel nach Anspruch 38, wobei das Nahrungsmolekül aus Aminosäuren, Vitaminen, Monosacchariden und Oligosacchariden ausgewählt wird.

40. Arzneimittel nach Anspruch 38 oder Anspruch 39, worin das Nahrungsmolekül ausgewählt wird aus Vitamin A, Vitamin B&sub1;, Vitamin B&sub2;, Vitamin B&sub6;, Vitamin B&sub1;&sub2;, Vitamin C, Vitamin D, Vitamin E, Fructose, Lactose, Mannose, Melibiose, Sorbitol oder Xylose.