PT1129064E - Reagentes de transfecção - Google Patents

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PT1129064E PT99971794T PT99971794T PT1129064E PT 1129064 E PT1129064 E PT 1129064E PT 99971794 T PT99971794 T PT 99971794T PT 99971794 T PT99971794 T PT 99971794T PT 1129064 E PT1129064 E PT 1129064E
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Malek Masoud
Gulilat Gebeyehu
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Description

DESCRIÇÃO
REAGENTES DE TRANSFECÇÃO
Antecedentes da Invenção
Campo da Invenção A presente invenção relaciona-se com lipidos catiónicos e composições de lipidos catiónicos que têm utilidade em agregados de lipidos para a transferência de macromoléculas e outros compostos para dentro de células. Técnica Relacionada
Verificou-se que os agregados de lipidos, tais como os lipossomas, são úteis como agentes de transferência para introduzir macromoléculas, tais como ADN, ARN, proteína e pequenos compostos químicos, tais como produtos farmacêuticos em células. Em particular, verificou-se que os agregados de lipidos que compreendem componentes lipidos catiónicos são especialmente eficazes para transferir moléculas aniónicas para células. Em parte, crê-se que a eficácia dos lipidos catiónicos resulta da afinidade aumentada por células, muitas das quais são portadoras de uma carga negativa líquida. Do mesmo modo, em parte, a carga positiva líquida sobre os agregados de lipidos que compreendem um lípido catiónico permite que o agregado se ligue a polianiões, tais como ácidos nucleicos. Sabe-se que os agregados de lipidos que contêm ADN são eficazes para a eficiente transfecção de células alvo. 1 A estrutura de vários tipos de agregados de lipidos varia, dependendo da composição e do método de formar o agregado. Tais agregados incluem lipossomas, vesículas unilamelares, vesículas multilamelares, micelas e outros, tendo dimensões particulares na gama nanométrica a micrométrica. Os métodos para preparar agregados de lipidos são, por agora, bem conhecidos na técnica. 0 problema principal da utilização de lipossomas contendo fosfolípidos convencionais para transferência é que o material a ser transferido tem de estar encapsulado e a composição do lipossoma ter uma carga negativa líquida que não é atraída para a superfície carregada negativamente das células. Ao se combinar compostos de lipidos catiónicos com um fosfolípido, vesículas carregadas positivamente e outros tipos de agregados de lipidos podem ligar-se ao ADN, que é negativamente carregado, podem ser retomados por células alvo e podem transfectar as células alvo. (Felgner, P. L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 84:7413-7417; Eppstein, D. et al., Patente U.S. N° 4.897.355).
Um lípido catiónico bem conhecido é o cloreto de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamónio (DOTMA). A estrutura do DOTMA é: CH3(CH2)7CH=CH(CH2)8— o— ch2 I Cl*
CH3(CH2)7CH=CH(CH2)8—O—CH CH2-N+(CH3)3 0 DOTMA por si só ou numa combinação 1:1 com dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) é formulado como lipossomas utilizando técnicas padrão. Felgner et al., supra, demonstraram que tais lipossomas proporcionaram uma eficaz transferência de ácidos 2 nucleicos para alguns tipos de células. Uma formulação de DOTMA:DOPE (1:1) é vendida sob o nome comercial de LIPOFECTIN (Life Technologies, Inc., Rockville, MD). Outro lipido catiónico disponível comercialmente é o 1,2-bis-(oleoiloxi)-3-3-propanoato de trimetilamónio (DOTAP), que difere do DOTMA apenas por as unidades de oleoilo estarem ligadas por meio de éster, em vez de ligações por éter à propilamina. Um grupo de compostos relacionado difere do DOTMA e DOTAP por um dos grupos metilo do grupo trimetilamónio estar substituído por um grupo hidroxietilo. Os compostos deste tipo são semelhantes ao Inibidor Rosenthal (RI) da fosfolipase A (Rosenthal, A. F. e Geyer, R. P. (1960) J. Biol. Chem. 235: 2202-2206) que tem ésteres estearoílicos ligados ao núcleo da propilamina. Os análogos de dioleoilo do RI são, de um modo geral, abreviados como DORI-éter e DORI-éster, dependendo da ligação das unidades de ácido gordo ao núcleo da propilamina. O grupo hidroxilo pode ser utilizado como um sítio para funcionalização adicional. O análogo de RI demiristiloxi é conhecido como DMRIE. Uma formulação 1:1 (M/M) de DMRIE:colesterol é vendida com o nome comercial de DMRIE-C (Life Technologies, Inc., Rockville, MD). A estrutura do DMRIE é: CH3-(CH2)13-0-1 CH3
ch3
Outra classe de compostos foi descrita por Behr et ai., (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 86:6982-6986; publicação EP 0 394 111 (24 de Outubro de 1990), em que a carboxiespermina foi 3 conjugada com dois tipos de lipidos. As estruturas de 5-carboxiespermilglicina dioctadecilamida (DOGS) é:
\ II II ^-C-CHz-NH-C-CH-fCHzfeNHÍCHakNHz
R NH(CH2)3NH2 R=CH3(CH2)17 A estrutura de dipalmitoilfosfatidiletanolamina 5-carboxiespermilamida (DPPES) é:
O
II R-C-O-CHa
R-C-O-CH Q Q II | || || 0 CHj-O- P- O-CHj- CH2NH-C—CH— (CHjfeNHtCH^N^ NH(CH2)3NH2 o* R=CH3(CH2)15
Tanto DOGS como DPPES foram utilizados para revestir plasmideos, formando um complexo de agregado de lípido que proporciona uma transfecção eficaz. Reivindica-se que os compostos são mais eficazes e menos tóxicos do que o DOTMA para a transfecção de algumas linhagens de células. 0 DOGS encontra-se disponível comercialmente como TRANSFECTAM™ (Promega, Madison, Wis.).
Foi também descrita uma outra classe de compostos em que a carboxi espermina foi conjugada a lipidos por meio de uma ligação amida (Gebeyehu, G. et al., Patente U. S. N° 5.334.761). Estes compostos são úteis para a eficaz transferência de ácidos nucleicos 4 para várias células e são também intermediários para preparar outros lipidos deste tipo. 0 2,3-di-oleiloxi-N-[2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-l-propan-aminio (DOSPA) encontra-se disponível como uma formulação 3:1 (p/p) com DOPE com o nome comercial de LipofectAMINE (disponível da Life Technologies, Inc., Rockville, MD). A estrutura do DOSPA é como a seguir:
CH3 (CH2)3 nh2
Foram também descritos compostos de lipidos com um grupo espermina de cabeça (Haces, A., et al., Patente U. S. N° 5.674.908). Estes compostos são especialmente úteis para a transferência de ácidos nucleicos para células de insectos. Uma formulação 1:1,5 (M/M) de tetrametiltetrapalmitil espermina (TM- TPS) para DOPE encontra-se disponível comercialmente com o nome comercial de CellFECTIN (Life Technologies, Inc., Rockville, MD). A estrutura de TM-TPS está apresentada adiante:
Wl5 (CH^s (CHa)* (CHa)* CH3 ch3 CH3 CH3 5
Um derivado de colesterol catiónico (DC-Col) foi sintetizado e formulado em lipossomas em combinação com DOPE. (Gao. X. e Huang, L. (1991) Biochim. Biophys. Res. Comm. 179:280-285). A estrutura do composto é: chk 8
. N^H-ÍClMíNH-C-l Colesterol |J CH^ f
Diz-se que os lipossomas formulados com DC-Col proporcionam uma transfecção mais eficaz e uma toxicidade mais baixa do que os lipossomas que contêm DOTMA para algumas linhagem de células. A lipopolilisina, formada pela conjugação de polilisina com DOPE, foi relatada como sendo especialmente eficaz para a transfecção na presença de soro, uma circunstância possível de ser encontrada in vivo (Zhou, X. et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065: 8-14) . O documento WO 97/42819 descreve outros tipos de lípidos catiónicos para a transfecção de ácidos nucleicos em células. O documento US 5.744.335 descreve um método para transfectar uma célula com um polinucleótido misturado com um ou mais compostos antipáticos e uma proteína de ligação ao ADN, tal como Hl, H2A ou H2B. Os compostos anfipáticos descritos incluem compostos anfipáticos catiónicos compreendendo uma unidade não natural de poliamina e uma unidade hidrófoba.
McCloskie et al., Antisense & Nucleic Acid Drug Development (1998), 8(5), páginas 401-414, descreve a transferência directa do 6 ADN para o sistema respiratório de murganhos utilizando ADN nu e formulado com lipido. Os lipidos descritos incluem análogos de tetrametiltetralquilespermina e formulações de DMRIE/colesterol. 0 documento EP 0846680 descreve outros lipidos catiónicos para a transferência de ácidos nucleicos para células, particularmente lipidos guanidino. O documento US 5.830.430 descreve lipidos catiónicos para a transferência de materiais bioactivos, tais como ácidos nucleicos e produtos farmacêuticos para células, particularmente lipidos compreendendo, pelo menos, dois grupos catiónicos. O documento WO 98/40502 descreve composições compreendendo péptidos e agentes de transfecção, tais como lipidos catiónicos e polímeros dendrímeros para a transfecção de células eucarióticas. Os péptidos podem ser acoplados aos agentes de transfecção. O documento WO 98/40499 descreve métodos e composições para transfectar tecidos epiteliais mucosais de murinos com complexos de ácido nucleico/lípido catiónico. 0 documento WO 98/02190 descreve anfifílicos catiónicos que facilitam o transporte de moléculas biologicamente activas, incluindo polinucleótidos, para dentro de células. Os anfifílicos catiónicos contêm grupos lipófilos derivados de esteróides, mono ou dialquilaminas, grupos alquilo ou acilo e grupos catiónicos derivados de aminas, alquilaminas ou polialquilaminas. O documento FR 1567214 descreve um detergente para ser utilizado em máquinas de lavar roupas compreendendo moléculas catiónicas. 7
Apesar dos avanços no campo, permanece uma necessidade de uma variedade de compostos de lipidos catiónicos melhorados. Em particular, não foi encontrado, até a data, um único lipido catiónico que funcione bem com todas as células. Uma vez que tipos diferentes de célula diferem uns dos outros na composição da membrana, não é surpreendente que composições e tipos de agregados de lipidos diferentes sejam eficazes para tipos de células diferentes, quer por sua capacidade de entrar em contacto e fundir com as membranas da célula alvo, quer por aspectos do próprio processo de transferência. Na actualidade, estes processos não são bem entendidos, consequentemente, a concepção de precursores lipossomais eficazes é muito empírica. Para além do conteúdo e da transferência, outros factores são de importância, por exemplo, a capacidade de formar agregados de lipidos adequados às finalidades pretendidas, a possibilidade de transfectar as células na presença de soro, a toxicidade para a célula alvo, a estabilidade com um transportador para o composto a ser transferido e a capacidade de funcionar num ambiente in vivo. Além disso, os agregados de lipidos podem ser melhorados ampliando a gama de substâncias que podem ser transferidas para as células. Os compostos de lipidos catiónicos da presente invenção têm uma função melhorada no que diz respeito a vários dos atributos precedentes.
Sumário da Invenção
Um composto tendo a fórmula:
0R7 (R|)r (R4X1 0R8 8 em que Q é N; L é um radical orgânico bivalente capaz de ligar cada Q;
Ri, R3, R4 e Rç , independentemente um do outro, são seleccionados de grupo que consiste em H e alcenilo C8-C24, arilo C8-C24 e alquilo C8-C24 opcionalmente substituídos por um ou mais de um álcool, uma amina, uma amida, um éter, um poliéter, uma poliamida, um éster, um mercaptano, uma ureia, uma tioureia, um guanidilo ou um grupo carbamoílo; e em que, pelo menos um de Ri, R3, R4 e Rs é um grupo alquilo ou alcenilo de cadeia linear ou ramificada ou um grupo arilo; X' é um anião fisiologicamente aceitável; a é o número de carga positiva a dividir pela valência de X; r, s, u e y são 0 ou 1, desde que as necessidades de valência do azoto sejam satisfeitas; e R7 e R8 são H.
Os compostos da invenção são úteis, quer sós ou em combinação com outros componentes formadores de agregados de lípidos (e.g., DOPE, DOPC ou colesterol) para a formulação em lipossomas ou outros agregados de lípidos. Tais agregados são policatiónicos capazes de formar complexos estáveis com macromoléculas aniónicas, tais como ácidos nucleicos. 0 complexo macromolecular de agregado de lípidos 9 interage com as células tornando a macromolécula disponível para absorção e retomada pela célula. A presente invenção proporciona um agregado de lípidos compreendendo um ou mais dos compostos da presente invenção. De preferência, o agregado de lípidos compreende, pelo menos, um composto formador de agregado de lípidos. De preferência, o composto formador de agregado de lípidos é seleccionado do grupo que consiste em DOPE, DOPC e colesterol.
Os compostos da presente invenção também podem ser conjugados ou misturados ou utilizados em conjunto com uma variedade de moléculas e substâncias úteis, tais como proteínas, péptidos, factores de crescimento e outros, para intensificar a vectorização celular, a retomada, a internalização, a vectorização nuclear e a expressão.
Esta invenção também inclui agregados de lípidos compreendendo um ou mais compostos da presente invenção ou misturas dos mesmos. Tais agregados de lípidos podem ser combinados com um ou mais componentes formadores de agregado e/ou intensificadores de transfecção.
Os métodos de transfecção aqui descritos, que utilizam os compostos ou composições (tais como os descritos acima) da presente invenção ou misturas destes podem ser aplicados na transfecção de células in vitro, particularmente para a transfecção de células ou tecidos eucarióticos, incluindo células animais, células de seres humanos, células de insectos, células de plantas, células de aves, células de peixes, células de mamíferos e outros.
Em concordância, a presente invenção proporciona um método para introduzir um polianião numa célula ou células, em que o 10 método compreende formar um lipossoma a partir de um composto carregado positivamente de acordo com a invenção, pôr o lipossoma em contacto com o polianião para formar um complexo de polianião-lipossoma carregado positivamente e incubar o complexo com uma célula ou células.
Os métodos aqui descritos podem ser utilizados para gerar células ou tecidos transfectados que expressam produtos génicos úteis. Os métodos aqui descritos também podem ser utilizados como um passo na produção de animais transgénicos. Os métodos aqui descritos são úteis em qualquer método terapêutico que necessita introduzir ácidos nucleicos no interior de células ou tecidos. Em particular, estes métodos são úteis no tratamento de cancro, em terapêutica génica ex vivo e em métodos para diagnóstico. Ver, por exemplo, a patente U.S. N° 5.589.466 de Felgner, et al. Os compostos ou composições de transfecção desta invenção podem ser utilizados como reagentes de investigação em qualquer transfecção de células ou tecidos realizada com a finalidade de investigação. Os ácidos nucleicos que podem ser transfectados por meio dos métodos desta invenção incluem ADN e ARN de qualquer fonte compreendendo bases naturais ou bases não naturais e incluem aqueles que codificam e que são capazes de expressar proteínas terapêuticas ou úteis de alguma forma em células ou tecidos, aqueles que inibem a expressão dos ácidos nucleicos em células ou tecidos, aqueles que inibem a capacidade enzimática ou que activam as enzimas, aqueles que catalisam as reacções (ribozimas) e aqueles que funcionam em ensaios para diagnóstico.
Os compostos, composições e métodos aqui proporcionados também podem ser prontamente adaptados, em virtude da presente descrição, para introduzir dentro de células, macromoléculas biologicamente activas ou substâncias que não sejam ácidos nucleicos, incluindo, entre outras, poliaminas, ácidos de 11 poliamina, polipéptidos, biotina e polissacáridos. Outros materiais úteis, por exemplo, agentes terapêuticos, materiais para diagnóstico e reagentes de investigação, podem ser introduzidos em células por meio dos métodos desta descrição. Num aspecto preferido, qualquer vector de ácido nucleico pode ser transferido para uma célula ou para o seu interior por meio da presente invenção.
Em concordância, é descrito um método para introduzir uma substância biologicamente activa dentro de uma célula, em que o método compreende formar um lipossoma de um composto de acordo com a invenção e uma substância biologicamente activa e incubar o lipossoma com uma célula ou cultura de células. A invenção também se relaciona com composições que compreendem um ou mais compostos da invenção e um ou mais componentes adicionais seleccionados que consistem em ácidos nucleicos, uma célula, uma cultura de células, células, tampões, meios de cultura, substância biologicamente activa, lipidos neutros e intensificadores de transfecção, de preferência, um ácido nucleico. A invenção também inclui kits de transfecção que incluem um ou mais dos compostos ou composições da presente invenção ou misturas destes. Particularmente, a invenção proporciona um kit compreendendo um ou mais dos compostos da presente invenção e, pelo menos, um componente adicional seleccionado do grupo que consiste numa célula, células, um meio de cultura de células, um ácido nucleico, um intensificador de transfecção e instruções para transfectar uma células ou células. A descrição também se relaciona com intermediários e métodos para a utilização de tais intermediários para preparar os compostos 12 ou composições a invenção. A descrição também se relaciona com composições, compostos ou componentes obtidos pela interacção de materiais (intermediários, compostos, lipidos, etc.) utilizados no método de síntese da invenção.
Outras formas de realização preferidas da presente invenção tornar-se-ão evidentes a um especialista na técnica em virtude dos seguintes desenhos e descrição da invenção.
Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 é um gráfico que ilustra a transfecção de células HEK-293 com reagentes de transfecção catiónicos. A Figura 2 é um gráfico que ilustra a transfecção de células COS-7 com reagentes de transfecção catiónicos. A Figura 3 é um gráfico que ilustra a transfecção de células CH0-K1 com reagentes de transfecção catiónicos. A Figura 4 é um gráfico que ilustra a transfecção de células HeLa com reagentes de transfecção catiónicos.
Descrição Pormenorizada das Formas de Realização Preferidas A presente invenção relaciona-se com lipidos catiónicos e composições de lipidos catiónicos que têm utilidade em agregados de lipidos para a transferência de macromoléculas e outros compostos para dentro de células. Os compostos podem ser utilizados sós ou em combinação com outros compostos para preparar lipossomas e outros 13 agregados de lípidos adequados para a transfecção ou transferência dos compostos para as células alvo in vitro.
De preferência, os compostos da presente invenção são policatiónicos e, deste modo, de preferência, formam complexos altamente estáveis com várias macromoléculas aniónicas, particularmente polianiões, tais como ácidos nucleicos. Estes compostos têm a propriedade, quando dispersos em água, de formar agregados de lipidos que se associam fortemente com os polianiões, por meio da sua porção catiónica. Quando se utiliza um excesso de cargas catiónicas em relação ao composto aniónico, os complexos polianião-lipido podem ser adsorvidos nas membranas celulares, facilitando, deste modo, a retomada do composto desejado pelas células. A descrição também se relaciona com intermediários para preparar os compostos e composições da invenção.
Mais especificamente, a presente invenção relaciona-se com um lipido catiónico para transfecção, o qual tem uma eficácia de transfecção superior aos produtos disponíveis comercialmente nos três tipos de célula mais comuns utilizados em investigação de expressão (CH0-K1, COS-7 e HEK293) tornando o mesmo útil para aplicações de alta produtividade; e, o qual tem um protocolo de fácil utilização, conforme definido pelo facto de que não são necessários reagentes adicionais (e.g., tal como o reagente LipofectAMINE PLUS disponível da Life Technologies, Inc.,
Rockville, MD) , nenhuma remoção de soro e, deste modo, não são necessárias mudanças de meios e o complexo ADN/lípido não necessita ser removido das células antes do ensaio.
Num aspecto, a presente invenção relaciona-se com compostos que têm a seguinte fórmula: 14 Η2Ν
0R7 (Ri)r (R4)o 0R8 em que Q é N; L é um radical orgânico bivalente capaz de ligar cada Q;
Ri, R3, R4 e Rg , independentemente um do outro, são seleccionados de grupo que consiste em H e alcenilo C8-C24, arilo C8—C24 e alquilo C8-C24 opcionalmente substituído por um ou mais de um álcool, uma amina, uma amida, um éter, um poliéter, uma poliamida, um éster, um mercaptano, uma ureia, uma tioureia, um guanidilo ou um grupo carbamoílo; e em que, pelo menos um de Ri, R3, R< e Rí é um grupo alquilo ou alcenilo de cadeia linear ou ramificada ou um grupo arilo; r, s, u e y são 0 ou 1, desde que as necessidades de valência do azoto sejam satisfeitas; R7 e R8 são H; X~ é um anião fisiologicamente aceitável; e a é o número de carga positiva a dividir pela valência de X.
Numa forma de realização, a invenção proporciona compostos de fórmula: 15
em que 1 é um número interior de 1 a 4 e todos os outros símbolos são conforme definido acima.
Numa forma de realização relacionada, a invenção proporciona compostos de fórmula: H?N' OR7 -N—(CH2),-N' R] R4 'NH2 or8 em que R7 e R8 são hidrogénio e todos os outros símbolos são conforme definido acima.
Compostos específicos no âmbito da invenção incluem os seguintes exemplos. R7 e Rs nas fórmulas são H. 16
17
Certos compostos da invenção podem ser insuficientemente solúveis nos meios fisiológicos para serem utilizados para métodos de transferência e transfecção. Os especialistas na técnica entenderão que há uma variedade de métodos disponíveis na técnica para aumentar a solubilidade de tais compostos em meios aquosos. Tais métodos são prontamente aplicáveis sem experimentação desnecessária aos compostos aqui descritos. 18
Definições
Os grupos arilo úteis são arilo C6-24· Os grupos arilo típicos incluem fenilo, naftilo, fenantrilo, antracilo, indenilo, azulenilo, bifenilo, bifenilenilo, fluorenilo, pirenilo, aceantrenilo, colantrenilo e acefenantrenilo.
Os grupos alquilo úteis são alquilo Cg-24 de cadeia linear ou ramificada. Os grupos alquilo típicos incluem etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, octilo, decilo, dodecilo, tetradecilo, hexadecilo, octadecilo, eicosilo e docosilo.
Os grupos alcenilo úteis são alcenilo Cs-24 de cadeia linear ou ramificada. Os grupos alcenilo típicos incluem etenilo, propenilo, isopropenilo, butenilo, sec-butenilo, hexenilo, octenilo, decenilo, dodecenilo, especialmente 9-dodecenilo, tetradecenilo, especialmente 9-tetradecenilo, hexadecenilo, especialmente 9-hexadecenilo, octadecenilo, especialmente 9-octadecenilo, eicosenilo e docosenilo.
Os grupos alcinilo úteis são alcinilo Cg-24 de cadeia linear ou ramificada. Os grupos alcinilo típicos incluem etinilo, propinilo, butinilo, hexinilo, octinilo, decinilo, dodecinilo, tetradecinilo, hexadecinilo, octadecinilo, eicosinilo e docosinilo.
Os grupos alquil éter típicos incluem quaisquer dos grupos alquilo C2-100 acima mencionados tendo um grupo éter.
Um grupo éter é -0-. 19
Os grupos poliéter típicos incluem o - (CHR14-CH2-0) t-, em que R14 é H ou um grupo alquilo Ci_4 e t é um número inteiro, conforme definido acima, de preferência, t é 2 a 5.
Para as finalidades da invenção um grupo amida é um radical orgânico tendo -NHC(O)- como grupo funcional. Os grupos amida típicos incluem alquil amidas, alcenil amidas, alcinil amidas e aril amidas, em que alquilo, alcenilo, alcinilo e arilo são conforme definido acima.
Tipicamente, os grupos poliamida incluem radicais orgânicos tendo dois ou mais grupos amida conforme definido acima.
Tipicamente, um grupo éster é um radical orgânico tendo -C(0)-0- como grupo funcional. Os grupos éster típicos incluem R14-C(0)-0-R15, em que R14 e R15 são grupos alcileno, alcenileno, alcinileno e arileno conforme definido acima.
Tipicamente, os grupos ureia são radicais orgânicos tendo -NH-C(0)-NH- como grupo funcional. Os grupos ureia típicos incluem R14NH-C(0)-NHR14, R14NH-C(0)-NHR15, R14R15N-C(0)-NR14R15 em que R14 e R15 são grupos alcileno, alcenileno, alcinileno e arileno conforme definido acima.
Tipicamente, os grupos tioureia são radicais orgânicos tendo um grupo ureia conforme definido acima, em que o oxigénio no grupo ureia é substituído por enxofre.
Tipicamente, os grupos guanidilo são radicais orgânicos tendo -NH-C(NH)-NH- como grupo funcional. Os grupos guanidilo típicos incluem R14NH-C (NH)-NHR14, R14NH-C (NH) -NHR15 e R14R15N-C (NH)-NR14R15 em que R14 e R15 são grupos alciileno, alcenileno, alcinileno e arileno conforme definido acima. 20
Um grupo carbamoílo é -NH-C(0)-0-.
Tipicamente, os grupos carbonato incluem radicais orgânicos contendo um radical C032~, i. e., -0-C(0)0.
Um grupo fosfato é um radical P043-.
Um grupo sulfato é um radical S042-.
Um grupo sulfóxido é —S(0)—.
Um grupo imina é -C(N)-.
Um grupo carbonilo é —C (0) — .
Um grupo amino secundário -NH-.
Tipicamente, os grupos aminoálcool são radicais orgânicos tento tanto um grupo amino secundário, conforme definido acima, e um grupo hidroxilo. Os aminoálcoois típicos incluem aminoetanol, aminopropanol e aminobutanol. A definição "D é uma ligação" significa que quando D não é Q há uma ligação simples entre (CH2)P e Z.
Substância Biologicamente Activa refere-se a qualquer molécula ou mistura ou complexo de moléculas que exercem um efeito biológico in vitro e/ou in vivo, incluindo produtos farmacêuticos, fármacos, proteínas, péptidos, polipéptidos, hormonas, vitaminas, esteróides, polianiões, nucleósidos, nucleótidos, ácidos nucleicos (e.g., ADN ou ARN), nucleótidos, polinucleótidos, etc. 21
Llpidos Catiónicos refere-se a quaisquer lípidos catiónicos que possam ser utilizados para transfecção, incluindo, mas não limitado a, DOSPA, DOTMA, DMRIE, DOTAP, DOGS e TM-TPS. Célula refere-se a células eucarióticas de qualquer tipo e de qualquer fonte. Os tipos de células eucarióticas incluem células epiteliais, fibroblásticas, neuronais, hematopoiéticas e outras a partir de células primárias, células de tumor ou linhagens de células imortalizadas. As fontes de tais células incluem qualquer animal, tal como seres humanos, caninos, murganho, hamster, gato, bovino, porcino, simio, macaco, ovelha, peixe, insecto, fungo e qualquer planta incluindo plantas cultivadas, ornamentais e árvores.
Transferência é utilizado para indicar um processo por meio do qual um composto desejado é transferido a uma célula alvo, de tal modo que o composto desejado fica, em última instância, situado no interior da célula alvo, ou dentro, ou sobre a membrana da célula alvo. Em muitas utilizações dos compostos da invenção, o composto desejado não é realmente retomado pela célula alvo e a transferência por meio de agregados de lipidos é um meio para conseguir o composto desejado no interior da célula. Em certas utilizações, é preferível a transferência para um tipo de célula específico e pode ser facilitada pelos compostos da invenção. Fármaco refere-se a qualquer agente terapêutico ou profilático, que não seja alimento, que é utilizado na prevenção, diagnóstico, alívio, tratamento ou cura de doença em ser humano ou animal.
Kit refere-se a estojos de transfecção ou expressão de proteína que incluem um ou mais dos compostos da presente invenção ou misturas destes. Tais kits podem compreender um meio 22 transportador sendo compartimentalizados para receber, em estreito confinamento, um ou mais meios recipientes, tais como frascos, tubos de ensaio e outros. Cada um destes meios recipientes compreende componentes ou uma mistura de componentes necessários para realizar a transfecção. Tais kits podem incluir um ou mais componentes seleccionados de ácidos nucleicos (de preferência um ou mais vectores), células, um ou mais compostos da presente invenção, compostos formadores de agregado de lipidos, intensificadores de transfecção, substâncias biologicamente activas, etc.
Agregado de Lipidos é um termo genérico que inclui lipossomas de todos os tipos, tanto unilamelares como multilamelares, bem como micelas e mais agregados amorfos de lipidos catiónicos ou lipidos misturados com lipidos anfipáticos, tais como fosfolipidos e esteróides.
Compostos Formadores de Agregados de Lipidos refere-se a compostos ou lipidos neutros tais como DOPE, DOPS e colesterol, etc. Célula Alvo refere-se a qualquer célula para a qual um composto desejado é transferido, utilizando um agregado de lipido como transportador para o composto desejado.
Transfecção é aqui utilizado para significar a transferência de ácido nucleico, proteína ou outra macromolécula para uma célula alvo, de tal modo que o ácido nucleico, proteína ou outra macromolécula é expressa ou tem uma função biológica na célula. 0 termo "ácido nucleico exprimível" inclui tanto o ADN como o ARN sem consideração pelo peso molecular, e o termo "expressão" significa qualquer manifestação da presença funcional do ácido nucleico no interior da célula incluindo, sem limitação, tanto a expressão transitória como a expressão estável. Os aspectos funcionais 23 incluem a inibição da expressão por oligonucleótidos ou transferência de proteína.
Intensificadores de Transfecção refere-se, de um modo genérico, a moléculas e substâncias, tais como proteínas, péptidos, factores de crescimento e outros que intensificam a vectorização da célula, a retomada, a internalização, a vectorização nuclear e a expressão. Tais moléculas e substâncias incluem ligandos, tais como insulina, transferrina, fibronectina que têm como objectivo a superfície celular; péptidos que têm como objectivo os receptores de integrina; e outros compostos, tais como Plus Reagent (disponível da Life Technologies, Inc., Rockville, Maryland). Exemplos de intensificadores de transfecção podem ser encontrados na patente U.S. N° 5.737.392 e Pedido U.S. Série N° 09/039.780 depositado em 16 de Março de 1998. A invenção será ainda esclarecida pelos exemplos a seguir, que se destinam a ser puramente exemplificativos da invenção. Os lípidos policatiónicos foram preparados seguindo os esquemas de reacção genéricos descritos adiante.
Exemplo 1 Síntese de N1 frf-dioleoil-diaminobutano (I)
Uma solução de 1,4-diaminobutano (4,28 g, 48,6 mmol) e trietilamina (20,4 mL, 146 mmol) em 10 mL de cloreto de metileno seco foi adicionada, lentamente, a uma solução de cloreto de oleoil (30,0 g, 99,7 mmol) em 300 mL de cloreto de metileno anidro num banho de gelo a 0 °C. A mistura de reacção foi agitada vigorosamente com um agitador mecânico. Depois de completa a adição, o banho de gelo foi removido e a mistura foi agitada à 24 temperatura ambiente durante 2,5 dias. A análise por TLC confirmou que a reacção tinha atingido o término e que o produto tinha precipitado. 0 excesso de cloreto de oleoil foi removido por filtração. 0 precipitado foi lavado duas vezes com 50 mL de cloreto de metileno. A água mãe foi concentrada e mais produto foi precipitado. O precipitado foi filtrado e combinado com o precipitado anterior. O sólido resultante foi seco a vácuo durante 4 horas. Foi obtido um total de 27,0 g de um sólido branco do produto desejado, N1, N4-dioleoil-diaminobutano. Síntese de N1, rf-dioleil-diaminobutano (II)
Hidreto de alumínio e litio (8,62 g, 95%, 216 mmol) foi adicionado, cuidadosamente, a uma suspensão de n\n4 -dioleoil- diaminobutano (27,0 g, 43,8 mmol) em 40 0 mL de éter dietílico anidro a 0 °C. Depois da adição, o banho de gelo foi removido. A mistura de reacção foi aquecida, lentamente, até a temperatura ambiente e, depois, aquecida suavemente até a temperatura de refluxo com um dispositivo de condensação apropriado e agitada durante 16 horas. A mistura de reacção foi, então, arrefecida e neutralizada cuidadosamente a 0 °C com 70 mL de uma solução de hidróxido de sódio 1 N. Mais 500 mL de éter dietílico foram adicionados e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante mais 2 horas. A camada superior de éter tornou-se gradualmente límpida e, depois, separou-se. A camada aquosa foi extraída três vezes com 100 mL de éter dietílico cada. A solução combinada de éter foi concentrada e seca em alto vácuo de um dia para o outro. Foi obtido um total de 17,0 g de N1, N4-dioleil-diaminobutano oleoso e incolor. 25 Síntese de N1 ^-dioleil-N1 ,N4-di-[2-hidroxi-3- (N-ftalamido) propil]-diamino-butano (III)
Diisopropiletilamina (11,1 mL, 63,7 mmol) foi adicionada a uma suspensão de N1,N4-dioleil-diaminobutano (15,5 g, 26,3 mmol) e N-(2,3-epoxipropil)-ftalimida (15,6 g, 76,8 mmol) em 110 mL de N,N-dimetilformamida seca. Depois de purgar com azoto, a mistura de reacção foi vedada num balão de fundo redondo e aquecida até cerca de 90 °C durante 24 horas. A Ν,Ν-dimetilformamida e a diisopropiletilamina foram removidas e foi obtido um óleo amarelo. Este material em bruto foi recristalizado de etanol. Foi obtido um total de 18,6 g de um sólido branco, N1,N4-dioleil-N1, N4-di-2-hidroxi-3-(N-ftalamido)propil]-diamino-butano. Síntese de N1 ,Ni-dioleyl-NL rl^-di^-hidroxi-S-fN-aminopropil) ]-diaminobutano (IV) (daqui por diante referido como DHDOS)
Hidrazina (4,0 mL, 80% aq., 103 mmol) foi adicionada a uma suspensão de N1,N4-dioleil-N1,N4-di-[2-hidroxi-3-(N- ftalamido)propil]-diaminobutano (17,0 g, 17,1 mmol) em 250 mL de etanol seco à temperatura ambiente. Com um dispositivo de condensação apropriado, a mistura de reacção foi aquecida até a temperatura de refluxo, ponto em que a suspensão se tornou uma solução límpida. O banho de óleo foi regulado para 85 °C. Depois de 45 minutos um sólido branco precipitou-se da solução. A mistura de reacção foi agitada à temperatura de refluxo durante 4 horas antes de ser arrefecida para -20 °C. O sólido branco depositou-se no fundo. A solução de límpida etanol da parte de cima foi decantada. O resíduo foi lavado duas vezes com etanol frio. A solução combinada de etanol foi concentrada e seca de uma dia para o outro sob vácuo. Foram obtidos 12,4 g de N1,N4-dioleil-N1,N4-di-2-hidroxi-3-(N-aminopropil)-diaminobutano oleoso. 26
Os compostos a seguir foram sintetizados por meio do método acima utilizando a diamina correspondente e um cloreto de acilo de cadeia longa: N1,N4-dimiristil-N1,N4-di- [2-hidroxi-3- (N-aminopropil) ] -diaminobutano; N1,N^dipalmitil-N1,N4-di- [2-hidroxi-3- (N-aminopropil) ] -diaminobutano; N1,N4-dipalmitolil-N1,N4-di- [2-hidroxi-3- (N-aminopropil) ] -diaminobutano; N1,N4-distearil-N1, N4-di- [2-hidroxi-3- (N-aminopropil) ] -diaminobutano; N1, N4-dilauril-N1, N4-di- [2-hidroxi-3- (N-aminopropil) ] -diaminobutano; N1, N2-dimiristil-N1, N2-di- [2-hidroxi-3- (N-aminopropil) ] -diaminoetano; N1,N2-dipalmitil-N1f N2-di- [2-hidroxi-3- (N-aminopropil) ] -diaminoetano; N1,N2-dipalmitolil-N1,N2-di- [2-hidroxi-3- (N-aminopropil) ] -diaminoetano; N1,N2-distearil-N1, N2-di- [2-hidroxi-3- (N-aminopropil) ] -diaminoetano; N1,N2-dilauril-N1,N2-di- [2-hidroxi-3- (N-aminopropil) ] -diaminoetano; 27 N1,N2-dioleil-N1,N2-di- [2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminoetano; N1, N9-dimiristil-N1, N9-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-Jeffamine; N1,N9-dipalmitil-N1,N9-di- [2-hidroxi-3- (N-aminopropil) ] -Jeffamine; N1,N9-dipalmitolil-N1,N9-di- [2-hidroxi-3- (N-aminopropil) ] -Jeffamine; N1, N9-distearil-N1, N9-di- [ 2-hidroxi-3- (N-aminopropil) ] - Jeffamine; N1,N9-dilauril-N1,N9-di- [2-hidroxi-3- (N-aminopropil) ] -Jeffamine; N1,N9-dioleyl-N1, N9-di- [2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-Jeffamine. Síntese de di-hidroxi-dioleiol-diesperminacarboxamido espermína e análogos (Esquema 1)
J
+ 0,(03,),0=03(01,), / Cl XEA I-(CS,) ,0=0 (CE,) ,0¾ /
HH —u—(03,),03=0(03,),0, I IA3 33(03,),0=0(03,),0¾
H3 (0,),0=0(0,),0¾ II
O IV (DHDOS)
Exemplo 2 Síntese de análogos poliméricos
Os análogos poliméricos da presente invenção podem ser sintetizados utilizando aminas poliméricas, tais como PEI como material de partida ou poliaminas dendriméricas. Por exemplo, a PEI pode ser acilada com cloreto de alquiloilo (e.g., cloreto de 29 oleoil) e a PEI acilada pode, então, ser reduzida com hidreto de alumínio e lítio para obter-se os compostos da invenção.
Embora os métodos acima exemplifiquem a síntese de compostos específicos, os esquemas de reacção proporcionam um método qenérico para preparar uma variedade de compostos de acordo com a presente invenção. Os especialistas na técnica entenderão que métodos e reagentes alternativos, que não sejam aqueles especificamente aqui pormenorizados, podem ser utilizados ou prontamente adaptados para produzir os compostos da invenção.
Os compostos da presente invenção podem ser utilizados da mesma maneira que são utilizados os compostos do estado da técnica anterior, tais como DOTMA, DOTAP, DOGS, DOSPA e outros. Os métodos para incorporar tais lípidos catiónicos em agregados de lípidos são bem conhecidos na técnica. Métodos representativos estão descritos por Felgner, et al., supra; Eppstein et al., supra·, Behr et al., supra·, Bangham, A. et al., (1965) M. Mol. Biol. 23_: 238-252; Olson, F. et al., (1979) Biochim, Biophys. Acta 557:9-23; Szoka, F. et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 75: 4194-4198; Mayhew, E. et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta 775: 169-175; Kim, S. et al., (1983) Biochim. Biophys. Acta 728: 339-348; e Fukunaga, M. et al., (1984) Endocrinol. 115: 757-761. As técnicas para a preparação de agregados de lípidos de tamanho apropriado para utilização como veículos de transferência incluem a sonicação e o congelamento-descongelamento mais extrusão como, talvez, as mais habitualmente utilizadas. Ver, e.g., Mayer, L. et al., (1986) Biochim. Biophys. Acta 858:161-168. A microfluidização é utilizada quando são desejados agregados consistentemente pequenos (50-200 nm) e relativamente uniformes (Mayhew, E., supra). São preferidos os agregados que variam de cerca de 50 nm a cerca de 200 nm de diâmetro; no entanto, tanto agregados de dimensões maiores como menores são funcionais. 30
Os métodos de transfecção e transferência de outros compostos são bem conhecidos na técnica. Os compostos e composições da presente invenção produzem agregados de lipidos que podem ser utilizados nos mesmos processos utilizados para outros agentes de transfecção conhecidos.
Tornar-se-á prontamente evidente para os especialistas na técnica que vários parâmetros genéricos são importantes para a eficácia óptima da transfecção ou transferência. Estes parâmetros incluem, por exemplo, a concentração do lípido catiónico, a concentração do composto a ser transferido, o número de células transfectadas, o meio utilizado para a transferência, a duração do tempo que as células são incubadas com o complexo polianião-lípido e as quantidades relativas de lipidos catiónicos e não catiónicos. Pode ser necessário optimizar estes parâmetros para cada tipo de célula em particular. Esta optimização é rotina que utiliza a orientação aqui proporcionada e o conhecimento geralmente disponível na técnica. A utilização de compostos representativos da invenção encontra-se também pormenorizada por referência aos exemplos a seguir. Todas as abreviações aqui utilizadas são abreviações padrão na técnica. Os procedimentos específicos que não estão descritos em pormenor estão referidos na técnica ou são bem conhecidos.
Exemplo 3
Este exemplo compara a transfecção de HEK-293 (linhagem celular derivada do rim embrionário humano), COS-7 (linhagem de células transformadas de macaco SV40), CH0-K1 (linhagem de células derivadas do Ovário de Hamster Chinês), e HeLa (linhagem de células derivadas de carcinoma cervical humano) células com o plasmídeo 31 repórter β-galactosidase de ADN pCMV-SPORT-P-gal (Life
Technologies, Rockville, MD) utilizando reagentes de transfecção de lipidos catiónico disponíveis comercialmente e os compostos da presente invenção.
As células foram plaqueadas no dia anterior à transfecção em placas de cultura de tecido de 24 poços num volume total de 0,4 mL de meio de cultura DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco,
Life Technologies, Rockville, MD), contendo uma solução de 1% de aminoácido não essencial (NEAA) (Life Technologies) e 10% de FBS. Para as células HEK-193 e COS-7, as placas de cultura de tecido foram pré-revestidas com Poli-L-Lisina para intensificar a ligação celular.
No dia seguinte, os complexos reagentes para transfecção de ADN foram preparados como a seguir:
Os reagentes do lípido catiónico e o ADN foram diluídos, separadamente, em alíquotas de 25 pL de DMEM livre de soro, contendo 1% de NEAA. Para LipofectAMINE PLUS, 7-14 pL de reagente PLUS foram adicionados ao ADN, misturados e incubados durante 15 minutos à temperatura ambiente. O ADN diluído foi combinado com o lípido diluído e incubado à temperatura ambiente durante, pelo menos, 15 minutos, a fim de permitir que o ADN e o lípido formassem complexos. A seguir a esta incubação os complexos foram adicionados directamente no meio de cultura, gota a gota, e misturados balançando a placa de cultura para frente e para trás. As células foram ainda incubadas a 37 °C por um total de 24 horas para permitir a expressão do transgene lacZ codificado pelo plasmídeo repórter pCMV-SPORT-P-gal. Vinte e quatro horas após a transfecção, 0 meio de crescimento e os complexos de transfecção foram removidos dos poços e as células em cada poço foram enxaguadas brevemente com 1 mL de D-PBS (PBS de Dulbecco, Life Technologies, Rockville, MD). 32
As células em cada poço foram lizadas pela adição de 0,15 a 2,0 mL de 0,1% de Tris, pH 8,0, contendo Triton X-100 0,1 M. As placas foram congeladas a -80 °C por um mínimo de 2 horas e descongeladas até atingirem a temperatura ambiente ou 37 °C. Os lizados de células descongeladas foram clarificadas por centrifugação e os sobrenadantes foram testados para verificação da actividade β-gal utilizando o substrato enzimático ONPG. Foi também determinada a concentração da proteína total nos lizados de células utilizando um ensaio Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) . A actividade β-gal nos extractos de células transfectadas foi calculada em comparação com uma curva padrão e expressa como ng β-gal por área de superfície de placa de cultura de tecido (ng/cm2) para reflectir a actividade total por transfecção, ou como ng β-gal por pg de proteína total (ng/pg) para reflectir a actividade específica.
As células HEK-293 (Figura 1), COS-7 (Figura 2), CHO-K1 (Figura 3) e HeLa (Figura 4) foram transfectadas com 0,4 ou 0,8 pg de ADN pCMV*SPORT^-gal e 0,2 a 4,0 pL de reagente de transfecção. Os reagentes de transfecção testados eram DHDOS (IV) formulados a 2 mg/mL com o co-lípido neutro, colesterol (a uma razão de 1:15 (M/M) de DHDOS para colesterol); DHDOS formulado a 2 mg/mL com o co-lípido neutro DOPE (dioleil fosfatidil etanolamina) (a uma razão de 1:1 (M/M) de DHDOS para DOPE); (Lipof ectAMINE PLUS (Life Technologies, Rockville, MD); e FuGENE™-6 (Boehringer Mannheim, Alemanha). As formulações de DHDOS foram testadas na gama de 0,2 a 1,5 pL; LipofectAMINE PLUS e FuGENE-6 foram testadas na gama de 0,2 a 4,0 pL. FuGENE-6 foi utilizada de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. DHDOS e LipofectAMINE foram utilizados de acordo com o protocolo acima. Os dados apresentados nas Figuras são expressos como a actividade total (ng/cm2) para melhor comparar a expressão total do ADN transfectado. Apenas os dados com 0,8 pg 33 de ADN estão apresentados, uma vez que foram obtidos resultados semelhantes com 0,4 e 0,8 pg de ADN.
Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados nesta memória descritiva são indicativos do nivel de habilitação dos especialistas na técnica à qual pertence esta invenção.
Lisboa, 21 de Janeiro de 2008. 34

Claims (35)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto tendo a fórmula:
    caracterizado por Q ser N; L ser um radical orgânico bivalente capaz de ligar cada Q; Ri, R3, R4 e r6, independentemente um do outro, serem seleccionados de grupo que consiste em H e alcenilo C8-C2 4, arilo C8-C24 e alquilo C8-C24 opcionalmente substituídos por um ou mais de um álcool, uma amina, uma amida, um éter, um poliéter, uma poliamida, um éster, um mercaptano, uma ureia, uma tioureia, um guanidilo ou um grupo carbamoilo; e por, pelo menos um de Ri, R3, R4 e R6 ser um grupo alquilo ou alcenilo de cadeia linear ou ramificada ou um grupo arilo; X~ ser um anião fisiologicamente aceitável; a ser o número de carga positiva a dividir pela valência de X; 1 r, s, u e γ serem 0 ou 1, desde que as necessidades de valência do azoto sejam satisfeitas; e R.7 e Rs serem H.
  2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto ter a fórmula:
    em que 1 é um número inteiro de 1 a 4.
  3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 2, que é:
  4. 4. Composto tendo a fórmula: H2N or7 N—(CH2),-NRi R4 Y NH or8 2 2 caracterizado por r4, R4, R7 e R8 serem de acordo com o definido na reivindicação 1 e 1 ser um número inteiro de 1 a 4.
  5. 5. Composto de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2 e 4, caracterizado por Ri, R3, R4 e R6 serem seleccionados dos referidos grupos alquilo opcionalmente substituídos.
  6. 6. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ser: H2N
    or7 (ÇH2)8
    nh2 (ÇH2)8 CHIIic I (ÇH2)7 ch3 CH CH I(ÇH2)7 ch3
  7. 7. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ser:
    3
  8. 8. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ser: H,N
    Ν’ X 'NH2 (CH2),3 or8
  9. 9. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ser:
  10. 10. Composto tendo a fórmula:
    caracterizado por R7 e R8 serem H.
  11. 11. Composto de acordo com a reivindicação 1, reivindicação e ou reivindicação 4, caracterizado por Ri, r3, R4 e R6, independentemente um do outro, serem seleccionados do grupo que consiste em H, alcenilo C8 a C24 e alquilo C8-24. 4
  12. 12. Composição caracterizada por compreender um ou mais compostos de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10.
  13. 13. Composição de acordo com a reivindicação 12 caracterizada por compreender ainda, pelo menos, um componente adicional seleccionado do grupo que consiste numa célula, células, uma cultura de células, meios de cultura de células, um lipido neutro, um ácido nucleico e um intensificador de transfecção.
  14. 14. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por compreender um ácido nucleico.
  15. 15. Composição de acordo com a reivindicação 13 ou reivindicação 14, caracterizada por pelo menos um componente adicional ser um lipido neutro.
  16. 16. Composição de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por o lipido neutro ser DOPE, DOPC ou colesterol.
  17. 17. Agregado de lipido caracterizado por compreender um ou mais compostos de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10.
  18. 18. Agregado de lipido de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por compreender, pelo menos, um lipido neutro.
  19. 19. Agregado de lipido de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o referido composto formador de agregado de lipido ser seleccionado do grupo que consiste em DOPE, DOPC e colesterol. 5
  20. 20. Kit compreendendo um ou mais compostos de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10 e, pelo menos, um componente adicional seleccionado do grupo caracterizado por consistir numa célula, células, meios de cultura de células, um ácido nucleico e um intensificador de transfecção e instruções para transfectar uma células ou células.
  21. 21. Método para introduzir um polianião numa célula ou células in vitro, o referido caracterizado por compreender formar um agregado de lipidos a partir de um composto carregado positivamente de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, pôr o agregado de lipido em contacto com um polianião para formar um complexo polianião-liposoma carregado positivamente e incubar o complexo com uma célula ou células.
  22. 22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o polianião ser um ácido nucleico.
  23. 23. Método de acordo com a reivindicação 21 ou reivindicação 22, caracterizado por o agregado de lipido ser um lipossoma.
  24. 24. Composição para utilização em métodos de transfecção, caracterizada por compreender um meio fisiológico; um composto policatiónico; e um anião fisiologicamente aceitável num número apropriado para equilibrar as cargas catiónicas do referido composto, o composto policatiónico sendo de fórmula: 6 η2ν
    NH. 2 r r OR, (R,)r (R4)u ORs em que Q é N; L é um radical orgânico bivalente capaz de ligar cada Q; Ri, R3, R4 e R6, independentemente um do outro, são seleccionados de grupo que consiste em H e alcenilo C8-C2 4, arilo C8-C24 e alquilo C8-C24 opcionalmente substituídos por um ou mais de um álcool, uma amina, uma amida, um éter, um poliéter, uma poliamida, um éster, um mercaptano, uma ureia, uma tioureia, um guanidilo ou um grupo carbamoílo; e em que, pelo menos um de Ri, R3, R4 e R6 é um grupo alquilo ou alcenilo de cadeia linear ou ramificada ou um grupo arilo; r, s, u e y são 0 ou 1, desde que as necessidades de valência do azoto sejam satisfeitas e o composto seja policatiónico; R7 e R8 são H.
  25. 25. Composição de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por o referido composto ter a fórmula: 7
    em que 1 é um número inteiro de 1 a 4.
  26. 26. Composição de acordo com a reivindicação 25, caracterizada por o referido composto ser:
    ch3
  27. 27. Composição para utilização em método de transfecção, caracterizada por compreender um meio fisiológico e um composto de fórmula: h2n y y—(ch2),—n y nh2 0R7 Ri R4 0R8 em que Rx, R4, R7 e R8 são de acordo com o definido na reivindicação 24 e 1 é um número inteiro de 1 a 4.
  28. 28. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 24, 25 e 27, caracterizada por Ri, r3, r4 e R6 serem seleccionados dos referidos grupos alquilo opcionalmente substituídos. 8
  29. 29. Composição de acordo com a reivindicação 27, caracterizada por o referido composto ser:
    CH3
  30. 30. Composição de acordo com a reivindicação 27, caracterizada por o referido composto ser:
  31. 31. Composição de acordo com a reivindicação 27, caracterizada por o referido composto ser:
  32. 32. Composição de acordo com a reivindicação 27, caracterizada por o referido composto ser:
  33. 33. Composição para utilização em métodos de transfecção, caracterizada por compreender um meio fisiológico e um composto de fórmula: OH h O
    0RS !jP>^NH2
    (ch2)8 CH II ÇH (ch,)7 CH3 em que R7 e R8 são H.
  34. 34. Composição de acordo com a reivindicação 24 ou reivindicação 25, caracterizada por Ri, r3, r4 e Rô serem seleccionados do grupo que consiste em H, alcenilo C8-C24, arilo C8-C24 e alquilo C8-C24.
  35. 35. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 24 a 34, caracterizada por transfectar um ácido nucleico numa células ou células in vitro. Lisboa, 21 de Janeiro de 2008. 10 9000
    f ' 01 0.4 0,6 0,9 11 1.5 01 05 1 2 3 4
    FUG0C~6 FIG.1 1/4 3500-
    PLUS REAGENTE DE TRANSFECÇÀO (VOL) } ESai fUGEN£-6 <L2 0.4 0.S QJ U 15 0.2 &5 1 2 3 4 FIG.2 2/4 1800-
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    UpofectAMUE PUJS
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