JP2761849B2 - ポリヌクレオチド配列、組換えｄｎａ分子および形質転換体宿主 - Google Patents
ポリヌクレオチド配列、組換えｄｎａ分子および形質転換体宿主Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡ、組換えＤＮＡ分
子、形質転換体宿主およびその培養体に関し、詳しく
は、経口投与用ワクチンに適した蛋白複合体を生産する
ためのＤＮＡ、組換えＤＮＡ分子、形質転換体宿主およ
びその培養体に関する。 【０００２】 【従来の技術】哺乳動物における感染の多くはその哺乳
動物に対して極めて有害な作用を及ぼすので、その感染
の原因となる特定の抗原に対してワクチン接種をするの
が適当である。このためにワクチン接種の体系が確立さ
れており、このワクチン接種により哺乳動物は抗原に対
して免疫的に抵抗性を有することになりそして免疫応答
が誘発されてその哺乳動物に対して免疫性が与えられる
ことになる。抗原を哺乳動物に投与するには、筋肉内注
射(i.m.)や皮下注射(s.c.)あるいは経口投与(per os)等
の種々の投与形態がある。筋肉内注射又は皮下注射は、
これを行うのに相応の熟練した技術を要すること、大規
模に行うのが困難なこと、高価であること、そして更に
はこれを投与する際に免疫抗原や乳化剤のいずれかに種
々の副反応が起る場合があること等の理由により不便で
ある。一方経口投与によりワクチンを投与する方法につ
いては、実際に吸収されて効果的な免疫応答を刺激し得
る物質の量が通常低いことからたいていの抗原の経口投
与においてはかなり大量の抗原の投与が必要である点を
除いては、ほとんど問題がない。経口投与による免疫性
付与のために必要とされる抗原の量は、組織体系的な免
疫性誘発に必要な抗原量をはるかに超えるものである。
又、抗体応答の生起に必要な大量の抗原を経口投与する
ことは更に又もう１つの重大な欠点がある。即ち、その
様に大量の抗原を経口投与することによりしばしば組織
体系的免疫耐性を誘発することがあることである。(Tom
asi(1980年); Mowat(1985年); MowatおよびParrot(1983
年); NganおよびKind(1978年); Hanson等(1979年); Ric
hman等(1978年); Rothberg等(1973年))。 【０００３】今日までの研究によれば、経口投与後に小
腸において抗原が吸収されるときの作用機序は、通常、
パイエル板や他のＧＡＬＴ（腸関連リンパ系組織）のリ
ンパ群上にあるＭ細胞による腸内腔内容物の非特異性サ
ンプリングに依存することが主であるとされている(Bla
ndおよびBritton(1984年))。そして局所リンパ球群を引
き続き感作することにより、局所ＩｇＡ免疫応答が起
り、かつ血清ＩｇＧ応答を同時に抑制するＩｇＧ抑制細
胞が感作されることになる。(Tomasi(1980年); Mowat(1
985年); MowatおよびParrot(1983年); NganおよびKind
(1978年); Hanson等(1979年); Richman等(1978年); Rot
hberg等(1973年))。従って、抗原吸収の部位は、それが
パイエル板かあるいは繊毛上皮を介してのものであった
にしても、そして又多分抗原の投与量も経口投与された
抗原により起る免疫応答の型を決定するものであること
が明らかである。ここで、経口投与により粘膜免疫系を
特異的に賦活し、そして（または）同様な投与法におい
て体液免疫応答を刺激し得る作用を有し、しかも組織体
系的免疫耐性を誘発することがなくかつ過剰量の抗原を
投与する必要のない、コレラ毒素以外の何らかの抗原が
あるのかどうかという問題が起って来る。 【０００４】以上の事を考慮に入れて、本発明者らは、
多くの腸内病原体に最初から付着しているある種の粘着
分子が、これを経口投与した場合に、免疫応答を刺激す
る能力を有するかどうかの可能性についての検討を行っ
た。種々の腸毒素原性大腸菌(E.coli)（ＥＴＥＣ）株に
粘着性を付与するこれらの表面抗原は、ベン毛を有さな
い形状構造のたん白質様付属器即ちピリ線毛として同定
されている(GaastraおよびGraaf(1982年))。その例とし
ては、ヒトＥＴＥＣ株のＣＦＡ ＩおよびＣＦＡ II抗
原や、動物ＥＴＥＣ株のＫ８８、Ｋ９９、Ｆ４１および
９８７Ｐピリ線毛がある(Gibbons等(1975年); Evansお
よびEvans(1978年); Levine等(1980年);Morgan等(1978
年); de GraafおよびRoorda(1982年))。更に又本発明者
等は、経口投与による免疫系を賦活する様な作用をその
コロニー形成中に明白に示さない様な種々の他のたん白
質の性能についても試験してみた。これらの抗原はたく
さんの種々のレクチン、Ｓ．チフィムリウム(S. typhim
urium）の血清型抗原（“ｉ”型べん毛）、非活性化ｆ
ｌｕウィルスおよびＳ．チフィムリウム内毒素（ＬＰ
Ｓ）を含有していた。経口投与による賦活効果を、全く
の筋肉内注射(i.m.)による投与による応答作用と比較し
た。 【０００５】結局これら研究の目的は、免疫原又は抗原
の胃腸管粘膜による吸収を、該免疫原を少量経口投与す
るだけでしかもその経口投与による免疫耐性を誘発する
ことなく血清および分泌性抗体を誘引し得る程度に高め
ることができる様な方法を提供することであった。その
結果、本発明者らは、脊椎動物宿主の粘膜上皮と特異的
に相互反応し得る担体分子に結合した免疫原から成る複
合体であって、該複合体は該免疫原の免疫活性とその脊
椎動物宿主の粘膜上皮と特異的に相互反応する担体分子
の活性とを実質的にあわせ持っておりかつ、この複合体
は脊椎動物宿主において組織体系的な細胞性および（ま
たは）粘膜性免疫応答を誘発せしめ得るものであること
を特徴とする前記複合体を見いだした。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】上記の複合体を効率よ
く生産するため、組換えＤＮＡ法等により、該複合体タ
ンパクを発現・生産させることが望まれた。本発明の目
的は上記複合体の生産に使用するＤＮＡ、組換えＤＮＡ
分子、形質転換体宿主およびその培養体を提供すること
である。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明は、担体分子のア
ミノ酸配列に融合した免疫原のアミノ酸配列を含有して
成り、該担体分子が脊椎動物宿主の粘膜上皮と特異的に
相互反応し得、かつ脊椎動物宿主において組織体系的な
細胞性および（または）粘膜性免疫応答を誘発せしめ得
るたん白質をコードするポリヌクレオチド配列から成る
ＤＮＡを提供する。このＤＮＡとしては、そのたん白質
が担体分子（より好ましくはＬＴＢ）のアミノ酸配列に
融合したＬＨＲＨの全部、１部又はその同族体、相同体
又は誘導体又はその組合わせのアミノ酸配列のコード配
列として作用するものであることが好ましい。 【０００８】本発明の他の態様として、本発明は又、担
体分子のアミノ酸配列に融合した免疫原のアミノ酸配列
を含有して成り該担体分子が脊椎動物宿主の粘膜上皮と
特異的に相互反応し得かつ脊椎動物宿主において組織体
系的な細胞性および（または）粘膜性免疫応答を誘発せ
しめ得るたん白質をコードするポリヌクレオチド配列か
ら成るＤＮＡと、ベクターＤＮＡとから成る組換えＤＮ
Ａ分子を提供するものである。その本発明の好ましい態
様としては、そのベクターＤＮＡはプラスミドＤＮＡで
あるが、その他のベクターも当然本発明の範囲内におい
て使用できるものであり、これには例えばウイルス、バ
クテリオファージやコスミド等がある。又本発明の好ま
しい態様としては、本発明はプラスミドｐＢＴＡＫ６６
を提供するものであり、このプラスミドは、宿主細胞を
これで形質転換した時に、その形質転換体が本発明のポ
リペプチドを含有するたん白質産物を生成する様なプラ
スミドである。 【０００９】本発明の別の態様として、担体分子のアミ
ノ酸配列に融合した免疫原のアミノ酸配列を含有して成
り該担体分子が脊椎動物宿主の粘膜上皮と特異的に相互
反応し得かつ脊椎動物宿主において組織体系的な細胞性
および（または）粘膜性免疫応答を誘発せしめ得るたん
白質をコードするポリヌクレオチド配列から成るＤＮＡ
と、ベクターＤＮＡとを含有する組換えＤＮＡ分子で形
質転換した形質転換体宿主を提供する。本発明の好まし
い態様としては、この形質転換体宿主はグラム陰性又は
グラム陽性菌、酵母、真菌又は高等真核細胞である。又
具体的に本発明の１つの好ましい態様としては、この宿
主はＥ．コリ（大腸菌）である。本発明の形質転換微生
物の培養物はＡＴＣＣ(American type culture collect
ion)寄託しており、その寄託番号 ＡＴＣＣ ６７１１
４ が与えられている。 【００１０】本発明の形質転換体宿主を培養することに
より、担体分子のアミノ酸配列に融合した免疫原のアミ
ノ酸配列を含有して成る融合たん白質を発現せしめ、そ
して得られた融合たん白質をを採取することができる。
この融合たん白質とは、脊椎動物宿主の粘膜上皮と特異
的に相互反応し得る担体分子に結合した免疫原から成る
複合体であって、該複合体は該免疫原の免疫活性とその
脊椎動物宿主の粘膜上皮と特異的に相互反応する担体分
子の活性とを実質的にあわせ持っておりかつ、この複合
体は脊椎動物宿主において組織体系的な細胞性および
（または）粘膜性免疫応答を誘発せしめ得るものであ
る。 【００１１】本発明における、好ましい免疫原として
は、ホルモン、医薬、抗原又はハプテンの全部、１部又
はその同族体、相同体又は誘導体又はこれらの組合わせ
を挙げることができる。これらの免疫原の例としては、
ＬＨＲＨ（黄体形成ホルモン放出ホルモン）、ＦＳＨ、
ＨＧＨおよびインヒビンの様なホルモン類；綿草花粉
（例えば大麦やひめかもじぐさ）、雑草花粉（例えばク
ローバーやスカンポ）、木の花粉（例えばトネリコやス
ギ）、その他の植物の花粉（例えばえにしだ）、上皮
（例えばネコの毛、イヌの毛やブタの毛）や家ぼこり、
小麦のもみがらやカポック（kapok）系のアレルゲン
類；インフルエンザ、はしか、紅疹（Rubella)、天然
痘、黄熱病、ジフテリア、破傷風、コレラ、ペスト、チ
フス、ＢＣＧ、ヘモフィルス インフルエンザ（Haemop
hilus influenza)、ネイゼリア カタラリス（Neisseri
a catarrhalis)、クレブジェラ ニューモニア（Klebsi
ella pneumonia）、Ｋ．ニューモノコクシ（K. pneumoc
occi）およびＫ．ストレプトコクシ（K. streptococci)
等にＳ．ミュータンス（S. mutans)等に対するワクチン
用の免疫原類；ならびにＥ．コリ（E. Coli)、Ｎ．ゴノ
ルホエ（N. gonorrhoeae）、Ｎ．ネンデティジス（N. n
eningitidis)、Ｎ．カタラリス（N. catarrhalis）、エ
ルシニア spp（Yersinia spp）、シュードモナス ア
エルギノーザ（Pseudomonas aeruginnosa)、シュードモ
ナス ｓｐｐ（Pseudomonas spp）、モラクセラボビス
（Moraxella bovis）、バクテロイデス ノドサス（Bac
teroides nodosus)、スタフィロコクシ ｓｐｐ（Staph
ylococci spp)、ストレプトコクシ ｓｐｐ（Streptoco
cci spp）、およびボルデテラ ｓｐｐ（Bordetella sp
p）由来のピリ線毛を含めてピリ線毛等が挙げられる。 【００１２】好ましい担体分子としては、９８７Ｐ、Ｋ
９９、ＣＦＡＩ、ＣＦＡＩＩ、Ｋ８８又はＦ４１等の様
な細菌性粘着素；インフルエンザ、はしか、紅疹、天然
痘又は黄熱病ウィルス等由来のウィルス性血球凝集素；
ＬＴＢリシン、アブリン、ジフテリア毒素、モデシン、
タタナス（tatanus)毒素およびその他これらと類似の構
造を有する物質等の様な毒素類又はその結合サブユニッ
ト；ならびに植物や他の生物由来のレクチン等を挙げる
ことができる。レクチンの例としては例えばコンカナバ
リンＡやポークウイードマイトーゲン、あるいはレンズ
クリナリス(Lens culinaris)、ヘリクス ポマチア(Hel
ix pomatia)、グリジン マックス(Glycine max)、アラ
キス ハイポジア(Arachis hypogea)又はウレクス ヨ
ーロペウス(Ulex europeus)又はアブリン、アスパラガ
ス豆、そら豆(Broad bean、Fava bean)、Camel's foot
tree、ひまの実、緑藻類(Green marine algae)、毛状か
らすのえんどう(Hairy vetch)、ホースグラム(Horse gr
am)、かぶとがに、ジャック豆(Jack bean)、のだふじ(J
apanese wisteria)、とうあずき、スコッチきばなふじ
(Scotch laburnum)、リマ豆、リムリン、ロータス、ヨ
ーロッパやどり木、ムング豆(Mung bean)、オーセージ
オレンジ(Osage orange)、えんじゅ(Pogoda tree)、庭
豆(Garden pea)、じゃがいも、レッド キドニー豆(Red
kidney bean)、赤藻類(Red marine algae)、シベリア
豆の木(Siberian pea tree)、食用かたつむり、庭かた
つむり(Garden snail)、にしき木(Spindle tree)、スイ
ートピー、トマト、小麦胚芽又は翼果(Winged pea)由来
のレクチン等を挙げることができる。 【００１３】本発明のポリヌクレオチド配列、ＤＮＡ分
子および形質転換体宿主により得られる前記複合体は、
薬学的に許容される担体又は希釈剤とから成る医薬とす
ることができる。その薬学的に許容される担体又は希釈
剤の例としては、錠剤や水溶液や重炭酸ナトリウム液に
おける代表的な担体や希釈剤の他の胃酸を中和し又はそ
れと同じ様な緩衝効果を有する同様の希釈剤、ならびに
グリコール、油剤あるいは水中油型又は油中水型乳剤等
における担体や希釈剤が挙げられ、又医薬は乳剤、ゲ
ル、ペースト又は粘着性コロイド状分散体の形のいずれ
でも良い。医薬としてはカプセル剤、錠剤、徐放性剤又
は万能薬の形態であるいはゲル状の又はペースト状の製
剤として投与されるものであって良く、あるいは又、点
鼻用スプレー剤としての投与形態のものでも良くそして
この場合にはエアゾールを含有していても良い。又この
医薬は家畜用飼料として又は消費者の便利を計った食品
とするものであっても良い。 【００１４】本発明者等は又、本発明の複合体をある種
の食物分子と一緒に併用投与することによってその複合
体の免疫原に対する免疫応答の程度および（または）形
を選択的に調整し得ることを見出した。従って、本発明
のポリヌクレオチド配列、ＤＮＡ分子および形質転換体
宿主により得られる前記複合体を、その複合体の免疫原
に対する免疫応答の程度および（または）形を選択的に
調整し得る様な食物分子とを組合わせて成る医薬とする
こともできる。 【００１５】前記複合体において使用可能な食物分子と
しては次のものが挙げられる。塩基性、中性又は酸性ア
ミノ酸、例えばアルギニン、ヒスチジン、リジン、アラ
ニン、システィン、シスチン、グリシン、イソロイシ
ン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリ
ン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、
バリン、アスパラギン酸、グリタミン酸；水溶性又は水
不溶性ビタミン、例えば、チアミン、リボフラビン、ピ
リドキサール、シアノコパラミン（Ｖ．Ｂ12）、アスコ
ルビン酸（Ｖ．Ｃ）、ビタミンＤ2等ならびにエルゴス
テロール、ビタミンＥ、ビタミンＡ、ビタミンＫ等；単
糖類を含めての糖類、たとえば、ガラクトース、マンノ
ース、マンニトール、ソルビトール、グルコース、キシ
ロース、アロース、アルトロース、アラビノース、ジギ
トキソース、エリスロース、フルクトース、リキソー
ス、ムラミン酸、マンノース、ピルビン酸、リボース、
タガトース、タロースおよびこれらのアミド化又はＮ−
アセチル化誘導体；オリゴ糖類、例えば、ラクトース、
マルトース、メリビオース、シュークロース、セルビオ
ース、Ｎ，Ｎ−ジアセチルキトビオース、ケントビオー
ス、イソアルトース、ラクトビオン酸、トレハロース、
トラノース；ならびに無機食物および共要素、例えば、
マンガン、マグネシウム、亜鉛、カルシウムおよび鉄等
である。 【００１６】 【実施例】以下実施例により本発明を説明するが、本発
明はこの実施例により限定されるものではない。 《ＬＨＲＨのβ−ガラクトシダーゼおよびＬＴＢへの遺
伝子融合》 〈融合ＬＴＢ／ＬＨＲＨハイブリッドポリペプチドを発
現するプラスミドベクターの構築〉 １．ＬＴＢコード配列を含有するＤＮＡ断片 変成したＥ．コリ株ＲＣ４１１(Dallus等、1979年）中
のプラスミドＮＰ３０７からのＬＴＢ遺伝子クローン(L
eong等、1985年）を含有するｐＢＲ３２２プラスミドか
ら、ＬＴＢの終止コドンに近いSpe I部位を使用してHin
d III断片を得て次いでこれを標準条件を使用してムン
グ豆(mung bean)ヌクレアーゼ消化した。（ここで特記
しない限り、標準組換えＤＮＡ技術に使用した条件およ
び核酸変成用酸素は、Molecular Cloning (Maniatis, F
ritschおよびSambrookによる実験室用手引き。Cold Spr
ing Harbor Laboratory, 1982年）に記載のものであ
る。）これは図１に示す様にして、ＬＴＢ中アミノ酸１
２３の後に通常見られる終止コドンをはずし、ＤＮＡの
９塩基対を除去してそして偶然にもHind III部位を生成
した。標準条件を使用してプラスミドをHind III消化し
そしてホスファターゼ処理した後に、この断片をベクタ
ーｐＵＣ１３(Messing, 1983年）中にライゲーションし
た。これによりＤＮＡインサートを有するＬＴＢ配列の
下流のPst I、Sal Iおよびxba I、Bam HI、Sat Iおよび
EcoRI部位を含めてのｐＵＣ１３の残りのポリリンカー
領域の配列が選定された。 【００１７】２．合成ＬＨＲＨをコードするオリゴヌク
レオチドの創製 図２に示すＡおよびＢの配列を有する長さ３０塩基の２
種のオリゴヌクレオチドを処理して、図２に示すＣの様
な重なりハイブリッド重複体を作った。これはペプチド
ホルモンＬＨＲＨ(SchallyおよびCoy, 1983年）をコー
ドする１０アミノ酸の末端から末端までの直線反復をコ
ードする重複体となると思われる。（Role of Peptides
and Proteins in Control of Reproduction; McCannお
よびDhindsa編、Elsevier Science Publishing Co.,
刊、89-110ページ参照。) この配列においてはグルタミ
ン酸が通常のＮ−末端ピログルタミン酸と置換してい
る。常法によって、２つのオリゴヌクレオチドを一緒に
して５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）中４０℃で１時間アニーリングし、クレノウ
(Klenow)で末端充てんし、そして次いでこの混合物をSm
a I切断Ｍ１３ｍｐ１８中にライゲーションした。イン
サートを含有するＭ１３ファージを単離し、このインサ
ートのＤＮＡ配列をジデオキシ法によって決定した。Ｐ
２９と命名した１つの組換え体を融合体構築のために選
んだ。Sma I部位でのインサートの領域中のそのＤＮＡ
配列を、そのコードするアミノ酸を含めて、図３に示し
た。このＤＮＡ配列において、合成オリゴヌクレオチド
由来のＤＮＡの挿入によりＬＨＲＨのコード配列の約３
・１／２（３．５）反復（３４アミノ酸）が枠内融合し
て配列していることが確認された。ＬＨＲＨの全コード
配列は矢印で示した。Ｐ２９のＤＮＡからの複製型をEc
oRIおよびHinc IIで消化し（その位置は上記のＤＮＡ配
列中に示した）、そして通常の方法で末端充てんした。
ポリアクリルアミドゲルから１４０塩基対の小断片を単
離した。 【００１８】３．ＬＴＢ／ＬＨＢＨ融合ベクターの構築 Hind III部位（上記部分１）に挿入したＬＴＢをコード
する配列を含有するｐＵＣ１３プラスミドをSal Iで消
化し、そして常法により末端充てんしそしてリン酸化し
た。次いでベクターＤＮＡを、Ｐ２９からの末端充てん
EcoR／HincII断片（上記部分２）とライゲーションし
た。２つの融合体は図４に示すアミノ酸配列を持つべき
である。ＬＴＢからの１２２アミノ酸を、ＬＨＲＨ反復
をコードする３４アミノ酸と、隣接する領域由来の更に
２０アミノ酸とを有する１７６アミノ酸ポリペプチドの
生成を決定するＬＨＲＨ配列の外側に終止コドン２４塩
基がある。生成物の小部分から採ったＤＮＡをEcoRIで
消化することによって正しい構造体をスクリーニングし
そしてそのEcoRIの適当な大断片を有するプラスミドを
求めた。ｐＵＣ１３の、ｌａｃプロモーター由来の、こ
のポリペプチドの発現用の推定構造を更にスクリーニン
グした。菌体抽出物をポリアクリルアミドゲルで分析
し、次いでニトロセルロース紙に転写しそしてＬＴＢお
よびＬＨＲＨの接合体に対するウサギ抗血清を使って、
ウェスタンブロッティング法によってブロッティングし
た。目的のサイズのペプチドの両抗血清により検出され
た。 【００１９】４．発現プラスミドＫ６６および発現株Ｂ
ＴＡｌｌ８５の構築 ＬＴＢ−ＬＨＲＨ融合をコードする領域を完全な体で有
している、前記第３項で得られたｐＵＣ１３ＬＴＢ−Ｌ
ＨＲＨ融合プラスミドの５７３ｂｐのEcoR I断片をアガ
ロースゲルから単離し、そしてEcoRIで切り出したリン
酸化発現ベクターＰＫＫ２２３−３（ファルマシア社
製）中にライゲーションした。得られた発現プラスミド
ｐＢＴＡ Ｋ６６はｔａｃプロモーターの支配下に融合
たん白質を発現した。（この発現はＩＰＴＧで誘発され
るものである。）このプラスミドでＥ．コリ宿主株ＪＭ
１０１ (SupE、thi、(lac-pro AB) [F'tra D36, pro AB
lacIq ZM15])を形質転換して病主ベクター発現系ＢＴ
Ａ１１８５を得た。 【００２０】５．動物実験用のＬＴＢ／ＬＨＲＨ融合た
ん白質の生成と精製 上記した方法によってＬＴＢ（ＬＨＲＨ）3.5産主株を
増殖させた。２時間ＩＰＴＧで誘発した後に、遠心分離
（３，０００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体をペレ
ット化した。次いでこの菌体をｄＨ2Ｏ中に再けんだく
をしてフレンチプレス(French Press）により分解し
た。遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分間、４℃）に
より菌体破砕片を除去した後に、上澄みをアグチオ−ガ
ラクトースカラム（シグマ社）上に負荷した。次いで融
合たん白質を０．５Ｍガラクトースで溶出しそして０．
１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）に対して透
析した。 【００２１】抗原投与と免疫応答の測定 雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１８−２２ｇ）をAnimal R
esources Center （パース、西オーストラリア）から入
手した。全マウスは抗原を経口（ｏ．ｓ．）又は筋肉内
（ｉ．ｍ．）投与する前３〜４時間絶食させた。特別に
用意した哺乳針を使用して、０．１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩
緩衝液（ｐＨ９．５）中の適当な濃度の抗原をマウスに
経口投与した。一方、０．１ｍｌの無菌生理食塩水中に
溶かした同投与量の抗原をマウスの左後足に筋肉内注射
した。経口投与又は筋肉内注射により抗原を投与した各
５匹のマウスのグループには、０日目と１４日目の２回
に同量の抗原を投与した。２８日目にマウスを安楽死さ
せて、その生殖器官（卵巣および子宮）の重さを計っ
た。 【００２２】〔結果〕 粘膜免疫原の担体能の確認 表１から分かるように、遺伝子工学的に構築したＬＴＢ
−（ＬＨＲＨ)3.5融合たん白質をマウスに経口投与した
場合は、雌マウスの子宮および卵巣の合計重量と体重の
比が、ＬＨＲＨ−Ｂ−ガラクトシダーゼや遊離のＬＨＲ
Ｈやコントロールを筋肉内注射また経口投与した場合に
比べ、小さくなった。従ってこの実験動物は効果的に
「去勢された」ことになる。 【００２３】 【表１】 【００２４】 【発明の効果】本発明のポリヌクレオチド配列、ＤＮＡ
分子および形質転換体宿主により、脊椎動物宿主の粘膜
上皮と特異的に相互反応し得る担体分子に結合した免疫
原から成る複合体が得られる。この複合体は該免疫原の
免疫活性とその脊椎動物宿主の粘膜上皮と特異的に相互
反応する担体分子の活性とを実質的にあわせ持っており
かつ、この複合体は脊椎動物宿主において組織体系的な
細胞性および（または）粘膜性免疫応答を誘発せしめ得
るものである。本発明のポリヌクレオチド配列、ＤＮＡ
分子および形質転換体宿主は、脊椎動物宿主への経口投
与用医薬の製造に利用される。本発明のポリヌクレオチ
ド配列、ＤＮＡ分子および形質転換体宿主により得られ
る複合体は、脊椎動物宿主への経口投与用医薬として利
用される。 【００２５】〈略語の説明〉 １．ＥＬＩＳＡ： 酵素結合免疫分析 ２．ＥＴＥＣ： 腸毒素原性大腸菌（E.Col
i） ３．ＧＡＬＴ： 腸関連リンパ系組織 ４．ｉ．ｍ．： 筋肉内 ５．ＬＨＰＨ： 黄体形成ホルモン放出ホル
モン ６．ＬＴＢ： 腸毒素原性大腸菌の非熱安
定性毒素
子、形質転換体宿主およびその培養体に関し、詳しく
は、経口投与用ワクチンに適した蛋白複合体を生産する
ためのＤＮＡ、組換えＤＮＡ分子、形質転換体宿主およ
びその培養体に関する。 【０００２】 【従来の技術】哺乳動物における感染の多くはその哺乳
動物に対して極めて有害な作用を及ぼすので、その感染
の原因となる特定の抗原に対してワクチン接種をするの
が適当である。このためにワクチン接種の体系が確立さ
れており、このワクチン接種により哺乳動物は抗原に対
して免疫的に抵抗性を有することになりそして免疫応答
が誘発されてその哺乳動物に対して免疫性が与えられる
ことになる。抗原を哺乳動物に投与するには、筋肉内注
射(i.m.)や皮下注射(s.c.)あるいは経口投与(per os)等
の種々の投与形態がある。筋肉内注射又は皮下注射は、
これを行うのに相応の熟練した技術を要すること、大規
模に行うのが困難なこと、高価であること、そして更に
はこれを投与する際に免疫抗原や乳化剤のいずれかに種
々の副反応が起る場合があること等の理由により不便で
ある。一方経口投与によりワクチンを投与する方法につ
いては、実際に吸収されて効果的な免疫応答を刺激し得
る物質の量が通常低いことからたいていの抗原の経口投
与においてはかなり大量の抗原の投与が必要である点を
除いては、ほとんど問題がない。経口投与による免疫性
付与のために必要とされる抗原の量は、組織体系的な免
疫性誘発に必要な抗原量をはるかに超えるものである。
又、抗体応答の生起に必要な大量の抗原を経口投与する
ことは更に又もう１つの重大な欠点がある。即ち、その
様に大量の抗原を経口投与することによりしばしば組織
体系的免疫耐性を誘発することがあることである。(Tom
asi(1980年); Mowat(1985年); MowatおよびParrot(1983
年); NganおよびKind(1978年); Hanson等(1979年); Ric
hman等(1978年); Rothberg等(1973年))。 【０００３】今日までの研究によれば、経口投与後に小
腸において抗原が吸収されるときの作用機序は、通常、
パイエル板や他のＧＡＬＴ（腸関連リンパ系組織）のリ
ンパ群上にあるＭ細胞による腸内腔内容物の非特異性サ
ンプリングに依存することが主であるとされている(Bla
ndおよびBritton(1984年))。そして局所リンパ球群を引
き続き感作することにより、局所ＩｇＡ免疫応答が起
り、かつ血清ＩｇＧ応答を同時に抑制するＩｇＧ抑制細
胞が感作されることになる。(Tomasi(1980年); Mowat(1
985年); MowatおよびParrot(1983年); NganおよびKind
(1978年); Hanson等(1979年); Richman等(1978年); Rot
hberg等(1973年))。従って、抗原吸収の部位は、それが
パイエル板かあるいは繊毛上皮を介してのものであった
にしても、そして又多分抗原の投与量も経口投与された
抗原により起る免疫応答の型を決定するものであること
が明らかである。ここで、経口投与により粘膜免疫系を
特異的に賦活し、そして（または）同様な投与法におい
て体液免疫応答を刺激し得る作用を有し、しかも組織体
系的免疫耐性を誘発することがなくかつ過剰量の抗原を
投与する必要のない、コレラ毒素以外の何らかの抗原が
あるのかどうかという問題が起って来る。 【０００４】以上の事を考慮に入れて、本発明者らは、
多くの腸内病原体に最初から付着しているある種の粘着
分子が、これを経口投与した場合に、免疫応答を刺激す
る能力を有するかどうかの可能性についての検討を行っ
た。種々の腸毒素原性大腸菌(E.coli)（ＥＴＥＣ）株に
粘着性を付与するこれらの表面抗原は、ベン毛を有さな
い形状構造のたん白質様付属器即ちピリ線毛として同定
されている(GaastraおよびGraaf(1982年))。その例とし
ては、ヒトＥＴＥＣ株のＣＦＡ ＩおよびＣＦＡ II抗
原や、動物ＥＴＥＣ株のＫ８８、Ｋ９９、Ｆ４１および
９８７Ｐピリ線毛がある(Gibbons等(1975年); Evansお
よびEvans(1978年); Levine等(1980年);Morgan等(1978
年); de GraafおよびRoorda(1982年))。更に又本発明者
等は、経口投与による免疫系を賦活する様な作用をその
コロニー形成中に明白に示さない様な種々の他のたん白
質の性能についても試験してみた。これらの抗原はたく
さんの種々のレクチン、Ｓ．チフィムリウム(S. typhim
urium）の血清型抗原（“ｉ”型べん毛）、非活性化ｆ
ｌｕウィルスおよびＳ．チフィムリウム内毒素（ＬＰ
Ｓ）を含有していた。経口投与による賦活効果を、全く
の筋肉内注射(i.m.)による投与による応答作用と比較し
た。 【０００５】結局これら研究の目的は、免疫原又は抗原
の胃腸管粘膜による吸収を、該免疫原を少量経口投与す
るだけでしかもその経口投与による免疫耐性を誘発する
ことなく血清および分泌性抗体を誘引し得る程度に高め
ることができる様な方法を提供することであった。その
結果、本発明者らは、脊椎動物宿主の粘膜上皮と特異的
に相互反応し得る担体分子に結合した免疫原から成る複
合体であって、該複合体は該免疫原の免疫活性とその脊
椎動物宿主の粘膜上皮と特異的に相互反応する担体分子
の活性とを実質的にあわせ持っておりかつ、この複合体
は脊椎動物宿主において組織体系的な細胞性および（ま
たは）粘膜性免疫応答を誘発せしめ得るものであること
を特徴とする前記複合体を見いだした。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】上記の複合体を効率よ
く生産するため、組換えＤＮＡ法等により、該複合体タ
ンパクを発現・生産させることが望まれた。本発明の目
的は上記複合体の生産に使用するＤＮＡ、組換えＤＮＡ
分子、形質転換体宿主およびその培養体を提供すること
である。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明は、担体分子のア
ミノ酸配列に融合した免疫原のアミノ酸配列を含有して
成り、該担体分子が脊椎動物宿主の粘膜上皮と特異的に
相互反応し得、かつ脊椎動物宿主において組織体系的な
細胞性および（または）粘膜性免疫応答を誘発せしめ得
るたん白質をコードするポリヌクレオチド配列から成る
ＤＮＡを提供する。このＤＮＡとしては、そのたん白質
が担体分子（より好ましくはＬＴＢ）のアミノ酸配列に
融合したＬＨＲＨの全部、１部又はその同族体、相同体
又は誘導体又はその組合わせのアミノ酸配列のコード配
列として作用するものであることが好ましい。 【０００８】本発明の他の態様として、本発明は又、担
体分子のアミノ酸配列に融合した免疫原のアミノ酸配列
を含有して成り該担体分子が脊椎動物宿主の粘膜上皮と
特異的に相互反応し得かつ脊椎動物宿主において組織体
系的な細胞性および（または）粘膜性免疫応答を誘発せ
しめ得るたん白質をコードするポリヌクレオチド配列か
ら成るＤＮＡと、ベクターＤＮＡとから成る組換えＤＮ
Ａ分子を提供するものである。その本発明の好ましい態
様としては、そのベクターＤＮＡはプラスミドＤＮＡで
あるが、その他のベクターも当然本発明の範囲内におい
て使用できるものであり、これには例えばウイルス、バ
クテリオファージやコスミド等がある。又本発明の好ま
しい態様としては、本発明はプラスミドｐＢＴＡＫ６６
を提供するものであり、このプラスミドは、宿主細胞を
これで形質転換した時に、その形質転換体が本発明のポ
リペプチドを含有するたん白質産物を生成する様なプラ
スミドである。 【０００９】本発明の別の態様として、担体分子のアミ
ノ酸配列に融合した免疫原のアミノ酸配列を含有して成
り該担体分子が脊椎動物宿主の粘膜上皮と特異的に相互
反応し得かつ脊椎動物宿主において組織体系的な細胞性
および（または）粘膜性免疫応答を誘発せしめ得るたん
白質をコードするポリヌクレオチド配列から成るＤＮＡ
と、ベクターＤＮＡとを含有する組換えＤＮＡ分子で形
質転換した形質転換体宿主を提供する。本発明の好まし
い態様としては、この形質転換体宿主はグラム陰性又は
グラム陽性菌、酵母、真菌又は高等真核細胞である。又
具体的に本発明の１つの好ましい態様としては、この宿
主はＥ．コリ（大腸菌）である。本発明の形質転換微生
物の培養物はＡＴＣＣ(American type culture collect
ion)寄託しており、その寄託番号 ＡＴＣＣ ６７１１
４ が与えられている。 【００１０】本発明の形質転換体宿主を培養することに
より、担体分子のアミノ酸配列に融合した免疫原のアミ
ノ酸配列を含有して成る融合たん白質を発現せしめ、そ
して得られた融合たん白質をを採取することができる。
この融合たん白質とは、脊椎動物宿主の粘膜上皮と特異
的に相互反応し得る担体分子に結合した免疫原から成る
複合体であって、該複合体は該免疫原の免疫活性とその
脊椎動物宿主の粘膜上皮と特異的に相互反応する担体分
子の活性とを実質的にあわせ持っておりかつ、この複合
体は脊椎動物宿主において組織体系的な細胞性および
（または）粘膜性免疫応答を誘発せしめ得るものであ
る。 【００１１】本発明における、好ましい免疫原として
は、ホルモン、医薬、抗原又はハプテンの全部、１部又
はその同族体、相同体又は誘導体又はこれらの組合わせ
を挙げることができる。これらの免疫原の例としては、
ＬＨＲＨ（黄体形成ホルモン放出ホルモン）、ＦＳＨ、
ＨＧＨおよびインヒビンの様なホルモン類；綿草花粉
（例えば大麦やひめかもじぐさ）、雑草花粉（例えばク
ローバーやスカンポ）、木の花粉（例えばトネリコやス
ギ）、その他の植物の花粉（例えばえにしだ）、上皮
（例えばネコの毛、イヌの毛やブタの毛）や家ぼこり、
小麦のもみがらやカポック（kapok）系のアレルゲン
類；インフルエンザ、はしか、紅疹（Rubella)、天然
痘、黄熱病、ジフテリア、破傷風、コレラ、ペスト、チ
フス、ＢＣＧ、ヘモフィルス インフルエンザ（Haemop
hilus influenza)、ネイゼリア カタラリス（Neisseri
a catarrhalis)、クレブジェラ ニューモニア（Klebsi
ella pneumonia）、Ｋ．ニューモノコクシ（K. pneumoc
occi）およびＫ．ストレプトコクシ（K. streptococci)
等にＳ．ミュータンス（S. mutans)等に対するワクチン
用の免疫原類；ならびにＥ．コリ（E. Coli)、Ｎ．ゴノ
ルホエ（N. gonorrhoeae）、Ｎ．ネンデティジス（N. n
eningitidis)、Ｎ．カタラリス（N. catarrhalis）、エ
ルシニア spp（Yersinia spp）、シュードモナス ア
エルギノーザ（Pseudomonas aeruginnosa)、シュードモ
ナス ｓｐｐ（Pseudomonas spp）、モラクセラボビス
（Moraxella bovis）、バクテロイデス ノドサス（Bac
teroides nodosus)、スタフィロコクシ ｓｐｐ（Staph
ylococci spp)、ストレプトコクシ ｓｐｐ（Streptoco
cci spp）、およびボルデテラ ｓｐｐ（Bordetella sp
p）由来のピリ線毛を含めてピリ線毛等が挙げられる。 【００１２】好ましい担体分子としては、９８７Ｐ、Ｋ
９９、ＣＦＡＩ、ＣＦＡＩＩ、Ｋ８８又はＦ４１等の様
な細菌性粘着素；インフルエンザ、はしか、紅疹、天然
痘又は黄熱病ウィルス等由来のウィルス性血球凝集素；
ＬＴＢリシン、アブリン、ジフテリア毒素、モデシン、
タタナス（tatanus)毒素およびその他これらと類似の構
造を有する物質等の様な毒素類又はその結合サブユニッ
ト；ならびに植物や他の生物由来のレクチン等を挙げる
ことができる。レクチンの例としては例えばコンカナバ
リンＡやポークウイードマイトーゲン、あるいはレンズ
クリナリス(Lens culinaris)、ヘリクス ポマチア(Hel
ix pomatia)、グリジン マックス(Glycine max)、アラ
キス ハイポジア(Arachis hypogea)又はウレクス ヨ
ーロペウス(Ulex europeus)又はアブリン、アスパラガ
ス豆、そら豆(Broad bean、Fava bean)、Camel's foot
tree、ひまの実、緑藻類(Green marine algae)、毛状か
らすのえんどう(Hairy vetch)、ホースグラム(Horse gr
am)、かぶとがに、ジャック豆(Jack bean)、のだふじ(J
apanese wisteria)、とうあずき、スコッチきばなふじ
(Scotch laburnum)、リマ豆、リムリン、ロータス、ヨ
ーロッパやどり木、ムング豆(Mung bean)、オーセージ
オレンジ(Osage orange)、えんじゅ(Pogoda tree)、庭
豆(Garden pea)、じゃがいも、レッド キドニー豆(Red
kidney bean)、赤藻類(Red marine algae)、シベリア
豆の木(Siberian pea tree)、食用かたつむり、庭かた
つむり(Garden snail)、にしき木(Spindle tree)、スイ
ートピー、トマト、小麦胚芽又は翼果(Winged pea)由来
のレクチン等を挙げることができる。 【００１３】本発明のポリヌクレオチド配列、ＤＮＡ分
子および形質転換体宿主により得られる前記複合体は、
薬学的に許容される担体又は希釈剤とから成る医薬とす
ることができる。その薬学的に許容される担体又は希釈
剤の例としては、錠剤や水溶液や重炭酸ナトリウム液に
おける代表的な担体や希釈剤の他の胃酸を中和し又はそ
れと同じ様な緩衝効果を有する同様の希釈剤、ならびに
グリコール、油剤あるいは水中油型又は油中水型乳剤等
における担体や希釈剤が挙げられ、又医薬は乳剤、ゲ
ル、ペースト又は粘着性コロイド状分散体の形のいずれ
でも良い。医薬としてはカプセル剤、錠剤、徐放性剤又
は万能薬の形態であるいはゲル状の又はペースト状の製
剤として投与されるものであって良く、あるいは又、点
鼻用スプレー剤としての投与形態のものでも良くそして
この場合にはエアゾールを含有していても良い。又この
医薬は家畜用飼料として又は消費者の便利を計った食品
とするものであっても良い。 【００１４】本発明者等は又、本発明の複合体をある種
の食物分子と一緒に併用投与することによってその複合
体の免疫原に対する免疫応答の程度および（または）形
を選択的に調整し得ることを見出した。従って、本発明
のポリヌクレオチド配列、ＤＮＡ分子および形質転換体
宿主により得られる前記複合体を、その複合体の免疫原
に対する免疫応答の程度および（または）形を選択的に
調整し得る様な食物分子とを組合わせて成る医薬とする
こともできる。 【００１５】前記複合体において使用可能な食物分子と
しては次のものが挙げられる。塩基性、中性又は酸性ア
ミノ酸、例えばアルギニン、ヒスチジン、リジン、アラ
ニン、システィン、シスチン、グリシン、イソロイシ
ン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリ
ン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、
バリン、アスパラギン酸、グリタミン酸；水溶性又は水
不溶性ビタミン、例えば、チアミン、リボフラビン、ピ
リドキサール、シアノコパラミン（Ｖ．Ｂ12）、アスコ
ルビン酸（Ｖ．Ｃ）、ビタミンＤ2等ならびにエルゴス
テロール、ビタミンＥ、ビタミンＡ、ビタミンＫ等；単
糖類を含めての糖類、たとえば、ガラクトース、マンノ
ース、マンニトール、ソルビトール、グルコース、キシ
ロース、アロース、アルトロース、アラビノース、ジギ
トキソース、エリスロース、フルクトース、リキソー
ス、ムラミン酸、マンノース、ピルビン酸、リボース、
タガトース、タロースおよびこれらのアミド化又はＮ−
アセチル化誘導体；オリゴ糖類、例えば、ラクトース、
マルトース、メリビオース、シュークロース、セルビオ
ース、Ｎ，Ｎ−ジアセチルキトビオース、ケントビオー
ス、イソアルトース、ラクトビオン酸、トレハロース、
トラノース；ならびに無機食物および共要素、例えば、
マンガン、マグネシウム、亜鉛、カルシウムおよび鉄等
である。 【００１６】 【実施例】以下実施例により本発明を説明するが、本発
明はこの実施例により限定されるものではない。 《ＬＨＲＨのβ−ガラクトシダーゼおよびＬＴＢへの遺
伝子融合》 〈融合ＬＴＢ／ＬＨＲＨハイブリッドポリペプチドを発
現するプラスミドベクターの構築〉 １．ＬＴＢコード配列を含有するＤＮＡ断片 変成したＥ．コリ株ＲＣ４１１(Dallus等、1979年）中
のプラスミドＮＰ３０７からのＬＴＢ遺伝子クローン(L
eong等、1985年）を含有するｐＢＲ３２２プラスミドか
ら、ＬＴＢの終止コドンに近いSpe I部位を使用してHin
d III断片を得て次いでこれを標準条件を使用してムン
グ豆(mung bean)ヌクレアーゼ消化した。（ここで特記
しない限り、標準組換えＤＮＡ技術に使用した条件およ
び核酸変成用酸素は、Molecular Cloning (Maniatis, F
ritschおよびSambrookによる実験室用手引き。Cold Spr
ing Harbor Laboratory, 1982年）に記載のものであ
る。）これは図１に示す様にして、ＬＴＢ中アミノ酸１
２３の後に通常見られる終止コドンをはずし、ＤＮＡの
９塩基対を除去してそして偶然にもHind III部位を生成
した。標準条件を使用してプラスミドをHind III消化し
そしてホスファターゼ処理した後に、この断片をベクタ
ーｐＵＣ１３(Messing, 1983年）中にライゲーションし
た。これによりＤＮＡインサートを有するＬＴＢ配列の
下流のPst I、Sal Iおよびxba I、Bam HI、Sat Iおよび
EcoRI部位を含めてのｐＵＣ１３の残りのポリリンカー
領域の配列が選定された。 【００１７】２．合成ＬＨＲＨをコードするオリゴヌク
レオチドの創製 図２に示すＡおよびＢの配列を有する長さ３０塩基の２
種のオリゴヌクレオチドを処理して、図２に示すＣの様
な重なりハイブリッド重複体を作った。これはペプチド
ホルモンＬＨＲＨ(SchallyおよびCoy, 1983年）をコー
ドする１０アミノ酸の末端から末端までの直線反復をコ
ードする重複体となると思われる。（Role of Peptides
and Proteins in Control of Reproduction; McCannお
よびDhindsa編、Elsevier Science Publishing Co.,
刊、89-110ページ参照。) この配列においてはグルタミ
ン酸が通常のＮ−末端ピログルタミン酸と置換してい
る。常法によって、２つのオリゴヌクレオチドを一緒に
して５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）中４０℃で１時間アニーリングし、クレノウ
(Klenow)で末端充てんし、そして次いでこの混合物をSm
a I切断Ｍ１３ｍｐ１８中にライゲーションした。イン
サートを含有するＭ１３ファージを単離し、このインサ
ートのＤＮＡ配列をジデオキシ法によって決定した。Ｐ
２９と命名した１つの組換え体を融合体構築のために選
んだ。Sma I部位でのインサートの領域中のそのＤＮＡ
配列を、そのコードするアミノ酸を含めて、図３に示し
た。このＤＮＡ配列において、合成オリゴヌクレオチド
由来のＤＮＡの挿入によりＬＨＲＨのコード配列の約３
・１／２（３．５）反復（３４アミノ酸）が枠内融合し
て配列していることが確認された。ＬＨＲＨの全コード
配列は矢印で示した。Ｐ２９のＤＮＡからの複製型をEc
oRIおよびHinc IIで消化し（その位置は上記のＤＮＡ配
列中に示した）、そして通常の方法で末端充てんした。
ポリアクリルアミドゲルから１４０塩基対の小断片を単
離した。 【００１８】３．ＬＴＢ／ＬＨＢＨ融合ベクターの構築 Hind III部位（上記部分１）に挿入したＬＴＢをコード
する配列を含有するｐＵＣ１３プラスミドをSal Iで消
化し、そして常法により末端充てんしそしてリン酸化し
た。次いでベクターＤＮＡを、Ｐ２９からの末端充てん
EcoR／HincII断片（上記部分２）とライゲーションし
た。２つの融合体は図４に示すアミノ酸配列を持つべき
である。ＬＴＢからの１２２アミノ酸を、ＬＨＲＨ反復
をコードする３４アミノ酸と、隣接する領域由来の更に
２０アミノ酸とを有する１７６アミノ酸ポリペプチドの
生成を決定するＬＨＲＨ配列の外側に終止コドン２４塩
基がある。生成物の小部分から採ったＤＮＡをEcoRIで
消化することによって正しい構造体をスクリーニングし
そしてそのEcoRIの適当な大断片を有するプラスミドを
求めた。ｐＵＣ１３の、ｌａｃプロモーター由来の、こ
のポリペプチドの発現用の推定構造を更にスクリーニン
グした。菌体抽出物をポリアクリルアミドゲルで分析
し、次いでニトロセルロース紙に転写しそしてＬＴＢお
よびＬＨＲＨの接合体に対するウサギ抗血清を使って、
ウェスタンブロッティング法によってブロッティングし
た。目的のサイズのペプチドの両抗血清により検出され
た。 【００１９】４．発現プラスミドＫ６６および発現株Ｂ
ＴＡｌｌ８５の構築 ＬＴＢ−ＬＨＲＨ融合をコードする領域を完全な体で有
している、前記第３項で得られたｐＵＣ１３ＬＴＢ−Ｌ
ＨＲＨ融合プラスミドの５７３ｂｐのEcoR I断片をアガ
ロースゲルから単離し、そしてEcoRIで切り出したリン
酸化発現ベクターＰＫＫ２２３−３（ファルマシア社
製）中にライゲーションした。得られた発現プラスミド
ｐＢＴＡ Ｋ６６はｔａｃプロモーターの支配下に融合
たん白質を発現した。（この発現はＩＰＴＧで誘発され
るものである。）このプラスミドでＥ．コリ宿主株ＪＭ
１０１ (SupE、thi、(lac-pro AB) [F'tra D36, pro AB
lacIq ZM15])を形質転換して病主ベクター発現系ＢＴ
Ａ１１８５を得た。 【００２０】５．動物実験用のＬＴＢ／ＬＨＲＨ融合た
ん白質の生成と精製 上記した方法によってＬＴＢ（ＬＨＲＨ）3.5産主株を
増殖させた。２時間ＩＰＴＧで誘発した後に、遠心分離
（３，０００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体をペレ
ット化した。次いでこの菌体をｄＨ2Ｏ中に再けんだく
をしてフレンチプレス(French Press）により分解し
た。遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分間、４℃）に
より菌体破砕片を除去した後に、上澄みをアグチオ−ガ
ラクトースカラム（シグマ社）上に負荷した。次いで融
合たん白質を０．５Ｍガラクトースで溶出しそして０．
１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）に対して透
析した。 【００２１】抗原投与と免疫応答の測定 雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１８−２２ｇ）をAnimal R
esources Center （パース、西オーストラリア）から入
手した。全マウスは抗原を経口（ｏ．ｓ．）又は筋肉内
（ｉ．ｍ．）投与する前３〜４時間絶食させた。特別に
用意した哺乳針を使用して、０．１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩
緩衝液（ｐＨ９．５）中の適当な濃度の抗原をマウスに
経口投与した。一方、０．１ｍｌの無菌生理食塩水中に
溶かした同投与量の抗原をマウスの左後足に筋肉内注射
した。経口投与又は筋肉内注射により抗原を投与した各
５匹のマウスのグループには、０日目と１４日目の２回
に同量の抗原を投与した。２８日目にマウスを安楽死さ
せて、その生殖器官（卵巣および子宮）の重さを計っ
た。 【００２２】〔結果〕 粘膜免疫原の担体能の確認 表１から分かるように、遺伝子工学的に構築したＬＴＢ
−（ＬＨＲＨ)3.5融合たん白質をマウスに経口投与した
場合は、雌マウスの子宮および卵巣の合計重量と体重の
比が、ＬＨＲＨ−Ｂ−ガラクトシダーゼや遊離のＬＨＲ
Ｈやコントロールを筋肉内注射また経口投与した場合に
比べ、小さくなった。従ってこの実験動物は効果的に
「去勢された」ことになる。 【００２３】 【表１】 【００２４】 【発明の効果】本発明のポリヌクレオチド配列、ＤＮＡ
分子および形質転換体宿主により、脊椎動物宿主の粘膜
上皮と特異的に相互反応し得る担体分子に結合した免疫
原から成る複合体が得られる。この複合体は該免疫原の
免疫活性とその脊椎動物宿主の粘膜上皮と特異的に相互
反応する担体分子の活性とを実質的にあわせ持っており
かつ、この複合体は脊椎動物宿主において組織体系的な
細胞性および（または）粘膜性免疫応答を誘発せしめ得
るものである。本発明のポリヌクレオチド配列、ＤＮＡ
分子および形質転換体宿主は、脊椎動物宿主への経口投
与用医薬の製造に利用される。本発明のポリヌクレオチ
ド配列、ＤＮＡ分子および形質転換体宿主により得られ
る複合体は、脊椎動物宿主への経口投与用医薬として利
用される。 【００２５】〈略語の説明〉 １．ＥＬＩＳＡ： 酵素結合免疫分析 ２．ＥＴＥＣ： 腸毒素原性大腸菌（E.Col
i） ３．ＧＡＬＴ： 腸関連リンパ系組織 ４．ｉ．ｍ．： 筋肉内 ５．ＬＨＰＨ： 黄体形成ホルモン放出ホル
モン ６．ＬＴＢ： 腸毒素原性大腸菌の非熱安
定性毒素
【図面の簡単な説明】
【図１】ＬＴＢコード配列を含有するＤＮＡ断片の作成
例を示す図。 【図２】合成ＬＨＲＨをコードするオリゴヌクレオチド
の作成例を示す図。 【図３】合成ＬＨＲＨをコードするオリゴヌクレオチド
およびそのコードするアミノ酸配列を示す図。 【図４】ＬＴＢ／ＬＨＢＨ融合ベクターがコードするア
ミノ酸配列を示す図。
例を示す図。 【図２】合成ＬＨＲＨをコードするオリゴヌクレオチド
の作成例を示す図。 【図３】合成ＬＨＲＨをコードするオリゴヌクレオチド
およびそのコードするアミノ酸配列を示す図。 【図４】ＬＴＢ／ＬＨＢＨ融合ベクターがコードするア
ミノ酸配列を示す図。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 ド・エイツプリユア，ヘンリー・ジエイ
ムス
オーストラリア国 ニユー・サウス・ウ
エールズ、2207、ベツクスレイ、ダグラ
ス・ストリート ９
(72)発明者 ハウエ，ピーター
オーストラリア国 ニユー・サウス・ウ
エールズ、2120、ウエスト・ペナント・
ヒルズ、ミユンドン・プレイス ６
(72)発明者 ランド，ケイス・ノーマン
オーストラリア国 ニユー・サウス・ウ
エールズ、2067、カツツウツド、フレン
コート・アヴエニユー 10エイ
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．担体分子のアミノ酸配列に融合した免疫原のアミノ
酸配列を含有して成り、該担体分子が脊椎動物宿主の粘
膜上皮と特異的に相互反応し得、かつ脊椎動物宿主にお
いて組織体系的な細胞性および（または）粘膜性免疫応
答を誘発せしめ得るたん白質をコードするポリヌクレオ
チド配列から成るＤＮＡ。 ２．たん白質が担体分子のアミノ酸配列に融合した抗原
又はハプテンを含有して成るものである請求項１記載の
ＤＮＡ。 ３．たん白質が、担体分子のアミノ酸配列に融合したＬ
ＨＲＨの全部、１部又はその同族体、相同体又は誘導体
又はその組合せを含有して成るものである請求項１記載
のＤＮＡ。 ４．担体分子のアミノ酸配列に融合した免疫原のアミノ
酸配列を含有して成り、該担体分子が脊椎動物宿主の粘
膜上皮と特異的に相互反応し得、かつ脊椎動物宿主にお
いて組織体系的な細胞性および（または）粘膜性免疫応
答を誘発せしめ得るたん白質をコードするポリヌクレオ
チド配列から成るＤＮＡと、ベクターＤＮＡとからなる
組換えＤＮＡ分子。 ５．ベクターＤＮＡがプラスミドＤＮＡである請求項４
記載の組換えＤＮＡ分子。 ６．プラスミドｐＢＴＡＫ６６０である請求項４記載の
組換えＤＮＡ分子。 ７．ベクターＤＮＡがウイルス、バクテリオファージ又
はコスミドＤＮＡである請求項４記載の組換えＤＮＡ分
子。 ８．担体分子のアミノ酸配列に融合した免疫原のアミノ
酸配列を含有して成り、該担体分子が脊椎動物宿主の粘
膜上皮と特異的に相互反応し得、かつ脊椎動物宿主にお
いて組織体系的な細胞性および（または）粘膜性免疫応
答を誘発せしめ得るたん白質をコードするポリヌクレオ
チド配列から成るＤＮＡと、プラスミドＤＮＡとからな
る組換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主。 ９．宿主がグラム陰性菌、グラム陽性菌、酵母、真菌又
は高等真核細胞である請求項８記載の宿主。 １０．宿主がＥ．コリである請求項８又９に記載の宿
主。 １１．ＡＴＣＣ ６７１１４と指定した請求項８の形質
転換宿主の培養体。
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