JP2003514852A - 炎症反応を阻害する細胞透過性ペプチドおよび使用方法 - Google Patents

炎症反応を阻害する細胞透過性ペプチドおよび使用方法

Info

Publication number
JP2003514852A
JP2003514852A JP2001539436A JP2001539436A JP2003514852A JP 2003514852 A JP2003514852 A JP 2003514852A JP 2001539436 A JP2001539436 A JP 2001539436A JP 2001539436 A JP2001539436 A JP 2001539436A JP 2003514852 A JP2003514852 A JP 2003514852A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
peptide
cell
subject
cells
inflammatory response
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001539436A
Other languages
English (en)
Inventor
ジェイ． ハウィガー，ジャック
ロビンソン，ダニエル
アン ビーチ，ルース
ヤン リウ，シュー
リウ，ダンヤ
ティモンズ，シェイラ
ディー コリンズ，ロバート
Original Assignee
バンダービルト ユニバーシティ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by バンダービルト ユニバーシティ filed Critical バンダービルト ユニバーシティ
Publication of JP2003514852A publication Critical patent/JP2003514852A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/501—Fibroblast growth factor [FGF] acidic FGF [aFGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、移入コンピテントシグナルペプチドに連鎖された生物学的に活性な分子を含んでなる複合体を細胞に投与することによって、細胞内部の中に生物学的に活性な分子、例えば、ペプチドをデリバリーすることに関する。このようなデリバリーは、例えば、炎症性症状を治療および／または予防するために利用することができ、このような症状は、例えば、全身的炎症反応、例えば、エンドトキシンショック、局在化炎症反応、例えば、炎症性皮膚の疾患および症状、および炎症性疾患、例えば、自己免疫疾患を包含するが、これらに限定されない。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 謝辞 本発明は、国立心臓、肺および血液研究所（National Heart，Lung and Bl
ood Institute）により与えられたNIH許可No. HL 30648およびNo. HL 4599
4下に政府の一部支援を得てなされた。
【０００２】 関係する出願に対する相互参照 この出願は米国特許出願第09／450,071号、1999年11月29日提出の一部継続出
願であり、後者は米国特許出願第09／170,754号、1998年10月13日提出の一部継
続出願であり、後者は米国特許出願第09／052,784号、1997年3月31日提出の一部
継続出願であり、後者は米国特許出願第08／252,852号、1994年6月13日提出の一
部継続出願であり、これらすべては引用することによって本明細書の一部とされ
る。
【０００３】 発明の分野 本発明は、生物学的に活性な分子、およびシグナルペプチドに連鎖された生物
学的に活性な分子を含んでなる複合体を細胞に投与することによって、細胞内部
に生物学的に活性な分子を送達する方法に関する。本発明は、また、細胞透過性
ペプチドアナローグの開発、および全身的炎症反応症候群、例えば、エンドトキ
シンショック、ならびに炎症性疾患および症状をコントロールするために、これ
らのペプチドアナローグをターゲット送達する方法に関する。
【０００４】 発明の背景 ペプチドは多数の療法的使用のために開発されてきている。例えば、現在新し
いペプチド薬剤がターゲットとする疾患は、心臓異常、癌、内分泌疾患、神経学
的欠陥、呼吸器異常、アレルギーおよび自己免疫疾患を包含する。既知治療ペプ
チドの製造は既知の方法、例えば、古典的合成技術または組換え遺伝子操作によ
り達成することができるが、ペプチドは容易に生物学的膜を横切って細胞の中に
入ることができないので、ペプチドのデリバリーは問題を残したままである。こ
うして、現在の方法は、細胞膜の透過化、または細胞の中へのマイクロインジェ
クションを包含する。これらの両方の方法は重大な欠点を有する。例えば、サポ
ニン、細菌トキシン、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション上皮細胞によ
る、細胞の透過化はex vivo方法についてのみ有効であり、そしてこれらの方法
は細胞に対する損傷を引き起こす。マイクロインジェクションは高度に熟練した
技術を必要とし（こうしてその使用は実験室の設定に制限される）、細胞を物理
的に損傷し、そして多数の細胞を実行可能に注入することができないので、例え
ば、細胞の塊または組織全体を処理するために使用することができない。
【０００５】 同様に、核酸のデリバリーは問題を引き起こした。現在使用されている方法は
、前述の欠点を有する、前述の透過化、ならびにウイルスに基づくデリバリー、
例えば、ウイルスベクター、およびリポソーム仲介デリバリーを包含する。しか
しながら、ウイルスベクターは患者に対して追加の危険を提示することがあり、
そしてリポソーム技術は満足すべき高いレベルの細胞の中へのデリバリーを達成
しなかった。
【０００６】 固相合成1は、共通の疎水性モチーフを共有し、哺乳動物小胞体（ER）を横切
る大部分の分泌タンパク質の転位および推定上のタンパク質伝導チャンネルを通
る原核原形質膜の転位を仲介する2~11。また、分泌タンパク質輸送の別のモデル
は、膜に対するタンパク質のターゲッティングにおけるシグナルペプチドの役割
を支持する12~15。
【０００７】 いくつかの型のシグナル配列の膜の中から外への転位が提案された。主要なモ
デルは、膜を横切って、多数の膜タンパク質により形成された親水性タンパク質
伝導チャンネルを通してタンパク質が輸送されることを意味する2~11。真核生物
において、細胞質において新しく合成されたタンパク質はシグナル配列によりER
膜にターゲッティングされる。シグナル配列は一般的にシグナル認識粒子（SRP
）およびその膜レセプターにより認識される。このターゲッティング段階に引き
続いて、タンパク質は実際にER膜を横切って、細胞の中から外に推定上のタンパ
ク質伝導チャンネルを通して移動する（最近の概観について、参考文献2〜5参照
）。細菌において、細胞質膜を横切る大部分のタンパク質の輸送はまた同様なタ
ンパク質伝導チャンネルを必要とする7~11。他方において、シグナリング経路は
脂質と強く相互作用し、細胞膜を横切るいくつかの分泌タンパク質の輸送が任意
のタンパク質チャンネルの非存在下に脂質二重層を直接通して起こることができ
るという提案を支持する。
【０００８】 こうして、in vivoおよびin vitroの両方において、細胞の中へ生物学的に
活性な分子を移入するために開発されてきている多数の試みは、いずれも完全に
は満足すべきものでないことが証明された。
【０００９】 発明の要約 本発明は、炎症性疾患および症状を治療する方法およびペプチドを提供する。
【００１０】 例えば、本発明は、被検体における炎症反応を治療または予防する方法を提供
する。この方法は、NF−κB核局在化配列を含有するペプチドを被検体に投与し
、被検体の細胞中のストレス反応性転写因子の移入を阻害し、これにより被検体
における炎症反応を治療または予防することを含んでなる。
【００１１】 本発明は、また、NF−κBの核局在化配列を含むペプチドを包含する化合物を
被検体に送達させ、NF−κBの核移入を阻害し、これにより被検体における敗血
症性ショックを治療または予防することを含む、被検体における敗血症性ショッ
クを治療または予防する方法を提供する。
【００１２】 本発明は、さらに、移入コンピテントシグナルペプチドに連鎖された生物学的
に活性な分子を含んでなる複合体を被検体に投与し、これにより被検体の細胞核
の中に前記分子を移入させることを含んでなる、被検体の細胞核の中に生物学的
に活性な分子を移入させる方法を提供する。
【００１３】 さらに、本発明は、移入コンピテントシグナルペプチドと、核局在化ペプチド
とに連鎖された生物学的に活性な分子を含んでなる複合体を被検体に投与し、こ
れにより被検体の細胞核の中に前記分子を移入させることを含んでなる、被検体
の細胞核の中に生物学的に活性な分子を移入させる方法を提供する。
【００１４】 本発明は、また、核酸、炭水化物、脂質、糖脂質および治療剤から成る群から
選択される生物学的に活性な分子に連鎖された移入コンピテントシグナルペプチ
ドを含んでなる複合体を提供する。
【００１５】 本発明は、また、本発明の方法において使用するペプチド、例えば、配列番号
9に記載するアミノ酸配列を含むペプチド；配列番号12に記載するアミノ酸配列
を含むペプチド；および配列番号13に記載するアミノ酸配列を含むペプチドを提
供する。
【００１６】 発明の詳細な説明 本発明は、本明細書に含まれる特定の態様および実施例および図面の下記の詳
細な説明を参照することによって、いっそう容易に理解することができる。
【００１７】 本発明は、移入コンピテントシグナルペプチド配列（また、同義用語「シグナ
ルペプチドの細胞膜透過性疎水性領域」により言及する）を選択した生物学的に
活性な分子に結合して複合体を形成し、この複合体を細胞に投与することによっ
て、完全な細胞の中への外因的生物学的に活性な分子の移入を操作できるという
発見を提供する。次いで複合体は細胞により細胞膜を横切って移入される。こう
して、移入コンピテントシグナルペプチド（また、「シグナルペプチドの細胞膜
透過性疎水性領域」として知られている）に連鎖された生物学的に活性な分子を
、移入条件下に、細胞に投与し、これによりこの分子を細胞の中に移入すること
を含む、ex vivoまたはin vivoにおいて生物学的に活性な分子を細胞の中に移
入する方法を提供する。
【００１８】 本明細書において使用するとき、「生物学的に活性な分子」は、細胞の中に移
入された場合、生物学的作用を有することができる任意の分子を包含する。しか
しながら、非常に大きいタンパク質（約100,000〜約1,000,000の分子量の範囲）
が細胞（例えば、抗体、フィブリノゲン、およびマイクログロブリン）により輸
出されるので、非常に大きいタンパク質をこの方法により細胞の中に移入するこ
とができる。大きさ範囲、数アミノ酸〜1,000アミノ酸のタンパク質を使用する
ことができる。タンパク質の大きさ範囲は、数アミノ酸〜約250アミノ酸である
。任意の分子について、大きさ範囲は約1,000,000までの分子量であることがで
き、好ましい大きさ範囲は約25,000までの分子量であり、なおより好ましい大き
さ範囲は約3,000までの分子量である。さらに、直接的または間接的にシグナル
ペプチドに連鎖することができる分子のみが本発明の範囲内に入る。同様に、本
発明は、細胞の中への有効な移入に適当な条件下に複合体を投与することを必要
とする。
【００１９】 生物学的に活性な分子の例は、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを包
含し、これらは生物学的に活性な分子、例えば、増殖因子、酵素、転写因子、ト
キシン、抗原ペプチド（ワクチンに関する）、抗体、および抗体フラグメントの
機能的ドメインを包含する。生物学的に活性な分子の追加の例は、核酸、プラス
ミド、コーディングDNA配列、mRNAおよびアンチセンスRNA分子、炭水化物、脂質
および糖脂質を包含する。生物学的に活性な分子のそれ以上の例は、治療剤、特
に低い細胞膜透過性を有するものを包含する。これらの治療剤のいくつかの例は
、癌薬剤、例えば、ダウロルビシン26、およびこの方法により投与できるより低
い投与量のために、今回安全に投与できる毒性化学物質を包含する。
【００２０】 生物学的に活性な分子の特定の例は、本明細書において配列番号2として記載
する、酸性繊維芽細胞増殖因子（aFGF）の核局在化配列（NLS）を含んでなるペ
プチドである。下記の実施例において証明されるように、aFGFのNLSは、シグナ
ルペプチドに連鎖され、細胞の中に輸送されたとき（例えば、本明細書において
配列番号2として記載する全ペプチド）、細胞において突然変異誘発応答を誘導
する。生物学的に活性な分子の他の例は、本明細書において配列番号10として記
載する、転写因子のNF−κBサブユニットp50のNLSを含んでなるペプチドである
。本明細書における実施例に示すように、ペプチドがK−FGFのシグナル配列およ
び転写因子NF−κB p50サブユニットのNLSを含んでなるとき、本明細書におい
て配列番号9として記載する、このペプチド（SN50と呼ぶ）は転写因子NF−κBを
有する細胞の中に転移され、核の中への活性NF−κB複合体の正常転位は阻害さ
れる。この方法において、NF−κBの作用を阻害し、したがって転写因子NF−κB
によりコントロールされる遺伝子発現を阻害することによって、細胞増殖を阻害
することができる。
【００２１】 生物学的に活性な分子のなお他の例は抗原ペプチドである。免疫応答に関係す
る細胞により移入されるとき、抗原ペプチドは投与されて免疫学的保護を提供す
ることができる。他の例は、免疫抑制ペプチド（例えば、自己反応性T細胞をブ
ロックするペプチド、これらのペプチドはこの分野において知られている）を包
含する。多数の他の例は当業者にとって明らかとなるであろう。
【００２２】 適当な移入条件は本明細書において例示され、約180℃〜約42℃の細胞および
複合体のみを温度を包含し、好ましい温度は約22℃〜約37℃である。被検体の細
胞に投与するために、複合体は、いったん被検体の中に入ると、もちろん被検体
の体温に調節される。ex vivo投与のために、複合体は細胞の生活能力を維持す
る標準方法により、例えば、それを培地（ターゲット細胞のために適当な）に添
加し、この培地を細胞に直接的に添加することによって投与することができる。
この分野において知られているように、この方法において使用する任意の培地は
、細胞を生存不可能しないように、水性および非毒性であることができる。さら
に、所望ならば、それは細胞の生活能力を維持するための標準培地を含有するこ
とができる。in vivo投与のために、複合体は、例えば、患者からの血液組織ま
たは組織試料に、または薬学上許容される担体、例えば、生理食塩水または緩衝
化生理食塩水に添加し、この分野において知られている任意のいくつかの手段に
より投与することができる。投与の例は、非経口的投与、例えば、1またはそれ
以上のターゲット細胞を有する1またはそれ以上の血管供給組織または1またはそ
れ以上の器官1またはそれ以上のターゲット細胞を有する1またはそれ以上のを通
す領域的灌流を包含する静脈内注射による投与、またはエーロゾルの吸入、皮下
または筋肉内注射、局所的投与、例えば、皮膚の創傷および病変、例えば、移植
のために準備された骨髄細胞の中への直接的トランスフェクションおよび引き続
く被検体の中への移植、および引き続いて被検体の中に移植される器官の中への
直接的トランスフェクションによる投与を包含する。他の投与法は、特に複合体
をカプセル化するとき、経口的投与、または特に複合体が坐剤形態であるとき、
経直腸的投与を包含する。薬学上許容される担体は、生物学的に活性でないか、
あるいはそうでなければ望ましくないものでない、任意の物質を包含する、すな
わち、この物質は望ましくない生物学的作用を引き起こさないで、または投与さ
れる医薬組成物の他の成分と有害な方法で相互作用しないで、選択した複合体と
一緒に個体に投与することができる。投与は約1分〜約72時間の時間的長さにわ
たって実行することができる。好ましい時間的長さは約5分〜約48時間、なおよ
り好ましくは約5分〜約20時間、なおより好ましくは約5分〜約2時間である。任
意の特定の複合体および任意の特定のターゲット細胞について最適な時間的長さ
および条件は、本明細書における教示およびこの分野における知識27が与えられ
ると、容易に決定することができる。詳しくは、特定の細胞型を、例えば、器官
または腫瘍からの局所的灌流により、ターゲッティングすべき場合、ターゲット
組織からの細胞を生検し、その組織の中に複合体を移入するための最適投与量を
、本明細書に記載するようにかつこの分野において知られているように、in vi
troで決定して、濃度および時間的長さを包含する、in vivo投与量を最適化す
ることができる。選択的に、同一細胞型の培養細胞をまた使用して、てターゲッ
ト細胞についてin vivo投与量を最適化することができる。
【００２３】 ex vivoまたはin vivo使用のために、複合体は任意の有効濃度で投与するこ
とができる。有効濃度は、細胞の中への生物学的に活性な分子の移入を生ずる量
である。このような濃度は典型的には約0.5nM〜約100μM（培地濃度（ex vivo）
または血清濃度（in vivo））であろう。特定の複合体および特定のターゲット
細胞のための最適濃度は、本明細書における教示に従い容易に決定することがで
きる。こうして、複合体のin vivo投与量は、複合体の血清濃度が約0.5nM〜約1
00μMである投与量である。好ましい濃度は約2nM〜約50μMである。投与される
複合体の量は、もちろん、治療される被検体、被検体の年齢および体重、投与方
法、および熟練した投与者の判断に依存するであろう。複合体の正確な量は、さ
らに、被検体の一般的状態、投与および選択した特定の複合体により処置される
疾患／症状の発病度に依存するであろう。しかしながら、本明細書における教示
が与えられると、当業者は日常的最適化を使用して適当な量を決定することがで
きる。
【００２４】 非経口的投与、例えば、局所的灌流は、使用する場合、一般に注射により特徴
づけられる。注射可能な流体は、慣用形態、例えば、液状の溶液、懸濁液、また
は乳濁液の形態で調製することができる。また、遅い放出または持続放出性系、
例えば、米国特許第3,710,795号に開示されている系を使用して、一定レベルの
投与量を維持することができる。
【００２５】 意図する投与モード（例えば、下記のものを包含するが、これらに限定されな
い：静脈内、非経口、経皮、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼内、心室内、莢
膜内、脊髄内、嚢内、腹腔内、鼻内、直腸内、膣内、エーロゾル、または経口）
に依存して、医薬組成物は固体、半固体または液体の投与形態、例えば、錠剤、
坐剤、丸剤、カプセル剤、散剤、液体、懸濁液、ローション、クリーム、ゲル、
またはその他の形態で、好ましくは正確な投与量の単一投与に適当な単位投与形
態であることができる。組成物は、前述したように、有効量の薬剤を薬学上許容
される担体と組合わせて含み、そして、さらに、他の医学的物質、例えば、薬学
的物質、担体、アジュバント、希釈剤、およびその他を含むことができる。
【００２６】 固体状組成物について、慣用の無毒固体状担体は、例えば、薬学的等級のマン
ニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリ
ン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム、および
その他を包含する。液状薬学的に投与可能な組成物は、例えば、本明細書に記載
する活性化合物、および必要に応じて薬学的アジュバントを賦形剤、例えば、水
、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびその他の中
に溶解、分散、などし、これにより溶液または懸濁液を形成することによって調
製することができる。所望ならば、投与すべき医薬組成物は少量の無毒補助物質
、例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝化剤およびその他を含有することができ
る。このような投与形態を調製する他の方法は既知であるか、あるいは当業者に
とって明らかとなるであろう；例えば、Remington's Pharmaceutical Science
s（27参照）。
【００２７】 本発明は、選択した移入コンピテントシグナルペプチドまたはシグナルペプチ
ドの細胞膜透過性疎水性領域に連鎖された生物学的に活性な分子を含んでなる複
合体を利用する。前述したように、生物学的に活性な分子は任意の種々の分子か
ら選択することができ、その選択は選択した細胞の中に分子を移入することによ
って達成すべき目的に依存する。「移入コンピテントシグナルペプチド」または
「シグナルペプチドの細胞膜透過性疎水性領域」は、本明細書において使用する
とき、一般に約10〜約50またはそれより長いアミノ酸残基長さの配列であり、そ
れらのうちの多数（典型的には約55〜60％）の残基は疎水性であり、こうして疎
水性、脂質可溶性部分を有する1。疎水性部分はシグナルペプチドの共通の、主
要なモチーフであり、そしてしばしば細胞から分泌されたタンパク質の中央部分
である。シグナルペプチドは細胞膜を貫通して細胞のタンパク質の輸出を可能と
するペプチドである。本発明のシグナルペプチドは、ここにおいて発見されたよ
うに、また、「移入コンピテント」または「細胞透過性」である、すなわち、細
胞の外側から細胞膜を通して細胞の内部に浸透することができる。アミノ酸残基
は、ペプチドの修飾が転位仲介機能に影響を与えないかぎり、突然変異されたお
よび／または修飾することができる（すなわち、模倣物を形成するために）。こ
うして言語「ペプチド」は模倣物を包含し、そして言語「アミノ酸」は修飾され
たアミノ酸、本明細書において使用するとき、異常なアミノ酸、およびD−型ア
ミノ酸を包含する。本発明に包含されるすべての移入コンピテントシグナルペプ
チドは、細胞の外側から細胞膜を横切って細胞の内部に入る転位を仲介する機能
を有する。このような移入コンピテントシグナルペプチドは、それらがタンパク
質を輸出する能力を喪失するが、分子を細胞の中に移入する能力を維持するよう
に、潜在的に修飾することができる。推定上のシグナルペプチドは、任意の選択
された細胞型に対する特異性についての試験を包含する、本明細書において提供
される教示に従い、この移入活性について容易に試験することができる。
【００２８】 シグナルペプチドは、例えば、SIGPEPデータベースから選択することができ、
このデータベースはまたシグナルペプチドの起源を記載する30、38。特定の細胞
型をターゲットとすべきとき、その細胞型が使用するシグナルペプチドを選択す
ることができる。例えば、特定のオンコジーンが発現される細胞をターゲッティ
ングするとき使用するために、そのオンコジーンによりコードされるシグナルペ
プチドを選択することができる。さらに、細胞型の中に生物学的に活性な分子を
移入するために、その細胞型に対して内因的であるシグナルペプチドを選択する
ことができる。そして再び、本明細書における教示に従い任意の所定の細胞型の
細胞膜を横切って転位する能力について、任意の選択したペプチドを日常的に試
験することができる。詳しくは、選択したシグナルペプチドを生物学的に活性な
分子に、例えば、細胞タンパク質のリポーター構築物の機能的ドメインに結合し
、細胞に投与し、そしてこの細胞を引き続いて活性分子の存在についてスクリー
ニングする。シグナルペプチド中の修飾されたアミノ酸の存在は、生物学的に活
性な分子がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である、複合体を被検体に
おけるペプチダーゼに対していっそう耐性とするために、さらに有効であること
がある。こうして、これらのシグナルペプチドは、より多くのペプチドをそれら
のターゲットに到達させ、そしてペプチドが分解する前のペプチドの寿命を延長
することによって、いっそう有効な治療を可能とすることができる。さらに、シ
グナルペプチドのアミノ酸配列を修飾して、もとのシグナル配列の中に存在する
タンパク質分解切断部位を変更してシグナル配列を除去することができる。切断
部位は、側鎖をもたない、小さい、正に帯電したアミノ酸により特徴づけられ、
シグナルペプチドのカルボキシ末端から約1〜約4アミノ酸内に局在化される1。
【００２９】 有用なシグナルペプチドの1例は、本明細書において配列番号5として記載する
、カパッソ（Capasso）繊維芽細胞増殖因子（K−FGF）からのシグナルペプチド
である16~17。しかしながら、細胞膜を横切って選択したターゲット細胞に内部
に転位することができる、任意のペプチドを本発明に従い使用することができる
。
【００３０】 「連鎖した」は、本明細書において使用するとき、シグナルペプチドが細胞膜
を横切るとき、生物学的に活性な分子もまた細胞膜を横切って移入されるような
方法で、生物学的に活性な分子がシグナルペプチドとアソシエートされているこ
とを意味する。このような連鎖の例は下記のものを包含する：（1）分子がペプ
チドであるとき、シグナルペプチド（および、所望ならば、核局在化ペプチド）
をペプチド結合により連鎖することができる、すなわち、2つのペプチドを隣接
させて合成することができる；（2）分子がポリペプチドまたはタンパク質（抗
体を包含する）であるとき、シグナルペプチド（および、所望ならば、核局在化
ペプチド）をペプチド結合または非ペプチド共有結合により分子に連鎖すること
ができる（例えば、シグナルペプチドを架橋剤でタンパク質に結合する）；（3
）負電荷を有する分子、例えば、核酸について、分子およびシグナルペプチド（
および、所望ならば、核局在化ペプチド）を負に帯電した分子とペプチド中の正
に帯電したアミノ酸との間の電荷アソシエーションにより、または核酸とアミノ
酸との間の他の型のアソシエーションにより結合することができる；（4）化学
的連鎖法を使用して、シグナルペプチド（および、所望ならば、核局在化ペプチ
ド）のカルボキシ末端アミノ酸と分子との間の結合をつくる。方法（1）および
（2）は典型的には好ましい。
【００３１】 方法（1）の例は下に示されており、ここでペプチドはこの分野において知ら
れている標準的手段24，25により合成され、アミノ末端から線形順序で、シグナ
ルペプチド配列、任意のスペーサーアミノ酸領域、および生物学的活性アミノ酸
配列を含有する。また、このようなペプチドは組換えDNA技術により製造し、前
述のアミノ10酸をコードする組換え構築物から発現させてペプチドをつくること
ができる28。
【００３２】 方法（2）について、前述のペプチド結合を利用するか、あるいは非ペプチド
共有結合を使用して、シグナルペプチドを生物学的に活性なポリペプチドまたは
タンパク質と連鎖することができる。この非ペプチド共有結合は、この分野にお
いて標準的な方法により、例えば、架橋剤、例えば、グルタルアルデヒドを介し
てシグナルペプチドをポリペプチドまたはタンパク質に結合させることによって
形成することができる。このような方法はこの分野において標準的である29。方
法（3）について、分子を単にシグナルペプチドと混合し、こうしてアソシエー
トさせることができる。これらの方法は、核酸とカチオン性リポソームとのアソ
シエーションと同一方法で実行する32~34。選択的に、核酸とペプチドとの間で
共有結合（チオエステル）結合を形成することができる。
【００３３】 方法（4）について、標準的化学的結合方法、例えば、シグナルペプチドのカ
ルボキシ末端アミノ酸と相互作用する化学的架橋リンカーを使用する方法を利用
することができる。このような方法はこの分野において標準的であり（例えば、
Goodfriend31、これは結合剤として水溶性カーボジイミドを使用する）、そして
シグナルペプチドのカルボキシ末端を任意の選択した生物学的に活性な分子に結
合するために容易に実行することができる。
【００３４】 被検体に投与される複合体はリポソームを含んでなることができる。カチオン
性およびアニオン性リポソーム、ならびに中性脂質を有するリポソームが本発明
において考えられる。カチオン性リポソーム、シグナルペプチドおよび負に帯電
した生物学的に活性な分子を混合し、それらを帯電アソシエートさせることによ
って、カチオン性リポソームをシグナルペプチドおよび負に帯電した生物学的に
活性な分子と複合化することができる。生物学的に活性な分子が核酸であるとき
、核酸の負の帯電のために、カチオン性リポソームは特に有効である。カチオン
性リポソームの例は、リポフェクチン、リポフェクタミン、リポフェクテイスお
よびDOTARである32~34。一般に、アニオン性リポソームはリポソーム内で物質を
細胞に送達させるために利用される。物質を包むカチオン性リポソームを形成す
る手順はこの分野において標準的であり、そして当業者は本発明の複合体を包む
ために本発明においてこの手順を容易に利用することができる。
【００３５】 生物学的に活性な分子の移入が有効である、選択した細胞と複合体を接触させ
る手段が存在するかぎり、任意の選択した細胞をこの方法によりターゲッティン
グすることができる。例えば、複合体を投与する血管により供給される、組織ま
たは器官内に細胞は存在することができる。さらに、例えば、ペプチドに連鎖さ
れた分子の吸入により肺上皮をターゲッティングすることによって、細胞をター
ゲッティングすることができる。本発明の方法によりターゲッティングすること
ができる細胞のいくつかの例は、なかでも、繊維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、
血球および腫瘍細胞を包含する。さらに、複合体を体の中の組織部位に直接的に
投与することができる。前述したように、利用するシグナルペプチドは選択した
ターゲット細胞が利用することが知られているシグナルペプチドから選択するこ
とができるか、あるいは本明細書における教示が与えられると、所望のシグナル
ペプチドを移入能力について試験することができる。しかしながら、一般に、少
なくとも一部分、疎水性特性のために、すべてのシグナルペプチドは細胞膜を横
切る共通の能力を有する。こうして、一般に、すべての真核細胞膜は同様な脂肪
二重層を有するので、膜透過性シグナルペプチドを設計し、任意の細胞型につい
て使用することができる。
【００３６】 1つの特に有効な例は免疫系細胞の中に抗原ペプチドを移入させ、これにより
抗原提示細胞が抗原を提示できるようにし、そして抗原に対する免疫応答を被検
体が発生できるようにする。ワクチンを、例えば、筋肉内、皮下または経口的に
投与する標準的方法に従い、これらの抗原ペプチドを含有する複合体を被検体に
投与し、引き続いて抗原に対する抗体の存在を測定することによって、有効性を
測定することができる。本発明は、また、シグナルペプチドの細胞膜透過性疎水
性領域と、核局在化ペプチドとに連鎖された生物学的に活性な分子を含んでなる
複合体を被検体に投与し、これにより被検体の細胞核の中に前記分子を移入させ
ることを含んでなる、被検体の細胞核の中に生物学的に活性な分子を移入させる
方法を提供する。核局在化ペプチドは、本明細書において使用するとき、細胞核
の中に細胞内ペプチドを送達する機能を有するペプチドである。このような核局
在化配列はこの機能を有することが知られている36，37。核局在化ペプチドの例
は、本明細書において配列番号2として記載する、aFGFの核局在化配列である。
核局在化ペプチド（aFGF）に連鎖されたシグナルペプチド（K−FGF）の例は、配
列番号3に記載される。これらの実施例が証明するように、所望ならば、核局在
化ペプチド配列をシグナルペプチドに隣接するペプチドとして合成することがで
きる。さらに、任意の手段、例えば、本明細書に記載する手段により、別々のペ
プチドを連鎖することができる。
【００３７】 本発明は、NF−κBの核局在化配列を含むペプチドを含んでなる化合物を被検
体に送達し、NF−κBの核移入を阻害する、現在好ましい態様において、AP−1、
NFAT、またはSTAT−1の1つまたはすべてをまた阻害する、ことを含んでなる、被
検体における敗血症（敗血症性ショック）を治療または予防する方法を提供する
。
【００３８】 下に例示する1つの態様において、移入コンピテントシグナルペプチドに連鎖
することによって、NF−κBの核局在化配列を被検体の細胞の中に送達させる。
また、下記の文献を参照のこと：Rojas、M.他、1998 Nature Biotechnology
16：370−375。しかしながら、NF−κBの核局在化配列は、また、他の手段、例
えば、タンパク質を細胞の中に導入する物理的方法（マイクロインジェクション
、エレクトロポレーションおよびATP処理）；化学的または生物学的孔形成（ジ
ニトニン、孔形成タンパク質およびATP処理）；修飾されたタンパク質の使用（
脂質化タンパク質および生物複合体、例えば、イムノトキシンとの複合体）；お
よび粒子吸収（微小球、ウイルス模擬物、誘導された飲作用）により送達するこ
とができる。Patton、J.、1998 Nature Biotechnology 16：141−143；Putne
yおよびBurke、1998 Nature Biotechnology 16：153−157およびFernandezお
よびBayley、1998 Nature Biotechnology 16：418−420。
【００３９】 選択的に、NF−κBの核局在化配列をコードする核酸を被検体に投与すること
によって、NF−κBの核局在化配列を送達することができる。このような核酸は
、例えば、裸DNAとして、ウイルスベクターで、またはカチオン性リポソームの
ような手段により、送達することができる。
【００４０】 本発明は、また、シグナルペプチドの細胞膜透過性疎水性領域と、核局在化ペ
プチドとに連鎖された生物学的に活性な分子を含んでなる複合体を被検体に投与
し、これにより被検体の細胞核の中に前記分子を移入させることを含んでなる、
被検体の細胞核の中に生物学的に活性な分子を移入させる方法を提供する。
【００４１】 本発明は、また、移入コンピテントシグナルペプチドに連鎖された増殖調節ペ
プチドを含んでなる複合体を被検体に投与して被検体の細胞の中に増殖調節ペプ
チドを移入させ、これにより細胞増殖を調節することを含んでなる、被検体にお
ける細胞増殖を調節する方法を提供する。選択した増殖調節ペプチドに依存して
、増殖を刺激または阻害することができる。本発明は、また、特定のターゲット
細胞における発現に適当なプロモーターの機能的制御下に増殖調節ペプチドをコ
ードする核酸を投与することによって、細胞増殖を調節する方法を提供し、ここ
で核酸をシグナルペプチドと複合化させ、ターゲット細胞に投与することに注意
すべきである。
【００４２】 この分野において知られている多数の増殖調節ペプチドが存在し、それらのい
ずれも、ターゲット細胞型および所望の調節型に適当ならば、本発明において利
用することができる。シグナルペプチドはターゲット細胞の中への増殖調節ペプ
チドの効率よい移入を促進し、そして、いったん調節ペプチドが移入されると、
それはその特異的方法で細胞増殖を調節する機能をする。特に有効なターゲット
細胞は、異常な細胞増殖をさらに阻害するためにその方法を使用できる、腫瘍細
胞である。酸性繊維芽細胞増殖因子（aFGF）の核局在化配列を含んでなる増殖調
節ペプチドを投与することによって、細胞増殖を刺激することができる。増殖を
阻害するペプチド、例えば、細胞における転写を阻害するペプチド、例えば、転
写因子NF−κBのp50サブユニットのNLSを投与することによって、細胞増殖を阻
害することができる。
【００４３】 この方法の例は下記の実施例において見られ、ここで増殖調節ペプチドは細胞
増殖を刺激し、aFGFの核局在化シグナルを含んでなる。この実施例が証明するよ
うに、所望ならば、増殖調節ペプチドはシグナルペプチドと隣接させて合成する
ことができるが、任意の既知の方法を利用してそれらを連鎖させることができる
。隣接ペプチドの例は配列番号3および配列番号4に記載されている。他の例は下
記において提供され、ここで転写因子NF−κB p50サブユニットのNLSに連鎖さ
れたK−FGFの膜透過性シグナルペプチドを含んでなる複合体（配列番号9）を投
与し、前炎症メディエイターをコードする遺伝子の発現を阻害する。
【００４４】 本発明は、また、NF−κB複合体の活性サブユニットの核局在化ペプチドに連
鎖された移入コンピテントシグナルペプチドを含んでなる複合体を調節に投与す
ることを含んでなる、転写因子NF−κBによりコントロールされる遺伝子の被検
体中の細胞における発現を阻害する方法を提供する。NF−κBによりコントロー
ルされる多数の遺伝子はこの分野において知られており、そして他の遺伝子を標
準的手段により容易に試験することができる。このような遺伝子の例は、サイト
カインおよびインターロイキン、例えば、IL−1、IL−6、顆粒球コロニー刺激因
子、プラスミノゲンアクチベーターインヒビターおよびプロコアグラント組織因
子を包含する。さらに、NF−κBにより影響を受ける遺伝子を有する生物はこの
方法により阻害することができ、このような生物はヒト免疫不全ウイルス（HIV
）およびサイトメガロウイルス（CMV）を包含する。特定の細胞型および特定の
遺伝子に最適な阻害ペプチドは、本明細書における教示が与えられると、標準的
方法により容易に決定することができる。さらに、特定の刺激因子に対して暴露
される特定の細胞型に最適な阻害ペプチドは容易に決定できる。
【００４５】 1例が本明細書において提供され、ここでリポ多糖（LPS）で刺激された内皮細
胞中の核へのNF−κB複合体の転位は、NF−κBのサブユニットp50のNLSに連鎖さ
れたシグナルペプチドを含んでなる複合体により阻害される。多分、サブユニッ
トp50のNLSは、競合的結合のために、核への複合体の転位を妨害する。いずれか
の刺激（または非刺激）に暴露されたいずれかの細胞型は、その細胞型について
最適な阻害ペプチド、すなわち、NF−κBのサブユニットの最適なNLSについて容
易にスクリーニングすることができる。例えば、LEIIについて、本明細書に証明
するように、p50のNLSは最適である。
【００４６】 NF−κB複合体のサブユニットはこの分野において知られている43。それらはp
50、p65および細胞のREL（c−REL）を包含する。これらのサブユニットの核局在
化配列もまた既知である。NF−κB複合体の「活性」サブユニットは、本明細書
において使用するとき、それが阻害されるとき、転写因子NF−κBがその制御下
に遺伝子転写を仲介する機能をしないようにさせるサブユニットを意味する。こ
の方法において使用する核局在化ペプチドは、本明細書における教示およびこの
分野において知られている知識に従い容易に決定できるように、それがNF−κB
によりコントロールされる遺伝子の発現を阻害する機能を保持するかぎり、これ
らのサブユニットの既知NLSの修飾物であることができる。
【００４７】 さらに、本発明は、抗原ペプチドに連鎖された移入コンピテントシグナルペプ
チドを含んでなる複合体を被検体に投与することを含んでなる、被検体の免疫系
を刺激する方法を提供する。複合体は、ワクチン投与についてこの分野において
知られている標準的手段により、被検体に投与することができる。この方法は、
引き続く抗原提示のための細胞の中への抗原吸収、および抗原に対する免疫性を
刺激する免疫系の既知カスケードの発生を促進することができる。
【００４８】 さらに、自己反応性T細胞をブロックする既知ペプチドをシグナルペプチドに
連鎖し、被検体に投与する場合、被検体における免疫抑制作用を刺激することが
できる。このような免疫抑制を刺激する方法を使用して、自己免疫疾患を治療す
ることができる。また、ペプチドを投与する既知の方法、例えば、ワクチンを投
与する方法により、これらのブロッキングペプチドを投与することができる。
【００４９】 本発明は、また、移入コンピテントシグナルペプチドと、核局在化ペプチドと
に連鎖された生物学的に活性な分子を含んでなる複合体を提供する。連鎖は前述
したようにまたはこの分野において知られている他の方法によりつくることがで
きる。前述したように、任意のシグナルペプチドおよび任意の核局在化配列を利
用することができるが、このような複合体は配列番号3および配列番号4に記載す
るアミノ酸配列により例示され、これらはaFGF核局在化ペプチド（配列番号2）
に連鎖されたK−FGFシグナルペプチド（配列番号5）を含有する。
【００５０】 本発明は、さらに、核酸、炭水化物、脂質、糖脂質および治療剤から成る群か
ら選択される生物学的に活性な分子に連鎖されたシグナルペプチドの細胞膜透過
性疎水性領域を含んでなる複合体を提供する。この複合体はリポソームをさらに
含んでなることができる。リポソームは前述したように選択することができる。
複合体は薬学上許容される担体の中に入れることができる。炎症性疾患および症状の治療 本発明の方法およびペプチドを使用して、前炎症サイトカインを含む任意の炎
症性疾患または症状を治療することができる。
【００５１】 例えば、本発明は、被検者における炎症反応を治療または予防する方法を提供
する。これらの方法は、NF−κB核局在化配列を含有するペプチドを被検体に投
与し、被検体の細胞におけるストレス反応性転写因子の移入を阻害し、これによ
り被検体における炎症反応を治療または予防することを含んでなる、被検体にお
ける炎症反応を治療または予防する方法を提供する。
【００５２】 下記において例示するように、ストレス反応性転写因子はNF−κB、AP−1、NF
AT、またはSTAT−1であることができる。NF−κB核局在化配列は、アミノ酸配列
Gln−Arg−Lys−Arg−Gln−Lysまたはアミノ酸配列Val−Gln−Arg−Lys−Arg−G
ln−Lys−Leu−Met−Proを包含することができる。また、NF−κB核局在化配列
を含有するペプチドは、シグナルペプチドの細胞膜透過性疎水性領域をさらに含
むことができる。
【００５３】 本発明は、シグナルペプチドの細胞膜透過性疎水性領域およびNF−κB核局在
化配列を含有する環状ペプチドを包含する。このような環状ペプチドの1つの特
定の例はcSN50（配列番号12）である。例えば、本発明の環状ペプチドは、アミ
ノ酸配列Cys−Xaa−Xaa−Gln−Arg−Lys−Arg−Gln−Lys−Xaa−Xaa−Xaa−Cys
（Cys−Xaa−Gln−Arg−Lys−Arg−Gln−Lys−Xaa−Xaa−Cys）を有する環化NF
−κB核局在化配列を含んでなり、ここでXaaは任意のアミノ酸（例えば、任意の
天然に存在するアミノ酸、またはそれらの合成変異型）である。その上、環状ペ
プチドの1またはそれ以上のアミノ酸はD−アミノ酸であることができる。環状ペ
プチドのNF−κB核局在化配列を取り囲むXaa残基のすべては、cSN50の中に見出
される配列または天然に存在するNF−κB核局在化配列の中に見出される配列に
対応することができるか、あるいはただ1つのXaa、または2つのXaa、3つのXaa、
またはすべての5つのXaaの任意の組合わせはcSN50の中に見出される配列または
天然に存在するNF−κB核局在化配列の中に見出される配列から分岐することが
できる。このような環状ペプチドのｘａ変異型はこの分野においてよく知られて
いる方法によりつくり、本明細書に証明するように、あるいは炎症反応またはス
トレス反応性転写因子の核移入を測定する任意の他のアッセイを使用して、試験
する。本発明は、本明細書に記載する任意の方法を使用して、被検体における炎
症反応を治療または予防するための環状ペプチドを同定する方法を提供する（例
えば、実施例III参照）。
【００５４】 環化は他の手段により、下記実施例Vに記載されているように達成することが
できる。また、環状ペプチドは、下記実施例Vに記載されているようにペプチド
のアミノ末端およびカルボキシ末端における残基（例えば、システイン）を介す
る環化により製造することができる。シグナルペプチドの細胞膜透過性疎水性領
域は、アミノ酸配列Ala−Ala−Val−Ala−Leu−Leu−Pro−Ala−Val−Leu−Ala
−Leu−Leu−Ala−Proを有するカポージ繊維芽細胞増殖因子またはアミノ酸配列
Val−Thr−Val−Leu−Ala−Leu−Gly−Ala−Leu−Ala−Gly−Val−Gly−Val−Gl
yを有するインテグリンベータ−3シグナルペプチド疎水性領域を含むことができ
る。
【００５５】 本発明の方法およびペプチドを使用して、微生物（または微生物からのトキシ
ン）、例えば、細菌（例えば、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌）、リケッ
チア、ウイルス、真菌、または原生動物により引き起こされる炎症反応を治療ま
たは予防することができる。例えば、細菌はグラム陰性細菌、例えば、大腸菌（
Escherichia coli）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、サルモネ
ラ・チフォサ（Salmonella typhosa）および他のサルモネラ（Salmonella）種
、またはシュードモナス・エルジノーサ［緑膿菌］（Pseudomonas aeruginosa
）および他のシュードモナス（Pseudomonas）種であることができるか、あるい
は細菌はグラム陽性細菌、例えば、スタヒロコッカス（Staphylococcus）、スト
レプトコッカス（Streptococcus）、およびニューモコッカス（Pneumoccocus）
の種であることができ、これらは、例えば、食物の毒作用または院内感染の結果
として、炎症反応を引き起こす。本発明の方法により治療または予防することが
できる炎症反応を引き起こす微生物感染の他の例は、リケッチア、例えば、リケ
ッチア・リケッチエ（Rickettsia Rickettsae）；ウイルス、例えば、エボラウ
イルス、デング出血性熱ウイルス、西ナイル脳炎ウイルス、および肝炎ウイルス
A、B、またはC；真菌、例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）
、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、および
ヒストプラズマ・カプスラツム（Histoplasma capsulatum）、および原生動物
、例えば、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）およびマラリアを引
き起こすプラスモジウム（Plasmodium）の他の種を包含する。
【００５６】 本発明の方法およびペプチドは、トキシン、例えば、炎症反応を引き起こす微
生物により産生される任意のトキシンにより誘発される炎症反応を治療または予
防するために使用することができ、このようなトキシンは下記のものを包含する
が、これらに限定されない：リポ多糖、または超抗原（例えば、スタヒロコッカ
ス・エンテロトキシン（Staphylococcus enterotoxin）AまたはB、化膿連鎖球
菌（Streptococcus pyogenes）のトキシンおよびMタンパク質、または微生物に
より産生される任意の超抗原）。また、これらの方法を使用して、超抗原により
誘導される任意の炎症反応を治療または予防することができる。本発明の方法に
より治療することができる炎症反応を誘発するトキシンの他の例は、植物トキシ
ン、例えば、ツタの毒またはオークの毒、ニッケル、ラテックス、環境的トキシ
ン（例えば、毒性化学物質）または皮膚接触または吸入時に炎症反応を誘発する
アレルゲンを包含する。例えば、トキシンの吸入は成人呼吸窮迫症候群を引き起
こすことがあり（これは敗血症性ショックおよび他の医学的症状を引き起こすこ
ともある）、これは本発明の方法により治療または予防することができる。
【００５７】 本発明の方法およびペプチドを使用して、全身的炎症反応および局在化炎症反
応の両方を治療または予防することができる。例えば、治療しない場合、究極的
に死を生ずる敗血症性ショックに導くことがある、全身的炎症反応症候群および
／または敗血症症候群を治療または予防するために、本発明の方法を使用するこ
とができる。この分野においてよく知られており、かつ下記実施例に記載されて
いるように、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌から生ずる菌血症は敗血症性
ショックに導く敗血症症候群を引き起こすことがある。このプロセスの1つのよ
く知られている例は、グラム陽性細菌、例えば、スタヒロコッカス（Staphyloco
ccus）またはスタヒロカス（Staphyloccus）の種により引き起こされる毒性ショ
ック症候群である。
【００５８】 また、本発明の方法およびペプチドを使用して、特定の器官または器官系の機
能に影響を与える炎症反応を治療または予防することができ、このような器官ま
たは器官系は、例えば、肝臓、腸、腎臓、関節、皮膚、膵臓、中枢神経系、末梢
神経系、膀胱、または生殖器官を包含するが、これらに限定されない。ある場合
において、炎症反応は炎症性疾患、例えば、自己免疫疾患により引き起こされる
。このような炎症性疾患の例は、炎症性腸疾患、クローン病、糸球体腎炎、多発
性硬化症、エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、乾癬、または若年性糖尿病を
包含するが、これらに限定されない。また、本発明の方法およびペプチドを使用
して、皮膚の慢性または急性炎症性疾患、例えば、乾癬、湿疹、または接触皮膚
炎を治療することができる。
【００５９】 その上、前炎症サイトカインおよび／またはストレス反応性転写因子（例えば
、NF−κB、AP−1、NFAT、またはSTAT−1）の核移入を包含する炎症症状により
誘導される細胞アポトーシスは、本発明の方法を使用して抑制、最小化、または
予防することができる。例えば、下記実施例に記載されているように、敗血症性
ショックから生ずる肝細胞アポトーシスは本発明の方法およびペプチドにより抑
制することができる。本発明の方法およびペプチドを使用して、炎症、例えば、
肝臓を中毒させる毒性（1例はアセトミノフェンによる）またはウイルス（例え
ば、肝炎ウイルス）から生ずる急性肝臓損傷の他の型により引き起こされる肝細
胞アポトーシスを抑制することができる。
【００６０】 本発明は、NF−κBの核局在化配列を含むペプチドを含んでなる化合物を被検
体に送達し、NF−κBの核移入を阻害し、これにより被検体における敗血症性シ
ョックを治療または予防することを含んでなる、被検体における敗血症性ショッ
クを治療または予防する方法を提供する。この方法および本発明の任意の他の方
法において使用するペプチドは、シグナルペプチドの細胞膜透過性疎水性領域を
さらに含む。さらに、本発明の方法は、また、AP−1、NFAT、またはSTAT−1から
成る群から選択されるメンバーの核移入を阻害し、本発明の方法は、また、AP−
1、NFAT、またはSTAT1の各々の核移入を阻害する。
【００６１】 本発明は、また、シグナルペプチドの細胞膜透過性疎水性領域と、核局在化ペ
プチドとに連鎖された生物学的に活性な分子を含んでなる複合体を被検体に投与
し、これにより被検体の細胞核の中に前記分子を移入させることを含んでなる、
被検体の細胞核の中に生物学的に活性な分子を移入させる方法を提供する。
【００６２】 さらに、本発明は、NF−κBの核局在化配列を含んでなるペプチドを被検体に
投与し、これにより被検体における全身的炎症反応を治療または予防することを
含んでなる、全身的炎症反応が被検体の細胞核の中へのストレス反応性転写因子
の移入を含む、被検体における全身的炎症反応を治療または予防する方法を提供
する。
【００６３】 本発明は、さらに、NF−κBの核局在化配列を含むペプチドを細胞に投与し、
これにより細胞核の中へのストレス反応性転写因子の移入を阻害することを含む
、細胞核の中へのストレス反応性転写因子の移入を阻害する方法を提供する。細
胞が被検体内に存在する場合、ペプチドを日常的方法により被検体に投与するこ
とができる。本発明の方法の1つの特定の例において、細胞は肝細胞であり、そ
して肝細胞へのペプチドの投与は肝細胞のアポトーシスを阻害する。この方法に
おいて使用するペプチドは、環状ペプチド、例えば、配列番号12に記載するアミ
ノ酸配列を包含する環状ペプチドであることができる。
【００６４】 本発明は、さらに、核酸、炭水化物、脂質、糖脂質および治療剤から成る群か
ら選択される生物学的に活性な分子に連鎖されたシグナルペプチドの細胞膜透過
性疎水性領域を含んでなる複合体を提供する。特定の例において、分子を環状ペ
プチド、例えば、配列番号12に記載するアミノ酸配列を含むペプチドに連鎖する
ことができる。
【００６５】 本発明は、また、ペプチド、例えば、配列番号9に記載するアミノ酸配列を含
むペプチド；配列番号12に記載するアミノ酸配列を含むペプチド；および配列番
号13に記載するアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。これらのペプチドおよ
び他のペプチドは本発明の方法において使用することができる。実用性に関する説明 本発明の方法は、細胞の中へ生物学的に活性な分子を移入する有効な方法を提
供し、in vivoおよびex vivoの両方において、多数の用途を有する。この方法
を使用する特定の用途は明らかであり、次のように例示される。in vivoにおい
て、この方法を使用して細胞治療分子、例えば、ペプチドおよびタンパク質を細
胞の中に送達して、異常な機能を調節するか、あるいは欠乏細胞を供給すること
ができる；遺伝子治療のためのDNA（例えば、嚢胞性繊維症の患者においてCFTR
を提供するために）；アンチセンス治療のためにRNA（例えば、癌細胞における
発現を阻害するとき増殖を阻害するために）；そして治療剤、例えば、癌薬剤ま
たは毒性化学物質（細胞の中にいっそう効率的に入るためにシグナルペプチドを
利用しない従来の方法に比較して、これらはより少ない投与量でこの方法により
投与することができる）。ex vivoにおいて、この方法は細胞損傷手順を実行し
ないで細胞の効率よいトランスフェクションを可能とする。したがって、ex viv
oにおいて、トランスフェクションを利用する方法、例えば、細胞の中にリポー
ター遺伝子をトランスフェクトして、リポーター遺伝子の発現に影響を与える化
合物についてスクリーニングする方法、および引き続いて被検体または培養細胞
の中に移植する骨髄細胞、血球、器官の細胞を、細胞におけるタンパク質の発現
に影響を与える遺伝子でトランスフェクトする方法において、本発明の方法は有
効である。
【００６６】 さらに詳しくは、この方法は、競合的結合により、血小板の凝集を仲介する既
知の細胞リポーターの機能的ドメインを投与することによって、抗血栓治療に使
用することができる。さらに、この方法は、免疫応答に関係する細胞の中に免疫
抑制ペプチドを導入することによって、自己免疫疾患における免疫抑制に使用す
ることができる。さらに、この方法により、増殖インヒビターを腫瘍細胞に投与
して、例えば、癌細胞を処置することができる。
【００６７】 この方法を使用して、消化管の内層より下の結合組織の中への生物学的に活性
な分子の運動を促進することによって、例えば、口、胃または腸管からの生物学
的に活性な分子の吸収を促進することができる。また、修飾されたアミノ酸を使
用するシグナルペプチドの設計を可能とすることによって、生物学的に活性なペ
プチドをペプチダーゼに対していっそう耐性とし、したがってまたペプチドの作
用を延長することによって、生物学的に活性なペプチドを安定化することができ
る。
【００６８】 さらに、敗血症を治療する方法がまた提供される。
【００６９】 本明細書において使用するとき、「a」は、それが使用される関係に依存して
、1またはそれ以上を意味することができる。
【００７０】 下記の実施例により、本発明をいっそう詳細に説明する。多数の変更および変
化が当業者にとって明らかであるので、これらの実施例は例示のみを意図する。
【００７１】 実施例I 本発明において使用するペプチドを段階的固相ペプチド合成アプローチ24によ
り合成し、記載されるように25、C18逆相カラムを使用する高性能液体クロマト
グラフィーにより精製した。精製したペプチドの正確な分子量を質量分析により
確認した。
【００７２】 K−FGFの予測されたシグナルペプチド配列16，17（配列番号5として本明細書
において別に記載する）後にSMペプチドのアミノ酸残基1〜16をパターン化し、
残基17〜19をスペーサーとして設計し、そして残基20〜26は抗体により認識され
るエピトープタグを含有する（配列番号1参照）。SAペプチドのアミノ酸残基1〜
19はSMペプチドのそれらと同一である。しかしながら、そのカルボキシル末端の
残基20〜26は、ANLペプチドの核局在化配列（配列番号2）に由来する、ANLペプ
チドの配列（配列番号2）と同一である。SAペプチドは配列番号3として記載され
る。SAαペプチドのアミノ酸配列はSAペプチドのそれと同一であるが、ただしそ
れは抗SMペプチド抗体に対するエピトープ（Leu−Met−Pro）をつくった、カル
ボキシル末端に2アミノ酸残基のエクステンション（Met−Pro）を有した。SAα
ペプチドを本明細書において配列番号4として記載する。膜透過性シグナル配列ペプチド（SMペプチド） カポージ繊維芽細胞増殖因子16~17（K−FGF）の予測されたシグナル配列を含
有する26残基のペプチド（SMと呼ぶ、本明細書において配列番号1として記載す
る）を化学的に合成した。エピトープを含有するSMペプチドに対する抗体を使用
する間接的免疫蛍光アッセイを使用して、NIH3T3細胞の細胞内区画へのSMペプチ
ドの転位を追跡した。SMペプチド−キーホールリンペットヘモシアニン複合体（
Pierce）に対してポリクローナル抗SMペプチド抗体をウサギにおいて発生させ、
ELISA（力価＞1：30,000）と反応させた。アフィニティー精製抗SMペプチドIgG
およびローダミン標識化抗ウサギ抗体（Kirkegaad & Perry）を使用する間接
的免疫蛍光アッセイにより、細胞内SMペプチドが検出された。簡単に述べると、
10％FBSを含有するDMEM中の0.5mlのSMペプチド溶液（100μg／ml）で、または10
％FBSのみを含有する0.5mlのDMEMで、チャンバースライド（Nunch）上のコンフ
ルエントNIH3T3細胞を37℃において30分間処理した。細胞をPBS中の3.5％パラホ
ルムアルデヒド溶液、次いでPBS中の0.25％トリトンX−100で固定し、次いで0.5
％ウシ血清アルブミン（BSA）中の1：20抗SMペプチドIgGで1.5時間処理した。引
き続いてローダミン標識化抗ウサギポリクローナル抗体と1時間インキュベート
することによって、細胞内SMペプチド抗体複合体を可視化した。対照系において
、抗SMペプチド抗体をSMペプチドと前インキュベートした。SMペプチドについて
前述したように、アフィニティー精製抗SMペプチドIgGを使用する免疫抑制アッ
セイにより、SAαペプチドの細胞内局在化を検出した。SMペプチドと細胞をイン
キュベートした後、細胞内沈着物がほとんどすべての細胞において観測された。
共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）によりSMペプチド処理細胞の10段階z位置区
画的走査により、これらの沈着物が細胞内に存在することが確認された。ペプチ
ド−抗体複合体とインキュベートした細胞は細胞内ペプチドの証拠を示さないの
で、SMペプチドの免疫検出は特異的であった。同様に、SMペプチドに対して暴露
しなかった細胞またはSMペプチドに対して暴露し、次いで二次抗体単独に対して
実験した細胞は陰性であった。細胞をペプチド処理前にパラホルムアルデヒドで
固定した場合、SMペプチドの細胞移入は妨害された。
【００７３】 細胞膜を横切るSMペプチドの移入速度を測定するために、SMペプチド処理NIH3
T3細胞を使用して、反応速度論的実験を実施した。10％FBSを含有するDMEM中の1
0μg／mlのSMペプチドの0.5mlで、細胞を37℃において1、5、15、30、60および1
20分間処理した。前述したように間接的免疫蛍光アッセイにより、細胞内SMペプ
チドの沈着物を検出した。細胞内SMペプチドの細胞内染色が最初の5分の間隔の
間に観測され、約30分にプラトーとなり、細胞の中へのシグナル配列仲介ペプチ
ド移入は急速であることがを示された。したがって、検出可能な移入のための最
適ペプチド濃度を決定するために、30分の時点を選択した。
【００７４】 最適ペプチド濃度を決定するために、10％FBSを含有するDMEM中の下記濃度のS
Mペプチド溶液の0.5mlでNIH3T3細胞を37℃において30分間処理した：0、2、10、
50、100、および150μg／ml。前述したように、間接的免疫蛍光アッセイにより
、SMペプチドの細胞内局在化を検出した。間接的免疫蛍光アッセイにおいて、細
胞を2μg／ml（約800nM）のペプチドに対して暴露したとき、細胞内の点状沈着
物の形態の検出可能なペプチドが明らかにされた。細胞移入は濃度依存性であり
、50μg／ml〜100μg／mlのプラトーに到達した。
【００７５】 細胞膜を横切るSMペプチドの輸送は温度依存性であった。細胞を4℃において1
00μg／mlのペプチドで30分間処理したとき、免疫蛍光染色は観測されなかった
が、22℃または37℃において処理した細胞は多数の点状沈着物を示した。したが
って、インキュベーション温度が4℃から37℃にシフトしたとき、SMペプチドの
細胞移入は回復した。
【００７６】 その上、このシグナル配列仲介移入はNIH3T3細胞に限定されない。前述の間接
的免疫蛍光アッセイにより、ベイビーハムスター腎−21細胞、ヒト臍静脈内皮細
胞（HUVF−Cs）および齧歯類内皮細胞系統（LE−II）においてSMペプチドの細胞
内局在化を使用して、NIH3T3細胞を使用したときと同一の結果が得られた。膜透過性シグナルペプチド（SKPペプチド） また、ペプチド移入後にプロテアーゼで細胞を処理することによって、膜透過
性ペプチドの細胞内局在化は示された。この実験のために、SMペプチドと同一の
疎水性配列、次いでK−FGFの配列（129〜153）を含有する41残基のペプチド（SE
Pと呼ぶ、本明細書において配列番号6として記載する）を設計し、合成した。後
者は、膜透過性SKPペプチドに対する対照として使用した、疎水性配列を含有し
ないKPペプチドの中に存在した。両方のペプチダーゼはチロシン残基を有するの
で、それらを125Iで放射能標識化し、後述するように、完全なNIH3T3細胞の中に
転位する能力について検査した。実質的な放射能な125I−SKPペプチド処理細胞
において検出されたが、125I処理KPペプチド処理細胞において検出されず、細胞
の中へのSKPペプチドの移入は疎水性膜透過性配列の存在のために選択的に達成
されることが示された。細胞内125I−SKPペプチドはプロテアーゼ作用に対して
耐性であった。125I−SKPペプチドを含有する細胞をプロナーゼまたはトリプシ
ンで処理した後、細胞関連放射能の有意な低下は観測されず、125I−SKPペプチ
ドが細胞内区画内に位置することが示唆された（表1）。膜透過性ペプチドの移
入は高エネルギー源としてATPに依存しなかった。なぜなら、ATPの約95％を消耗
した細胞はATP陽性細胞に比較して同様な125I−SKPペプチド吸収を示したからで
ある（表1）。
【００７７】 SKPペプチドおよびKPペプチドの両方をイオドゲン（Iodogen）法（Pierce）に
より125Iで放射能標識化した。両方のペプチドの比活性は同様であった（2.5×1
04cpm／ng）であった。NIH3T3細胞を60mmの皿上で継代培養し、37℃において3日
間インキュベートした。次いで各皿上のコンフルエント単層（1.6×106細胞）を
PBSで2回洗浄し、15ngの125I−SKPペプチドまたは125I−KPペプチドで37℃にお
いて示した時間の間処理した。洗液の中に放射能が検出できなくなるまで、細胞
をPBSで8回洗浄し、2M NaCl緩衝液（pH7.5）で2回洗浄した。洗浄した細胞を溶
解緩衝液（10mMのTris−HCl、pH7.0、0.1mMのEDTA、1mMのフッ化フェニルメチル
スルホニル、1mMのジチオスレイトール、および1％のトリトンX−100）中で溶解
し、細胞ライゼイト中の放射能をパッカード自動ガンマカウンターで計数した。
いくつかの実験において、洗浄した細胞をDMEM中のプロナーゼ（1mg／ml）また
はトリプシン（0.05％）溶液で37℃において5分間さらに処理した。上清および
細胞を分離し、それらの放射能を別々に計数した。ATP消耗分析のために、細胞
をDMEM中の5μg／mlのアンチマイシン、6.5mMの2−デオキシグルコース、および
10mMのグルコノ−δ−ラクトンと37℃において2時間インキュベートした後、125 I−SKPペプチドを添加した。ATP消耗細胞および正常細胞におけるATPレベルをAT
P生物ルミネセンスアッセイキット（Sigma）により測定した。ATP消耗細胞にお
いて、測定可能なATPは観測されなかった。
【００７８】
【表１】
【００７９】 ATP消耗アッセイについて、各皿中のコンフルエントNIH3T3細胞（1.6×106細
胞）をATP消耗剤（アンチマイシン、2−デオキシグルコース、およびグルコノ−
δ−ラクトン）で37℃において2時間処理するか、あるいは処理しなかった。次
いで細胞を15ngの125I−SKPペプチドで37℃において処理した。細胞外125I−SKP
ペプチドを完全に除去した後、細胞ライゼイト中の放射能を計数した。プロテア
ーゼを使用するアッセイのために、前述したように、細胞を125I−SKPペプチド
で処理し、洗浄した。次いで125I−SKPペプチド関連細胞をプロナーゼ（1mg／ml
）、トリプシン（0.05％）、または希釈剤で37℃において5分間処理した。上清
および細胞中の放射能を別々に計数した。表1中のデータは、単一実験の三重反
復測定の平均±SEMを表す。実験を3回反復し、同様な結果が得られた。機能的ペプチドカーゴ（cargo）を有する膜透過性シグナルペプチド（SAペプチ
ド） シグナルペプチドを含有するペプチドの細胞移入の可能性が証明されたので、
細胞タンパク質の核局在化に関係する配列の形態の機能的カーゴをシグナルペプ
チドに連鎖した。酸性FGF（aFGF）の核局在化配列（NLS）は、以前にFGFマイト
ジェン活性において必須の役割を演ずることが報告されたので、利用した18。そ
のNLS領域Asn−Tyr−Lys−Lys−Pro−Lys−Leu（NYKKPKL）、本明細書において
配列番号2として記載する、に欠失を有する突然変異aFGFは、in vitroにおいて
DNA合成および細胞増殖を刺激することができなかったが、なおFGFに結合し、細
胞内レセプター仲介チロシンリン酸化およびc−fos発現を誘導することができる
ことが以前に示された18。さらに、aFGFの核輸送の最近の研究19は、核へのaFGF
の転位がin vitroにおけるaFGFによるDNA合成の刺激に必要であることを示唆し
た。
【００８０】 26残基のハイブリッドペプチド（SAと呼ぶ、本明細書において配列番号3とし
て記載する）を設計し、合成した。それはそのアミノ末端領域にK−FGF16，17の
シグナル配列（配列番号3の残基1〜6）およびそのカルボキシル末端にaFGF18の
核局在化配列（NLS）の形態の「機能的カーゴ」（配列番号3の残基20〜26）を含
有し、これらはAla−Ala−Ala（配列番号3の残基17〜19）のスペーサー領域によ
り分離されている。こうして、SAペプチドはその7残基のカルボキシル末端の「
カーゴ領域」においてSMペプチドと異なる。機能的アッセイを実行し、ここで同
一NLSを担持するaFGF18に類似する方法で、［3H］チミジン組込みにより測定し
て、SAペプチドはNIH3T3細胞のマイトジェン応答を誘導することができた。
【００８１】 この機能的アッセイにおいて、10％FBSを含有するDMEM中で最初に増殖したコ
ンフルエント3T3細胞を低血清培地（0.5％FBSを含有するDMEM）に2日間移した。
被験ペプチド、SAペプチド、SAαペプチド、ANLペプチド、またはSMペプチド、
またはaFGFを37℃において新鮮な低血清培地に示した濃度で添加した。16時間後
、［3H］チミジンを添加し、4時間後、細胞をPBSで洗浄し、トリクロロ酢酸で処
理し、0.15M NaOHで可溶化し、液体シンチレーションカウンターで放射能を測
定した。
【００８２】 第1a図に示すように、SAペプチドは［3H］チミジン組込みを6倍刺激したが、a
FGFは同一アッセイにおいてほぼ8倍の刺激を誘導した（第1b図）。バーは三重反
復試験において実施した少なくとも3回の独立の実験における平均±SEMを表し、
これらは対照試料を超えた試験した試料中の計数の多重度として計算した。使用
した濃度範囲（0〜46μM）内のSAペプチドは、フルオレセインジアセテート／臭
化エチジウムを使用する染色20により測定して細胞障害性ではなかった。SAペプチドのマイトジェン活性 SAペプチドのマイトジェン活性がその全長を必要とするかどうかを決定するた
めに、2つの対照ペプチドを同一アッセイにおいて検査した。SAペプチドは、本
明細書において配列番号1として記載するシグナルペプチドと、aFGFのNLSを表す
7残基のペプチド（ANLと呼ぶ、本明細書において配列番号2として記載する）と
を含有するSMペプチドである。いずれの対照ペプチドも、匹敵する濃度範囲内に
おいて試験したとき、有意なマイトジェン活性を示さなかった（第1a図）。これ
らの結果が示唆するように、シグナルペプチド単独（SMペプチド）および核局在
化配列単独（NLSペプチド）は有糸分裂誘発のための十分でなかった。したがっ
て、SAペプチドはK−FGFのシグナルペプチド配列（細胞の中への移入のための）
およびaFGFの核局在化配列（マイトジェン活性のための）の両方を含有したので
、有糸分裂誘発において有効であった。
【００８３】 さらにSAペプチドのマイトジェン活性を確認するために、DNA合成に対するそ
の作用を検査した。血清飢餓NIH3T3細胞をSAペプチドで処理し、固定し、DNA濃
度を標準的フローサイトメトリー分析により測定した。詳しくは、0.5％FBSを含
有するDMEM中でコンフルエントNIH3T3細胞（1.3×106細胞）を2日間血清飢餓さ
せた。細胞を処理しないか、あるいはSAペプチドまたはaFGFで20時間処理し、収
集し、遠心し、無血清PBSで3回洗浄した。細胞をメタノールで固定し、バンダー
ビルト大学（Vanderbilt University）のフローサイトメトリー研究サービスに
より実施されるDNA分析のために−20℃において前もってプールした。データは6
回の実験の平均±SEMであり、変動解析により統計的有意性について解析した。
【００８４】 表2に示すように、細胞をSAペプチドで100μg／mlにおいて処理したとき、細
胞周期のS期におけるDNA合成は有意に増加し、この濃度はチミジン組込みアッセ
イにおける活性濃度と一致した（第1a図）。この結果は有糸分裂誘発におけるaF
GFのNLS領域の役割18をさらに確証する。こうして、また、これらのデータはNLS
がそのマイトジェン活性を発揮することを神経鞘腫由来因子が必要とするという
遺伝学的アプローチを使用する、最近の証明21と一致する。
【００８５】
【表２】
【００８６】 しかしながら、aFGFと比較すると、SAペプチドはチミジン組込みアッセイおよ
びDNA分析アッセイ両方においてマイトジェン的に効力に劣る（第1図および表2
）。aFGFはNIH3T3細胞上のFGFレセプターに結合し、FGFレセプターのシグナリン
グ基質として示唆されてきてきた多数の細胞内タンパク質22，23のチロシンリン
酸化を誘導する。対照的に、SAペプチドは、DNA合成を誘導するために十分な濃
度においてさえ、同一細胞におけるこれらの細胞内タンパク質のチロシンリン酸
化を刺激しなかった。総合すると、これらの結果はSAペプチドのマイトジェン作
用がFGFレセプターにより仲介されないであろうこと示唆する。修飾されたSAペプチドについての免疫蛍光アッセイ 細胞内SAペプチドは、有効な抗SMペプチド抗体により認識されなかったので、
免疫蛍光アッセイにより追跡することができなかった。しかしながら、SAペプチ
ドのカルボキシル末端に2つの余分のアミノ酸残基（Met−Pro）を取付けると、
修飾されたSAペプチド（SAαと呼ぶ、本明細書において配列番号4として記載す
る）が産生され、これは抗SMペプチド抗体により認識される3アミノ酸エピトー
プタグ、Leu−Met−Proを含有した。したがって、抗SMペプチド抗体を使用する
間接的免疫蛍光アッセイにより、細胞内SAαペプチドはSAα処理NIH3T3細胞にお
いて点状染色パターンで観測された。SAペプチドと同様に、SAαペプチドはチミ
ジン組込みアッセイにおいてマイトジェン性であった。これらの結果は、細胞内
区画の中へのSAペプチドの移入とそれらのマイトジェン活性との間の関係と一致
する。機能的ペプチドカーゴを有する膜透過性シグナルペプチド（SN50） 膜透過性SMペプチドおよびSKPペプチドの細胞移入の可能性が証明されたので
、他の機能的カーゴをアミノ末端の疎水性配列に取付けて膜透過能力を与えた。
この目的のために、核局在化シグナルに関係する核因子κBの機能的ドメインを
表す配列（NF−κB）を選択した。このようなペプチドの細胞の中への移入は、
刺激された細胞におけるNF−κB複合体の核転位の阻害により測定されるであろ
う。NF−κBは多面作用性アクチベーター39,40であり、ヒト免疫不全ウイルス（
HIV）のエンハンサーを包含する、多数の細胞およびウイルス遺伝子の調節にお
いてきわめて重要な役割を演ずる。NF−κBの不活性細胞質ゾル形態はヘテロダ
イマーであり、p50、p65および阻害タンパク質IκBを包含する。細胞を刺激因子
、例えば、リポ多糖（LPS）またはサイトカインで活性化すると43，44，45、Iκ
Bは複合体から解離する。この解離は、核へのp50およびp65サブユニットの転位
を可能とする。両方のp50およびp65サブユニットはNLSを含有し、NLS配列はNF−
κBの核吸収のために重要であることがある示唆される。
【００８７】 p50およびp65サブユニットのNLS機能的意味を決定するために、配列モチーフ
を含有する2つのペプチドを設計し、合成した。第1ペプチド（SN50と呼ぶ、本明
細書において配列番号9として記載する）は、そのアミノ末端領域（残基1〜16）
にK−FGFのシグナル配列16，17およびそのカルボキシ末端領域（残基17〜26）に
NF−κB p50サブユニットのNLSの形態の「機能的カーゴ」を含有した。また、
第2ペプチドは26残基のペプチド（SN65と呼ぶ、本明細書において配列番号9とし
て記載する）であり、同一の疎水性配列およびpH6.5サブユニットのNLSを含有す
る。両方のペプチドを、LE−II細胞におけるNF−κB複合体の核転位に対する、
それらの能力について試験した。LPSで1時間処理した細胞からの核抽出物におけ
る電気泳動移動性シフトアッセイ43により、誘導可能なκB結合活性は検出可能
であった。しかしながら、核画分の中のこのLPS誘導κB結合活性は、SN50ペプチ
ド処理細胞において実質的に減少した。SN50ペプチドにより阻害は濃度依存性で
あり、50μg／mlにおいて88％の阻害であった。対照的に、SN65ペプチド処理LEI
I細胞において阻害は観測されなかった。NF−κB複合体へのオリゴヌクレオチド
プローブの結合におけるSN50ペプチドの妨害により阻害が引き起こされる可能性
を排除するために、SN50ペプチドをin vitroにおいて核抽出物およびオリゴヌ
クレオチドプローブとインキュベートした。この操作はLPS誘導κB結合活性に対
して測定可能な作用を与えず、SN50ペプチドにより阻害は、活性NF−κB複合体
が細胞質ゾルから核に動く段階における、その活性から生ずることが示唆された
。SN50ペプチドによる阻害が疎水性膜透過性配列を必要としたかを決定するため
に、2つの対照ペプチド（SMペプチドおよびN50ペプチド、それぞれ、本明細書に
おいて配列番号1および10として記載する）をまた同一移動性シフトアッセイに
おいて試験した。N50ペプチドは疎水性配列を含まないNLSを含有しが、SMペプチ
ドはNLSを含まない疎水性配列を含有した。これらの2つのペプチドのいずれも、
細胞質ゾルから核へのNF−κB複合体のLPS誘導細胞内転位に対して有意な作用を
示さなかった。これらの結果が示唆するように、疎水性配列単独（SMペプチド）
および核局在化配列単独（N50ペプチド）のいずれもNF−κBの機能阻害を引き起
こすために十分でなかった。したがって、SN50ペプチドの観測された阻害作用は
、その固有のNLSと核膜との相互作用を可能とする、その細胞内移入に起因する
に違いない。 SN50ペプチドはSMペプチドと同一のエピトープを含有し、こうし
てELISAにおいて抗SMペプチド抗体により認識されることができる。これは間接
的免疫蛍光アッセイにより、SN50ペプチドがLE−II細胞の中に移入されて、その
機能的役割を発揮するという、直接的確認を可能とする。結果により、細胞内SN
50ペプチドは細胞内SMペプチドに比較してより多い核染色パターンで分布されて
いることが示された。
【００８８】 実施例II 致死的敗血症性ショックを生ずるin vivo変化を阻害するNF−κBおよび他の
ストレス応答トランスアクチベーターの核移入の細胞内阻害の効能は、細胞膜転
位配列およびNLSドメインを含有するSN50ペプチドの非侵入性細胞内デリバリー
の使用に基づく50~52。2つの細胞透過性ペプチド、SMペプチドおよびSN50ペプチ
ドを前述したように合成し、精製し51，52、最初にin vitroにおいてLPSに対す
るターゲットであることが知られている2つの型の細胞において試験した：ネズ
ミマクロファージJ774および内皮LEII細胞系統（SMペプチドおよびSN50ペプチド
、本明細書において配列番号1および9として記載する）。ネズミJ774マクロファ
ージにおける敗血症性ショックインデューサー、LPS（10ng／ml）により誘導さ
れる転写因子NF−κBの核移入はSN50ペプチドによりブロックされたが、SMペプ
チドによりブロックされなかった（両方共、31μMにおいて）。両方のペプチド
は細胞透過性であるが、SMペプチドの機能的ドメインは「機能喪失」突然変異し
たNLS配列を含有する51，52。J774細胞を敗血症性ショックの前炎症性メディエ
イター、TNFα（20U／ml）で刺激したとき、結果の同様なパターンが得られた。
また、SN50ペプチドは、LPS（10ng／ml）およびTNFα（100U／ml）で刺激したネ
ズミ内皮細胞LEIIにおいて、NF−κBの誘導可能核移入を阻害した。こうして、L
PSおよびTNFαにより刺激されたネズミマクロファージおよび内皮細胞において
、SN50ペプチドはNF−κBの誘導可能核移入の細胞内阻害を引き起こしたが、SM
ペプチドは引き起こさなかった。
【００８９】 C57BL/6マウスにD−ガラクトサミン（20mg）および引き続いて大腸菌（E. co
li）血清型0127：E8（1μg）を腹腔内注射することによって、in vivo敗血症性
ショックの減衰または防止におけるNF−κBおよび他のストレス応答トランスア
クチベーターの核移入のSN50ペプチド特異的阻害の効能は証明された。D−ガラ
クトサミンで処置したマウスは低い投与量のLPSに対して感受性であった60。第2
A図に示すように、1匹のマウスを除外してすべては、LPS注射後4時間以内に急性
の病気の症候を示し、6時間以内に死亡した。対照的に、第2C図に示すように、S
N50ペプチド（LPS後3.5時間まで5回の注射）で処置したマウスはショックの症候
を示さず、最初の24時間生き残った。48時間までに、50％のマウスが生存し、72
時間までに、20％生存率が観測された。保護的in vivo作用はSN50ペプチドの機
能的NLSドメインに依存する。なぜなら、突然変異したNLSドメインを有するSMペ
プチドを使用したとき、それは阻害されたからである。すべてのSMペプチド処置
マウス（LPS後3.5時間まで5回の注射）は急性の病気の症候を示し、5時間以内に
死亡した（第2B図）。SN50ペプチドのin vivo保護作用は時間および濃度依存性
であった。SN50ペプチドの投与はLPS（7回の腹腔内注射）後6および12時間に延
長し、72時間において64％の生存率を生じた（第2D図）。生存率の差は、対数等
級づけ試験に基づいてP＜0.001で統計的に有意である。
【００９０】 この敗血症性ショックのモデルは、激症肝臓損傷、肝臓に集中した組織病理学
的分析により特徴づけられる。D−ガラクトサミンおよびLPSの致死的組合わせを
与えたマウスから得られた切片は、アポトーシスの特徴を有する拡散した肝細胞
損傷（断片化した核）、血小板血栓で充填された血管の充血、および赤血球の管
外遊出を明らかにした。出血性肝臓壊死を伴う肝細胞の大量のアポトーシスの同
一パターンが、SMペプチド処置マウスにおいて観測された。対照的に、敗血症性
ショックに対して72時間生存したSN50ペプチド処置なくてはならないの肝臓から
の組織切片はほとんど正常の肝臓構築を示し、肝細胞のアポトーシスの明白な徴
候および出血性壊死が存在しなかった。これらの結果の最も簡単な意味は、SN50
ペプチドの腹腔内投与が、D−ガラクトサミン／LPS誘導敗血症性ショックのネズ
ミモデルにおける主要なターゲット器官である肝臓の有意な細胞保護を提供する
ことである57，60。
【００９１】 これらにより、in vivo投与されたSN50ペプチドはLPSにより誘導される致死
的敗血症性ショックを減衰および／または防止することが明らかである。敗血症
性ショックの微生物インデューサー、LPSは、前炎症サイトカイン（TNFα、IL−
1、6、8、および12）、シグナルトランスデューサー（iNOSおよびCOX2）、細胞
接着分子（E−セレクチン、VCAM、ICAM）および前凝固分子（組織因子、プラス
ミノゲンアクチベーターインヒビター）をコードする同義遺伝子を発現する、単
球、マクロファージ、顆粒球、および内皮細胞に作用する48，49，67，68。スト
レス応答性遺伝子産物の持続的発現は、血球および血管内皮の無活動表現型を「
活性化された」表現型に変化させ、不可逆的血管機能障害に寄与し、究極的に致
死的結果に導く47，49。NF−κBはヒトおよびマウスにおけるLPSにより誘導され
る核に対するシグナリングの主要な細胞内メディエイターであり、ここでNF−κ
Bの持続的核転位は致死的結果に関係付けられる49。細胞外LPSインヒビターまた
はサイトカインリポーターアンタゴニストと異なり、SN50ペプチドは、開始刺激
に無関係に、NF−κBおよび他のストレス応答性トランスアクチベーターによる
核に対する細胞内シグナリングにおける最終前の必須工程をブロックする50，52 。
【００９２】 SN50ペプチドの保護作用のin vivoメカニズムをこれらの研究から推定するこ
とができる。第1に、SN50ペプチドは、敗血症性ショックの細胞および分子の病
原性に寄与するサイトカインおよび他のストレス応答性遺伝子産物のNF−κB依
存的発現を減衰するようである。NF−κBおよび他のトランスアクチベーターに
より調節される遺伝子発現に対するSN50ペプチドの阻害作用が証明された52。第
2に、SN50ペプチドが作用する主要な細胞部位はLPS刺激腹膜マクロファージでな
いようである。なぜなら、これらのマクロファージはエンドトキシンショック間
の全体の疎水性配列応答に関係する主要な細胞であると思われないからである69 。むしろ、SN50ペプチドはその保護作用を発揮し、この作用は腹腔から系統的に
吸収され、血管内皮細胞ならびに血液単球および組織マクロファージの形質膜を
横切ることを我々は証明した。その中において、それは細胞内ターゲット、イン
ポーチン−αおよび−βヘテロダイマー（また、カリオヘリン−αおよび−βと
呼ばれる）に到達し、NF−κB、AP−1、NFAT、またはSTAT−1を核に輸送する52
。SN50ペプチドの反復腹腔内投与後における肝臓の有意な細胞保護作用および全
体的生存率増加は、その系統的in vivo作用を示す。第3に、肝臓におけるSN50
ペプチドの観測されたin vivo細胞保護作用は、アポトーシスの防止および誘導
におけるNF−κBの報告されたジャヌス（Janus）様役割の関係において顕著であ
る63。肝臓におけるSN50ペプチドの時間依存的抗アポトーシス作用は、以前に証
明されたように52、NF−κB、AP−1、NFAT、またはSTAT−1の核移入がSN50ペプ
チドによりブロックされるとき、LPSおよび前炎症サイトカイン、例えば、TNFα
およびインターフェロンγがアポトーシスを誘導できないことを示す。遺伝子操
作されたマウスの他の研究により、敗血症性ショックの必須分子メディエイター
としてLPSレセプター、サイトカインレセプター、および細胞内カスパス（caspa
ses）を正確に定めることによって、LPS誘導敗血症性ショックの分子メカニズム
がかなり明らかにされた54，59，70~73。方法 動物および処置 C57BL/6マウスをジャクソン・ラボラトリー（Jackson Laboratory）から入手
した。10〜12週齢の雌マウスに、大腸菌（E. coli）0127：B8からのLPSの0.2ml
の懸濁液（フェノール抽出およびゲル濾過により調製した、Sigma Chemical C
o.）を腹腔内注射した。LPS30分前に、D−ガラクトサミン（0.2ml中の20mg；Sig
ma Chemical Co.）を腹腔内注射した。細胞透過性SN50ペプチドおよびSMペプ
チド（0.2mlの中の各々2mg）または0.9％生理食塩水（希釈剤）をLPSの30分前お
よび30、90、150、210分後に注射した。LPSの6および12時間後に、生存動物にSN
50ペプチドをさらに腹腔内注射した。すべての注射剤は無菌であり、注射用の発
熱因子を含まない生理食塩水中で調製した。最初の12時間の間、2時間の間隔で
、引き続く12時間の間、4時間の間隔で、その後毎日2回、動物を観測した。肝臓
、脾臓、肺、および腎臓からの組織切片を検査した。D−ガラクトサミン（20mg
）単独（n＝5）またはLPS（1μg）単独（n＝5）を与えたマウスは生存し、主要
な器官からの組織切片に基づいて影響を受けなかった。アメリカン・アソシエー
ション・オブ・アクレディテイション・オブ・ラボラトリー・アニマル・ケアー
（American Association of Accreditation of Laboratory Animal Care
）カイドラインに従い、動物を取り扱い、実験手順はそれに従い、インスチチュ
ーショナル・アニマル・ケアー・コミッティー（Institutional Animal Care
Committee）に承認された。細胞透過性ペプチド 記載されているように51，52、SN50ペプチドおよびSMペプチドを合成し、濾過
滅菌し、分析した。細胞培養物 検出可能なLPSを含有しない（＜0.006ng／ml、製造会社により測定、Atlanta
Biological、ジョージア州ノークロス）10％熱不活性化胎仔ウシ血清、2mMのL
−グルタミンおよびATCCにより推奨される抗体を補充したダルベッコ最小必須培
地中で、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Cu
lture Collection）（マリイランド州ロックビレ）から入手したネズミマクロ
ファージRAW 264.7細胞系統およびT. Maciag博士（Maine Medical Center、
メイン州ポートランド）から入手したネズミ内皮（LEII）細胞を培養した。示す
場合、大腸菌（E. coli）0127：B8からのLPS（Difco）または32,000U／μgの効
力を有するTNFα（Mallinckrodt）でテキストの中に示されている濃度および組
織で、5mlのRAW 264.7またはLEII細胞（106／ml）を刺激した。電気泳動移動性ゲルシフトアッセイ（EMSA） RAW 264.7またはLEII細胞におけるNF−κBの核移入を測定するために、記載
するように放射線標識化κBプローブを使用してEMSAを実行した。統計的解析 対数等級づけ試験を使用して、マウス生存率データのP値を決定した61。
【００９３】 実施例III この実験において、NF−κB（p50）に由来する核局在化配列（NLS）を有するS
N50を使用して、ネズミマクロファージおよび内皮細胞におけるこのクラスの細
胞透過性ペプチドの有効性をin vitroにおいて測定し、前述したようにSMを合
成し、精製し、そして2つのシステインフランキングNLSモチーフを挿入して鎖内
ジサルファイド結合を形成することによって、第3環状ペプチド（cSN50）を設計
した（cSN50ペプチド、本明細書において配列番号12として記載する）。すべて
の3つのペプチドは細胞透過性であるが、SMペプチドの機能的ドメインはインポ
ーチンα（また、カリオフェリンαまたはRch 1と呼ぶ）により認識されない突
然変異したNLSを含有する52。ネズミJ774マクロファージにおいて、LPS（10ng／
ml）に応答するNF−κBの核移入はSN50によりブロックされたが、SMによりブロ
ックされなかった（両方共100μMにおいて）。TNFα（20U／ml）、すなわち、敗
血症性ショックの前炎症性メディエイターでJ774細胞を刺激したとき、同様な結
果が得られた。また、LPS（10ng／ml）およびTNFα（20U／ml）で刺激したネズ
ミ内皮LEII細胞において、SN50ペプチドはNF−κBの誘導可能な核移入を制限し
た。第3ペプチド、すなわち、環化NLSドメインを含有するcSN50は10〜30μMの濃
度において阻害性であった。これらの結果の定量的ホスホイメイジャー（phosph
oimager）分析に基づいて、cSN50の効力はプロトタイプのSN50ペプチドよりも3
〜10倍大きい。こうして、細胞透過性ペプチドはin vitroでエンドトキシン応
答性細胞におけるSRTFの核移入を阻害した。
【００９４】 致死的エンドトキシンショックのネズミモデルを使用して、cSN50をin vivo
で試験した60。このモデルにおいて、大腸菌（E. coli）血清型0127：B8（LD10 0 ＝800μg）からのLPSをC57BL/6マウスに腹腔内注射した。第3A図に示すように
、LPS注射後72時間に、すべての動物は死亡した。対照的に、cSN50で処置したマ
ウス（LPSチャレンジの30前〜12時間後7回の0.7mgの注射）は、その典型的な徴
候（立毛、傾眠、下痢、出血性結膜炎、出血性皮膚壊死、および麻痺）の欠如に
より証明されるように、敗血症性ショックから保護された。引き続く24時間の間
に1匹の動物が死亡し、48時間後、4匹が死亡し、50％の生存率が生じた（第3B図
）。投与量を1.5mg／注射に増加したとき、cSN50の保護作用は改善された（第3C
図）。1匹を除くすべての動物は72時間生存した（90％の生存率）。引き続いて1
0日間観測した生存動物は疾患の明らか徴候を示さなかった。機能的NLSモチーフ
がSMペプチドにおけるように突然変異された場合、このin vivo保護作用は喪失
した。すべてのSMペプチド処置マウスは72時間以内に死亡した（第3D図）。対数
等級づけ試験に基づいて、cSN50ペプチド処置グループと対照との間の生存率の
差は統計的に有意であった（p＜0.001）。切除した器官（肺、肝臓、脾臓、およ
び腎臓）の組織学的検査はcSN50ペプチド処置生存動物の最小変化を示したが、
エンドトキシンから死亡する未処置マウスは肺血管の特に際立った拡張および充
血を示した。
【００９５】 前の研究において、ヒトおよび動物の中へのLPS注射後、敗血症性ショックの
前炎症サイトカインメディエイター、TNFα、IL−1、およびTNF−γ（75）の初
期バーストが存在することが示された。エンドトキシン暴露後に投与したとき、
cSN50ペプチドが致死率を減少するかどうかを決定するために、最初のペプチド
投与量をエンドトキシン後30分に与えた。生存率は60％であり、cSN50は、エン
ドトキシンへの暴露後短時間に与えた場合、その保護作用を発揮できることを示
す。総合すると、cSN50ペプチドは時間および濃度依存的方法でマウスをエンド
トキシン誘導致死的ショックから保護した。注射するペプチドの投与量および／
または注射回数の増加は生存率を改善した。細胞透過性ペプチドの反復投与につ
いての要件は、その保護作用が一時的であることを示し；注射回数の減少は生存
率を低下し、SN50の比較的短い細胞内半減期（抗体45分）50と一致する。こうし
て、こうして、細胞透過性ペプチドの急速に可逆的な作用はその短時間の有効性
および安全性を説明する。ペプチド単独を与えられた動物において、致死性また
は組織損傷は観測されなかった。
【００９６】 この研究に記載する細胞透過性ペプチドの効能は、SRTFにより仲介される核へ
のシグナリングのin vivo阻害を反映するようである51，52。核移入インヒビタ
ーの非存在下に、SRTFは致死的ショックの前炎症性メディエイターをコードする
遺伝子の転写を有効に刺激する48，68，77。引き続いて、単球、マクロファージ
、顆粒球、および内皮細胞におけるこれらの遺伝子の持続的発現は深遠な血管機
能障害および死亡に関連する48，49，57，68，77。NF−κBおよび他のSRTFによ
り調節される遺伝子発現に対するSN50ペプチドの阻害作用は証明された52。NLS
を担持する細胞透過性ペプチドがin vitro核移入を阻害するという発見は、細
胞透過性ペプチドがこれらの情報ストレス応答性遺伝子のLPS誘導活性化をin v
ivoにおいて妨害することができることを示す。これと一致して、NLS機能を不活
性化する突然変異はエンドトキシンに対する急性全身的炎症反応に影響を与える
ことができない細胞透過性ペプチド（SM）を生ずる。
【００９７】 これらの実験は、エンドトキシンショックの治療に対する概念的に新規なアプ
ローチを提供する。LPSまたはサイトカインレセプターのアンタゴニストの細胞
外インヒビターと対照的に、SRTFの核移入インヒビターは細胞内的にターゲット
される50。複数の前炎症性アゴニスト、例えば、LPSおよびサイトカインは、そ
れらの同族レセプターに導かれると、SRTFの核移入の共通段階において収れんす
るシグナリング段階のカスケードを開始する48，54~58，68，77。cSN50により例
示される核移入の可逆的インヒビターは、全身的炎症反応を抑制することができ
る抗炎症剤の新しいクラスを構成する。このアプローチと一致して、SN50ペプチ
ドは、ネズミTリンパ球と相互作用する、超抗原、スタヒロコッカル・エンテロ
トキシンBにより誘導される致死的ショックのブロッキングにおいて有効であっ
た76。結論すると、核移入インヒビターとして機能するNLSペプチドを使用する
我々の結果は、エンドトキシンショックにより例示される全身的炎症反応症候群
における罹患率および死亡率を減少する新しい、有効な、好都合なin vivoター
ゲッティング戦略を提供する。方法 動物および処置 C57BL/6マウスをジャクソン・ラボラトリー（Jackson Laboratory）から入手
した。10〜12週齢の雌マウス（20gの体重）に、大腸菌（E. coli）0127：B8（D
ifco、ミシガン州デトロイト）からのLPSの0.2mlの懸濁液（800μg）を腹腔内注
射した。細胞透過性cSN50ペプチドおよびSMペプチド（0.2mlの中の各々2mg）ま
たは0.8％生理食塩水（希釈剤）をLPSの30分前および30、90、150、210分、6時
間および12時間後に注射した。いくつかの実験において、LPS前にcSN50ペプチド
を注射しなかった。すべての注射剤は無菌であり、注射用の発熱因子を含まない
生理食塩水中で調製した。最初の8時間の間、2時間の間隔で、引き続く16時間の
間、4時間の間隔で、その後毎日2回、動物を観測した。死亡後または72時間に殺
した後短時間に剖検を実行した。生存する動物を10日間観測した。アメリカン・
アソシエーション・オブ・アクレディテイション・オブ・ラボラトリー・アニマ
ル・ケアー（American Association of Accreditation of Laboratory An
imal Care）カイドラインに従い、動物を取り扱い、実験手順はそれに従い、イ
ンスチチューショナル・アニマル・ケアー・コミッティー（Institutional Ani
mal Care Committee）に承認された。細胞透過性ペプチド 記載されているように11，12，51，52、SN50ペプチドおよびSMペプチドを合成
し、濾過滅菌し、分析した。同様な方法において、cSN50ペプチドを合成し、分
析した。細胞培養物 ネズミマクロファージJ774細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（American Type Culture Collection）（マリイランド州ロックビレ）
から入手し、そしてネズミ内皮（LEII）細胞をT. Maciag博士（Maine Medical
Center、メイン州ポートランド）から入手した。
【００９８】 検出可能なLPSを含有しない（＜0.006ng／ml、製造会社により測定、Atlanta
Biological、ジョージア州ノークロス）10％熱不活性化胎仔ウシ血清、2mMのL
−グルタミンおよび抗体を補充したダルベッコ最小必須培地中で、両方の細胞系
統を培養した。示す場合、大腸菌（E. coli）0127：B8からのLPS（Difco）また
はTNFα（32,000U／μg；Mallinckrodt）でテキストの中に示されている濃度お
よび時間で、80％のJ774のコンフルエント単層または100％のコンフルエントLEI
I細胞（10mlの新鮮な培地を有する100mmのプレート）を刺激した。放射線標識化
κBプローブを使用する電気泳動移動性ゲルシフトアッセイにより、J774およびL
EII細胞におけるNF−κBの核移入を測定した。電気泳動移動性ゲルシフトアッセイ（EMSA） 記載するように放射線標識化κBプローブを使用して、NF−κBの核移入を測定
した。組織学的分析 肝臓、スパン、肺、および腎臓のホルマリン固定し、パラフィンで埋め込んだ
切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色して全体の組織を評価した。統計的解析 対数等級づけ試験を使用して、マウス生存率データのP値を決定した61。
【００９９】 分子レベルにおいて、敗血症性ショックメディエイターの発現を調節する、NF
−κBおよび他のストレス反応性転写因子（SRTF）の核シグナリングを介して、
全身的炎症反応症候群、例えば、エンドトキシンショックは仲介される48，49。
これらの発見は、核シグナリングのレベルにおいて急性全身的炎症反応の治療的
コントロールにおけるNF−κBの細胞透過性ペプチドインヒビターのin vivo実
用性を証明する。細胞透過性環状ペプチドによるSRTFの核移入阻害は、全身的炎
症反応症候群、例えば、エンドトキシンショックのコントロールに対する新しい
アプローチを証明する。
【０１００】 エンドトキシンリポ多糖（LPS）により誘発される敗血症性ショックは、高い
罹患率および死亡率を生ずる循環系の崩壊、散在性嚢内凝固、および多発性器官
破損により特徴づけられる、全身的炎症反応症候群の極端な形態である46，47。
多様なメディエイターが致死的結果に導くので、敗血症性ショックの治療はしば
しば無効である53，66。SRTFはエンドトキシン応答性細胞（単球、マクロファー
ジ、内皮細胞）における核へシグナルを送るので、これらのメディエイターは発
現される48，68，77。
【０１０１】 SRTFは、細胞質から核に到達し、前炎症サイトカイン、例えば、腫瘍壊死因子
α（TNFα）、インターロイキン1、6、8、12、18、細胞接着分子、ICAM−1、Eセ
レクチンおよびVCAM、ならびに前凝固分子、組織因子およびプラスミノゲンアク
チベーターインヒビターをコードする遺伝子を活性化するという、証拠が豊富に
存在する48，68，77。SRTFは、炎症性および免疫ストレスに対する応答を仲介し
、NF−κB、AP−1、NFAT、またはSTAT−1である48，49，57，67，68，77。例え
ば、NF−κBおよびNFATは、敗血症性ショックの主要なサイトカインメディエイ
ター、TNFαおよびインターフェロンγ（INF−γ）をコードする遺伝子を調節す
る74。組織因子、汎発性血管内凝固をコードする遺伝子はNF−κBおよびAP1によ
り調節される68。
【０１０２】 ヒトおよびマウスにおいて、単核食作用細胞におけるNF−κBの持続的核転位
は敗血症性ショックと相関された49。これらのトランスアクチベーターの核移入
は、SN50ペプチドの非侵入性細胞内デリバリーによりブロックすることができる
。SN50ペプチドは、膜転位モチーフと、NF−κBに由来しかつインポーチンαお
よびインポーチンβ（また、カリオフェリン−αおよび−β）により認識される
核局在化配列（NLS）から構成された機能的ドメインとを有する。これらのin v
ivo発見は、NF−κBおよび他のストレス応答性トランスアクチベーターの核ター
ゲッティングに影響を与える細胞透過性ペプチドのデリバリーを含む致死的敗血
症性ショックを治療的にコントロールする新規なアプローチを提供する。実施例IV：超抗原誘導毒性ショックおよび急性肝臓損傷のcSN50ペプチドにより
阻害 細菌超抗原（SAg）は、グラム陽性細菌、例えば、スタフィロコッキおよびβ
−溶血性ストレプトコッキにより産生されるトキシンである。これらのトキシン
は、スタヒロコッカル・エンテロトキシン、毒性ショック症候群トキシン−1、
およびスタヒロコッカル発熱性エキソトキシンを包含し、ヒトおよび動物におい
て毒性ショック症候群を誘導する。ゲル透過クロマトグラフィーによる感染の結
果として放出されるSAgは感染した個体の体におけるすべてのT細胞の比較的大き
い百分率（約10〜50％）を刺激することができ、そしてこれらのT細胞の活性化
は全身的サイトカイン（TNF−α、IL−2、IFN−γ）産生に導く。このようなT細
胞SAg誘導活性化は、クラスIIのMHC分子を発現する抗原提示細胞（APC）の存在
を必要とする。生ずる全身的炎症反応は、剥離、血管損傷、低血圧、および汎発
性血管内凝固（DIC）により特徴づけられる。総合すると、これらの作用は致死
的毒性ショックを産生する；スタフィロコッカル誘導毒性ショック症候群のため
の死亡率は約5％であり、そしてストレプトコッカル誘導毒性ショック症候群の
ための死亡率は約30〜80％である。
【０１０３】 分子レベルにおいて、T細胞レセプター／CD3複合体を介する核へのT細胞シグ
ナリングは前炎症サイトカインの発現を誘導する。このシグナリングは、AP1お
よびNF−ATを包含する、NF−κBおよび他のストレス反応性転写因子（SRTF）に
より仲介される。NF−κB p50／p65ヘテロダイマーを阻害性タンパク質IκBと
複合化させる。細胞活性化はリン酸化を生じ、次いでIκBを分解させ、これによ
り核移入のためのNF−κB p50／p65ヘテロダイマーを放出する。AP−1タンパク
質、c−Fosおよびc−Junは休止T細胞の中に低レベルで存在する。新たなタンパ
ク質合成に引き続いて、c−Fosおよびc−Junの核移入が起こる。NF−ATは休止T
細胞の細胞質中のリンタンパク質である。T細胞の活性化はそのリン酸化および
核移入を誘導する。NFATは単独でまたはc−Fosおよびc−Junと複合化してDNAに
結合する。転写因子は核の中に入り、前炎症遺伝子のプロモーターに結合し、サ
イトカイン、例えば、TFN−α、IL−2、およびINF−γの発現を誘導する。新し
く発現されたTNF−αはそのレセプターに結合し、他の活性化サイクルを誘導す
る。こうして、NF−κB核局在化配列（NLS）の細胞透過性ペプチドアナローグに
よるNF−κBおよび他のストレス反応性転写因子の核移入の阻害は、毒性ショッ
クのメディエイターをコードする遺伝子の発現を抑制することができる。
【０１０４】 ナチュラルキラーT（NK−T）細胞におけるNF−κB核移入に対するcSN50ペプチ
ドの作用を研究するために、樹枝細胞（DC）をスタヒロコッカル・エンテロトキ
シンB（SEB）と37℃において60インキュベートし、別々にNK−TをcSN50ペプチド
と37℃において30分間インキュベートし、次いで95％のNK−T細胞を5％のDCと混
合し、この混合物を37℃において2時間インキュベートした。インキュベーショ
ン後、核抽出物を調製し、NF−κBの結合部位を含有するプローブを使用する電
気泳動移動性シフトアッセイ（EMSA）により分析した。プローブに結合するNF−
κBの非常に低いレベルにより証明される非刺激細胞に比較して、強いEMSAシグ
ナルにより証明されるように、SEB刺激NK−T細胞は高いレベルの核へのNF−κB
転位を表した（第4図；第1レーンと第2レーンとの比較）。対照として、すべて
のEMSA反応のために、NF−Y、すなわち、構成的に発現される核タンパク質の結
合部位を含有するプローブを含めた。この対照は第4図に示すレーンの等しい負
荷を示す。これらの結果が示すように、cSN50ペプチドはNK−T細胞においてNF−
κB核移入を阻害した。
【０１０５】 次に、C57Bl/6マウス（野生型）に対するスタヒロコッカルエンテロトキシンB
（SEB）、ならびに感作剤としてD−ガラクトサミン（20mg）の投与を含む、SAg
誘導毒性ショックのネズミモデルを確立した。毒性ショックの発生を研究するた
めに、前炎症サイトカインTNF−αおよびTFNγの発現、マウス生存率、および組
織学をモニターした。毒性ショックの発生に対するcSN50ペプチドのin vivo作
用を研究するために、野生型マウスを使用し、これらに0.7mgのcSN50ペプチドを
7回腹腔内注射した。cSN50ペプチド処置のスケジュールはSEB前30分およびSEB後
30、90、150、210分、6時間、および12時間であった（第5図）。陰性対照として
、突然変異したNLS配列を有する、不活性細胞透過性ペプチドSM（前述）を追加
のマウスに注射した。ペプチドを注射したマウスを病気の徴候および／または生
存について72時間観測した。
【０１０６】 SEBチャレンジし、cSN50ペプチド処置したマウスは80％の生存率を表した（第
5図）。対照的に、SEBチャレンジし、SMペプチド処置したマウスは、ペプチドで
処置しないSEBチャレンジしたマウスのそれに類似する、わずかに10％の生存率
を表した。これらの結果が示すように、cSN50ペプチドはSEB誘導毒性ショックか
らマウスを保護する。
【０１０７】 この毒性ショックのモデルの最も顕著な特徴は、アポトーシスおよび出血性壊
死を伴う急性肝臓損傷である（第6A図〜第6D図）。左のパネル（第6A図および第
6D図）は、それぞれ、広範な出血性壊死およびアポトーシスを明らかにする、SE
Bでチャレンジし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した未処置対照マウス
およびApop Tag（Intergen、ニューヨーク州パーチェイス）からの肝臓切片を
示す。対照的に、右に示す（第6B図および第6C図）上に示す、cSN50ペプチド処
置し、SEBでチャレンジしたマウスからの肝臓切片は、肝臓損傷またはアポトー
シスの検出可能な徴候を表さず、cSN50ペプチドがグラム陽性細菌からのSAgによ
り誘導される炎症作用からの有効な保護を提供したことを示す。実施例V：環化ペプチドを製造する方法 型X1−X2の選択したペプチド配列（ここでX1は膜透過性モチーフを含有し、そ
してX2は核局在化配列（NLS）を含有する）は、次のようにし2つのシステイン残
基でフランクすることができる：X1−CysX2CysまたはCysX1−X2Cys。システイン
残基のこのような位置決定は、効率よいジサルファイド結合の形成および機能的
セグメント（X2）または全二連ペプチド（X1−X2）の環化を可能とする。選択的
に、ラクタムまたはラクトンの環化は、X2のN末端におけるシステインをセリン
（ラクトン）またはジアミノプロピオルペプチド（ラクタン）で置換することに
よって実行することができる。上記実施例IIIに示すように、生物学的に活性な
セグメント（例えば、核局在化配列を含有する）の拘束はペプチドの活性を増強
する。その上、環状ペプチドの分解速度は線形ペプチドよりも明確により遅くな
る。なぜなら、ペプチド鎖の破壊はアミノ末端またはカルボキシ末端から最も容
易に起こるからである。
【０１０８】 NLSを含有するペプチドを環化する他のアプローチは、チオラクトン環形成を
介して環状チオエステルペプチドを合成する、固相分子内化学的結合戦略に基づ
く。完全に非保護のペプチドを反応性チオールエステル結合を通して固体支持体
上に固定化する。前もって負荷したt−ブトキシカルボニル−アミノアシル−3−
メルカプト−プロピオンアミド−ポリエチレングリコール−ポリ−（N,N−ジメ
チルアクリルアミド）（Boc−AA−［COS］−PEGA）樹脂を合成に使用する（Cama
reo、J.A.他、J. Pept. Res. 51：303−316、1998およびSchno lzer、M.他、
Int. J. Pept. Protein Res. 40：180−193、1997）。ペプチド−［COS］
−PEGA樹脂をHFで4℃において1時間処理して、完全に非保護のペプチドを得る。
このような非保護ペプチド−［COS］−PEGA樹脂は、ペプチドを樹脂に定着させ
るエステル結合を含有し、無水HF中で安定であり、次いで選択的に環化すると同
時にその膨潤性水性緩衝液（80：20比の0.1Mのリン酸ナトリウム、pH7.0および
アセトニトリル）により樹脂から清浄することができる。樹脂を水中の0.1％TFA
で洗浄した後、環化ペプチドを逆相HPLCにより精製する。
【０１０９】 ペプチドを環化するなお他の方法は「主鎖環化」（Gilon、C.他、Biopolymers
31：745−750、1991）であり、ここでペプチド主鎖中のNαまたはCα原子の互
いにまたはカルボキシルおよびアミノ末端に対する接続は生物学的に活性なペプ
チドのセグメントの拘束されたコンフォメーションを提供する。
【０１１０】 一般に、N−t−ブトキシカルボニル（t−Boc）またはN−9フルオレニルメトキ
シカルボニル（Fmoc）戦略を使用して、ペプチドを合成する。システイン残基を
アセトアミドメチル（Acm）で保護することができる。ジクロロメタン（DCM）中
の50％トリフルオロ酢酸（TFA）を使用して、Boc脱保護を実行する。DMF中の20
％ピペリジンで30分間Fmoc脱保護を実行し、各回2回反復する。TFA／チオアニソ
ール／トリイソプロピルシラン／メタノール（90：5：2.5：2.5；vol／vol／vol
／vol）により20℃において4時間、Fmoc合成からのペプチドを樹脂から切断する
。無水フッ化水素酸（HF）／アニソール（9:1 vol／vol）により4℃において1
〜2時間、Boc合成からのペプチドを樹脂から切断し、粗製ペプチドを冷エチルエ
ーテルで沈殿させ、H2O中の6％アセトニトリル中に溶解し、凍結乾燥する。Spec
tra／Por CE透析膜（分子量カットオフ：500）を使用して水に対してペプチド
を透析し、高圧液体クロマトグラフィー、逆相（HPLC）カラム（Vydac C−18；
水／アセトニトリル勾配中の0.045％TFA）上のクロマトグラフィーにかける。ビ
ス（Acm）−Cys保護ペプチドを、例えば、記載されているように（Kamber、B.他
、Helv. Chim. Acta 63：899−915、1980）8：1酢酸／水中で、環化する。エ
レクトロスプレー質量分析（Acm基の喪失）および陰性エルマン（Ellman）試験
により、環化の完全性を評価することができる。精製されたペプチドを分析用HP
LC、マトリックス補助レーザー脱着イオン化質量分析（MALDI−MS）およびアミ
ノ酸分析により分析する。実施例VI：D−アミノ酸置換MPS−NF−κBペプチドによりNF−κB核移入の阻害 原形質膜バリヤーを横切る機能的ペプチドの輸送に根元的な基本的メカニズム
は、まだ説明されていないままである。理論により拘束されたくないが、多数の
細胞型の原形質膜を横切る我々の細胞透過性ペプチドの細胞内デリバリーは、レ
セプターまたはトランスポーター特異的認識および吸収よりむしろ、膜リン脂質
二重層を通る転位を包含すると、我々は仮定する。この仮定を試験するために、
我々が以前に膜透過性配列（MPS）として設計した、疎水性モチーフのシグナル
配列のエナンチオ−インバーソ（enantio−inverso）（すべてのD−アミノ酸）
アナローグを合成し、精製し、試験した。
【０１１１】 前述したように、すべてのL−またはすべてのD−アミノ酸を使用して、カポー
ジ繊維芽細胞増殖因子（KFGF）のシグナル配列の疎水性領域に基づくMPSを合成
して、移入がキラル特異的レセプターまたは膜輸送に依存するかどうかを確立し
た。核因子−κB（NF−κB）の核局在化配列（NLS）を含有する機能的ドメイン
（「カーゴ」）に、すべてのL−またはその「鏡像」のすべてのD−MPSをカップ
リングした。このようなペプチドは、細胞質／核転位メカニズムの完全な阻害に
より、核に対するNF−κBシグナリングを阻害する。MPSの両方の異性体は、前炎
症性アゴニストLPS（第7A図）およびTNF−α（第7B図）により誘導される濃度依
存的核移入阻害により証明されるように、ネズミ内皮LEII細胞（第7A図）および
ヒト赤白血病細胞（第7B図）の細胞質にNLSを送達することができた。こうして
、機能的ペプチドの細胞内デリバリーはMPSのキラリティーに依存せず、特定の
レセプターまたはトランスポーターが関係しないことを示す。その上、すべての
D−アミノ酸から作られたMPSは移入されたペプチドのこの部分をペプチダーゼ耐
性とする。実施例VII：化合物SN50ペプチドによる炎症皮膚反応の阻害 皮膚と接触する前炎症性因子は局在化炎症反応を引き起こす。例えば、このよ
うな反応は、皮内注射（準備投与）としてウサギに最初に適用する、細菌のリポ
多糖（サルモネラ・チフォサ（Salmonella typhosa）LPS 無菌の発熱因子を含
まない生理食塩水中の200μg／ml）により、誘発することができる。第1注射部
位において局在化炎症反応を誘発するために、LPS（100μg／kg体重）の第2注射
を18〜24時間以内にウサギの耳静脈に投与する。引き続いて、通常4時間後、最
初の皮膚注射部位におけるチャレンジが検出される。それは脈管透過性のための
局在化腫脹、血管拡張のための赤色、および皮膚血管中の全血球および血小板の
蓄積により発現される。この反応は、「局在化シュワルツマン(Shwartzman）反
応」と命名され、生物学的色素、例えば、エバンスブルーの静脈内注射により可
視化することができる。こうして、陽性反応は皮膚の第1LPS注射部位において炎
症反応の青色領域として発現される。第2LPS注射前における、細胞透過性ペプチ
ドSN50の皮内適用は、青色変色領域の大きい減少により反映されるように、局在
化皮膚炎症反応を減少した。希釈剤単独（発熱因子を含まない生理食塩水）を陰
性対照として投与したとき、局在化皮膚炎症反応は未変化に止まった。こうして
、皮膚に局所的に適用した、細胞透過性ペプチドSN50は、局在化炎症反応を減少
することができる。炎症性皮膚病のこのモデルまたは他の既知モデルを使用して
、細胞透過性ペプチド（例えば、NF−κB NLSを含有する線形または環状ペプチ
ド、例えば、SN50またはcSN50）の効能を研究しかつ皮膚における炎症反応を阻
害するこれらのペプチドを同定することができる。このようなNF−κB NLSをベ
ースとするペプチドは、自己免疫またはアレルギー反応を含む皮膚の炎症性疾患
および症状の作用を治療し、予防し、または減少することができる。このような
反応は、例えば、乾癬、湿疹、接触皮膚炎（例えば、ツタまたはオークの毒素、
ニッケル、ラテックス、環境的トキシン、または細菌または真菌の感染、すなわ
ち、「みずむし」または「いんきん」を引き起こすもの、との接触による）を包
含するが、これらに限定されない。また、ペプチドは皮膚に対する化学的または
熱的熱傷の炎症作用を治療し、予防し、または減少するために使用することがで
きる。
【０１１２】 この出願を通して、種々の刊行物を参照した。本発明が関係する技術水準を完
全に記載するために、これらの刊行物の開示はそれらの全体において引用するこ
とによって本明細書の一部とされる。
【０１１３】 本発明のある種の態様の特定の細部を参照して本発明のプロセスを記載したが
、本発明の領域は添付された特許請求の範囲に含まれる程度に限定される以外、
このような細部に限定されない。
【０１１４】
【化１】
【０１１５】
【化２】
【０１１６】
【化３】
【０１１７】
【化４】
【０１１８】
【化５】
【０１１９】 この特許のファイルは少なくとも1つのカラーで実行した図面を含有する。カ
ラーの図面を有するこの特許のコピーは、要求に応じて必要な費用を払うと、特
許および商標庁から入手できる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 第1図は、（a）SAペプチド、SAαペプチド、ANLペプチドまたはSMペプチドま
たは（b）酸性繊維芽細胞増殖因子（aFGF）で刺激したNIH3T3により［3H］チミ
ジンの組込みを示すグラフである。
【図２】 第2A図〜第2D図は、未処理対照またはSMペプチド処理対照に比較した、SN50ペ
プチドで処理したC57B1/6マウスの生存率の改良を証明する1系列のグラフである
。5匹のマウスのグループの各々に、大腸菌（E. coli）0127：B8からのLPSの5
分前に、ペプチド（2mg）を含むか、または含まないD−ガラクトサミン（発熱因
子を含まない生理食塩水中の20mg）を腹腔内注射した。ペプチドの注射をLPS後3
0、90、150、および210分に反復した（第2B図および第2C図に示すように）；追
加の2回の注射をLPS後6および12時間に投与した（第2D図）。生存するマウスを7
2時間後に安楽死させた。2〜3グループの累積結果を第3A図に示す（生理食塩水
（希釈剤）の5回の注射で処理した対照マウス）；第2B図（SMペプチドの5回の注
射で処理した動物）；第2C図（SN50ペプチドの5回の注射で処理した動物）；お
よび第2D図（SN50ペプチドの7回の注射で処理した動物）。
【図３】 第3A図〜第3E図は、LPS注射後のマウスの生存率を図解する1系列のグラフであ
る。雌C57B1/6マウス（20g）をランダムにグループ（5マウス／グループ）に分
け、それらにLPS（大腸菌（E. coli）0127：B5、800μg）を腹腔内注射した。
処理において、cSN50（1.5mgまたは0.7mg）およびSMペプチド（1.5mg）をLPS前3
0分に、そしてその後30、90、150、210分および6時間および12時間に与えた。第
3A図は、対照（生理食塩水）を使用した生存率を示す。第3B図は、cSN50ペプチ
ドを0.7mg×7で投与した生存率を示す。第3C図は、cSN50ペプチドを1.5mg×7で
投与した生存率を示す。第3D図は、SMペプチドを1.5mg×7で投与した生存率を示
す。第3E図は、cSN50ペプチド（1.5mg）をエンドトキシン後30分に投与し、次い
で0.7mgを90、150、210分後および6、12、および24時間後に注射した。
【図４】 第4図は、T細胞におけるNF−κB核移入に対するcSN50ペプチドの阻害効果を示
す、電気泳動移動性シフトアッセイ（EMSA）のダイアグラムである。
【図５】 第5図は、スタヒロコッカルエンテロトキシンB（SEB）誘導毒性ショックから
の死がNF−κB NLS含有ペプチドcSN50によるNF−κB核移入の阻害により防止さ
れることを示すグラフである。
【図６】 第6A図〜第6D図は、未処理SEBチャレンジマウスおよびNF−κB NLS含有ペプ
チドcSN50で処理したSEBチャレンジマウスからの、ヘマトキシリンおよびエオシ
ン（H & E）で染色した、肝臓切片の顕微鏡写真を示すダイアグラムである。
【図７】 第7A図〜第7B図は、炎症誘発性アゴニストLPS（7A）及びTNP−α（7B）により
誘導されたNF−κBの核輸送の濃度依存性阻害を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ビーチ，ルース アン アメリカ合衆国，テネシー 37027，ブレ ントウッド，バリー ドライブ 6610 (72)発明者 リウ，シュー ヤン アメリカ合衆国，テネシー 37215，ナッ シュビル，マウンテン ビュー ドライブ 4623 (72)発明者 リウ，ダンヤ アメリカ合衆国，テネシー 37212，ナッ シュビル，アクレン アベニュ 2121 ＃12 (72)発明者 ティモンズ，シェイラ アメリカ合衆国，テネシー 37215，ナッ シュビル，ベルモント パーク テラス 4207 (72)発明者 コリンズ，ロバート ディー アメリカ合衆国，テネシー 37215，ナッ シュビル，ヒルズボロ ロード 5830 Ｆターム(参考） 4C076 BB11 CC04 CC14 CC31 EE41 EE59 FF34 4C084 AA02 BA01 BA09 BA17 BA18 BA23 BA24 MA01 NA13 NA14 ZA512 ZB112 ZB212 ZB322

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 NF−κB核局在化配列を含むペプチドを被検体に投与し、被
    検体の細胞中のストレス反応性転写因子の移入を阻害し、これにより被検体にお
    ける炎症反応を治療または予防することを含む、被検体における炎症反応を治療
    または予防する方法。
  2. 【請求項２】 ストレス反応性転写因子がNF−κB、AP−1、NFAT、またはST
    AT−1である、請求項1に記載の方法。
  3. 【請求項３】 ペプチドがシグナルペプチドの細胞膜透過性疎水性領域をさ
    らに含む、請求項1に記載の方法。
  4. 【請求項４】 シグナルペプチドの細胞膜透過性疎水性領域が、アミノ酸配
    列Ala−Ala−Val−Ala−Leu−Leu−Pro−Ala−Val−Leu−Ala−Leu−Leu−Ala−
    Proを有するカポージ繊維芽細胞増殖因子シグナルペプチド疎水性領域を含む、
    請求項3に記載の方法。
  5. 【請求項５】 シグナルペプチドの細胞膜透過性疎水性領域が、アミノ酸配
    列Val−Thr−Val−Leu−Ala−Leu−Gly−Ala−Leu−Ala−Gly−Val−Gly−Val−
    Glyを有するインテグリンベータ−3シグナルペプチド疎水性領域を含む、請求項
    3に記載の方法。
  6. 【請求項６】 NF−κB核局在化配列がアミノ酸配列Gln−Arg−Lys−Arg−G
    ln−Lysを含む、請求項1に記載の方法。
  7. 【請求項７】 NF−κB核局在化配列がアミノ酸配列Val−Gln−Arg−Lys−A
    rg−Gln−Lys−Leu−Met−Proを含む、請求項6に記載の方法。
  8. 【請求項８】 ペプチドがシグナルペプチドの細胞膜透過性疎水性領域と、
    アミノ酸Gln−Arg−Lys−Arg−Gln−Lysを含んでなるNF−κB核局在化配列とを
    含む環状ペプチドである、請求項1に記載の方法。
  9. 【請求項９】 ペプチドがアミノ酸配列Cys−Xaa−Xaa−Gln−Arg−Lys−Ar
    g−Gln−Lys−Xaa−Xaa−Xaa−Cysを有する環化NF−κB核局在化配列を含み、こ
    こでXaaは任意のアミノ酸である、請求項1に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 環状ペプチドの1またはそれ以上のアミノ酸がD−アミノ酸
    である、請求項9に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 環状ペプチドがcSN50のアミノ酸配列である、請求項9に記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】 炎症反応が微生物または微生物のトキシンにより引き起こ
    される、請求項1に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 微生物がグラム陰性細菌またはグラム陽性細菌である、請
    求項12に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 炎症反応が全身的炎症反応である、請求項1に記載の方法
    。
  15. 【請求項１５】 全身的炎症反応が敗血症性ショックを引き起こす、請求項
    14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 炎症反応が局在化炎症反応である、請求項1に記載の方法
    。
  17. 【請求項１７】 局在化炎症反応が炎症性皮膚症状である、請求項1に記載
    の方法。
  18. 【請求項１８】 NF−κBの核局在化配列を含むペプチドを含む化合物を被
    検体にデリバリーし、NF−κBの核移入を阻害し、これにより被検体における敗
    血症性ショックを治療または予防することを含む、被検体における敗血症性ショ
    ックを治療または予防する方法。
  19. 【請求項１９】 ペプチドがシグナルペプチドの細胞膜透過性疎水性領域を
    さらに含む、請求項18に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 AP−1、NFAT、またはSTAT−1から成る群から選択されるメ
    ンバーの核移入がまた阻害される、請求項18に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 AP−1、NFAT、またはSTAT1の各々の核移入がまた阻害され
    る、請求項18に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 ペプチドが環状ペプチドである、請求項1に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 シグナルペプチドの細胞膜透過性疎水性領域と、核局在化
    ペプチドとに連鎖された生物学的に活性な分子を含む複合体を被検体に投与し、
    これにより被検体の細胞核の中に前記分子を移入させることを含む、被検体の細
    胞核の中に生物学的に活性な分子を移入させる方法。
  24. 【請求項２４】 分子が配列番号12に記載するアミノ酸配列を含むペプチド
    に連鎖されている、請求項23に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 分子が配列番号13に記載するアミノ酸配列を含むペプチド
    に連鎖されている、請求項23に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 NF−κBの核局在化配列を含んでなるペプチドを被検体に
    投与し、これにより被検体における全身的炎症反応を治療または予防することを
    含む、全身的炎症反応が被検体の細胞核の中へのストレス反応性転写因子の移入
    を含む、被検体における全身的炎症反応を治療または予防する方法。
  27. 【請求項２７】 NF−κBの核局在化配列を含んでなるペプチドを細胞に投
    与し、これにより細胞核の中へのストレス反応性転写因子の移入を阻害すること
    を含む、細胞核の中へのストレス反応性転写因子の移入を阻害する方法。
  28. 【請求項２８】 細胞が被検体内に存在する、請求項27に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 ペプチドを被検体に投与する、請求項28に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 細胞が肝細胞であり、そして肝細胞へのペプチドの投与が
    肝細胞のアポトーシスを阻害する、請求項27に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 ペプチドが環状ペプチドである、請求項27に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 環状ペプチドが配列番号12に記載するアミノ酸配列を含む
    、請求項27に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 核酸、炭水化物、脂質、糖脂質および治療剤から成る群か
    ら選択される生物学的に活性な分子に連鎖されたシグナルペプチドの細胞膜透過
    性疎水性領域を含む複合体。
JP2001539436A 1999-11-29 2000-11-29 炎症反応を阻害する細胞透過性ペプチドおよび使用方法 Pending JP2003514852A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/450,071 US6495518B1 (en) 1994-06-13 1999-11-29 Method for importing biologically active molecules into cells
US09/450,071 1999-11-29
PCT/US2000/032516 WO2001037821A1 (en) 1999-11-29 2000-11-29 Cell permeable peptides for inhibition of inflammatory reactions and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003514852A true JP2003514852A (ja) 2003-04-22

Family

ID=23786649

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001539436A Pending JP2003514852A (ja) 1999-11-29 2000-11-29 炎症反応を阻害する細胞透過性ペプチドおよび使用方法

Country Status (10)

Country Link
US (2) US6495518B1 (ja)
EP (1) EP1246616B1 (ja)
JP (1) JP2003514852A (ja)
KR (1) KR20030025901A (ja)
AT (1) ATE334664T1 (ja)
AU (1) AU783479B2 (ja)
BR (1) BR0015977A (ja)
CA (1) CA2391943A1 (ja)
DE (1) DE60029829T2 (ja)
WO (1) WO2001037821A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008519839A (ja) * 2004-11-09 2008-06-12 セルテック バイオサイエンス エルエルシー 癌細胞におけるアポトーシスの増加のための組成物および方法
JP2010537666A (ja) * 2007-09-04 2010-12-09 プロセル セラピューティックス インコーポレーティッド 細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質、これをコードするポリヌクレオチド及びこれを有効成分として含有する抗癌組成物
JP2010537665A (ja) * 2007-09-04 2010-12-09 プロセル セラピューティックス インコーポレーティッド 細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質、これをコードするポリヌクレオチド及びこれを有効成分として含有する癌転移抑制用組成物
JP2020524144A (ja) * 2017-06-16 2020-08-13 ヴァンダービルト ユニヴァーシティ 微生物性炎症を処置するための方法および組成物
JP2022501337A (ja) * 2018-09-14 2022-01-06 ヴァンダービルト ユニヴァーシティ 皮膚疾患を治療するための方法および組成物
JP2023509063A (ja) * 2020-02-18 2023-03-06 セリベリー セラピューティクス，インコーポレーテッド サイトカインストーム又は炎症性疾患を抑制するために改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチド及びその用途

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6495518B1 (en) * 1994-06-13 2002-12-17 Vanderbilt University Method for importing biologically active molecules into cells
US7553929B2 (en) * 1994-06-13 2009-06-30 Vanderbilt University Cell permeable peptides for inhibition of inflammatory reactions and methods of use
PT1129064E (pt) 1998-11-12 2008-01-31 Invitrogen Corp Reagentes de transfecção
US6773920B1 (en) 1999-03-31 2004-08-10 Invitrogen Corporation Delivery of functional protein sequences by translocating polypeptides
ATE385503T1 (de) 1999-06-28 2008-02-15 Inter K Pty Ltd Verfahren zur modulierung von integrin- vermittelter zellaktivitaet und hierfuer geeignete reagenzien
US20030104622A1 (en) * 1999-09-01 2003-06-05 Robbins Paul D. Identification of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, DNA and viruses
US20040101488A1 (en) * 2000-03-24 2004-05-27 Balaram Ghosh Method for the prevention of septic shock lethality using curcumin
AUPR230500A0 (en) * 2000-12-22 2001-01-25 University Of Newcastle Research Associates Limited, The A method of modulating map kinase mediated cellular activity and agents useful in same
DE10148886A1 (de) * 2001-10-04 2003-04-30 Avontec Gmbh Inhibition von STAT-1
EP1476176A4 (en) * 2002-01-30 2006-02-22 Univ Yale TRANSPORT PEPTIDES AND ITS USE
GB0207624D0 (en) * 2002-04-02 2002-05-15 Cancer Res Ventures Ltd Chemokine and uses thereof
GB2409679B (en) 2003-10-17 2005-12-28 Inter K Pty Ltd Anti-cancer agents which inhibit the interaction between integrins and MAP kinases.
AU2005264172A1 (en) * 2004-07-21 2006-01-26 Centre For Dna Fingerprinting And Diagnostics (Cdfd) Antigenic peptides
AU2006340711C1 (en) 2005-04-05 2013-02-07 Allergan, Inc. Clostridial toxin activity assays
US7517959B2 (en) * 2005-11-11 2009-04-14 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research SOCS3 proteins
EP2023947A4 (en) * 2006-05-10 2009-11-25 Smithkline Beecham Corp COMPOSITION AND METHOD IMPROVING THE CELL PERMEABILITY OF A COMPOUND
WO2009033792A2 (en) * 2007-09-11 2009-03-19 Mondobiotech Laboratories Ag Gamma 1 msh alone or in combination with pentagastrin as a therapeutic agent
JP2011512364A (ja) * 2008-02-22 2011-04-21 インター−ケイ ピーティーワイ リミテッド 治療用ペプチド
AU2009223161B2 (en) 2008-03-14 2014-10-30 Allergan, Inc. Immuno-based botulinum toxin serotype A activity assays
JP2012533521A (ja) 2008-07-17 2012-12-27 ニュートリペップ・ピーティーワイ・リミテッド 治療剤
PT2406371T (pt) 2009-03-13 2018-10-18 Allergan Inc Células úteis para ensaios de atividade de sérotipos da toxina botulínica baseados na imunologia
DK3281953T3 (da) 2009-03-13 2020-01-20 Allergan Inc Immun-baserede omdirigerede endopeptidase-aktivitetsassays
KR101122845B1 (ko) * 2009-07-30 2012-03-21 부산대학교 산학협력단 경구용 염증성 장질환 치료제
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US8932559B2 (en) 2011-10-06 2015-01-13 Vanderbilt University Compositions and methods for preserving insulin-producing cells and insulin production and treating diabetes
US9388224B2 (en) * 2011-10-06 2016-07-12 Vanderbilt University Compositions for preserving insulin-producing cells and insulin production and treating diabetes
US10272133B2 (en) 2011-10-06 2019-04-30 Vanderbilt University Compositions and methods for treating and preventing hyperlipidemia, fatty liver, atherosclerosis and other disorders associated with metabolic syndrome
US9044433B2 (en) 2011-10-06 2015-06-02 Vanderbilt University Compositions and methods for treating and preventing hyperlipidemia, fatty liver, atherosclerosis and other disorders associated with metabolic syndrome
CN104364392B (zh) 2012-02-27 2018-05-25 赛卢拉研究公司 用于分子计数的组合物和试剂盒
US9492544B2 (en) 2013-04-11 2016-11-15 Vanderbilt University Compositions and methods for targeting nuclear import shuttles and treating inflammatory disorders
US11571455B2 (en) 2013-04-11 2023-02-07 Vanderbilt University Methods and compositions for treating alcoholic liver disease
GB2546833B (en) 2013-08-28 2018-04-18 Cellular Res Inc Microwell for single cell analysis comprising single cell and single bead oligonucleotide capture labels
WO2016011203A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Life Technologies Corporation Compositions with lipid aggregates and methods for efficient delivery of molecules to cells
US10342847B2 (en) 2015-02-27 2019-07-09 Vanderbilt University Compositions and methods for preventing and reducing inflammation and treating disorders associated with inflammation
EP3262192B1 (en) 2015-02-27 2020-09-16 Becton, Dickinson and Company Spatially addressable molecular barcoding
JP7508191B2 (ja) 2015-03-30 2024-07-01 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー コンビナトリアルバーコーディングのための方法および組成物
ES2745694T3 (es) 2015-09-11 2020-03-03 Cellular Res Inc Métodos y composiciones para normalización de biblioteca de ácido nucleico
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
KR102363716B1 (ko) 2016-09-26 2022-02-18 셀룰러 리서치, 인크. 바코딩된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 시약을 이용한 단백질 발현의 측정
WO2018144240A1 (en) 2017-02-01 2018-08-09 Cellular Research, Inc. Selective amplification using blocking oligonucleotides
EP3635135A1 (en) 2017-06-05 2020-04-15 Becton, Dickinson and Company Sample indexing for single cells
CA3097976A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
US11365409B2 (en) 2018-05-03 2022-06-21 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
JP2022511398A (ja) 2018-10-01 2022-01-31 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ５’転写物配列の決定
JP2022506546A (ja) 2018-11-08 2022-01-17 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ランダムプライミングを使用した単一細胞の全トランスクリプトーム解析
CN113195717A (zh) 2018-12-13 2021-07-30 贝克顿迪金森公司 单细胞全转录组分析中的选择性延伸
CN113574178A (zh) 2019-01-23 2021-10-29 贝克顿迪金森公司 与抗体关联的寡核苷酸
EP3924506A1 (en) 2019-02-14 2021-12-22 Becton Dickinson and Company Hybrid targeted and whole transcriptome amplification
US11939622B2 (en) 2019-07-22 2024-03-26 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
WO2021092386A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 Becton Dickinson And Company Using random priming to obtain full-length v(d)j information for immune repertoire sequencing
EP4090763A1 (en) 2020-01-13 2022-11-23 Becton Dickinson and Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
WO2021231779A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
WO2022109343A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Becton, Dickinson And Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
WO2023220713A2 (en) * 2022-05-12 2023-11-16 Amytrx Therapeutics, Inc. Peptide formulations and uses thereof

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3710795A (en) * 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US5041376A (en) * 1988-12-09 1991-08-20 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Method for identifying or shielding functional sites or epitopes of proteins that enter the exocytotic pathway of eukaryotic cells, the mutant proteins so produced and genes encoding said mutant proteins
US5191063A (en) * 1989-05-02 1993-03-02 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Production of biologically active polypeptides by treatment with an exogenous peptide sequence
US5126323A (en) * 1989-11-16 1992-06-30 Genetics Institute, Inc. Homogeneous purified k-fgf and compositions containing the same
US5811512A (en) * 1991-08-22 1998-09-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Non-peptide peptidomimetics and related cyclic hexapeptides
US5807746A (en) * 1994-06-13 1998-09-15 Vanderbilt University Method for importing biologically active molecules into cells
US6495518B1 (en) * 1994-06-13 2002-12-17 Vanderbilt University Method for importing biologically active molecules into cells
US5916872A (en) 1996-07-24 1999-06-29 Intrabiotics Pharmaceuticals, Inc. Cyclic peptides having broad spectrum antimicrobial activity
US5962415A (en) 1996-09-20 1999-10-05 Bristol-Myers Squibb Co. Compositions comprising a peptide inhibitor of nuclear protein translocation and an immunosuppressant and methods of use thereof
US5877282A (en) 1996-09-20 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Peptide inhibitors of nuclear protein translocation having nuclear localization sequences and methods of use thereof
US6323317B1 (en) * 1996-11-01 2001-11-27 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Therapeutic and diagnostics proteins comprising a SOCS box
ES2308785T3 (es) 1996-11-01 2008-12-01 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Agentes terapeuticos y diagnosticos capaces de modular la sensibilidad celular a citoquinas.
US6090539A (en) * 1997-01-13 2000-07-18 Yale University Methods and compositions utilizing Rad51
WO1998034118A1 (en) 1997-01-30 1998-08-06 Yale University Diagnostic methods and compositions based on the distribution of rad51
EP0970215A1 (en) 1997-11-03 2000-01-12 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Suppressor of cytokine signaling
US6248558B1 (en) 1998-03-31 2001-06-19 Vanderbilt University Sequence and method for genetic engineering of proteins with cell membrane translocating activity
JP2003520577A (ja) 1999-10-21 2003-07-08 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション Ｅｐｏ一次応答遺伝子１、ｅｐｒｇ１
AU2001280767A1 (en) * 2000-07-31 2002-02-13 Active Motif Peptide-mediated delivery of molecules into cells

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008519839A (ja) * 2004-11-09 2008-06-12 セルテック バイオサイエンス エルエルシー 癌細胞におけるアポトーシスの増加のための組成物および方法
JP2010537666A (ja) * 2007-09-04 2010-12-09 プロセル セラピューティックス インコーポレーティッド 細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質、これをコードするポリヌクレオチド及びこれを有効成分として含有する抗癌組成物
JP2010537665A (ja) * 2007-09-04 2010-12-09 プロセル セラピューティックス インコーポレーティッド 細胞透過性Ｎｍ２３組換えタンパク質、これをコードするポリヌクレオチド及びこれを有効成分として含有する癌転移抑制用組成物
JP2020524144A (ja) * 2017-06-16 2020-08-13 ヴァンダービルト ユニヴァーシティ 微生物性炎症を処置するための方法および組成物
JP2023027127A (ja) * 2017-06-16 2023-03-01 ヴァンダービルト ユニヴァーシティ 微生物性炎症を処置するための方法および組成物
JP2022501337A (ja) * 2018-09-14 2022-01-06 ヴァンダービルト ユニヴァーシティ 皮膚疾患を治療するための方法および組成物
JP2023509063A (ja) * 2020-02-18 2023-03-06 セリベリー セラピューティクス，インコーポレーテッド サイトカインストーム又は炎症性疾患を抑制するために改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチド及びその用途
JP7450983B2 (ja) 2020-02-18 2024-03-18 セリベリー セラピューティクス，インコーポレーテッド サイトカインストーム又は炎症性疾患を抑制するために改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチド及びその用途

Also Published As

Publication number Publication date
AU1933101A (en) 2001-06-04
WO2001037821A1 (en) 2001-05-31
DE60029829D1 (de) 2006-09-14
EP1246616B1 (en) 2006-08-02
EP1246616A1 (en) 2002-10-09
AU783479B2 (en) 2005-11-03
US20040147435A1 (en) 2004-07-29
BR0015977A (pt) 2006-06-06
US6495518B1 (en) 2002-12-17
DE60029829T2 (de) 2007-03-01
KR20030025901A (ko) 2003-03-29
ATE334664T1 (de) 2006-08-15
EP1246616A4 (en) 2005-01-05
US8324148B2 (en) 2012-12-04
CA2391943A1 (en) 2001-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2003514852A (ja) 炎症反応を阻害する細胞透過性ペプチドおよび使用方法
US7553929B2 (en) Cell permeable peptides for inhibition of inflammatory reactions and methods of use
US6043339A (en) Method for importing biologically active molecules into cells
JP6426103B2 (ja) ｃ−Ｍｅｔタンパク質アゴニスト
US20040038876A1 (en) Polymer conjugates of hedgehog proteins and uses
JP2004203890A (ja) マクロファージ炎症蛋白変種
AU758576B2 (en) Chemokines with amino-terminal modifications
JP4624639B2 (ja) 短い荷電ペプチド鎖によってｎ及び／又はｃ末端が修飾されたペプチド
JP2003530360A (ja) 薬剤送達のためのペプチド複合体
JP2006505243A (ja) Ｍｃｐタンパク質の新規のアンタゴニスト
US7569229B2 (en) Monocyte locomotion inhibitory factor
US8501680B2 (en) Antagonists against interaction of PF4 and RANTES
JP2006516546A (ja) 間質性膀胱炎の治療用細胞調節性ペプチド
KR102017973B1 (ko) 항-b형 간염 바이러스 x 단백질 폴리펩티드 약제
JPWO2003078460A1 (ja) ペプチド、該ペプチドを含有する医薬組成物及び癌治療用医薬組成物
HRP970654A2 (en) Muteins of obese protein
WO1996011700A1 (en) Reduction of mammalian neoplasms with phospholipase a2 activatiing substances
JP6758022B2 (ja) 血管内皮細胞増殖因子受容体阻害ペプチド
CA2531228A1 (en) Novel therapeutic fusion proteins
CA2408387A1 (en) A ligand for enhancing oral and cns delivery of biological agents
WO2000015253A1 (en) Human chorionic gonadotropin vaccines
JPH11155576A (ja) ＲｓｂＶ−１
WO2005056581A2 (en) Peptide able to specifically bind a chemokine receptor and use thereof