JP2001504334A

JP2001504334A - プロテアーゼ活性化可能なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様プロタンパク質

Info

Publication number: JP2001504334A
Application number: JP52177298A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．フィッツジェラルド，デイビッド; レイター，ヨーラム; パスタン，イラ
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 1996-11-06
Filing date: 1997-11-05
Publication date: 2001-04-03
Also published as: CA2271291A1; DE69729389D1; AU716564B2; ATE268386T1; EP0941334A2; US6423513B1; AU5247498A; WO1998020135A3; EP0941334B1; WO1998020135A2; US6426075B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、プロテアーゼ活性化可能なPseudomonas体外毒素Ａ様（「PE様」）プロタンパク質を提供する。プロタンパク質は、（１）細胞表面レセプターに結合する10と1500との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；（２）タンパク質分解切断の際に細胞サイトゾルへのトランスロケーションをもたらすための、PEのドメインIIに十分に相同なアミノ酸配列を含む改変されたPEトランスロケーションドメイン（ここで、トランスロケーションドメインは、プロテアーゼによって切断され得るプロテアーゼ活性化可能な配列を含むシステイン-システインループを含み、そしてここで、システイン-システインループは、フリンによって実質的に活性化され得ない）；（３）必要に応じて、1500アミノ酸までのアミノ酸配列を含むPE Ib様ドメイン；（４）PEのドメインIIIに実質的に相同なアミノ酸配列を含む細胞傷害性ドメイン（この細胞傷害性ドメインは、ADPリボシル化活性を有する）；ならびに（５）小胞体（「ER」）残留配列を含む。本発明はまた、標的細胞を殺傷するためにこれらのプロタンパク質を用いる方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】プロテアーゼ活性化可能なPseudomonas体外毒素Ａ様プロタンパク質本願は、米国仮特許出願第60/030,376号（1996年11月６日出願、その全体を本明細書中で参考として援用する）の出願日の利益を主張する。技術分野選択的毒性について改変されたPseudomonas体外毒素プロタンパク質に関する方法および組成物。体外毒素は、ドメインIIループにおけるプロテアーゼ活性化可能な配列の挿入によって、所望のプロテアーゼによって活性化されるように改変される。プロタンパク質の活性化は、細胞傷害性Pseudomonas体外毒素の形成を生じる。発明の背景 Pseudomonas体外毒素（PE）（これは、レセプター媒介性エンドサイトーシスによって哺乳動物細胞と結合し、そして侵入する）は、タンパク質分解切断に依存して、細胞サイトゾルへとトランスロケーションし、延長因子２をADPリボシル化し、そしてタンパク質合成を阻害するＣ末端活性フラグメントを生成する。細胞によって適切にプロセシングされ得ない変異型のPEは、非毒性である。フリン（furin）は、この切断を担う細胞内プロテアーゼとして同定されている。切断は、毒素のドメインIIに位置するアルギニンリッチループにおいて、アルギニン279とグリシン280との間に生じる。生化学的実験において、フリン媒介性切断は、穏和な酸性条件下（pH5.5）でのみ明白である。近年、Gartenら、（EMBO J, 14(11):2424-35(1995)）は、フリンの細胞質テイルにおける配列が、細胞表面へのその循環を担い、そしてエンドソーム区画を介して再侵入することを提唱している。PEは、α2-マクログロブリンレセプター／低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質（LRP）を介して細胞に侵入するので、このレセプターは、酸性エンドソーム区画へPEを送達し、ここでPEはフリンによって切断されるようである。PEは幅広く細胞傷害性である。なぜなら、ほとんどの哺乳動物細胞および組織は、LRPおよびフリンの両方を発現するからである。インビボにおいて、天然PEの注射は、根深い肝臓毒性を生じる。 PEは結晶化されており、その三次元構造は、Ｘ線回折解析によって決定されている（Alluredら、Proc.Natl.Acad.Sci.，83:1320-1324(1986)）。PEは、４つの構造ドメインを含む：Ｎ末端ドメイン（ドメインIa）は、LRPへの結合を媒介し、第２ドメイン（ドメインII）は、プロテアーゼプロセシング部位およびサイトゾルへのトランスロケーションに必要な配列を有する；第３ドメイン（ドメイン Ib）は、同定された機能を有さない；そして第４のＣ末端ドメイン（ドメインII I）は、ADPリボシル化活性およびER残留配列を有する。 PEの細胞殺傷活性をガン細胞に標的するための現存するストラテジーは、細胞結合ドメインをコードするDNAを欠失すること、そしてこれをガン関連細胞表面決定基を認識する結合リガンドまたは抗体フラグメントをコードするcDNAと置換することである。次いで、表面結合は、フリン含有区画へのPE-イムノトキシンのインターナリゼーションを媒介し、この区画で、適切なＣ末端フラグメントが生じる。ほとんどのガン細胞はフリンを発現するので、この切断活性化工程は、イムノトキシン作用の選択性に寄与しない。第I/III相臨床試験からのデータは、正常細胞における標的抗原の低レベルの発現が、イムノトキシンベースの治療の成功に対して有意な障害を提示することを示す。この問題は、固形腫瘍の処置に特に関連し得る。ここで、個々のガン細胞は接近するのが困難であり、そして高レベルのイムノトキシンは長期間維持されなければならない。ガン細胞は、高レベルの特定のプロテアーゼ（メタロプロテイナーゼ、セリンプロテアーゼ、および種々のリソソーム酵素を含む）を頻繁に発現する。これらは、細胞の転移性拡散を促進すること、および増殖因子を（前駆体および結合タンパク質から）局所的に放出することの両方に機能する。前立腺特異的抗原（PS A）は、カリクレイン様プロテアーゼであり、これは、通常はSemenogelin IおよびIIをいくつかの部位で切断するが、しばしば、前立腺ガンを有する患者において非常に高いレベルに上昇する。さらに、いくつかの近年の報告は、PSAが、乳ガン組織においても発現されることを示唆する。前立腺ガンにおいて、PSAは、血清中をCTIとの複合体とし，て循環することが見い出されるが、明らかに局所的に活性であり、ここで、基質タンパク質を分解し、そしてその結合タンパク質からインシュリン様増殖因子を放出するその能力のおかげで、前立腺ガン細胞へいくつかの生存利点を与える。発明の要旨 Pseudomonas体外毒素Ａ（「PE」）は、ドメインIIにおけるフリン認識部位がフリンによって切断された後に、サイトゾルへトランスロケーションされる。プロテアーゼ活性化可能なPE様プロタンパク質は、死が標識化される細胞（例えば、ガン細胞）によって作製または分泌されるプロテアーゼによって認識される部位によって、フリン認識部位を置換するように操作される。標的プロテアーゼによる切断の際、PE様プロタンパク質は、サイトゾルにトランスロケーションされ、ここで毒素のADPリボシル化活性は、ポリペプチド延長を妨害することによって、細胞を殺傷する。本発明のPE様プロタンパク質は、いくつかの利点を提供する。第１に、それらはフリンによってではなく標的プロテアーゼによって活性化されるので、それらの毒性は、天然のPEより有意に細胞特異的である。第２に、PEドメインIIのシステイン-システインループが切断される場合、還元される前には、ジスルフィド結合が、残りのPEに結合される細胞認識ドメインを保持する。多くのガン細胞は、細胞の周りに蓄積する傾向の細胞特異的プロテアーゼを分泌する。例えば、前立腺ガン細胞は、前立腺特異的抗原を分泌する。それゆえ、本発明のプロタンパク質は、標的細胞に侵入する前に切断され得る。しかし、プロテアーゼ活性化可能な配列は、プロタンパク質のドメインII様配列のシステイン-システインループに導入される。それゆえ、細胞認識ドメインは、プロタンパク質の切断の際に依然として細胞の外側に結合し、そして続くエンドサイトーシスのための細胞表面レセプターを結合するために依然として利用可能である。第３に、適切な細胞認識ドメインを選択することによって、毒素は、特異的な細胞型に結合するように標的化され得る。例えば、改変されたPEプロタンパク質は、イムノトキシンとして投与され得、所望の細胞に対するその選択的毒性をさらに増加し得る。プロテアーゼは、代表的には、哺乳動物細胞内で発現される。細胞内のプロテアーゼは、その細胞型に天然であり得るか、または細胞は操作されて、非天然プロテアーゼを発現し得る。従って、本発明は、エクスビボおよびインビボの両方において有用性を有する。エクスビボでの有用性は、プロテアーゼ活性化可能な配列を切断するプロテアーゼを発現する培養哺乳動物細胞の選択的除去を含む。 PEプロタンパク質をコードする核酸は、ベクターとして使用され得る。PEプロタンパク質コード配列の核酸インサートでの破壊は、ベクターでトランスフェクトされた哺乳動物細胞が生存することを可能にする。PEプロタンパク質ベクターでトランスフェクトされた細胞は、除去される。プロテアーゼ活性化可能な配列は、所望のプロテアーゼに感受性であるように改変され得る。インビボでの有用性は、特定の哺乳動物細胞（例えば、ガン細胞）に実質的に限定されるプロテアーゼを発現するこれらの細胞へのPEの増加した選択的毒性を含む。１つの局面において、本発明は、以下を含むプロテアーゼ活性化可能なPseudo monas体外毒素Ａ様（「PE様」）プロタンパク質を提供する：（１）細胞表面レセプターに結合する10と1500との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；（２）タンパク質分解切断の際に細胞サイトゾルへのトランスロケーションをもたらすための、PEのドメインIIに対して十分に相同なアミノ酸配列を含む改変されたPEトランスロケーションドメイン（ここで、トランスロケーションドメインは、プロテアーゼによって切断可能なプロテアーゼ活性化可能な配列を含むシステイン-システインループを含み、そしてここで、システイン-システインループは、フリンによって実質的に活性化され得ない）；（３）必要に応じて、1500アミノ酸までのアミノ酸配列を含むPE Ib様ドメイン；（４）PEのドメインIIIに実質的に相同なアミノ酸配列を含む細胞傷害性ドメイン（この細胞傷害性ドメインは、ADP リボシル化活性を有する）；および（５）小胞体（「ER」）残留配列。 PE様プロタンパク質の１つの実施態様において、改変されたPEトランスロケーションドメインは、アミノ酸279と280との間でプロテアーゼによる切断を生じるようにプロテアーゼ活性化可能な配列を導入するアミノ酸置換で改変された、PE ドメインII配列（配列番号１のアミノ酸253〜364）を有する。別の実施態様において、プロテアーゼ活性化可能な配列は、ガン細胞によって分泌されるプロテアーゼによって切断され得る。別の実施態様において、細胞認識ドメインは、ガン細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体を含む。別の実施態様において、プロテアーゼ活性化可能な配列は、前立腺特異的抗原（「PSA」）、ウロキナーゼ、中性エンドプロテアーゼ、ストロメライシン、コラゲナーゼ、カテプシンＢ、またはカテプシンＤによって切断され得る。別の実施態様において、PE Ib様ドメイン、細胞傷害性ドメイン、およびER残留配列はともに、天然PEのドメインIbおよびIIIの配列を有する。他の実施態様において、細胞認識ドメインは、ペプチド結合を介して（すなわち、融合タンパク質として）、または化学結合を介して、改変されたトランスロケーションドメインにカップリングされる。別の局面において、本発明は、薬学的組成物を提供し、これは、薬学的に受容可能なキャリア、および本発明のプロテアーゼ特異的Pseudomonas体外毒素Ａ様（「PE様」）プロタンパク質の治療有効量を含む。別の局面において、本発明は組換えポリヌクレオチドを提供し、これは、本発明のプロテアーゼ特異的Pseudomonas体外毒素Ａ様（「PE様」）プロタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。１つの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列に作動可能に連結される発現制御配列をさらに含む、発現ベクターである。別の局面において、本発明は、標的細胞を殺傷するための方法を提供し、この方法は、細胞を本発明のプロテアーゼ特異的Pseudomonas体外毒素Ａ様（「PE様」）プロタンパク質と接触させる工程を含む。１つの実施態様において、ガン細胞は、限定されずに、前立腺ガン細胞、乳ガン細胞、または結腸ガン細胞である。別の局面において、本発明は、ガンに苦しむ被験体を治療的に処置するための方法を提供し、この方法は、被験体に本発明のプロテアーゼ特異的Pseudomonas 体外毒素Ａ様（「PE様」）プロタンパク質を投与する工程を含む。より詳細には、PE様プロタンパク質は、ガン細胞によって産生される酵素によって切断される、プロテアーゼ活性化可能な配列を含む。PE様プロタンパク質は、薬学的組成物として投与され得る。図面の簡単な説明図１Ａ〜１Ｂ。PSAによる切断および活性化のための残基を含む、新規なイムノトキシンの発現のためのプラスミドの構築。Ａ．２つの新規なジスルフィド安定化イムノトキシンHB21dsFvPE40（seml）およびHB21dsFvPE40（sem2）の成分の発現のためのプラスミドは、実施例に記載されるように、部位特異的変異誘発および複数のクローニング工程を介して構築された。単鎖FvイムノトキシンHB21scFvPE38Kをコードするプラスミドからのウラシル含有一本鎖DNAは、部位特異的変異誘発（Kunkel T.A.，Proc.Nat'l.Acad.Sc i.U.S.A．82,488-492頁(1985)）のためのテンプレートとして使用された。pPWHB VH（HB21VH(cys)をコードする）は、gly45をシステインで置換し、停止コドン、続いてアンチトランスフェリン（anti-transferrin）VH遺伝子のＣ末端でEcoRI 部位を導入し、そしてリンカーおよびVL毒素をコードするEcoRIフラグメントを欠失することによって得られた。pPWHB38K（HB21VL(cys)PE38Kをコードする）を作製するために、本発明者らは、アンチトランスフェリンVL遺伝子のＮ末端でNd eI部位およびATG翻訳開始コドンを導入し、ala238をシステインで置換し、そして続いて、HB21（VH）をコードするNdeIフラグメントおよびリンカーを欠失させた。最終発現プラスミドpPWHB40（sem１または２）（HB21VL(cys)PE40（sem１または２）をコードする）は、HB21VL(cys)PE38KをコードするプラスミドからのPE 38K（ドメインIIおよびIII）をコードするBspMI/EcoRIフラグメントを、PE40（ドメインII、IB、およびIII）をコードするBspMI/EcoRIフラグメントおよびpMOA 1A2VK352からのドメインII内に挿入されたセメノゲリン（semenogelin）オリゴ二重鎖配列で置換することによって構築された。Ｂ．プラスミド構築物、それらのコードタンパク質、対応するイムノトキシン、ならびにイムノトキシンの構造およびその切断部位の間の関係を示すチャート。図２．精製組換えHB21dsFvPE40(sem)イムノトキシンのドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動。Ｍ、分子量標準（キロダルトンでのサイズを左側に示した）。非還元：レーン１、HB21dsFvPE40(wt)；レーン２、HB21ds FvPE40(sem１)；レーン３、HB21dsFvPE40(sem２)；レーン４、HB21dsFvPE40(sem ２W)。還元：レーン１、HB21dsFvPE40(wt)；レーン２、HB21dsFvPE40(sem１)；レーン３、HB21dsFvPE40(sem２)；レーン４、HB21dsFvPE40(sem２W)。図３Ａ〜３Ｂ。PSAによる組換えHB21dsFvPE40(sem)イムノトキシンの切断。Ａ.HB21dsFvPE40内のセメノゲリンインサートの模式図。PEのドメインIIからの13〜15アミノ酸は、PSAによって切断されるセメノゲリンIからの残基で置換された。フリン（WT）またはPSA（sem１および２）によって認識される基質に、下線を付す。Ｂ．PSAによる組換えHB21dsFvPE40(sem)イムノトキシンの切断。組換えイムノトキシンHB21dsFvPE40(wt)、HB21dsFvPE40(sem1)、HB21dsFvPE40(sem２)、およびHB21dsFvPE40(sem２W)）は、PSAとともに、50mM Tris、100mM NaCl（pH7.0）において、1:10のモル比で、６時間、37℃にてインキュベートされ、そして切断産物は、還元条件下でSDS-PAGEを介して分析された。レーンＭ、分子量標準（キロダルトンでのサイズを左側に示した）；レーン１、HB21dsFvPE40(wt)；レーン２、HB21dsFvPE40(sem1)；レーン３，HB21dsFvPE40(sem２)。イムノトキシンHB2 1dsFvPE40(sem２)は、PSAによって最も大規模に切断された（レーン３）。ドメインII内に新規に操作されたPSA部位を含む３つ全てのイムノトキシンのPSA媒介切断は、37kDおよび15kDのフラグメントを生じた（レーン２〜３）（配列分析を介して確認された）。HB21dsFvPE40(wt)の非特異的切断は、37kDよりわずかに大きなバンドを生じた（レーン１）。図４Ａ〜４Ｂ。HB21dsFvPE40(sem２)のPSA媒介切断のための条件の至適化。Ａ．HB21dsFvPE40(sem２)の種々の酵素：基質比でのPSA媒介切断。HB21dsFvPE 40(sem２)は、種々の酵素：基質比（各レーンの上に示される）で、PSAとともに、PSA緩衝液（50mM Tris，100mM NaCl(pH7.0)）において、６時間、37℃にてインキュベートされた。切断産物は、還元条件下で、SDS-PAGEを介して分析された。レーンＭ、分子量標準（キロダルトンでのサイズを左側に示した）。ドメイン IIに挿入されたセメノゲリン配列内の特異的切断から生じた切断産物は、37kDおよび15kDのサイズであった（レーン３〜５）。最大量の特異的切断を達成し、そして非特異的切断を最小化するための、至適酵素：基質比は、1:10であった（レーン４）。Ｂ．HB21dsFvPE40(sem２)のPSA媒介切断の経時変化。イムノトキシンHB21dsFv PE40(sem２)は、PSAとともに、1:10のモル比で、PSA緩衝液において、37℃にてインキュベートされ、そして経時的な切断の程度がアッセイされた。切断産物は、還元条件下で、SDS-PAGEを介して分析された。インキュベーション時間は、各レーンの上に示される。レーンＭ、分子量標準（キロダルトンでのサイズを左側に示した）。挿入されたセメノゲリン配列内の特異的切断から生じた切断産物は、37kDおよび15kDのサイズであった（レーン３〜６）。非特異的切断産物における増加（29〜35kDのサイズ）は、経時的に明らかであった。至適インキュベーション期間は、６時間であった（レーン５）。図５。HB21dsFvPE40(sem)イムノトキシンは、フリンによる切断に対して不応答性である。３つのHB21dsFvPE40(sem)イムノトキシンおよびHB21dsFvPE40(wt) は、活性フリンとともに、1:10のモル比で、フリン緩衝液（0.2M NaOAc（pH5.5 ）、５mM CaCl2）において、16時間25℃でインキュベートされた。切断産物は、還元条件下でSDS-PAGEを介して分析された。レーンＭ、分子量標準（左側にキロダルトンにおいて示されたサイズ）；レーン１、HB21dsFvPE40(wt)−フリン；レーン２、HB21dsFvpE40(wt)＋フリン；レーン３、HB21dsFvPE40(sem1)−フリン；レーン４、HB21dsFvPE40(sem1)＋フリン；レーン５、HB21dsFvPE40(sem２)−フリン；レーン６、HB21dsFvPE40(sem２)＋フリン。HB21dsFvPE40(wt)（これは、インタクトなフリン部位を含む）は切断されて、予測された37kDおよび15kDのフラグメントを生じた。HB21dsFvPE40(sem)イムノトキシン（これは、フリン切断部位の位置に、セメノゲリンI残基を含む）は、フリンによる切断に感受性ではなかった（レーン４および６）。図６Ａ〜６Ｂ。HB21dsFvPE40(sem)イムノトキシンの細胞傷害性および特異性。Ａ．一晩細胞傷害性アッセイにおける、HB21dsFvPE40(wt)、HB21dsFvPE40(sem 1)、およびB21dsFvPE40(sem２)の、PSAを発現しないDU145細胞およびPSA発現LNC aP細胞に対する、細胞傷害性の比較。Ｂ．一晩細胞傷害性アッセイにおける、PSAで前処理されたHB21dsFvPE40(wt) 、HB21dsFvPE40(sem1)、およびB21dsFvPE40(sem２)の、PSAを発現しないDU145 細胞およびPSA発現LNCaP細胞に対する、細胞傷害性の比較。図７は、プロテアーゼフリンおよびウロキナーゼ（uPA）による３つの改変体の切断を示す。図８は、Pseudomonas体外毒素Ａ構造のダイアグラムである。配列番号２に基づくアミノ酸位置が示される。ドメイン１aは、アミノ酸１から252まで伸びる。ドメインIIは、アミノ酸253から364まで伸びる。アミノ酸265〜287でシステインによって形成されたシステイン-システインループを含む。フリンは、アミノ酸2 79と280の間のシステイン-システインループ内を切断する。アミノ酸280で開始するPEのフラグメントは、サイトゾルにトランスロケーションする。アミノ酸34 5〜364が排除される構築物もまたトランスロケーションする。ドメインIbは、アミノ酸365〜399にわたる。アミノ酸372と379でシステインによって形成されたシステイン-システインループを含む。このドメインは、完全に排除され得る。ドメインIIIは、アミノ酸400〜613にわたる。アミノ酸553の欠失は、ADPリボシル化活性を排除する。小胞体配列REDKL（配列番号１から）は、分子のカルボキシ末端（アミノ酸609〜613）で局在する。図９は、天然のPEプロタンパク質のドメインIIループを示し、これはフリン媒介切断の部位を含む。発明の詳細な説明Ｉ．定義他に規定されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術的および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される多くの用語の一般的な定義とともに、当業者に提供される：Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Bi ology（第２版、1994）；The Cambridge Dictionary of Science and Technolog y（Walker編、1988）；ならびにHaleおよびMarham，The Harper Collins Dictio nary of Biology(1991)。単位、接頭語、および記号は、それらのSI認可形態において表示され得る。数値範囲は、範囲を規定する数を含む。本明細書中に提供される表題は、全体として明細書を参照することによって有され得る本発明の種々の局面または実施態様の制限ではない。従って、すぐ以下に規定される用語は、その全体において明細書を参照することによってより完全に規定される。本明細書中で用いられるように「プロテアーゼ活性化可能な配列」は、PEプロタンパク質の改変されたトランスロケーションドメインのシステイン-システインループ内に含まれる場合、プロテアーゼによって認識および切断されるアミノ酸配列をいうことを含む。「非天然のプロテアーゼ活性化可能な配列」は、天然のPEのドメインIIループに存在しないプロテアーゼ活性化可能な配列（例えば、フリン活性化可能な配列）をいうことを含む。本明細書中で用いられるように、「活性化」は、例えば、実施例において提供される細胞傷害性アッセイに従って、わずか30ng/mlのIC50を有する細胞傷害性P E様分子の形成をいうことを含む。Brinkmannら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88:8 616-8620(1991)もまた参照のこと。本明細書中で用いられるように、「細胞特異的リガンド」は、その結合部分の結合パートナーをその表面上に提示する細胞に、結合パートナーを欠如する細胞にに対して、相対的に優先的に結合する結合部分をいうことを含む。細胞表面レセプターは、頻繁にパートナーである。一般的には、細胞特異的リガンド結合は、結合パートナーを欠如する細胞についてよりも、結合パートナーを提示する細胞について、少なくとも５倍大きい親和性を有する。このような細胞特異的リガンドの例としては、抗体、増殖因子（例えば、TGFα、IL2、IL4、IL6、IGF1、またはCD4）、リンホカイン、サイトカイン、ホルモンなどの、所望の標的細胞に特異的に結合するものが挙げられるが、これらに限定されない。もちろん、ある程度の非特異的相互作用は、リガンドと結合パートナーを実質的に欠如する細胞表面との間に生じ得ることが認識される。にもかかわらず、細胞特異的リガンドは、標的分子の特異的認識を介して結合すると認識され得る。代表的には、細胞特異的リガンドは、非結合パートナー分子に対してよりも、その結合パートナーに対してより強力な会合を形成する。例えば、細胞特異的リガンドである抗体は、特定の結合パートナーについてのそれらの特異性について選択される。その同族の一価抗原についての抗体結合部位の親和定数は、少なくとも10⁶〜10⁷の間、通常は少なくとも10⁸、好ましくは少なくとも10⁹、より好ましくは少なくとも10¹⁰、そして最も好ましくは少なくとも10¹¹リットル／モルである。種々のイムノアッセイフォーマットは、特定のタンパク質に対して特異的に反応性である抗体を選択するのに適切である。例えば、固相ELISAイムノアッセイは、タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体を選択するために日常的に用いられる。特異的反応性を決定するのに使用され得るイムノアッセイフォーマットおよび条件の記載については、HarlowおよびLane(1988)Antibodies，AL aboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，New Yorkを参照のこと。本明細書中で用いられるように、「哺乳動物細胞」は、ヒト、ラット、マウス、モルモット、チンパンジー、またはマカクを含むがこれらに限定されない哺乳動物由来の細胞をいうことを含む。細胞は、インビボまたはエキソビボで培養され得る。用語「トランスフェクト」は、ポリヌクレオチドの真核生物細胞への導入をいうことを含み、ここでポリヌクレオチドが細胞のゲノム（すなわち、染色体、プラスミド、またはミトコンドリアDNA）に取り込まれ得るか、自律複製に変換され得るか、または一過的に発現され得る（例えば、トランスフェクトmRNA）。用語「有効量」または「に有効な量」または「治療的有効量」は、所望の結果（例えば、少なくとも20％、30％、または40％まで細胞タンパク質合成を阻害するか、または細胞を殺傷する）を生成するのに十分な量をいうことを含む。「エキソビボ」は、細胞（単数または複数）が得られるかまたは細胞株が単離される生物の体の外側の細胞に、組成物を導入するこということを含む。エキソビボトランスフェクションの後には、しばしば、細胞の生体への再注入が続く。用語「イムノトキシンコンジュゲート」または「イムノトキシン」は、毒素の抗体への共有結合または非共有結合をいうことを含む。毒素は、抗体に、例えば融合タンパク質として直接的に、または例えば、リンカー分子（例えば、免疫コンジュゲート）を介して間接的に結合され得る。「ポリヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合を介して結合されるヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、関連する天然に存在する構造改変体、およびその天然に存在しない合成のアナログ）、関連する天然に存在する構造改変体、およびその天然には存在しない合成のアナログから構成されるポリマーをいう。従って、用語はヌクレオチドポリマーを含み、ここにおいて、ヌクレオチドおよびそれらの間の結合は、天然に存在しない合成アナログ（例えば、制限しないが、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラル-メチルホスホネート、2-0-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（「PNA」）など）を含む。このようなポリヌクレオチドは、例えば、自動化DNA合成機を用いて台成され得る。「核酸」は、代表的には、巨大なポリヌクレオチドをいう。「オリゴヌクレオチド」は、代表的には、短いポリヌクレオチド、一般的には、約50ヌクレオチドを超えないポリヌクレオチドをいう。ヌクレオチド配列が、DNA配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって示される場合、これらはまた、「Ｕ」が「Ｔ」を置換するRNA配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）を含むことが理解される。従来の表記法が、ポリヌクレオチド配列を記載するために本明細書中で使用される：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は、5'末端である；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、5'方向としていわれる。ヌクレオチドの新生RNA 転写物への5'〜3'付加の方向は、転写方向としていわれる。・RNAと同じ配列を有するDNA鎖は、「コード鎖」としていわれる；DNAから転写される・RNAと同じ配列を有し、そしてRNA転写物の5'末端の5'側に位置するDNA鎖における配列は、「上流配列」といわれる；RNAと同じ配列を有し、そしてコードRNA転写物の3'末端の3'側に位置するDNA鎖における配列は、「下流配列」といわれる。「組換えポリヌクレオチド」は、ともに天然に結合されない配列を有するポリヌクレオチドをいう。増幅またはアセンブリした組換えポリヌクレオチドは、適切なベクター中に含まれ得、そしてベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するために使用され得る。組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」としていわれる。次いで、遺伝子は、例えば、「組換えポリペプチド」を産生する組換え宿主細胞において発現される。組換えポリヌクレオチドは、非コード機能（例えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合部位など）を提供し得る。適切な単細胞宿主は、真核生物または噛乳動物ポリヌクレオチドを発現するのに日常的に使用される任意のものを含み、これらには、例えば、E.coliのような原核生物；および、例えば、酵母のような真菌を含む真核生物；ならびに昆虫細胞（例えば、Sf9）およびCHO、R1.1、B-W、L-M、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、COS1、C0S7、BSC1、BSC40、およびBMT10）および培養ヒト細胞のような動物細胞を含む哺乳動物細胞が含まれる。「発現制御配列」は、それに作動可能に連結されるヌクレオチド配列の発現（転写および／または翻訳）を調節するポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド配列をいう。「作動可能に連結される」は、ある部分の活性（例えば、転写を調節する能力）が、他の部分における作用（例えば、配列の転写）を生じる、２つの部分の間の機能的関係をいう。発現制御配列は、例えば、プロモーターの配列（例えば、誘導性、抑制性、または構成性）、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン（すなわち、ATG）、イントロンについてのスプライシングシグナル、および停止コドンを含み得るが、これらに限定されない。「発現ベクター」は、組換えポリヌクレオチドを含むベクターをいい、これは、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結される発現制御配列を含む。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用エレメントを含む；発現のための他のエレメントは、宿主細胞またはインビトロでの発現系によって供給され得る。発現ベクターは、コスミド、プラスミド（例えば、裸、またはリポソームに含まれる）、および組換えポリヌクレオチドを取り込むウイルスのような、当該分野で公知のもの全てを含む。「コードする」は、生物学的プロセスにおいて他のポリマーおよび巨大分子の合成のためのテンプレートとして作用するポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、 cNDA、またはmRNA）におけるヌクレオチドの特定の配列の固有の特徴をいい、これは、ヌクレオチドの規定された配列（すなわち、rRNA、tRNA、および・RNA）またはアミノ酸の規定された配列およびそこから生じる生物学的特徴を有する。従って、遺伝子は、遺伝子によって産生されるmRNAの転写および翻訳が、細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。遺伝子またはcDNAのコード鎖（そのヌクレオチド配列が、mRNA配列に同一であり、そして通常、配列表において提供される）および非コード鎖（転写のためのテンプレートとして用いられる）の両方は、タンパク質またはその遺伝子またはcDNA の他の産物をコードするといわれ得る。他に特定しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり、そして同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列およびRNAは、イントロンを含み得る。代表的には、アミノ酸配列は、「ユニバーサル」遺伝子コードを用いて、核酸によってコードされる。しかし、ユニバーサルコードの改変（例えば、いくつかの植物、動物、および真菌ミトコンドリアに存在する）、細菌Mycoplasma capricolum（Proc.Natl.A cad.Sci.，82:2306-2309(1985)、または繊毛Macronuclesは、核酸がこれらの生物の翻訳機構を用いて発現される場合、用いられ得る。「対立遺伝子改変体」は、同じ遺伝子座を占有する遺伝子の２つ以上の多形形態のいずれかをいう。対立遺伝子改変体は、変異を介して自然に発生し、そして集団内の表現型多型性を生じ得る。遺伝子変異は、サイレント（コードされたポリペプチドにおいて変化なし）であり得るか、または変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。「対立遺伝子改変体」はまた、遺伝子座での非コード配列および遺伝的対立遺伝子改変体のmRNA転写物に由来するcDNAにおける多形性、ならびにそれによってコードされるタンパク質をいう。「特異的にハイブリダイズする」または「特異的ハイブリダイゼーション」または「選択的にハイブリダイズする」は、その配列が複合体混合（例えば、全細胞）DNAまたはRNAに存在する場合、ストリンジェントな条件下で、ポリヌクレオチドが特定のヌクレオチド配列に優先的に結合、二重化、またはハイブリダイズすることをいう。「ストリンジェントな条件」は、その条件下でプローブがその標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして他の配列にはより劣勢にハイブリダイズするか、または全くハイブリダイズしない条件をいう。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション実験の文脈において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」（例えば、サザンおよびノーザンハイブリダイゼーション）は、配列依存性であり、そして異なる環境パラメーター下で異なる。ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに対する広範なガイドは、Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes第１部、第２章「Overview of principles of hybridization and the strategy of nuclei c acid probe assays」Elsevier，New Yorkに見いだされる。一般的には、高度にストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定されたイオン強度およびpHで、特定の配列の熱融解点（Tm）より約５℃低いように選択される。Tmは、標的配列の50％が完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度である（規定されたイオン強度およびpH下）。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのTmに等しいように選択される。サザンまたはノーザンブロットにおけるフィルター上に100を超える相補的な残基を有する相補的なポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、１mgのヘパリンを有する50 ％ホルマリン、42℃、ハイブリダイゼーションは一晩行われる、である。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、0.15M NaCl、72℃、約15分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、0.2×SSC洗浄、65℃、15分間である（SSC緩衝液の説明については、Sambrookらを参照のこと）。しばしば、高ストリンジェンシー洗浄の前に、バックグラウンドプローブシグナルを除去するための低ストリンジェンシー洗浄が行われる。例えば、100ヌクレオチドを超える二重鎖についての培地ストリンジェンシー洗浄の例は、１×SSC、45℃、15分間である。例えば、100ヌクレオチドを超える二重鎖についての低ストリンジェンシー洗浄の例は、４〜６×SSC、40℃、15分間である。一般的には、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける未関連プローブについて観察されるものの２×（またはそれ以上）のシグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造改変体、およびペプチド結合を介して連結されるその合成の天然に存在しないアナログ、関連する天然に存在する改変体、およびその合成の天然に存在しないアナログから構成されるポリマーをいう。合成ポリペプチドは、例えば、自動化ポリペプチド合成機を用いて合成され得る。用語「タンパク質」は、代表的には、巨大なポリペプチドをいう。用語「ペプチド」は、代表的には、短いポリペプチドをいう。用語「残基」または「アミノ酸残基」または「アミノ酸」は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（集団的に「ペプチド」）に取り込まれるアミノ酸をいうことを含む。アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であり得、そして他に限定しない限りは、天然に存在するアミノ酸と同様の様式において機能し得る天然のアミノ酸の公知のアナログを包含し得る。従来の表記法が、ポリペプチド配列を表現するために本明細書中で使用される：ポリペプチド配列の左側末端は、アミノ末端である；ポリペプチド配列の右側末端は、カルボキシ末端である。２つ以上のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の配列関係を説明するために用いられる用語としては、「参照配列」「選択化形態」「比較窓」「同一」「配列同一性のパーセント」「実質的に同一」「相補的」および「実質的に相補的」が挙げられる。「参照配列」は、配列比較のための基準として用いられる規定された配列であり、そしてより大きな配列（例えば、完全cDNA、タンパク質、または遺伝子配列）のサブセットであり得る。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、各々、（１）２つのポリヌクレオチド間に類似である配列（すなわち、完全ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部のみ）、または（２）２つのポリヌクレオチド間に分散される配列を含み得るので、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、代表的には、「比較ウィンドウ」をこえる２つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって行われ、配列類似性の局所領域を同定および比較する。「比較ウィンドウ」は、参照配列に比較される代表的には少なくとも12の連続ヌクレオチドまたは４の連続するアミノ残基の概念上のセグメントをいう。比較ウィンドウは、頻繁に、少なくとも15もしくは少なくとも25ヌクレオチドまたは少なくとも５もしくは少なくとも８アミノ酸の長さを有する。比較ウィンドウは、２つの配列の至適アラインメントについて、参照配列（これは付加または欠失を含まない）に比べて、約20パーセント未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウィンドウを整列するための配列の至適アラインメントは、アルゴリズムのコンピューター実行（Wisconsin Genetics Software Package Re lease 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WIにおける GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）によって、または検査が行われ得、そして種々の方法のいずれかによって作製された最良のアラインメント(すなわち、比較ウィンドウにわたって最も高い割合を生じる)が選択される。目的のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、２つの配列が、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の長さにわたる最大の一致について整列される場合に同一である場合、参照配列と「同一」である。２つの配列間の「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウにわたる２つの至適に配列された配列を比較し、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が一致した位置の数を得るために両方の配列を生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の全数（すなわち、ウィンドウのサイズ）によって割り、そして結果に100を掛けて配列同一性の割合を得ることによって計算される。他に特定されない限り、２つの配列を比較するのに使用される比較ウィンドウは、より短い配列の長さである。配列同一性の割合が、ポリペプチドに対する参照において使用される場合、同一でない残基位置は、しばしば、保存的アミノ酸置換によって異なり、ここでアミノ酸残基は、他のアミノ酸残基について類似の化学的性質（例えば、荷電または疎水性）で置換され、それゆえ、分子の機能的性質を変化しない。ここで、配列は保存的置換において異なり、配列同一性のパーセントは、上向きに調整されて、置換の保存的性質について補正し得る。この調整を行う手段は、当業者に周知である。代表的には、これは、保存的置換を完全不一致とは異なる部分としてスコアリングし、それにより配列同一性の割合を増加することを含む。従って、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、そして非保存的置換が０の得点を与えられた場合、保存的置換は、０〜１のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、公知のアルゴリズムによって計算される。例えば、 MeyersおよびMiller(1988)Computer Applic.Biol.Sci．4:11-17；SmithおよびWa terman(1981)Adv.Appl.Math．2:482；NeedlemanおよびWunsch(1970)J.Mol.Biol ．48:443；PearsonおよびLipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85: 2444；HigginsおよびSharp(1988)Gene 73:237-244；HigginsおよびSharp，CABIO S 5:151-153(1989)；Corpetら(1988)Nucleic Acids Research 16:10881-90；Hua ngら(1992)Computer Applications in the Biosciences 8:155-65；ならびにPea rsonら(1994)Methods in Molecular Biology 24:307-31を参照のこと。アラインメントはまた、しばしば、検査および手動アラインメントによって行われる。目的のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、目的のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が、比較ウィンドウにわたって少なくとも80％の配列同一性を有する場合、参照配列に「実質的に同一」である。従って、参照配列との少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有する配列もまた、「実質的に同一」である。互いに同一である２つの配列はまた、もちろん、「実質的に同一」である。「相補的」は、２つのポリヌクレオチドの位相的適合性または２つのポリヌクレオチドの相互作用表面がともに一致することをいう。従って、２つの分子は、相補的として記載され得、そしてさらに、接触表面特徴は、互いに相補的である。第１のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、第２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列に同一である場合、第２のポリヌクレオチドに相補的である。従って、配列5'-T ATAC-3'であるポリヌクレオチドは、配列が5'-GTATA-3'であるポリヌクレオチドに相補的である。ヌクレオチド配列は、目的のヌクレオチド配列に対する配列相補性が、参照ヌクレオチド配列に実質的に同一である場合、参照ヌクレオチド配列に「実質的に相補的」である。「保存的置換」は、アミノ酸のポリペプチドにおける、機能的に類似のアミノ酸との置換をいう。以下の６つの群は、互いに保存的置換であるアミノ酸を各々含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。本明細書中で参照されるアミノ酸およびアナログは、以下のような略記命名法によって記載される：本明細書中で用いられるように、「抗体」は、体液性応答のインビトロまたはインビボでの生成によって得られる免疫グロブリン分子をいうことを含み、そしてポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を含む。用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、異種結合体抗体（例えば、二特異的（bisp ecific）抗体）、および組換え一本鎖Fvフラグメント（scFv）のような遺伝子操作された形態を含む。用語「抗体」はまた、抗体の抗原結合形態（例えば、Fab' 、F(ab')₂、Fab，Fv，rIgG、および反転IgG）を含む。Pierce Catalog and Hand book，1994-1995（Pierce Chemical Co.，Rockford，IL）を参照のこと。特定の抗原と免疫学的に反応性の抗体は、インビボで、またはファージもしくは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択のような組換え方法によって作製され得る。例えば、Huseら(1989)Science 246:1275-1281；Wardら(1989)Nat ure 341:544-546；ならびにVaughanら(1996)Nature Biotechnology，14:309-314 を参照のこと。「実質的に純粋」は、目的の種が、存在する優性種(すなわち、モル基準において、組成における任意のほかの個々の有機生物分子種より豊富)であり、そして実質的に精製した画分が、目的の種がすべての存在する有機生物分子種の少なくとも約50％（モル基準において）を含む組成物であることを意味する。一般的には、実質的に純粋な組成物は、組成物における有機生物分子種提示の約80％〜 90％以上が、目的の精製種であることを意味する。目的の種は、組成物が本質的に単一の有機生物分子種からなる場合、本質的に均質に精製される（夾雑種は、従来の検出方法によって、組成物中に検出され得ない）。「有機生物分子」は、生物起源の有機分子（例えば、タンパク質、ポリヌクレオチド、炭水化物、または脂質）をいう。溶媒種、小分子（＜500ダルトン）、安定剤（例えば、BSA）、および要素イオン種は、この定義の目的のための有機生物分子種とは考えられない。対象に適用されるような「天然に存在する」は、その対象が天然に見出され得るような事実をいう。例えば、天然の供給源から単離され得る生物(ウイルスを含む)に存在し、そして研究室においてヒトによって意図的に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。「検出する」は、サンプル中の分析物の存在、非存在、または量を決定する事をいい、そしてサンプル中またはサンプル中の細胞あたりの分析物量を定量することを含み得る。「薬学的組成物」は、目的の薬学的使用に適切な組成物をいう。薬学的組成物は、薬学的に有効な量の活性薬剤、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。「薬学的有効量」は、意図される薬学的結果を産生するのに有効な薬剤の量をいう。「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意の標準的な薬学的キャリア、緩衝液、および賦形剤（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水溶液、デキストロースの５％水性溶液、および油／水または水／油エマルジョンようなエマルジョン）、ならびに種々の型の湿潤剤および／またはアジュバントをいう。適切な薬学的キャリアおよび処方物は、Remington's Pharmaceutical Science，第19版（Mack Pub lishing Co.，Easton，1995）に記載される。好ましい薬学的キャリアは、活性薬剤の投与の意図される様態に依存する。投与の代表的な様態は、経腸（例えば、経口）または非経口（例えば、皮下、筋肉内、または静脈内腹膜内注射；または局所的、経皮的、もしくは経粘膜的投与）を含む。診断および処置の「被験体」は、動物（例えば、ヒトを含む哺乳動物）である。処置に対する非ヒト動物被験体は、例えば、魚、トリ、および哺乳動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、およびネコ）を含む。「予防的」処置は、疾患の徴候を示さないか、または病原体の発症の危険を減少する目的のために初期の徴候のみ示す被験体への処置投与である。「治療的」処置は、これらの徴候を減少または排除する目的のための、病原体の徴候を示す被験体への処置投与である。「システイン-システインループ」は、2つのジスルフィド結合したシステイン残基によって接するアミノ酸配列によって規定されるポリペプチドにおけるペプチド部分をいう。「Pseudomonas体外毒素Ａ」または「PE」は、３つの突出した球状ドメイン（I a、II、およびIII）ならびにドメインIIおよびIIIに結合する１つの小さなサブドメイン（Ib）からなる67kDタンパク質として、P.aeruginosaによって分泌される（A.S.Alluredら(1986)Proc.Natl.Acad.Sci．83:1320-1324。）。PEのドメインIaは、細胞結合を媒介する。事実上、ドメインIaは、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質（「LRP」）（α2-マクログロブリンレセプター（「α2-M R」）としても知られる）に結合する。（M.Z.Kounnasら(1992)J.Biol.Chem．267 :12420-23。）それは、アミノ酸１〜252にわたる。ドメインIIは、サイトゾルへのトランスロケーションを媒介する。それは、アミノ酸253〜364にわたる。ドメインIbは、機能が同定されていない。それは、アミノ酸365〜399にわたる。ドメインIIIは、細胞傷害性の原因であり、そして、小胞体滞留配列を含む。それは、伸長因子２（これは、タンパク質合成を不活化する）のADPリボシル化媒介する。それは、アミノ酸400〜613にわたる。PEは、EF2 ADPリボシル化活性を欠如する場合、「解毒」される。ドメインIIIからのアミノ酸E553の欠失（「ΔE553 」）は、分子を解毒する。変異ΔE553を有するPEは、本明細書中で「PEΔE553」といわれる。PEの遺伝的改変形態は、例えば、Pastanら、米国特許第5,602,095 号；Pastanら、米国特許第5,512,658号、Pastanら、米国特許第5,458,878号、およびPastanら、米国特許第5,328,984号に記載される。PEの対立遺伝子形態は、この定義に含まれる。例えば、M.L.Vasilら、(1986)Infect.Immunol．52:538-48 を参照のこと。Pseudomonas体外毒素Ａのヌクレオチド配列(配列番号１)および推定アミノ酸配列(配列番号２)は以下である： II．プロテアーゼ活性化可能Pseudomonas体外毒素Ａ様プロタンパク質Ａ．基本構造プロテアーゼ活性化可能Pseudomonas体外毒素Ａ様（「PE様」）プロタンパク質は、本明細書中に提供される場合を除いて、PEの４つの構造ドメインと同じ一般的配列に組織される構造ドメインを有し、かつPEの機能的ドメインによっても所有される特定の機能（例えば、細胞認識、サイトゾルトランスロケーション、細胞傷害性、および小胞体残留）を有するポリペプチドである。より詳細には、一般的順番は、以下の通りである：ドメインIa、ドメインII、ドメインIb、ドメインIII。しかし、本明細書中により詳細に記載されるように、ドメインIaは、除去され、そして分子に化学的にカップリングした結合タンパク質により置換され得るか、または細胞認識ドメインは、ドメインIIIのER残留配列の直前に挿入され得る。ドメインIbは除去され得る。ドメインIIは、ドメインIIIのアミノ末端側に配置される。天然のPEとは対照的に、本発明のPE様プロタンパク質は、ドメインIIの天然のフリン（furin）切断部位を除去し、そしてPEのドメインII内に（そして好ましくはドメインIIのシステイン-システインループ内に）標的プロテアーゼにより切断され得るプロテアーゼ活性化可能配列を含むように操作される。好ましくは、標的プロテアーゼは、死の標的とされる細胞（例えば、ガン細胞）により生成されるプロテアーゼである。従って、PE様プロタンパク質は、アミノ酸配列を含む以下の構造ドメインを含み、このドメインは、プロタンパク質へ特定の機能を与える：(1)細胞表面レセプターのリガンドとして機能し、かつ細胞へのこのタンパク質の結合を媒介する「細胞認識ドメイン」；(2)エンドソームからサイトゾルへのトランスロケーションを媒介し、かつプロテアーゼ活性化可能配列を含み、かつフリンにより実質的に活性化され得ない「トランスロケーションドメイン」；(3)1500アミノ酸までの必要に応じた「PE lb様ドメイン」；(4)好ましくはADPリボシル化活性を妨害することにより、細胞を殺傷するように機能する「細胞傷害性ドメイン」；および(5)分子をエンドソームから小胞体（この分子はここからサイトゾルへと入る）へとトランスロケーションするように機能する「小胞体（「ER」）残留配列」。 PE構造とその機能との関連は、広範に研究されてきた。PEのアミノ酸配列は、新たな機能を提供するように再操作されており、そしてPE機能に重要である多くのアミノ酸またはペプチドセグメントおよび重要でないものが同定されている。従って、本発明のPE様プロタンパク質は、本明細書中に示す境界内でPEに対するこれらの構造改変を含み得る。Ｂ．細胞認識ドメインプロテアーゼ活性化可能Pseudomonas体外毒素様プロタンパク質は、「細胞認識ドメイン」をコードするアミノ酸配列を含む。細胞認識ドメインは、細胞表面レセプターのリガンドとして機能する。これは、細胞へのタンパク質の結合を媒介する。その目的は、プロタンパク質をプロセシングのためにサイトゾルへ輸送する細胞にプロタンパク質を標的化することである。細胞認識ドメインは、PEのドメインIaの位置に配置され得る。しかし、このドメインは、正常な組織化配列から除去され得る。より詳細には、細胞認識ドメインは、ER残留配列の上流に挿入され得る。あるいは、細胞認識ドメインは、毒素に化学的にカップリングされ得る。また、プロタンパク質は、Iaドメインの位置に第１の細胞認識ドメインを、そしてER残留ドメインの上流に第２の細胞認識ドメインを含み得る。このような構築物は、１つより多くの細胞型に結合し得る。例えば、R.J.Kreitmanら，Bl ood 90，252-259頁（1992）Bioconjugate Chem．3:63-68を参照のこと。細胞認識ドメインは、プロタンパク質を細胞に付着（attach）させるための取っ手として機能するので、特定のレセプターに結合することが公知の任意のポリペプチドの構造を有し得る。従って、このドメインは、一般に、公知のポリペプチドリガンドのサイズ（例えば、約10アミノ酸と約1500アミノ酸との間、または約100アミノ酸と約300アミノ酸との間）を有する。いくつかの方法は、プロタンパク質で用いるための機能的な細胞認識ドメインを同定するために有用である。１つの方法は、細胞認識ドメインを含むプロタンパク質と、レセプターまたはレセプターを有する細胞との間の結合を検出することを含む。他の方法は、最初の段階である細胞結合が成功したことを示す、プロタンパク質のサイトゾルへの進入を検出することを含む。これらの方法は、下記の試験の節に詳細に記載される。細胞認識ドメインは、細胞表面レセプターに結合する任意のポリペプチドの構造を有し得る。本発明の目的が、ガン細胞へプロタンパク質を標的化することである限り、好ましい実施態様では、細胞認識ドメインは、ガン細胞のマーカーとして作用する細胞表面タンパク質に特異的に結合する。しかし、他の実施態様では、アミノ酸配列は、PEのドメインIaの配列であり、それによりキメラタンパク質をα2-MRドメインに標的化する。なおさらなる実施態様では、ドメインIaは、以下のもので置換され得る：上皮増殖因子（「EGF」）に結合する増殖因子（例えば、TGFα）；IL-2レセプターに結合するIL-2；IL-6レセプター（例えば、活性化Ｂ細胞および肝臓細胞）に結合するIL-6;HIV感染細胞に結合するCD4；ケモカインレセプター（例えば、CCR5またはヒューシン（fusin）（CXCR4））に結合するケモカイン（例えば、Rantes、MIP-1α、またはMIP-1β）；白血球細胞表面レセプターのリガンド（例えば、GM-CSF、G-CSF）；IgAレセプターのリガンド；または任意のレセプターに対する抗体もしくは抗体フラグメント（例えば、ヒトトランスフェリンレセプターに対する単鎖抗体）。I.Pastanら，（1992）Annu． Rev．Biochem．61:331-54。１つの実施態様では、細胞認識ドメインは、PEのドメインIaの代わりに配置される。別の実施態様では、これはリンカーを介して分子の他の部分に付着し得る。操作研究はまた、Pseudomonas体外毒素が、ポリペプチドのカルボキシ末端に配置されるER残留配列の上流に、細胞認識ドメインを導入することにより特定の細胞型に標的化され得ることを示す。例えば、TGFαは、アミノ酸604の直前（すなわち、カルボキシ末端から約10アミノ酸）にドメインIIIに挿入されている。このキメラタンパク質は、EGFレセプターを有する細胞に結合する。Pastanら、米国特許第5,602,095号。好ましい実施態様では、本発明のPE様プロタンパク質は、特定の細胞へPE様プロタンパク質を標的化するために、細胞特異的リガンドで改変され得る。このように改変されたPE様プロタンパク質は、そのリガンドに結合パートナーを提示する細胞に優先的に結合する。好ましい実施態様では、細胞特異的リガンドは、抗体であり；それにより、プロタンパク質は、イムノトキシンである。タンパク質である細胞特異的リガンドは、しばしば、部分的にまたは全体に、本発明のPE様プロタンパク質との融合タンパク質として生成され得る。「融合タンパク質」は、一方のポリペプチドのアミノ末端と他方のポリペプチドのカルボキシ末端とにより形成されるペプチド結合を介する、２つ以上のポリペプチドを連結することにより生成されるポリペプチドへの言及を含む。融合タンパク質は、構成成分のポリペプチドの化学カップリングにより生成され得るが、代表的には、単一の連続する融合タンパク質をコードする核酸配列からの単一のポリペプチドとして発現される。このような融合タンパク質の中に含まれるのは、単鎖Fvフラグメント（scFv）である。特に好ましい標的化PE様プロタンパク質は、本明細書中に例示されるように、一部、融合タンパク質として形成され得る、ジスルフィドで安定化されたイムノトキシンである。他のタンパク質性細胞特異的リガンドは、当業者に周知のクローニング方法論を用いて、融合タンパク質として形成され得る。細胞特異的リガンドの付着はまた、リンカーの使用を介して達成され得る。本明細書中に用いられる「リンカー」は、２つの分子を連結するために用いられる分子である。リンカーは、両方の分子と共有結合または高親和性非共有結合を形成し得る。適切なリンカーは、当業者に周知であり、直鎖状または分枝鎖状炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーを含むがこれらに限定されない。リンカーは、構成成分アミノ酸に、それらの側鎖を介して（例えば、システインとのジスルフィド結合を介して）連結され得る。１つの実施態様では、プロテアーゼ活性化可能PE様プロタンパク質は、特定のガン細胞に対するイムノトキシンである。従って、細胞認識ドメインは、ガン細胞に特異的な細胞表面レセプターまたはマーカーに特異的に結合する抗体である。これは、例えば、前立腺ガン細胞、乳ガン細胞、または結腸ガン細胞を含む。別の実施態様では、プロタンパク質は、融合タンパク質またはコンジュゲート（ conjugate）タンパク質であり得る。融合タンパク質では、ドメインIaは、ガン細胞に特異的な免疫グロブリンからの免疫グロブリン重鎖のポリペプチド配列で置換される。免疫グロブリンの軽鎖は、軽鎖-重鎖ダイマーを形成するように、プロタンパク質と同時発現され得る。コンジュゲートタンパク質では、抗体は、プロタンパク質の他のドメインを含むポリペプチドに化学的に連結される。 PE様プロタンパク質を、抗体または他の細胞特異的リガンドに付着させるための手順は、毒素の化学構造に従って変化する。抗体は、種々の官能基（例えば、スルフヒドリル基（-S）、カルボン酸基（COOH）、または遊離アミン基（-NH₂））を含み、これらは毒素上の適切な官能基との反応に利用され得る。従って、またはあるいは、抗体またはPE様プロタンパク質は、さらなる反応性官能基に曝すため、または付着させるために誘導体化され得る。誘導体化は、任意の多数のリンカー分子（例えば、Pierce Chemical Company，Rockford Illinoisから入手可能なリンカー分子）の付着を含み得る。 PE様プロタンパク質上の基と反応性のある官能基、および細胞特異的リガンドと反応性の別の基を有する二官能性リンカーは、所望のコンジュゲートを形成するために用いられ得る。あるいは、誘導体化は、PE様プロタンパク質または細胞特異的リガンドの化学処理（例えば、遊離のアルデヒド基を生成するための、過ヨウ素酸塩での糖タンパク質抗体の糖部分のグリコール切断）を含み得る。抗体上の遊離のアルデヒド基は、抗体上の遊離のアミンまたはヒドラジン基と反応してPE様プロタンパク質をそれに対して結合させ得る。（米国特許第4,671,958号を参照のこと）。抗体または他のタンパク質上の遊離のスルフヒドリル基の生成のための手順もまた、公知である（米国特許第4,659,839を参照のこと）。毒素を含む種々の化合物の付着のための多くの手順およびリンカー分子が公知である。例えば、欧州特許出願第188,256号；米国特許第4,671,958号、同第4,65 9,839号、同第4,414,148号、同第4,699,784号；同第4,680,338号；同第4,569,78 9号；同第4,589,071号；およびBorlinghausら，Cancer Res．47:4071-4075(1987 )を参照のこと。特に、種々のイムノトキシンコンジュゲートの生成は、当該分野で周知であり、そして例えば、「Monoclonal Antibody-Toxin Conjugate:Aimi ng the Magic Bullet」，Thorpeら，「Monoclonal Antibodies in Clinical Med icine」，Academic Press，168-190頁(1982)，Waldmann，Science，252:1657(19 91)、米国特許第4,545,985号および同第4,894,443号（これらは本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。また、例えば、BirchおよびLennox,Mono clonal Antibodies:Principles and Applications，第４章，Wiley-Liss，New Y ork，New York(1995);米国特許第5,218,112号、同第5,090,914号；Hermanson，B ioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego，CA(1996)を参照のこと。いくつかの状況では、コンジュゲートが、その標的部位に到達した場合は、PE 様プロタンパク質を抗体または他の細胞特異的リガンドから遊離させることが所望される。それゆえ、標的部位付近または標的部位内で切断され得る連結を含むコンジュゲートが、毒素が標的部位で放出される場合に用いられ得る。薬剤をリガンドから放出させるための連結の切断は、免疫コンジュゲートが、標的細胞の内側または標的部位付近のいずれかでさらされる酵素活性または条件により刺激され得る。多くの異なる切断可能リンカーが、当業者に公知である。米国特許第 4,618,492号；同第4,542,225号、および同第4,625,014号を参照のこと。SPDPは、アミン含有分子をスルフヒドリルにコンジュゲートするために用いられる可逆的なNHSエステル、ピリジルジスルフィド架橋剤である。別の化学的修飾試薬は、アミンと反応し、そしてスルフヒドリルを生じる、2-イミノチオラン（2-imin othiolane）である。水溶性SPDPアナログ（例えば、スルホ-LC-SPDP（Pierce，R ockford，IL））もまた利用可能である。SMPTは、抗原性標的に到達する前にインビボで切断されるのを回避するように開発された、可逆的なNHSエステル、ピリジルジスルフィド架橋剤である。さらに、SMPTのNHSエステルは、水溶液中で比較的安定である。Ｃ．PE 様トランスロケーションドメインプロテアーゼ活性化可能PE様プロタンパク質はまた、「改変PEトランスロケーションドメイン」をコードするアミノ酸配列を含む。改変PEトランスロケーションドメインは、プロテアーゼ活性化可能配列を含むシステイン-システインループを含み、そして天然のフリン認識部位を除去するように操作される。これは、細胞によりサイトゾルへとエンドサイトーシスが行われたキメラタンパク質のトランスロケーションをもたらすに十分なアミノ酸配列を含む。システイン-システインループ内に配列RXXRを含まないプロタンパク質は、フリンにより実質的に活性化不可能であり、そして結果として、プロテアーゼ活性化可能な配列を切断する酵素を有しない細胞に対して実質的に無毒性である。アミノ酸配列は、一般に、PEのドメインIIから選択される配列に実質的に同一である。プロテアーゼ活性化可能配列を認識するプロテアーゼによる切断およびジスルフィド結合の還元の際、プロタンパク質はここで活性化される、すなわち、サイトゾルへのトランスロケーションおよびその後の細胞傷害活性が可能になる。より詳細には、プロテアーゼ活性化可能PE様プロタンパク質は、プロテアーゼ活性化可能配列を含むシステイン-システインループを含む。ループは、一般に、約10と約50との間のアミノ酸、より好ましくは天然のPEにおいてのように約23 アミノ酸を有する。プロテアーゼ活性化可能配列は、システイン-システインループ内のいずこかに配置され得る。好ましくは、配列は、ジスルフィド結合に関与するシステイン残基からの５より多くのアミノ酸である。より好ましくは、システイン-システインループは、プロテアーゼ活性化可能配列を導入する置換以外は、天然のPEのループ配列を有する。システイン-システインループはまた、天然のフリン認識配列を除去するように改変される。フリンは、配列RXXRを認識し、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。この配列は、天然のPEにおいて、アミノ酸276-279で生じる。切断部位付近の領域を定義するために開発された命名法によれば、「Ｐ」番号は、分子のアミノ末端に向かってアミノ酸を示し、一方、「Ｐ’」番号は、カルボキシ末端に向かって切断部位を同定する。従って、天然のPEでは、切断部位は、（配列番号１からの）配列RQPR/GWEQを有し、ここで「/」は、切断部位を示す。これらのアミノ酸は、それぞれ、P4、P3、P2、Pl/P'l、P'2、P'3、およびP'4 と命名される。従って、好ましい実施態様では、プロテアーゼ活性化可能配列は、プロタンパク質の配列が天然のPEと最適にアラインメントされた場合に、P1およびP'1がPEの279位および280位に位置するように配置される。トランスロケーションをもたらすために十分なアミノ酸配列は、天然のPEのトランスロケーションドメインに由来し得る。このドメインは、アミノ酸253〜364 にまたがる。トランスロケーションドメインは、ドメインIIの全体配列を含み得る。しかし、全体配列はトランスロケーションに必要ではない。例えば、アミノ酸配列は、例えば、PEのドメインIIのアミノ酸280〜344を最少限含み得る。この領域の外側の配列（すなわち、アミノ酸345〜364)は、このドメインから除去され得る。アミノ酸253〜264もまた、除去または置換され得るが、構築物はシステイン-システインループを含むべきである。このドメインはまた、トランスロケーション活性が保持される限り、（好ましくは、保存的な）置換を用いて操作され得る。トランスロケーションドメインは以下の通りに機能する。細胞表面上のレセプターに結合した後、キメラタンパク質は、クラスリン被覆小孔を通してエンドサイトーシスにより細胞に進入する。残基265および287は、ジスルフィドループを形成するシステインである。一旦、酸性環境を有するエンドソーム内にインターナライズされると、ペプチドは、Arg279とGly280との間でプロテアーゼであるフリンにより切断される。次いで、ジスルフィド結合が還元される。Arg279での変異は、フリンによるタンパク質分解性切断および続いてのサイトゾルへのトランスロケーションを阻害する。M.Ogataら（1990）J.Blol.Chem 265:20678-85。しかし、Arg279の下流の配列を含むPEのフラグメント（「PE37」と呼ばれる）は、サイトゾルにトランスロケーションする実質的な能力を保持する。C.B.Siegall ら（1989）J.Biol.Chem.264:14256-61。アミノ酸345を超えるドメインIIにおける配列はまた、トランスロケーションを阻害せずに欠失され得る。さらに、339 位および343位のアミノ酸は、トランスロケーションに必要であるようである。C .B.Siegallら（1991）Biochemistry 30:7154-59。トランスロケーションドメインの機能性を決定するための方法は、下記の試験の節に記載される。好ましくは、トランスロケーションドメインは、天然のシステイン-システインループ配列の破壊が最少であるように、コグネートプロテアーゼによる認識および切断のために要求される程度の少ないアミノ酸を含むプロテアーゼ活性化可能配列を含む。さらに、システイン-システインループは、代表的には、ジスルフィド結合について265位および287位のシステイン残基と競合し得るシステイン残基を欠く。プロテアーゼ活性化可能配列は、非天然（すなわち、非野生型）のシステイン-システインループ配列である。プロテアーゼ活性化可能配列として作用し得るアミノ酸配列は、所望のプロテアーゼのペプチド基質から選択される。プロテアーゼおよびそれらのアミノ酸配列基質は、当該分野で周知である。例えば、ウロキナーゼは、転移性が活性な多くのガンにおいて見出される酵素である。ウロキナーゼの配列は、Nagaiら，Gen e，36:183-188(1985);Riccioら，Nucl.Acids Res.，13:2759-2771(1985);および Holmesら，Bio/Technology 3:923-929(1985)（これらの全ては本明細書中に参考として援用される）により記載される。ウロキナーゼのペプチド基質（「ウロキナーゼ活性化可能配列」）は、以下の配列を含む：アンギオテンシンからのDR/V YIHPF（配列番号３）、インスリンＢ鎖からのVVCGER/GFFYTP（配列番号４）、FF YTPK/A（配列番号５）、ならびに副腎皮質刺激ホルモン（adrenal corticotroph ic hormone）（ACTH）からの配列：KRRPVK/VYP（配列番号６）、PVGKKR/RPVKVY （配列番号７）、KPVGKK/RRPVKV（配列番号８）、およびGKPVGK/KRRPVK（配列番号９）、ここで、「/」は、切断部位を示す。特に好ましい実施態様では、ウロキナーゼ活性化可能配列は、配列TFAGNAVRR/SVGQ（配列番号10）を有する。一般に、配列番号10は、PE様プロタンパク質の残基271と残基283との間に挿入される。上記で開示されるウロキナーゼ活性化可能配列の配列は、原型配列の少なくとも２つの残基が切断部位のいずれの側でも保持されるように、カルボキシルおよび／またはアミノ末端で１つまたは２つのアミノ酸残基だけ短縮化され得る。他の実施態様において、プロテアーゼ活性化可能配列は、前立腺特異的抗原(「 PSA」)の任意の基質に由来する。これには、例えば、セメノゲリン(semenogelin) ＩまたはセメノゲリンII、あるいはインスリン様成長因子結合タンパク質が含まれる。好ましいプロテアーゼ活性化可能配列は、セメノゲリンＩに由来する。セメノゲリンＩに由来するプロテアーゼ活性化可能配列(PSA活性化可能配列)には、配列SKGSFSTQY/TYHV(配列番号11)を有するsem 1、配列HLGGSQQLL/HNKQ(配列番号12)を有するsem 3、および配列SKGKGTSSQY/SNTE(配列番号13)を有するsem 5が含まれる。ここで、「/」は279位の切断を示す。特に好ましい実施態様において、sem 1，sem 3、およびsem 5プロテアーゼ活性化可能配列は、残基271と283との間に存在するネイティブのPE様プロタンパク質アミノ酸と置換される。上記に開示されたPSA活性化可能配列の配列は、プロトタイプの配列のうちの少なくとも２つの残基が、切断部位の両側で維持されるように、カルボキシル末端および /またはアミノ末端で１つまたは２つのアミノ酸残基だけ短くし得る。他の実施態様において、プロテアーゼ活性化可能配列は、Xa因子(Nagaiおよび Thogerse、Nature、309:810-812(1984)；Aurellら、Thrombosis Res.、11:595-6 09(1984))によって切断される。Xa因子は、Plerce Chemical Co.(Rockford，IL) のような商業的供給元より容易に入手可能である。Xa因子は、配列Ile-Glu-Gly- Arg中の最後のアミノ酸を切断する。したがって、本発明において、上記Xa因子活性化可能配列は、アミノ酸残基278または279まで及ぶはずである。さらなる実施態様において、プロテアーゼ活性化可能配列は、中性エンドプロテアーゼ(EC 3.4.24.11、「NEP」)により認識されそして切断される。Erdosら、J. Biol.Chem.，264:14519-14523(1989)を参照のこと。NEPは、共通急性リンパ芽球性白血病抗原(CALLA)と同一である。中性エンドプロテアーゼは、疎水性アミノ酸のアミノ側で切断する。例えば、中性エンドプロテアーゼは、エンケファリンをGly-Pheで、トリペプチドおよびジペプチドに切断する。中性エンドプロテアーゼの他の基質には、ブラジキニン、および心房性ナトリウム利尿ペプチドが含まれる。したがって、これらの基質は、同族プロテアーゼ中性エンドプロテアーゼとともにプロテアーゼ活性化可能配列として(すなわち、「中性エンドプロテアーゼ活性化可能配列」として)用いられ得る。本発明において用いられ得る他のプロテアーゼには、ストロメライシン、コラゲナーゼ、カテプシンＢ、およびカテプシンＤが含まれるが、これらに限定されない。Ｄ．PE 1b 様ドメインプロテアーゼ活性化PE様プロタンパク質は、必要に応じて、「PE 1b様ドメイン」をコードするアミノ酸配列を含む。PE 1b様ドメインは、PEのネイティブIbドメイン位置で、トランスロケーションドメイン(例えば、ドメインII)と細胞傷害性ドメイン(例えば、ドメインIII)との間に位置する。PE 1b様ドメインは約1500アミノ酸までであり得る。これは、約15と約350との間のアミノ酸または約15と約5 0との間のアミノ酸を有するドメインを含む。ネイティブなPseudomonas体外毒素Ａにおいて、ドメインIbはアミノ酸365〜39 9にわたる。ネイティブなIbドメインは、372位および379位の２つのシステイン間のジスルフィド結合によって構造的に特徴付けられる。ドメインIbは、細胞結合活性、トランスロケーション活性、ER残留活性またはADPリボシル化活性に必須ではない。したがって、これは、全体が再操作され得るか、または完全に消去され得る。PE 1b様ドメインは直鎖状であり得るか、またはシステイン-システインループを含み得る。Ｅ．細胞傷害性ドメインおよびER残留配列 PE様プロタンパク質はまた、「細胞傷害性ドメイン」および「小胞体(「ER」)残留配列」をコードするアミノ酸配列を含む。細胞傷害性ドメインは、ADPリボシル化活性を付与するに十分、ネイティブなPEのドメインIIIに相補的な配列を有し、このことにより構築物を細胞傷害性にする。ER残留配列は、プロタンパク質をエンドソームから小胞体(ここから、サイトゾルに輸送される)までトランスロケートする際に機能する。細胞傷害性ドメインは、PE中のドメインIIIの位置に位置する。細胞傷害性ドメインは、カルボキシ末端に、ER残留配列を有するアミノ酸配列を含む。ネイティブなPE中のER残留配列はREDLKである。リジンは、活性の減少を伴うことなく除去され得る(すなわち、REDL)。REDLKは、他のER残留配列(例えば、KDEL)またはこれらの配列のポリマーで置換され得る。M.Ogataら(1990)J.Bi ol.Chem.265:20678-85。Pastanら、米国特許第5,458,878号。I.Pastanら(1992)A nnu.Rev.Biochem．61:331-54。ネイティブなPEにおいて、ドメインIIIは２つの機能を有する。これは、ADPリボシル化活性を示し、そしてエンドサイトーシスされた毒素を小胞体へと導く。 PEのリポシル化活性は、PEのアミノ酸400と600との間あたりに位置する。ADPリボシル化活性は、例えば、アミノ酸E553を欠失させる(「ΔE553」)ことによって除去される。M.Lukacら(1988)Infect.and Immun．56:3095-3098。このドメインの活性は、下記のアッセイを用いて、標的細胞サイトゾルへのタンパク質のトランスロケーションについて試験することによって評価され得る。１つの実施態様において、細胞傷害性ドメインおよびER残留配列の配列は、ドメインIIIのネイティブなアミノ酸配列、またはそのフラグメント（例えば、機能を変化させない保存的置換を含む）と実質的に同一である。１つの実施態様において、細胞傷害性ドメインおよびER残留配列は、PEのドメインIIIである。別の実施態様において、細胞認識ドメインが、ER残留配列の前のアミノ酸配列 (例えば、ドメインIII)に挿入される。例えば、細胞認識ドメインは、ER残留配列の直ぐ上流に、ER残留配列が細胞認識ドメインのカルボキシ末端と直接か、または10アミノ酸以内で連結されるように、挿入され得る。Ｆ．PE 様プロタンパク質を作製する方法 PE様プロタンパク質は、好ましくは、下記のように組換え的に産生される。本発明はまた、当該分野に利用可能な方法を使用する化学的合成によるPEキメラタンパク質の産生を意図する。Ｇ．PE 様プロタンパク質の試験プロタンパク質のドメインとして種々の構造が選択されると、これらのドメインの機能および全体としてのプロタンパク質の機能が、機能性を検出するために試験され得る。PE様プロタンパク質は、日常的なアッセイを使用して、細胞認識、切断可能性、サイトゾルトランスロケーション、および細胞傷害性について試験され得る。野生型毒素のネイティブなドメインとこれらを置換することによって、プロタンパク質全体が試験され得るか、または種々のドメインの機能が試験され得る。１．レセプター結合/細胞認識細胞結合ドメインの機能は、単離されたかまたは細胞表面上のいずれかの標的レセプターに結合するプロタンパク質の関数として試験され得る。１つの方法では、標的へのプロタンパク質の結合は、アフィニティークロマトグラフィーによって実行される。例えば、プロタンパク質は、アフィニティーカラム中のマトリクスに付着され、そしてマトリクスへのレセプターの結合が検出され得る。細胞上のレセプターへのプロタンパク質の結合は、例えば、プロタンパク質を標識し、そして例えば、蛍光細胞選別、オートラジオグラフィーなどにより細胞へのその結合を検出することによって試験され得る。細胞認識ドメインが由来するリガンドに結合する抗体が同定されている場合、抗体もまた、免疫アッセイまたは同族レセプターについての競合アッセイにより、キメラ免疫原中の細胞認識ドメインの存在を検出するのに有用である。２．プロテアーゼ活性化可能切断プロテアーゼ活性化可能配列の機能は、切断アッセイにより試験され得る。ここで、プロタンパク質は、これを認識するプロテアーゼに曝される。切断から生じるポリペプチドフラグメントの生成が検出される。このようなアッセイは、実施例において詳細に記載される。３．サイトゾルへのトランスロケーショントランスロケーションドメインおよびER残留配列の機能は、サイトゾルへの進入(access)を獲得するプロタンパク質の能力の関数として試験され得る。進入はまず細胞への結合を必要とするので、これらのアッセイはまた、細胞認識ドメインが機能しているかどうかを決定するのに有用である。ａ．サイトゾルにおける存在１つの方法では、サイトゾルへの進入は、サイトゾルにおけるプロタンパク質の物理的存在を検出することによって決定される。例えば、プロタンパク質は標識され得、そしてプロタンパク質が細胞に曝され得る。次いで、サイトゾル画分が単離され、そしてその画分中の標識の量が決定される。画分中の標識の検出により、プロタンパク質がサイトゾルへの進入を獲得したことを示す。４．細胞傷害性(ADPリボシル化活性) 別の方法では、サイトゾルへのトランスロケーションをもたらすトランスロケーションドメインおよびER残留配列の能力が、ADPリボシル化活性を有するドメインIIIを含む構築物を用いて試験され得る。簡潔に述べると、細胞が組織培養プレートに播種され、そしてPE様プロタンパク質、またはネイティブなドメインの代わりに改変されたトランスロケーションドメインもしくはER残留配列を含む操作されたPE体外毒素に曝される。ADPリボシル化活性は、例えば、³H-ロイシンの取り込みをモニターすることによって、タンパク質合成の阻害の関数として決定される。 III．PE 様プロタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドＡ．組換えポリヌクレオチド１．供給源本明細書中に提供されるプロテアーゼ活性化可能配列および配列番号１に開示されるPE配列を用いて、当業者は、機能的に等価な核酸(例えば、配列は異なるが同じPE様プロタンパク質をコードする核酸)を含む種々のクローンを容易に構築し得る。PE様プロタンパク質関連組成物(例えば、細胞特異的リガンドを含むP E様プロタンパク質融合タンパク質)もまた構築され得る。これらの目的を達成するためのクローニング方法論および核酸の配列を確認するための配列決定方法は、当該分野において周知であり、そして本明細書中で例示される。適切なクローニング技術および配列決定技術の他の例、および多くのクローニングの使用により当業者を導くに十分な指示は、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第２版、１〜３巻、Cold Spring Harbor Laboratory(1989))、Methodsi n Enzymology、第152巻：Guide to Molecular Cloning Techniques(BergerおよびKimmel(編)、San Diego:Academic Press，Inc．(1987))、またはCurrent Prot ocols inMolecular Biology，(Ausubelら(編)、Greene Publishing and Wiley-I nterscience，New York(1987))に見出される。生物学的試薬および実験装置の製造業者からの製品情報もまた、公知の生物学的方法において有用な情報を提供する。このような製造業者には、SIGMA chemic al company(Saint Louis，MO)、R&D systems(Minneapolis，MN)、Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway，NJ)、CLONTECH Laboratories Inc．(Palo Alto,CA )、Chem Genes Corp.、Aldrich Chemical Company(Milwaukee，WI)、Glen Resea rch，Inc.、GIBCO BRL Life Technologies，Inc．(Gaithersberg，MD)、Fluka C hemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)、Invitr ogen(San Diego，CA)、およびApplied Biosystems(Foster City，CA)、ならびに当業者に公知である他の多くの商業的供給元が含まれる。 PE様プロタンパク質またはそのサブ配列(例えば、プロテアーゼ活性化可能配列)をコードするポリヌクレオチドは、任意の適切な方法(例えば、上記の適切な配列のクローニングおよび制限を含む)によって、またはNarangら、Meth.Enzymo l．68:90-99(1979)のホスホトリエステル法；Brownら、Meth.Enzymol．68:109-1 51(1979)のホスホジエステル法；Beaucageら、Tetra.Lett．22:1859-1862(1981) のジエチルホスホルアミダイト法；例えば、自動合成機(例えば、Needha・-VanD evanterら(1984)Nucleic Acids Res.、12:6159-6168に記載されるような)を使用する、BeaucageおよびCaruthers(1981)、Tetrahedron Letts．22(20):1859-1862 により記載される固相ホスホルアミダイトトリエステル法；ならびに米国特許第 4,458,066号の固体支持体法のような直接化学合成によって調製され得る。化学合成は一本鎖のオリゴヌクレオチドを生成する。これは、相補的配列とのハイブリダイゼーションにより、またはテンプレートとしてこの一本鎖を使用するDNA ポリメラーゼでの重合化により二本鎖DNAに変換され得る。DNAの化学合成は約10 0塩基の配列に制限されるが、より長い配列は、より短い配列の連結により得られ得ることを、当業者は認識する。ネイティブなPE体外毒素をコードする核酸は、本発明のPE様プロタンパク質を生成するよう改変され得る。部位特異的変異誘発による改変は、当該分野において周知である。ネイティブなPE体外毒素の核酸は、インビトロ方法により増幅され得る。増幅方法には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、転写ベースの増幅系(TAS)、自己維持配列複製系(SSR)が含まれる。広範なクローニング法、宿主細胞、およびインビトロ増幅方法論は当業者に周知である。タンパク質の変異体型は、そのタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドの部位特異的変異誘発により、または0.1mM MnCl₂および不均衡なヌクレオチド濃度を用いて、元のポリヌクレオチドのPCRエラー率が増大することによって引き起こされるランダム変異誘発により作製され得る。一旦本発明のPE様プロタンパク質をコードする核酸が単離およびクローニングされると、組換え的に操作された細胞(例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞)において所望のタンパク質を発現させ得る。当業者は、タンパク質の発現に利用可能な多くの発現系を理解し得ることが予測される。原核細胞または真核細胞におけるタンパク質の発現のための種々の方法を、詳細に記載することは試みない。簡潔には、本発明の単離されたタンパク質をコードする天然または合成の核酸の発現は、代表的には、発現制御配列(例えば、構成的または誘導性のいずれかであるプロモーター)にDNAまたはcDNAを作動可能に連結し、続いて発現ベクター中に取り込むことによって達成される。ベクターは、原核細胞または真核細胞のいずれかにおいて複製および組込みに適切であり得る。代表的な発現ベクターは、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにタンパク質をコードするDNAの発現の調節に有用なプロモーター含む。クローニングされた遺伝子の高レベル発現を得るために、転写を導く強力プロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写/翻訳ターミネーターを最低限含む発現ベクターを構築することが望ましい。当業者は、PE様タンパク質をコードする核酸に対して、その生物学的活性を減少させることなく、改変をなし得ることを認識する。いくつかの改変は、クローニング、発現、または融合タンパク質への標的化分子の取り込みを容易にするためになされ得る。このような改変は当業者に周知であり、そして例えば、開始部位を提供するためにアミノ末端に付加されたメチオニン、または都合良く配置された制限部位もしくは終止コドンまたは精製配列を作成するためにいずれかの末端に位置するさらなるアミノ酸(例えば、ポリHis)を含む。ポリヌクレオチドを細胞へ送達するために種々の手段が利用可能である。これには、例えば、溶液からの細胞による分子の直接取り込み、リポフェクション( 例えば、リポソームまたは免疫リポソーム)によって容易にされた取り込み、粒子媒介トランスフェクション、および阻害性ポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を有する発現カセットからの細胞内発現が含まれる。Inouyeら、米国特許第5,272,065号；Methods in Enzymo logy、第185巻、Academic Press，Inc.、San Diego、CA(D.V.Goeddel編)(1990) またはM.Krieger、Gene Transfer and Expression--A Laboratory Manual．Stoc kton Press、New York、NY,(1990)もまた参照のこと。組換えDNA発現プラスミドもまた、遺伝子治療による以外の手段による送達用に本発明のポリヌクレオチドを調製するために使用されるが、インビトロ化学合成によって短いポリヌクレオチドを作製するのがより経済的であり得る。構築物はまた、タンパク質の単離を単純にするためのタグを含み得る。例えば、ポリヒスチジンタグ(例えば６個のヒスチジン残基のもの)が、タンパク質のアミノ末端に取り込まれ得る。ポリヒスチジンタグは、ニッケルキレートクロマトグラフィーにより単一工程において、タンパク質の簡便な単離を可能にする。本発明のPE様プロタンパク質をコードする核酸は、種々の宿主細胞（E.coli、他の細菌性宿主、酵母、および種々の高等真核生物細胞（例えば、COS、CHO、およびHeLa細胞株）を含む）および黒色腫細胞株において発現され得る。組換えタンパク質遺伝子は、各宿主について適切な発現制御配列に作動可能に連結される。E.coliについて、これは、プロモーター（例えば、T7、trp、またはλプロモーター）、リボソーム結合部位、そして好ましくは転写終結シグナルを含む。真核生物細胞について、制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウイルスなどから誘導されるプロモーターおよび好ましくはエンハンサー、ならびにポリアデニル化配列を含み、そしてスプライスドナーおよびアクセプター配列を含み得る。本発明のプラスミドは、周知の方法（例えば、E.coliについては塩化カルシウム形質転換、および哺乳動物細胞についてはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーション）によって、選択された宿主細胞中に移入され得る。プラスミドによって形質転換された細胞は、プラスミド上に含まれる遺伝子（例えば、amp、gpt、neo、およびhyg遺伝子）によって与えられる抗生物質に対する耐性によって選択され得る。一旦発現されると、組換え融合タンパク質は、当該分野の標準的な手順（硫安沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む）によって精製され得る（一般に、R．Scopes，Protein Purificatlon，Spr lnger-Verlag，N.Y．(1982)を参照のこと）。少なくとも約90〜95％均一性の実質的に純粋な組成物が好ましく、そして98〜99％またはそれ以上の均一性が薬学的使用に最も好ましい。所望のように部分的または均一に一旦精製されると、次いで本発明のPE様プロタンパク質は、治療的に使用され得る。本発明のPE様プロタンパク質はまた、標準的な合成方法を用いて全体的または部分的に構築され得る。約50未満のアミノ酸長の単離された本発明のタンパク質の固相合成は、配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に付着させ、続いて配列中の残りのアミノ酸を連続的に付加させることによって達成され得る。固相合成についての技術は、BaranyおよびMerrifield，Solid-Phase Peptide Synthesis;3- 284頁、The Peptides:Analysis，Synthesis，Bioogy．第２巻：Special Methods in Peptide Synthesis，Part A.、Merrifieldら、J．Am．Chem．Soc.，85:2149 -2156(1963)、ならびにStewartら、Solid Phase Peptide Synthesis，第２版、P lerce Chem．Co.，Rockford，Ill．(1984)によって記載される。より大きな長さのタンパク質は、より短いフラグメントのアミノ末端およびカルボキシ末端の縮合によって合成され得る。カルボキシ末端の活性化によって（例えば、カップリング試薬のN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドの使用によって）ペプチド結合を形成する方法は、当業者に公知である。アミノ酸１〜252をコードするヌクレオチドを除去することで、「PE40」といわれる構築物を生成する。アミノ酸１〜279をコードするヌクレオチドを除去することで「PE37」と呼ばれる構築物が生じる。（Pastanら、米国特許第5,602,095 号を参照のこと。）実施者は、これらのプラットホームの5'末端に細胞認識ドメインをコードする配列を連結して、特定の細胞表面レセプターを指向するPE様キメラタンパク質を操作し得る。これらの構築物は、必要に応じて、アミノ末端メチオニンをコードし得る。細胞認識ドメインは、そのような構築物中にER残留配列をコードするヌクレオチド配列に挿入され得る。構築物はまた、タンパク質のアミノ末端にて分泌配列をコードするように操作され得る。そのような構築物は、哺乳動物細胞においてタンパク質を産生するために有用である。 IV．抗体産生好ましい実施態様において、本発明のPE様プロタンパク質は、抗体に付着されイムノトキシンを形成する。本明細書中に例示されるようなジスルフィド安定化抗体が特に好ましい。付着は、共有結合的または非共有結合的手段（例えば、ビオチンおよびアビジン）によってであり得る。代表的には、共有結合的付着は、融合タンパク質の構築によって、または上記で議論されるような化学的リンカーの使用によって達成され得る。以下の議論は、利用可能な技術の一般的概要として提示される；しかし、当業者は、以下の方法に対する多くのバリエーションが公知であることを認識する。Ａ.抗体産生ポリクローナル抗体を産生する方法は、当業者に公知である。簡単には、免疫原（抗原）はアジュバントと混合され、そして動物はその混合物で免疫される。免疫原は、好ましくは、抗体の結合パートナーを形成する精製細胞表面抗原である。あるいは、細胞表面抗原は、適切なキャリア（例えば、GST、キーホールリンペットヘモシアニン、または等価物）に結合されるか、または細胞表面抗原をコードする核酸は、組換えワクシニアウイルス（米国特許第4,722,848号を参照のこと）のような免疫ベクター中に取り込まれる。免疫原調製物に対する動物の免疫応答は、試験採血を行い、そして目的の細胞表面抗原に対する反応性力価を決定することによってモニターされる。免疫原に対する適切な高力価の抗体が得られる場合、血液は動物から回収され、そして抗血清が調製される。所望される場合、抗血清のさらなる分画を実施して、細胞表面抗原に反応性の抗体を富化する（例えば、Coligan，Current Protocols in Immunology，Wiley/Greene，NY(1 991)；ならびにHarlowおよびLane(1989)Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press，NYを参照のこと）。所望の細胞表面抗原の予め決定されたフラグメントに対する抗体（それらの結合フラグメントおよび単鎖組換え改変体を含む）は、例えば、フラグメントと上記のキャリアタンパク質との結合体で動物を免疫することによって惹起される。代表的には、目的の免疫原は、少なくとも約５アミノ酸長の細胞表面抗原であり、より代表的には、細胞表面抗原は少なくとも10アミノ酸長、好ましくは、少なくとも15アミノ酸長、より好ましくは少なくとも25アミノ酸長である。ペプチドは、代表的には、キャリアタンパク質（例えば、融合タンパク質として）に結合されるか、または免疫ベクターにおいて組換え発現される。抗体が結合するペプチドの抗原決定基は、代表的には３〜10アミノ酸長である。モノクローナル抗体は、所望の抗体を分泌する細胞から調製される。モノクローナル抗体は、免疫原が誘導された細胞表面抗原への結合についてスクリーニングされる。特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体は、通常、少なくとも10^-6〜10^-7M、好ましくは少なくとも10^-8M、好ましくは少なくとも10^-9M、より好ましくは少なくとも10^-10M、最も好ましくは少なくとも10^-11Mの親和定数で結合する。いくつかの場合において、モノクローナル抗体を、種々の哺乳動物宿主（例えば、マウス、齧歯類、霊長類、ヒトなど）から調製することが所望される。このようなモノクローナル抗体を調製するための技術の説明は、例えば、Stitesら（編）、Basic and Clinical Immunology（第４版）、Lange Medical Publicati o ns，Los Altos，CA、およびそこに引用される参考文献；HarlowおよびLane、前出；Goding（1986）Monoclonal Antibodies:Principles and Practice（第２版）Academic Press，New York，NY；ならびにKohlerおよびMilstein（1975）Natu re 256:495-497に見い出される。簡単に要約すると、この方法は、細胞表面抗原を含む免疫原を動物に注射することによって進行される。次いで、動物を屠殺し、そして細胞をその脾臓から採取し、これをミエローマ細胞と融合する。得られるものは、インビトロで再生し得るハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」である。次いで、ハイブリドーマの集団を、個々のクローンを単離するためにスクリーニングし、各クローンは、免疫原に対して単一の抗体種を分泌する。この様式において、得られる個々の抗体種は、免疫原性物質上の認識される特異的部位に応答して産生された、免疫動物由来の、不死化され、そしてクローン化された単一Ｂ細胞の産物である。不死化の別の方法は、エプスタインバーウイルス、ガン遺伝子、もしくはレトロウイルスでのトランスフェクション、または当該分野で公知の他の方法を含む。単一の不死化細胞から生じるコロニーは、抗原についての所望の特異性および親和性の抗体の産生についてスクリーニングされ、そしてこのような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収量は、種々の技術（脊椎動物（好ましくは哺乳動物）宿主の腹膜腔への注射を含む）によって増大される。他の適切な技術は、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択を含む（例えば、Huseら、（1989）Science 246:1275-1281；およびWardら、（1989）Nature 341:544-546；およびVaughanら、（1996）Nature Biotechnology 14:309-314を参照のこと）。あるいは、高アビディティーヒトモノクローナル抗体は、未再編成ヒト重鎖および軽鎖Ig遺伝子座のフラグメントを含むトランスジェニックマウス（すなわち、小遺伝子座（minilocus）トランスジェニックマウス）から得られ得る。Fishwildら、Nature Biotech．14:845-851 (1996)。Ｂ.ヒトまたはヒト化（キメラ）抗体産生それらが惹起された種とは異なる生物に投与された抗体は、しばしば免疫原性である。従って、例えば、ヒトに投与されたマウス抗体は、しばしば、複数回投与の際に抗体に対する免疫学的応答（例えば、ヒト抗マウス抗体（HAMA）応答）を誘導する。抗体の免疫原性特性は、特徴的なヒト配列へ抗体の部分または全体を改変すること(それによりそれぞれ、キメラまたはヒト抗体が産生される)により減少する。１．ヒト化（キメラ）抗体ヒト化（キメラ）抗体は、ヒトおよび非ヒト部分を含むイムノグロブリン分子である。より詳細には、ヒト化キメラ抗体の抗原結合領域（または可変領域）は、非ヒト供給源（例えば、マウス）に由来し、そしてキメラ抗体の定常領域（これは、イムノグロブリンに生物学的エフェクター機能を付与する）は、ヒト供給源に由来する。ヒト化キメラ抗体は、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性、およびヒト抗体分子によって付与されるエフェクター機能を有するはずである。キメラ抗体を産生する多数の方法は、当業者に周知である（例えば、米国特許第5,502, 167号、同第5,500,362号、同第5,491,088号、同第5,482,856号、同第5,472,693 号、同第5,354,847号、同第5,292,867号、同第5,231,026号、同第5,204,244号、同第5,202,238号、同第5,169,939号、同第5,081,235号、同第5,075,431号、および同第4,975,369号を参照のこと）。キメラ（ヒト化）抗体の調製のための詳細な方法は、米国特許第5,482,856号に見い出され得る。２．ヒト抗体別の実施態様において、本発明は、PE様プロタンパク質の構築のための細胞特異的リガンドとして作用する完全なヒト抗体を提供する。ヒト抗体は、全体的に、特徴的なヒトポリペプチド配列からなる。本発明のヒト抗体は、広範な種々の方法を用いて産生され得る（例えば、概説については、Larrickら、米国特許第5 ,001,065号を参照のこと）。いくつかの実施態様において、本発明のヒト抗体は、通常、トリオーマ細胞において最初に産生される。次いで、抗体をコードする遺伝子は、他の細胞、特に非ヒト哺乳動物細胞においてクローン化および発現される。トリオーマ技術によってヒト抗体を産生するための一般的なアプローチは、Ostbergら(1983)、Hybri doma 2:361-367、Ostberg、米国特許第4,634,664号、およびEngelmanら、米国特許第4,634,666号によって記載されている。この方法によって得られる抗体産生細胞株はトリオーマと称される。なぜなら、それが３つの細胞（２つのヒトおよび１つのマウス）の子孫であるからである。トリオーマは、ヒト細胞から作製される普通のハイブリドーマより安定に抗体を産生することが見い出されている。トリオーマ細胞株によって分泌されるイムノグロブリンの重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は、当該分野で公知の方法にしたがってクローン化され、これは、ポリメラーゼ連鎖反応を含む（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A La boratory Manual，第２版、Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；BergerおよびKim mel、Methods in Enzymology，第152巻：Guide to Molecular Cloning Techniqu es，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.，1987；Coら、（1992）J.Immun ol.，148:1149を参照のこと）。例えば、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は、トリオーマのRNAの逆転写によって産生されるトリオーマのゲノムDNAまたはcD NAからクローン化される。クローニングは、従来の技術によって達成され、これは、クローン化される遺伝子に隣接または重複する配列、または遺伝子のセグメントにハイブリダイズするPCRプライマーの使用を含む。Ｖ．哺乳動物細胞のトランスフェクション本発明は、所望のプロテアーゼ活性化可能配列の切断のためのプロテアーゼをコードする核酸（プロテアーゼ核酸）を提供する。哺乳動物細胞は、特定のプロテアーゼ活性化可能配列に対して同族のプロテアーゼを発現するように改変され得る。従って、哺乳動物細胞は、特定のPE様プロタンパク質に対する感受性について改変され得る。本発明はまた、本発明のPE様プロタンパク質組成物をコードする核酸（PE様プロタンパク質核酸）を提供する。これらのPE様プロタンパク質は、同族プロテアーゼを発現する組換えまたは天然の細胞におけるタンパク質合成を阻害するために使用され得る。本発明の核酸は、エキソビボおよびインビボでの哺乳動物細胞のトランスフェクションのための核酸を含む。これらの核酸は、以下に記載するような標的細胞および生物のトランスフェクションのための多くの周知のベクターのうちの任意のものに挿入され得る。核酸は、ベクターと標的細胞との相互作用を介して、エキソビボでまたはインビボで細胞にトランスフェクトされる。本発明の核酸は、上記でより十分に議論されている。遺伝子治療手順の総説については、Anderson、Science（1992）256:808-813； NabelおよびFelgner(1993)TIBTECH 11:211-217；MitaniおよびCaskey(1993)TIBT ECH 11:162-166；Mulligan(1993)Science 926-932；Dillon(1993)TIBTECH 11:16 7-175；Miller(1992)Nature 357:455-460；Van Brunt(1988)Blotechnology6(10) :1149-1154；Vigne(1995)Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36；K remerおよびPerricaudet(1995)British Medical Bulletin 51(l):31-44；Haddad aら(1995)Current Topics inMicrobiology and Immunology、Doerfl Therapy(1994)l:13-26を参照のこと。治療的遺伝子治療適用における使用（例えば、再注入）を意図しない哺乳動物細胞のエキソビボトランスフェクションは、上記のような標準的な分子生物学方法を用いて達成され得る。哺乳動物細胞中への標的核酸の送達は、疾患の遺伝子治療処置の第一の重要な工程である。多数の送達方法が当業者に周知である。このような方法には、例えば、リポソームに基づく遺伝子送達(DebsおよびZhu（1993）WO93/24640;Manni noおよびGould-Fogerite（1988）BioTechniques 6(7):682-691;Rose、米国特許第5,279,833号；Brigham（1991）WO91/06309;ならびにFelgnerら、（1987）Proc .Natl．Acad．Sci．USA 84:7413-7414)、および治療的ポリヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノムの一部として保有する複製欠損レトロウイルスベクター（例えば、Millerら(1990)Mol．Cell．Biol．10:4239(1990)；Kolberg（1992）J． NIH Res．4:43、およびCornettaら(1991)Hum．Gene Ther．2:215(1991)を参照のこと）が含まれる。広範に使用されるレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス(MuLV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、サル免疫不全ウイルス(S IV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、およびこれらの組み合わせに基づくベクターが含まれる。例えば、Buchscherら(1992)J．Virol．66(5)2731-2739；Johannら( 1992)J．Virol．66(5)1635-1640(1992)；Sommerfeltら(1990)Virol.176:58-59； Wilsonら(1989)J．Virol．63:2374-2378；MillerらJ．Virol．65:2220-2224(199 1)；Wong-Staalら、PCT/US94/05700、ならびにRosenburgおよびFauci（1993）Fu ndamental Immunology，第３版，Paul（編）Raven Press，Ltd.,New York、およびその中の参考文献、ならびにYuらGene Therapy（1994）（前出）を参照のこと。 AAVに基づくベクターもまた、標的核酸で哺乳動物細胞をトランスフェクトするために、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボおよびエキソビボの遺伝子治療手順において使用される。AAVベクターの概説については、Westら(1987)Virology 160:38-47；Carterら(1989)米国特許第 4,797,368号；CarterらWO93/24641(1993)；Kotin（1994）Human Gene Therapy 5 :793-801；Muzyczka（1994）J．Clin．Invst．94:1351、およびSamulski（前出）を参照のこと。組換えAAVベクターの構築は、Lebkowski、米国特許第5,173,41 4号；Tratschinら(1985)Mol．Cell．Biol．5(11):3251-3260；Tratschinら、(19 84)Mol．Cell．Blol．4:2072-2081；HermonatおよびMuzyczka（1984）Proc.Natl ．Acad．Sci．USA 81:6466-6470；McLaughlinら（1988）およびSamulskiら、（1 989）J．Vlrol．63:03822-3828を含む多くの刊行物に記載される。rAAVによってトランスフェクトされ得る細胞株には、Lebkowsklら(1988)Mol．Cell．Biol.8:3 988-3996に記載されるものが含まれる。Ａ．細胞のエキソビボトランスフェクション遺伝子治療（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再注入による）のためのエキソビボ哺乳動物細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。好ましい実施態様において、細胞は、被験体哺乳動物生物から単離され、標的核酸（すなわち、プロテアーゼまたはPE様プロタンパク質核酸）でトランスフェクトされ、そして被験体生物（例えば、患者）に再注入して戻される。エキソビボトランスフェクションに適した種々の哺乳動物細胞型は、当業者に周知である（患者から、細胞を単離しそして培養する方法の議論については、例えば、 Freshneyら、Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique）第３版、Wiley-LISS，NeW York(1994)およびその中での引用文献を参照のこと）。上記のように、好ましい実施態様において、標的核酸をコードするパッケージング可能な核酸は、活性化または構成的プロモーターの制御下にある。トランスフェクトされた細胞は、機能的PE様プロタンパク質またはプロテアーゼを発現する。１つの特に好ましい実施態様において、幹細胞は、遺伝子治療のためのエキソビボ手順において使用される。幹細胞を使用する利点は、それらが他の細胞型にエキソビボで分化され得るか、または哺乳動物（例えば、細胞のドナー）（そこで骨髄に移植する）に導入され得ることである。GM-CSF、IFN-γ、およびTNF- αのようなサイトカインを使用して、CD34⁺細胞をエキソビボで、臨床的に重要な免疫細胞型に分化させるための方法は公知である（Inabaら(1992)J．Exp．Med ．176:1693-1702、およびSzabolcsら（1995）154:5851-5861を参照のこと）。幹細胞は、公知の方法を使用するトランスフェクションおよび分化のために単離される。例えば、マウスにおいて、骨髄細胞は、マウスを屠殺し、そして足の骨をハサミで切断することによって単離される。幹細胞は、骨髄細胞から、所望でない細胞（例えば、CD4⁺およびCD8⁺(T細胞)、CD45⁺(panB細胞)、GR-l(顆粒球) 、およびIa^d(分化した抗原提示細胞))に結合する抗体で骨髄細胞をパニングすることによって単離される。このプロトコルの例については、Inabaら(1992)J．Ex p．Med．176:1693-1702を参照のこと。ヒトにおいて、腸骨稜由来の骨髄吸引を、例えば、手術室で一般的な麻酔下で行った。骨髄吸引は、約1,000mlの量であり、そして後方腸骨および稜から回収する。回収した細胞の総数が約２×10⁸／kgよりも少ない場合、後方稜に加えて胸骨および前方腸骨稜を用いる第二の吸引を行う。手術の間、２単位の照射されたパックされた赤血球細胞を、吸引によって採取された骨髄の投与量を置換するために投与する。ヒト造血前駆体および幹細胞を、CD34表面膜抗原の存在によって特徴づける。この抗原を、精製（例えば、CD34を結合したアフィニティーカラムにおいて）に使用する。骨髄を採取した後、単核細胞を、フィコール勾配遠心分離によって、他の成分から分離する。これを、細胞分離機（例えば、Baxter F enwal CS3000+またはTerumo machine）を使用する半自動化方法によって行う。軽い密度の細胞（ほとんど単核細胞から構成される）を回収し、そしてこの細胞をプラスチックフラスコ中で37℃)にて1.5時間インキュベートする。接着細胞（単球、マクロファージ、およびＢ細胞）を破棄する。次いで非接着細胞を回収し、そしてモノクローナル抗CD34抗体（例えば、マウス抗体9C5)とともに、４℃にて30分間、穏やかに回転させながらインキュベートする。抗CD34抗体の最終濃度は、10μg/mlである。２回の洗浄後、ヒツジ抗マウスIgG（Fc）抗体でコートした常磁性ミクロスフェア(Dyna Beads、Baxter Immunotherapy Group、Santa Ana ，Californiaから提供される）を２細胞／ビーズの比で細胞懸濁物に添加する。４℃、30分のさらなるインキュベーションの後、磁気ビーズを有するロゼット形成細胞を磁石で回収する。200U/mlの最終濃度のキモパパイン（BaxterImmunothe rapy Group、Santa Ana，Californiaから提供される）を添加し、CD34+細胞からビーズを除去する。あるいは、そして好ましくは、CD34またはCD34に結合する抗体に結合するアフィニティーカラム単離手順を使用し得る（以下の実施例を参照のこと）。Hoら、(1995)Stem Cells 13(補遺3):100-105を参照のこと。また、Br enner(1993)Journal of Hematotherapy 2:7−17を参照のこと。別の実施態様において、造血幹細胞を胎児臍帯血から単離する。Yuら、（1995 ）Proc．Natl．Acad．Sci．USA，92:699-703は、レトロウイルスベクターを用いてのヒト胎児臍帯血からのCD34+細胞の形質導入の好ましい方法を記載する。 VI．薬学的組成物および投与本発明のPE様プロタンパク質組成物(PE様プロタンパク質および標的化PE様プロタンパク質（すなわち、細胞特異的リガンドに結合したPE様プロタンパク質を含む）は、非経口投与（例えば、血管内投与または体腔または器官の管腔への投与）に特に有用である。投与のための組成物は、通常薬学的に受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）に溶解されたPE分子融合タンパク質の溶液を含む。種々の水性キャリア（例えば、緩衝化生理食塩水など）が使用され得る。これらの溶液は、無菌であり、そして一般には所望でない物資を含まない。これらの組成物は、従来的な、周知の滅菌技術によって滅菌され得る。組成物は、pH調整および緩衝剤、毒性調整剤など（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど）のような近似の生理学的状態に必要とされるような、薬学的に受容可能な補助物質を含み得る。これらの処方物における融合タンパク質の濃度は広範に変化し得、そして主に液量、粘性、体重などに基づき、選択された特定の投与様態および患者の必要性に従って、選択される。従って、血管内投与の代表的な薬学的組成物は、約0.1〜10mg／患者／日である。特に、薬物が血流ではなく隔離された部位（例えば、体腔中または器官の管腔中）に投与される場合、0.1〜約100mg／患者／日投与量を使用し得る。投与可能な組成物を調製するために実際の方法は、当業者に公知または明らかであり、そしてRemington's Pharmaceutical Science，第19版，Mack Publishing Compan y，Easton，Pennsylvania(1995)のような刊行物に、より詳細に記載される。本発明の融合タンパク質またはそのカクテル（すなわち、ほかのタンパク質を有する）を含む組成物が、治療処置のために投与され得る。治療適用において、組成物を、疾患に罹患した患者に、疾患および合併症を治療または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で投与し得る。これを達成するのに適切な量を、「治療有効量」と定義する。この使用に有効な量は、疾患の重篤度および患者の健康の一般的な状態に依存する。組成物の単一または複数投与物を、患者によって必要とされ、そして耐性であるような投与量および頻度に依存して投与し得る。任意の事象において、組成物は、患者を効果的に処置するに十分な量の本発明のタンパク質を提供するべきである。好ましくは、投与量は一回投与されるが、治療結果が達成されるか、または副作用が治療の非継続の理由となるかのいずれかまで周期的に適用され得る。一般には、投与量は、患者に受容可能でない毒性を生じることなく、疾患の症状または兆候を処置または緩解させるのに十分な量であるべきである。有効量の化合物は、症状の主観的な改善、または臨床医もしくは他の資格を持った観察者によって留意されるような客観的に同定可能な改善を提供するものである。本発明のPE様タンパク質組成物の制御された放出の非経口処方物は、移植物、油性注入として、または特定の系としてなされ得る。タンパク質送達系の広い概要については、Banga，A．J.，「Therapeutic Peptides and Proteins:Formulat ion，Processing，and Delivery Systems」Technomic Publishing Company，Inc. 1995．Lancaster，PA（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。特定の系には、ミクロスフェア、微粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア、およびナノ粒子が含まれる。マイクロカプセルは、中心コアとして治療タンパク質を含む。ミクロスフェアにおいては、粒子を通して治療剤が分散される。約１μmより小さい、粒子、ミクロスフェア、およびマイクロカプセルは、一般にそれぞれ、ナノ粒子、ナノスフェア、ナノカプセルといわれる。ナノ粒子のみが血管内に投与されるように、キャピラリーは約５μmの直径を有する。微粒子は、代表的には約100μmの直径であり、そして皮下または筋肉内に投与される。例えば、Kreuter，J．1994．「Nanoparticles,」Colloidal Drug Deliver y Systems，J．Kreuter編、Marcel Dekker，Inc．New York，NY,219-342頁；Tic eおよびTabibi，1992．「Parenteral Drug Delivery:Injectibles」Treatise on Controlled Drug Delivery，A．Kydonieus編，Marcel Dekker，Inc．New York ，NY,315-339頁（両方とも本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。治療タンパク質の制御された送達のための多数の系が公知である。例えば、米国特許第5,055,303号、第5,188,837号、第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837, 028号、第4,957,735号、および第5,019,369号、第5,055,303号、第5,514,670号、第5,413,797号、第5,268,164号、第5,004,697号、第4,902,505号、第5,506,20 6号、第5,271,961号、第5,254,342号、および第5,534,496号（各々は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。ポリマーは、本発明のPE組成物のイオン制御された放出の使用のために代表的に使用される。制御された薬物送達における使用のための種々の分解可能および分解可能でないポリマー物質は、当該分野で公知である。Langer，R．1993．「P olymer-Controlled Drug Delivery Systems」Accounts Chem．Res.，26:537-542 。例えば、ブロックコポリマー、ポーラキサマー（polaxamer）407は、低い温度で移動性の粘稠物として存在するが、体温で半固体ゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン-2およびウレアーゼの処方および持続性送達に有効なビヒクルであることが示されている。Johnstonら、Pharm．Res.，9:425-434(1992)； Pecら、J．Parent．Sci．Tech.，44(2):58-65(1990)。ヒドロキシアパタイトもまた、タンパク質の制御された放出のためのマイクロキャリアとして使用され得る。Ijntemaら、Int．J．Pharm.，112:215-224(1994)。リポソームは、制御された放出ならびに包入された薬物の薬物標的のために使用され得る。Betageriら、 1993.「Targeting of Liposomes」Liposome Drug Delivery Systems，Technomic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，PA。米国特許第4,235,871号、第4,501,728 号、第4,837,028号、第4,957,735号、および第5,019,369号（各々は本明細書中で参考として援用される）もまた参照のこと。 PE様プロタンパク質は、プロテアーゼ活性可能配列を切断するプロテアーゼを産生する細胞を殺傷するために、被験体の治療処置に有用である。より詳細には、特定のガンがこの様式で処置され得る。これは、前立腺ガン、乳ガン、または結腸ガンの処置を含む。前立腺ガンの処置のためのPE様プロタンパク質は、PSA 活性可能配列を含む。多数の転移性活性ガンはウロキナーゼを発現する。従って、これらのガンの処置は、一般には、ウロキナーゼ活性可能配列を含むPE様プロタンパク質の使用による。処置には、被験体への治療有効量の調製物の投与を含む。以下の実施例は、限定的ではなく、例示的な目的で提供される。実施例 I．緒言本研究において、タンパク質工学ストラテジーを使用してタンパク質分解プロセシングに対する組換えイムノトキシン（immuntoxin）の感受性を変化させ得ることが示された。PEに基づくイムノトキシンのフリン特異的プロセシング部位を、それにガン発現プロテアーゼ、PSAによる切断可能性を与えるように変化した。毒素切断およびガン関連事象の活性化を行うことにより、イムノトキシン標的について第二のレベルの特異性を達成する。改変イムノトキシンはフリンに耐性であり、そしてそれらは多様な非PSA分泌細胞株に対する毒性を示した。従って、他のプロテアーゼ（まだ同定されていない）は、これらの新規のタンパク質をプロセスし得る。通常、フリンによるPEの切断は、細胞内で起こる。しかし、定着性結合は、システイン265と287とを結合するジスルフィド結合によって共に安定に保持されるドメインIIの一部内に位置するので、切断が細胞内位置で起こる必要はない。PS A切断ならびにsem1およびsem2イムノトキシンの活性化は細胞周囲で生じ、切断されたイムノトキシンが、細胞に結合して侵入し、そして細胞質に転位するのに十分強力であることが期待される。これは、PSAによるインビトロ切断が、非常に強力な細胞傷害性剤である、ニック（nicked）sem1および２イムノトキシンを産生することを示す実験によって確認された。 II．潜在的なPSA物質を含む組換えイムノトキシンの発現のためのプラスミドの構築 PSAによって切断および活性化され得るPE由来イムノトキシンを作成するために、本発明者らは、フリンの存在する部位で、アミノ酸組成物におけるさらなる改変体を作成した。まず、フリン切断を除去するために、PEコードプラスミド（ pM0AlA2VK352）のドメインIIにおける残基273と284との間の配列を、特有のBspM I-XhoIフラグメントを切除することによって、除去した。次いで、このフラグメントを、PSAの潜在的な基質配列をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖と置換した。特に、二重鎖は、セメノゲリン（semenogelin）Iのアミノ酸58-71（sem1 ）または151-163（sem2）をコードした（図3A）。最終的に、一連のサブクローニング工程において、これらのインサートを、PEコードベクターから、新しく構築したジスルフィド安定化Fvイムノトキシンに導入した。概念の証拠として、PS A基質配列を、イムノトキシン、HB21dsFvPE40（ヒトトランスフェリンレセプターに対して標的化される）に挿入した。いくつかの設計特徴に留意すべきである。第一に、BspMIおよびXhoIでの消化によって切除されている、正確に同じ数のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖を、挿入した。第二に、各セメノゲリン配列（これは、両インサートについてチロシンであった）のP1アミノ酸を、天然の配列におけるP1アルギニン残基によって通常支配される位置に挿入した。第三に、インサートを、主に、PS Aによる切断を可能にするように選択した。 HB21dsFvPE40イムノトキシン（VHおよびVL毒素）の成分を、別々のE．coliBL2 1（lDE3）培養物中で発現させ、封入体から回収し、そして本明細書中に記載されるように再折り畳みさせた。再折り畳みdsFvイムノトキシンを、Qセファロースおよびモノ-Qイオン交換クロマトグラフィーによって、dsFvイムノトキシン精製について確立されたプロトコル（Reiterら、Biochemistry,5451-5459頁，1994 #115；Buchner Anal.Biochem．205,263-270頁(1992)，#113）を用いて精製した。モノＱクロマトグラフィー後の精製、活性、組換え毒素の収率は、再折り畳みされた総タンパク質の10〜20％の範囲であった。SDS-PAGE分析により、組換えイムノトキシンが＞90％純粋であることが明らかになった（図２）。ジスルフィド安定化イムノトキシン、HB21(dsFv)PE38Kの成分をコードする発現プラスミド（pPWHB38KおよびpPWHBVH）を、部位特異的変異誘発を介して構築（Kunkelら、1993）し、そして図１に示すようにサブクローニングした。プラスミドpRKHB9Kのウラシル含有一本鎖DNA（HB21(scFv)PE38K（Kreltman，1997）をコードする）を、テンプレートDNAとして使用した。３つの変異原性オリゴヌクレオチドを使用して、pPWHBVH(HB2lVH(cys)をコードする）を作製した。5' GTTG AAGCCA GAAGCCTTGC AGGACAACTG AC 3'（配列番号14）は、クローニングの目的で 151位のHindIII部位を欠如する；5' CCATCCAATC CACTCTAGACACTGTTCAGG CCTCTG3 '（配列番号15）は、gly45をシステインと置換される；および5' GCCGCCACCACCG GATCGAA TTCATTATGA GGAGACGGTG AC 3'（配列番号16）は、終止コドンに続いてアンチトランスフェリンVH遺伝子の3'末端でのEcoRI部位が導入される。各オリゴは、ポジティブクローンの同定のために、分析用の制限部位（下線）を含んだ。HB2VL(cys)PE38KをコードするpPWHB38Kを作製するために、オリゴヌクレオチド5' GGTCATTACA ATATTCATATGGCCACCT CCAGAGCC3'（配列番号17）を使用して、NdeI部位およびATG翻訳開始コドンを、アンチトランスフェリンVL遺伝子の5 '末端に導入した。Ala238を、オリゴヌクレオチド5' ATCTCCAGCT TGGTACCACA AC GAACGTGA GAGG 3'（配列番号18）を用いてシステインに変異した。発現プラスミドpPWHBVHを作製するための全ての３つの変異を含むクローンを、新しく導入したかまたは欠失した制限部位、HindIII、EcoRI、およびXbaIを用いて制限酵素分析によって選択した。 pPWHBPE38Kを作製するための両変異を含むクローンを、NdeIおよびAsp7l8での制限分析により選択した。続いて、pPWHBVHを、リンカーおよびHB21VL(cys)PE38 KをコードするEcoRIフラグメントを欠失することによって構築した。pPWHB38Kを、HB21VH（cys）およびリンカーをコードするNdeIフラグメントを欠失させることによって構築した。正しいpPWHBVHおよびpPWHB38Kクローンを制限分析によって同定し、そしてDNA配列決定によって確認した。それぞれ、HB2lVL(cys)PE40(sem1)およびHB21VL(cys)PE40(sem2)をコードする発現プラスミドpPWHB40sem1およびpPWHB40sem2を、図１に示されるように構築した。セメノゲリンI配列を含むオリゴヌクレオチド二重鎖を、pPWM0sem1およびpP WM0sem2を作製するために、BspMI(937)とXhoI(981)部位との間にPE全体をコードする、pM0AlAlVK352（Ogataら、1992）に各々挿入した。隣接配列とともにPSA基質IQYTYH（配列番号20）をコードするオリゴヌクレオチドSem1(5' GGAGTCAAAAGGAAGCTT TT CAATTCAATA CACATATCAT GTAC 3'）（配列番号19）は、HindIII分析用制限部位（下線）を含んだ。PSA基質SQYSNT（配列番号22）および隣接配列をコードするオリゴヌクレオチドSem2、5' GGAGTCAGGA AAAGGTATTT CATCTCAGTA CTCA AATACA GAAC 3'（配列番号21）は、ScaI制限部位を含んだ。ポジティブクローンを、新しい制限部位の存在により選択した。最終的な発現プラスミドpPWHB40(se m1)およびpPWHB40(sem2)を構築するために、PE40をコードする1.129kb BspMI/Ec oRIフラグメントおよび挿入されたセメノゲリン配列を、pPWM0sem1および2からp PWHB38Kにサブクローニングした。ポジティブpPWHB40semlおよびpPWHB40sem2クローンを、それぞれ、EcoRI/XhoI、BamHI、またはScaI/XbaIでの制限分析によって同定した。 HB21VL(cys)PE40(wt)をコードするコントロール発現プラスミド、pPWHB40を、 PE40および抗Tac(Fv)PE40をコードするpRK78からのインタクトなフリン切断部位をコードする1.2kb HindIII/EcoRIフラグメント（Spenceら、Bioconj．Chem．4, (1993)）を、HindIII/EcoRI切断pPWHB38Kへサブクローニングすることより構築した。ポジティブクローンを、制限分析によって同定した。 III．タンパク質の発現および精製 HB21dsFvPE40イムノトキシンを、２つの別々の成分VH毒素およびVL毒素として生成する。HB21VL(cys)PE40(sem)、HB21VL(cys)PE40(wt)、およびHB21VH(cys)タンパク質を対応する発現プラスミドを含む別々のE.coli BL21DE3培養物に発現させた。細胞は、100μg/mlアンピシリン、1.62mM MgSO₄、および0.4％グルコースを補充したSuperbroth（Advanced Biotechnologies Inc.）中で37℃で、0.2の開始A600からA600＝3.0にまで増殖させた。タンパク質発現を、イソプロピル-β-D -チオガラクトピラノシド（IPTG）で、1mMで1.5時間誘導した。細菌細胞をペレット化し、そして50mM Tris（pH7.4）、20mM EDTA（pH8.0）中の200μg/mlリゾチームで溶解した。組換えタンパク質を含む不溶性封入体を、以前に記載（Buch nerら、1992）のように、精製し、可溶化し（6M グアニジン-HCl、0.1M Tris（p H8.0）、2mM EDTA）、そして65mMでジチオエリスリトール（DTE）（pH8.0-8.5）で４時間、室温で還元した。可溶化し、還元したIBタンパク質を、VH対VL毒素の 2:1モル比で合わせ、そして酸還元混合再生緩衝液（0.1M Tris、0.5M L-アルギニン-HCl、0.9mMグルタチオン、２mM EDTA、pH9.5）（Brinkmannら、Proc.Nat'l .Acad.Sci.U.S.A.、90、7538〜7543頁（1993B）；Buchnerら、1992）中に100倍に希釈した。再折り畳み混合物を、10℃で36〜40時間インキュベートし、そして 20mM Tris（pH7．4）、100mM尿素に対して、伝導率が2.5〜3.0mMHOになるまで透析した。適切に折り畳まれたイムノトキシンを、Ｑ−SepharoseおよびMonoQカラム上でのイオン交換によって精製した。 IV．PSA切断アッセイ HB21dsFvPE40イムノトキシンのPSAによる切断に対する感受性を試験するために、本発明者らは、HB21dsFvPE40（wt）およびHB21dsFvPE40（sem1および2）を、50Tris，100mM NaCl（pH7.0）中の種々の量の酵素的に活性なPSAと37℃でインキュベートした。切断条件は、まず、異なるインキュベーション期間（図4A）、種々の酵素対基質比（図4B）、および種々のpH条件を試験することによって最適化した。切断生成物を、SDS-PAGEおよびクマシーブルー染色によって分析した。非特異的な切断の最低量を有する、所望の切断生成物を生成するための最適条件は、酵素対基質が1：10のモル比での、37℃、pH7.0での、PSAとの６時間のインキュベーションであった。酵素的に活性なPSAをFitzgerald Industries International,Inc(Concord,MA) から購入した。PSA切断アッセイのために、イムノトキシンをPSA緩衝液（50mMTr ls．100mM NaCl、pH7.0）中のPSAと37℃でインキュベートした。経時反応について、20μgHB21（sem2）dsFvPE40を、100μlのPSA緩衝液を３μMで最終濃度に希釈した。PSAを酵素について、0.3μMの最終濃度（1：10の基質モル比）で添加した。20μlアリコートを0、1、3、6、および12時間の点で取り、そして反応を還元SDS-PAGEサンプル緩衝液で終結させた。還元サンプルを４〜20％SDS-PAGE勾配ゲルで流してPSAによる切断度を分析した。酵素：基質比アッセイについて、４ μgのHB21dsFvPE40（sem2）をPSAと、種々な濃度で６時間、37℃で、インキュベートした。反応を還元SDS-PAGEサンプル緩衝液で終結させ、そしてSDS-PAGEによって分析した。示すように（図３、レーン３）、HB21dsFvPE40（sem2）は、sem1バージョン（レーン２）よりも切断に対してより感受性であった。上記の条件を使用して、約 90％のsem2イムノトキシンは、切断されて37kDおよびl5kDのフラグメントを産生した一方、HB21dsFvPE40（sem1）は約20％が切断されただけであった（図３、レーン２）。PSAは、sem1イムノトキシンおよびsem2イムノトキシンを、１部位でのみ切断した。イムノトキシンに対して非常に高いPSAでの比で、長いインキュベーションで、wtイムノトキシンをPSAとインキュベートした場合に、マイナー切断生成物が存在した（図３Ｂ、レーン１および下部）。37kDカルボキシ末端フラグメントのＮ末端配列分析によって、sem2におけるチロシンとセリンとの間、およびsem1のチロシンとスレオニンとの間に切断が生じたことが検証された。これらは、PSAによってセメノジェリンIにおいて切断されるペプチド結合と同一であった。HB21dsFvPE40-wtの高濃度のPSAとのインキュベーションは、HB21dsFvPE 40（sem1および2）イムノトキシンから生成される37kDフラグメントよりもゆっくり移動する、マイナーフラグメント（図3B、レーン１）を生成した。このフラグメントを配列決定した場合、切断が、PEのスレオニン260とアラニン261との間で生じることが示された。Ｖ．PSA切断生成物のアミノ末端配列決定 50μgの全PEおよび組換えイムノトキシンHB21dsFvPE40（seml）および有B21ds FvPE40（sem2）を、各々、75μlのPSA緩衝液中の7.7μgのPSA（10：1モル比）と、37℃で６時間インキュベートした。反応を25μlの還元サンプル緩衝液で終結させ、そして切断生成物を４〜20％SDS-PAGEゲルで分離した。タンパク質をImmo bilon-Pトランスファーメンブレン（Millipore）に移し、そして37kD切断生成物を切り出し、そしてエドマン分解によって配列決定した（Bowman Gray School o f Medicine、Winston-Salem、NC）。 VI.フリン切断アッセイフリンは、P1,P2およびP4位に塩基性残基（もっとも頻繁にはアルギニン）を有する基質を切断する（Hosaka、1991、＃24）。P2でのプロリンの存在はまた、充分な耐性を示す(Matthews、1994＃119；Chironら、（1994）J.Biol.Chem.269 ：18167-18176）。sem1イムノトキシンおよびsem2イムノトキシンがフリン媒介切断に対して感受性であるか否かを決定するために、本発明者らは、1：10モル比で、25℃で16時間フリンとインキュベートした。フリンを、記載されるように調製した（Chironら、1993）。４μｇの組換えイムノトキシンを、各々、フリン緩衝液（0.2M NaOAc（pH5.5）、5mM CaCl2）中の 485ngのフリン（1：10の酵素：基質モル比）と、室温で16時間インキュベートした。これらの条件は、以前に、PEのフリン切断のために最適であると確立された（Chironら、1993）。反応を還元サンプル緩衝液で終結させ、そしてサンプルを４〜20％SDS-PAGE勾配ゲルで流した。反応混合物のSDS-PAGE分析は、sem1１イムノトキシンおよびsem2イムノトキシンが実際にフリンに抵抗性であることを示した（図５）。野生型イムノトキシンを切断し、そして生成物は、予測されたサイズの、15kD（Ｎ末端フラグメント）および37kD（Ｃ末端フラグメント）であった。 VII．他のセリンプロテアーゼによる切断 PSAは、キモトリプシン様特異性を有するセリンプロテアーゼとして記載されている。それゆえ、sem1イムノトキシンおよびsem2イムノトキシンがPSAに対して感受性にさせる変化が、これらのイムノトキシンを他のセリンプロテアーゼにより感受性にさせるか否かを決定することは興味深かった。WT，sem1イムノトキシンおよびsem2イムノトキシンは、各々、ウロキナーゼ、または配列決定用グレードのトリプシンもしくはキモトリプシンとインキュベートして、そして生成物を還元SDS-PAGEおよび非還元SDS-PAGEによって分析した。結果は、sem1およびse m2イムノトキシンがこれらのプロテアーゼによって切断されたことを示した。しかし、WTイムノトキシンと比較して、これらの３つのプロテアーゼのいずれかに対する感受性の増加の証拠は存在しなかった。 VIII．細胞傷害性アッセイ HB21dsFvPE40（wt）およびHB21dsFvPE40（sem）イムノトキシンの活性を、以前に記載されるように（Brinkmannら、1991）、培養細胞におけるタンパク質合成の阻害により決定した。PSAによって予め切断されたイムノトキシンを使用するアッセイにおいて、イムノトキシンを、細胞に添加する前に、1；10モル比で3 7℃で６時間、PSAとインキュベートした。競合実験について、mAb HB21またはmA b 0VB3をイムノトキシンの添加の15分前に添加した。前立腺ガン細胞株の以前の特徴付けによって、LnCAP細胞はPSAを発現するがDU 145はしないことが示されている。それゆえ、これら両方の株におけるsem1イムノトキシンおよびsem2イムノトキシンの相対細胞傷害性活性を評価することは興味深い。LnCAP細胞における一晩のアッセイにおいて、sem2イムノトキシンはsem 1のイムノトキシンよりも10倍高かった（表1）。これは、PSAによる切断に対するより大きな感受性と相関した。血清含有組織培養培地におけるプロテアーゼインヒビターの存在のため、PSA のタンパク質分解活性を評価することは容易ではなかった。それゆえ、さらなる実験を行った。sem1およびsem2イムノトキシンを、まず、インビトロでPSAとインキュベートし、そして得られたニック毒素を細胞に４時間添加した。これらの短期間アッセイにおいて、PSAによる前切断は、sem１およびsem２イムノトキシンの能力を劇的に増加させた。PSA切断は、sem1のIC₅₀を、500ng/mlから25ng/ml に減少させたが、sem2のIC₅₀は、25から3.7ng/mlになった（図6Aおよび6B）。細胞関連PSAが寄与するタンパク質分解活性を知ることなしに、これらの値は、おそらく、sem1イムノトキシンおよびsem2イムノトキシンの最適活性を表す。これらの条件下で、前切断したsem2イムノトキシンは、WTイムノトキシンの1／6だけの強さであった（下記および考証を参照のこと）。予想外に、sem1イムノトキシンおよびsem2イムノトキシンはまた、DU145細胞に対して毒性であった。ここで、sem2イムノトキシンは、sem１バージョンよりも５倍活性が高かった（表１）。DU145細胞は、PSAを分泌することは知られていないので、これは、他のプロテアーゼがまた、イムノトキシンを処理することを示唆する。PSAに加えて、前立腺ガン細胞は、他のカリクレインであるカテプシンＤを発現し、そしてプロウロキナーゼからその活性形態への変換し得る。さらなる研究によって、これらの細胞に関連するタンパク質加水分解活性を決定する。 DU145細胞での結果は、sem1イムノトキシンおよびsem2イムノトキシンの種々の非前立腺ガン細胞株における細胞傷害性活性の評価を加速する。LnCAPおよびD U145における結果とは対照的に、HUT-102、A431、MCF-7、およびOVCAR-3細胞においてアッセイした場合には、sem1イムノトキシンとsem2イムノトキシンとの間の活性には差異が存在しなかった（表１）。試験した全ての細胞株において、sem1イムノトキシンおよびsem2イムノトキシンは、WTイムノトキシンほどは活性ではなかった。この減少は、タンパク質加水分解プロセシングにおける差異というよりはむしろ、37kD切断生成物が細胞サイトゾルヘ移行する能力における差異に起因し得る。前立腺細胞株において、sem2 イムノトキシンは、WTよりも50倍活性が弱かったが、非前立腺細胞においては、差異は、HUT-102細胞についての４倍からMCF-7細胞についての600倍に及んだ。これらの研究によって、sem1イムノトキシンおよびsem2イムノトキシンは、種々の細胞株において細胞傷害性であったことが明らかになった。しかし、それらの能力は、野生型イムノトキシンに比べて減少していた。この減少は、おそらく、37kDC末端フラグメントの細胞のサイトゾルへの移行能力の差異に起因している。ネイティブPEにおいて、37kDフラグメントのＮ末端におけるトリプトファン 280およびロイシン284が、サイトゾルへの移行に重要であるようである。本発明者らのsem1イムノトキシンおよびsem2イムノトキシンにおいて、本発明者らは、 13〜15の新規アミノ酸を挿入し、そして定着結合のＰ’側の３〜４残基を変換した。これらの残基は、野生型NH₂末端GWEQLE配列（配列番号２由来）と同程度有効に移行を媒介し得ない。 IX.安定性アッセイ結合特異性を検証するために、過剰のHB21抗体がHB21dsFvPE40(sem2)の細胞傷害性活性をブロックした一方で、同様の濃度の無関連抗体である0VB3の添加は活性をブロックし得ないことが示された。sem1イムノトキシンおよびsem2イムノトキシンの構築の際に、PE40において実質的な数のアミノ酸が変換されるので、タンパク質の安定性が変化されるか否かを決定することが重要であった。これはまた、重要であった。なぜなら、sem1イムノトキシンおよびsem2イムノトキシンが、WTイムノトキシンほどは活性でなかったからであった。HB21dsFvPE40（wt）およびHB21dsFvPE40（sem2）の安定性を、各々のイムノトキシンをヒト血清中10μ g／mlで37℃でインキュベートすることによってアッセイした。種々のインキュベーション時間後の残留活性イムノトキシンを、培養細胞における20時間細胞傷害性アッセイにより決定した。凍結保存されたサンプルとの比較では減少は認められなかった。表１．種々のヒトガン細胞株に対するWTイムノトキシン、sem1イムノトキシン、およびsem2イムノトキシンの細胞傷害性活性。Ｘ．ウロキナーゼ活性化可能な配列その物質を切断するために、フリンは、上記のようにP1およびP4にアルギニン残基を必要とする。ウロキナーゼは、P1およびP2の両方にアルギニンが存在する場合に、基質を切断する。残基272および残基284の間のwtPE配列を有するイムノトキシンは、フリンによって切断されるがuPAによってはされない。ジフテリア毒素は、フリンおよびuPAによって切断される。DTのループに類似する配列を構築するために、８個のアミノ酸を挿入し、ここでこれらは、wtPE配列を置換しする。これらに下線を付す。新たなイムノトキシンは、フリンおよびuPAの両方によって切断される。このイムノトキシンをフリンに対して耐性でかつuPAに対して感受性にさせるために、さらなる変異体を作製した。アルギニンからアラニンへの変換のみで、uPAによって切断され、そしてフリンによって切断されない安定なタンパク質の産生が可能になった（グリシンおよびグルタミンへの変換は有用な変異体を生成しなかった）。切断部位の右の残基は、Ｐ’アミノ酸と呼ばれる。wtPEにおけるP'2はトリプトファンである。この位置でのトリプトファンの存在は、wtPEおよびPE誘導体化イムノトキシンの毒性にとって非常に重要である。P'2でトリプトファンを有し、そしてuPAによって切断可能なイムノトキシンを構築するために、さらなるセットの変異体を生成した。これらの中には、P'2位でのトリプトファンの回復があった。個の変異は、uPAにより切断されるが、フリンにより切断されない特徴を保持していた。細胞実験において、P'2位でのトリプトファンの存在は、タンパク質がuPAによって切断され、次いで標的細胞に添加される場合、最も細胞傷害性であることが証明された（グラフを参照のこと）。本発明は、PseudomonasエキソトキシンＡ様プロタンパク質およびそれらを使用する方法を提供する。特定の実施例が提供されたが、上記は、例示であって、そして制限的ではない。本発明の多くの改変は、この発明の詳細な説明を参照すれば当業者には明らかになる。従って、本発明の範囲は、上記の記載によって決定されるべきではなく、代わりに、添付の請求の範囲をその等価物の全範囲とともに参照して決定されるべきである。本願で引用されるすべての刊行物および特許公報は、個々の刊行物または特許公報が個々にそう記されるのと同程度にまで、すべての目的で、その全体が参考として援用される。

【手続補正書】【提出日】平成１２年７月２７日（２０００．７．２７）【補正内容】6.1 請求の範囲を別紙の通り補正します。6.2 明細書を以下の通り補正します。 6.2.1 明細書の第７頁第７行の「フリン（WT）またはPSA（sem１および２）」を「フリン（WT；配列番号２３）またはPSA（sem１（配列番号２４）および２（配列番号２５））」に補正します。 6.2.2 明細書の第９頁第２行の「３つの改変体」を「３つの改変体（wtpE＝配列番号２６；DT8＝配列番号２７；DT8ala276＝配列番号２８）」に補正します。 6.2.3 明細書の第９頁第14行の「REDKL（配列番号１から）」を「REDLK（配列番号３３）」に補正します。 6.2.4 明細書の第９頁第16行の「天然PEプロタンパク質のドメインIIループ」を「天然PEプロタンパク質のドメインIIループ（配列番号２９）」に補正します。 6.2.5 明細書の第31頁第26行の「RXXR」を「RXXR(配列番号３０）」に補正します。 6.2.6 明細書の第32頁第12行の「RXXR」を「RXXR（配列番号３０）」に補正します。 6.2.7 明細書の第32頁第18行の「(配列番号１からの）配列RQPR/GWEQ」を「配列RQPR/GWEQ（配列番号３１）」に補正します。 6.2.8 明細書の第34頁第21行の「SKGSFSTQY/TYHV」を「SKGSFSIQY/TYHV」に補正します。 6.2.9 明細書の第35頁第３行〜第４行の「配列Ile-Glu-Gly-Arg」を「配列II e-Glu-Gly-Arg(配列番号３２）」に補正します。 6.2.10 明細書の第36頁第15行の「REDLK」を「REDLK(配列番号３３）」に補正します。6.2 ．11 明細書の第36頁第16行の「(すなわち、REDL)」を「(すなわち、REDL ；配列番号３４）」に補正します。 6.2 ．12 明細書の第36頁第16行の「REDLK」を「REDLK(配列番号３３）」に補正します。 6.2.13 明細書の第36頁第17行の「KDEUを「KDEL(配列番号３５）」に補正します。 6.2.14 明細書の第63頁第10行の「配列番号２由来」を「配列番号３６」に補正します。請求の範囲１．以下を含有する、プロテアーゼ活性化可能Pseudomonas体外毒素Ａ様（「PE 様」）プロタンパク質：（１）細胞表面レセプターに結合する、10と1500との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；（２）タンパク質分解切断において細胞サイトゾルへのトランスロケーションを達成するのに十分にPEのドメインIIに相同性であるアミノ酸配列を含む、改変されたPEトランスロケーションドメインであって、該トランスロケーションドメインが、プロテアーゼにより切断可能なプロテアーゼ活性化可能配列を含むシステイン-システインループを含み、そして該システイン-システインループが、フリンによって実質的に活性化可能ではない、改変されたPEトランスロケーションドメイン；（３）必要に応じて、1500アミノ酸までのアミノ酸配列を含むPE Ib様ドメイン；（４）ＰEのドメインIIIに実質的に相同性のアミノ酸配列を含む細胞傷害性ドメインであって、該細胞傷害性ドメインがADPリボシル化活性を有する、細胞傷害性ドメイン；および（５）小胞体（「ER」）残留配列。２．前記改変されたPEトランスロケーションドメインが、アミノ酸279と280との間で前記プロテアーゼによって切断を引き起こすように、前記プロテアーゼ活性化可能配列を導入するアミノ酸置換で改変された、PEドメインII配列（配列番号１のアミノ酸253-364）を有する、請求項１に記載のPE様プロタンパク質。３．前記プロテアーゼ活性化可能配列が、ガン細胞によって分泌されるプロテアーゼによって切断可能である、請求項１に記載のPE様プロタンパク質。４．前記細胞認識ドメインが、ガン細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体を含有する、請求項１に記載のPE様プロタンパク質。５．前記プロテアーゼ活性化可能配列が、前立腺特異的抗原（「PSA」）によって切断可能である、請求項２に記載のPE様プロタンパク質。６．前記プロテアーゼ活性化可能配列が、ウロキナーゼによって切断可能である、請求項２に記載のPE様プロタンパク質。７．前記プロテアーゼ活性化可能配列が、中性エンドプロテアーゼ、ストロメライシン、コラゲナーゼ、カテプシンＢ、またはカテプシンＤによって切断可能である、請求項２に記載のPE様プロタンパク質。８．前記PE Ib様ドメイン、前記細胞傷害性ドメインおよび前記ER残留配列が、ともに天然のPEのドメインIbおよびIIIの配列を有する、請求項２に記載のPE様プロタンパク質。９．前記細胞認識ドメインが、ペプチド結合を介して前記改変されたトランスロケーションドメインにカップリングされる、請求項３に記載のPE様プロタンパク質。１０．前記プロテアーゼ活性化可能配列が、SKGSFSIQY/TYHV（配列番号11）、HL GGSQQLL/HNKQ（配列番号12）、またはSKGKGTSSQY/SNTE（配列番号13）である、請求項５に記載のPE様プロタンパク質。１１．前記プロテアーゼ活性化可能配列が、DR/VYIHPF（配列番号３）、VVCGER/ GFFYTP（配列番号４）、FFYTPK/A（配列番号５）、KRRPVK/VYP（配列番号６）、 PVGKKR/RPVKVY（配列番号７）、KPVGKK/RRPVKV（配列番号８）、GKPVGK/KRRPVK （配列番号７）、またはTFAGNAVRR/SVGQ(配列番号10）である、請求項６に記載のPE様プロタンパク質。１２．前記細胞認識ドメインが、ペプチド結合を介して前記改変されたトランスロケーションドメインにカップリングされた抗体であり、そして該抗体がガン細胞表面マーカーに特異的に結合する、請求項８に記載のPE様プロタンパク質。１３．以下を含有する、薬学的に受容可能なキャリアおよび治療有効量のプロテアーゼ特異的Pseudomonas体外毒素A様（「PE様」）プロタンパク質を含有する薬学的組成物：（１）細胞表面レセプターに結合する、10と1500との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；（２）タンパク質分解切断において細胞サイトゾルへのトランスロケーションを達成するのに十分にPEのドメインIIに相同性であるアミノ酸配列を含む、改変されたPEトランスロケーションドメインであって、該トランスロケーションドメインが、プロテアーゼにより切断可能なプロテアーゼ活性化可能配列を含むシステイン-システインループを含み、そして該システイン-システインループが、フリンによって実質的に活性化可能ではない、改変されたPEトランスロケーションドメイン；（３）５と1500との間のアミノ酸のアミノ酸配列を含むPE Ib様ドメイン；（４）PEのドメインIIIに実質的に相同性のアミノ酸配列を含む細胞傷害性ドメインであって、該細胞傷害性ドメインがADPリボシル化活性を有する、細胞傷害性ドメイン；および（５）小胞体（「ER」）残留配列。１４．（a）前記細胞認識ドメインが、ペプチド結合を介して前記改変されたPE トランスロケーションドメインにカップリングされた抗体であって、該抗体がガン細胞表面マーカーに特異的に結合し；（b）前記改変されたPEトランスロケーションドメインが、アミノ酸279と280との間で前記プロテアーゼによって切断を引き起こすように、前記プロテアーゼ活性化可能配列を導入するアミノ酸置換で改変されたPEドメインII配列（配列番号１のアミノ酸253-364）を有し；そして（c）前記PE Ib様ドメイン、前記細胞傷害性ドメインおよび前記ER残留配列が、ともに天然のPEのドメインIbおよびIIIの配列を有する、請求項１３に記載の薬学的組成物。１５．前記プロテアーゼ活性化可能配列が、前立腺特異的抗原またはウロキナーゼによって切断可能である、請求項１４に記載の薬学的組成物。１６．以下を含有する、プロテアーゼ特異的Pseudomonas体外毒素A様（「PE様」）プロタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチド：（１）細胞表面レセプターに結合する、10と1500との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；（２）タンパク質分解切断において細胞サイトゾルへのトランスロケーションを達成するのに十分にPEのドメインIIに相同性であるアミノ酸配列を含む、改変されたPEトランスロケーションドメインであって、該トランスロケーションドメインが、プロテアーゼにより切断可能なプロテアーゼ活性化可能配列を含むシステイン-システインループを含み、そして該システイン-システインループが、フリンによって実質的に活性化可能ではない、改変されたPEトランスロケーションドメイン；（３）５と1500との間のアミノ酸のアミノ酸配列を含むPE Ib様ドメイン；（４）PEのドメインIIIに実質的に相同性のアミノ酸配列を含む細胞傷害性ドメインであって、該細胞傷害性ドメインがADPリボシル化活性を有する、細胞傷害性ドメイン；および（５）小胞体（「ER」）残留配列。１７．（a）前記細胞認識ドメインが、ペプチド結合を介して前記改変されたPE トランスロケーションドメインにカップリングされた抗体であって、該抗体がガン細胞表面マーカーに特異的に結合し；（b）前記改変されたPEトランスロケーションドメインが、アミノ酸279と280との間でプロテアーゼによって切断を引き起こすように、前記プロテアーゼ活性化可能配列を導入するアミノ酸置換で改変されたPEドメインII配列（配列番号１のアミノ酸253-364）を有し；そして（c）前記PE Ib様ドメイン、前記細胞傷害性ドメインおよび前記ER残留配列が、ともに天然のPEのドメインIbおよびIIIの配列を有する、請求項１５に記載の組換えポリヌクレオチド。１８．前記プロテアーゼ活性化可能配列が、前立腺特異的抗原またはウロキナーゼによって切断可能である、請求項１７に記載の組換えポリヌクレオチド。１９．前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列をさらに含む発現ベクターである、請求項１６に記載の組換えポリヌクレオチド。２０．ガン細胞を死滅させる方法であって、該細胞と、以下を含有するプロテアーゼ特異的Pseudomonas体外毒素A様（「PE様」）プロタンパク質とを接触させる工程を包含する、方法：（１）細胞表面レセプターに結合する、10と1500との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；（２）タンパク質分解切断において細胞サイトゾルへのトランスロケーションを達成するのに十分にPEのドメインIIに相同性であるアミノ酸配列を含む、改変されたPEトランスロケーションドメインであって、該トランスロケーションドメインが、プロテアーゼにより切断可能なプロテアーゼ活性化可能配列を含むシステイン-システインループを含み、そして該システイン-システインループが、フリンによって実質的に活性化可能ではない、改変されたPEトランスロケーションドメイン；（３）５と1500との間のアミノ酸のアミノ酸配列を含むPE Ib様ドメイン；（４）PEのドメインIIIに実質的に相同性のアミノ酸配列を含む細胞傷害性ドメインであって、該細胞傷害性ドメインがADPリボシル化活性を有する、細胞傷害性ドメイン；および（５）小胞体（「ER」）残留配列。２１．前記ガン細胞が前立腺ガン細胞である、請求項２０に記載の方法。２２．前記ガン細胞が大腸ガン細胞である、請求項２０に記載の方法。２３．ガンを患う被験体の処置に使用される、請求項２０に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者パスタン，イラアメリカ合衆国メリーランド 20854, ポトマック，ビールマウンテンロード 11710

Claims

【特許請求の範囲】１．以下を含有する、プロテアーゼ活性化可能Pseudomonas体外毒素A様（「PE様」）プロタンパク質：（１）細胞表面レセプターに結合する、10と1500との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；（２）タンパク質分解切断において細胞サイトゾルへのトランスロケーションを達成するのに十分にPEのドメインIIに相同性であるアミノ酸配列を含む、改変されたPEトランスロケーションドメインであって、該トランスロケーションドメインが、プロテアーゼにより切断可能なプロテアーゼ活性化可能配列を含むシステイン-システインループを含み、そして該システイン-システインループが、フリンによって実質的に活性化可能ではない、改変されたPEトランスロケーションドメイン；（３）必要に応じて、1500アミノ酸までのアミノ酸配列を含むPE Ib様ドメイン；（４）PEのドメインIIIに実質的に相同性のアミノ酸配列を含む細胞傷害性ドメインであって、該細胞傷害性ドメインがADPリボシル化活性を有する、細胞傷害性ドメイン；および（５）小胞体（「ER」）残留配列。２．前記改変されたPEトランスロケーションドメインが、アミノ酸279と280との間で前記プロテアーゼによって切断を引き起こすように、前記プロテアーゼ活性化可能配列を導入するアミノ酸置換で改変された、PEドメインII配列（配列番号１のアミノ酸253-364）を有する、請求項１に記載のPE様プロタンパク質。３．前記プロテアーゼ活性化可能配列が、ガン細胞によって分泌されるプロテアーゼによって切断可能である、請求項１に記載のPE様プロタンパク質。４．前記細胞認識ドメインが、ガン細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体を含有する、請求項１に記載のPE様プロタンパク質。５．前記プロテアーゼ活性化可能配列が、前立腺特異的抗原（「PSA」）によって切断可能である、請求項２に記載のPE様プロタンパク質。６．前記プロテアーゼ活性化可能配列が、ウロキナーゼによって切断可能である、請求項２に記載のPE様プロタンパク質。７．前記プロテアーゼ活性化可能配列が、中性エンドプロテアーゼ、ストロメライシン、コラゲナーゼ、カテプシンＢ、またはカテプシンＤによって切断可能である、請求項２に記載のPE様プロタンパク質。８．前記PE Ib様ドメイン、前記細胞傷害性ドメインおよび前記ER残留配列が、ともに天然のPEのドメインIbおよびIIIの配列を有する、請求項２に記載のPE様プロタンパク質。９．前記細胞認識ドメインが、ペプチド結合を介して前記改変されたトランスロケーションドメインにカップリングされる、請求項３に記載のPE様プロタンパク質。１０．前記プロテアーゼ活性化可能配列が、SKGSFSTQY/TYHV（配列番号11）、HL GGSQQLL/HNKQ（配列番号12）、またはSKGKGTSSQY/SNTE（配列番号13）である、請求項５に記載のPE様プロタンパク質。１１．前記プロテアーゼ活性化可能配列が、DR/VYIHPF（配列番号３）、VVCGER/ GFFYTP（配列番号４）、FFYTPK/A（配列番号５）、KRRPVK/VYP（配列番号６）、 PVGKKR/RPVKVY（配列番号７）、KPVGKK/RRPVKV（配列番号８）、GKPVGK/KRRPVK （配列番号７）、またはTFAGNAVRR/SVGQ（配列番号10）である、請求項６に記載のPE様プロタンパク質。１２．前記細胞認識ドメインが、ペプチド結合を介して前記改変されたトランスロケーションドメインにカップリングされた抗体であり、そして該抗体がガン細胞表面マーカーに特異的に結合する、請求項８に記載のPE様プロタンパク質。１３．以下を含有する、薬学的に受容可能なキャリアおよび治療有効量のプロテアーゼ特異的Pseudomonas体外毒素A様（「PE様」）プロタンパク質を含有する薬学的組成物：（１）細胞表面レセプターに結合する、10と1500との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；（２）タンパク質分解切断において細胞サイトゾルへのトランスロケーションを達成するのに十分にPEのドメインIIに相同性であるアミノ酸配列を含む、改変されたPEトランスロケーションドメインであって、該トランスロケーションドメインが、プロテアーゼにより切断可能なプロテアーゼ活性化可能配列を含むシステイン-システインループを含み、そして該システイン-システインループが、フリンによって実質的に活性化可能ではない、改変されたPEトランスロケーションドメイン；（３）５と1500との間のアミノ酸のアミノ酸配列を含むPE Ib様ドメイン；（４）PEのドメインIIIに実質的に相同性のアミノ酸配列を含む細胞傷害性ドメインであって、該細胞傷害性ドメインがADPリボシル化活性を有する、細胞傷害性ドメイン；および（５）小胞体（「ER」）残留配列。１４．（a）前記細胞認識ドメインが、ペプチド結合を介して前記改変されたPE トランスロケーションドメインにカップリングされた抗体であって、該抗体がガン細胞表面マーカーに特異的に結合し；（b）前記改変されたPEトランスロケーションドメインが、アミノ酸279と280との間で前記プロテアーゼによって切断を引き起こすように、前記プロテアーゼ活性化可能配列を導入するアミノ酸置換で改変されたPEドメインII配列（配列番号１のアミノ酸253-364）を有し；そして（c）前記PE Ib様ドメイン、前記細胞傷害性ドメインおよび前記ER残留配列が、ともに天然のPEのドメインIbおよびIIIの配列を有する、請求項１３に記載の薬学的組成物。１５．前記プロテアーゼ活性化可能配列が、前立腺特異的抗原またはウロキナーゼによって切断可能である、請求項１４に記載の薬学的組成物。１６．以下を含有する、プロテアーゼ特異的Pseudomonas体外毒素A様（「PE様」）プロタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチド：（１）細胞表面レセプターに結合する、10と1500との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；（２）タンパク質分解切断において細胞サイトゾルへのトランスロケーションを達成するのに十分にPEのドメインIIに相同性であるアミノ酸配列を含む、改変されたPEトランスロケーションドメインであって、該トランスロケーションドメインが、プロテアーゼにより切断可能なプロテアーゼ活性化可能配列を含むシステイン-システインループを含み、そして該システイン-システインループが、フリンによって実質的に活性化可能ではない、改変されたPEトランスロケーションドメイン；（３）５と1500との間のアミノ酸のアミノ酸配列を含むPE Ib様ドメイン；（４）PEのドメインIIIに実質的に相同性のアミノ酸配列を含む細胞傷害性ドメインであって、該細胞傷害性ドメインがADPリボシル化活性を有する、細胞傷害性ドメイン；および（５）小胞体（「ER」）残留配列。１７．（a）前記細胞認識ドメインが、ペプチド結合を介して前記改変されたPE トランスロケーションドメインにカップリングされた抗体であって、該抗体がガン細胞表面マーカーに特異的に結合し；（b）前記改変されたPEトランスロケーションドメインが、アミノ酸279と280との間でプロテアーゼによって切断を引き起こすように、前記プロテアーゼ活性化可能配列を導入するアミノ酸置換で改変されたPEドメインII配列（配列番号１のアミノ酸253-364）を有し；そして（c）前記PEIb様ドメイン、前記細胞傷害性ドメインおよび前記ER残留配列が、ともに天然のPEのドメインIbおよびIIIの配列を有する、請求項１５に記載の組換えポリヌクレオチド。１８．前記プロテアーゼ活性化可能配列が、前立腺特異的抗原またはウロキナーゼによって切断可能である、請求項１７に記載の組換えポリヌクレオチド。１９．前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列をさらに含む発現ベクターである、請求項１６に記載の組換えポリヌクレオチド。２０．ガン細胞を死滅させる方法であって、該細胞と、以下を含有するプロテアーゼ特異的Pseudomonas体外毒素A様（「PE様」）プロタンパク質とを接触させる工程を包含する、方法：（１）細胞表面レセプターに結合する、10と1500との間のアミノ酸の細胞認識ドメイン；（２）タンパク質分解切断において細胞サイトゾルへのトランスロケーションを達成するのに十分にPEのドメインIIに相同性であるアミノ酸配列を含む、改変されたPEトランスロケーションドメインであって、該トランスロケーションドメインが、プロテアーゼにより切断可能なプロテアーゼ活性化可能配列を含むシステイン-システインループを含み、そして該システイン-システインループが、フリンによって実質的に活性化可能ではない、改変されたPEトランスロケーションドメイン；（３）５と1500との間のアミノ酸のアミノ酸配列を含むPE Ib様ドメイン；（４）PEのドメインIIIに実質的に相同性のアミノ酸配列を含む細胞傷害性ドメインであって、該細胞傷害性ドメインがADPリボシル化活性を有する、細胞傷害性ドメイン；および（５）小胞体（「ER」）残留配列。２１．前記ガン細胞が前立腺ガン細胞である、請求項２０に記載の方法。２２．前記ガン細胞が大腸ガン細胞である、請求項２０に記載の方法。２３．ガンを患う被験体の処置に使用される、請求項２０に記載の方法。