JP2012051939A - 極性上皮細胞層を横断するタンパク質の送達 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】該生物活性複合体は、(1)α2マクログロブリン受容体(α2−MR)に結合する細胞認識部分と(2)生物活性部分とを含み、該生物活性部分は(a)生物活性をもち、(b)単独では免疫反応を誘導する免疫原としては機能せず、また(c)ADPリボシル化活性をもたない。本発明の生物活性複合体は生物活性部分を極性上皮細胞膜を横断して輸送する方法に有用である。したがって、本発明はタンパク質を注射によらずに非経口的に投与する方法を提供する。
【選択図】なし
Description
本願は1999年10月22日付仮出願U.S.S.N 60/160,923号に対する優先権を主張するものであり、同仮出願の開示内容は参照指示により本書にその全体が組み込まれる。
・連邦政府後援の研究開発に基づく発明への権利に関する声明
該当せず。
・発明の背景
本発明は分子生物学及び医薬の分野に関連する。
他実施態様では、生物活性部分はポリペプチドであり、該ポリペプチドは抗体、レクチン、DNA結合性タンパク質、脂質結合性タンパク質、細胞表面受容体に対応するリガンド、酵素、インスリン、インターフェロン、成長ホルモン又はエリスロポエチンを含む。別の実施態様では、生物活性部分は第二ポリペプチド、炭水化物、脂質又は核酸に結合したポリペプチドリガンドを含む。
特に断らない限り、本書で使用する技術・学術用語はすべて当業者に慣用の意味をもつ。本発明で使用する数多くの用語の一般的な意味は以下の参考資料に記載されている: Singleton 他、「DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY」(2d 版、1994);「THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY」(Walker ed., 1988);「THE GLOSSARY OF GENETICS」5版、R. Rieger 他.(編), Spring Verlag (1991);及びHale & Marham「THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY」(1991)。以下の用語の意味は本書では特に断らない限り、次のとおりとする。
「受容体」はリガンドに特異的に結合する化合物をいう。
「予防上の」処置は、疾病の徴候を示していない、又は初期徴候を示すにすぎない対象に対して、病理進行のリスクを低減させる目的で実施される処置をいう。
「生物活性部分」は生物有機分子であって、(a)受容体結合性、サイトカイン活性、酵素活性、ホルモン活性、インターロイキン活性、神経伝達活性、転写又は翻訳調節、及び別の生物有機分子(免疫グロブリンなど)に対する親和性から選択される生物活性をもち、(b)単独では免疫反応を誘導する免疫原としては機能せず、また(c)ADPリボシル化活性をもたないことを特徴とする生物有機分子をいう。
A. 基本構造
本発明は、適用部位となる上皮膜の頂面から基底面へと横断することができる生物活性複合体を提供する。本発明の生物活性複合体は(1)細胞認識部分及び(2)生物活性部分を含む。細胞認識部分は上皮膜頂面上の受容体、最も好ましくはα2マクログロブリン受容体(α2-MR)に結合する働きをする。好ましい実施態様では、該複合体は細胞認識ドメインとポリペプチド生物活性部分が単一ポリペプチドとして産生される融合タンパク質を含む。しかし、各部分を互いに化学結合させることによって複合体を調製することもできる。
本発明の複合体は「細胞認識部分」をコードするアミノ酸配列を含む。細胞認識部分は極性上皮細胞層頂面の細胞表面受容体に対応するリガンドとして機能し、細胞への複合体の結合を仲介する。該部分の目的は複合体を該膜表面に結合させることであるが、それは膜基底側への移行を実現するための最初の、最も重要な工程である。本発明のPE複合体では、細胞認識部分は好ましくはPEのドメインIaの場所に位置する。ただし、このドメインは通常の編成配列の外へ移動させることができる。特に、細胞認識部分はPEドメインIII 内の、該ドメインの最初の70アミノ酸の後に挿入することができる。また、細胞認識部分は複合体へと化学的に結合することもできる。
実施態様によっては、本発明の複合体はPE部分をさらに含む。その種の複合体はPE複合体という。PE複合体はPEドメインII、PEドメインIII 、及び所望によりPEドメインIbに由来するアミノ酸配列を含む。PE複合体が上皮膜頂面から基底側へと通過する途上で頂面からサイトゾルへのPE複合体の移行を引き起こすには、これらのアミノ酸配列で十分である。
本発明の複合体にはポリペプチド、核酸、炭水化物又は脂質などのような生物有機分子を含む「生物活性部分」が含まれる。この生物活性部分は(a)受容体結合性、サイトカイン活性、酵素活性、ホルモン活性、インターロイキン活性、神経伝達活性、転写又は翻訳の調節、及び別の生物有機分子(免疫グロブリンなど)に対する親和性から選択される生物活性をもち、(b)単独では免疫反応を誘導する免疫原としては機能せず、また(c)ADPリボシル化活性をもたないことを特徴とする。本発明の複合体の目的は、生物活性部分を粘膜下腔へと送達し、そこで生物活性部分が固有の薬理作用を及ぼせるようにすることである。
生物活性複合体は好ましくは遺伝子組換えにより融合タンパク質として作製するが、化学合成によって作製することもできる。
1. 組換えポリヌクレオチド
a. 源
本発明は本発明の複合体をコードするヌクレオチド配列を含んでなる組換えポリヌクレオチドを提供する。その種のポリヌクレオチドは複合体を作製するうえで有用である。生物活性複合体をコードする本発明の組換えポリヌクレオチドはシュードモナス属外毒素A (PE)又はその部分をコードするポリヌクレオチドに由来する。PEをコードするヌクレオチド配列は前掲のとおりである。発明の実施者はこの配列を用いて、全長配列の単離に用いるPCRプライマーを調製することができる。このPE配列を組み換えればPE複合体をコードするポリヌクレオチドが作製できる。
組換え版複合体はタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発により、又は0.1 mM MnCl2や不均衡ポリペプチド濃度で原ポリヌクレオチドのPCRのエラー率を高めることによるランダム突然変異誘発により、作製することができる。
本発明はまた、生物活性複合体を発現させるための発現ベクターを提供する。発現べたクーは、ポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列に発現調節配列を作動可能に連結させてなる組換えポリヌクレオチド配列である。発現ベクターは、mRNAの転写と翻訳のための適当なプロモーター、複製配列、マーカーなどを含めることにより、原核生物又は真核生物中で機能するように改造することができる。発現ベクターの構築とそれを導入した細胞内での遺伝子の発現には、やはり当業界で周知の分子クローニング手法を用いる。Sambrook 他「MOLECULAR CLONING - A LABORATORY MANUAL」Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)及びCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F.M. Ausubel 他編、(Current Protocols; Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.の共同出資会社)。そうした目的のための有用なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウィルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性MMTVプロモーター、SV40プロモーター、MRP polIII プロモーター、構成的MPSVプロモーター、テトラサイクリン誘導性CMVプロモーター(ヒト前初期CMVプロモーターなど)、及び構成的CMVプロモーターなどである。遺伝子治療に有用なプラスミドは他の機能要素、たとえば、選択マーカー、識別領域及び他遺伝子を含むことができる。
本発明はまた、本発明のキメラ免疫原をコードするヌクレオチド配列を発現させるための発現ベクターを含む組換え細胞を提供する。タンパク質を精製するには高発現レベルの宿主細胞を選択することができる。細胞は大腸菌(E. coli)などのような原核細胞でも真核細胞でもよい。有用な真核細胞は酵母細胞や哺乳動物細胞などである。細胞はたとえば培養組換え細胞でもインビボ細胞でもよい。
本発明の融合タンパク質のような長いポリペプチドは新しい方法で化学的に合成することができる。そうした方法の1つはW. Lu 他「Federation of European Biochemical Societies Letters.」429:31-35 (1989)に記載されている。
PE複合体の諸部分として種々の構造を選択したら、これら諸部分の、又は全体としての複合体の機能を試験してその機能性を検出することができる。生物活性複合体は慣用の試験方法により、細胞認識、上皮細胞層を横断する移行、及び活性部分の生物活性を試験することができる。全体としてのキメラタンパク質の試験、又はさまざまなドメインの機能の試験は、それらのドメインを野生型毒素の天然ドメインと入れ替えることにより行うことができる。
細胞結合ドメインの機能は、単離された又は細胞表面上の標的受容体に対する複合体の結合能として試験することができる。
PE部分の機能は、上皮細胞層を横断して移行する複合体の能力から試験することができる。全身への到達は細胞との結合が前提となるので、これらの検定法は細胞認識部位の機能を調べる方法としても有効である。移行能の試験はインビトロ、インビボのいずれでもよい。
活性部分の機能もまた試験することができる。インビトロ試験法では、複合体に取り付けた生物活性部分の活性を該部分の種類に応じた任意の既定検定法で調べることができる。たとえば、該部分が酵素であれば、酵素活性検定法を用いる。該部分がサイトカインであれば、その活性を、細胞活性を変化させるサイトカインの能力に関する任意の既定検定法で調べることができる。
本発明の生物活性複合体は注射によらずに、生物活性分子を全身に送達させる。したがって本発明の生物活性複合体は、体内にタンパク質を導入する必要がある任意の予防上又は治療上の処置、あるいは診断法に有用である。さらに、本発明の複合体は導入後に循環系に入るものの、粘膜下腔から体内に入るため、粘膜下腔内にある細胞や粘膜下腔を往来する細胞を標的にするうえで特に有効である。その種の細胞は、たとえば、リンパ節との往来がある免疫系細胞(リンパ球、マクロファージ、その他の白血球など)、神経細胞及び筋細胞である。
本発明の生物活性複合体は好ましくは医薬組成物として処置対象の粘膜表面に投与する。本発明の化合物はさまざまな方法での粘膜表面への投与に適した剤型とする。一般的な投与経路は経口、舌下、経鼻、経膣、経肛門などである。投与様式は嚥下、吸入または粘膜表面への局所適用などとすることができる。一般に、特定の投与様式に合った特定の剤型がある。見込まれる剤型は水溶液、固形製剤、エアゾール製剤など多様である。
水溶液の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス液、リンガー液、デキストロース/生理食塩水、グルコースなどの溶液である。組成物には、生理的条件の近似化又は安定性、外観、投与しやすさなどの改善に必要とされる製薬上許容しうる助剤、たとえば緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤、洗剤などを加えることができる。添加剤には追加の有効成分、たとえば殺菌剤又は安定化剤などを含めることができる。たとえば水溶液には酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソネビタンモノラウレート又はオレイン酸トリエタノールアミンなどを加えることができる。これらの組成物は周知慣用の滅菌法で滅菌処理し、又は滅菌ろ過することができる。得られる水溶液はそのままで使用できるように包装してもよいし、凍結乾燥してもよいが、凍結乾燥製剤は滅菌水溶液と混合してから投与する。
全身性投与もまた経粘膜的手段によって行うことができる。経粘膜投与では、透過対象の隔膜に合った浸透剤を製剤に使用する。その種の浸透剤は当業界で周知であり、たとえば胆汁酸塩やフシジン酸誘導体などである。さらに、透過を助長する洗剤を使用してもよい。経粘膜投与はたとえば鼻内噴霧により、又は肛門又は膣用の座剤を用いて行うことができる。
吸入の場合、複合体は、好ましくはエアゾール、液体又は固体の形で投与する。エアゾール投与の場合、複合体は好ましくは界面活性剤や推進剤と共に微粒子の形で供給する。界面活性剤は薬剤が推進剤と不混和性である場合に必要となる。
本発明の医薬組成物の調製では、本発明の複合体に手を加えて、その薬物動力学と生体内分布を変えるようにするのが望ましい場合もある。薬物動力学の概論について、「REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE」(上掲)Chapter 37-39を参照。薬物動力学と生体内分布を変えるには多数の方法が当業者に周知である。たとえば、タンパク質、脂質(リポソームなど)、炭水化物、合成高分子などのような物質からなる小胞に複合体を入れて保護する方法などである。
医薬組成物は主治医が決める投薬量及び形態で単回又は複数回投与することができる。いずれにせよ、組成物は患者を効果的に治療するに足る量の化合物を与えるものでなければならない。
Claims (37)
- 生物活性部分を極性上皮細胞層を横断して輸送する方法であって、 (1) α2マクログロブリン受容体(α2-MR)に結合する細胞認識部分および (2) 生物活性部分を含み、該生物活性部分は (a) 受容体結合性、サイトカイン活性、酵素活性、ホルモン活性、インターロイキン活性、神経伝達活性、転写又は翻訳の調節、及び生物有機分子に対する親和性から選択される生物活性をもち、 (b) 単独では免疫反応を誘導する免疫原として機能せず、また (c) ADPリボシル化活性をもたないことを特徴とする生物活性複合体を該細胞層の頂面に投与することを含む方法。
- 生物有機分子がポリペプチドである請求項1の方法。
- 上皮細胞層がインビトロ培養膜である請求項2の方法。
- 上皮細胞層が対象哺乳動物の粘膜表面である請求項2の方法。
- 哺乳動物が人間である請求項4の方法。
- 細胞認識部分がα2ミクログロブリンに結合する抗体を含む請求項4の方法。
- 細胞認識部分がシュードモナス属外毒素A (PE)ドメインIaのうちの、α2ミクログロブリンに結合するに足る部分を含む請求項4の方法。
- 細胞認識部分がシュードモナス属外毒素A (PE)ドメインIaを含み、また複合体がPEのドメインIIをさらに含む請求項4の方法。
- 複合体が (a) シュードモナス属外毒素A (PE)ドメインIa、及び (b) 極性上皮細胞層の頂面から基底面への移行を引き起こすに足るPE部分を含むPE複合体であって、該PE部分はPEドメインII、リボシル化活性をもたないPEドメインIII の少なくとも一部分、及び所望によりPEドメインIbを含み、また生物活性部分がポリペプチドを含むことを特徴とする請求項4の方法。
- 粘膜表面が呼吸器系の粘膜表面である請求項4の方法。
- 粘膜表面が胃腸系の粘膜表面である請求項4の方法。
- 粘膜表面が生殖器系の粘膜表面である請求項4の方法。
- 生物活性部分が抗体、レクチン、DNA結合性タンパク質又は脂質結合性タンパク質を含むポリペプチドを含んでなる請求項4の方法。
- 生物活性部分が対象哺乳動物の細胞表面受容体に対応するリガンドを含むポリペプチドを含んでなる請求項4の方法。
- 生物活性部分が酵素を含むポリペプチドを含んでなる請求項4の方法。
- 生物活性部分がインスリン、インターフェロン、成長ホルモン又はエリスロポエチンを含むポリペプチドを含んでなる請求項4の方法。
- 生物活性部分が第二ポリペプチド、炭水化物、脂質又は核酸に結合したポリペプチドリガンドを含んでなる請求項4の方法。
- 生物活性部分がポリペプチドを含み、また複合体が細胞認識部位を該ポリペプチドに融合させてなる融合タンパク質を含む請求項4の方法。
- 細胞認識部分とPE部分がPE (配列番号2)のアミノ酸1〜470を含む請求項18の方法。
- PE部分がPE (配列番号2)のアミノ酸253〜470又はアミノ酸280〜470を含む請求項18の方法。
- 融合タンパク質がプロテアーゼによって認識される開裂部位を含み、該部位での開裂により融合タンパク質から生物活性部分が放出されることを特徴とする請求項18の方法。
- プロテアーゼが膜の基底面に局在化しているプロテアーゼである請求項21の方法。
- 複合体が該複合体と製薬上許容しうる担体とを含んでなる製剤組成物の形で投与される請求項4の方法。
- 担体が粉末又は水溶液である請求項23の方法。
- 組成物がドロップ剤、噴霧剤又はカプセル剤として製剤化される請求項23の方法。
- 複合体が、細胞認識部分、PE部分及びポリペプチド部分を構成要素とする単一ポリペプチドとしての融合タンパク質を含む請求項23の方法。
- 1μg〜1000mgの複合体を投与することを含む請求項4の方法。
- 膜上のPE受容体を飽和させるに足る量の複合体を投与することを含む請求項4の方法。
- 生物活性複合体であって (1) α2マクログロブリン受容体(α2-MR)に結合する細胞認識部分および (2) 生物活性部分を含み、該生物活性部分は (a) 受容体結合性、サイトカイン活性、酵素活性、ホルモン活性、インターロイキン活性、神経伝達活性、転写又は翻訳の調節、及び生物有機分子に対する親和性から選択される生物活性をもち、 (b) 単独では免疫反応を誘導する免疫原として機能せず、また (c) ADPリボシル化活性をもたないことを特徴とする生物活性複合体。
- 極性上皮細胞層の頂面から基底面への移行を引き起こすに足るPE部分をさらに含む生物活性複合体であって、該PE部分がPEドメインII、PEドメインIII 及び所望によりPEドメインIbに由来する配列を含むことを特徴とする請求項29の生物活性複合体。
- 生物有機分子がポリペプチドである請求項29の生物活性複合体。
- 細胞認識部分を生物活性部分と結合するプロテアーゼによる開裂が可能なアミノ酸配列をさらに含む生物活性複合体であって、該アミノ酸配列の開裂により複合体から生物活性部分が放出されることを特徴とする請求項29の生物活性複合体。
- 極性上皮細胞層の頂面から基底面への移行を引き起こすに足るPE部分をさらに含む生物活性複合体であって、該PE部分がPEドメインII、PEドメインIII 及び所望によりPEドメインIbに由来する配列と、ドメインIII と生物活性部分の間に配置された、プロテアーゼによる開裂が可能なアミノ酸配列とを含み、該アミノ酸配列の開裂により複合体から生物活性部分が放出されることを特徴とする請求項30の生物活性複合体。
- 製薬上許容しうる担体と (1) α2マクログロブリン受容体(α2-MR)に結合する細胞認識部分および (2) 生物活性部分を含み、該生物活性部分は (a) 受容体結合性、サイトカイン活性、酵素活性、ホルモン活性、インターロイキン活性、神経伝達活性、転写又は翻訳の調節、及び生物有機分子に対する親和性から選択される生物活性をもち、 (b) 単独では免疫反応を誘導する免疫原として機能せず、また (c) ADPリボシル化活性をもたないことを特徴とする生物活性とを含み、局所投与用に調剤される医薬組成物。
- 融合タンパク質複合体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、該融合タンパク質が (1) α2マクログロブリン受容体(α2-MR)に結合する細胞認識部分と結合した (2) 生物活性部分を含み、該生物活性部分は (a) 受容体結合性、サイトカイン活性、酵素活性、ホルモン活性、インターロイキン活性、神経伝達活性、転写又は翻訳の調節、及び生物有機分子に対する親和性から選択される生物活性をもち、 (b) 単独では免疫反応を誘導する免疫原として機能せず、また (c) ADPリボシル化活性をもたないことを特徴とする核酸。
- 複合体が極性上皮細胞層の頂面から基底面への移行を引き起こすに足るPE部分をさらに含み、該PE部分がPEドメインII、PEドメインIII 及び所望によりPEドメインIbに由来する配列を含むことを特徴とする請求項35の核酸。
- 複合体をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む請求項35の核酸。
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