ES2308785T3 - Agentes terapeuticos y diagnosticos capaces de modular la sensibilidad celular a citoquinas. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE, EN GENERAL, A UNOS AGENTES TERAPEUTICOS Y DIAGNOSTICOS, Y MAS ECONCRETAMENTE, A UNAS MOLECULAS TERAPEUTICAS CAPACES DE MODULAR LA TRANSDUCCION DE SEÑAL, ESPECIALMENTE, PERO NO EXCLUSIVAMENTE, LA TRANSDUCCION DE SEÑAL A TRAVES DE LAS CITOQUININAS. DICHAS MOLECULAS SON POR TANTO UTILES PARA LA MODULACION DE LA RECEPTIVIDAD CELULAR A LAS CITOQUININAS ASI COMO A OTROS MEDIADORES DE TRANSDUCCION DE SEÑAL, COMO POR EJEMPLO LAS MOLECULAS ENDOGENAS O EXOGENAS, LOS ANTIGENOS, LOS MICROBIOS Y PRODUCTOS MICROBIANOS, VIRUS O COMPONENTES DE LOS MISMOS, IONES, HORMONAS Y PARASITOS.

Description

Agentes terapéuticos y diagnósticos capaces de modular la sensibilidad celular a citoquinas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a agentes terapéuticos y diagnósticos. Más particularmente, la presente invención proporciona moléculas terapéuticas capaces de modular la transducción de señales como, aunque sin limitarse a ésta, la transducción de señales mediada por citocinas. Las moléculas de la presente invención son útiles, por lo tanto, para modular la sensibilidad celular a las citocinas como también otros mediadores de la transducción de señales tales como las moléculas endógenas o exógenas, microbios y productos microbianos, virus o sus componentes, iones, hormonas y parásitos.

Los detalles bibliográficos de las publicaciones a las que el autor hace referencia en esta memoria figuran al final de la descripción. Los números de identidad de secuencia (SEC ID No) para las secuencias de nucleótidos y aminoácidos a las que se hace referencia en la memoria se definen después de la bibliografía. Se expone un resumen de los No ID SEC en la Tabla I.

En toda la memoria y en las reivindicaciones siguientes, a menos que el contexto indique otra cosa, la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un entero especificado o grupo de enteros pero no la exclusión de ningún otro entero o grupo de enteros.

Antecedentes de la invención

Las células monitorean continuamente su entorno con el fin de modular procesos fisiológicos y bioquímicos que, a su vez, afectan la conducta futura. Con frecuencia, la interacción inicial de una célula con sus alrededores se produce mediante receptores expresados en la membrana plasmática. La activación de estos receptores, o bien a través de la unión de ligandos endógenos (como citocinas) o ligandos exógenos (como antígenos), desencadena una cascada bioquímica desde la membrana a través del plasma y hacia el núcleo.

De los ligandos endógenos, las citocinas representan un grupo particularmente importante y versátil.

Las citocinas son proteínas que regulan la supervivencia, proliferación, diferenciación y funcionamiento de una diversidad de células del organismo [Nicola, 1994]. Las citocinas hemotopoyéticas tienen en común una estructura de haz tetra-alfahelicoidal y la gran mayoría interactúa con una familia estructuralmente relacionada de receptores de superficie celular, los receptores de citocinas de tipo I y tipo II [Bazan, 1990; Sprang. 1993]. En todos los casos, la agregación de receptores inducida por ligandos parece ser un episodio crítico en la iniciación de las cascadas de transducción de señales intracelulares. Algunas citocinas, por ejemplo la hormona del crecimiento, eritropoyetina (Epo) y el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), desencadenan la homodimerización, mientras que para otras citocinas, es crucial la heterodimerización o heterotrimerización. En este último caso, varias citocinas comparten subunidades del receptor y, en base a esto, pueden agruparse en tres subfamilias con características similares de activación intracelular y efectos biológicos [Hilton, 1994]. La interleucina 3 (IL-3), IL-5 y el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) usan la subunidad del receptor \beta común (\betac) y cada citocina estimula la producción y actividad funcional de los granulocitos y los macrófagos. Las IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15 usan cada una la cadena \gamma común (\gammac), mientras que las IL-4 e IL-13 comparten una cadena Y alternativa (\gamma'c o cadena \alpha del receptor de IL-13). Cada una de estas citocinas cumple una función importante en regular la inmunidad adquirida en el sistema linfoide. Finalmente, las IL-6, IL-11, el factor inhibidor de leucemia (LIF), oncostatina M (OSM), factor neurotrófico ciliar (CNTF) y la cardiotrofina (CT) comparten la subunidad del receptor gp130. Cada una de estas citocinas parece ser altamente pleiotrópico, con efectos tanto dentro como fuera del sistema hemopoyético [Nicola, 1994].

En todos los casos mencionados, por lo menos una subunidad de cada complejo receptor contiene los elementos de la secuencia conservados, denominados box1 y box2, en sus extremos citoplásmicos [Murakami, 1991]. Box1 es un motivo rico en prolina ubicado más proximal al dominio transmembrana que el elemento ácido box 2. La región box-1 sirve como el sitio de unión para una clase de tiorosina cinasas citoplásmicas denominadas JAK (cinasas Janus). La dimerización del receptor inducida por ligandos sirve para aumentar la actividad catalítica de las JAK asociadas a través de la fosforilación cruzada. Las JAK activadas luego tirosina fosforilan varios sustratos, incluyendo los receptores propiamente dichos. Los residuos fosfotirosina específicos en el receptor sirven luego como sitios de anclaje para proteínas que contienen SH2, en donde los mejores caracterizados son los transductores y activadores de señales de transcripción (STAT) y el adaptador de la proteína, shc. Los STAT luego se fosforilan en tirosinas, probablemente por JAK, se disocian del receptor y forman o bien homodímeros o heterodímeros a través de la interacción del dominio SH2 de un STAT con el residuo fosfotirosina de la otra. Los dímeros de STAT se translocan luego al núcleo en donde se unen a promotores sensibles a citocina específicos y activan la transcripción [Darnell, 1994; Ihle, 1995; Ihle, 1995]. En una vía separada, la tirosina fosforilada shc interactúa con otra proteína que contiene el dominio SH2, Grb-2, conduciendo en última instancia a la activación de miembros de la familia cinasa MAP y a su vez factores de transcripción como fos y jun [Sato, 1993; Cutler, 1993]. Estas vías no son los únicos miembros de la familia de receptores de citocina ya que las citocinas que se unen a las tirosina cinasas del receptor también son capaces de activar los STAT y los miembros de la familia cinasa MAP [David, 1996; Leaman, 1996; Shual, 1993; Sato, 1993; Cutler, 1993].

Se han descrito cuatro miembros de la familia JAK de tirosina cinasas citoplásmicas, JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2, cada uno de los cuales se une a un subconjunto específico de subunidades del receptor de citocina. Se han descrito seis STAT (STAT1 a STAT6), y éstos también se activan por complejos citocina/receptor distintos. Por ejemplo, STAT1 parece ser funcionalmente específico del sistema de interferón, STAT4 parece ser específico de IL-12, mientras que STAT6 parece ser específico de IL-4 y IL-13. Por lo tanto, a pesar de los mecanismos de activación comunes, se puede lograr algún grado de especificidad de la citocina a través del uso de JAK y STAT específicos [Thierfelder, 1996; Kaplan, 1996; Takeda, 1996; Shimoda, 1996; Meraz, 1996; Durbin, 1996.

Además de los descritos anteriormente, hay claramente otros mecanismos de activación de estas vías. Por ejemplo, las vías JAK/STAT parecen ser estables para activar las cinasas MAP independientes de la vía inducida por shc [David, 1995] y los STAT propiamente dichos pueden activarse sin unión al receptor, posiblemente por interacción directa con JAK [Gupta, 1996]. A la inversa, la activación total de los STAT puede requerir la acción de la cinasa MAP además de aquella de las JAK [David, 1995; Wen, 1995].

Si bien la activación de estas vías de señalización está siendo mejor comprendida, poco se sabe acerca de la regulación de estas vías, como el empleo de bucles re retroalimentación negativos o positivos. Esto es importante, ya que una vez que una célula ha comenzado a responder a un estímulo, es crítico que la intensidad y duración de la respuesta sean reguladas y que la transducción de señales se suspenda. A su vez, es conveniente aumentar la intensidad de una respuesta sistémicamente o incluso localmente según la situación lo requiera.

En el trabajo que lleva a la presente invención, los inventores buscaron aislar reguladores negativos de transducción de señales. Los inventores han identificado ahora una nueva familia de proteínas capaces de actuar como reguladores de señalización. La nueva familia de proteínas se define como la familia de supresores de la señalización de citocinas (SOCS) en base a la capacidad de las moléculas SOCS inicialmente identificadas para suprimir la señalización mediada por citocinas. Se ha de observar, no obstante, que no todos los miembros de la familia SOCS deben necesariamente compartir la función supresora ni dirigir exclusivamente la señalización mediada por citocinas. La familia SOCS comprende por lo menos tres clases de moléculas de proteínas basadas en motivos de secuencias de aminoácidos ubicadas en N-terminal de un motivo C-terminal que se denominan SOCS box. La identificación de esta nueva familia de moléculas reguladoras permite la generación de una gama de moléculas efectoras o moduladoras capaces de modular la transducción de señales y, en consecuencia, la sensibilidad celular a una gama de moléculas que incluyen las citocinas. La presente invención, por lo tanto, provee agentes terapéuticos y diagnósticos basados en proteínas SOCS, sus derivados, homólogos, análogos y sus miméticos, como también agonistas y antagonistas de proteínas SOCS.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere, entre otros, a moléculas de ácido nucleico que codifican números de la familia de proteínas SOCS como también las proteínas propiamente dichas. En lo sucesivo, "SOCS" abarca todos y cada uno de los miembros de la familia SOCS. Las moléculas SOCS específicas se definen numéricamente como tales, por ejemplo, SOCS1, SOCS2 y SOCS3. Las especies de las cuales se ha obtenido SOCS pueden indicarse con un prefijo abreviado con una sola letra en donde "h" es humano, "m" es murino y "r" es rata. Por consiguiente, "mSOCS1" es un SOCS específico de animal murino. La referencia en esta memoria a "SOCS" no implica que la proteína suprima exclusivamente la transducción de señales mediada por citocinas, ya que la molécula puede modular otras transducciones de señales mediadas por transducciones de efectores como por hormonas u otras moléculas endógenas o exógenas, antígenos, microbios y productos microbianos, virus o sus componentes, iones, hormonas y parásitos. El término "modula" abarca ascenso o descenso como también mantenimiento de niveles particulares. La invención reivindicada en esta memoria se refiere particularmente a una proteína SOCS-3.

Un aspecto de la presente invención provee, por consiguiente, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o complementaria a una secuencia que codifica, una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO 8 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70% de similitud con la SEC ID NO 8, en donde dicha proteína comprende un SOCS box en su región C-terminal y modula la transducción de señales.

Dicha molécula de ácido nucleico puede codificar una proteína que además comprende una región de interacción proteína:molécula ubicada en una región N-terminal del SOCS box.

Preferiblemente, la región de interacción proteína:molécula es una región de unión proteína:DNA o proteína:proteí-
na.

En particular, la molécula de ácido nucleico de la presente invención puede codificar una proteína que comprende un dominio SH2 N-terminal del SOCS box.

La proteína comprende un SOCS box en su región C-terminal en donde el SOCS box comprende la secuencia de aminoácidos:

X_{1} X_{2} X_{3} X_{4} X_{5} X_{6} X_{7} X_{8} X_{9} X_{10} X_{11} X_{12} X_{13} X_{14} X_{15} X_{16}[X_{j}]_{n} X_{17} X_{18} X_{19} X_{20} X_{21} X_{22} X_{23} [X_{j}]_{n} X_{24} X_{25} X_{26} X_{27} X_{28}

En donde

X_{1} es L, I, V, M, A o P;

X_{2} es cualquier residuo de aminoácido;

X_{3} es P, T o S;

X_{4} es L, I, V, M, A o P;

X_{5} es cualquier aminoácido;

X_{6} es cualquier aminoácido;

X_{7} es L, I, V, M, A, F, Y o W;

X_{8} es C, T o S;

X_{9} es R, K o R;

X_{10} es cualquier aminoácido;

X_{11} es cualquier aminoácido;

X_{12} es L, I, V, M, A o P;

X_{13} es cualquier aminoácido;

X_{14} es cualquier aminoácido;

X_{15} es cualquier aminoácido;

X_{16} es L, I, V, M, A, P, G, C, T o S;

[X_{j}]_{n} es una secuencia de aminoácidos n en donde n es 1 a 50 aminoácidos y en donde la secuencia X_{j} puede comprender los mismos o diferentes aminoácidos seleccionados entre cualquier residuo de aminoácido;

X_{17} es L, I, V, M, A o P;

X_{18} es cualquier aminoácido;

X_{19} es cualquier aminoácido;

X_{20} L, I, V, M, A o P;

X_{21} es P;

X_{22} es L, I, V, M, A, P o G;

X_{23} es P o N;

[X_{j}]_{n} es una secuencia de aminoácidos n en donde n es 1 a 50 aminoácidos y en donde la secuencia X_{j} puede comprender los mismos o diferentes aminoácidos seleccionados entre cualquier residuo de aminoácido;

X_{24} es L, I, V, M, A o P;

X_{25} es cualquier aminoácido;

X_{26} es cualquier aminoácido;

X_{27} es Y o F;

X_{28} es L, I, V, M, A o P;

y una región de interacción proteína:molécula como un dominio SH2 N-terminal del SOCS box.

Preferiblemente, las moléculas SOCS modulan la transducción de señales tales como desde una citocina u hormona u otra molécula endógena o exógena, microbio o producto microbiano, antígeno o parásito.

Más preferiblemente, las moléculas SOCS modulan la transducción de señales mediada por citocinas.

Por consiguiente, la molécula de ácido nucleico de la presente invención se define además como codificante de una proteína capaz de modular la transducción de señales.

Preferiblemente, la transducción de señales es mediada por una citocina, como una o más de EPO, TPO, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-2, IL-4, IL-7, IL-13, IL-6, LIF, IL-12, IFN\alpha, TNF\alpha, IL-1 y/o M-CSF.

Preferiblemente, la transducción de señales es mediada por una o más de interleucina 6 (IL-6), factor inhibidor de leucemia (LIF).

Preferiblemente, la transducción de señales es mediada por IL-6.

Las moléculas de ácido nucleico particularmente preferidas comprenden secuencias de nucleótidos sustancialmente expuestas en la SEC ID NO:7 (mSOCS3) o una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 70% de similitud con la SEC ID NO:7 o una molécula de ácido nucleico capaz de hibridarse a la SEC ID NO:7 bajo condiciones rigurosas del medio a 42ºC.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO 8 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70% de similitud con la SEC ID NO 8, en donde la proteína comprende un SOCS box en su región C-terminal y modula la transducción de señales.

La proteína de la presente invención puede comprender además una región de interacción proteína:molécula, que puede estar ubicada en una región N-terminal del SOCS box.

Preferiblemente, la región de interacción proteína: molécula es una región de unión proteína:DNA o proteína:proteína.

En particular, la proteína de la presente invención puede comprender un domino SH2 N-terminal del SOCS box.

La proteína modula la transducción de señales tal como la transducción de señales mediada por citocinas.

Las citocinas preferidas son EPO, TPO, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-2, IL-4, IL-7, IL-13, IL-6, LIF, IL-12, IFN\gamma, TNF\alpha, IL-1 y/o M-CSF.

Una citocina particularmente preferida es IL-6.

Otro aspecto de la presente invención contempla un método in vitro para modular niveles de una proteína SOCS-3 en dicho método que comprende poner en contacto una célula que contiene un gen SOCS-3 con una cantidad eficaz de un modulador de la expresión del gen SOCS-3 o actividad de la proteína SOCS-3 durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para modular los niveles de dicha proteína SOCS-3.

Un aspecto de la presente invención proporciona un método in vitro para modular la transducción de señales en una célula que contiene un gen SOCS-3, que comprende poner en contacto dicha célula con una cantidad eficaz de un modulador de la expresión del gen SOCS-3 o actividad de la proteína SOCS-3 durante un tiempo suficiente para modular la transducción de señales.

Incluso otro aspecto de la presente invención se refiere a un método in vitro para influir en la interacción entre células, en donde por lo menos una célula lleva un gen SOCS-3, comprendiendo dicho método poner en contacto la célula que lleva el gen SOCS-3 con una cantidad eficaz de un modulador de la expresión del gen SOCS-3 o la actividad de la proteína SOCS-3 durante un tiempo suficiente para modular la transducción de señales.

La invención proporciona además el uso de un modulador de la expresión de un gen SOCS-3, que comprende una secuencia de nucleótidos según se definió previamente en la presente memoria, o la actividad de una proteína SOCS-3 como se definió previamente en la presente memoria, en la elaboración de un medicamento para uso de un modulador de la expresión de un gen SOCS-3 que comprende una secuencia de nucleótidos como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4 a 7, o la actividad de una proteína SOCS-3 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en la elaboración de un medicamento para tratar una afección modulando los niveles de dicha proteína SOCS-3, modulando la transducción de señales o influenciando la interacción entre las células.

De acuerdo con la presente invención, n en [X_{j}]_{n} y [X_{j}]_{n} pueden, además de ser 1-50, estar comprendidos entre 1-30, 1-20, 1-10 y 1-5.

En la Tabla 1 se expone un resumen de las SEC ID NO a las que se hace referencia en la descripción.

TABLA 1 Resumen de números de identificación de secuencias

1

2

\newpage

Se usan abreviaturas de una y tres letras para denotar residuos aminoácidos y éstas se resumen en la Tabla 2.

TABLA 2

3

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Breve descripción de los dibujos

En algunas de las Figuras, las abreviaturas se usan para denotar proteínas SOCS con ciertos motivos de unión. Las proteínas SOCS que contienen repeticiones WD-40 se denominan WSB1-WSB4. Las proteínas SOCS con repeticiones anquirina se denominan ASB1-ASB3.

La Figura 1 es una representación diagramática que muestra la generación de un clon MI insensible a IL-6-por infección retrovírica. El retrovirus RUFneo muestra la posición de sitios de escisión de endonucleasas de restricción marca, el inserto cDNA 4A2 y la posición de las secuencias del cebador PCR.

La Figura 2 es una representación fotográfica de los análisis Southern y Northern. (Paneles izquierdo y central) Método Southern, análisis de DNA genómico del clon 4A2 y un gen M1 infectado control. Se digirió DNA con BamH I, para revelar el número de retrovirus que porta cada clon, y Sac I, para estimular el tamaño del inserto de cDNA retrovírico. Panel izquierdo; sondeado con neo. Panel derecho; sondeado con producto PCR 4A2 digerido con Xho E. (Panel derecho). Análisis Northern de RNA total del clon 4A2 y, un clon M1 infectado con control, con sondeado con producto PCR 4A2 digerido con Xho I Las dos bandas representan transcritos retrovíricos no empalmados y empalmados, resultantes de los sitios donantes y aceptores de empalmes en el genoma retrovírico.

\newpage

La Figura 3 es una representación de la secuencia de nucleótidos y la estructura del gen SOCS1. A. Contexto genómico de SOCS 1 en relación al grupo de genes protamina en el cromosoma murino 16. El número de acceso de este locus es MMPRMGNS (solicitud directa; G. Schlueter, 1995) para el ratón y BTPRMTNP2 para la rata (solicitud directa; G. Schlueter, 1996). B. Secuencia de nucleótidos del SOCS1 cDNA y secuencia de aminoácidos deducida. Las abreviaturas convencionales de una sola letra se usan para la secuencia de aminoácidos y el asterisco indica el codón de terminación. La secuencia de señales de poliadenilación está subrayada. La región codificante se muestra en mayúsculas y la región no traducida se muestra en minúsculas.

La Figura 4 es una representación gráfica de la diferenciación celular en presencia de citocinas. Se usaron cultivos de agar semisólido de células M1 parentales (M1 y M1.mpl) y células M1 que expresan SOCS1 (4A2 y M1.mpl. SOCS1), y se determinó el porcentaje de colonias que se diferenciaban en respuesta a una valoración de 1 mg/ml IL-6 (\medbullet), 100 ng/ml LIF (\lozenge), 1 mg/ml OSM (\square), 100 ng/ml IFN-\gamma (\ding{115}), 500 ng/ml TPO (\medbullet) o 3x10^{-6} M dexametasona (*).

La Figura 5 es una representación fotográfica de citospinas de cultivos líquidos de células M1 parentales (M1 y M1.mpl)) y células M1 que expresan SOCS1 (4A2 y M1.mpl.SOCS1) cultivadas durante 4 días en presencia de 10 ng/ml IL-6 o solución salina. A diferencia de las células parentales M1, las características morfológicas consistentes con la diferenciación de macrófagos no se observan en las células M1 que expresan constitutivamente SOCS1 (4A2 y M1.mpl.SOCS1) cuando se cultivan en IL-6.

La Figura 6 es una representación fotográfica que muestra la inhibición de fosforilación de moléculas de señalización por SOCS1. Se incubaron células M1 parentales (M1 y M1.mpl) y células M1 que expresan SOCS1 (4A2 y M1.mpLSOCS1) en ausencia (-) o presencia (+) de 10 ng/ml de IL-5 durante 4 minutos a 37ºC. Las células se lisaron luego y los extractos o bien inmunoprecipitaron usando anticuerpo anti-ratón gp 130 antes de SDS-PAGE (dos paneles superiores) o se sometieron a electroforesis directamente (dos paneles inferiores). Se sometieron geles a electrotransferencia y los filtros se sondearon luego con anti-fosfotirosina (panel superior), anticuerpo anti-gp130 (segundo panel de arriba), anti-fosfo-STAT3 (segundo panel de abajo) o anti-STAT3 (panel inferior). Las electrotransferencias se visualizaron usando anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y reactivos de quimioluminiscencia potenciada (Enhanced Chemiluminescence o ECL).

La Figura 7 es una representación de extractos de proteínas preparados a partir de (A) células M1 o M1 que expresan SOCS1 (4A2) y células (B) M1.mpl o M1.mpl.SOCS1 incubadas durante 10 min a 37ºC en 10 ml de DME libre de suero que contenía o bien solución salina, 100 ng/ml de IL-6 o 100 ng/ml de IFN-\gamma. Las reacciones de unión contenían 4-6 \mug de proteína (constante dentro de un experimento determinado), 5 ng de oligonucleótido m67 marcado con ^{32}P que codifica el sitio de unión a SIF (factor inducible de c-sis) de gran afinidad) y 800 ng de DNA de esperma de salmón sonicado. Para determinados experimentos, las muestras de proteína se preincubaron con un exceso de oligonucleótido m67 no marcado, o anticuerpos específicos de STAT1 o STAT3.

La Figura 8 es una representación fotográfica de la hibridación Northern. Se inyectaron 2 \mug por vía intravenosa a ratones y, después de varios períodos de tiempo, se extirparon los hígados y se purificó polyA+ mRNA. Se estimularon células M1 durante diversos períodos de tiempo con 500 ng/ml de IL-6, después de lo cual se aisló polyA+ mRNA. El mRNA se fraccionó por electroforesis y se inmovilizó sobre filtros de nylon. Las electrotransferencias Northern se prehibridaron, se hibridaron con SOCS1 marcado con ^{32}P cebado aleatoriamente SOCS1 o fragmentos de GAPDH DNA, se lavaron y se expusieron a una película durante una noche.

La Figura 9 es una representación de una comparación de las secuencias de aminoácidos de SOCS1, SOCS2, SOCS3 y CIS. Alineación de la secuencias de aminoácidos previstas de ratón (mm), ser humano (hs) y rata (rr) SOCS1, SOCS2, SOCS3 y CIS. Los residuos sombreados se conservan en tres o cuatro miembros de la familia SOCS de ratón. El dominio SH2 está encuadrado en líneas continuas, mientras que el SOCS box está unido por líneas
dobles.

La Figura 10 es una representación fotográfica que muestra el fenotipo de clon de células M1 insensibles a IL-6, 4A2. Las colonias de células M1 parentales (panel izquierdo) y el clon 4A2 (panel derecho) se cultivaron en agar semisólido durante 7 días en solución salina o 100 ng/ml de IL-6.

La Figura 11 es una representación fotográfica que muestra la expresión de mRNA para los miembros de la familia SOCS in vitro e in vivo.

(A)

Análisis Northern de mRNA de una gama de órganos de ratón que muestra expresión constitutiva de miembros de la familia SOCS en un número limitado de tejidos.

(B)

Análisis Northern de mRNA de hígado y células M1 que muestra la inducción de la expresión de los miembros de la familia SOCS tras la exposición a BL-5.

(C)

Análisis PCR de transcriptasa inversa de mRNA de médula ósea que muestra la inducción de la expresión de miembros de la familia SOCS por una gama de citocinas.

La Figura 12 es una representación fotográfica que muestra que SOCS1 suprime la fosforilación y activación de gp130 y STAT-3.

\newpage

(A)

Inmunotransferencias de extractos de células M1 parentales (M1 y M1.mpl) y células M1 que expresan SOCS1 (4A2 y M1.mpl.SOCS1) estimuladas con (+) o sin (-) 100 ng/ml de IL-6. Arriba: Extractos inmunoprecipitados con antu-gp130 (\alphagp130) e inmunoelectrotransferidos con anti-fosfotirosina (\alphaPY-STAT3), o para STAT3 (\alphaSTAT3) a fin de demostrar la carga equivalente de la proteína. Los pesos moleculares de las bandas se muestran a la derecha.

(B)

EMSA de células M1.mpl y M1.mpl.SOCS1 estimuladas con (+) y sin (-) 100 ng/ml de IL-6 o 100 ng/ml de IFN\gamma. Los complejos de unión a DNA SIF A, B y C se indican a la izquierda.

La Figura 13 es una representación de una comparación entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas SOCS

(A)

Representación esquemática de estructuras de proteínas SOCS que incluye proteínas que contienen repeticiones WD-40 (WSB) y repeticiones anquirina (ASB). (B) Alineación de regiones N-terminales de proteínas SOCS. (C) Alineación de los dominios SH2 de CIS, SOCS1, 2, 3, 5, 9, 11 y 14. (D) Alineación de las repeticiones WEMO de SOCS4, SOCS6, SOCS13 y SOCS15. (E) Alineación de las repeticiones anquirina de SOCS7 y SOCS10. (F) Alineación de las regiones entre SH2, WD-40 y las repeticiones anquirina y SOCS box. (G) Alineación de SOCS box. En cada caso, se usan las abreviaturas de una sola letra convencionales para aminoácidos, donde X denota residuos de identidad incierta y OOO denota el comienzo y el final de los cóntigos. La secuencia de aminoácidos obtenida de la traducción conceptual derivada de cDNA aislados se muestra en mayúsculas, mientras que la secuencia de aminoácidos obtenida por traducción conceptual de EST se muestra en minúsculas y es aproximada solamente. Los residuos conservados, definidos como (LIVMA), (FYW), (DE), (QN), (C, S, T), (KRH), (PG)están sombreados en el dominio SH2, las repeticiones WD-40, las repeticiones anquirina y SOCS box. Para la alineación de los dominios SH2, las repeticiones WE-40 y las repeticiones anquirina se muestra arriba una secuencia de consenso. En cada caso, ésta deriva del examen de un conjunto grande y diverso de dominios (Neer et al, 1994; Bork, 1993).

Las Figuras 14(A) y (B) son representaciones fotográficas que muestran análisis de expresión de mRNA de SOCS1 y SOCS5 de ratón y SOCS que contiene una repetición WD-40 (WSB2) y repeticiones anquirina (ASB1).

La Figura 15 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos del SOCS4 cDNA de ratón. Los nucleótidos que codifican la región codificante madura del codón de "comienzo" ATG previsto hacia el codón de terminación se muestra en mayúsculas, mientras que las regiones previstas 5' y 3' no traducidas se muestran en minúsculas. La relación de la secuencia cDNA de ratón a cóntigos EST de ratón y humano se ilustra en la Figura 17.

La Figura 16 es una representación que muestra la secuencia de aminoácidos prevista de la proteína SOCS4 de ratón, derivada de la secuencia de nucleótidos en la Figura 15. SOCS box, que también se muestra en la Figura 13, está subrayado.

La Figura 18 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos de cóntigos SOCS4 cDNA humanos h4.1 y h4.2, derivados del análisis de EST que se enumeran en la Tabla 4.1. La relación de estos cóntigos a la secuencia de cDNA de ratón se ilustra en la Figura 17.

La Figura 19 es una representación diagramática que muestra la relación de clones genómicos de SOCS5 de ratón (57-2) y cDNA (5-3-2) a cóntigos derivados del análisis de EST de ratón (Tabla 5.1) y clon de cDNA humano (5-94-2) y EST (Tabla 5.2). La secuencia de nucleótidos del cóntigo SOCS5 de ratón se muestra en la Figura 20, donde la secuencia del cóntigo SOCS5 humano (h5.1) se muestra en la Figura 21. La secuencia de aminoácidos deducida de SOCS5 de ratón se muestra en la Figura 20B. La estructura de la proteína se muestra esquemáticamente, con el dominio SK2 indicado por ( ) y SOCS box por ( ). Las regiones traducidas 5' y 3' putativas se muestran mediante la línea delgada continua.

La Figura 20A es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos del SOCS5 de ratón derivado del análisis de clones genómicos y de cDNA. Los nucleótidos que codifican la región codificante madura del codón de "comienzo" ATG previsto hacia el codón de terminación se muestran en mayúsculas, mientras que las regiones no traducidas 5' y 3' previstas se muestran en minúsculas. La relación de secuencia cDNA de ratón a cóntigos EST de ratón y humano se ilustra en la Figura 29.

La Figura 20B es una representación de la secuencia de aminoácidos prevista de la proteína SOCS5 de ratón, derivada de la secuencia de nucleótidos en la Figura 20A. SOCS box, que se muestra en la Figura 13, está subrayado.

La Figura 21 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos del cóntigo SOCS5 cDNA humano h5.1, derivado del análisis del clon de cDNA 5-94-2 y los EST que se enumeran en la Tabla 5.2. La relación de estos cóntigos a la secuencia de cDNA de ratón se ilustra en la Figura 19.

La Figura 22 es una representación diagramática que muestra la relación de clones SOCS6 cDNA (6-1A, 6-2A, 6-5B, 6-4N, 6-18, 6-29, 6-3N y 6-5N) a cóntigos derivados del análisis de EST de ratón (Tabla 6.1) y EST humanos (Tabla 6.2). La secuencia de nucleótidos del cóntigo SOCS-6 de ratón se muestra en la Figura 23, donde la secuencia de cóntigos SOCS6 humanos (h6.1 y h6.2) se muestra en la Figura 24. La secuencia de aminoácidos deducida de SOCS6 de ratón se muestra en la Figura 23B. La estructura de la proteína se muestra esquemáticamente, mientras que las repeticiones de WD-40 se indican con ( ) y de SOCS box con ( ). Las regiones no traducidas 5' y 3' putativas se muestran mediante la línea delgada continua.

La Figura 23A es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos de SOCS6 derivado del análisis del clon cDNA 64-10A-11. Los nucleótidos que codifican la parte de la región codificante prevista, que finalizan en el codón de terminación, se muestran en mayúsculas, mientras que las regiones no traducidas 3' previstas se muestran en minúscula. La relación de la secuencia de cDNA de ratón a cóntigos EST humanos se ilustra en la Figura 22.

La Figura 23B es una representación que muestra la secuencia de aminoácidos prevista de proteína SOCS6 de ratón, derivadas de la secuencia de nucleótidos en la Figura 23 A. SOCS box, que también se muestra en la Figura 13, está subrayado.

La Figura 24 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos del cóntigo SOCS 6 cDNA h6.1. derivado del análisis del clon de cDNA 5-94-2, y los EST se mencionan en la Tabla 6.2. La relación de estos cóntigos a la secuencia de cDNA de ratón se ilustra en la Figura 22.

La Figura 25 es una representación diagramática que muestra la relación del clon SOCS7 cDNA de ratón (74-10A-11) a cóntigos derivados del análisis de EST de ratón (Tabla 7.1) y EST humanos (Tabla 7.2). La secuencia de nucleótidos del cóntigo SOCS7 de ratón se muestra en la Figura 26 donde la secuencia de cóntigos SOCS7 humanos (h7.1 y h7.2) se muestra en la Figura 27. La secuencia de aminoácidos deducida de SOCS7 de ratón se muestra en la Figura 26B. La estructura de la proteína se muestra esquemáticamente, con las repeticiones anquirina indicadas por
( ) y las SOCS box por ( ). Las regiones no traducidas 5' y 3' putativas se muestran mediante la línea delgada continua en el ratón y mediante la línea ondulada en h.7.2. En base al análisis de los clones aislados hasta la fecha y a los EST, las regiones no traducidas 3' de mSOCS7 y hSOCS7 comparten poca similitud.

La Figura 26A es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos del SOCS7 de ratón derivada del análisis del clon de cDNA 74-10A-11. Los nucleótidos que codifican la parte de la región codificante prevista, finalizando en el codón de terminación, se muestran en mayúsculas, mientras que las regiones no traducidas 3' previstas se muestran en minúsculas. La relación de la secuencia de cDNA de ratón a cóntigos EST de ratón y humano se ilustra en la Figura 25.

La Figura 26B es una representación que muestra la secuencia de aminoácidos prevista de la proteína SOCS7 de ratón, derivada de la secuencia de nucleótidos en la Figura 26A. SOCS box, que también se muestra en la Figura 13, está subrayado.

La Figura 27 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos del cóntigo SOCS7 cDNA humano h7.1 y h7.2 derivado del análisis de los EST enumerados en la Tabla 7.2. La relación de estos cóntigos a la secuencia de cDNA ratón se ilustra en la Figura 25.

La Figura 28 es una representación diagramática de la relación de secuencia derivada del análisis de SOCS8 EST de ratón (Tabla 8.1 y Figura 29 A) a la estructura de proteína provista de SOCS8 de ratón. La secuencia de aminoácidos parcial deducida de SOCS8 ratón se muestra en la Figura 29B. La estructura de la proteína se muestra esquemáticamente con el SOCS box resaltado ( ). La región no traducida 3' prevista se muestra mediante la línea delgada.

La Figura 29A es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos parcial de SOCS8 cDNA de ratón (cóntigo 8.1) derivada del análisis de EST. Los nucleótidos que codifican la parte de la región codificante prevista, que finalizan en el codón de terminación, se muestran en mayúscula, mientras que las regiones no traducidas 3' previstas se muestran en minúscula.

La Figura 29B es una representación que muestra la secuencia de aminoácidos prevista parcial de la proteína SOCSS de ratón, derivada de la secuencia de nucleótidos en la Figura 29A. SOCS box, que también se muestra en la Figura 13, está subrayado.

La Figura 30 es una representación diagramática que muestra la relación de SOCS9 EST de ratón (Tabla 9.1) y SOCS9 EST humanos (Tabla 9.2). La secuencia de nucleótidos del cóntigo SOCS9 de ratón (m9.1) se muestra en la Figura 31, donde la secuencia del cóntigo SOCS9 humano (h9.1) se muestra en la Figura 32. La secuencia de aminoácidos deducida de SOCS9 humano se muestra esquemáticamente, con el dominio SH2 indicado por ( ) y SOCS box por ( ). La región no traducida 3' putativa se muestra mediante la línea delgada continua.

La Figura 31 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos parcial de SOCS9 cDNA de ratón (cóntigo m9.1), derivada del análisis de los EST enumerados en la Tabla 9.1. La relación de estos cóntigos a la secuencia cDNA de ratón se ilustra en la Figura 30.

La Figura 32 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos parcial de SOCS9 cDNA humano (cóntigo h9.1)derivada del análisis de los EST enumerados en la Tabla 9.2. Si bien está claro que el cóntigo h9.1 codifica una proteína con un dominio SH2 y un SOCS box, la calidad de la secuencia no es lo suficientemente alta para derivar un marco de lectura abierto simple inequívoco. La relación de estos cóntigos a la secuencia de cDNA de ratón se ilustra en la Figura 30.

La Figura 33 es una representación que muestra la relación de clones SOCS10 cDNA de ratón (10-9, 10-12, 10-23 y 10-24) a cóntigos derivados del análisis de EST de ratón (Tabla 10.1) y EST humanos (Tabla 10.2). La secuencia de nucleótidos del cóntigo SOCS10 humano se muestra en la Figura 10.2, donde la secuencia de cóntigos SOCS10 humanos (h10.1 y h10.2) se muestra en la Figura 35. La estructura prevista de la proteína se muestra esquemáticamente, con las repeticiones anquirina indicadas por ( ) y SOCS box por ( ). Las regiones no traducidas 3' putativas se muestran mediante la línea delgada continua en el ratón y mediante la línea ondulada en h 10.2. En base a este análisis de los clones aislados hasta la fecha y los EST, las regiones no traducidas 3' de mSOCS-10 y hSOCS-10 comparten poca similitud.

La Figura 34 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos del SOCS 10 de ratón derivada del análisis de los clones de cDNA 10-9, 10-12, 10-23 y 10-24. Los nucleótidos que codifican la parte de la región codificante prevista, que finalizan en el codón de terminación, se muestran en mayúsculas, mientras que las regiones no traducidas 3' previstas se muestran en minúsculas. Si bien está claro que el cóntigo m10.1 codifica una proteína con una serie de repeticiones anquirina y un SOCS box, la calidad de la secuencia no es lo suficientemente alta para derivar un marco de lectura abierto inequívoco simple. La relación de secuencia de cDNA de ratón a cóntigos EST de ratón y humano se ilustra en la Figura 33.

La Figura 35 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos del cóntigo SOCS 10 cDNA humano h10.2 y h10.2 derivado del análisis de los EST mencionados en la Tabla 10.2. La relación de estos cóntigos a la secuencia de cDNA de ratón se ilustra en la Figura 33.

La Figura 36A es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos parcial del SOCS11 cDNA humano derivada del análisis de los EST enumerados en la Tabla 11.1 Los nucleótidos que codifican la región codificante madura del codón de "comienzo" ATG previsto al codón de terminación se muestran en mayúsculas, mientras que las regiones no traducidas 5' y 3' previstas se muestran en minúsculas. La relación de la secuencia de cDNA parcial, derivada de los EST, a la proteína prevista se muestra en la Figura 37.

La Figura 36B es una representación que muestra la secuencia de aminoácidos prevista parcial de la proteína SOCS11 humana, derivada de la secuencia de nucleótidos en la Figura 36A. SOCS box, que también se muestra en la Figura 13, está subrayado.

La Figura 37 es una representación diagramática que muestra la relación de la secuencia derivada del análisis de SOCS-11 EST humanos (Tabla 11.1 y Figura 36A) a la estructura de la proteína prevista de SOCS11 humano. La secuencia de aminoácidos parcial deducida de SOCS11 humano se muestra en la Figura 36B. La estructura de la proteína se muestra esquemáticamente con el dominio SH2 indicado por ( ) y SOCS box resaltado por ( ). La región no traducida 3' prevista se muestra mediante la línea delgada.

La Figura 38 es una representación diagramática que muestra la relación de clones SOCS12 cDNA de ratón (12-1) a cóntigos derivados del análisis de EST de ratón (Tabla 12.1) y EST humanos (Tabla 12.2). La secuencia de nucleótidos del cóntigo SOCS12 de ratón se muestra en la Figura 12.2, donde la secuencia de cóntigos SOCS12 humanos (h12.1 y h12.2) se muestra en la Figura 40. La secuencia de aminoácidos parcial deducida de SOCS12 de ratón se muestra en la Figura 39. La estructura de la proteína se muestra esquemáticamente, con las repeticiones anquirina indicadas por
( ) y SOCS box por ( ). La región no traducida 3' putativa se muestra mediante la línea delgada continua en el ratón y mediante la línea ondulada en h12,2. En base a este análisis de clones aislados hasta la fecha y EST, las regiones no traducidas 3' de mSOCS12 y hSOCS12 comparten poca similitud.

La Figura 39 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos del SOCS12 de ratón derivada del análisis del clon de cDNA 12-1 y los EST que se enumeran en la Tabla 12.1. Los nucleótidos que codifican la parte de la región codificante prevista, incluyendo el codón de terminación, se muestran en mayúsculas, mientras que la región no traducida 3' se muestra en minúsculas. Por homología con SOCS12 humano, está claro que el cóntigo m12.1 codifica una proteína con una serie de repeticiones anquirina y un SOCS box, donde la calidad de la secuencia no es lo suficientemente alta para derivar en un marco de lectura abierto inequívoco simple. La relación de la secuencia de cDNA ratón a cóntigos EST de ratón y humano se ilustra en la Figura 38.

La Figura 40 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos del cóntigo SOCS12 cDNA humano h12.1 y h12.2 derivado del análisis de los EST que se enumeran en la Tabla 12.2. La relación de estos cóntigos a la secuencia cDNA de ratón se ilustra en la Figura 38.

La Figura 41 es una representación diagramática que muestra la relación del cóntigo m13.1 derivado del análisis de los clones SOCS13 cDNA de ratón (62-1, 62-6-7, 62-14) y los EST de ratón (Tabla 13.1) al cóntigo h13.1 derivado del análisis de EST humanos (Tabla 13.2). La secuencia de nucleótidos del cóntigo SOCS 13 de ratón se muestra en la Figura 42, donde la secuencia del cóntigo SOCS13 humano (h13.1) se muestra en la Figura 43. La secuencia de aminoácidos deducida del SOCS13 humano se muestra en la Figura 42B. La estructura de la proteína se muestra esquemáticamente, con las repeticiones WD-40 resaltadas por ( ) y SOCS box resaltado por ( ). La región no traducida 3' se muestra mediante la línea delgada continua.

La Figura 42A es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos del SOCS13 de ratón derivado del análisis de los clones de cDNA 62-1, 62-6-7 y 62-14. Los nucleótidos que codifican parte de la región codificante prevista, finalizando en el codón de terminación, se muestran en mayúsculas, mientras que aquellos que codifican las regiones no traducidas 3' previstas se muestran en minúsculas. La relación de la secuencia de cDNA de ratón a cóntigos EST humanos se ilustra en la Figura 41.

La Figura 42B es una representación que muestra la secuencia de aminoácidos prevista de proteína de SOCS13 ratón, derivada de la secuencia de nucleótidos en la Figura 42 A. SOCS box, que también se muestra en la Figura 13, está subrayado.

La Figura 43 es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos de cóntigo SOCS13 cDNA humano h13.1 derivado del análisis de los EST que se mencionan en la Tabla 13.2. La relación de estos cóntigos a la secuencia de cDNA de ratón se ilustra en la Figura 41.

La Figura 44 es una representación diagramática que muestra la relación de un clon SOCS14 cDNA de ratón (14-1) a cóntigos derivados del análisis de los EST de ratón (Tabla 14.1). La secuencia de nucleótidos del cóntigo SOCS14 de ratón se muestra en la Figura 45. La secuencia de aminoácidos parcial deducida de SOCS 14 de ratón se muestra en la Figura 45B. La estructura de la proteína se muestra esquemáticamente, con el dominio SH3 indicado por ( ) y SOCS box por ( ). La región no traducida 3' putativa se muestra con la línea delgada.

La Figura 45A es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos de SOCS14 de ratón derivada del análisis de clones genómicos y de cDNA. Los nucleótidos que codifican la región codificante madura del codón de "comienzo" previsto al codón de terminación se muestran en mayúsculas, mientras que las regiones no traducidas 5' y 3' previstas se muestran en minúsculas. La relación de la secuencia de cDNA de ratón a cóntigos EST de ratón y humanos se ilustra en la Figura 44.

La Figura 45B es una representación que muestra la secuencia de aminoácidos prevista de la proteína SOCS14 de ratón, derivada de la secuencia de nucleótidos en la Figura 45B. SOCS box, que también se muestra en la Figura 13, está subrayado.

La Figura 46 es una representación diagramática que muestra la relación del cóntigo m15.1 derivado del análisis de BAC de ratón y EST de ratón (Tabla 15.1) al cóntigo h15.1 derivado del análisis del BAC humano y EST humanos (Tabla 15.2). La secuencia de nucleótidos del cóntigo SOCS15 de ratón se muestra en la Figura 47, donde la secuencia del cóntigo SOCS15 humano (h15.1) se muestra en la Figura 47. La secuencia de aminoácidos deducida de SOCS15 de ratón se muestra en la Figura 47B. La estructura de la proteína se muestra esquemáticamente, con las repeticiones WD-40 resaltadas con ( ) y SOCS box resaltado con ( ). Las regiones no traducidas 5' y 3' se muestran mediante la línea delgada continua. Los intrones que interrumpen la región codificante se muestran con ^{\wedge}.

La Figura 47A es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos que cubre el gen SOCS15 de ratón derivado del análisis de BAC de ratón que se enumera en la Tabla 15.1. Los nucleótidos que codifican la región codificante prevista, comenzando con el ATG y finalizando en el codón de terminación, se muestran en mayúsculas, mientras que aquellos que codifican la región no traducida 5', los intrones y la región no traducida 3' se muestran en minúsculas. La relación de BAC de ratón a cóntigos EST de ratón y humanos se ilustra en la Figura 46.

La Figura 47B es una representación que muestra la secuencia de aminoácidos prevista de la proteína SOCS15 de ratón, derivada de la secuencia de nucleótidos en la Figura 47A. SOCS box, que también se muestra en la Figura 13, está subrayado.

La Figura 48A es una representación que muestra la secuencia de nucleótidos que cubre el gen SOCS 15 humano del análisis del BAC humano enumerado en la Tabla 15.2. Los nucleótidos que codifican la región codificante provista, comenzando con el ATG y finalizando en el codón de terminación, se muestran en mayúsculas, mientras que aquellos que codifican la región 5' no traducida prevista, los intrones y la región no traducida 3' se muestran en minúsculas. La relación del BAC humano a los cóntigos EST de ratón y humano se ilustran en la Figura 46.

La Figura 48B es una representación que muestra la secuencia de aminoácidos prevista de la proteína SOCS15 humana, derivada de la secuencia de nucleótidos en la Figura 48 A. SOCS box, que también se muestra en la Figura 13, está subrayado.

La Figura 49 es una representación fotográfica que muestra la inhibición SOCS1 de la actividad de la cinasa JAK2. (A) Panel superior células Cos M6 se transfectaron transitoriamente con mJAK2 marcado con Flag y mSOCS-1 DNA (SOCS1) o Flag-mJAK2 DNA solo (-), se lisaron, las proteínas JAK2 inmunoprecipitaron usando anticuerpo JAK2 y se sometieron a un ensayo de cinasa in vitro. Panel inferior. Una porción de los inmunoprecipitados JAK2 se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpo anti-JAK2. (B) Panel superior. Se transfectaron transitoriamente células Cos M6 con Flag- mJAK2 y Flag- mSOCS-1 DNA o FIag-mJAK2 DNA solo, se lisaron, las proteínas JAK2 inmunoprecipitaron usando anti-JAK2 (UBI) y se separaron por gel SDS/PAGE. Los inmunoprecipitados se analizaron luego por inmunotransferencia con anticuerpo anti-fosfotirosina. Panel inferior; expresión de JAK2. Los lisados de células Cos se separaron por gel SDS/PAGE y se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpo anti-FLAG (M2).

La Figura 50 es una representación fotográfica que muestra la interacción entre JAK2 y la proteína SOCS. (A) Se transfectaron transitoriamente células Cos M6 con mJAK2 marcado con Flag y diversos SOCS DNA marcados con Hag (SOCS-1;S1, SOCS-2;S2, SOCS-3;S3, CIS) o Flag-mJAK2 solo, se lisaron, inmunoprecipitaron las proteínas JAK2 usando anti-JAK2 (UBI) y se separaron por SDS/PAGE. Los inmunoprecipitados se analizaron luego por inmunotransferencia con anticuerpo anti-FLAG (M2). (E) Los lisados de células Cos descritos en (A) se separaron por SDS/PAGE y se determinaron los niveles de expresión de las diversas proteínas por inmunotransferencia con anticuerpo anti-FLAG (M2). (C) Fosforilación de tirosina JAK2. Los lisados de células Cos descritos en (A) se separaron por SDS/PAGE y se analizaron las proteínas por inmunotransferencia con anticuerpo anti-fosfotirosina.

La Figura 51 es una representación diagramática de p\betagalpAloxneo.

La Figura 52 es una representación diagramática de p\betagaipAloxneoTK.

La Figura 53 es una representación diagramática del constructo inactivado SOCS1.

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Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La presente invención se refiere a una nueva familia de moduladores de la transducción de señales. Como los miembros iniciales de la señalización de citocinas suprimidas por esta familia, la familia se denomina "supresores de la señalización de citocinas" o familia "SOCS". La familia SOCS se define por la presencia de un dominio C-terminal denominado "SOCS box". Diferentes clases de moléculas SOCS son definidas por un motivo en general, pero no exclusivamente, ubicado N-terminal al SOCS box y que está implicado por la interacción proteína:molécula como la interacción proteína:DNA o proteína:proteína. Los motivos particularmente preferidos se seleccionan entre un dominio SH2, repeticiones WD-40 y repeticiones anquirina.

Las repeticiones WD-40 fueron originalmente reconocidas en la subunidad B de las proteínas G. Las repeticiones WD-40 parecen formar una estructura de tipo propulsor B y pueden estar implicadas en las interacciones proteína-proteína. Las repeticiones anquirina fueron originalmente reconocidas en la anquirina de la proteína citoesque-
lética.

Los miembros de la familia SOCS pueden identificarse por una gran cantidad de métodos. Por ejemplo, SOCS 1 a SOCS 3 se identificaron por su capacidad de suprimir la transducción de señales mediada por citocinas y, en consecuencia, se identificaron basándose en la actividad. SOCS4 a SOCS 15 se identificaron como secuencias de nucleótidos que exhiben similitud al nivel del SOCS box.

El SOCS box es un motivo conservado ubicado en la región C-terminal de la molécula SOCS. De acuerdo con la presente invención, la secuencia de aminoácidos del SOCS box es:

X_{1} X_{2} X_{3} X_{4} X_{5} X_{6} X_{7} X_{8} X_{9} X_{10} X_{11} X_{12} X_{13} X_{14} X_{15} X_{16} [X_{j}]_{n} X_{17} X_{18} X_{19} X_{20} X_{21} X_{22} X_{23} [X_{j}]_{n} X_{24} X_{25} X_{26} X_{27} X_{28}

en donde:

X_{1} es L, I, V, M, A o P;

X_{2} es cualquier residuo de aminoácidos;

X_{3} es P, T o S;

X_{4} es L, I, V, M, A o P;

X_{5} es cualquier aminoácido;

X_{6} es cualquier aminoácido;

X_{7} es L, I, V, M, A, F, Y o W;

X_{8} es C, T o S;

X_{9} es R, K o H;

X_{10} es cualquier aminoácido;

X_{11} es cualquier aminoácido;

X_{12} es L, I, V, M, A o P;

X_{13} es cualquier aminoácido;

X_{14} es cualquier aminoácido;

X_{15} es cualquier aminoácido;

X_{16} es L, I, V, M, A, P, G, C, T o S;

[X_{j}]_{n} es una secuencia de aminoácidos n en donde n es de 1 a 50 aminoácidos

y en donde la secuencia X_{1} puede comprender los mismos o diferentes aminoácidos seleccionados entre cualquier residuo de aminoácidos;

X_{17} es L, I, V, M, A o P;

X_{18} es cualquier aminoácido;

X_{19} es cualquier aminoácido;

X_{20} L, I, V, M, A o P;

X_{21} es P;

X_{22} es L, I, V, M, A, P o G;

X_{23} es P o N;

[X_{j}]_{n} es una secuencia de aminoácidos n en donde n es 1 a 50 aminoácidos

y en donde la secuencia X_{j} puede comprender los mismos o diferentes aminoácidos seleccionados entre cualquier residuo de aminoácidos;

X_{24} es L, I, V, M, A o P;

X_{25} es cualquier aminoácido;

X_{26} es cualquier aminoácido;

X_{27} es Y o F; y

X_{28} es L, I, V, M, A o P.

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Como se mencionó anteriormente, las proteínas SOCS se dividen en clases separadas en base a la presencia de una región de interacción proteína:molécula como, aunque sin limitación, un dominio SH2, repeticiones WD-40 y repeticiones anquirina ubicadas en N-terminal del SOCS box. Los últimos tres dominios son dominios de interacción proteína:proteína.

Los ejemplos de SH2 que contienen proteínas SOCS incluyen SOCS1, SOCS2, SOCS3, SOCS5, SOCS9, SOCS11 y SOCS14. Los ejemplos de SOCS que contienen repeticiones WD-40 incluyen SOCS4, SOCS6 y SOCS15. Los ejemplos de SOCS que contienen repeticiones anquirina incluyen SOCS7, SOCS10 y SOCS12.

La presente invención provee, entre otros, moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas SOCS-3, proteínas SOCS-3 naturales modificadas como también formas recombinantes de proteínas SOCS-3 y métodos para modular la transducción de señales modulando la actividad de las proteínas SOCS-3 o la expresión de genes SOCS-3. Preferiblemente, la transducción de señales está mediada por una citocina, cuyos ejemplos incluyen EPO, TPO, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-2, IL-4, IL-7, IL-13, IL-6, LIF, IL-I2, IFN\gamma, TNF\alpha, IL-1 y/o M-CSF. Las citocinas particularmente preferidas incluyen OSM, IL-6 y LIF.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o complementa una secuencia que codifica, una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO 5 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70% de similitud con la SEC ID NO 8, en donde dicha proteína comprende un SOCS box en su región C-terminal y modula la transducción señales. Opcionalmente, la proteína puede incluir un dominio de interacción proteína:molécula N-terminal del SOCS box.

Preferiblemente, el domino de interacción proteína:molécula es un domino de interacción proteína:DNA o proteína:proteína. Lo más preferiblemente, el dominio de interacción proteína:molécula es un domino SH2.

Como se mencionó anteriormente, preferiblemente el sujeto SOCS modula la transducción de señales mediada por citocinas. La presente invención se extiende, no obstante, a moléculas SOCS que modulan la transducción de señales mediada por efectores como por otras moléculas endógenas o exógenas, antígenos, microbios y otros productos microbianos, virus o sus componentes, iones, hormonas y parásitos. Las moléculas endógenas en este contexto son moléculas producidas dentro de la célula que portan la molécula SOCS. Las moléculas exógenas son producidas por otras células o introducidas en el organismo.

La molécula de ácido nucleico o la proteína SOCS están en forma aislada o purificada. Los términos "aislada" y "purificada" significan que una molécula ha sido sometida a por lo menos una etapa de purificación de otro mate-
rial.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico está en forma aislada y es DNA tal como cDNA o DNA genómico. El DNA puede codificar la misma secuencia de aminoácidos como el SOCS natural, o el SOCS puede contener una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos puede corresponder a la secuencia codificante genómica (incluyendo exones e intrones) o a la secuencia de nucleótidos en cDNA de mRNA transcrito del gen genómico o puede portar una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones de nucleóti-
dos.

En una realización preferida, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEC ID NO NO:7 (mSOCS3) o una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 70% de similitud con la SEC ID NO:7 o una molécula de ácido nucleico capaz de hibridarse a la SEC ID NO:7 bajo condiciones de rigurosidad del medio a 42ºC.

La referencia en esta memoria a una baja rigurosidad a 42ºC incluye y abarca entre por lo menos aproximadamente 1% v/v y por lo menos aproximadamente 15% v/v formamida y entre por lo menos aproximadamente 1M y por lo menos aproximadamente 2M sal para hibridación y por lo menos aproximadamente 1M (o por lo menos aproximadamente 2M sal para condiciones de lavado. Las condiciones de rigurosidad alternativas pueden aplicarse, si es necesario, como rigurosidad del medio, lo que incluye y abarca entre por lo desde aproximadamente 16% v/v hasta por lo menos aproximadamente 30% v/v formamida y desde por lo menos aproximadamente 0,5M hasta por lo menos aproximadamente 0,9M sal para hibridación, y por lo menos desde aproximadamente 0,5M hasta por lo menos aproximadamente 0,9M sal para condiciones de lavado, o alta rigurosidad, lo que incluye y abarca desde por lo menos aproximadamente 31% v/v hasta por lo menos aproximadamente 50% v/v formamida y desde por lo menos aproximadamente 0,01M hasta por lo menos aproximadamente 0,15M sal para hibridación, y por lo menos desde aproximadamente 0,01M hasta por lo menos aproximadamente 0,15M sal para condiciones de lavado.

El porcentaje de similitudes de nucleótidos preferido incluye por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90% o más, como 93%, 95%, 98% o 99%.

Las similitudes de aminoácidos preferidas incluyen por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97% o 98% o más.

La similitud se puede medir contra una molécula entera o una región que comprende por lo menos 21 nucleótidos o por lo menos 7 aminoácidos. Preferiblemente, la similitud se mide en una región conservada tal como el dominio SH2 u otros dominios de interacción proteína:molécula o un SOCS box.

El término "similitud" incluye identidad exacta entre secuencias o, si la secuencia difiere, diferentes aminoácidos se relacionan entre sí en los niveles estructurales, funcionales, bioquímicos y/o conformacionales.

La molécula de ácido nucleico se puede aislar de cualquier animal tal como seres humanos, primates, ganado (p. ej., caballos, vacas, oveja, burros, cerdos), animales de laboratorio (p. ej., ratones, ratas, conejos, hámsteres, cobayos), animales de compañía (p. ej., perros, gatos) o animales salvajes en cautiverio (p. ej., ciervos, lobos, cangu-
ros).

Los términos "derivados" o su forma singular "derivado", o bien se en relación con una molécula de ácido nucleico o una proteína, incluyen partes, mutantes, fragmentos y análogos como también híbridos o moléculas de fusión y variantes de glucosilación. Los derivados incluidos dentro del alcance de la presente invención se definen en las reivindicaciones por referencia al % de similitud de secuencia o por referencia a hibridación. Los derivados particularmente útiles comprenden sustituciones, deleciones y/o adiciones a la secuencia de aminoácidos SOCS sencillas o
múltiples.

Un derivado tiene actividad funcional o, alternativamente, actúa como antagonista o agonista.

Los homólogos de SOCS incluyen la molécula funcional o estructuralmente relacionada de diferentes especies animales. Los homólogos y análogos incluidos dentro de la presente invención son aquellos definidos en las reivindicaciones por referencia al % de similitud de secuencia o por referencia a la hibridación.

Como se indicó anteriormente, la presente invención contempla antagonistas de SOCS-3 que consisten en secuencias de oligonucleótidos antisentido. Los oligonucleótidos útiles son aquellos que tienen una secuencia de nucleótidos complementaria a por lo menos una porción de la secuencia codificante de proteínas o "sentido" de la secuencia de nucleótidos. Estos nucleótidos antisentido se pueden usar para efectuar la inhibición específica de la expresión de genes. El planteamiento antisentido puede causar la inhibición de la expresión de genes aparentemente formando un dúplex antiparalelo por apareamiento de bases complementarias entre el constructo antisentido y el mRNA direccionado, presumiblemente dando como resultado la interrupción de la hibridación en la traducción. También pueden utilizarse ribozomas y las moléculas de co-supresión. Puede que primero sea necesario modificar químicamente las moléculas antisentido y de otros ácidos nucleicos para permitir la penetración de membranas celulares y/o aumentar su semivida en suero o hacerla más estable para administración in vivo. Los anticuerpos pueden también actuar como antagonistas o agonistas aunque son más útiles en aplicaciones diagnósticas o en la purificación de proteínas SOCS. Los antagonistas y agonistas pueden también identificarse con el cribado de productos naturales o el cribado de colecciones de compuestos químicos, o pueden ser derivados o análogos de las moléculas
SOCS.

Se pueden usar análogos de las proteínas SOCS, por ejemplo, en el tratamiento o la profilaxis de disfunciones mediadas por citocinas, como autoinmunidad, inmunosupresión o inmunidad hiperactiva u otra afección que incluya, aunque sin limitación, disfunciones en los sistemas hematopoyético, endocrino, hepático y neural. Disfunciones mediadas por otros elementos de transducción de señales tales como hormonas o moléculas endógenas o exógenas, antígenos, microbios y productos microbianos, virus o sus componentes, hormonas y parásitos.

Los análogos de las proteínas que se contemplan en la presente memoria incluyen, aunque sin limitación, modificación de cadenas laterales, incorporación de aminoácidos sintéticos y/o sus derivados durante la síntesis de péptidos, polipéptidos o proteínas y el uso de reticulantes y otros métodos que imponen restricciones conformacionales sobre la molécula proteinácea o sus análogos.

Los ejemplos de modificaciones de cadenas laterales contempladas por la presente invención incluyen modificaciones de grupos amino tal como por alquilación reductora por reacción con un aldehído seguida de reducción con NaBH_{4}; amidinación con metilacetimidato; acilación con anhídrido acético; carbamoilación de grupos amino con cianato; trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2, 4, 6-trinitrobencenosulfónico (TNBS); acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y piridoxilación de lisina con piridoxal-5-fosfato seguida de reducción con NaBH_{4}.

El grupo guanidina de residuos arginina puede modificarse por la formación de productos de condensación heterocíclicos con reactivos tales como 2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.

El grupo carboxilo puede modificarse por activación de carbodiimida vía formación de O-acilisourea seguida de derivatización subsiguiente, por ejemplo, a una amida correspondiente.

Los grupos sulfidrilo pueden modificarse por métodos como la carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; oxidación de ácido perfórmico a ácido cisteico; formación de disulfuros mixtos con otros compuestos tiol; reacción con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida sustituida; formación de derivados de mercurio usando 4-cloromercuribenzoato, ácido 4-cloromercurifenilsulfónico, cloruro de fenilmercurio, 2-cloromercuri-4-nitrofenol y otros derivados de mercurio; carbamoilación con eyenato a pH alcalino.

Los residuos triptófano pueden modificarse, por ejemplo, por oxidación con N-bromosuccinimida o alquilación del anillo indol con bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros de sulfenilo.

Los residuos tirosina, por otra parte, pueden alterarse por nitración con tetranitrometano para formar un derivado 3-nitrotirosina.

La modificación del anillo imidazol de un residuo histidina puede lograrse por alquilación con derivados de ácido yodoacético o N-carbetoxilación con dietilpirocarbonato.

Los ejemplos de incorporación de aminoácidos sintéticos y derivados durante la síntesis de péptidos incluyen, aunque sin limitación, el uso de norleucina, ácido 4-aminobutírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico, ácido 6-aminohexanoico, t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, omitina, sarcosina, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico, 2-tienil alanina y/o isómeros D de aminoácidos. En la Tabla 3 se expone una lista de los aminoácidos sintéticos contemplados en la presente memoria.

TABLA 3

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5

6

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Se pueden usar reticulantes, por ejemplo, para estabilizar las conformaciones 3D, usando reticulantes homobifuncionales tales como imidoésteres bifuncionales que tienen grupos espaciadores (CH_{2})_{n} con n=1 a n=6, glutaraldehído, ésteres N-hidroxisuccinimida y reactivos heterobifuncionales que usualmente contienen un resto aminorreactivo tal como N-hidroxisuccinimida y otro resto reactivo específico de grupo tal como maleimido o ditio (SH) o carbodiimida (COOH). Además, los péptidos pueden restringirse conformacionalmente, por ejemplo, por incorporación de ácidos C_{\alpha} y N_{\alpha}-metilamino, introducción de dobles enlaces entre átomos C_{\alpha} y C_{\beta} de aminoácidos y formación de péptidos cíclicos o análogos por introducción de enlaces covalentes, como formando un enlace amida entre los términos N y C, entre dos cadenas laterales o entre una cadena lateral y el término N o C.

Estos tipos de modificaciones pueden ser importantes para estabilizar las citocinas, si se administran a un individuo o para uso como reactivo diagnóstico.

Otros derivados incluyen una gama de variantes de glucosilación de una molécula completamente sin glucosilar a una molécula glucosilada modificada. Las características de glucosilación alterada pueden producirse por la expresión de moléculas recombinantes en diferentes células hospedantes.

Un método para modular la expresión de una proteína SOCS en un mamífero puede comprender poner en contacto un gen que codifica un SOCS o un factor/elemento implicado en controlar la expresión del gen SOCS con una cantidad eficaz de un modulador de la expresión de SOCS durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para aumentar o disminuir o de otro modo modular la expresión de SOCS. Un ejemplo de un modulador es una citocina tal como IL-6 u otros reguladores de transcripción de la expresión SOCS.

La expresión incluye transcripción, traducción o ambas.

Un método para modular la actividad de SOCS en un ser humano puede comprender administrar a dicho mamífero una cantidad moduladora eficaz de una molécula por un tiempo y bajo condiciones suficientes para aumentar o disminuir la actividad de SOCS. La molécula puede ser una molécula proteinácea o una entidad química y puede además ser un derivado de SOCS o un análogo químico o mutante de truncación de SOCS.

Un método para inducir la síntesis de SOCS o la transcripción/traducción de SOCS puede comprender poner en contacto una célula que contiene un gen SOCS con una cantidad eficaz de una citocina capaz de inducir dicho SOCS por un tiempo y bajo condiciones suficientes para que se produzca dicho SOCS. Por ejemplo, SOCS1 puede inducirse por IL-6.

Un método para modular los niveles de una proteína SOCS en una célula puede comprender poner en contacto una célula que contiene un gen SOCS con una cantidad eficaz de un modulador de expresión del gen SOCS o actividad de la proteína SOCS durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para modular los niveles de dicha proteína SOCS.

Un método para modular la transducción de señales en una célula que contiene un gen SOCS puede comprender poner en contacto dicha célula con una cantidad eficaz de un modulador de expresión del gen SOCS o actividad de la proteína SOCS durante un tiempo suficiente para modular la transducción de señales.

Un método para influenciar la interacción entre las células, en donde por lo menos una célula porta un gen SOCS, puede comprender poner en contacto la célula que porta el gen SOCS con una cantidad eficaz de un modulador de la expresión del gen SOCS o la actividad de la proteína SOCS durante un tiempo suficiente para modular la transducción de señales.

Una gama de miméticos o moléculas pequeñas pueden ser capaces de actuar como agonistas o antagonistas de SOCS. Dichas moléculas pueden obtenerse a partir del cribado de productos naturales como coral, tierra, vegetales o el océano u entornos antárticos. Alternativamente, se pueden cribar fácilmente colecciones de péptidos, polipéptidos o proteínas o quimiotecas. Por ejemplo, las células Ml que expresan SOCS no se someten a diferenciación en presencia de IL-6. Este sistema se puede usar para cribar moléculas que permiten la diferenciación en presencia de IL-6 y SOCS. Se pueden preparar una diversidad de células de ensayo para cribar antagonistas y agonistas para una diversidad de citocinas. Dichas moléculas son preferiblemente moléculas pequeñas y pueden ser de origen de aminoácidos o de origen químico. Las moléculas SOCS que interactúan con las proteínas de señalización (p. ej., JAKS) proporcionan cribados moleculares para detectar moléculas que interfieren o promueven esta interacción. Uno de dichos protocolos de cribado implica el cribado de productos naturales.

Por consiguiente, la presente invención contempla una composición farmacéutica que comprende una proteína SOCS-3 como se definió precedentemente o un modulador de la expresión de SOCS-3 o la actividad de SOCS-3 y uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Se hace referencia a estos componentes como los "ingredientes activos".

Las formas farmacéuticas que contienen ingredientes activos adecuados para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (solubles en agua) polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles. Debe ser estable bajo las condiciones de elaboración y conservación, y debe preservarse de la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), sus mezclas adecuadas, y aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, con el uso de un recubrimiento como licitina, con el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y con el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede efectuar mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede realizar mediante el uso en las composiciones de agentes que demoran la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente adecuado con varios de los otros ingredientes ya enumerados, según se requiera, y luego por esterilización filtrada. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son las técnicas de secado a vacío y liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de su solución previamente filtrada estéril.

Cuando los ingredientes activos se protegen adecuadamente, pueden administrarse oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden encerrarse en cápsulas de gelatina dura o blanda, o comprimirse en comprimidos. Para administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en la forma de comprimidos para ingerir, comprimidos bucales, pastillas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Dichas composiciones y preparaciones deben contener por lo menos 1% en peso del compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede, desde ya, variar y puede estar comprendido convenientemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 80% del peso de la unidad. La cantidad de compuesto activo en dichas composiciones terapéuticamente útiles deberá proporcionar una dosis adecuada. Las composiciones o preparaciones preferidas de acuerdo con la presente invención se preparan de modo que una forma unitaria de dosificación oral contiene entre aproximadamente 0,1 \mug 2000 mg del compuesto activo.

Los comprimidos, pastillas, píldoras, cápsulas y similares pueden también contener los componentes mencionados a continuación. Un aglutinante, como goma, goma arábiga, almidón de maíz o gelatina; excipientes como fosfato dicálcico; un agente disgregante como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante como estearato de magnesio; y puede agregarse un edulcorante como sacarosa, lactosa o sacarina o un saporífero como menta piperita, aceite de gaulteria o saborizante de cereza. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo mencionado anteriormente, un vehículo líquido. Pueden estar presentes diversos otros materiales como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden estar recubiertos con goma laca, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, una tintura y saporífero como saborizante de cereza o naranja. Desde ya, todo el material utilizado en la preparación de cualquier forma unitaria de dosificación debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto(s) activo puede incorporarse en preparaciones y formulaciones de liberación controlada.

La presente invención también se extiende a formas adecuadas para aplicación tópica, como cremas, lociones y geles.

Los vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de retardo isotónicos y de absorción, y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas se conoce en la técnica. Excepto que algún medio o agente sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar ingredientes activos complementarios a las composiciones.

Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma unitaria de dosificación utilizada en la presente memoria se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se han de tratar; donde cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las nuevas formas unitarias de dosificación de la invención son dictadas por y dependen directamente de (a) las características únicas del material activo y el efecto terapéutico particular que se ha de lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de mezclado, como el material activo para el tratamiento de enfermedades en sujetos vivos que tienen una afección en la que la salud del organismo está debilitada como se describe en detalle en este documento.

El ingrediente activo principal se mezcla para administración conveniente y eficaz en cantidades eficaces con un vehículo farmacéuticamente aceptable en forma unitaria de dosificación, como se describió anteriormente en la presente memoria. Una forma de dosificación unitaria puede contener, por ejemplo, el compuesto activo principal en cantidades en el intervalo de 0,5 \mug a aproximadamente 2000 mg. Expresado en proporciones, el compuesto activo en general está presente entre aproximadamente 0,5 \mug y aproximadamente 2000 mg/ml de vehículo. En el caso de composiciones que contengan ingredientes activos complementarios, las dosificaciones se determinarán por referencia a la dosis y el modo usuales de administración de dichos ingredientes. La cantidad eficaz puede también expresarse convenientemente en términos de una cantidad por kg de peso corporal. Por ejemplo, pueden administrarse entre aproximadamente 0,01 ng y aproximadamente 10.000 mg/kg de peso corporal.

La composición farmacéutica puede también comprender moléculas genéticas como un vector capaz de transfectar células diana, en donde el vector porta una molécula de ácido nucleico capaz de modular la expresión de SOCS o la actividad de SOCS. El vector puede, por ejemplo, ser un vector vírico, en este sentido, la invención permite una serie de terapias génicas que incluyen aislar ciertas células, manipular genéticamente y retornar la célula al mismo sujeto o a un sujeto similar o genéticamente relacionado.

Incluso otro aspecto de la presente invención se refiere a anticuerpos para SGCS-3 y sus derivados. Dichos anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden seleccionarse entre anticuerpos naturales para SOCS-3 o pueden elevarse específicamente para SOCS-3 o sus derivados. En el último caso, puede ser necesario asociar primero SOCS-3 o sus derivados con una molécula vehículo. Los anticuerpos y/o SOCS-3 recombinante o sus derivados de la presente invención son particularmente útiles como agentes terapéuticos o diagnósticos.

Por ejemplo, se pueden usar SOCS y sus derivados para cribar anticuerpos naturales para SOCS. Éstos pueden ocurrir, por ejemplo, en algunas enfermedades autoinmunitarias. Alternativamente, se pueden usar anticuerpos específicos para cribar SOCS. Las técnicas para dichos ensayos se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, ensayos en sándwich y ELISA. El conocimiento de los niveles de SOCS puede ser importante para el diagnóstico de determinados tipos de cáncer o una predisposición a ciertos tipos de cáncer o para vigilar la sensibilidad celular mediada por citocinas o para controlar determinados protocolos terapéuticos.

Los anticuerpos para SOCS-3 de la presente invención pueden ser monoclonales o policlonales. Alternativamente, se pueden usar fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab. Asimismo, la presente invención se extiende a anticuerpos recombinantes y sintéticos y a híbridos de anticuerpos. En la presente memoria, se considera que un "anticuerpo sintético" incluye fragmentos e híbridos de anticuerpos. Los anticuerpos de este aspecto de la presente invención son particularmente útiles para inmunoterapia y pueden además usarse como una herramienta de diagnóstico para evaluar la apoptosis o controlar el programa de un régimen terapéutico.

Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos específicos para cribar proteínas SOCS. Esto último sería importante, por ejemplo, como medio para cribar niveles de SOCS en un extracto celular u otro fluido biológico o para purificar SOCS elaborados por medios recombinantes a partir de fluido sobrenadante de cultivo. Las técnicas para los ensayos contemplados aquí se conocen en el campo e incluyen, por ejemplo, ensayos en sándwich y ELISA.

Está dentro del alcance de la presente invención incluir cualquier anticuerpo secundario (monoclonal, policlonal o fragmentos de anticuerpos o anticuerpos sintéticos) dirigidos a los primeros anticuerpos mencionados que se analizaron anteriormente. Tanto el primero como el segundo anticuerpo se pueden usar en ensayos de detección con un anticuerpo de anti-inmunoglobulina disponible en el mercado. Un anticuerpo contemplado en esta invención incluye cualquier anticuerpo específico para cualquier región de SOCS-3.

Tanto los anticuerpos policlonales como los monoclonales se obtienen por inmunización con la enzima o proteína y cualquier tipo se puede utilizar para inmunoensayos. Los métodos para obtener ambos tipos de suero se conocen en la técnica. Los sueros policlonales se prefieren en menor medida pero se preparan en un modo relativamente fácil por inyección a un animal de laboratorio adecuado con una cantidad eficaz de SOCS, o sus partes antigénicas, recogiendo el suero del animal, y aislando sueros específicos mediante cualquier técnica inmunoadsorbente conocida. Si bien los anticuerpos producidos por este método se pueden utilizar prácticamente en cualquier tipo de inmunoensayo, en general se ven menos favorecidos debido a la heterogeneidad potencial del producto.

El uso de anticuerpos monoclonales en un inmunoensayo se prefiere particularmente debido a la capacidad de producirlos en grandes cantidades y a la homogeneidad del producto. La preparación de líneas celulares de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales derivada condensando una línea celular inmortal y linfocitos sensibilizados contra la preparación inmunogénica se puede realizar por técnicas conocidas para los expertos en el campo.

Otro aspecto de la presente invención contempla un método para detectar SOCS-3 en una muestra biológica de un sujeto, donde dicho método comprende poner en contacto dicha muestra biológica con un anticuerpo específico para SOCS-3, según se define en este documento, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que se forme un complejo anticuerpo-SOCS-3, y luego detectar dicho complejo.

La presencia de SOCS se puede lograr en una diversidad de formas, como por procedimientos de inmunotransferencia y ELISA. Existe una diversidad de técnicas de inmunoensayo, como se puede observar por referencia a las patentes estadounidenses No 4.016.043, 4.424.279 y 4.018.653. Éstas, por supuesto, incluyen ensayos en un solo sitio y en dos sitios o "sándwich" de los tipos no competitivos, como también los ensayos de unión competitivos tradicionales. Estos ensayos también incluyen la unión directa de un anticuerpo no marcado a una diana.

Los ensayos sándwich están entre los más útiles y comúnmente utilizados, y se prefieren para uso en la presente invención. Existe una serie de variaciones de la técnica del ensayo sándwich, y todas esas variaciones tienen como fin incluirse dentro de la presente invención. En síntesis, en un ensayo directo típico, se inmoviliza un anticuerpo no marcado sobre un sustrato sólido, y la muestra a ensayar se pone en contacto con la molécula unida. Después de un período adecuado de incubación, durante un período de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo anticuerpo-antígeno, se añade luego y se incuba un segundo anticuerpo específico al antígeno, marcado con una molécula indicadora capaz de producir una señal detectable, dejando un tiempo suficiente para la formación de otro complejo anticuerpo-anticuerpo marcado con antígeno. Se elimina todo el material sin reaccionar, y se determina la presencia del antígeno por observación de una señal producida por la molécula indicadora. Los resultados pueden ser o bien cualitativos, por simple observación de la señal visible, o pueden cuantificarse comparando con una muestra control que contiene cantidades conocidas de hapteno. Las variaciones en el ensayo directo incluyen un ensayo simultáneo, en donde tanto la muestra como el anticuerpo marcado se añaden simultáneamente al anticuerpo unido. El experto en la materia conoce bien estas técnicas y cualquiera de sus variaciones menores que serán obvias. Según la presente invención, la muestra es una que podría contener SOCS, p. ej., extracto celular, biopsia de tejido o posiblemente suero, saliva, secreciones mucosas, linfa, líquido intersticial y fluido respiratorio. La muestra es, por lo tanto, en general una muestra biológica que comprende fluido biológico pero además se extiende a fluido de fermentación y fluido sobrenadante tal como aquel proveniente de un cultivo celular.

En el típico ensayo sándwich directo, un primer anticuerpo que tiene especificidad para el SOCS o sus partes antigénicas, se une covalente o pasivamente a una superficie sólida. La superficie sólida es típicamente vidrio o un polímero, siendo los polímeros más comúnmente utilizados celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. Los soportes sólidos pueden tener la forma de tubos, esferas, discos de microplacas, o cualquier otra superficie adecuada para llevar a cabo un inmunoensayo. Los procedimientos de unión se conocen en la técnica y en general consisten en reticular, unir covalentemente o adsorber físicamente, donde el complejo polímero-anticuerpo se lava para preparar la muestra de ensayo. Se añade luego una alícuota de la muestra que se ha de ensayar al complejo en fase sólida y se incuba durante un período de tiempo suficiente (p. ej., 2-40 minutos o durante una noche, si resulta más conveniente) y bajo condiciones adecuadas (p. ej., temperatura ambiente hasta 37ºC) para permitir la unión de cualquier subunidad presente en el anticuerpo. Después del período de incubación, la fase sólida de la subunidad de anticuerpo se lava, se seca y se incuba con un segundo anticuerpo específico para una porción del hapteno. El segundo anticuerpo está unido a una molécula indicadora que se usa para indicar la unión del segundo anticuerpo al hapteno.

Un método alternativo implica inmovilizar las moléculas diana en la muestra biológica y luego exponer la diana inmovilizada a un anticuerpo específico que puede o no estar marcado con una molécula indicadora. Dependiendo de la cantidad de diana y la potencia de la señal de la molécula indicadora, una diana unida puede ser detectable por marcado directo con el anticuerpo. Alternativamente, un segundo anticuerpo marcado, específico para el primer anticuerpo, se expone al complejo diana-primer anticuerpo para formar un complejo terciario diana-primer anticuerpo-segundo anticuerpo. El complejo se detecta por la señal emitida por la molécula indicadora.

Por "molécula indicadora", como se usa en la presente memoria, se entiende una molécula que, por su naturaleza química, provee una señal analíticamente identificable que permite la detección del anticuerpo unido a antígeno. La detección puede ser cualitativa o cuantitativa. Las moléculas indicadoras más comúnmente utilizadas en este tipo de ensayo son moléculas que contienen radionúclidos, enzimas o fluoróforos (es decir, radioisótopos) y moléculas quimiluminiscentes.

En el caso de un inmunoensayo enzimático, se conjuga una enzima al anticuerpo secundario, en general mediante glutaraldehído o peryodato. Como se reconocerá fácilmente, no obstante, existe una amplia variedad de técnicas de conjugación diferentes, que están fácilmente disponibles para el experto en la técnica. Las enzimas comúnmente utilizadas incluyen peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina, entre otras. En general, para la producción se eligen los sustratos que se usarán con las enzimas específicas, tras hidrólisis por la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen fosfatasa alcalina y peroxidasa. También es posible emplear sustratos fluorogénicos, que proporcionan un producto fluorescente en lugar de los sustratos cromogénicos mencionados anteriormente. En todos los casos, el anticuerpo marcado con enzima se añade al primer complejo de hapteno anticuerpo, se deja que se una y luego se elimina el exceso de reactivo. Se añade luego una solución que contiene el sustrato adecuado al complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo. El sustrato reaccionará con la enzima unida al segundo anticuerpo, proporcionando una señal visual cualitativa, que puede cuantificarse, usualmente espectrofotométricamente, para dar una indicación de la cantidad de hapteno que estuvo presente en la muestra. "Molécula indicadora" se extiende también al uso de aglutinación celular o inhibición de aglutinación como glóbulos rojos en esferas de látex, y similares.

Alternativamente, los compuestos fluorescentes, como fluoresceína y rhodamina, pueden acoplarse químicamente a anticuerpos sin alterar su capacidad de unión. Cuando se activa por iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo adsorbe la energía de la luz, induciendo un estado para excitabilidad en la molécula, seguido de emisión de la luz a un color característico visualmente detectable con un microscopio de luz. Como en el EIA, el anticuerpo marcado fluorescente se deja unir al complejo de primer anticuerpo-hapteno. Después de eliminar el reactivo no unido, el complejo terciario restante se expone luego a la luz de la longitud de onda adecuada, la fluorescencia observada indica la presencia del hapteno de interés. La inmunofluorescencia y las técnicas EIA están ambas bien consolidadas en el campo y se prefieren particularmente para este método. No obstante, se pueden emplear también otras moléculas indicadoras, como radioisótopos, moléculas quimiluminiscentes o bioluminiscentes.

Los ensayos genéticos como los que implican análisis PCR se pueden usar para detectar el gen SOCS o sus derivados. Los métodos alternativos o los métodos utilizados en conjunto incluyen secuenciación de nucleótidos directa o barrido de mutaciones, como análisis de polimorfismos de conformación monocatenaria (SSCP) como hibridación de oligonucleótidos específicos, como también métodos tales como ensayos directos de truncación de proteínas.

Dado que las citocinas están implicadas en la transcripción de algunas moléculas SOCS, la detección de SOCS proporciona marcadores sustitutos para citocinas o actividad de citocinas. Esto puede ser útil para evaluar sujetos con una diversidad de condiciones, como aquellos con enfermedades autoinmunitarias, por ejemplo, artritis reumatoidea, diabetes y síndrome del hombre rígido, entre otras.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser DNA o RNA. Cuando la molécula de ácido nucleico está en forma de DNA, puede ser DNA genómico o cDNA. Las formas RNA de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención son en general mRNA.

Si bien las moléculas de ácido nucleico de la presente invención en general están en forma aislada, pueden estar integradas o ligadas o de otro modo condensadas o asociadas a otras moléculas genéticas como moléculas de vectores y, en particular, moléculas de vectores de expresión. Los vectores y los vectores de expresión son en general capaces de replicación y, si corresponde, de expresión en una o ambas entre una célula procariótica y una célula eucariótica. Preferiblemente, las células procarióticas incluyen E. coli, Bacillus sp y Pseudamonas sp. Las células eucarióticas preferidas incluyen células de levadura, hongos, mamíferos e insectos.

Por consiguiente, un constructo genético puede comprender una porción de vector y una porción de un mamífero, y más particularmente una porción del gen SOCS humano, en donde la porción del gen SOCS es capaz de codificar un polipéptido SOCS o su derivado funcional o inmunológicamente interactivo.

Preferiblemente, la porción del gen SOCS del constructo genético está operativamente unida a un promotor en el vector de modo tal que dicho promotor es capaz de dirigir la expresión de dicha porción del gen SOCS en una célula adecuada.

Además, la porción del gen SOCS del constructo genético puede comprender todo o parte del gen condensado a otra secuencia genética tal como una secuencia de nucleótidos que codifica glutatión-S-transferasa o parte de ésta.

Dichos constructos genéticos pueden estar contenidos en células procarióticas o eucarióticas.

Los SOCS y su secuencia genética, como se describe en este documento, serán útiles en la generación de una gama de reactivos terapéuticos y diagnósticos, y serán especialmente útiles en la detección de una citocina implicada en una respuesta celular particular o un receptor de esa citocina. Por ejemplo, las células que expresan el gen SOCS, como las células M1 que expresan el gen SOCS1, ya no serán sensibles a una citocina particular tal como, en el caso de SOCS1, la IL-5. La presente invención contempla células tales como M1 que expresan un gen SOCS-3 tal como se define en esta memoria. Se pueden usar moléculas que regulen o potencien la capacidad de las citocinas terapéuticas. Por ejemplo, las moléculas que bloquean cierta actividad de SOCS pueden actuar como actividad de citocinas terapéuticas potenciales (p. ej., G-CSF).

Los polipéptidos SOCS solubles pueden ser también particularmente útiles en el tratamiento de enfermedades, lesiones o anomalías que impliquen sensibilidad celular mediada por citocinas, como hiperinmunidad, inmunosupresión, alergias, hipertensión y similares.

Otro aspecto de la presente invención contempla el uso de SOCS-3, como se definió anteriormente en esta memoria, en la elaboración de medicamento para el tratamiento de afecciones que implican sensibilidad celular mediada por citocinas.

La presente invención contempla también células mamíferas transgénicas que expresan un gen SOCS-3 como se definió precedentemente. Dichas células son líneas celulares indicadoras útiles para ensayar la función de supresión de las citocinas. Un ejemplo consiste en las células Ml que expresan un gen SOCS-3. Dichas líneas celulares pueden ser útiles para cribar citocinas o cribar moléculas tales como moléculas naturales de vegetales, corales, microorganismos o agua o tierra biorgánicamente activa capaces de actuar como antagonistas o agonistas de citocinas.

Se pueden formar híbridos entre diferentes SOCS de la misma o distinta especie animal. Por ejemplo, se puede formar un híbrido entre todo o una parte funcional de SOCS1 de ratón y SOCS1 humano. Alternativamente, se puede formar un híbrido entre todo o parte de SOCS1 de ratón y SOCS2 de ratón. Todos esos híbridos son particularmente útiles en el desarrollo de moléculas pleiotrópicas.

Se puede usar una gama de ensayos diagnósticos basados en genética para cribar individuos con genes SOCS defectuosos. Dichas mutaciones pueden proporcionar tipos celulares no sensibles a una citocina particular o proporcionar una hipersensibilidad que conduce a una diversidad de condiciones. La secuencia genética de SOCS puede verificarse fácilmente usando una serie de técnicas PCR u otras técnicas para determinar si una mutación reside en el gen. La terapia génica adecuada u otra terapia intervencionista pueden entonces adoptarse.

La presente invención se describe además mediante los siguientes Ejemplos no limitativos.

Los Ejemplos 1-16 se refieren a SOCS1, SOCS2 y SOCS3, que se identificaron en base a la actividad. Los ejemplos 17-24 se refieren a diversos aspectos de SOCS4 a SOCS15, que se clonaron inicialmente en base a similitud de secuencia. Los Ejemplos 25-36 se refieren a aspectos específicos de SOCS4 a SOCS15, respectivamente.

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Ejemplo 1

Cultivo celular y citocinas

La línea celular M1 derivó de una leucemia que surgió espontáneamente en ratas SL [Ichikawa, 1969]. Las células M1 parentales utilizadas en este estudio han estado en pasaje en el Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research, Melbourne, Victoria, Australia, durante aproximadamente 10 años. Se mantuvieron células M1 por pasaje semanal en medio Eagle modificado de Dulbecco (DME) que contenía suero de ternero fetal al 10% (v/v) (FCS). Las citocinas recombinantes por lo general se obtienen de fuentes comerciales o se prepararon según métodos publicados. Se produjo LIF murino recombinante en Escherichia coli y se purificó, como se indicó previamente [Gearing, 1989]. Se adquirió oncostatina M humana purificada de PeproTech Inc (Rocky Hill, NJ, EE. UU.) y se obtuvo IFN-\gamma de ratón purificado de Genzyme Diagnostics (Cambridge, MA, EE. UU.). Se produjo trombopoyetina murina recombinante como una proteína de fusión marcada con FLAGTM en células CHO y luego se purificó.

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Ejemplo 2

Ensayo de colonias de agar

Con el fin de ensayar la diferenciación de células M1 en respuesta a citocinas, se cultivaron 300 células en placas de Petri de 35 mm que contenían 1 ml de DME enriquecido con suero de ternero fetal (FCS) al 20% (v/v), agar al 0,3% (p/v) y 0,1 ml de diluciones en serie de IL-6, LIF, OSM, IFN-\gamma, tpo o dexametasona (Sigma Chemical Company, St Louis, MI). Después de 7 días, se cultivó a 37ºC en una atmósfera totalmente humidificada, que contenía 10% (v/v) CO_{2} en aire, se contaron las colonias de células M1 y se clasificaron según se diferenciaba que estaban compuestas por células dispersas o tenían una corona de células dispersas alrededor de un centro firmemente compactado.

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Ejemplo 3

Generación de una colección retrovírica

Se construyó una colección de expresión de cDNA a partir de la línea celular hematopoyética dependiente del factor FDC-P1, esencialmente como se describe [Rayner, 1994]. En síntesis, se clonó cDNA en el vector retrovírico pRUFneo y luego se transfectó a una línea celular compactada anfotrófica (PA317). El virus generado transitoriamente se recogió del sobrenadante celular 48 h después de la transfección y se usó para infectar células compactadas ecotrópicas Y2, para generar una línea celular que produce virus de alta valoración.

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Ejemplo 4

Infección retrovírica de células Ml

Se irradiaron grupos de 10^{6} células \psi2 infectadas (3000 rad) y se co-cultivaron con 10^{6} células M1 en DME enriquecido con FCS al l0% (v/v) y 4 \mug/ml de Polybrene, durante 2 días a 37ºC. Para seleccionar clones insensibles a IL-6, se lavaron una vez en DME células M1 infectadas retrovíricamente y se cultivaron a aproximadamente 2xl0^{4} células/ml en 1 ml de cultivos de agar que contenían 400 \mug/ml de geneticina (GibcoBRL, Grand Island, NY) y 100ng/ml de IL-6. La eficacia de infección de las células M1 fue 1-2%, según lo estimado disponiendo las células infectadas en placas de agar en presencia de geneticina solamente.

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Ejemplo 5

PCR

Se digirió DNA genómico de células M1 infectadas retrovíricamente con Sac I, y se amplió luego 1 \mug de DNA extraído con fenol/cloroformo por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los cebadores empleados para ampliar los insertos de cDNA del retrovirus integrado fueron GAGS (5' CACGCCGCCCACGTGAAGGC 3' [SEC ID NO:1]), que corresponde a la secuencia del vector gag aproximadamente 30 bp 5' del sitio de clonación múltiple, y HSVTK (5' TTCGCCAATGACAAGACGCT 3' [SEC ID NO:2]), que corresponde a la secuencia pMC1neo aproximadamente 200 bp 3' del sitio de clonación múltiple. La PCR abarcó una desnaturalización inicial a 94ºC durante 5 min, 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 1 min, anelación a 56ºC durante 2 min y extensión a 72ºC durante 3 min, seguida de una extensión final de 10 min. Los productos PCR se purificaron con gel y luego se ligaron al plásmido pGEM-T (Promega, Madison, WI) y se secuenciaron usando un Kit de Secuenciación del Ciclo de Terminación de Tinte ABI PRISM y un Secuenciador de DNA Automático Modelo 373 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA).

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Ejemplo 6

Clonación de cDNA

Se aislaron clones de cDNA independientes que codifican SOCS1 de ratón de una colección de cDNA de timo murino según se describe (Hilton et al, 1994). Los nucleótidos y las secuencias de aminoácidos previstas de SOCS1 cDNA de ratón se compararon con bases de datos usando los algoritmos BLASTN y TFASTA (Pearson and Lipman, 1988; Pearson, 1990; Aitshcul et al, 1990). Se diseñaron los oligonucleótidos a partir de EST que codifican SOCS1 humano y SOC-1 y SOCS3 de ratón, y se usaron para sondear colecciones de cDNA de timo y bazo de ratón obtenibles en el mercado. La secuenciación se realizó usando un secuenciador automático ABI de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

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Ejemplo 7

Análisis southern, northern y RT-PCR

Se generaron sondas marcadas con ^{32}P usando un kit de marcado de decanucleótidos aleatorio (Bresatec, Adelaide, Australia del Sur) de un fragmento Pst I de 600 bp que codifica neomicina fosfotransferasa del plásmido pPGKneo, fragmento de 1070 bp del gen SOCS1 obtenido por digestión del producto PCR de 1,4 kbp con Xho I, SOCS2, SOCS3, CIS, y un fragmento de 1,2 kbp del gen 3-fosfato deshidrogenasa de gliceraldehído aviar [Dugaiczyk, 1983].

Se aisló el DNA genómico de las células usando un procedimiento de dodecilsulfato K-sódico de proteinasa esencialmente como se describe. Se digirieron quince microgramos de DNA o bien con BamK I o Sac I, se fraccionaron en gel de agarosa al 0,8% (p/v), se transfirieron a una membrana GensScreenPlus (Du Pont NEN, Boston MA), se prehibridaron, se hibridaron con fragmentos de DNA marcados con ^{32}P cebados aleatoriamente y se lavaron esencialmente como se describe [Sambrook, 1989].

Se aisló el RNA total de las células y los tejidos usando el reactivo Trizol, según lo recomendado por el fabricante (GibcoBRL,Grand Island. NY). Cuando fue necesario, se purificó polyA+ mRNA esencialmente como se describe [Alexander, 1995]. Los análisis Northern se prehibridaron, se hibridaron con fragmentos de DNA marcados con 32P cebados aleatoriamente y se lavaron como se describe [Alexander, 1995].

Para evaluar la inducción de los genes SOCS por IL-6, se inyectaron ratones (C57BL6) por vía intravenosa con 5 \mug de IL-6 seguidos de extirpación del hígado en los puntos de tiempo indicados después de la inyección. Las células M1 se cultivaron en presencia de 20 ng/ml de IL-6 y se recogieron en los tiempos indicados. Para el análisis RT-PCR, se recogieron células de médula ósea tal como se describe (Metacalf et al, 1995) y se estimularon durante 1 h a 37ºC con 100 ng/ml de una gama de citocinas. El análisis RT-PCR se llevó a cabo en RNA total según se describe (Metcalf et al, 1995). Los productos PCR se resolvieron en un gel de agarosa y los análisis Southern se hibridaron con sondas específicas para cada miembro de la familia SOCS. Se evaluó la expresión de p-actina para asegurar la uniformidad de la ampliación.

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Ejemplo 8

Constructos de DNA y transfección

Se generó un cDNA que codifica SOCS1 marcado con epítopo subclonando toda la región codificante de SOCS1 en el vector de expresión pEF-BOS [Mizushima, 1990], se manipuló genéticamente para codificar un epítopo FLAG hacia 3' de una metionina de iniciación (pF-SOCS1). Usando electroporación tal como se describió previamente [Hilton, 1994], se transfectaron células M1 que expresan el receptor de trombopoyetina (M1.mpl) con 20 \mug del plásmido de expresión pF-SQCS1 digerido con Aat Il-y 2 \mug de plásmido digerido con Sca I, en donde la transcripción de un cDNA que codifica puromicina N-acetiltransferasa se realizó a partir del promotor de fosfoglicerocinasa de ratón (pPGKPuropA). Después de 48 horas en cultivo, se seleccionaron las células transfectadas con 20 \mug/ml de puromicina (Sigma Chemical Company, St Louis MO), y se cribaron para expresión de SOCS1 por inmunotransferencia, usando el anticuerpo monoclonal M2 anti-FLAG de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Eastman Kodak, Rochester NY). En otros experimentos, se transfectaron células M1 solamente con el plásmido pF-SOCS1 o un control y se seleccionaron por su capacidad de desarrollarse en agar en presencia de 100 ng/ml de IL-6.

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Ejemplo 9

Inmunoprecipitación e inmunotransferencia

Antes de la inmunoprecipitación o la inmunotransferencia (Western blotting), se lavaron dos veces 10^{7} células M1 o sus derivados, se resuspendieron en 1 ml de DME y se incubaron a 37ºC durante 30 min. Las células se estimularon luego durante 4 min a 37ºC o bien con solución salina o con 100 ng/ml de IL-6, tras lo cual se añadió vanadato de sodio (Sigma Chemical Co., St Louis, MI) hasta una concentración de 1 mM. Las células se dispusieron en hielo, se lavaron una vez con solución salina que contenía vanadato de sodio 1 mM y luego se solubilizaron durante 5 min en hielo con 303 \mul 1% (v/v) de Triton X-100, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, que contenía inhibidores de proteasa Complete (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) y vanadato de sodio 1 mM. Los lisados se depuraron por centrifugación y se cuantificaron usando un Reactivo de Ensayo de Proteínas Coomassie (Pierce, Rockford EL).

Para inmunoprecipitaciones, se incubaron concentraciones equivalentes de extractos de proteína (1-2 mg) durante 1 h o durante una noche a 4ºC, o bien con 4 \mug de anticuerpo anti-gp 130 (M20; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) o con 4 \mug de anticuerpo anti-fosfotirosina (4G10; Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid NY), y 15 \mul de volumen de proteína G Sephsrose (Pharmacia, Uppsala, Suecia) (Hilton et al, 1996]. Los inmunoprecipitados se lavaron dos veces en NP40 al 1% (v/v), NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM a pH 8,0, que contenía inhibidores de proteasa Complete (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania y vanadato de sodio 1 mM. Las muestras se calentaron durante 5 min a 95ºC en tampón de muestra SDS (Tris-HCl 625 mM a pH 6,8, SDS al 0,05% (p/v), glicerol al 0,1% (v/v), azul bromofenol, 2-mercaptoetanol al 0,125% (v/v)), se fraccionaron por SDS-PAGE y se inmunotransfirieron como se describió anteriormente.

Para la inmunotransferencia, se cargaron 10 \mug de proteína de un extracto celular o material de una reacción de inmunoprecipitación a 4-15% geles Ready (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA) y se resolvieron por electroforesis en geles de dodecilsulfato sódico y poliacrilamida (SDS-PAGE). Las proteínas se transfirieron a una membrana PVDF (Micron Separations Inc., Westborough MA) durante 1 h a 100 V. Las membranas se sondearon con los siguientes anticuerpos primarios: STAT3 fosforilado con anti-tirosina (dilución 1:1000; New England Biolabs, Beverly, MA); anti-STAT3 (C-20; dilución 1:100; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz CA); anti-gpl30 (M20, dilución 1:100; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz CA); anti-fosfotirosina (RC20 conjugado con peroxidasa de rábano picante, dilución 1:5000; Transduction Laboratories, Lexington KY); cinasa MAP fosforilada con anti-tirosina y anticuerpos de cinasa anti-MAP (dilución 1:1000; New England Biolabs, Beverly, MA). Las electrotransferencias se visualizaron usando anticuerpos secundarios conjugados a peroxidasa y reactivos de Quimioluminiscencia Potenciada (Enhanced Chemiluminiscence o ECL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce, Rockford
IL).

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Ejemplo 10

Ensayos de cambio de la movilidad electroforética

Se realizaron ensayos tal como se describe [Novak, 1995], usando el sitio de unión m67 a SIF (factor inducible de c-sis) de gran afinidad [Wakao, 1994]. Los extractos de proteínas se prepararon a partir de células M1 incubadas durante 4-10 min a 37ºC en 10 ml de DME libre de suero que contenía solución salina, 100 ng/ml de IL-6 o 100 ng/ml de IFN-\gamma. Las reacciones de unión contenían 4-6 \mug de proteína (constantes dentro de un experimento determinado), 5 ng de oligonucleótido m67 marcado con ^{32}P y 800 ng de DNA de esperma de salmón sonicado. Para determinados experimentos, las muestras de proteína se preincubaron con un exceso de oligonucleótido m67 no marcado, o anticuerpos específicos para STATI (Transduction Laboratories, Lexington, KY) o STAT3 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz CA), tal como se describe [Novak, 1995].

Las inmunotransferencias se realizaron usando STAT3 o anti-STAT3 fosforilados con anti-tirosina (New England Biolabs, Beverly, MA) o anti-gp130 (Santa Cruz Biotechnology Inc.) como se describe (Nicola et al, 1996). Los ensayos EMSA se realizaron usando la sonda oligonucleotídica m67, tal como se describe (Novak et al, 1995).

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Ejemplo 11

Clonación de la expresión de un nuevo supresor de la transducción de señales de citocinas

Con el fin de identificar cDNA capaces de suprimir la transducción de señales de las citocinas, se adoptó un planteamiento de clonación de expresión. Esta estrategia se centra en las células M1, una línea celular de leucemia monocítica que se diferencia en macrófagos maduros y cesa la proliferación en respuesta a las citocinas IL-6, LIF, OSM y EFN-\gamma, y dexametasona esteroide. Se infectaron células M1 parentales con el retrovirus RUFneo, en el cual se habían clonado cDNA de la línea celular hematopoyética dependiente del factor FDC-P1. En este retrovirus, la transcripción del gen de resistencia a neomicina y del cDNA clonado se separa del potente promotor constitutivo presente en el LTR retrovírico (Figura 1). Cuando se cultivan en agar semisólido, las células M1 parentales forman grandes colonias firmemente compactadas. Tras la estimulación con IL-6, las células M1 sufren una rápida diferenciación, lo que resulta en la formación en agar de solamente macrófagos simples o pequeños racimos de células dispersas. Las células M1 infectadas retrovíricamente que fueron insensibles a la IL-6 se seleccionaron en cultivo de agar semisólido por su capacidad de formar grandes colonias firmemente compactadas en presencia de IL-6 y geneticina. Se obtuvo un clon individual estable insensible a IL-6, 4A2, después de examinar 10^{4} células infectadas.

Se usó un fragmento del gen de neomicina fosfotransferasa (neo) para sondear un análisis Southern de DNA genómico del clon 4A2, y esto reveló que la línea celular estaba infectada con un retrovirus individual que contenía un cDNA de aproximadamente 1,4 kbp de longitud (Figura 2). La ampliación PCR usando cebadores del vector retrovírico que flanqueaba el sitio de clonación de cDNA permitió la recuperación de un inserto de cDNA de 1,4 kbp, que hemos denominado supresor de la señalización de citocinas 1, o SOCS1. Este producto PCR se usó para sondear un análisis Southern similar de DNA genómico 4A2 y se hibridó a dos fragmentos, uno de los cuales correspondía al gen SOCS1 endógeno y el otro, que era compatible con el tamaño de la banda vista usando la neo, correspondía al SOCS1 cDNA clonado en el retrovirus integrado (Figura 2). El último no se observó en un clon de células M1 infectadas con un retrovirus que contenía un cDNA irrelevante. De modo similar, el análisis Northern reveló que SOCS1 mRNA era abundante en la línea celular 4A2, pero no en el clon de células M1 infectadas con control
(Figura 2).

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Ejemplo 12

SOCS1, SOCS2, SOCS3 y cis definen una nueva familia de proteínas que contienen SH2

El producto de PCR SOCS1 se usó como una sonda para aislar cDNA homólogos de una colección de cDNA de timo de ratón. Se comprobó que la secuencia de los cDNA era idéntica al producto PCR, lo que sugiere que la expresión constitutiva o la hiperexpresión, en lugar de la mutación, de la proteína SOCS1 fueron suficientes para generar un fenotipo insensible a IL-6. La comparación de la secuencia de SOCS1 cDNA con las bases de datos de secuencias de nucleótidos reveló que estaba presente en clones de DNA genómico de ratón y rata que contenían el agrupamiento del gen protamina que se halla en el cromosoma 16 del ratón. Una inspección más minuciosa reveló que la secuencia SOCS1 de 1,4 kb no era homóloga a ninguno de los genes protamina, en cambio representaba un marco de lectura abierto previamente no identificado ubicado en el extremo 3' de estos clones (Figura 3). No hubo regiones de discontinuidad entre las secuencias del SOCS1 cDNA y el locus genómico, lo que sugiere que SOCS1 está codificado por un exón simple. Además del clon genómico que contenía los genes protamina, una serie de marcadores secuenciados expresados en murinos y seres humanos (EST) también reveló grandes bloques de identidad de secuencia de nucleótidos a SOCS1 de ratón. La información de las secuencias provista por los EST humanos posibilitó la rápida clonación de los cDNA que codifican SOCS1 humano.

El gen SOCS1 de rata y ratón codifica una proteína de 212 aminoácidos, mientras que el gen SOCS1 humano codifica una proteína de 211 aminoácidos. Las proteínas de SOCS1 de rata, ratón y ser humano comparten 95-99% de identidad de aminoácidos (Figura 9). Una búsqueda de bases de datos de ácido nucleico traducido con la secuencia de aminoácidos prevista de SOCS1 demostró que estaba principalmente relacionado a un producto génico anterior inmediato inducible por citocinas recientemente clonado, CIS, y dos clases de EST. Se aislaron los cDNA de longitud total de las dos clases de EST, y se halló que codifican proteínas de longitud y estructura general similares a SOCS1 y CIS. A estos clones se los llamó SOCS2 y SOCS3. Cada una de las cuatro proteínas contiene un dominio SH2 central y una región C-terminal denominada motivo SOCS. Las proteínas SOCS1 exhiben un nivel extremadamente alto de similitud de secuencia de aminoácidos (95-99% de identidad) entre las distintas especies. No obstante, las formas de SOCS1, SOCS2, SOCS3 y CIS del mismo animal, si bien definiendo claramente una nueva familia de proteínas que contienen SH2, exhibieron una identidad de aminoácidos inferior. SOCS2 y CIS exhiben aproximadamente 38% identidad de aminoácidos, mientras que el resto de los miembros de la familia comparte aproximadamente 25% identidad de aminoácidos (Figura 9). La región codificante de los genes para SOCS1 y SOC3 parece no contener intrones, mientras que la región codificante de los genes para SOCS2 y CIS contiene uno y dos intrones, respectiva-
mente.

Los números de acceso en Genbank para las secuencias a las que se hace referencia en la presente memoria son SOCS1 cDNA de ratón (U88325), SOCS1 cDNA humano (U88326), SOCS2 cDNA de ratón (U88327), SOCS3 cDNA de ratón (U88328).

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Ejemplo 13

La expresión constitutiva de SOCS2 suprime la acción de una serie de citocinas

Para establecer formalmente que el fenotipo de la línea celular 4A2 se relacionó directamente con la expresión de SOCS1, y no con cambios genéticos no asociados que pueden haber ocurrido independientemente en estas células, se transfectó un cDNA que codifica una versión marcada del epítopo de SOCS1 bajo el control del promotor EF1\alpha, a células M1 parentales, y a células M1 que expresan el receptor para trombopoyetina, c-mpl (M1.mpl). La transfección del vector de expresión SOCS1 en ambas líneas celulares proporcionó un incremento de la frecuencia de células MI insensibles a IL-6.

Múltiples clones independientes de expresión de células M1 SOCS1, según lo detectado por inmunotransferencia, exhibieron un fenotipo insensible a las citocinas que no se pudo distinguir de 4A2. Además, si los transfectantes no se mantuvieron en puromicina, la expresión de SOCS1 se perdió con el tiempo y las células recuperaron su sensibilidad a las citocinas. En ausencia de citocina, las colonias derivadas de 4A2 y otros clones que expresan SOCS1 crecieron característicamente hasta un tamaño más pequeño que las colonias formadas por células M1 control
(Figura 10).

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El efecto de la expresión constitutiva de SOCS1 sobre la respuesta de las células M1 a una gama de citocinas se investigó usando la línea celular 4A2 y un clon de células M1.mpl que expresa SOCS1 (M1.mpl.SOCS1). A diferencia de las células M1 parentales y las células M1.mpl, las dos líneas celulares que expresan SOCS1 continuaron proliferando y no pudieron formar colonias diferenciadas en respuesta a IL-6, LIF, OSM, EFN-\gamma o, en el caso de la línea celular M1.mpLSOCS1, trombopoyetina (Figura 4). Para ambas líneas celulares, no obstante, se observó una respuesta normal a la dexametasona, sugiriendo que SOCS1 afectó específicamente la transducción de señales de citocina en lugar de la diferenciación per se. Coherente con estos datos, si bien las células M1 parentales y las células M1.mpl se agrandaron y ahuecaron en respuesta a IL-6, las células 4A2 y M1.rnpl.SOCS1 no mostraron signos de diferenciación morfológica en respuesta a IL-5 u otras citocinas (Figura 5).

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Ejemplo 14

SOCS1 inhibe una serie de procesos de transducción de señales de IL-6, incluyendo la fosforilación y activación de STAT3

Se cree que la fosforilación del componente del receptor de superficie celular gp130, la tirosina cinasa citoplásmica JAK1 y el factor de transcripción STAT3 cumple una función central en la transducción de señales de IL-6. Estos eventos se compararon en las líneas celulares parentales M1 y M1.mpl y sus contrapartes que expresan SOCS1. Como se esperaba, gp130 se fosforiló rápidamente en respuesta a IL-6 en ambas líneas parentales, no obstante, esto se redujo de cinco a diez veces en las líneas celulares que expresan SOCS1 (Figura 6). Asimismo, la fosforilación de STAT3 también se redujo aproximadamente diez veces en respuesta a IL-6 en aquellas líneas celulares que expresaban SOCS1 (Figura 6). Coherente con una reducción en la fosforilación de STAT3, la activación de complejos de unión STAT DNA específicos, según lo determinado por el ensayo de cambio en la movilidad electroforética, también se redujo. Notablemente, hubo una reducción en la formación SIF-A (que contenía STAT3), SIF-B (heterodímero STAT1/STAT3) y SIF-C (que contenía STAT1), los tres complejos STAT inducidos en células M1 estimuladas con IL-6 (Figura 7). De modo similar, la expresión constitutiva de SOCS1 también inhibió la formación estimulada por IFN-\gamma de homodímeros p91 (Figura 7). La fosforilación y activación de STAT no fueron los únicos procesos citoplásmicos efectuados por la expresión de SOCS1, ya que la fosforilación de otras proteínas, incluyendo shc y cinasa MAP, se redujo hasta un grado similar (Figura 7).

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Ejemplo 15

Transcripción del gen SOCS1 estimulada por IL-6 in vitro e in vivo

Si bien SOCS1 puede inhibir la transducción de señales de citocina cuando se expresa constitutivamente en células M1, esto no necesariamente indica que SOCS1 funciona normalmente para regular negativamente una respuesta de IL-6. Con el fin de investigar esta posibilidad, los inventores determinaron si la transcripción del gen SOCS1 es regulada en respuesta de las células M1 a la IL-6 y, debido a la función crítica que cumple la IL-6 en regular la respuesta de fase aguda a lesiones e infecciones, la respuesta del hígado a la inyección intravenosa de 5 mg de IL-6. En ausencia de IL-6, SOCS1 mRNA no fue detectable ni en células M1 ni en el hígado. No obstante, para ambos tipos de células, se indujo un transcripto de SOCS1 de 1,4 kb dentro de 20 a 40 minutos por IL-6 (Figura 8). Para células M1, donde la IL-6 estuvo presente en todo el experimento, el nivel de SOCS1 mRNA permaneció elevado (Figura 8). En cambio, la IL-6 se administró in vivo mediante una inyección intravenosa única y se depuró rápidamente de la circulación, dando como resultado un pulso de estimulación de IL-6 al hígado. Coherente con esto, la expresión transitoria de SOCS1 mRNA fue detectable en el hígado, alcanzando un máximo aproximadamente 40 minutos después de la inyección y declinando a niveles basales dentro de las 4 horas (Figura 8).

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Ejemplo 16

Regulación de genes SOCS

Ya que se clonó CIS como un gen de expresión precoz inducible de citocinas, los inventores examinaron si SOCS1, SOCS2 y SOCS3 se regulaban de manera similar. El patrón basal de expresión de los cuatro genes SOCS se examinó por análisis Northern de mRNA de una diversidad de tejidos de ratones C57B1/6 macho y hembra (Figura 11A). La expresión constitutiva de SOCS1 se observó en el timo y en un grado menor en el bazo y el pulmón. La expresión de SOCS2 se limitó principalmente al testículo y, en algunos animales, al hígado y el pulmón; para SOCS3, se observó un bajo nivel de expresión en el pulmón, bazo y timo, mientras que la expresión de CIS estuvo más expandida, incluyendo el testículo, corazón, pulmón, riñón y, en algunos animales, el hígado.

Los inventores buscaron determinar si la expresión de los cuatro genes SOCS fue regulada por la IL-6. Los análisis Northern de mRNA preparados a partir de hígados de ratones no tratados e inyectados con IL-6, o a partir de células M1 no estimuladas y estimuladas con IL-6, se hibridaron con fragmentos marcados de SOCS1, SOCS2, SOCS3 y CIS cDNA (Figura 11B). La expresión de los cuatro genes SOCS aumentó en el hígado después de la inyección de IL-6, no obstante, la cinética de inducción pareció diferir. La expresión de SOCS1 y SOCS3 fue transitoria en el hígado, con mRNA detectable después de 20 minutos de la inyección de IL-6 y declinando a niveles basales dentro de las 4 horas para SOCS y 8 horas para SOCS3. La inducción de SOCS2 y CIS mRNA en el hígado siguió una cinética inicial similar a aquella de SOCS1, pero se mantuvo en un nivel elevado durante por lo menos 24 horas. Se observó una inducción similar del mRNA del gen SOCS en otros órganos, notablemente el pulmón y el bazo. En contraste, en células M1, si bien SOCS1 y CIS mRNA fueron inducidos por IL-6, no se detectó inducción de expresión de SOCS2 o SOCS3. Este resultado resalta las diferencias específicas de cada tipo celular en la expresión de los genes de los miembros de la familia SOCS en respuesta a la misma citocina.

Con el fin de examinar el espectro de citocinas que fue capaz de inducir la transcripción de los distintos miembros de la familia del gen SOCS, se estimularon células de médula ósea durante una hora con una gama de citocinas, después de lo cual se extrajo mRNA y se sintetizó cDNA. Se usó luego PCR para evaluar la expresión de SOCS1, SOCS2, SOCS3 y CIS (Figura 11C). En ausencia de estimulación, se detectó poca o ninguna expresión de los genes SOCS en la médula ósea por PCR. La estimulación de células de médula ósea con una amplia gama de citocinas pareció ser capaz de elevar el mRNA para uno o más miembros de la familia SOCS. IFN\gamma, por ejemplo, indujo la expresión de los cuatro genes SOCS, mientras que la eritropoyetina, el factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos y la interleucina 3 indujeron expresión de SOCS2, SOCS3 y CIS. De manera interesante, el factor de necrosis tumoral alfa, el factor estimulante de colonias de macrófagos y la interleucina 1, que actúan a través de receptores que no caen dentro de la clase de receptores de citocinas de tipo I, también parecieron ser capaces de inducir la expresión de SOCS3 y CIS, lo que sugiere que las proteínas SOCS pueden cumplir una función más amplia en la regulación de la transducción de señales.

Como expresión constitutiva de que SOCS1 inhibió la respuesta de las células M1 a una gama de citocinas, los inventores examinaron si la fosforilación del componente del receptor de la superficie celular gp130 y el factor de transcripción STATS, que se cree cumplen una función central en la transducción de señales de IL-6, se vieron afectados. Estos eventos se compararon en las líneas celulares parentales M1 y M1.mpl y sus contrapartes que expresan SOCS1. Como era de esperarse, gpl30 se fosforiló rápidamente en respuesta a IL-6 en ambas líneas parentales, no obstante, esto se redujo en las líneas celulares que expresaban SOCS1 (Figura 12A). Asimismo, la fosforilación de STAT3 también se redujo en respuesta a IL-6 en aquellas líneas celulares que expresan SOCS1 (Figura 12A). Coherente con una reducción en la fosforilación de STAT3, la activación de complejos de unión STAT/DNA específicos, según lo determinado por el ensayo del cambio en la movilidad electroforética, también se redujo. Notablemente, hubo una imposibilidad de formar SIF-A (que contenía STAT3) y SIF-B (heterodímero STAT1/STAT3), los complejos STAT más importantes inducidos en células M1 estimulados con IL-6 (Figura 12B). De modo similar, la expresión constitutiva de SOCS1 también inhibió la formación estimulante de IFN\gamma de SIF-C (homodímero STAT1, Figura 12B). Estos experimentos son coherentes con la propuesta de que SOCS1 inhibe la transducción de señales hacia 5' del receptor y la fosforilación de STAT, potencialmente a nivel de las cinasas JAK.

La capacidad de SOCS1 de inhibir la transducción de señales y, en última instancia, la respuesta biológica a las citocinas sugiere que, al igual que la fosfatasa que contiene SH2, SHP-1 [Thie et al, 1994; Yi et al, 1993], las proteínas SOCS pueden cumplir una función central en controlar la intensidad y/o duración de una respuesta celular a una gama diversa de estímulos extracelulares suprimiendo el proceso de transducción de señales. Las pruebas provistas aquí indican que la familia SOCS actúa en un bucle de retroalimentación negativo clásico para la transducción de señales de citocinas. Al igual que otros genes como OSM, la expresión de genes que codifican las proteínas SOCS es inducida por las citocinas a través de la activación de STAT. Una vez expresadas, se propone que las proteínas SOCS inhiben la actividad de las JAK y reducen así la fosforilación de receptores y STAT, suprimiendo de este modo la transducción de señales y proporcionando una respuesta biológica. Cabe destacar que la inhibición de la activación de STAT conducirá, con el transcurso del tiempo, a una reducción de la expresión del gen SOCS, permitiendo que las células vuelvan a recuperar la sensibilidad a las citocinas.

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Ejemplo comparativo 17

Búsquedas en bases de datos

La base de datos de la secuencia genética NCBI (Genbank), que abarca la base de datos más importante de marcadores de secuencias expresadas (EST) y la base de datos de TIGR de marcadores de secuencias expresadas humanas, se buscaron para identificar secuencias con similitud a una secuencia SOCS box de consenso usando los algoritmos TFASTA y MOTIVO/PATRÓN [Pearson, 1990; Cockwell y Giles, 1989]. Usando el software SRS [Etzold el al, 1996], los EST que exhibieron similitud con el SOCS box (y sus compañeros derivados de secuenciar el otro extremo de los cDNA) se recuperaron y ensamblaron en cóntigos usando Autoassembler (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias de nucleótidos de consenso derivadas de superponer los EST se usaron luego para buscar las distintas bases de datos usando BLASTN [Altschul et al, 1990]. Nuevamente, se recuperaron los EST positivos y se añadieron al cóntigo. Este procedimiento se repitió hasta que no pudieron recuperarse más EST. Las secuencias de nucleótidos de consenso finales se tradujeron luego usando Sequence Navigator (Applied Biosystems, Foster City,
CA).

Los EST que codifican las nuevas proteínas SOCS son los siguientes: SOCS4 humano (EST81149, EST180909, EST182619, ya99H09, ye70co4. yh53c09, yh77gl1, yh87h05, yi45h07, yj04e06. yql2h06, yq56a05, yq60e02,
yq92g03, yq97h06, yr90f01, yt69c03, yv30a08, yv55f07, yv57h09, yv87h02, yv98e11, yw68d10, yw82a03, yx08a07, yx72h06, yx76b09, yy37h08, yy66b02, za81f08, zbl8f07, zc06e08, zd14g06, zd51h12, zd52b09, ze25g11, ze69f02, zf54f03, zh96e07, zv66h12, zs83a08 y zs83g08). SOCS-4 de ratón (mc65f04, mf42e06, mp10c10, mr81g09 y
mt19h12). SOCS-5 humano (EST15B103, EST15B105, EST27530 y zf50f01). SOCS-5 de ratón (mc55a0l, mh98f09, my26h12 y ve24e06). SOCS-6 humano (yf61e08, yf93a09, yg05f12, yg41f04, yg45c02, yh11f10, yh13b05, zc35a12, ze02h08, zl09a03, zf69e10, zn39d08 y zo39e06). SOCS-6 de ratón (mc04c05, md48a03, mf31d03, mh26b07,
mh78e11, mh.88h09, mh94h07, mi27h04 y mj29c05, mp66g04, mw75g03, va53b05, vb34h02, vcS5d07, vc59e05, vc67d03, vc68d]Q, vc97n0l, vc99c08, vdQ7h03, vdOScOl, vd09M2, vd19b02, vd29a04 y vd46d06). SOCS-7 humano (STS W130171, EST00939, EST12913, yc29b05. yp49f10, zt10f03 y zx73g04). SOCS-7 de ratón (mj39a01 y vi52h07). SOCS-8 de ratón (mj6e09 y vj27a029). SOCS-9 humano (CSRL-82f2-u, EST114054, yy06b07, yy06g06, zr40c09, zr72h01, yx92c08. yx93b08 y hfe0662). SOCS-9 de ratón (me65d05). SOCS-10 humano (aa48h10, zp35h01, zp97h12, zq08h01, zr34g05, EST73000 y HSDHEI005). SOCS-10 de ratón (mb14d12, mb40f06, mg89b11, mq89e12, mp03g12 y vh53c11). SOCS-11 humano (zt24h06 y zr43b02). SOCS-13 humano (EST59161). SOCS-13 de ratón (ma39a09, me60c05, mi78g05, mk10c11, mo48g12, mp94a01, vb57c07 y vh07c11). SOCS-14 humano (mi75e03, vd29h11 y vd53g07).

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Ejemplo comparativo 18

Clonación de cDNA

En base a las secuencias de consenso derivadas de los EST superpuestos, se diseñaron oligonucleótidos que eran específicos de diversos miembros de la familia SOCS. Como se describió anteriormente, los oligonucleótidos se marcaron y usaron para cribar colecciones genómicas y de cDNA obtenibles en el mercado clonadas con bacteriófago \lambda. Se aislaron clones genómicos y/o de cDNA que cubrían toda la región codificante de SOCS4 de ratón, SOCS5 de ratón y SOCS6 de ratón. Todo el gen para SOCS15 está en el 12p13 BAC humano (número de acceso en Genbank HSU47924) y el cromosoma 6 BAG de ratón (número de acceso en Genbank AC002393). También se aislaron cDNA parciales para SOCS7, SOCS9, SOCS 10, SOCS11, SOCS12, SOCS13 y SOCS14 de ratón.

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Ejemplo comparativo 19

Análisis Northern y rtPCR

Se efectuaron los análisis Northern como se describió precedentemente. Las fuentes de sondas de hibridación fueron las siguientes: (i) toda la región codificante del SOCS1 cDNA de ratón, (ii) un producto PCR de 1059 bp derivado de la región codificante de SOCS5 hacia 5' del dominio SH2, (iii) toda la región codificante del SOCS6 cDNA de ratón, (iv) un producto PCR de 790'bp derivado de la región codificante de un SOCS7 cDNA parcial y (v) un fragmento Pst I de 1200 bp del cDNA de 3-fosfato deshidrogenasa de gliceraldehído (GAPDH) aviar.

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Ejemplo comparativo 20

Miembros adicionales de la familia SOCS

SOCS1, SOCS2 y SOCS3 son miembros de la familia de proteínas SOCS identificados en los Ejemplos 1-16. Cada uno contiene un dominio SH2 central y un motivo conservado en el término C, denominado SOCS box. Con el fin de aislar otros miembros de esta familia de proteínas, se buscó en diversas bases de datos de DNA con la secuencia de aminoácidos correspondiente a residuos conservados del SOCS box. Esta búsqueda reveló la presencia de EST humanos y de ratón que codifican otros doce miembros de la familia de proteínas SOCS (Figura 13). Usando esta información sobre las secuencias, se han aislado los cDNA que codifican SOCS4, SOCS5, SOCS6, SOCS7, SOCS9, SOCS10, SOCS11, SOCS12, SOCS13, SOCS14 y SOCS15. Análisis adicionales de cóntigos derivados de los EST y cDNA revelaron que las proteínas SOCS podrían disponerse en tres grupos de acuerdo a su estructura prevista N-terminal del SOCS box. Los tres grupos son aquellos con (i) dominios SH2, (ii) repeticiones WD-40 y (iii) repeticiones anquirina.

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Ejemplo 21

Proteína SOCS con dominio SH2

Se han identificado ocho proteínas SOCS con dominios SH2. Éstas incluyen SOCS1, SOCS2 y SOCS3, SOCS5, SOCS9, SOCS11 y SOCS14 (Figura 13). Los cDNA de longitud total se aislaron para SOCS5 y SOCS14 de ratón, y clones parciales que codifican SOCS9 y SOCS14 de ratón. Los análisis de la secuencia de aminoácidos primaria y la estructura genómica sugieren que pares de estas proteínas (SOCS1 y SOCS3, SOCS2 y CIS, SOCS5 y SOCS14, y SOCS9 y SOCS11) están más estrechamente relacionados (Figura 13). De hecho, los dominios SH2 de SOCS5 y SOCS14 son prácticamente idénticos (Figura 13B) y, a diferencia de CIS, SOCS1, SOCS2 y SOCS3, SOCS5 y SOCS14 tienen una extensa, aunque menos conservada, región N-terminal que precede a sus dominios SH2 (Figura 13A).

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Ejemplo comparativo 22

Proteínas SOCS con repeticiones WD.40

Se identificaron cuatro proteínas SOCS con repeticiones WD-40. Como con las proteínas SOCS con dominios SH2, los pares de estas proteínas parecen estar más estrechamente relacionados. Se aislaron los cDNA de longitud total de SOCS4 y SOCS6 de ratón, y se demostró que codifican proteínas que contienen ocho repeticiones WD-40 N-terminales del SOCS box (Figura 13) y que SOCS4 y SOCS6 comparten 65% similitud de aminoácidos. Se reconoció a SOCS15 como un marco de lectura abierto tras la secuenciación de BAC del cromosoma humano 12p13 y la región sintética del cromosoma de ratón 6 [Ansari-Lari et al, 1997]. En ser humano, chimpancé y ratón, SOCS15 está codificado por un gen con dos exones codificantes que yace dentro de algunos cientos de pares de bases del extremo 3' del gen triosa fosfato isomerasa (TPI), pero que está codificado en la cadena opuesta a TPI (9). Además de un SOCS box C-terminal, la proteína SOCS15 contiene cuatro repeticiones WD-40. Cabe destacar que dentro de las bases de datos de EST, hay una secuencia de un nematodo, un insecto y un pez relativos de SOCS15. SOCS15 parece más estrechamente relacionado a SOCS13.

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Ejemplo comparativo 23

Proteínas SOCS con repeticiones anquirina

Se identificaron tres proteínas SOCS con repeticiones anquirina. El análisis de cDNA parciales de SOCS7, SOCS10 y SOCS12 de ratón demostró la presencia de múltiples repeticiones anquirina.

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Ejemplo comparativo 24

Patrón de expresión de proteínas SOCS

Se examinó la expresión de mRNA de miembros representativos de cada clase de proteínas SOCS -SOCS1 y SOCS5 del grupo del dominio SH2, SOCS6 del grupo de repetición WD-40 y SOCS7 del grupo de repetición anquirina. Como se demostró anteriormente, SOCS1 mRNA se halla, en abundancia, en el timo y, en niveles inferiores, en otros tejidos adultos.

Dado que la transcripción del gen SOCS1 es inducida por citocinas, los inventores buscaron determinar si los niveles de SOCSS, SOCS6 y SOCS7 mRNA aumentan tras la estimulación de citocinas. En los hígados de ratones a los que se les inyectó IL-6, SOCS1 mRNA es detectable después de 20 min y disminuye a niveles de fondo al cabo de 2 horas. En contraste, la cinética de la expresión de SOCS5 mRNA es bastante diferente, siendo solo detectable 12 a 24 horas después de la inyección de IL-6. SOCS6 mRNA parece expresarse constitutivamente mientras que SOCS7 mRNA no se detectó en el hígado ni antes de la inyección de IL-6 ni en ningún otro momento después de la
inyección.

La expresión de estos genes también se examinó después de la estimulación de citocinas de la línea celular dependiente del factor FDCP-1 manipulada para expresar bcl-w. Nuevamente, mientras que SOCS6 mRNA se expresó constitutivamente.

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Ejemplo comparativo 25

SOCS4

Se reconocieron SOCS4 de ratón y ser humano a través de la búsqueda de bases de datos de EST, usando el consenso SOCS box (Figura 13). Aquellos EST derivados de SOCS4 cDNA de ratón y ser humano se exponen a continuación (Tablas 4.1 y 4.2). Usando la información de secuencias derivadas de los EST de ratón se diseñaron varios oligonucleótidos y se usaron para cribar, en el modo convencional, una colección de cDNA de timo de ratón clonada al bacteriófago \lambda. Se aislaron dos cDNA que codifican SOCS4 de ratón, se secuenciaron en su totalidad (Figura 15) y demostraron superponerse a los EST de ratón identificados en la base de datos (Tabla 4.1 y Figura 17). Estos cDNA incluyen una región de la región no traducida 5', la región codificante de SOCS4 de ratón completa y una región de la región no traducida 3' (Figura 17). El análisis de la secuencia confirma que SOCS4 cDNA codifica un SOCS Box en su término C y una serie de repeticiones 8 WD-40 antes del SOCS Box (Figuras 17 y 16). La relación de estos dos cóntigos de secuencias de SOCS4 humano (h4.1 y h4.2) a la secuencia SOCS4 cDNA de ratón determinada experimentalmente se muestra en la Figura 17. La secuencia de nucleótidos de los dos cóntigos humanos se enumera en la Figura 18.

Las SEC ID NO:13 y 14 representan la secuencia de nucleótidos de SOCS4 murino y la secuencia de aminoácidos correspondiente. Las SEC ID NO: 15 y 16 son cóntigos humanos de SOCS4 cDNA h4.1 y h4.2, respectivamente.

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Ejemplo comparativo 26

SOCS5

Se reconocieron SOCS5 de ratón y humano a través de la búsqueda en bases de datos de EST, usando el consenso SOCS box (Figura 13). Aquellos EST derivados de SOCS5 cDNA de ratón y ser humano se muestran a continuación (Tablas 5.1 y 5.2). Usando la información de las secuencias derivadas de los EST de ratón y ser humano, se diseñaron varios oligonucleótidos y se utilizaron para cribar, en el modo convencional, una colección de cDNA de timo de ratón, una colección de DNA genómico de ratón y una colección de cDNA de timo humano clonadas al bacteriófago \lambda. Se aislaron y secuenciaron en su totalidad un clon de DNA genómico individual (57-2) y (5-3-2) un clon de cDNA que codifica SOCS5 de ratón, y demostraron superponerse con los EST de ratón identificados en la base de datos (Figuras 19 y 20A). Toda la región codificante, además de una región de las regiones no traducidas 5' y 3' de SOCS5 de ratón, parece estar codificada en un solo exón (Figura 19). El análisis de la secuencia (Figura 20) confirma que los clones de cDNA y genómicos de SOCS5 codifican una proteína con un SOCS box en su término C además de un dominio SH2 (Figura 19 y 20B). La relación del cóntigo SOCS5 humano (h5.1; Figura 21) derivado del análisis del clon de cDNA 5-94-2 y los SOCS5 EST humanos (Tabla 5.2) a la secuencia de SOCS5 DNA de ratón se muestra en la Figura 19. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de SOCS5 murino correspondiente se muestran en las SEC ID NO: 17 y 18, respectivamente. La secuencia de nucleótidos SOCS5 de ser humano se muestra en la SEC ID NO: 19.

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Ejemplo comparativo 27

SOCS6

Se reconocieron SOCS6 de ratón y ser humano a través de la búsqueda en bases de datos de EST, usando el consenso SOCS box (Figura 13). Aquellos EST derivados de SOCS5 cDNA de ratón y ser humano se exponen a continuación (Tablas 6.1 y 6.2). Usando la información de las secuencias derivadas de los EST de ratón, se diseñaron varios oligonucleótidos y se usaron para cribar, en el modo convencional, una colección de cDNA de timo de ratón. Se aislaron y secuenciaron ocho clones de cDNA (6-1A, 6-2A, 6-5B, 6-4N, 6-18, 6-29, 6-3N, 6-5N), el clon de cDNA que codifica SOCS6 de ratón en su totalidad, y se muestra que se superponen con los EST de ratón identificados en la base de datos (Figuras 22 y 23A). El análisis de la secuencia (Figura 23) confirma que los clones de SOCS6 cDNA de ratón codifican una proteína con un SOCS box en su término C además de ocho repeticiones WD-40 (Figuras 22 y 23B). La relación de los cóntigos SOCS-6 humanos (h6.1 y h6.2; Figura 24) derivados del análisis de SOCS6 EST humanos (Tabla 6.2) a la secuencia de SOCS6 DNA de ratón, se muestra en la Figura 22. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de SOCS6 murino correspondientes se muestran en las SEC ID. NO: 20 y-21, respectivamente. Los cóntigos humanos SOCS6 h6.1 y h6.2 se muestran en las SEC ID NO: 22 y 23, respectivamente.

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Ejemplo comparativo 28

SOCS7

Se reconocieron SOCS7 de ratón y ser humano a través de la búsqueda en las bases de datos de EST, usando el consenso SOCS box (Figura 13). Aquellos EST derivados de SOCS-7 cDNA de ratón y ser humano se exponen a continuación (Tablas 7.1 y 7.2). Usando la información de las secuencias derivadas de los EST de ratón, se diseñaron varios oligonucleótidos y se usaron para cribar, en el modo convencional, una colección de cDNA de timo de ratón. Un clon de cDNA (74-10A-11), el clon de cDNA que codifica SOCS7 de ratón, se aisló y secuenció en su totalidad, y demostró superponerse con los EST de ratón identificados en la base de datos (Figuras 25 y 26A). El análisis de la secuencia (Figura 26) sugiere que SOCS7 de ratón codifica una proteína con un SOCS box en su término C, además de varias repeticiones anquirina (Figura 25 y 26B). La relación de los cóntigos SOCS7 humanos (h7.1 y h.7.2; Figura 27) derivados del análisis de SOCS7 EST humanos (Tabla 7.2) a la secuencia de SOCS7 DNA de ratón se muestra en la Figura 25. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de SOCS7 murino correspondientes se muestran en las SEC ID NO: 24 y 25, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de cóntigos SOCS7 humanos h7.1 y h7.2 se muestran en las SEC ID NO: 26 y 27, respectivamente.

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Ejemplo comparativo 29

SOCS8

Los EST derivados de SOCS cDNA de ratón se exponen a continuación (Tabla 8.1). Como se describe para otros miembros de la familia SOCS, es posible aislar cDNA para SOCS8 de ratón usando la información de las secuencias derivadas de los EST de ratón. La relación de los EST a la región codificante prevista de SOCS8 se muestra en la Figura 28. Con la secuencia de nucleótidos obtenida de los EST que se muestran en la Figura 29A y la secuencia de aminoácidos parcial de SOCS8 que se muestra en la Figura 29B. La secuencia de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos correspondientes para SOCS8 murino se muestran en las SEC ID NO: 28 y 29, respectivamente.

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Ejemplo comparativo 30

SOCS9

Se reconocieron SOCS-9 de ser humano y ratón buscando en las bases de datos de EST, usando el consenso SOCS box (Figura 13). Aquellos EST derivados de SOCS9 cDNA de ratón y ser humano se exponen a continuación (Tablas 9.1 y 9.2). La relación de los cóntigos SOCS9 de ratón (m9.1; Figura 9.2) derivados del análisis del SOCS9 EST de ratón (Tabla 9.1) al cóntigo SOCS-9 DNA humano (h9.1; Figura 32) derivado del análisis de SOCS9 EST humanos (Tabla 9.2) se muestra en la Figura 31. El análisis de la secuencia (Figura 32) indica que el SOCS9 cDNA humano codifica una proteína con un SOCS box en su término C, además de un dominio SH2 (Figura 30). La secuencia de nucleótidos de SOCS9 cDNA murino se muestra en la SEC ID NO:30. La secuencia de nucleótidos de SOCS9 cDNA humano se muestra en la SEC ID NO:31.

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Ejemplo comparativo 31

SOCS10

Se reconocieron SOCS10 de ratón y ser humano a través de las búsquedas en las bases de datos de EST, usando el consenso SOCS box (Figura 13). Aquellos EST derivados de SOCS10 cDNA de ratón y ser humano se exponen a continuación (Tabla 10.1 y 10.2). Usando la información de las secuencias derivadas de los EST de ratón, se diseñaron varios oligonucleótidos y se usaron para cribar, en el modo convencional, una colección de cDNA de timo de ratón. Se aislaron cuatro clones de cDNA (10-9, 10-12, 10-23 y 10-24) que codifican SOCS10 de ratón, se secuenciaron en su totalidad y demostraron superponerse con los EST de ratón y humano identificados en la base de datos (Figuras 33 y 34). El análisis de la secuencia (Figura 34) indica que el clon SOCS10 cDNA de ratón no es de longitud total pero codifica una proteína con un SOCS box en su término C, además de varias repeticiones anquirina (Figura 33). La relación de los cóntigos SOCS10 humanos (h10.1 y h10.2; Figura 35) derivados del análisis de SOCS10 EST humanos (Tabla 10.2) a la secuencia SOCS10 DNA de ratón se muestra en la Figura 33. La comparación de los clones cDNA y los EST de ratón con los EST humanos indica que las regiones no traducidas 3' de SOCS10 de ratón y ser humano difieren significativamente. La secuencia de nucleótidos de SOCS10 murino se muestra en la SEC ID NO:32, y la secuencia de nucleótidos de cóntigos humanos SOCS10 h10.l y h10.2 se muestra en las SEC ID NO:33 y 34, respectivamente.

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Ejemplo comparativo 32

SOCS11

Se reconoció SOCS11 humano a través de la búsqueda en las bases de datos de EST, usando el consenso SOCS box (Figura 13). Aquellos EST derivados de SOCS11 cDNA humanos se exponen a continuación (Tabla 11.1 y 11.2). La relación de los cóntigos SOCS11 humanos (h11.1; Figura 36A, B), derivados de los análisis de EST (Tabla 11.2) a la proteína codificada prevista se muestra en la Figura 37. El análisis de la secuencia indica que SOCS11 cDNA humano codifica una proteína con SOCS box en su término C, además de un dominio SH2 (Figura 37 y 36B). La secuencia de nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos de SOCS11 humano se representan en las SEC ID NO:35 y 36, respectivamente.

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Ejemplo comparativo 33

SOCS12

Se reconoció SOCS-12 de ratón y humano a través de la búsqueda en las bases de datos de EST, usando el consenso SOCS box (Figura 13). Aquellos EST derivados de SOCS12 cDNA de ratón y humano se exponen a continuación (Tablas 12.1 y 12.2). Usando la información de las secuencias derivadas de EST de ratón, se diseñaron varios oligonucleótidos y se usaron para cribar, en el modo convencional, una colección de cDNA de timo de ratón. Se aislaron cuatro clones de cDNA (10-9, 10-12, 10-23 y 10-24) que codifican SOCS 12 de ratón, se secuenciaron en su totalidad y mostraron superponerse con los EST de ratón y humano identificados en la base de datos (Figura 38 y 39). El análisis de la secuencia (Figura 39 y 40) indica que el clon SOCS 12 cDNA codifica una proteína con un SOCS box en su término C, además de varias repeticiones anquirina (Figura 38). La relación de los cóntigos SOCS 12 humanos (h12.1 y h12.2; Figura 40) derivados del análisis de SOCS12 EST humanos (Tabla 12.2) a la secuencia SOCS12 DNA de ratón se muestra en la Figura 38. La comparación de los clones de cDNA y EST de ratón con los EST humanos sugiere que las regiones no traducidas 3' del SOCS 12 de ratón y humano difieren significativamente. La secuencia de nucleótidos de SOCS12 se muestra en la SEC ID NO:37. La secuencia de nucleótidos de los cóntigos SOCS12 humanos h12.1 y h12.se muestra en las SEC ID NO:38 y 39, respectivamente.

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Ejemplo comparativo 34

SOCS13

Se reconoció SOCS-13 de ratón y humano a través de la búsqueda en las bases de datos de EST, usando el consenso SOCS box (Figura 13). Aquellos EST derivados de SOCS13 cDNA de ratón y humano se exponen a continuación (Tabla 13.1 y 13.2). Usando la información de las secuencias derivadas de los EST de ratón, se diseñaron varios oligonucleótidos y se usaron para cribar, en el modo convencional, una colección de cDNA de timo de ratón y de embrión de ratón. Se aislaron tres clones de cDNA (62-1, 62-6-7 y 62-14) que codifican SOCS13 de ratón, se secuenciaron en su totalidad y demostraron superponerse con los EST de ratón identificados en la base de datos (Figura 41 y 42A). El análisis de la secuencia (Figura 42) indica que el SOCS13 cDNA de ratón codifica una proteína con un SOCS box en su término C, además de una repetición WD-40 potencial (Figura 41 y 42B). La relación de los cóntigos SOCS13 humanos (h13.1 y h13.2; Figura 43) derivados del análisis de SOCS13 EST humanos (Tabla 13.2) a la secuencia de SOCS13 DNA de ratón se muestra en la Figura 41. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de SOCS13 murino correspondiente se muestra en las SEC ID NO:40 y 41, respectivamente. La secuencia de nucleótidos del cóntigo SOCS13 humano h13.1 se muestra en la SEC ID NO:42.

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Ejemplo comparativo 35

SOCS14

Se reconoció SOCS-14 de ratón y humano a través de la búsqueda en las bases de datos de EST, usando el consenso SOCS box (Figura 13). Aquellos EST derivados de SOCS14 cDNA de ratón y humano se exponen a continuación (Tablas 14.1 y 14.2). Usando la información de la secuencia derivada de los EST de ratón y humano, se diseñaron varios oligonucleótidos y se usaron para cribar, en el modo convencional, una colección de cDNA de ratón, una colección de DNA genómico de ratón y una colección de cDNA de timo humano clonados al bacteriófago \lambda. Se aislaron y secuenciaron en su totalidad un clon de DNA genómico individual (57-2) y un clon de cDNA (5-3-2) que codifica SOCS14 de ratón, y se demostró que se superponen con los EST de ratón identificados en la base de datos (Figuras 44 y 45A). Toda la región codificante, además de la región 6 de las regiones no traducidas 5' y 3', de SOCS14 de ratón, parece estar codificada en un exón individual (Figura 44). El análisis de la secuencia (Figura 45) confirma que los clones SOCS14 de cDNA y genómico codifican una proteína con un SOCS box en su término C además de un dominio SH2 (Figura 44 y 45B). La relación del cóntigo SOCS14 humano (h14.1; Figura 14.3) derivado del análisis del clon cDNA 5-94-2 y los SOCS14 EST humanos (Tabla 14.2) a la secuencia de SOCS14 DNA de ratón se muestra en la Figura 44.

La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de SOCS14 murino correspondiente se muestran en las SEC ID NO: 43 y 44, respectivamente.

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Ejemplo comparativo 36

SOCS15

Se reconoció SOCS15 de ratón y humano a través de la búsqueda en las bases de datos de DNA, usando el consenso SOCS box (Figura 13). Aquellos EST derivados de SOCS15 cDNA de ratón y humano se exponen a continuación (Tablas 15.1 y 15.2), ya que son BAC de ratón y humano que contienen todos los genes SOCS-15 de ratón y ser humano. Usando la información de la secuencia derivada de los EST y los BAC, es posible predecir toda la secuencia de aminoácidos de SOCS15 y, como se describe para los otros genes SOC, es factible diseñar sondas de oligonucleótidos específicas para poder aislar los cDNA. La relación de los BAC a los EST se muestra en la Figura 46 y la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos prevista del SOCS-15, derivada de los BAC de ratón y ser humano se muestra en las Figuras 47 y 48. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de SOCS15 murino correspondiente se muestran en las SEC ID NO:46 y 47, respectivamente. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de SOCS15 humano correspondiente se muestran en las SEC ID NO:48 y 49, respectivamente.

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Ejemplo 37

Interacción de SOCS con cinasa JAK2

Estos ejemplos muestran la interacción entre SOCS y la cinasa JAK2. La interacción es mediada por el dominio SH2 de SOCS1, 2, 3 y CIS. La interacción proporcionó la inhibición de la actividad de la cinasa JAK2 por SOCS1 (Figura 49). La interacción general entre JAK2 y SOCS1, 2, 3 y CIS se muestra en la Figura 50.

Se emplean los siguientes métodos:

Inmunoprecipitación: Se transfectaron transitoriamente células Cos 6 por electroporación y se cultivaron durante 48 horas. Las células luego se lisaron sobre hielo en tampón de lisis (Tris 50 mM /HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton-X-100 al 1%v/v, EDTA 1 mM, Naf 1 mM, Na_{3} 1 mM VO_{4}) con la adición de inhibidores de proteasa complete (Boehringer Mannheim), se centrifugaron a 4ºC (14.000 x g, 10 min.), y se retuvo el sobrenadante para inmunoprecipitación. Las proteínas JAK2 inmunoprecipitaron usando 5 \mul de anticuerpo anti-JAK2 (UBI). Los complejos antígeno-anticuerpo se recuperaron usando la proteína A-Sepharose (30 \mul de una suspensión al 50%).

Inmunotransferencia: los inmunoprecipitados se analizaron por dodecilsulfato sódico (SDS)-electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) bajo condiciones de reducción. La proteína se transfirió luego electroforéticamente a nitrocelulosa, se bloqueó durante una noche en 10% p/v leche desnatada y se lavó en PBS/Tween-20 al 0,1% v/v (Sigma) (tampón de lavado) antes de la incubación con anticuerpo anti-fosfotirosina (4G10) (1:5000, UBI), anticuerpo anti-FLAG (1,6 \mug/ml) o anticuerpo anti-JAK2 (1:2000, UBI) diluido en tampón de lavado/BSA al 1% p/v durante 2 h. Se lavaron transferencias de nitrocelulosa y se detectó el anticuerpo primario con inmunoglobulina anticonejo de oveja conjugada con peroxidasa (1:5000, Silenus) o inmunoglobulina antirratón de oveja conjugada con peroxidasa (1:5000, Silenus) diluida en tampón de lavado/BSA al 1% p/v. Se lavaron las transferencias y se visualizó la unión de anticuerpos usando el sistema de quimioluminiscencia potenciada (ECL) (Amersham, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ensayo de cinasa in vitro: Se llevó a cabo un ensayo de cinasa in vitro para evaluar la actividad catalítica de la cinasa JAK2 intrínseca. Inmunoprecipitó la proteína JAK2 como se describió, se lavó dos veces en tampón de ensayo de cinasa (NaCl 50 mM, MgCl_{2} 5 mM, MnCl2 5 mM, NaF 1 mM, Na_{3}VO_{4} 1 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4) y se suspendió en un volumen equivalente de tampón de cinasa que contenía 0,25 \muC/ml (\gamma-^{32}P)-ATP (30 min, temperatura ambiente). Se eliminó el exceso de (\gamma-P)-ATP y los inmunoprecipitados se analizaron por SDS/PAGE bajo condiciones de reducción. Los geles se sometieron a hidrólisis alcalina leve por tratamiento con KOH 1 M (55ºC, 2 horas) para eliminar la fosfoserina y la fosfotreonina. Las bandas radiactivas se visualizaron con el software IMAGEQUANT en un sistema PhosphorImage (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, EE. UU.).

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Ejemplo comparativo 38

Elaboración de constructos SOCS-1 inactivados

Los diagramas de constructos de plásmidos y constructos inactivados se muestran en las Figuras 51-53. El clon SOCS-1 genómico 95-11-10 se digirió con las enzimas de restricción BamH1 y EcoR1 para obtener un fragmento de DNA de 3,6Kb 3'de la región codificante (exón SOCS-1), que se usó como el brazo 3' en los vectores inactivados SOCS-1. Los extremos de este fragmento luego se enromaron. Este fragmento se ligó luego a los siguientes vectores:

pBgalpAloxNeo y

pBgalpAloxNeoTK

que habían sido linealizados en el sitio XhoI único y luego se enromaron. Esta ligadura proporcionó la formación de los siguientes vectores:

brazo 3' SOCS-1 en pBgalpAloxNeo y

brazo 3'SOCS-1 en pBgalpAloxNeoTK

El brazo 5' de los vectores inactivados SOCS-1 se construyó usando PCR para generar un producto PCR de 2,5Kb a partir del clon SOCS-1 genómico 95-11-10 justo en 5' de la región codificante SOCS-1 (exón SOCS-1). Los oligo utilizados para generar este producto fueron:

5' oligo (sentido) (2465)
AGCT AGA TCT GGA CCC TAC AAT GGC AGC	[SEC ID NO:49]
3' oligo (antisentido) (2466)
AGCT AG ATC TGC CAT CCT ACT CGA GGG GCC AGC TGG	[SEC ID NO:50]

El producto PCR se digirió luego con la enzima de restricción BglII, para generar extremos BglII hacia el producto PCR. Este producto 5' SOCS-1 PCR, con los extremos BglII, se ligó luego de la siguiente manera:

brazo 3'SOCS-1 en pBgalpAloxNeo y brazo 3'SOCS-1 en pBgalpAloxNeoTK, que habían sido linealizados con la enzima de restricción única BamHl. Esto proporcionó la formación de los siguientes vectores:

brazos 5' y 3'SOCS-1 en pBgalpAloxNeo y

brazos 5' y 3'SOCS-1 en pBgalpAloxNeoTK

Éstos fueron los constructos inactivos SOCS-1 finales. Ambos constructos carecían de la región codificante SOCS-1 entera (EXÓN SOCS-1), reemplazada con porciones de las secuencias de Bgal, B globina polyA, promotor PGK, neomicina y PGK polyA. Los brazos 5' y 3' SOCS-1 en el vector pBgalpAloxNeoTK también contenían la secuencia del gen timidina cinasa, entre las secuencias de neomicina y PGK poly A.

Vectores: los brazos 5' y 3' SOCS-1 en pBgalpAloxNeo y los brazos 5' y 3' SOCS-1 en pBgalpAloxNeoTK se linealizaron con la enzima de restricción única Notl y luego se transfectaron a embriocitoblastos por electroporación. Los clones resistentes a la neomicina se seleccionaron y analizaron por análisis Southern para determinar si contenían la secuencia diana SOCS-1 correctamente integrada. Para determinar si había tenido lugar la correcta integración, se digirió DNA genómico de los clones resistentes a neomicina con la enzima de restricción EcoR1. El DNA digerido se transfirió luego a filtros de nylon y se sondeó con EcoR1 de 1,5 Kb/fragmento HindIII DNA, que estaba además 5' de la secuencia del brazo 5' utilizada en los constructos inactivados. Los tamaños de las bandas esperados para la integración correcta fueron:

alelo SOCS-1 de tipo salvaje de 5,4Kb

alelo SOCS-1 inactivado de 8,2Kb en los brazos 5' y 3'SOCS-1 en pBgalpAloxNeo u 11Kb en los brazos 5'y 3'SOCS-1 en células transformadas apBgalpAloxNeoTK.

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TABLA 4.1 Resumen de EST derivados de SOCS-4 cDNA de ratón

7

8

TABLA 4.2 Resumen de EST derivados de SOCS-4 cDNA humanos

9

10

TABLA 5.1 Resumen de EST derivados de SOCS-5 cDNA de ratón

12

TABLA 5.2 Resumen de EST derivados de SOCS-5 cDNA humanos

13

TABLA 6.1 Resumen de EST derivados de SOCS-6 cDNA de ratón

14

15

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TABLA 6.2 Resumen de EST derivados de SOCS-S cDNA humanos

16

17

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TABLA 7.1 Resumen de EST derivados de SOCS-7 cDNA de ratón

18

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TABLA 7.2 Resumen de EST derivados de SOCS-5 cDNA humanos

19

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TABLA 8.1 Resumen de EST derivados de SOCS-S cDNA de ratón

20

TABLA 9.1 Resumen de EST derivados de SOCS-9 cDNA de ratón

21

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TABLA 9.2 Resumen de EST derivados de SOCS-S cDNA humanos

22

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TABLA 10.1 Resumen de EST derivados de SOCS-10 cDNA de ratón

23

TABLA 10.2 Resumen de EST derivados de SOCS-5 cDNA humanos

24

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TABLA 11.1 Resumen de EST derivados de SOCS-5 cDNA humanos

25

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TABLA 12.1 Resumen de EST derivados de SOCS-12 cDNA de ratón

26

TABLA 12.2 Resumen de EST derivados de SOCS-5 cDNA humanos

27

TABLA 13.1 Resumen de EST derivados de SOCS-13 cDNA de ratón

28

TABLA 13.2 Resumen de EST derivados de SOCS-13 cDNA humanos

29

TABLA 14.1 Resumen de EST derivados de SOCS-14 cDNA de ratón

30

TABLA 15.1 Resumen de EST derivados de SOCS-15 cDNA de ratón

31

32

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\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 15.2 Resumen de EST derivados de SOCS-15 cDNA humanos

33

Bibliografía

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: (distinto de US) THE WALTER AND ELIZA HALL INSTITUTE OF MEDICAL RESEARCH (solo US)

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: AGENTES TERAPÉUTICOS Y DE DIAGNÓSTICO

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 49

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: DAVIES COLLISON CAVE

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 1 LITTLE COLLINS STREET

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(C)

CIUDAD: MELBOURNE

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(D)

ESTADO: VICTORIA

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(E)

PAÍS: AUSTRALIA

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 3000

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMATO DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Floppy disk

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(B)

ORDENADOR: PC compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25

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(vi)

DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PCT INTERNACIONAL

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 31-OCT-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUD PRIORITARIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PO5117

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 14-FEB-1997

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(vii)

DATOS DE SOLICITUD PRIORITARIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PO 3384

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 01-NOV-1996

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: HUGHES DR, E JOHN L

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: EJH/EK

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TÉFONO: +61 3 9254 2777

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: +61 3 9254 2770

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACGCCGCCC ACGTGAAGGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCGCCAATG ACAAGACGCT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1236 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..636

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 212 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1121 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 223..819

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 198 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2187 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 18..695

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

39

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 225 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1094 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 211 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2807 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

47

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 212 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1611 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 263..1529

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

50

51

52

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 422 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

54

55

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 783 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

57

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1122 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

59

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2537 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 422..2029

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

61

62

63

64

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 535 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

66

67

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1221 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2369 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 116..1330

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

70

71

72

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 404 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

74

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1246 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 422 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2019 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

78

79

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 350 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

81

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 419 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

\vskip1.000000\baselineskip

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 595 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 896 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 4..396

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

85

86

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 130 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

\vskip1.000000\baselineskip

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 436 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

89

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2180 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

90

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2649 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:32:

92

93

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 495 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

\vskip1.000000\baselineskip

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 709 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 848 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..624

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

97

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 207 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

\vskip1.000000\baselineskip

99

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 464 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:37:

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 747 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:38:

\vskip1.000000\baselineskip

102

103

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1018 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:39:

104

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1897 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:40:

105

106

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 134 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:41:

107

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 265 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:42:

108

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2438 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:43:

109

110

111

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 542 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:44:

113

114

115

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4999 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:45:

116

117

118

119

120

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 264 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:46:

121

122

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5615 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:47:

123

124

125

126

127

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 263 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:48:

128

129

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTAGATCT GGACCCTACA ATGGCAGC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:50:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTAGATCT GCCATCCTAC TCGAGGGGCC AGCTGG

\hfill

36

Claims (34)

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o es complementaria a una secuencia que codifica, una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID No 8 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70% similitud con la SEC ID NO 8, en donde dicha proteína comprende un SOCS box en su región C-terminal y modula la transducción de señales.

2. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos es como se expone en la SEC ID NO 7, o tiene por lo menos 70% similitud con la SEC ID NO 7 o es capaz de hibridarse a la SEC ID NO 7 bajo condiciones rigurosas a 42ºC.

3. Una proteína aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO 8 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70% similitud con la SEC ID NO 8, en donde la proteína comprende un SOCS box en su región C-terminal y modula la transducción de señales.

4. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o una proteína según la reivindicación 3, en la que la proteína comprende un dominio SK2 en una región N-terminal del SOCS box.

5. Una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4 o una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, en la que la transducción de señales está mediada por una citocina u otra molécula endógena, una hormona, un microbio o un producto microbiano, un parásito, un antígeno u otra molécula efectora.

6. Una molécula de ácido nucleico o una proteína según la reivindicación 5, en la que la proteína modula la transducción de señales mediada por citocinas.

7. Una molécula de ácido nucleico o una proteína según la reivindicación 6, en la que la transducción de señales está mediada por una o más de las citocinas G-CSF, IL-6 y/o LIF.

8. Un método in vitro para modular los niveles de una proteína SOCS-3 en una célula, comprendiendo dicho método poner en contacto una célula que contiene un gen SOCS-3 con una cantidad eficaz de un modulador de la expresión del gen SOCS-3 como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4 a 7, o de la actividad de una proteína SOCS-3 según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para modular los niveles de dicha proteína SOCS-3.

9. Un método in vitro para modular la transducción de señales en una célula que contiene un gen SOCS-3 que comprende poner en contacto dicha célula con una cantidad eficaz de un modulador de la expresión del gen SOCS-3 según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4 a 7, o de la actividad de una proteína SOCS-3 según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 durante un tiempo suficiente para modular la transducción de señales.

10. Un método in vitro para influir en la interacción entre las células, en el que por lo menos una célula porta un gen SOCS-3, comprendiendo dicho método poner en contacto la célula que porta el gen SOCS-3 con una cantidad eficaz de un modulador de la expresión del gen SOCS-3 según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4 a 7, o de la actividad de una proteína SOCS-3 según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 durante un tiempo suficiente para modular la transducción de señales.

11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la transducción de señales es mediada por un mediador según se ha definido en las reivindicaciones 5 a 7.

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que la proteína SOCS-3 es como se ha definido en las reivindicaciones 3 a 7 y/o el gen SOCS-3 comprende una molécula de ácido nucleico según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4 a 7.

13. Un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia complementaria a por lo menos una porción de la secuencia "sentido" de una molécula de ácido nucleico según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4 a 7, siendo dicho oligonucleótido antisentido un antagonista de SOCS-3 capaz de inhibir la expresión del gen SOCS-3.

14. Una composición farmacéutica que comprende una proteína según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, y uno o más vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

15. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4 a 7.

16. Una línea celular de mamífero transgénica que expresa una molécula de ácido nucleico según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4 a 7.

17. Uso de una proteína según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la hiperinmunidad, inmunosupresión, alergias e hipertensión.

18. Uso de un modulador de la expresión de un gen SOCS-3 que comprende una secuencia de nucleótidos según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4 a 7, o según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, o de la actividad de una proteína SOCS-3 según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la hiperinmunidad, inmunosupresión, alergias e hipertensión.

19. Un anticuerpo o su fragmento que es específico de una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7.

20. Un anticuerpo o su fragmento según la reivindicación 19, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo sintético o un anticuerpo recombinante.

21. Un anticuerpo o su fragmento según la reivindicación 19 o la reivindicación 20, en el que dicho anticuerpo está marcado con una molécula indicadora.

22. Un anticuerpo o su fragmento que es específico de un anticuerpo o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 y que está opcionalmente marcado con una molécula indicadora.

23. Un método para detectar una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 en una muestra, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo o su fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar un complejo entre dicha proteína y dicho o anticuerpo o fragmento de anticuerpo y luego detectar dicho complejo.

24. Un método según la reivindicación 23, en el que dicha muestra es una muestra biológica.

25. Un método según la reivindicación 24, en el que dicha muestra biológica es un extracto celular.

26. Un método según la reivindicación 25, en el que la muestra biológica es un fluido biológico.

27. Un método según la reivindicación 26, en el que el fluido biológico se selecciona entre suero, saliva, secreciones mucosas, linfa, líquido intersticial y fluido respiratorio.

28. Un método según la reivindicación 23, en el que la muestra es un fluido de fermentación o fluido sobrenadante tal como el proveniente de un cultivo celular.

29. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28, en el que el método es un inmunoensayo.

30. Un método según la reivindicación 29, en el que el inmunoensayo es un ELISA.

31. Un método según la reivindicación 29, en el que el método es un ensayo sándwich.

32. Un método según la reivindicación 29, en el que el inmunoensayo es una inmunotransferencia.

33. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, que es cuantitativo.

34. Uso de un anticuerpo o su fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22 para purificar una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7.