JP2003512441A - 極性上皮細胞層を横断するタンパク質の送達 - Google Patents

極性上皮細胞層を横断するタンパク質の送達

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Abstract

(57)【要約】 本発明は生物活性複合体を提供する。該生物活性複合体は、（１）α２マクログロブリン受容体（α２−ＭＲ）に結合する細胞認識部分と（２）生物活性部分とを含み、該生物活性部分は（ａ）生物活性をもち、（ｂ）単独では免疫反応を誘導する免疫原としては機能せず、また（ｃ）ＡＤＰリボシル化活性をもたない。本発明の生物活性複合体は生物活性部分を極性上皮細胞膜を横断して輸送する方法に有用である。したがって、本発明はタンパク質を注射によらずに非経口的に投与する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願との相互参照 本願は1999年10月22日付仮出願U.S.S.N 60/160,923号に対する優先権を主張す
るものであり、同仮出願の開示内容は参照指示により本書にその全体が組み込ま
れる。 連邦政府後援の研究開発に基づく発明への権利に関する声明 該当せず。
【０００２】 発明の背景 本発明は分子生物学及び医薬の分野に関連する。 組換えDNA技術のおかげで高純度タンパク質の大量生産が可能となるに至った
。その種のタンパク質には目下医薬品として使用されているものも多い。遺伝子
組換えで生産されている医薬タンパク質はたとえばインスリン、エリスロポエチ
ン、ヒト成長ホルモン、βインターフェロンなどである。
【０００３】 全身に到達させる必要がある医薬タンパク質は経腸投与することができない。
全身に到達する前に消化器系酵素により分解されてしまうからである。そこで、
医薬タンパク質は一般に注射で投与する。長期にわたるタンパク質の投与が必要
とされる糖尿病などの疾患では、毎日注射が必要となる場合もある。もちろん、
頻繁な注射は患者には不愉快であり、最善の投与方法でもないであろう。したが
って、注射によらずにタンパク質を送達する手段が実現すれば好都合であろう。
【０００４】 種々のタンパク質は粘膜表面を横断して全身に到達することが知られている。
たとえばvan Deurs 他(European J. Cell Biol., 51: 96 (1990))は、リシンが
トランスサイトーシスによって上皮組織を横断することを証明した。EP 0 222 8
35号（B1）(Russell-Jones 他、May 25, 1987)は、粘膜上皮組織と特異的に相互
作用する種々の毒素などを含む担体分子の、細胞性免疫の誘導を目的とした免疫
原の経口送達への使用について開示している。
【０００５】 シュードモナス属外毒素A (PE)は緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa)が産生す
る毒性タンパク質である。このタンパク質は天然型では、上皮細胞を含むさまざ
まな細胞表面に見られるα2マクログロブリン受容体(α2-MR)に結合する。その
分子は4ドメインを含む。ドメインIaはα2-MRに結合する。ドメインIIは細胞内
への該分子のエンドサイトーシスを引き起こす。ドメインIbは機能が特定されて
いない。ドメインIII は(タンパク質合成の不活性化を仲介することにより)毒性
を引き起こし、また小胞体内に毒素を保持する働きをする。PEでは新特性を付与
する遺伝子組換えが幅広く行われてきた。たとえば、ドメインIaは特定の標的受
容体へと結合するタンパク質に置き換えられた。
【０００６】 ドメインIII には結合能を付与するためにターゲティングタンパク質が組み込
まれた。その種の構築体は抗毒素としての用途が見つかっている。ADPリボシル
化活性を取り除くためのドメインIII の組換えも行われた。ドメインIIは移行能
を保持したまま短縮された。このように、PEの各ドメインは比較的独立した機能
単位として働くので、他の機能単位への取り換えが可能であり、またそれ自体の
幅広い組換えも可能である。たとえば次の資料を参照: 米国特許第5,863,745号(
FitzGerald 他.); 米国特許第5,854,044号(Pastan 他.); 米国特許第5,705,163
号(Pastan 他.); 米国特許第5,705,156号(Pastan 他.); 5,696,237号(FitzGeral
d 他.); 米国特許第5,602,095号(Pastan 他.); 米国特許第5,458,878号(Pastan
他.); 米国特許第5,082,927号(Pastan 他.); 米国特許第4,892,827号(Pastan 他
.); Y. Reiter 他., Nature Biotechnology (1996) 14:1239及びU. Brinkmann a
nd I. Pastan, Biochim. et Biophys. Acta (1994) 1198:27。
【０００７】 発明の要約 α2マクログロブリン受容体に結合する分子は、極性上皮細胞層の頂面に適用
すると、細胞膜の基底側を横断して上皮下腔へと抜け出ることができる。本発明
はこの特性を利用してα2マクログロブリン受容体に結合する分子を担体として
用い、それと結合したタンパク質や分子を上皮細胞表面を横断して送達し、もっ
てタンパク質の注射を不要にしようとするものである。かかる結合性分子のこう
した使用は思いがけないものである。というのは、それらの分子に結合したタン
パク質が細胞表面横断後も活性を保持するとは誰にも予測できなかったと思われ
るからである。したがって、本発明は注射を用いない経粘膜的な送達によるタン
パク質の非経口的投与法を提供する。本発明はくり返し注射されるインスリン、
インターフェロン、成長ホルモン、エリスロポエチンなどのようなタンパク質医
薬の投与に使用できる。
【０００８】 別の態様では、本発明は生物活性複合体であって(1) α2マクログロブリン受
容体(α2-MR)に結合する細胞認識部分と(2)生物活性部分とを含み、該生物活性
部分は(a)受容体結合性、サイトカイン活性、酵素活性、ホルモン活性、インタ
ーロイキン活性、神経伝達活性、転写又は翻訳調節、及び生物有機分子に対する
親和性から選択される生物活性をもち、(b)単独では免疫反応を誘導する免疫原
としては機能せず、また(c)ADPリボシル化活性をもたないことを特徴とする生物
活性複合体を提供する。
【０００９】 一実施態様では、上皮細胞層はインビトロ培養した膜である。別の実施態様で
は、上皮細胞層は対象哺乳動物の粘膜表面である。
【００１０】 他実施態様では、細胞認識部分はα2ミクログロブリンに結合する抗体を含む
か、α2ミクログロブリンに結合するに足るシュードモナス属外毒素A (PE)ドメ
インIaの一部分を含むか、又はシュードモナス属外毒素A (PE)ドメインIaを含み
かつ複合体がさらにPEのドメインIIを含む。別の実施態様では、複合体は(a) シ
ュードモナス属外毒素A (PE)ドメインIa、(b)極性上皮細胞層の頂面から基底面
への移行を引き起こすに足るPE部分を含むPE複合体であって、該PE部分はPEドメ
インII、リボシル化活性をもたないPEドメインIII の少なくとも一部分、及び所
望によりPEドメインIbを含み、また生物活性部分はポリペプチドを含むことを特
徴とする。
【００１１】 他実施態様では、粘膜表面は呼吸器系、胃腸系又は生殖器系の粘膜表面である
。 他実施態様では、生物活性部分はポリペプチドであり、該ポリペプチドは抗体
、レクチン、DNA結合性タンパク質、脂質結合性タンパク質、細胞表面受容体に
対応するリガンド、酵素、インスリン、インターフェロン、成長ホルモン又はエ
リスロポエチンを含む。別の実施態様では、生物活性部分は第二ポリペプチド、
炭水化物、脂質又は核酸に結合したポリペプチドリガンドを含む。
【００１２】 別の実施態様では、生物活性部分がポリペプチドを含み、複合体が該ポリペプ
チドに細胞認識部分を融合させてなる融合タンパク質を含む。別の実施態様では
、該融合タンパク質はプロテアーゼによって認識される開裂部位を含み、開裂に
より融合タンパク質から生物活性部分が放出されることを特徴とする。
【００１３】 一態様において、本発明は極性上皮細胞層を横断して生物活性部分を輸送する
方法を提供するが、該輸送法は本発明の生物活性複合体を該細胞層の頂面に適用
することを含む。
【００１４】 別の態様において、本発明は製薬上許容しうる担体と本発明の生物活性複合体
とを含有する、局所投与用に調製される製剤組成物を提供する。
【００１５】 別の態様において、本発明は融合タンパク質複合体をコードするヌクレオチド
配列を含む核酸を提供するが、該融合タンパク質は(1) α2マクログロブリン受
容体(α2-MR)に結合する細胞認識部分と融合した (2)遺伝子又は遺伝子産物の発
現又は活性を変化させる活性をもつ生物活性部分を含み、該生物活性部分は(a)
受容体結合性、サイトカイン活性、酵素活性、ホルモン活性、インターロイキン
活性、神経伝達活性、転写又は翻訳の調節、及び生物有機分子に対する親和性か
ら選択される生物活性をもち、(b)単独では免疫反応を誘導する免疫原としては
機能せず、また(c)ADPリボシル化活性をもたないことを特徴とする。
【００１６】 （発明の詳細な説明） I. 定義 特に断らない限り、本書で使用する技術・学術用語はすべて当業者に慣用の意
味をもつ。本発明で使用する数多くの用語の一般的な意味は以下の参考資料に記
載されている: Singleton 他、「DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR B
IOLOGY」(2d 版、1994);「THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLO
GY」(Walker ed., 1988);「THE GLOSSARY OF GENETICS」5版、R. Rieger 他.(編
), Spring Verlag (1991);及びHale & Marham「THE HARPER COLLINS DICTIONARY
OF BIOLOGY」(1991)。以下の用語の意味は本書では特に断らない限り、次のと
おりとする。
【００１７】 「核酸」はヌクレオチド単位(リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド
、関連の天然に存在する構造変異体及びそれらの天然に存在しない合成類縁物質
) がホスホジエステル結合又は他の合成結合を介して連結した高分子をいう。ヌ
クレオチド配列をDNA配列(すなわちA、T、G及びC)で表わすときは、UがTに置き
換わるRNA配列(すなわちA、T、G及びC)をも含むものとする。
【００１８】 ヌクレオチド配列は慣用の表記法を用いて表わす。すなわち一本鎖ヌクレオチ
ド配列の左手側末端は5’末端であり、二本鎖ヌクレオチド配列の左手方向は5’
方向という。新生RNA転写産物に対する5’から3’への付加方向は「転写方向」
という。mRNA配列と同じ配列をもつDNA鎖は「コード鎖」という; DNA鎖上の配列
であって、そのDNAから転写されるmRNAと同じ配列をもちRNA転写産物の5’末端
に対して5’に位置する配列は「上流配列」という; DNA鎖上の配列であって、そ
のDNAから転写されるmRNAと同じ配列をもち、コードRNA転写産物の3’末端に対
して3’に位置する配列は「下流配列」という。
【００１９】 「〜をコードする」はポリヌクレオチド中の特定ヌクレオチド配列(たとえば
遺伝子、cDNA又はmRNA)の固有の性質であって、定義済みヌクレオチド配列(すな
わちrRNA、tRNA及びmRNA)か又は定義済みアミノ酸並びにそれに由来する生物学
的性質をもつ他の高分子及び巨大分子を生物学的過程において合成するための鋳
型として機能する固有の性質をいう。したがって、細胞や他の生体系においてあ
る遺伝子に由来するmRNAの転写と翻訳からあるタンパク質が産生される場合には
、その遺伝子はそのタンパク質をコードしていることになる。遺伝子又はcDNAの
、そのヌクレオチド配列がmRNAと同一であり通常は塩基配列表に記載されている
コード鎖及び転写用鋳型として使用される非コード鎖はどちらも、その遺伝子又
はcDNAのタンパク質又は他の産物をコードしているといえる。特に断らない限り
、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重版であってか
つ同じアミノ酸配列をコードする諸々のヌクレオチド配列を含む。タンパク質及
びRNAをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含む場合もある。
【００２０】 「組換え核酸」は天然には結合していない複数のヌクレオチド配列をもつ核酸
をいう。増幅又は組立組換え核酸を入れた適当なベクターを使用すれば、適当な
宿主細胞を形質転換することができる。組換え核酸を含む宿主細胞は「組換え宿
主細胞」という。次にその遺伝子を組換え宿主細胞内で発現させれば、たとえば
「組換えポリペプチド」が産生される。組換え核酸は(たとえばプロモーター、
複製起点、リボソーム結合部位などとして)非コード機能をも果たす場合もある
。
【００２１】 「発現調節配列」はポリヌクレオチド中のヌクレオチド配列であって、それと
作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現(転写及び／又は翻訳)を調節する
ものをいう。「作動可能に連結された」は、一方の部分の活性(たとえば転写調
節能)が他方の部分の働き(たとえば配列の転写)を招く結果となるような、2部分
間の機能的な関係をいう。発現調節配列は(たとえば誘導的又は構成的)プロモー
ター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン(すなわちATG)、イント
ロン用のスプライシングシグナル、及び終止コドンの配列を含むことができるが
、それだけに限らない。
【００２２】 「発現カセット」は発現性ヌクレオチド配列に作動可能に連結させた発現調節
配列を含む組換え核酸構築体をいう。発現カセットは一般に発現用の十分なシス
作動性エレメントを含むが、他の発現用エレメントを宿主細胞又はインビトロ発
現系によって供給することもできる。
【００２３】 「発現ベクター」は発現カセットを入れたベクターをいう。発現ベクターには
発現カセットを入れた当業界で既知のすべてのベクター、たとえばコスミド、 (
たとえば剥き出しの、又はリポソームに入れた) プラスミド、及びウィルスなど
がある。
【００２４】 「ポリペプチド」はアミノ酸残基、関連の天然に存在する構造変異体及びそれ
らの天然には存在しない合成類縁物質がペプチド結合で連結されたもの、関連の
天然に存在する構造変異体及びそれらの天然には存在しない合成類縁物質をいう
。合成ポリペプチドは、たとえば自動ポリペプチド合成装置を使用して合成する
ことができる。一般に、「タンパク質」は大きなポリペプチドをいい、「ペプチ
ド」は短いポリペプチドをいう。
【００２５】 「融合タンパク質」は、2以上のポリペプチドが、一方のポリペプチドのアミ
ノ末端と他方のポリペプチドのカルボキシル末端によって形成されるペプチド結
合による連結によって形成されるポリペプチドをいう。融合タンパク質は一般に
、単一の連続した融合タンパク質をコードする核酸配列から単一ポリペプチドと
して発現させることができる。ただし、構成ポリペプチドの化学結合によって融
合タンパク質を形成することもできる。
【００２６】 本書では慣用の表記法でポリペプチド配列を表わす。すなわちポリペプチド配
列の左手側末端はアミノ末端であり、右手側末端はカルボキシル末端である。
【００２７】 「同類置換（conservative）」はポリペプチド中のアミノ酸の、機能的に類似
するアミノ酸との置換をいう。次の6群はそれぞれ、互いに同類置換をなすアミ
ノ酸を含んでいる:
【００２８】 1) アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T); 2) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E); 3) アスパラギン(N)、グルタミン(Q); 4) アルギニン(R)、リシン(K); 5) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオナン(M)、バリン(V); 6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
【００２９】 「対立遺伝子の変異体」は同じ遺伝子座を占める複数の遺伝子多型相のうちの
いずれかをいう。対立遺伝子の変異は突然変異により自然に起こるが、個体群中
に表現型多型をもたらすことがある。遺伝子の突然変異はサイレント(コードさ
れるポリペプチドの変化を伴わない)変異の場合もあれば、アミノ酸配列を変化
させたポリペプチドをコードする場合もあろう。「対立遺伝子の変異体」は、対
立遺伝子の変異体のmRNA転写産物に由来するcDNA、又はそれによってコードされ
るタンパク質についてもいう。
【００３０】 配列比較では、一般に一方の配列が基準配列となり、それと評価配列が比較さ
れる。配列比較アルゴリズムを使用するときは、評価及び基準配列をコンピュー
タに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、また配列アルゴリズムのプロ
グラムパラメーターを指定する。プログラムパラメーターはデフォルト値が使用
される。比較のための配列アラインメント法は当業界で周知である。比較のため
の最適配列アラインメントは、たとえば、Smith & Waterman「Adv. Appl. Math.
」2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch.「J. Mo
l. Biol.」48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson
& Lipman「Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA」85: 2444 (1988)の類似性検索法に
より、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行(Wisconsin Genetics
Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA; Genetics Computer Gro
up, 575 Science Dr., Madison, WI)により、又はマニュアルアラインメントと
目視検査により(たとえば、「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausu
bel 他編、1995 supplement))、行うことができる。
【００３１】 有用なアルゴリズムの一例はPILEUPである。PILEUPはFeng & Doolittle「J. M
ol. Evol.」35:351-360 (1987)の段階的アラインメント法の拡充版を用いる。使
用される方法はHiggins ＆ Sharp「CABIOS」5:151-153 (1989)に記載の方法と類
似している。PILEUPでは、次のパラメーターを用いて基準配列を他の評価配列と
比較して配列同一性パーセントを求める: ギャップウェートのデフォルト値(3.0
0)、ギャップ長ウェートのデフォルト値(0.10)、及びウェート付きの末端ギャッ
プ。PILEUPはGCC配列解析ソフトウェアパッケージのたとえばversion 7.0から得
られる(Devereaux 他., Nuc. Acids Res. 12: 387-395 (1984))。
【００３２】 配列同一性及び配列類似性パーセントの算定に適したもう1つのアルゴリズム
例は、Altschul 他「J. Mol. Biol」215: 403-410 (1990)及びAltschul 他「Nuc
leic Acids Res.」25:3389-3402 (1977)に記載のBLAST及びBLAST 2.0アルゴリズ
ムである。BLAST解析用のソフトウェアはNational Center for Biotechnology I
nformationを通じて公開されている(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。BLASTNプ
ログラム(ヌクレオチド配列用)はデフォルト値として語長(W) 11、アラインメン
ト(B) 50、期待(E) 10、M=5、N=4を用い、また両鎖の比較を用いる。BLASTPプロ
グラム(アミノ酸配列用)はデフォルト値として語長(W) 3、期待(E) 10を用い、
またBLOSUM62スコアマトリックスを用いる(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)を参照)。
【００３３】 「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は50%ホルムアミド、5x
SSC及び1% SDS、42℃でのインキュベーション又は5x SSC、1% SDS、65℃でのイ
ンキュベーション、それに0.2x SSC、0.1% SDS、65℃での洗浄をいう。
【００３４】 「リガンド」は標的分子に特異的に結合する化合物をいう。 「受容体」はリガンドに特異的に結合する化合物をいう。
【００３５】 「抗体」は、エピトープ(抗原など)を特異的に認識、結合する1以上の免疫グ
ロブリンL鎖又はH鎖可変部を含むポリペプチドリガンドをいう。これには、完全
な形の免疫グロブリンや技術上周知のその変異体又は部分、たとえばFab’フラ
グメント、F(ab)’2フラグメント、及びscFvタンパク質などが含まれる。scFvは
L鎖可変部とH鎖可変部がリンカーで結合された融合タンパク質である。天然の免
疫グロブリンは免疫グロブリン遺伝子によってコードされている。たとえばカッ
パ及びラムダL鎖定常部遺伝子、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミ
ューH鎖定常部遺伝子、それに無数の免疫グロブリン可変部遺伝子などである。
「抗体」は免疫、ハイブリドーマ又は組み換えによって産生されるポリクローナ
ル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体などである。
【００３６】 リガンド又は受容体が分析物と「特異的に結合する」のは、該リガンド又は受
容体が異種の化合物試料中に該分析物が存在することの決め手となる結合反応で
機能する場合である。したがって、リガンド又は受容体は特定の分析物に対して
優先的に結合し、試料中の他の化合物にはあまり結合しない。たとえば、あるポ
リヌクレオチドは相補配列を含むポリヌクレオチドとしての分析物に特異的に結
合し、また抗体は該抗体の産生を誘導したエピトープをもつ抗原としての分析物
に免疫検定条件下で特異的に結合する。
【００３７】 「実質的に純粋な」又は「単離(された)」は、目的の種が卓越種として存在(
たとえばモルベースで、組成物中の他のいかなる高分子種よりも高濃度に存在)
することを意味し、また実質的に純粋な画分は目的の種が(モルベースで)全高分
子種の50%以上存在するような組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は
組成物中に存在する高分子種の約80%〜90%が精製された目的種であることを意味
する。組成物が本質的に単一高分子種からなる(通常の検出法で組成物中に汚染
種が検出されない)ならば、目的種は本質的に均質に精製されたことになる。こ
の定義では、溶媒種、小分子(<500Da)、安定剤(BSAなど)、及び元素イオン種は
高分子種とみなさない。
【００３８】 「リンカー」は2分子を共有結合、イオン結合、ファンデルワールス結合又は
水素結合で結びつける別の分子をいう。
【００３９】 「医薬組成物」は哺乳動物への医薬としての使用に適した組成物をいう。医薬
組成物は薬理的有効量の有効成分と製薬上許容しうる担体とを含有する。「薬理
的有効量」は所期の薬理効果を生み出すうえで有効な成分量をいう。「製薬上許
容しうる担体」はリン酸緩衝生理食塩水、5%デキストロース水溶液、水中油又は
油中水型などの乳濁液、種々の湿潤剤及び／又はアジュバントなどのような、任
意の標準的な製薬担体、緩衝液及び賦形剤をいう。適当な製薬担体及び調剤は「
REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE」19版 (Mack Publishing Co., Easton,
1995)に記載されている。好ましい製薬担体は有効成分の所期投与方式に左右さ
れる。本発明の複合体は粘膜表面から投与される。「製薬上許容しうる塩」は医
薬用化合物へと調製しうる塩、たとえば金属(ナトリウム、カリウム、マグネシ
ウム、カリウムなど)塩及びアンモニア又は有機アミン塩である。
【００４０】 診断又は処置の「対象」は人間又は人間以外の哺乳動物である。人間以外の処
置又は診断「対象」哺乳動物は霊長類、有蹄類、イヌ科及びネコ科の動物などで
ある。対象はウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギなどの家畜でもよい。
【００４１】 「処置」は予防上又は治療上の処置をいう。 「予防上の」処置は、疾病の徴候を示していない、又は初期徴候を示すにすぎ
ない対象に対して、病理進行のリスクを低減させる目的で実施される処置をいう
。
【００４２】 「治療上の」処置は病理徴候を示している対象に対して、そうした徴候の緩和
又は一掃を目的に実施される処置をいう。
【００４３】 「診断」は病状の存在又は性質の解明をいう。診断法は有病正診率と無病正診
率が異なる。診断法の「有病正診率」は検査結果が陽性と出る有病者の比率(真
陽性比率)である。診断法の無病正診率は1マイナス偽陽性率であるが、偽陽性率
というのは検査結果が陽性と出る無病者の比率である。診断法によっては状態の
最終的な診断が下せない場合もあろうが、診断に役立つ陽性の印を示す診断法で
あれば十分である。
【００４４】 「予後」は起こる可能性が大きい病状進行(重篤度など)の予測をいう。 「生物活性部分」は生物有機分子であって、(a)受容体結合性、サイトカイン
活性、酵素活性、ホルモン活性、インターロイキン活性、神経伝達活性、転写又
は翻訳調節、及び別の生物有機分子(免疫グロブリンなど)に対する親和性から選
択される生物活性をもち、(b)単独では免疫反応を誘導する免疫原としては機能
せず、また(c)ADPリボシル化活性をもたないことを特徴とする生物有機分子をい
う。
【００４５】 「生物有機分子」は、一般に生体で産生される種類の有機分子をいう。これに
はたとえばヌクレオチド、アミノ酸、糖、脂肪酸、ステロイド、核酸、ポリペプ
チド、炭水化物、脂質、これらの化合物の組み合わせ（たとえば、糖タンパク質
、リボ核タンパク質、リポタンパク質）などが含まれる。
【００４６】 「シュードモナス属外毒素A」又は「PE」はシュードモナス・エルギノサ（P.
aeruginosa）が分泌する67 kDタンパク質であり、3つの際立った球状ドメイン(I
a、II及びIII )及びドメインIIとIII をつなぐ1つの小さなサブドメイン(Ib)か
らなる(A.S.Allured 他（1986)「Proc. Natl. Acad. Sci.」83: 1320 -1324)。
PEのドメインIaは細胞結合を仲介する。自然状態では、ドメインIaはα2マクロ
グロブリン受容体(α2-MR) 、すなわち、低密度リポタンパク質受容体関連タン
パク質(LRP)に結合する(M.Z. Kounnas他 (1992)「J. Biol. Chem.」267:1240-23
)。その位置はアミノ酸1〜252にまたがる。ドメインIIはサイトゾルへの移行を
仲介する。その位置はアミノ酸253〜364にまたがる。ドメインIbは機能が判明し
ていない。その位置はアミノ酸365〜399にまたがる。ドメインIII は細胞毒性の
原因であり、小胞体保持配列を含む。ドメインIII は、タンパク質の合成を不活
性化する伸長因子2 (EF2)のADPリボシル化を仲介する。その位置はアミノ酸400
〜613にまたがる。PEはEF2のADPリボシル化活性を欠く場合には「無害」である
。ドメインIII からアミノ酸E553が欠失 (ΔE553) するとPEは無害化する。PEの
対立形質はこの定義に包摂される。M.L. Vasil 他 (1986)「Infect. Immunol.」
52: 538-48を参照。シュードモナス属外毒素Aのヌクレオチド配列(配列番号1)と
推定アミノ酸配列(配列番号2)は次のとおりである:
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】 II. 上皮膜を横断する生物活性複合体 A. 基本構造 本発明は、適用部位となる上皮膜の頂面から基底面へと横断することができる
生物活性複合体を提供する。本発明の生物活性複合体は(1)細胞認識部分及び(2)
生物活性部分を含む。細胞認識部分は上皮膜頂面上の受容体、最も好ましくはα 2 マクログロブリン受容体(α2-MR)に結合する働きをする。好ましい実施態様で
は、該複合体は細胞認識ドメインとポリペプチド生物活性部分が単一ポリペプチ
ドとして産生される融合タンパク質を含む。しかし、各部分を互いに化学結合さ
せることによって複合体を調製することもできる。
【００５１】 実施態様によっては、本発明の複合体は「PE複合体」であり、 (3)上皮細胞の
頂面に結合された複合体の上皮細胞基底側への輸送途上において細胞サイトゾル
への移行を仲介する「PE部分」をさらに含む。実施態様によっては、生物活性部
分はPEのIbドメイン内に配置されていない。他の生物活性機能をもたせるための
変更を何ら受けていない天然型PE又はその無毒化版は本発明の複合体ではない。
【００５２】 Ｂ．細胞認識部分 本発明の複合体は「細胞認識部分」をコードするアミノ酸配列を含む。細胞認
識部分は極性上皮細胞層頂面の細胞表面受容体に対応するリガンドとして機能し
、細胞への複合体の結合を仲介する。該部分の目的は複合体を該膜表面に結合さ
せることであるが、それは膜基底側への移行を実現するための最初の、最も重要
な工程である。本発明のPE複合体では、細胞認識部分は好ましくはPEのドメイン
Iaの場所に位置する。ただし、このドメインは通常の編成配列の外へ移動させる
ことができる。特に、細胞認識部分はPEドメインIII 内の、該ドメインの最初の
70アミノ酸の後に挿入することができる。また、細胞認識部分は複合体へと化学
的に結合することもできる。
【００５３】 細胞認識ドメインは、それが細胞結合機能を果たすことを可能にするような任
意の場所に配置することができる。好ましい実施態様では、細胞認識部分はPEの
ドメインIaの位置に取って代わる。それは融合タンパク質として、又はリンカー
を介して、該PE部分に取り付けることができる。あるいは、細胞認識ドメインは
ドメインIII の代わりに、又はドメインIII 内に配置することもできる。
【００５４】 最も好ましくは、細胞認識部位はα2マクログロブリン受容体に結合するポリ
ペプチドである。その種のポリペプチドはたとえば天然のリガンド又は抗体であ
る。好ましい実施態様では、細胞認識ドメインはα2マクログロブリン受容体に
結合するPEドメインIaの天然配列である。別の実施態様では、細胞認識部分はα 2 マクログロブリンである。他の実施態様では、細胞認識部分はα2-MRを認識す
る抗体である。好ましくは、該免疫グロブリンの一鎖はPE部分との融合タンパク
質として産生される。その種の融合タンパク質には一本鎖Fvフラグメント(scFv)
が含まれる。一実施態様では、ドメインIaは該標的受容体に対して特異的な免疫
グロブリンに由来する免疫グロブリンH鎖に対応するポリペプチド配列で置き換
わる。該免疫グロブリンのL鎖はPE複合体と同時発現させてL鎖H鎖二量体を形成
させるようにすることができる。複合体タンパク質では、抗体をこのキメラ免疫
原の他ドメインを含むポリペプチドと化学的に結合させる。
【００５５】 細胞特異的リガンドの取り付けにはリンカーを使用することもできる。該リン
カーは両分子に対し共有結合又は高親和性の非共有結合を形成することができる
。好適なリンカーは当業者に周知であり、直鎖又は分岐鎖炭素リンカー、複素環
式炭素リンカー、又はペプチドリンカーなどを含むが、それらに限らない。リン
カーは構成要素のアミノ酸へと、その側基を介して(たとえばシステインとのジ
スルフィド結合により)結合される場合もある。
【００５６】 キメラ免疫原に使用する機能的な細胞認識部分を特定するにはいくつかの方法
が有用である。一つの方法は細胞認識部分を含む複合体の、受容体との、又は受
容体含有細胞との結合を検出する方法である。他の方法は、膜基底側への複合体
の移送(これは第1工程である細胞結合性の成功を表わす)を検出する方法である
。これらの方法は後に、「生物活性複合体の試験」の節で詳しく説明する。
【００５７】 C. PE部分 実施態様によっては、本発明の複合体はPE部分をさらに含む。その種の複合体
はPE複合体という。PE複合体はPEドメインII、PEドメインIII 、及び所望により
PEドメインIbに由来するアミノ酸配列を含む。PE複合体が上皮膜頂面から基底側
へと通過する途上で頂面からサイトゾルへのPE複合体の移行を引き起こすには、
これらのアミノ酸配列で十分である。
【００５８】 PE部分はPEドメインIIに由来する配列を含む。このドメインはアミノ酸253〜3
64にまたがる。PE部分にはドメインIIの全配列を含めてもよいが、移行を引き起
こすには全配列が必要というわけではない。たとえば必要最小限の配列としてPE
ドメインIIのアミノ酸280〜344を含めればよい。この領域以外の配列、すなわち
アミノ酸253〜279及び／又は345〜364はドメインIIから削除してよい。このドメ
インは、移行活性が維持される限りで、置換による組換えにも可能である。
【００５９】 PE部分には所望によりPE Ibドメインを含めてもよい。天然型のシュードモナ
ス属外毒素AではドメインIbは配列番号2のアミノ酸365〜399にわたり、またPEド
メインIIとPEドメインIII の間に位置する。天然型ドメインIbの構造的特徴は位
置372と379の2システイン間のジスルフィド結合にある。ドメインIbは細胞結合
にも移行にも不可欠というわけではないので、組換え又は完全削除が可能である
。たとえば、このドメインを約1500アミノ酸までの他アミノ酸配列で置き換えて
もよい。PE Ibドメインは線状でもよいしシステイン−システイン・ループを含
んでもよい。しかし、複合体には天然型PE Ibドメインを残すのが好ましい。そ
の種の構築体のほうが作製に手間がかからないからである。
【００６０】 天然型PEではドメインIII は3つの機能をもつ。第1にそのアミノ末端部分のア
ミノ酸400〜470は移行に関与しているように見受けられる。第2にドメインIII
はADPリボシル化活性を示す。第3にPEドメインIII はエンドサイトーシスで取り
込まれた毒素を小胞体中に導くER保持配列を含む。
【００６１】 PE部分は一般に、PEドメインIII のうち移行に必要な部分を含むであろうし、
また好ましくはそれ以外の部分を含まないであろう。たとえば、PE部分は一般に
PEドメインIII のアミノ末端部分に由来する少なくとも70アミノ酸(配列番号2の
アミノ酸400〜470)を含むであろう。
【００６２】 PEのリボシル化活性はPEのアミノ酸400〜600あたりに存在する。本発明の生物
活性複合体は好ましくは無害である。そうした実施態様ではリボシル化活性をな
くする。それは好ましくは、PEドメインIII のおよそアミノ酸470 (配列番号2)
以降の配列を除去することによって実現される。あるいは、アミノ酸E553の除去
(ΔE553)によりADPリボシル化活性を失わせてもよい。M. Lukac 他. (1988)「In
fect. and Immun.」56:3095-3098.
【００６３】 PEドメインIII はそのカルボキシル末端に小胞体(ER)保持配列を含む。ER保持
配列は配列REDLK (配列番号2のアミノ酸609〜613)をもつ。この配列は細胞内にE
Rを保持する機能を果たす。この機能は本発明のPE複合体に不可欠ではないので
、ER配列は除去するのが好ましい。
【００６４】 PE部分は次のように機能する。キメラタンパク質はこの細胞表面上の受容体に
結合した後、エンドサイトーシスによりクラスリンで被覆されたくぼみから細胞
に取り込まれる。265及び287残基は、ジスルフィドループを形成するシステイン
である。酸性環境のエンドソーム中に取り込まれると、ペプチドがArg279とGly2
80の間でプロテアーゼのフリンによる開裂作用を受ける。するとジスルフィド結
合が解消される。Arg279の突然変異はタンパク質分解酵素による開裂を、ひいて
はその後のサイトゾルへの移行を阻害する。M. Ogata 他 (1990)「J. Biol. Che
m.」265: 20678-85. しかし、Arg279の下流配列を含むPE断片(PE37と呼ぶ)はサ
イトゾルへの移行能を実質的に保持する。C.B. Siegall 他 (1989)「J. Biol. C
hem.」264:14256-61. PEドメインIIのアミノ酸345以降の配列もまた、移行を阻
害することなく除去することができる。さらに、位置339と343のアミノ酸は移行
に必要であるように見える。C.B. Siegall 他 (1991)「Biochemistry」30:7154-
59.
【００６５】 好ましい実施態様では、PE部分のアミノ酸配列はPEに由来する連続配列である
。この実施態様では、PE部分は最小限、PE (配列番号2)のアミノ酸253〜470を含
む。別の好ましい実施態様では、細胞認識部分とPE部分は共にPEに由来する。そ
のため、これらの2部分はPE (配列番号2)のアミノ酸1〜470を含みうる。
【００６６】 PE部分の機能性を決定する方法については、後に「生物活性複合体の試験」の
節で説明する。
【００６７】 D. 生物活性部分 本発明の複合体にはポリペプチド、核酸、炭水化物又は脂質などのような生物
有機分子を含む「生物活性部分」が含まれる。この生物活性部分は(a)受容体結
合性、サイトカイン活性、酵素活性、ホルモン活性、インターロイキン活性、神
経伝達活性、転写又は翻訳の調節、及び別の生物有機分子(免疫グロブリンなど)
に対する親和性から選択される生物活性をもち、(b)単独では免疫反応を誘導す
る免疫原としては機能せず、また(c)ADPリボシル化活性をもたないことを特徴と
する。本発明の複合体の目的は、生物活性部分を粘膜下腔へと送達し、そこで生
物活性部分が固有の薬理作用を及ぼせるようにすることである。
【００６８】 好ましい実施態様では、生物活性部分はポリペプチドを含む。生物活性部分を
構成するポリペプチドは目的のポリペプチド又はその部分なら何でもよい。この
ポリペプチドはサイトカイン、インターロイキン、酵素、細胞の受容体に対応す
るリガンド、脈管形成阻害物質、標的受容体又は抗原に結合するか又はその活性
を遮断する抗体などのように、それ自体が所望の生物活性をもってもよい。ある
いは、生物活性を阻害する他分子の担体として機能するポリペプチドでもよい。
たとえば、このポリペプチドはDNA結合性タンパク質、炭水化物結合性タンパク
質(レクチン)、脂質結合性タンパク質、あるいはタンパク質リガンド又は受容体
とすることができる。したがって、活性部分は目的の核酸、炭水化物、脂質又は
他のタンパク質を送達するために使用することができる。
【００６９】 生物活性部分を構成するポリペプチドとして最も好ましいのは、目下注射によ
り非経口的に投与されている医薬タンパク質である。その種のタンパク質は、た
とえば、インスリン、インターフェロン(α-インターフェロン、β-インターフ
ェロン、γ-インターフェロンなど)、成長ホルモン、エリスロポエチン、組織プ
ラスミノーゲン活性化因子、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロフ
ァージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン(IL-1、IL-2又は腫瘍壊死
因子(TNF)など)、凝固因子VIII又はグルコセレブロシダーゼなどである。
【００７０】 生物活性部分は複合体に化学結合させることができる。しかし、複合体は細胞
認識部分、PE部分及び生物活性部分を含む単一融合タンパク質として遺伝子工学
的に作製するのが好ましい。複合体にポリペプチド部分を化学的又は遺伝子工学
的に結合させる手段は後述のとおりである。
【００７１】 生物活性部分は、移行又は細胞結合活性を妨げない限りで、複合体の任意の位
置に結合させることができる。一実施態様では、生物活性部分をPEのドメインIa
又はα2-MRに対する抗体などのような細胞認識部分に直接結合させる。本発明の
PE複合体では、3部分の相対位置はアミノ末端側から順に細胞認識部分−PE部分
−生物活性部分とする。そうした実施態様では、PEドメインIII のかなりの部分
はPEから除去し、生物活性部分のポリペプチドで置き換えることができる。
【００７２】 しかし他の配置も可能である。たとえば活性部分はアミノ末端に、また細胞認
識部分はカルボキシル末端に、それぞれ配置することができる。ただし、活性部
分が細胞認識部分の機能を妨げてはならない。したがって、細胞認識部分がPEド
メインIaに由来するか、又はPEドメインIaの位置に配置される場合には、活性部
分は好ましくはPEドメインIII の位置に配置する。あるいは、好ましさでは劣る
が、細胞認識部位をPEドメインIII の位置に配置し、活性部分をPEドメインIaの
代わりに配置することもできる。
【００７３】 活性部分の位置を選択する際には、ポリペプチドの性質を考慮に入れるのがよ
い。たとえば、活性をもたせるうえでアミノ末端の遊離端が必要とされるタンパ
ク質(たとえば成長ホルモン)では、ポリペプチドはカルボキシル末端で複合体に
融合させるのが最善である。そうした実施態様では、ポリペプチドがPEドメイン
Iaに取って代わり、細胞認識ドメインがPEドメインIII のいくつかの部分に取っ
て代わるのがよい。
【００７４】 一実施態様では、活性部分は細胞認識部分又はPE部分にプロテアーゼ開裂可能
部位を含むポリペプチドリンカーにより連結する。こうすれば、プロテアーゼの
働きで活性部分を複合体から放出することができる。好ましくは、この部位は細
胞内又は上皮組織の基底面存在するプロテアーゼにより認識される。その場合に
は、活性部分は膜を横断後に放出される。たとえば、プロテアーゼ活性化適性配
列はゼラチナーゼによって認識されるPro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg (配列番号3
)でもよいし、またコラゲナーゼによって認識されるArg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-A
rg-Ser (配列番号4)でもよい。
【００７５】 この部分の活性は標的細胞サイトゾルへのタンパク質の移行を後述の検定法で
試験することにより評価することができる。
【００７６】 別の実施態様では、細胞認識部分をER保持ドメインのアミノ酸配列(たとえば
ドメインIII )中に挿入する。たとえば、細胞認識部分をER保持配列のすぐ上流
に挿入すれば、ER挿入配列を細胞認識部分のカルボキシル末端に直接、又は同末
端から10アミノ酸以内に、連結することができる。
【００７７】 III . 生物活性複合体の作製 生物活性複合体は好ましくは遺伝子組換えにより融合タンパク質として作製す
るが、化学合成によって作製することもできる。
【００７８】 A. 生物活性複合体をコードする組換えポリヌクレオチド 1. 組換えポリヌクレオチド a. 源 本発明は本発明の複合体をコードするヌクレオチド配列を含んでなる組換えポ
リヌクレオチドを提供する。その種のポリヌクレオチドは複合体を作製するうえ
で有用である。生物活性複合体をコードする本発明の組換えポリヌクレオチドは
シュードモナス属外毒素A (PE)又はその部分をコードするポリヌクレオチドに由
来する。PEをコードするヌクレオチド配列は前掲のとおりである。発明の実施者
はこの配列を用いて、全長配列の単離に用いるPCRプライマーを調製することが
できる。このPE配列を組み換えればPE複合体をコードするポリヌクレオチドが作
製できる。
【００７９】 PEをコードするポリヌクレオチド又は本発明のキメラタンパク質に使用される
他の任意のポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反
応(LCR)、転写利用増幅法(TAS)、自己持続性配列複製系（self-sustained seque
nce replication system) (3SR)、Qβレプリカーゼ増幅法(Qβ)などのようなイ
ンビトロ法によりクローニング又は増幅することができる。たとえば該タンパク
質をコードするポリヌクレオチドは、PE又は細胞認識分子のDNA配列に由来する
プライマーを使用したcDNAのPCRにより単離することができる。
【００８０】 多種多様なクローニング法やインビトロ増幅法が当業者に周知である。PCR法
はたとえば米国特許第4,683,195号; Mullis 他 (1987)「Cold Spring Harbor Sy
mp. Quant. Biol.」51:263; 及びErlich 編、「PCR TECHNOLOGY」(Stockton Pre
sss, NY, 1989)に記載されている。ポリヌクレオチドはまた、所望ポリヌクレオ
チドの配列から選択したプローブによるストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件下でのゲノム又はcDNAライブラリーのスクリーニングによって単離する
こともできる。
【００８１】 b. 組換え版複合体 組換え版複合体はタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドの部位特異的
突然変異誘発により、又は0.1 mM MnCl2や不均衡ポリペプチド濃度で原ポリヌク
レオチドのPCRのエラー率を高めることによるランダム突然変異誘発により、作
製することができる。
【００８２】 アミノ酸1〜252をコードするヌクレオチドを除去すると「PE40」という構築体
が得られる。アミノ酸1〜279をコードするヌクレオチドを除去すると「PE37」と
いう構築体が得られる。米国特許第5,602,095号(Pastan 他.)を参照。これらの
基本骨格の5’末端に細胞認識部分をコードする配列を連結すると、特定の細胞
表面受容体に向けられるPE様のキメラタンパク質が産生される。これらの構築体
は所望によりアミノ末端メチオニンをコードすることができる。細胞認識部分は
そうした構築体の、PE保持ドメインをコードするヌクレオチド配列の中へと挿入
することができる。
【００８３】 2. 発現ベクター 本発明はまた、生物活性複合体を発現させるための発現ベクターを提供する。
発現べたクーは、ポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列に発現調節配
列を作動可能に連結させてなる組換えポリヌクレオチド配列である。発現ベクタ
ーは、mRNAの転写と翻訳のための適当なプロモーター、複製配列、マーカーなど
を含めることにより、原核生物又は真核生物中で機能するように改造することが
できる。発現ベクターの構築とそれを導入した細胞内での遺伝子の発現には、や
はり当業界で周知の分子クローニング手法を用いる。Sambrook 他「MOLECULAR C
LONING - A LABORATORY MANUAL」Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY (1989)及びCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F.M. Ausub
el 他編、(Current Protocols; Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wi
ley & Sons, Inc.の共同出資会社)。そうした目的のための有用なプロモーター
は、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウィルス主要後期プロモータ
ー、デキサメタゾン誘導性MMTVプロモーター、SV40プロモーター、MRP polIII
プロモーター、構成的MPSVプロモーター、テトラサイクリン誘導性CMVプロモー
ター(ヒト前初期CMVプロモーターなど)、及び構成的CMVプロモーターなどである
。遺伝子治療に有用なプラスミドは他の機能要素、たとえば、選択マーカー、識
別領域及び他遺伝子を含むことができる。
【００８４】 本発明に有用な発現ベクターは所期の用途次第である。その種の発現ベクター
はもちろん、宿主細胞と適合しうる発現及び複製シグナルを含まなければならな
い。生物活性複合体の発現に有用な発現ベクターはレトロウィルス、アデノウィ
ルス及びアデノ随伴ウィルスなどのようなウィルスベクター、プラスミドベクタ
ー、コスミドなどである。哺乳動物細胞へのトランスフェクションにはウィルス
ベクターとプラスミドベクターが好ましい。発現ベクターpcDNA1 (Invitrogen,
San Diego, CA)は発現調節配列にCMVプロモーターを含むものであり、トランス
フェクション及び発現率が高い。本発明の遺伝子治療法にはアデノ随伴ウィルス
ベクターが有用である。
【００８５】 細胞にポリヌクレオチドを導入する手段は多様であり、たとえば細胞による溶
液からの分子の直接取込み、(リポソームやイムノリポソームなどを使用する)リ
ポフェクションによる促進取込み、粒子仲介トランスフェクション、及び抑制性
ポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列へと作動可能に連結された発現
調節配列をもつ発現カセットからの細胞内発現などがある。米国特許第5,272,06
5号(Inouye 他.);「METHODS IN ENZYMOLOGY」 vol. 185, Academic Press, Inc.
, San Diego, CA (D.V. Goeddel, ed.)(1990)又はM. Krieger「GENE TRANSFER A
ND EXPRESSION - A LABORATORY MANUAL」Stockton Press, New York, NY (1990)
をも参照。また、組換えDNA発現プラスミドを用いて、本発明のポリヌクレオチ
ドを遺伝子治療以外の手段によって導入することを目的に調製することができる
。ただし、短いオリゴヌクレオチドならインビトロ化学合成によって調製するほ
うが経済的であろう。
【００８６】 構築体にはタンパク質の単離を容易にするためのタグを入れることもできる。
たとえば、タンパク質のアミノ末端に6ヒスチジン残基からなるポリヒスチジン
タグを組み込むことができる。ポリヒスチジンタグはNiキレートクロマトグラフ
ィーによる便利なワンステップタンパク質単離を可能にする。
【００８７】 3. 組換え細胞 本発明はまた、本発明のキメラ免疫原をコードするヌクレオチド配列を発現さ
せるための発現ベクターを含む組換え細胞を提供する。タンパク質を精製するに
は高発現レベルの宿主細胞を選択することができる。細胞は大腸菌（E. coli）
などのような原核細胞でも真核細胞でもよい。有用な真核細胞は酵母細胞や哺乳
動物細胞などである。細胞はたとえば培養組換え細胞でもインビボ細胞でもよい
。
【００８８】 PE複合体の産生への大腸菌の使用はすでに成功している。この細胞ではタンパ
ク質の折りたたみもジスルフィド結合も可能である。
【００８９】 B. 化学合成 本発明の融合タンパク質のような長いポリペプチドは新しい方法で化学的に合
成することができる。そうした方法の1つはW. Lu 他「Federation of European
Biochemical Societies Letters.」429:31-35 (1989)に記載されている。
【００９０】 また、本発明の複合体は融合タンパク質してではなく、種々の機能部分を化学
結合させた化学複合体として調製することもできる。化学結合の方法は当業界で
周知である。
【００９１】 シュードモナス属外毒素複合体の諸部分を化学結合させる方法は複合体の化学
構造に応じて異なろう。抗体類はスルフヒドリル基(-S)、カルボキシル基(-COOH
)又は遊離アミノ基(-NH2)などの多様な官能基を含み、それらが複合体上の適当
な官能基との反応に利用される。それに加えて、又はその代わりに、追加の反応
性基を露出又は付加するように抗体又はシュードモナス属外毒素複合体を誘導体
化することもできる。この誘導体化は、任意の数のリンカー分子たとえばPierce
Chemical Company (Rockford, Illinois)から市販されているようなリンカー分
子の付加を伴う場合もあろう。
【００９２】 シュードモナス属外毒素複合体上の基と反応する官能基と細胞特異的リガンド
と反応する別の官能基とをもつ二官能性リンカーを使用すれば、所望の複合体を
形成することができる。あるいは、誘導体化がシュードモナス属外毒素複合体又
は細胞特異的リガンドの化学処理、たとえば過ヨウ素酸塩による糖タンパク質抗
体の糖部分のグリコール開裂とその結果としての遊離アルデヒド基の生成を伴う
場合もあろう。抗体上の遊離アルデヒド基は抗体上の遊離アミノ基又はヒドラジ
ン基と反応し、シュードモナス属外毒素複合体をそれに結合させよう(米国特許
第4,671,958号[J.D. Rodwell 他.]を参照)。抗体又は他タンパク質上に遊離スル
フヒドリル基を生成させる方法も技術上周知である(米国特許第4,659,839号(R.A
. Nicoletti 他)を参照)。
【００９３】 一実施態様では、PE部分の誘導体化は活性基をもつアミノ酸残基たとえばリシ
ン、アルギニン又はシステインを該分子のカルボキシル又はアミノ末端に付加す
ることによって行う。該残基が活性アミノ基を含むときは、細胞認識部位又は活
性部分をリシン上のアミノ基と反応する二官能性リンカーによって連結すること
ができる。システインの場合には、硫黄原子をPE部分と細胞認識部分又は活性部
分との間のジスルフィド結合の土台に用いることができる。
【００９４】 IV. 生物活性複合体の試験 PE複合体の諸部分として種々の構造を選択したら、これら諸部分の、又は全体
としての複合体の機能を試験してその機能性を検出することができる。生物活性
複合体は慣用の試験方法により、細胞認識、上皮細胞層を横断する移行、及び活
性部分の生物活性を試験することができる。全体としてのキメラタンパク質の試
験、又はさまざまなドメインの機能の試験は、それらのドメインを野生型毒素の
天然ドメインと入れ替えることにより行うことができる。
【００９５】 A. 受容体結合／細胞認識 細胞結合ドメインの機能は、単離された又は細胞表面上の標的受容体に対する
複合体の結合能として試験することができる。
【００９６】 一試験法では、アフィニティークロマトグラフィーにより標的受容体に対する
複合体の結合を調べる。たとえば、複合体をアフィニティーカラム中のマトリッ
クスに付着させ、マトリックスに対する受容体の結合を検出することができる。
【００９７】 細胞上受容体に対する複合体の結合は、たとえば複合体を標識し、細胞に対す
るその結合能を蛍光セルソーティングやオートラジオグラフィーなどにより検出
するという方法で試験することができる。
【００９８】 細胞認識部分の由来であるリガンドに結合する抗体がすでに同定されている場
合には、それらの抗体を利用して、キメラ免疫原中の細胞認識部分の存在を免疫
検定法で、又は同系受容体に関する競合検定法で検出することもできる。
【００９９】 B. 基底面への移行 PE部分の機能は、上皮細胞層を横断して移行する複合体の能力から試験するこ
とができる。全身への到達は細胞との結合が前提となるので、これらの検定法は
細胞認識部位の機能を調べる方法としても有効である。移行能の試験はインビト
ロ、インビボのいずれでもよい。
【０１００】 一試験法では、サイトゾルへの到達を、サイトゾル中の複合体の物理的存在を
検出することにより決定する。たとえば、複合体を標識してから細胞に接触させ
る。次にサイトゾル画分を単離し画分中の標識量を測定する。画分中に標識が検
出されれば、複合体はサイトゾルに到達していることを意味する。
【０１０１】 別の試験法では、インビトロ培養膜を使用して膜横断的な移行能を調べる。va
n Deurs 他「Europ. J. Cell Biol.」1990, 51:96は極性上皮細胞のモデル系に
ついて記載している。同モデル系ではMDCK細胞を浸透膜上にまく。本発明の複合
体はこのモデルを使用して、複合体を浸透膜の頂面上に膜と接触させて載せ、次
いで複合体が透過したかどうかを膜の反対側で調べることにより試験することが
できる。
【０１０２】 別の試験法では、試験動物の粘膜表面に複合体を適用し、全身又は基底面にお
ける複合体の存在を検出する。
【０１０３】 C. 生物活性部分の活性 活性部分の機能もまた試験することができる。インビトロ試験法では、複合体
に取り付けた生物活性部分の活性を該部分の種類に応じた任意の既定検定法で調
べることができる。たとえば、該部分が酵素であれば、酵素活性検定法を用いる
。該部分がサイトカインであれば、その活性を、細胞活性を変化させるサイトカ
インの能力に関する任意の既定検定法で調べることができる。
【０１０４】 複合体がプロテアーゼ開裂可能部位を含む場合には、複合体から活性部分を開
裂させる標的酵素の能力を調べ、次いで該部分の活性を前述の要領で調べること
ができる。
【０１０５】 生物活性部分の活性は、複合体が上皮細胞層を横断的に通過した後に試験して
、複合体がなお活性を保持しているかを調べてもよい。インビトロ試験法では、
前述の上皮細胞層モデルを使用してもよい。その場合は、上皮細胞層を通過させ
てから収集した複合体について活性部分の活性を試験する。
【０１０６】 別の試験法では、活性をインビボで試験する。この試験法では、複合体をマウ
スなどの動物モデルの上皮細胞表面に適用し、次いで動物中の複合体の活性を試
験する。
【０１０７】 Ｖ. 生物活性複合体の使用 本発明の生物活性複合体は注射によらずに、生物活性分子を全身に送達させる
。したがって本発明の生物活性複合体は、体内にタンパク質を導入する必要があ
る任意の予防上又は治療上の処置、あるいは診断法に有用である。さらに、本発
明の複合体は導入後に循環系に入るものの、粘膜下腔から体内に入るため、粘膜
下腔内にある細胞や粘膜下腔を往来する細胞を標的にするうえで特に有効である
。その種の細胞は、たとえば、リンパ節との往来がある免疫系細胞(リンパ球、
マクロファージ、その他の白血球など)、神経細胞及び筋細胞である。
【０１０８】 本発明の複合体はタンパク質注射の必要性を除去するので、タンパク質医薬を
治療薬とする慢性疾患の治療に特に有用である。本発明の複合体は、経粘膜投与
であり注射ほど短時間には送達されないため、急性症状よりも慢性症状の治療に
好ましい。たとえば糖尿病の治療では、複合体の活性部分にインスリンを含める
ことができる。多発性硬化症の治療なら活性部分はβインターフェロンとするこ
とができる。放射線療法などに起因する赤血球欠損症の治療なら、活性部分はエ
リスロポエチンとすることができる。化学療法の際の(白血球産生の刺激による)
感染症予防なら、活性部分は顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)とすることができ
る。肝炎又はヘルペス感染症の治療なら、活性部分はαインターフェロンとする
ことができる。血友病の治療なら、活性部分は因子VIIIなどの凝固因子とするこ
とができる。成長異常の治療なら、又は脂肪のない筋量を増大させるなら、活性
部分はヒト成長ホルモンとすることができる。造血を促進させるなら、活性部分
は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)とすることができる。
【０１０９】 本発明の治療法では、生物活性部分は着目の標的細胞、たとえば、がん細胞上
の抗原に結合する標的捕捉用部分を含む。生物活性部分はまた、標的細胞の増殖
を阻害する又は標的細胞を殺すような毒性成分を含むであろう。
【０１１０】 別の実施態様では、本発明の生物活性複合体は診断薬として有用である。この
場合、生物活性部分は診断用成分を含む。たとえば、診断用成分にはがん細胞な
どの標的細胞に結合するリガンドと検出可能部分とを含めることができる。一般
に、画像診断用の視覚化には任意の慣用の方法を用いることができる。たとえば
結合は磁気共鳴映像法(MRI)又は電子スピン共鳴法(ESR)で検出することができる
。通常、撮像にはガンマ放出又は陽電子放出型の放射性同位体を使用しMRIには
常磁性同位体を使用する。
【０１１１】 VI. 医薬組成物と送達方法 本発明の生物活性複合体は好ましくは医薬組成物として処置対象の粘膜表面に
投与する。本発明の化合物はさまざまな方法での粘膜表面への投与に適した剤型
とする。一般的な投与経路は経口、舌下、経鼻、経膣、経肛門などである。投与
様式は嚥下、吸入または粘膜表面への局所適用などとすることができる。一般に
、特定の投与様式に合った特定の剤型がある。見込まれる剤型は水溶液、固形製
剤、エアゾール製剤など多様である。
【０１１２】 A. 経腸、非経口又は経粘膜投与用の水溶液 水溶液の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス液、リンガ
ー液、デキストロース／生理食塩水、グルコースなどの溶液である。組成物には
、生理的条件の近似化又は安定性、外観、投与しやすさなどの改善に必要とされ
る製薬上許容しうる助剤、たとえば緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤、洗剤などを加
えることができる。添加剤には追加の有効成分、たとえば殺菌剤又は安定化剤な
どを含めることができる。たとえば水溶液には酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム
、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソネビタンモノラウレート
又はオレイン酸トリエタノールアミンなどを加えることができる。これらの組成
物は周知慣用の滅菌法で滅菌処理し、又は滅菌ろ過することができる。得られる
水溶液はそのままで使用できるように包装してもよいし、凍結乾燥してもよいが
、凍結乾燥製剤は滅菌水溶液と混合してから投与する。
【０１１３】 B. 経粘膜送達のための局所投与 全身性投与もまた経粘膜的手段によって行うことができる。経粘膜投与では、
透過対象の隔膜に合った浸透剤を製剤に使用する。その種の浸透剤は当業界で周
知であり、たとえば胆汁酸塩やフシジン酸誘導体などである。さらに、透過を助
長する洗剤を使用してもよい。経粘膜投与はたとえば鼻内噴霧により、又は肛門
又は膣用の座剤を用いて行うことができる。
【０１１４】 担体は、鉱物性、動物性及び植物性油又は合成油などを含む油類、たとえば、
ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などから選択することができる。好適な製
薬用賦形剤には、一般に安全視されている任意の物質たとえばでんぷん、セルロ
ース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、マルトース、
米、フラワー、白亜、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナ
トリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセ
リン、プロピレングリコール、水、エタノールなどがある。
【０１１５】 局所投与では、賦形剤は、軟膏、クリーム、パウダー、ゲルなどの形にする。
一実施態様では、経皮用賦形剤をDMSOとすることができる。
【０１１６】 C. 吸入による送達 吸入の場合、複合体は、好ましくはエアゾール、液体又は固体の形で投与する
。エアゾール投与の場合、複合体は好ましくは界面活性剤や推進剤と共に微粒子
の形で供給する。界面活性剤は薬剤が推進剤と不混和性である場合に必要となる
。
【０１１７】 界面活性剤は好ましくは推進剤に可溶性である。そうした界面活性剤の代表は
、炭素原子数6〜22の脂肪酸のエステル又は部分エステル、たとえば、カプロン
酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノ
レン酸、オレステリン酸及びオレイン酸と脂肪族多価アルコール又はその環式無
水物、たとえば、エチレングリコール、グリセリン、エリトリトール、アラビト
ール、マンニトール、ソルビトール、ソルビトールから誘導したヘキシトール無
水物との反応によるもの、及びこれらのエステルのポリオキシエチレン及びポリ
オキシプロピレン誘導体である。混合又は天然グリセリドなどのような混合エス
テルを使用してもよい。組成物中の界面活性剤の含量は0.1質量％〜20質量％と
することができるが、好ましくは0.25質量％〜5質量％である。
【０１１８】 組成物の残りの成分は通常、推進剤である。液化推進剤は一般に常温で気体で
あるため、加圧液化してある。好適な液化推進剤は炭素原子数5以下の低級アル
カン、たとえばブタンやプロパンなどであり、好ましくはフッ素化又はフルオロ
塩素化アルカンである。以上の物質の混合物を使用してもよい。エアゾールを生
産する際には、溶液又は微粒子としての薬剤と界面活性剤を入れた適当な弁付き
容器に、然るべき推進剤を充填する。後は内容物を、弁の操作で放出されるとき
まで高圧で維持する。
【０１１９】 吸引用のネブライザー又はエアゾール装置では一般に、1回の吸引で約1〜50mg
の化合物が投与される。
【０１２０】 D. その他の剤型 本発明の医薬組成物の調製では、本発明の複合体に手を加えて、その薬物動力
学と生体内分布を変えるようにするのが望ましい場合もある。薬物動力学の概論
について、「REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE」（上掲）Chapter 37-39を
参照。薬物動力学と生体内分布を変えるには多数の方法が当業者に周知である。
たとえば、タンパク質、脂質(リポソームなど)、炭水化物、合成高分子などのよ
うな物質からなる小胞に複合体を入れて保護する方法などである。
【０１２１】 VII . 投与 医薬組成物は主治医が決める投薬量及び形態で単回又は複数回投与することが
できる。いずれにせよ、組成物は患者を効果的に治療するに足る量の化合物を与
えるものでなければならない。
【０１２２】 本発明の複合体は任意の利用可能な粘膜表面に投与することができる。これに
はたとえば、呼吸器系(たとえば鼻又は肺)、胃腸系(たとえば口、腸、直腸又は
肛門)、生殖器系(たとえば膣又は尿道)などの上皮表面、又は他の任意の上皮表
面たとえば脂腺、耳及び目などが含まれる。
【０１２３】 本発明の化合物は全有効量を単回投与してもよいし、また分割治療プロトコー
ルに従って投与してもよいが、後者の場合、複数回投与がより長期間にわたって
行われる。当業者は、ある患者に有効量を投与するうえで必要となる本発明の化
合物の濃度がその患者の年齢や全般的な健康状態、投与経路、投与回数、及び処
方医の判断など多数の要因に左右されることを知るであろう。当業者はこれの要
因を考慮して、特定の用途に応じた有効量を与えるように用量を調節することに
なろう。
【０１２４】 一般に、複合体の投与量は約10mg〜100mgであろう。水溶液の場愛、複合体の
量は約1mg/ml〜約100mg/ml、もっと好ましくは約10mg/mlとすることができる。
本発明の生物活性複合体は上皮細胞の受容体に結合することにより全身に到達す
る。したがって、粘膜表面に適用される複合体の最適量は受容体を飽和させるに
足る量である。これを超える量を適用しても到達速度は何ら上昇しないであろう
。
【０１２５】 本発明は新規の生物活性複合体及びそれらの複合体を使用してタンパク質を注
射によらずに非経口投与する方法を提供する。種々の具体例を示したが、以上の
説明は限定ではなく例示が目的である。本明細書を検討すれば当業者には本発明
の数多くの変形が自明となろう。したがって、本発明の範囲は以上の説明から決
定されるべきではなく、添付の請求項並びにその全範囲にわたる相当物から決定
されるべきである。
【０１２６】 本願で引用した諸々の出版物及び特許文献は参照指示によりそれらの全体が諸
々の目的のために、あたかも各出版物又は特許文献が個別にその旨を表示された
かのように、本願に組み込まれる。出願人は種々の参考資料を本願で引用したが
、それをもっていずれか特定の参考資料が本発明の「先行技術」であることを認
めるものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1はシュードモナス属外毒素A (PE) の構造模式図である。
【図２】 図2はPE構造の図解である。配列番号2に基づくアミノ酸位置が示してある。ド
メインIaはアミノ酸1〜252にわたる。ドメインIIはアミノ酸253〜364にわたり、
アミノ酸265〜287のシステインによって形成されるシステイン−システイン・ル
ープを含む。フリンはこのシステイン−システイン・ループ内のアミノ酸279と2
80の間で開裂する。アミノ酸280で始まるPEフラグメントはサイトゾルへと移行
する。アミノ酸354〜364を除去した構築体も移行する。ドメインIbはアミノ酸36
5〜399にわたり、アミノ酸372と379のシステインによって形成されるシステイン
−システイン・ループを含む。該ドメインは完全に除去することができる。ドメ
インIII はアミノ酸400〜613にわたる。アミノ酸553の欠失はADPリボシル化活性
を失わせる。小胞体配列REDLK (配列番号2のアミノ酸600〜605)はPE分子のカル
ボキシル末端の、アミノ酸609〜613に位置する。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年５月２１日（２００１．５．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】 ＰＥドメインＩＩＩはそのカルボキシル末端に小胞体（ＥＲ）保持配列を含む
。ＥＲ保持配列は配列ＲＥＤＬＫ（配列番号５：配列番号２のアミノ酸６０９〜
６１３）をもつ。この配列は細胞内にＥＲを保持する機能を果たす。この機能は
本発明のＰＥ複合体に不可欠ではないので、ＥＲ配列は除去するのが好ましい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はシュードモナス属外毒素Ａ（ＰＥ）の構造模式図である。
【図２】 図２はＰＥ構造の図解である。配列番号２に基づくアミノ酸位置が示してある
。ドメインＩａはアミノ酸１〜２５２にわたる。ドメインＩＩはアミノ酸２５３
〜３６４にわたり、アミノ酸２６５〜２８７のシステインによって形成されるシ
ステイン−システイン・ループを含む。フリンはこのシステイン−システイン・
ループ内のアミノ酸２７９と２８０の間で開裂する。アミノ酸２８０で始まるＰ
Ｅフラグメントはサイトゾルへと移行する。アミノ酸３５４〜３６４を除去した
構築体も移行する。ドメインＩｂはアミノ酸３６５〜３９９にわたり、アミノ酸
３７２と３７９のシステインによって形成されるシステイン−システイン・ルー
プを含む。該ドメインは完全に除去することができる。ドメインＩＩＩはアミノ
酸４００〜６１３にわたる。アミノ酸５５３の欠失はＡＤＰリボシル化活性を失
わせる。小胞体配列ＲＥＤＬＫ（配列番号５：配列番号２のアミノ酸６００〜６
０５）はＰＥ分子のカルボキシル末端の、アミノ酸６０９〜６１３に位置する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/21 Ａ６１Ｋ 47/26 38/27 47/42 38/28 47/44 39/395 47/48 47/26 Ａ６１Ｐ 3/10 47/42 31/00 47/44 37/02 47/48 Ｃ０７Ｋ 14/21 Ａ６１Ｐ 3/10 16/18 31/00 19/00 37/02 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ０７Ｋ 14/21 37/26 16/18 37/66 19/00 37/36 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ムルスニー，ランダル ジェイ． アメリカ合衆国，カリフォルニア 94061， レッドウッド シティー，ブエナ ビスタ 515 (72)発明者 マッキー，ミリアム アメリカ合衆国，バージニア 22066，グ レート フォールズ，ホリー クリーク ドライブ 929 (72)発明者 ドハーティー，アン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94303， パロ アルト，エル カジョン 943 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA38 BA43 CA07 HA20 4C076 AA24 AA36 AA53 BB01 BB21 CC21 CC29 CC34 DD66 EE41 EE51 FF01 FF65 FF68 4C084 AA02 AA14 AA17 AA27 BA01 BA08 BA22 BA23 BA41 BA44 CA53 CA56 CA59 DA21 DA31 DB34 DB52 DB56 MA05 MA13 MA34 MA37 MA52 MA55 NA05 NA10 NA13 NA14 ZB072 ZB322 ZC352 4C085 AA13 BB11 BB12 CC21 EE01 EE05 4H045 AA10 BA41 CA11 CA40 DA76 DA83 EA20 FA74

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物活性部分を極性上皮細胞層を横断して輸送する方法であ
    って、 (1) α2マクログロブリン受容体(α2-MR)に結合する細胞認識部分および (2) 生物活性部分を含み、該生物活性部分は (a) 受容体結合性、サイトカイン活性、酵素活性、ホルモン活性、インター
    ロイキン活性、神経伝達活性、転写又は翻訳の調節、及び生物有機分子に対する
    親和性から選択される生物活性をもち、 (b) 単独では免疫反応を誘導する免疫原として機能せず、また (c) ADPリボシル化活性をもたない ことを特徴とする生物活性複合体を該細胞層の頂面に投与することを含む方法。
  2. 【請求項２】 生物有機分子がポリペプチドである請求項1の方法。
  3. 【請求項３】 上皮細胞層がインビトロ培養膜である請求項2の方法。
  4. 【請求項４】 上皮細胞層が対象哺乳動物の粘膜表面である請求項2の方法
    。
  5. 【請求項５】 哺乳動物が人間である請求項4の方法。
  6. 【請求項６】 細胞認識部分がα2ミクログロブリンに結合する抗体を含む
    請求項4の方法。
  7. 【請求項７】 細胞認識部分がシュードモナス属外毒素A (PE)ドメインIaの
    うちの、α2ミクログロブリンに結合するに足る部分を含む請求項4の方法。
  8. 【請求項８】 細胞認識部分がシュードモナス属外毒素A (PE)ドメインIaを
    含み、また複合体がPEのドメインIIをさらに含む請求項4の方法。
  9. 【請求項９】 複合体が (a) シュードモナス属外毒素A (PE)ドメインIa、及び (b) 極性上皮細胞層の頂面から基底面への移行を引き起こすに足るPE部分 を含むPE複合体であって、該PE部分はPEドメインII、リボシル化活性をもたない
    PEドメインIII の少なくとも一部分、及び所望によりPEドメインIbを含み、また
    生物活性部分がポリペプチドを含むことを特徴とする請求項4の方法。
  10. 【請求項１０】 粘膜表面が呼吸器系の粘膜表面である請求項4の方法。
  11. 【請求項１１】 粘膜表面が胃腸系の粘膜表面である請求項4の方法。
  12. 【請求項１２】 粘膜表面が生殖器系の粘膜表面である請求項4の方法。
  13. 【請求項１３】 生物活性部分が抗体、レクチン、DNA結合性タンパク質又
    は脂質結合性タンパク質を含むポリペプチドを含んでなる請求項4の方法。
  14. 【請求項１４】 生物活性部分が対象哺乳動物の細胞表面受容体に対応する
    リガンドを含むポリペプチドを含んでなる請求項4の方法。
  15. 【請求項１５】 生物活性部分が酵素を含むポリペプチドを含んでなる請求
    項4の方法。
  16. 【請求項１６】 生物活性部分がインスリン、インターフェロン、成長ホル
    モン又はエリスロポエチンを含むポリペプチドを含んでなる請求項4の方法。
  17. 【請求項１７】 生物活性部分が第二ポリペプチド、炭水化物、脂質又は核
    酸に結合したポリペプチドリガンドを含んでなる請求項4の方法。
  18. 【請求項１８】 生物活性部分がポリペプチドを含み、また複合体が細胞認
    識部位を該ポリペプチドに融合させてなる融合タンパク質を含む請求項4の方法
    。
  19. 【請求項１９】 細胞認識部分とPE部分がPE (配列番号2)のアミノ酸1〜470
    を含む請求項18の方法。
  20. 【請求項２０】 PE部分がPE (配列番号2)のアミノ酸253〜470又はアミノ酸
    280〜470を含む請求項18の方法。
  21. 【請求項２１】 融合タンパク質がプロテアーゼによって認識される開裂部
    位を含み、該部位での開裂により融合タンパク質から生物活性部分が放出される
    ことを特徴とする請求項18の方法。
  22. 【請求項２２】 プロテアーゼが膜の基底面に局在化しているプロテアーゼ
    である請求項21の方法。
  23. 【請求項２３】 複合体が該複合体と製薬上許容しうる担体とを含んでなる
    製剤組成物の形で投与される請求項4の方法。
  24. 【請求項２４】 担体が粉末又は水溶液である請求項23の方法。
  25. 【請求項２５】 組成物がドロップ剤、噴霧剤又はカプセル剤として製剤化
    される請求項23の方法。
  26. 【請求項２６】 複合体が、細胞認識部分、PE部分及びポリペプチド部分を
    構成要素とする単一ポリペプチドとしての融合タンパク質を含む請求項23の方法
    。
  27. 【請求項２７】 1μg〜1000mgの複合体を投与することを含む請求項4の方
    法。
  28. 【請求項２８】 膜上のPE受容体を飽和させるに足る量の複合体を投与する
    ことを含む請求項4の方法。
  29. 【請求項２９】 生物活性複合体であって (1) α2マクログロブリン受容体(α2-MR)に結合する細胞認識部分および (2) 生物活性部分を含み、該生物活性部分は (a) 受容体結合性、サイトカイン活性、酵素活性、ホルモン活性、インター
    ロイキン活性、神経伝達活性、転写又は翻訳の調節、及び生物有機分子に対する
    親和性から選択される生物活性をもち、 (b) 単独では免疫反応を誘導する免疫原として機能せず、また (c) ADPリボシル化活性をもたない ことを特徴とする生物活性複合体。
  30. 【請求項３０】 極性上皮細胞層の頂面から基底面への移行を引き起こすに
    足るPE部分をさらに含む生物活性複合体であって、該PE部分がPEドメインII、PE
    ドメインIII 及び所望によりPEドメインIbに由来する配列を含むことを特徴とす
    る請求項29の生物活性複合体。
  31. 【請求項３１】 生物有機分子がポリペプチドである請求項29の生物活性複
    合体。
  32. 【請求項３２】 細胞認識部分を生物活性部分と結合するプロテアーゼによ
    る開裂が可能なアミノ酸配列をさらに含む生物活性複合体であって、該アミノ酸
    配列の開裂により複合体から生物活性部分が放出されることを特徴とする請求項
    29の生物活性複合体。
  33. 【請求項３３】 極性上皮細胞層の頂面から基底面への移行を引き起こすに
    足るPE部分をさらに含む生物活性複合体であって、該PE部分がPEドメインII、PE
    ドメインIII 及び所望によりPEドメインIbに由来する配列と、ドメインIII と生
    物活性部分の間に配置された、プロテアーゼによる開裂が可能なアミノ酸配列と
    を含み、該アミノ酸配列の開裂により複合体から生物活性部分が放出されること
    を特徴とする請求項30の生物活性複合体。
  34. 【請求項３４】 製薬上許容しうる担体と (1) α2マクログロブリン受容体(α2-MR)に結合する細胞認識部分および (2) 生物活性部分を含み、該生物活性部分は (a) 受容体結合性、サイトカイン活性、酵素活性、ホルモン活性、インター
    ロイキン活性、神経伝達活性、転写又は翻訳の調節、及び生物有機分子に対する
    親和性から選択される生物活性をもち、 (b) 単独では免疫反応を誘導する免疫原として機能せず、また (c) ADPリボシル化活性をもたない ことを特徴とする生物活性とを含み、局所投与用に調剤される医薬組成物。
  35. 【請求項３５】 融合タンパク質複合体をコードするヌクレオチド配列を含
    む核酸であって、該融合タンパク質が (1) α2マクログロブリン受容体(α2-MR)に結合する細胞認識部分と結合した (2) 生物活性部分を含み、該生物活性部分は (a) 受容体結合性、サイトカイン活性、酵素活性、ホルモン活性、インター
    ロイキン活性、神経伝達活性、転写又は翻訳の調節、及び生物有機分子に対する
    親和性から選択される生物活性をもち、 (b) 単独では免疫反応を誘導する免疫原として機能せず、また (c) ADPリボシル化活性をもたない ことを特徴とする核酸。
  36. 【請求項３６】 複合体が極性上皮細胞層の頂面から基底面への移行を引き
    起こすに足るPE部分をさらに含み、該PE部分がPEドメインII、PEドメインIII 及
    び所望によりPEドメインIbに由来する配列を含むことを特徴とする請求項35の核
    酸。
  37. 【請求項３７】 複合体をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結さ
    れたプロモーターをさらに含む請求項35の核酸。
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