JP2008530164A - 改良免疫毒素を用いた癌治療法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、癌関連プロテアーゼ部位でフューリン部位が置換されたETA部分を有する、修正毒素を提供する。また、本発明は、癌関連プロテアーゼ部位でフューリン部位が置換されたETA部分に接着した癌細胞と結合するリガンドを有する修正免疫毒素も提供する。さらに、本発明の免疫毒素を用いて哺乳動物の癌細胞を阻害又は破壊する方法及びヒト癌を治療するための薬学的組成物も提供される。

Description

発明の分野
本発明は、癌に対する治療法として有用な修正毒素、及び、該修正毒素を含む免疫毒素に関する。具体的には、シュードモナス属(Pseudomonas)外毒素Aタンパク質中の内部フューリン部位が、腫瘍細胞関連プロテアーゼにより開裂される開裂部位により置換されている。
発明の背景
免疫療法は、癌と闘うための潜在的に効果的なアプローチとして現れた。腫瘍関連抗原(「TAA」)に対する、マウス抗体およびヒト化/キメラ抗体、ならびにそれらの抗体断片は、ある種のヒト癌の診断及び療法に用いられてきた2-10。そのような療法においては、これらの抗体の、非接合形態、毒素接合形態、及び放射線標識形態が用いられてきた。
外毒素A(ETA)は緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の病原性株が放出する毒性タンパク質の一つである16。これは、分子量66,000ダルトンの前酵素として分泌される17。外毒素Aは、感受性の高い哺乳動物細胞へと転位され、ここで、分子の共有結合の変化により酵素的に活性化される。シュードモナス属外毒素Aは、ジフタミドと呼ばれる延長因子-2の翻訳後修飾ヒスチジン残基をアデノシン二リン酸リボシル化することにより、細胞におけるタンパク質合成をいやおうなく阻害し、アポトーシスを誘発する1。細胞死誘発用のドメインを含むが細胞結合ドメインを欠いている欠失型のETAは、免疫毒素の抗体部分によってターゲティングされていない細胞へETA部分が進入するのを妨げる。
一つの具体的なアプローチはVB4-845免疫毒素を用いる標的化療法であった。VB4-845は、シュードモナス属外毒素A(ETA 252-608)(WO 2004/096271(特許文献1))の欠失型に融合される一本鎖Fv組み替え抗体断片からなる免疫毒素である。4D5MOCBと呼ばれる該抗体断片は、Ep-CAMと特異的に結合するMOC31マウスモノクローナル抗体のヒト化及び安定化を通じて得られた13-15
Ep-CAM(Epithelial Cell Adhesion Molecule(上皮細胞接着分子)の略称であり、17-1A、KSA、EGP-2、及びGA733-2としても知られている)は、肺癌、胸癌、卵巣癌、結腸直腸癌、および頭頚部扁平上皮細胞癌を含む多くの固形腫瘍において高発現する経膜タンパク質であるが、多くの正常上皮組織においては弱く発現する。癌形成におけるEp-CAMの役割は未だ明らかではないが、その発現は細胞増殖速度と相関関係がある。Ep-CAM特異抗体は、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌の患者における原発性腫瘍及び転移を可視化および検出するために用いられてきた。抗Ep-CAMモノクローナル抗体の中でも、マウスモノクローナル抗体であるPANOREX(登録商標)(エドレコロマブとしても知られている)は、ドイツにおいて大腸癌の治療用に認可されており、米国においても臨床試験段階に入っている11-12。しかしながら、PANOREX(登録商標)治療が、腹部痙攣、悪心、一過性の下痢、及び皮膚の蕁麻疹病変を含む、望ましくない副作用との関連性を示してきた点には注意を要する21-24。他のEp-CAM標的抗体の臨床試験はほとんど成功していない。たとえば、抗体BIS-1は末梢血管収縮、呼吸困難、及び発熱と関連があり、抗体3622W94は急性壊死性膵炎と関連があった18-20。効果的で毒性の低い抗Ep-CAM抗体の探求は続いており、十分にヒト化された抗Ep-CAM抗体であり、抗体依存性細胞障害性(ADCC)を通じて作用するとされているMT201が報告されている25。マウスモノクローナル抗体MOC31に由来する、ヒト化された安定化抗Ep-CAM一本鎖抗体である4D5MOC-Bもまた開発されており、これは、2000年4月10日に出願され2000年10月19日に公開された国際特許出願第PCT/EP00/03176号、公開番号WO 00/61635(特許文献2)において、またWilldaらにより述べられている26
VB4-845のETA部分においては、低pHを原因として分子がエンドソーム内で展開したら、内部フューリン部位が露出する。したがって、フューリンがフューリン感受性部位において免疫毒素を開裂でき、それにより毒素の効果的な送達が可能になり、最終的に細胞死に至る。フューリンは様々な癌において過剰発現するが、広範な正常組織においても十分に発現する。したがってこれは、一部の正常組織に対する毒性を引き起こすような追加的な腫瘍特異性を、免疫毒素に提供するわけではない。非腫瘍特異的フューリン感受性部位を、癌標的化免疫毒素の腫瘍特異性を増加させるものと置換することは有利でありうる。
マトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)は、その触媒部位が外部表面に露出した、原形質膜に固定されている経膜プロテアーゼである。MMPは21を超えるタンパク質分解性のメンバーからなるファミリーを構成しており、広スペクトルの細胞外タンパク質及び非マトリクスタンパク質の分解に関与している。これらのプロテアーゼは広く発現しており、多くの正常及び病的な過程において中心的役割を果たしているが、正常細胞においてはその発現は厳重に調節されており、フューリンよりも制限されている。その異常調節すなわち過剰発現は、炎症、自己免疫疾患、心臓血管疾患及び癌のような疾病状態と関連がある。発現量の上昇は、高度に分化した、侵襲性のより高い腫瘍細胞株と関連していた。加えて、ある種のMMPは、侵襲性および転移性が非常に高い腫瘍においてより強度の細胞質発現を示し、MMP-2の局在化及び細胞内分布の変化は、良性前立腺上皮から高度前立腺上皮内腫瘍への移行と関連している(Upadhyay J, Shekarriz B, Nemeth JA, Dong Z, Cummings GD, Fridman R, Sakr W, Grignon DJ, Cher ML. Membrane type 1-matrix metalloproteinase (MT1-MMP) and MMP-2 immunolocalization in human prostate: change in cellular localization associated with high-grade prostatic intraepithelial neoplasia. Clin Cancer Res.1999 Dec;5(12):4105-10(非特許文献1))。さらには、悪性前立腺上皮によるMMP-2の発現の増加は、前立腺癌の無再発生存の減少の一つの独立予測因子である(Trudel D, Fradet Y, Meyer F, Harel F, Tetu B. Significance of MMP-2 expression in prostate cancer: an immunohistochemical study. Cancer Res. 2003 Dec 1 ;63(23):8511-5(非特許文献2))。
WO 2004/096271 WO 00/61635 Upadhyay J, Shekarriz B, Nemeth JA, Dong Z, Cummings GD, Fridman R, Sakr W, Grignon DJ, Cher ML. Membrane type 1-matrix metalloproteinase (MT1-MMP) and MMP-2 immunolocalization in human prostate: change in cellular localization associated with high-grade prostatic intraepithelial neoplasia. Clin Cancer Res.1999 Dec;5(12):4105-10 Trudel D, Fradet Y, Meyer F, Harel F, Tetu B. Significance of MMP-2 expression in prostate cancer: an immunohistochemical study. Cancer Res. 2003 Dec 1 ;63(23):8511-5
発明の概要
本発明は、癌関連プロテアーゼ部位でフューリン部位が置換されたETA部分を含む、修正毒素に関する。また、本発明は癌特異的リガンドに接着した修正毒素を有する免疫毒素にも関する。ある局面において、癌特異的リガンドは癌細胞の表面においてEp-CAMと結合する。
本発明の免疫毒素は、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頚部癌、膀胱癌、消化器癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肉腫、神経膠腫、T細胞リンパ腫及びB細胞リンパ腫のような、種々の形態の癌の治療に用いられてよい。
したがって、一つの態様において、本発明は、腫瘍細胞と関連しているプロテアーゼにより認識される部位でフューリン部位が置換されたETA部分を含む、修正毒素を提供する。別の態様において、 本発明は、(a)修正毒素に接着した癌細胞と結合するリガンド;(b)癌関連プロテアーゼ部位でフューリン部位が置換されたETA部分を含む該修正毒素、を含む免疫毒素を提供する。さらなる態様において、リガンドは、正常細胞に比して癌細胞の表面で過剰発現した分子を認識する。一つの態様においては、リガンド又は免疫毒素は癌細胞によって内在化される。さらなる態様においては、リガンドは癌細胞の表面を認識する抗体又は抗体断片である。具体的な態様においては、抗体はEp-CAMを認識する。最も具体的な態様においては、本発明は、癌関連プロテアーゼ部位で置換されたETA部分のフューリン部位RQPRを有する、変異VB4-845免疫毒素を含む免疫毒素を提供する。
本発明のある態様において、癌関連プロテアーゼ部位はMMP-2及びMMP-9(それぞれゼラチナーゼA及びB)を認識する。そしてさらに別の態様において、癌関連プロテアーゼ部位は、MMP-2及びMMP-9により特異的に認識される配列GPLGMLSQを含む。別の態様においては、癌関連プロテアーゼは、MMPファミリーの他のメンバーによっても認識される配列GPLGLWAQを含む。さらなる態様においては、癌関連プロテアーゼ部位の開裂はゼラチナーゼA及び/又はゼラチナーゼBの阻害剤によって阻害される。
別の局面において本発明は、癌関連プロテアーゼと関連している癌細胞を阻害又は破壊する方法であって、癌関連プロテアーゼに対する開裂部位でフューリン部位が置換された本発明の免疫毒素を調製する工程、及び該細胞へ該免疫毒素を投与する工程を含む方法を提供する。ある態様において、癌は、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頚部癌、膀胱癌、消化器癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肉腫、神経膠腫、T細胞リンパ腫及びB細胞リンパ腫からなる群より選択される。
本発明はまた、癌に冒された細胞が癌関連プロテアーゼと関連しているような、癌に罹患した哺乳動物を、本発明の一つまたは複数の免疫毒素の有効量を該哺乳動物に投与することにより治療する方法にも関する。
本発明はまた、癌罹患哺乳動物を治療するための、本発明の一つまたは複数の免疫毒素の有効量の使用も包含する。本発明の追加的態様は、癌罹患哺乳動物を治療するための薬物製造のための、本発明の一つまたは複数の免疫毒素の有効量の使用である。一つの態様において、癌細胞は癌関連プロテアーゼと関連している。
さらにまた、以下の工程を含む、癌に冒された細胞が癌関連プロテアーゼと関連しているような癌に罹患した哺乳動物を治療するための薬剤を調製するプロセスが提供される:プロテアーゼに対する開裂認識部位を同定する工程;癌関連プロテアーゼ部位で置換されたフューリン部位RQPRを有するEp-CAM標的ETA免疫毒素を調製する工程;及び、薬学的に許容される担体、希釈薬又は賦形剤中に該タンパク質を懸濁する工程。
さらなる局面において本発明は、本発明の免疫毒素及び薬学的に許容される担体、希釈薬又は賦形剤を含む、癌に冒された細胞が癌関連プロテアーゼと関連しているような癌に罹患した哺乳動物を治療するための薬学的組成物を提供する。
本発明の他の特徴及び利点は下記の詳細な説明において明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨及び範囲内の種々の変更や修正はこの詳細な説明から当業者に明らかになるであろうから、詳細な説明及び具体的実施例は、本発明の好ましい態様を示す一方で、例示のみを目的として与えられることを理解するべきである。
発明の詳細な説明
本発明者は、免疫毒素VB4-845における(ゼラチナーゼ;MMP-2/MMP-9)プロテアーゼ感受性部位によるフューリン部位の置換によって、免疫毒素の細胞毒性効果の組織特異性が増加し、したがって、野生型VB4-845免疫毒素と比較して正常組織に対する毒性の大半が減少することを見出した。
本発明の修正毒素
本発明は、癌関連プロテアーゼ部位でフューリン部位が置換されたETA部分を含む、修正毒素を提供する。
本明細書で用いられている「ETA部分」という用語は緑膿菌由来の外毒素Aを意味する。この用語は、全長ETA、および、癌関連プロテアーゼ部位と置換可能なフューリン部位を包含するその断片又は変種を包含する。
一つの態様においてフューリン部位は配列RQPRを含む。別の態様において、癌関連プロテアーゼ部位はMMP-2、MMP-9又はそれらの組み合わせによって認識される。さらに別の態様においては、癌関連プロテアーゼ部位はGPLGMLSQ及びGPLGLWAQからなる群より選択される配列を含んでいる。別の態様においては、癌関連プロテアーゼ部位は置換されたフューリン部位RQPRよりも多くのアミノ酸を含んでいる。
本発明の免疫毒素
前述の通り、本発明は(a)修正毒素に接着した癌細胞と結合するリガンド;(b)癌関連プロテアーゼ部位でフューリン部位が置換されたETA部分を含む該修正毒素を含む、免疫毒素を提供する。一つの態様において、免疫毒素は癌細胞により内在化される。
免疫毒素において用いられる場合、「ETA部分」とは、全長ETA又は、癌細胞に対して毒性を有するのに十分なETAの一部を含む、その断片若しくは変種であろう。本発明に従った免疫毒素の設計には種々のETA毒素を用いてよい。好ましい態様においては、ETA毒素は、少なくともシュードモナス属外毒素A(「ETA」)の毒性部分、又は癌関連プロテアーゼ部位によってフューリン部位が置換されたその変種を含む。特定の態様において、細胞毒性部分は、単独で投与された場合には実質的に細胞と結合できない、ETA変種を含む。細胞毒性部分は当技術分野において公知のシュードモナス属外毒素(たとえば、Kreitman, 1995,“Targeting pseudomonas exotoxin to hematologic malignancies,”Seminars in Cancer Biology 6:297-306;Pastan, 2003,“Immunotoxins containing pseudomonas exotoxin A: a short history,”Cancer Immunol. Immunother. 52:338-341参照)の一つもしくは複数、又は、フューリン部位が癌関連プロテアーゼ部位と置換されているその変種を含んでよい。
シュードモナス属外毒素の変種の幾つか、ならびに、シュードモナス属外毒素変種を含む構築物の作製法および使用法は、当技術分野において公知である。(たとえば、米国特許出願US2003054012号;米国特許第6531133号;米国特許第6426075号;米国特許第6423513号;米国特許第6074644号;米国特許第5980895号;米国特許第5912322号;米国特許第5854044号;米国特許第5821238号;米国特許第5705163号;米国特許第5705156号;米国特許第5621078号;米国特許第5602095号;米国特許第5512658号;米国特許第5458878号;米国特許第5082927号;米国特許第4933288号;米国特許第4892827号;米国特許第4677070号;米国特許第4545985号;国際公開WO98/20135;WO93/25690;WO91/18100;WO91/18099;WO91/09949;及びWO88/02401号;Kondo et al., 19888, “Activity of immunotoxins constructed with modified pseudomonas exotoxin a lacking the cell recognition domain.” J Biol Chem. 263:9470-9475; Batra et al., 1989, “Antitumor activity in mice of an immunotoxin made with anti-transferring receptor and a recombinant form of pseudomonas exotoxin.” Proc Natl. Acad. Sci. USA 86:8545-8549; Puri et al., 1991, “Expression of high-affinity interleukin 4 receptors on murine sarcoma cells and receptor-mediated cytotoxicity of tumor cells to chimeric protein between interleukin 4 and Pseudomonas exotoxin.” Cancer Res 51:3011-3017; Siegall et al., 1992, “Cytotoxicity of chimeric (human murine) monoclonal antibody BR96 IgG, F(ab')2, and Fab' conjugated to Pseudomonas exotoxin.” Bioconjug-Chem 3:302-307; Hall et al., 1994, “In vivo efficacy of intrathecal transferrin-Pseudomonas exotoxin A immunotoxin against LOX melanoma.” Neurosurgery 34:649-655; Kuan and Pai, 1995, “Immunotoxins containing pseudomonas exotoxin that target Le y damage human endothelial cells in an antibody-specific mode: relevance to vascular leak syndrome.” Clin Cancer Res 1:1589-1594; Kreitman, 1995, “Targeting pseudomonas exotoxin to hematologic malignancies.” Sem Cancer Biol 6:297-306; Kawooya et al., “The expression, affinity purification and characterization of recombinant pseudomonas exotoxin 40 (PE40) secreted from Escherichia coli.” J Biotechnol 42:9-22; Kaun and Pai, 1995, “Immunotoxins containing pseudomonas exotoxin that target LeY damage human endothelial cells in an antibody-specific mode: Relevance to vascular leak syndrome.” Clin Cancer Res 1:1589-1594; Puri et al., 1996, “Preclinical development of a recombinant toxin containing circularly permuted interleukin 4 and truncated Pseudomonas exotoxin for therapy of malignant astrocytoma.” Cancer Res 56:5631-5637; Pai et al., 1996, “Treatment of advanced solid tumors with immunotoxin LMB-1: An antibody linked to Pseudomonas exotoxin.” Nature Med. 3:350-353; Pai et al., 1998, “Clinical Trials with pseudomonas exotoxin immunotoxins.” Curr Top. Microbiol. Immunol. 234: 83-96; Klimka et al., 1999, “An anti-CD30 single chain Fv selected by phage display and fused to pseudomonas exotoxin A (Ki-4(scFv)-ETA') is a potent immunotoxin against a Hodgkin-derived cell line.” British J Cancer 80:1214-1222; Rand et al., 2000, “Intratumoral administration of recombinant circularly permuted interleukin-4-Pseudomonas exotoxin in patients with high-grade glioma.” Clin Cancer Res 6:2157-2165; Leland et al., 2000, “Human breast carcinoma cells express type II IL-4 receptors and are sensitive to antitumor activity of chimeric IL-4-pseudomonas exotoxin fusion protein in vitro and in vivo.” Molecular Medicine Today 6:165-178;Tur et al., 2001, “An anti-GD2 single chain Fv selected by phage display and fused to Pseudomonas exotoxin A develops specific cytotoxic activity against neuroblastoma derived cell lines.” Int J Mol.Med 8:579-584; Onda et al., 2001, “Cytotoxicity of antiosteosarcoma recombinant immunotoxins composed of TP-3 Fv fragments and a truncated pseudomonas exotoxin A.” J Immunother 24:144-150; 18.”Synergistic interaction between an anti-p185her-2 pseudomonas exotoxin fusion protein [scfv(frp5)-eta] and ionizing radiation for inhibiting growth of ovarian cancer cells that overexpress HER-2.” Schmidt et al., 2001, “Synergistic interaction between an anti-p185HER-2 pseudomonas exotoxin fusion protein [scFv(FRP5)-ETA] and ionizing radiation for inhibiting growth of ovarian cancer cells that overexpress HER-2.”Gynecol Oncol 80:145-155; Pastan, 2003, “Immunotoxins containing pseudomonas exotoxin A: a short history.” Cancer Immunol Immunother 52:338-341; Li et al., 1996, “Crystal structure of the catalytic domain of Pseudomonas exotoxin A complexed with a nicotinamide adenine dinucleotide analog: implications for the activation process and for ADP ribosylation.” Proc Natl Acad Sci USA. 9:6902-6906; Kreitman and Pastan, 2003, “Immunobiological treatments of hairy-cell leukaemia.” Best Pract Res Clin Haematol. 16:117-33参照)
リガンドは癌細胞に結合できる任意の分子でよく、タンパク質も含まれるが、それに限定されるものではない。一つの態様においては、リガンドは癌細胞の表面を認識する抗体又は抗体断片である。好ましい態様においては、リガンドは癌細胞により内在化される。具体的な態様においては、抗体はEp-CAMを認識する。最も具体的な態様においては、本発明は、癌関連プロテアーゼ部位でETA部分のフューリン部位が置換された変異VB4-845免疫毒素を含む免疫毒素を提供する。本明細書で用いられる「VB4-845」という用語は、a)scFvヒト化抗体4D5MOC-Bであって、b)252-608位のアミノ酸ならびにHISタグ及びKDEL配列からなる切断型ETAに融合しているものを含む免疫毒素を意味する。
一つの態様において、フューリン部位は配列RQPRを含んでいる。別の態様においては、癌関連プロテアーゼ部位はMMP-2、MMP-9又はそれらの組み合わせによって認識される。さらに別の態様においては、癌関連プロテアーゼ部位は、GPLGMLSQ及びGPLGLWAQからなる群より選択される配列を含む。別の態様においては、癌関連プロテアーゼ部位は置換されたフューリン部位RQPRよりも多くのアミノ酸を含んでいる。標的プロテアーゼによってプロテアーゼ部位が開裂されるまで非毒性である点が、本発明の免疫毒素の利点である。
本発明の免疫毒素は、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頚部癌、膀胱癌、消化器癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肉腫、神経膠腫、T細胞リンパ腫及びB細胞リンパ腫のような種々の形態の癌を治療するのに用いられうる。
したがって、ある態様において、本発明は、(a)修正毒素に接着した癌細胞においてEp-CAMと結合する抗体又は抗体断片;(b)癌関連プロテアーゼでフューリン部位が置換されたETA部分を含む該修正毒素を含む、Ep-CAM標的ETA免疫毒素を提供する。具体的な態様においては、免疫毒素は、(a)ヒトEp-CAMの細胞外ドメインと結合し、かつ、修正毒素に接着したMOC-31抗体に由来する相補性決定領域(CDR)配列を含む、ヒト化抗体又は抗体断片;(b)癌関連プロテアーゼ部位でフューリン部位が置換されたETA部分を含む該修正毒素を含む。
本発明による適切なEp-CAM標的ETA免疫毒素には、VB4-845及びその変種、Ep-CAMと選択的に結合するその他の一本鎖又は二本鎖の免疫グロブリン又はその変種を含むその他の免疫毒素が包含されるが、それらに限定されるわけではない。
このように、本免疫毒素は、癌細胞を特異的に標的化するために用いられうる。癌関連プロテアーゼが細胞内で免疫毒素を開裂し、それによって毒素の効果的な送達を可能にし、最終的に細胞死をもたらす点はさらなる利点である。結果として、該癌細胞は特異的に標的化され、癌関連プロテアーゼを包含しない正常細胞は活性化ETAに直接曝露されないことになる。
一つの態様において、Ep-CAM結合部分は完全な免疫グロブリン分子を含む。他の態様においては、Ep-CAM結合部分は、Fab、Fab'、scFv、単一ドメイン抗体断片、又はジスルフィド安定化Fv断片の二量体である。別の態様においては、Ep-CAM結合部分は可変重鎖、可変軽鎖、Fab、Fab'、scFv、単一ドメイン抗体断片、又はジスルフィド安定化Fv断片を含む。Ep-CAM結合分子の一部は一つまたは複数の種に由来してもよく、好ましくはヒトに由来する部分を含み、最も好ましくは完全にヒト由来又はヒト化されている。精製を促進するため又は毒素との接合のために設計された領域は、Ep-CAM結合部分に包含されるか又は付加されてもよい。
具体的で非限定的な態様において、免疫毒素はVB4-845を含む。他の非限定的な態様においては、免疫毒素はVB4-845の変種を含む。VB4-845変種は、VB4-845が結合するのと同一のEp-CAMエピトープ又は実質的に類似のEp-CAMエピトープと結合し、該変種は生理的条件下で少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%の割合で、VB4-845とEp-CAMとの結合を競合的に阻害しうる。VB4-845変種はVB4-845と同一のシュードモナス属外毒素A断片を含んでもよく、同一の毒素の異なる部分、若しくは異なる毒素を含んでもよい。
別の非限定的態様において、免疫毒素は、MOC31の可変領域又はその変種を含んでいるEp-CAM結合部分を含む。さらに別の態様においては、免疫毒素は、4D5MOCB又はその変種を含むEp-CAM結合部分を含む。これらの免疫毒素の任意のものとEp-CAMとの結合は、生理的条件下で、参照MOC31又は4D5MOCB抗体との競合によって、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%減少しうる。生存細胞における間接的な流量サイトメトリーを用いると、VB4-845の親和性はKD=1.6×10-8である。Lineweaver-Burke分析(data Notebook:0935, page50)は、Benedictら(1997)J. Immunol. Methods, 201:223-231の手法を用いて行った。Willudaらにより記載された(Cancer Research 59, 5758-5767, 1999)、MOC31Bの親和性は、実験方式で述べられていたRIA及びBiacoreを用いて計測すると、KD=3.9×10-9である。したがって、本発明は2.0×10-8未満の解離定数(KD)を有する免疫毒素を包含する。
あるいは、本免疫毒素は、前段落において論じられたもの以外の、Ep-CAMと選択的に結合するEp-CAM結合部分を含む。好ましい態様においては、該Ep-CAM結合部分の結合親和性は、標準的な試験室技術により計測されたVB4-845、PANOREX(登録商標)又はMT-201の結合親和性の、少なくとも4桁、好ましくは少なくとも3桁、より好ましくは2桁未満である。非限定的な態様において、該Ep-CAM結合部分は、これらに限定されないが、PANOREX(登録商標)又はMT-201などの公知の抗Ep-CAM抗体とEp-CAMとの結合を、生理的条件下で少なくとも0.1%、1%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%競合的に遮断しうる。
CDR又はホット・スポットのような抗体の結合領域の同定ができることを、当業者であれば理解するであろう。アラニンなどによる結合領域におけるアミノ酸の個々の置換、またはその他の変異により、エピトープへの抗体の親和性を少なくとも1/10、好ましくは少なくとも1/100、より好ましくは少なくとも1/1000に減少させることができる。この親和性の喪失は、抗体がエピトープと結合する能力における残基の重要性を強調するものである。たとえば、Tamura et al., 2000,“Structural correlates of an anticarcinoma antibody: identification of specificity-determining residues (SDRs) and development of a minimally immunogenic antibody variant by retention of SDRs only,”J. lmmunol. 164(3):1432-1441参照。
結合活性に対する、特に結合親和性に対する単一又は複数の変異の効果は、特定の一連のアミノ酸の結合相互作用における重要性(たとえば、軽鎖又は重鎖CDR2の結合への寄与)を査定すべく同時発生的に評価されうる。アミノ酸変異の効果はまた、個別に査定された場合の単一のアミノ酸の寄与を査定すべく連続的にも評価されうる。そのような評価はたとえば、インビトロ飽和スキャニング(たとえば、米国特許第6,180,341号;Hilton et al., 1996,“Saturation mutagenesis of the WSXWS motif of the erythropoietin receptor,”J Biol Chem.271:4699-4708参照)及び位置指定変異誘発(たとえば、Cunningham and Wells, 1989,“High-resolution epitope mapping of hGH-receptor interactions by alanine-scanning mutagenesis,”Science 244:1081-1085; Bass et al.,1991,“A systematic mutational analysis of hormone-binding determinants in the human growth hormone receptor,”Proc Natl Acad Sci. USA 88:4498-4502参照)により行うことができる。アラニンスキャニング変異誘発技術では、単一のアラニン変異体を分子内の複合残基へ導入し、分子の活性に不可欠であるアミノ酸残基を同定するために結果的に生じる変異体分子を生物学活性について試験する。
リガンド受容体の部位又は他の生物学的相互作用部位は、推定的接触部位のアミノ酸の変異と組み合わせて、たとえば核磁気共鳴、結晶解析法、電子線回折、又は光親和性標識によって決定されるような構造の物理的分析法によっても同定できる(たとえば、de Vos et a1.,1992,“Human growth hormone and extrace1lular domain of its receptor: crystal structure of the complex,”Science 255:306-312; Smith et al.,1992,“Human interleukin 4. The solution structure of a four-helix bundle protein,”J Mol Biol. 224:899-904; Wlodaver et al.,1992,“Crystal structure of human recombinantinterleukin-4 at 2.25 A resolution,”FEBS Lett. 309:59-64参照)。さらに、特定の個々のアミノ酸又は一連のアミノ酸の重要性は、関連ポリペプチド又は類似の結合部位のアミノ酸配列との比較によって評価されるであろう。
さらには、結合活性の強化により、結合親和性の低さを埋め合わせできることを、当業者であれば理解するであろう。Ep-CAMに対する免疫毒素の結合活性は、複数の結合部位を有するEp-CAMとのEp-CAM結合部分の結合力の尺度となる。Ep-CAMとEp-CAM結合部分との機能的結合力は全ての親和的結合力の総計を示しており、したがって、個々の構成要素は比較的低い親和性で結合しうるが、そのような構成要素の多量体は強い生物学的作用を示す可能性がある。実際に、Ep-CAM結合部位とEp-CAMエピトープの間の多重相互作用は、付加的な生物学的作用をはるかに超えた作用を示すと考えられる。すなわち、多価性の利点は平衡定数の点で桁違いでありうる。
一つの非限定的態様においては、Ep-CAM結合部位は4D5MOCBのそれと実質的に類似の構造を有する。該実質的類似構造は、免疫毒素のEp-CAM結合部分とEp-CAM分子との結合点を反映するエピトープマップを参照することによって特色づけることができる。
本発明の免疫毒素は、固相合成法(Merrifield, J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154(1964))又は均一溶液中での合成(Houbenweyl,Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, vol. 15 I and II, Thieme, Stuttgart(1987))のようなタンパク質化学において周知の技術を用いた化学合成により調製されうる。一つの態様においては、癌結合リガンド及びETA毒素は双方ともタンパク質であり、当技術分野において周知である技術を用いて接合させることができる。二つのタンパク質を接合させることができる利用可能な架橋剤(crosslinker)は数百にも上る。(たとえば“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”. 1991,Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor参照)。架橋剤は、一般に、リガンド若しくは毒素において利用可能な若しくは挿入された反応性官能基に基づいて選択される。加えて言うと、もし反応基がなければ、光活性化可能な架橋剤を用いることができる。ある場合には、リガンドと毒素の間にスペーサーを包含するのが望ましいであろう。当技術分野において公知である橋かけ剤(crosslinking agent)は、ホモ二官能基剤であるグルタルアルデヒド、ジメチルアジポイミデート(dimethyladipimidate)、およびビス(ジアゾベンジジン)、ならびにヘテロ二官能基剤であるmマレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドおよびスルホ-mマレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドを包含する。
リガンド-ETA毒素融合タンパク質は組み替えDNA技術を用いて調製されてもよい。そのような場合においては、癌結合リガンドをコードしているDNA配列は、変異ETA毒素をコードしているDNA配列と融合され、これによりキメラDNA分子が生じる。キメラDNA配列はリガンド-毒素融合タンパク質を発現する宿主細胞にトランスフェクトされる。融合タンパク質は細胞培養物により回収でき、当技術分野における公知技術を用いて精製される。
Ep-CAMのような腫瘍抗原に対して特異性を有する抗体は従来の方法で調製されうる。哺乳動物(たとえば、マウス、ハムスター、又はウサギ)を、哺乳動物における抗体反応を引き出すペプチドの免疫原性形状によって免疫化することができる。ペプチドに免疫原性を与える技術は、担体との接合、又は、当技術分野において周知である他の技術を包含する。たとえば、ペプチドはアジュバントの存在下で投与されうる。免疫化の経過は血漿や血清における抗体価の検出によりモニタリングすることができる。標準的なELISA又は他の免疫学的検定の手順は、抗体量を検査するための抗原としての免疫原と共に用いることができる。免疫化に引き続いては、抗血清を得ることができ、望ましいならば、ポリクロナール抗体を該血清から単離することができる。
モノクローナル抗体を産生するには、免疫化した動物から抗体産生細胞(リンパ球)を採取し、標準的な体細胞の融合手法によって骨髄腫細胞と融合させることができ、それによりこれらの細胞を不死化してハイブリドーマを得る。そのような技術は、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., Immunol. Today 4:72(1983))、ヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV-ハイブリドーマ技術(Cole et al., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy Allen R., Bliss, Inc., 77-96(1985))、および組み合わせ抗体ライブラリーのスクリーニング(Huse et al., Science 246:1275(1989))のような他の技術と同様に、当技術分野において周知である(たとえばKohler and Milsteinにより初めに開発されたハイブリドーマ技術 (Nature 256:495-497 (1975))。ハイブリドーマ細胞を、ペプチドに特異的に反応する抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングでき、また、モノクローナル抗体を分離することができる。
本明細書において用いられている「抗体」という用語は、細胞表面構成成分にも特異的に反応するその断片も包含することを意図している。抗体は、従来技術を用いて断片化することができ、該断片は、上述と同じ様式で有用性についてスクリーニングすることができる。たとえば、F(ab')2断片は抗体をペプシンで処理することで産生することができる。得られたF(ab')2断片を処理して、Fab'断片を産生するためにジスルフィド架橋を減少させることができる。
キメラ抗体誘導体、つまり、非ヒト動物可変領域とヒト定常領域を組み合わせた抗体分子は、本発明の範囲内であると考えることができる。キメラ抗体分子には、たとえば、ヒト定常領域と結合している、マウス、ラット、又は他の種の抗体からの抗原結合ドメインが包含されうる。細胞表面抗原を認識する免疫グロブリン可変領域を包含するキメラ抗体を作製するため、従来の方法を用いてもよい(たとえば、Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 81:6851(1985); Takeda et al., Nature 314:452(1985), Cabilly et al., 米国特許第4,816,567号; Boss et al., 米国特許第4,816,397号; Tanaguchi et a1.,欧州特許第171,496号;欧州特許第173,494号,英国特許第GB 2177096B号参照)。ヒト被験体におけるキメラ抗体の免疫原性が、対応する非キメラ抗体よりも低いことが期待される。キメラ抗体はPluckthun et al., WO 00/61634で述べられた方法により安定化させることができる。
細胞表面構成成分に特異的に反応するモノクローナル抗体又はキメラ抗体は、可変領域の一部、特に抗原結合ドメインの保存フレームワーク領域がヒト由来であり、かつ超可変領域のみが非ヒト由来である、ヒト定常領域キメラを産生することで、更にヒト化することができる。そのような免疫グロブリン分子は当技術分野において公知である技術によって作製されてもよい(たとえば、Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:7308-7312(1983); Kozbor et al., Immunology Today 4:7279(1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92:3-16(1982),及び PCT公報 WO92/06193又はEP239,400)。ヒト化抗体は市販されてもいる(Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britain)。
細胞表面構成成分に反応性を有する特定の抗体又は抗体断片は、バクテリアにおいて細胞表面構成成分と共に発現する免疫グロブリン遺伝子又はその一部をコードしている発現ライブラリーをスクリーニングすることで、産生してもよい。たとえば、ファージ発現ライブラリーを用いて、完全なFab断片、VH領域及びFV領域をバクテリアにおいて発現させることができる(たとえば、Ward et al., Nature 341:544-546(1989); Huse et al., Science 246:1275-1281(1989);及び McCafferty et al., Nature 348:552-554(1990)参照)。あるいは、抗体又はその断片を産生するため、たとえばGenpharmによって開発されたモデルであるSCID-hu マウスを用いることができる。
一つの態様においては、抗体は癌細胞により内在化される。
本発明の免疫毒素の有用性
本発明のタンパク質は、プロテアーゼのように癌罹患細胞と関連する、癌罹患哺乳動物細胞を特異的に阻害又は破壊するために用いられてよい。細胞結合構成要素により得られたものに加えて該細胞に対する特異性を有していることが本発明の免疫毒素の利点である。低pHのために、分子がエンドソームの内部で展開したら、ETA部分の癌関連プロテアーゼ部位が露出し、したがって、癌関連プロテアーゼの存在下で、ETA毒素が放出されて毒素の効果的な送達が可能になり、最終的に細胞死がもたらされる。
それゆえ、ある態様においては、本発明は、以下の工程を含む、癌関連プロテアーゼと関連する細胞である癌細胞を阻害し又は破壊する方法を提供する:癌関連プロテアーゼのための開裂部位でフューリン部位が置換された本発明の免疫毒素を調製する工程;及び細胞に免疫毒素を投与する工程。ある態様においては、該癌は結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頚部癌、膀胱癌、消化器癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肉腫、神経膠腫、T細胞リンパ腫及びB細胞リンパ腫である。
本発明の免疫毒素の特異性は、開裂認識部位に特異的と考えられる癌関連プロテアーゼで免疫毒素を処理し、開裂生成物を分析することによって試験されうる。癌関連プロテアーゼは癌細胞から分離されてもよいし、たとえばDarketらの手順(J. Biol. Chem. 254:2307-2312(1988))に従って組み換え的に調製されてもよい。開裂生成物は、たとえばサイズ、抗原性、または活性に基づいて同定されうる。免疫毒素の毒性は、たとえばBrome Mosaic Virus mRNAを鋳型として用い、開裂生成物を細胞溶解液におけるインビトロ翻訳分析に供することで調査されうる。開裂生成物の毒性は、リボソーム不活性化分析(Westbyら Bioconjugate Chem. 3:377-382(1992))を用いて決定されうる。タンパク質合成に対する開裂生成物の効果は、たとえばリボソームの供給源としての網赤血球溶解物製剤、ならびに、mRNA鋳型およびアミノ酸のような種々の必須の補因子からなる部分的に定義された無細胞系を用いた、標準化インビトロ翻訳分析によって測定されうる。混合物中で放射線標識アミノ酸を使用することにより、遊離アミノ酸前駆体のトリクロル酢酸沈殿タンパク質中への混和を定量することができる。ウサギ網赤血球溶解物を用いるのが好都合であろう(O'Hare, FEBS Lett. 273:200-204(1990))。
本発明の免疫毒素が動物癌細胞を選択的に阻害又は破壊する能力は、動物癌細胞株を用いてインビトロで容易に検証できるであろう。本発明の免疫毒素の選択的阻害効果は、たとえば、癌細胞における細胞増殖の選択的阻害を示すことによって、測定されうる。さらに、プロテアーゼの特異性は、本発明の免疫毒素を単独で又はプロテアーゼ特異的阻害剤の存在下で使用して、細胞増殖の阻害を比較することにより、検証することができる。このようなプロテアーゼ阻害剤は、MMP-2/MMP-9阻害剤であるGM1489、GM6001、及びGI-I〜GI-IVを包含しうる。
毒性は細胞生存度に基づいても計測されうる。たとえば、免疫毒素に曝露された正常細胞培養物及び癌細胞培養物の生存度を比較できる。細胞生存度はトリパンブルー除外分析のような公知技術によって査定されうる。
別の例では、幾つものモデルが、癌関連マトリクスメタロプロテアーゼの開裂認識部位を含む癌関連プロテアーゼ配列を有する免疫毒素の細胞毒性を検証するために用いられ得る。Thompson, E.W.ら(Breast Cancer Res. Treatment 31:357-370(1994))は、細胞外マトリクスの腫瘍細胞媒介性タンパク質分解及び再構成基底膜(コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル、またはゼラチン)の腫瘍細胞侵襲を計測することで、インビトロでのヒト乳癌細胞の侵襲性決定モデルを説明した。他の応用可能な癌細胞モデルは、乳線癌培養細胞(Young, T.Nら Gynecol. Oncol. 62:89-99(1996);Moore, D.H.ら Gynecol. Oncol. 65:78-82(1997))、ヒト甲状腺濾胞癌細胞(Demeure, M.J.ら, World J. Surg. 16:770-776(1992))、ヒトメラノーマ(A-2058)及び繊維肉腫(HT-1080)細胞株(Mackay, A.R.ら Lab. Invest. 70:781-783(1994))、ならびに肺扁平上皮(HS-24)および線癌(SB-3)細胞株(Spiess, E.ら J. Histochem. Cytochem. 42:917-929(1994))を包含する。腫瘍移植及び無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍の成長と転移の計測に関わるインビボ検査システムもまた記載されている(Thompson, E.ら, Breast Cancer Res. Treatment 31:357-370(1994); Shi, Y.E.ら, Cancer Res. 53:1409-1415(1993))。
本発明はまた、癌に冒された細胞が癌関連プロテアーゼと関連しているような癌に罹患した哺乳動物を、本発明の免疫毒素の一つまたは複数の有効量を該哺乳動物に投与することにより治療する方法にも関する。本明細書で用いられている「癌罹患哺乳動物の治療」という用語は、哺乳動物における、癌細胞複製の阻害、癌の拡散(転移)の阻害、腫瘍成長の阻害、癌細胞数もしくは腫瘍成長の減少、癌の悪性度(たとえば、分化の増大)の低減、又は、癌関連症状の改善を指す。
本発明はまた、癌罹患哺乳動物を治療するために、本発明の一つまたは複数の免疫毒素の有効量の使用も包含する。本発明の追加的態様は、癌罹患哺乳動物治療用の薬剤を製造するための、本発明の一つまたは複数の免疫毒素の有効量の使用である。一つの態様においては、癌細胞は癌関連プロテアーゼと関連している。
別の態様においては、以下の工程を含む、癌に冒された細胞が癌関連プロテアーゼと関連しているような癌罹患哺乳動物を治療するための薬剤を調製するためのプロセスが提供される:プロテアーゼ開裂認識部位を同定する工程;癌関連プロテアーゼでフューリン部位が置換された本発明の免疫毒素を調製する工程;および薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤中に該タンパク質を懸濁する工程。
本発明はまた、本発明の免疫毒素及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、癌に冒された細胞が癌関連プロテアーゼと関連しているような癌罹患哺乳動物を治療するための薬学的組成物も提供する。
好ましい態様においては、哺乳動物はヒトである。さらなる態様においては、癌関連プロテアーゼはMMP-2、MMP-9開裂部位又はそれらの組み合わせを認識する。別の態様においては、癌は結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頚部癌、膀胱癌、消化器癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肉腫、神経膠腫、T細胞リンパ腫及びB細胞リンパ腫からなる群より選択される。
本発明の免疫毒素は、インビボ投与に適した生物学的に適合性のある形態での対象への投与のための薬学的組成物に製剤化されうる。「インビボ投与に適した生物学的に適合性のある形態」とは、いかなる毒性効果よりも治療効果の方が勝る、投与されるべき物質の形態を意味している。該物質はヒトや動物を含む生きた生物に投与されてよい。本発明の薬学的組成物の治療的活性量又は本発明の薬学的組成物の「有効量」の投与とは、所望の結果を得るために必要な用量および期間において有効な量を意味している。たとえば、物質の治療的活性量は、個体の疾病段階、年齢、性別、及び重量、ならびに個体中で望ましい反応を引き出す抗体の能力といった要素によって変わりうる。投与計画は、最適な治療的反応を提供すべく調整されうる。たとえば、いくつかに分割した用量を毎日投与してもよいし、用量を、治療状況の緊急事態に示されるように相応に減らしてもよい。
活性物質は注射(皮下、静脈内、筋肉内等)、経口投与、吸入、経皮投与(局所クリームまたは軟膏等)、又は座剤によるような便利な様式で投与されてよい。投与経路によっては、活性物質は、酵素、酸、及び化合物を不活性化しうる他の自然条件の作用から化合物を保護するための物質でコーティングされうる。
本明細書に記載の組成物は、活性物質の有効量が、薬学的に許容されるビヒクルと混合物中で組み合わされるような、対象に投与することが可能である薬学的に許容される組成物の調製のためのそれ自体が公知の方法により調製できる。適切なビヒクルはたとえば、Remington's Pharmaceutical Science(Remington's Pharmaceutical Science, 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 2000)で述べられている。これを基に、該組成物は、排他的ではないにしろ、一つまたは複数の薬学的に許容されるビヒクル若しくは希釈剤に関連する物質の溶液を包含するもので、適切なpHの緩衝液中に含まれ、体液と等張である。
薬学的組成物は、癌に罹患した、哺乳動物を包含する動物、好ましくはヒトを治療する方法において用いられうる。該組成物は、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頚部癌、膀胱癌、消化器癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肉腫、神経膠腫、T細胞リンパ腫及びB細胞リンパ腫に罹患した患者を治療するのに特に有用であろうことが予想される。投与されるべき免疫毒素の用量及びタイプは、ヒト対象において容易にモニタリングされうる種々の要素に左右されるであろう。そのような要素には病因や新生物の重篤度(グレードおよび段階)が包含される。
上述の通り、本発明の新規免疫毒素は、細胞が免疫毒素の癌関連開裂部位を開裂できるプロテアーゼを含むような癌細胞を治療するのに有用である。当業者であれば、癌関連プロテアーゼが同定されてしまえば多くの異なる免疫毒素を調製できることを理解できるであろう。
以下の非限定的実施例は本発明の例証である。
実施例1:
MMP特異的開裂リンカーを含む免疫毒素
組み替え一本鎖免疫毒素4D5MOCB-ETA(VB4-845)は、癌関連抗原Ep-CAMを発現するヒト腫瘍細胞を効果的に殺す。細胞表面に結合しているEp-CAMにおいて、VB4-845は受容体媒介性エンドサイトーシスによって内在化され、次いで、哺乳動物細胞に偏在的に発現するプロテアーゼであるフューリンによる処理を受けて、ETA部分が細胞基質に放出される。
免疫毒素変種(IMMPA)のような新しい「プロドラッグ」は、野生型毒素のaa 306-309位に存在するフューリン共通認識配列RQPRを、ゼラチナーゼA(MMP-2)及びゼラチナーゼB(MMP-9)と呼ばれるマトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)のサブクラスによって認識される開裂部位GPLGMLSQと置換することによって産生された(図1)。両プロテアーゼは腫瘍組織において豊富に存在することが示されており、その活性は腫瘍成長及び悪性進行の異なる段階の間アップレギュレートされる。対照として、フューリンかMMPのいずれかによるタンパク質分解性開裂に耐性のある、開裂部位欠失免疫毒素変種(IMMDF)が開発された。
エンドソーム/リボソームへのEp-CAM媒介性内在化において、該免疫毒素は、プロテアーゼ認識部位を露わにし、毒素にタンパク質分解開裂の影響を受けやすくさせる構造変化を受ける。これは、フューリンによって、また意外にもMMP-9ではなくMMP-2によっても加水分解される、親免疫毒素VB4-845について確認されたものである(図2)。共通配列が変異した後、インビトロにおけるIMMPAのタンパク質分解開裂は二つの活性化ゼラチナーゼのみに限定され、フューリンに抵抗性を有した。
種々の細胞株におけるEp-CAMの発現が研究された。図3は、染色およびFACS分析後の、腫瘍および不死化正常細胞の一連のEpCAM発現量を表している。EpCAM発現及びMMP発現プロファイルに焦点を当てた説明は表1に列挙されている。
EpCAMを過剰発現させている種々の腫瘍細胞株の増殖は、IMMPA又はVB4-845のいずれかの存在下で査定された(図4)。IMMPAの毒性は少し低いが、これはおそらくフューリンと比較してMMPの活性が低いためだけでなく、IMMPAが両プロテアーゼによってではなくMMPのみによってプロセシングされるからである。しかしながら、IMMPAは医学的に妥当である十分な毒性を有する。他の腫瘍細胞株及び幾つかの不死化正常細胞に対する細胞毒性もまた、IMMPA又はVB4-845の存在の下、研究された(図5)。IMMPA及びVB4-845に同様に感受性であった乳癌細胞株MCF-7を除き、全ての他の細胞株の生存度はおよそ1対数減少した。Vero及びHTB-100のようなEp-CAM陰性の細胞株は、Ep-CAM陽性細胞株よりもVB4-845に対する感受性がずっと低く、HT1080は濃度100nMでも影響されず、IMMPAによる影響はさらに少なかった。
HTB100及びVeroは陰性対照として選択され、EpCAMをコードする構築物でトランスフェクトされた。タンパク質発現はFACS分析によって確認された(図6)。結果は、中程度の(E1)及び高度な(F4)HTB100産生細胞クローンの発現を表している。
トランスフェクトされた細胞株の細胞毒性は図7において示されている。HTB100の低発現体(low expresser)が親HTB100として増殖したのに対し、高発現体(high expresser)は、IMMPA活性に対する感度が非常に高かった。これはHTB100がMMP活性を有していることを間接的に証明している。SV40ウイルスを用いた不死化はMMP活性に影響を与えることが示されている。Vero EpCAM発現クローンは低いEpCAM発現レベルしか有しないことが明らかにされ、かつおそらくはこの低い発現性の結果、毒素治療に対して感受性が低かった。
異なる培養時間後のMCF-7腫瘍細胞に対するIMMPA作用が査定された(図8)。これらの細胞の生存度は、個別に適用された培養時間の全予定の中に関して濃度100pMで減少して最小になった。
IMMPAのMMP特異活性を示したが、MMP依存的様式で細胞生存度を減少させる能力はまた、一連のMMP阻害剤を用いることによっても査定された(図9)。Ep-CAM陽性腫瘍細胞株(MCF-7乳癌細胞及びHT29大腸癌細胞)は、MMP阻害剤の固定用量を用いてプレインキュベートされ、その後、高用量のIMMPA又は親VB4-845で治療された。双方の細胞株について示されるように、MMP阻害剤の存在によりIMMPAの完全な活性化が阻害され、細胞死誘導が有意に阻害されたが、一方でVB4-845の細胞毒性活性の阻害は観察されなかった。
MMPを発現する癌細胞に対するMMP開裂可能免疫毒素変種IMMPAの特異性をさらに査定するために、Ep-CAMを過剰発現するMCF-7乳癌細胞、Ep-CAMの発現レベルが低い正常な乳房上皮細胞株HTB100、及びEp-CAM陰性HT1080繊維肉腫細胞株に対する、その細胞毒性活性が査定された。野生型免疫毒素(wt)又はIMMPAの存在下で72時間培養した後の比色MTT細胞生存度分析において得られた結果は図10に示されている。IMMPAはMCF-7細胞においてwt免疫毒素と等しく強力であったが、MMPを発現しないとされている正常乳房対照細胞に対して約1対数低い細胞毒性活性を示した。この知見は、wt免疫毒素のフューリン部位を置換するIMMPAにおけるMMP開裂可能部位によって提供される、腫瘍特異性の増加を示している。いずれの免疫毒素も、Ep-CAM陰性繊維肉腫細胞株に対する計測可能な細胞毒性を示さなかった。
本発明は、現在好ましい実施例とみなされているものを参照して説明されたが、本発明は開示された実施例に限られないということは理解されるべきである。反対に、本発明は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲に包含される種々の改変及び同等の機構に及ぶことを意図している。
各個別の刊行物、特許、または特許出願が、全文が参照により組み入れられると具体的及び個別的に示されるのと同程度に、全ての刊行物、特許、および特許出願は全文が参照により本明細書に組み入れられる。
Figure 2008530164
imm=SV40不死化正常ヒト細胞株
参照
Figure 2008530164
Figure 2008530164
Figure 2008530164
本発明を、添付の図面に関して説明する。
(a)親免疫毒素VB4-845、MMP処理されたIMMPA、及び対照免疫毒素(IMMDF)のタンパク質分解性開裂共有部位の概略図を示す。矢印は、IMMPAにおいてはゼラチナーゼ基質配列GPLGMLSQによって、若しくはIMMDFにおいては両プロテアーゼに対して感受性を有さない配列によって置換された、フューリンコンセンサスRQPRにおける開裂部位を示している。(b)開裂点の移置を示しているIMMPAの三次元構造を示す。(c)ドメイン構造の模式図及び開裂部位の移置を示す。 インビトロ開裂後の(a)VB4-845及び(b)IMMPAの分析を示す。免疫毒素は指示された時点までフューリン又はゼラチナーゼMMP-2及びMMP-9でインキュベーションされ、試料はポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分析された。 染色及びFACS分析後の、腫瘍及び不死化正常細胞の一連のEpCAM発現量を示す。 EpCAMを過剰発現している腫瘍細胞株阻害のグラフ図である。 他の腫瘍細胞株及び一部の不死化正常細胞の細胞毒性スクリーニングのグラフ図である。 FACS分析によるトランスフェクト細胞におけるEpCAMの発現を示す。 トランスフェクト細胞株の細胞毒性のグラフ図である。 異なるインキュベーション時間後のMCF-7腫瘍細胞に対するIMMPAの効果のグラフ図である。細胞は異なる時間で毒素と共にインキュベーションされ、その後、上清を正常培地と置換してインビトロ生存度評価に用いられる72時間インキュベーションの標準手順を行った(MTT)。72時間インキュベーションのグラフ図(黄色の×印を伴う黒い四角)は培地から決して毒素が除去されない正常なプロトコルを反映している。 IMMPA活性化に対するMMP阻害剤の効果及びMCF-7並びにHT29細胞における細胞生存度のグラフ図である。MMP阻害剤はIMMPAの活性化を妨げ、MCF-7細胞における死の誘導を阻害した。(a)3'000 MCF-7又は(b)HT29癌細胞は、完全なRPMI細胞培地上で96ウェルプレートの中で一晩培養された。MMP-2/MMP-9阻害剤であるGM1489、GM6001、GI-I〜IV又は対照GM6001cに対しては濃度100μMで、無血清RPMIにおけるMMP-3及びMMP-8阻害剤に対しては濃度10μMで、種々のMMP阻害剤が追加された。30分間の前培養においては100pMの免疫毒素IMMPA又はVB4-845が追加され、さらなる3時間の培養においては、毒素とMMP阻害剤を含む培地は、細胞がMMT生存度分析で72時間インキュベーションされる前に完全なRPMIにより置換された。細胞生存度は、それぞれのMMP阻害剤単独の存在下で成長した細胞生存度(これは任意に100%に設定された)に対する割合(%)として表現されている。バーは3回の独立した実験の平均を表している。 MTT検査において計測された細胞生存度のグラフ図である。

Claims (33)

  1. 癌関連プロテアーゼ部位でフューリン部位が置換されたETA部分を含む、毒素。
  2. 癌関連プロテアーゼ部位がMMP-2、MMP-9又はこれらの組み合わせによって開裂される、請求項1記載の毒素。
  3. 癌関連プロテアーゼ部位がGPLGMLSQ及びGPLGLWAQからなる群より選択される配列を含む、請求項1又は2記載の毒素。
  4. 癌関連プロテアーゼ部位が、置換されたフューリン部位よりも多くのアミノ酸を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の毒素。
  5. (a)修正毒素に接着した癌細胞に結合するリガンド;および
    (b)癌関連プロテアーゼ部位でフューリン部位が置換されたETA部分を含む該修正毒素
    を含む、免疫毒素。
  6. 免疫毒素が癌細胞により内在化される、請求項5記載の免疫毒素。
  7. リガンドが、癌細胞の表面に結合する抗体又は抗体断片である、請求項5または6記載の免疫毒素。
  8. 抗体又は抗体断片が癌細胞の表面においてEp-CAMと結合する、請求項7記載の免疫毒素。
  9. Ep-CAMと結合する抗体又は抗体断片が、ヒトEp-CAMの細胞外ドメインと結合し、かつ、MOC-31抗体に由来する相補性決定領域配列を含む、ヒト化された抗体又は抗体断片である、請求項8記載の免疫毒素。
  10. 癌関連プロテアーゼ部位でフューリン部位が置換されたVB4-845を含む、免疫毒素。
  11. 癌関連プロテアーゼ部位がMMP-2、MMP-9又はこれらの組み合わせによって認識される、請求項5〜10のいずれか一項記載の免疫毒素。
  12. 癌関連プロテアーゼ部位がGPLGMLSQ及びGPLGLWAQからなる群より選択される配列を含む請求項5〜11のいずれか一項記載の免疫毒素。
  13. 癌関連プロテアーゼ部位が、置換されたフューリン部位よりも多量のアミノ酸を含む、請求項5〜12のいずれか一項記載の免疫毒素。
  14. 請求項5〜13のいずれか一項記載の免疫毒素の有効量を投与する工程を含む、癌罹患哺乳動物の治療方法。
  15. 癌が、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頚部癌、膀胱癌、消化器癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肉腫、神経膠腫、T細胞リンパ腫及びB細胞リンパ腫からなる群より選択される、請求項14記載の方法。
  16. 哺乳動物がヒトである、請求項14又は15記載の方法。
  17. 癌罹患哺乳動物を治療するための、請求項5〜13のいずれか一項記載の免疫毒素の有効量の使用。
  18. 癌罹患哺乳動物の治療用ための薬物を製造するための、請求項5〜13のいずれか一項記載の免疫毒素の有効量の使用。
  19. 癌が、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頚部癌、膀胱癌、消化器癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肉腫、神経膠腫、T細胞リンパ腫及びB細胞リンパ腫からなる群より選択される、請求項17又は18記載の使用。
  20. 哺乳動物がヒトである、請求項17又は18記載の使用。
  21. 癌細胞を阻害又は破壊する方法であって、以下の工程を含む方法:
    (a)請求項5〜13のいずれか一項記載の免疫毒素を調製する工程;及び
    (b)該免疫毒素を該癌細胞へ投与する工程。
  22. 癌罹患哺乳動物を治療するための薬剤を調製するプロセスであって、以下の工程を含むプロセス:
    (a)癌関連プロテアーゼに対する開裂認識部位を同定する工程;
    (b)開裂認識部位でフューリン部位が置換されたETA部分を含む修正毒素に接着した癌結合リガンドを有する免疫毒素を調製する工程;及び
    (c)薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤中に該タンパク質を懸濁する工程。
  23. 癌が、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、頭頚部癌、膀胱癌、消化器癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肉腫、神経膠腫、T細胞リンパ腫及びB細胞リンパ腫からなる群より選択される、請求項22記載のプロセス。
  24. 哺乳動物がヒトである、請求項22又は23記載のプロセス。
  25. 癌関連プロテアーゼ部位でフューリン部位が置換されたETA部分を含む修正毒素に接着した癌結合リガンドを有する免疫毒素;及び、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、薬学的組成物。
  26. 免疫毒素が癌細胞により内在化される、請求項25記載の薬学的組成物。
  27. リガンドが、癌細胞の表面と結合する抗体又は抗体断片である、請求項25または26記載の薬学的組成物。
  28. 抗体又は抗体断片が癌細胞の表面においてEp-CAMと結合する、請求項27記載の薬学的組成物。
  29. Ep-CAMと結合する抗体又は抗体断片が、ヒトEp-CAMの細胞外ドメインと結合し、かつ、MOC-31抗体に由来する相補性決定領域配列を含む、ヒト化された抗体又は抗体断片である、請求項28記載の薬学的組成物。
  30. ETA部分に接着した癌結合リガンドの可変領域が4D5MOCBである、請求項25または26記載の薬学的組成物。
  31. 癌関連プロテアーゼ部位がMMP-2、MMP-9又はこれらの組み合わせによって認識される、請求項25〜30のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  32. 癌関連プロテアーゼ部位が、GPLGMLSQ及びGPLGLWAQからなる群より選択される配列を含む、請求項25〜31のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  33. 癌関連プロテアーゼ部位が、置換されたフューリン部位よりも多量のアミノ酸を含む、請求項25〜32のいずれか一項記載の薬学的組成物。
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