JP2014091687A - 軟骨又は骨の破壊の診断薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】葉酸リセプターβに対する抗体、又は該抗体と生物学的もしくは化学的活性物質との複合体を含有する、関節リウマチ、変形性関節症又は悪性腫瘍の骨転移による軟骨又は骨の破壊の診断薬。
【選択図】なし
Description
(1)葉酸リセプターβに対する抗体、又は該抗体と生物学的もしくは化学的活性物質との複合体を含有する、関節リウマチ、変形性関節症又は悪性腫瘍の骨転移による軟骨又は骨の破壊の診断薬。
(2)葉酸リセプターβに対する抗体が一重鎖又は二重鎖である前記(1)に記載の診断薬。
(3)葉酸リセプターβに対する抗体が放射性物質、蛍光物質又は磁気ナノ粒子で標識されている前記(1)又は(2)に記載の診断薬。
[FR−β発現細胞の作成]
以下の方法にてFR−β発現B300−19細胞を作成する。先ず、pEF−BOSベクターにFR−β遺伝子を組み込む。ベクターはpEF−BOSベクターに限らず、哺乳類の発現ベクターのいずれでもよい。次に、FR−β遺伝子をリポフェクタミン法にてマウスB300−19細胞に遺伝子導入する。導入法はエレクトロポレーション法でもよい。また、細胞株はマウスBalb/C由来の細胞株であればいずれでもよい。
この抗体とトキシン、好ましくはシュードモナス・エクソトキシン(Pseudomonas exotoxin;PE)をHaasanらの方法に準じ(Haasan et al.Anti-tumor activity of K1-LysPE38QQR,an immunotoxin targeting mesothelin,a cell-surface antigen overexpressed in ovarian cancer and malignant mesothelioma.J Immunother.2000 J;23(4):473-9)、サクシニミヂルトランス−4−マレイミヂルメチルシクロヘキサン1−カルボキシレート(Succinimidyltrans-4-(maleimidylmethyl)cyclohexane 1-carboxylate)(SMCC)にて結合させ、イムノトキシンを作成する。
抗FR−βイムノトキシンは関節リウマチと同様マクロファージによって軟骨、骨破壊がおこると考えられている変形性関節症の軟骨破壊、脳腫瘍、悪性黒色腫、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、骨髄腫、大腸癌、腎癌,胃癌、子宮癌、甲状腺癌の骨転移の際の骨破壊の抑制にも有効である。
関節リウマチ、変形性関節症又は悪性腫瘍の骨転移による軟骨又は骨の破壊を診断するのに有効である濃度で投与される。この目的を達成するために、診断薬は、当該技術分野で知られている許容される種々の賦形剤を用いて処方される。典型的には、診断薬は、注射によって、静脈内又は関節腔内投与される。本発明組成物は、医薬的に許容される非経口賦形剤と混合して、液剤、懸濁剤又は乳剤などの単位投与注射用形態で処方される。かかる賦形剤は、本質的に、無毒性であり、非治療的である。かかる賦形剤の例は、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液である。固定油及びオレイン酸エチルなどの非水性賦形剤を用いてもよい。好ましい賦形剤は、生理食塩水中5%のデキストロースである。賦形剤は、バッファー及び保存剤を含む、等張性及び化学的安定性を増強する物質などの少量の添加剤を含有してよい。
投与形態は、好ましくは、全身投与又は局所投与である。
[抗原であるFR-β発現細胞の調製]
Lewisラット肝臓からトリゾール(Trizol)(GibcoBRL)、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にて添付説明書に従って全RNAを抽出後、SuperScript plasmid System(Invitrogen)にて添付説明書に従ってcDNAを合成した。Lewisラット肝臓cDNAをBioneer PCR premix(Bioneer)に加え、10ピコモル量に調整したセンスプライマー(ラット肝臓:tct aga aag aca tgg cct gga aac ag 配列番号1)及びアンチセンスプライマー(ccc aac atg gat cag gaa ct配列番号2)を加え、94℃20秒、58℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させることにより、ラットFR-βを増幅した。増幅したFR-β遺伝子のPCR産物をpTAC-1(バイオダイナミックラボラトリー社)にライゲーションを行った。すなわちPCR産物2.5μlにNaCl溶液を1μl、滅菌蒸留水1.5μl、ベクタープラスミド(PCR2.1-TOPO)1μlを加えて室温で5分間インキュベートし、その内の2μlを大腸菌(TOP10F')に加えて氷中で30分反応後、42℃30秒の熱処理をし、氷中で2分間静置し、250μlのSOC培地を加えた後、37℃、1時間シェーカー内で培養した。培養終了後、LB培地に捲き、37℃で一晩培養した。
ラットFR-β発現マウスB300-19細胞を1x107個に調整し、フロインド完全アジュバンドと混合し、Balb/Cマウスの尾部に3ヵ所、腹腔内に免疫した。この免疫を2〜4回繰り返した。
ハイブリドーマクローン4A67を1x107個にそれぞれ調整し、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成した4A67はIg-Prime Kitを用いてVH及びVLの遺伝子をPCRにて決定した。PCR条件は添付の説明書に従って行った。すなわち、94℃60秒、50℃60秒、72℃120秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させ、VH及びVLの遺伝子を増幅した。増幅したVH及びVLのPCR産物をプラスミドPCR2.1-TOPO(Invitrogen)にライゲーションし、大腸菌(TOP10F')に遺伝子導入した。遺伝子導入した大腸菌よりプラスミドを精製し、4A67のVH及びVLの塩基配列を決定した。塩基配列はBigDye Terminaor V3.1 cycle sequencing kit(ABI)を用いてPCRを行い、PCR産物をABI 310 DNA sequencerにて解析した。
[免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)にシステインの変異を導入]
マウス抗ラットFR-βモノクローナル抗体4A67の免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)の63番目のアミノ酸グリシン(塩基配列ggc)をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製し(センス:gtgaagcaggctccaggaaagTGTttaaagtggatgggctggata配列番号3;アンチセンス:tatccagcccatccactttaaACActttcctggagcctgcttcac配列番号4)、Quick change site-directed mutagenesis kit (Stratagene)を用いて実施例1で得た4A67のVHを含むプラスミドpCR2.1-TOPO 4A67VHに変異誘発処理を行った。このPCR反応は、反応液を95℃30秒、55℃60秒、68℃4分のサイクルを12回連続して行った。
次に、PE38遺伝子を含むpRSETベクターpRSETPE38に4A67VHの変異を導入したVHの挿入を以下の方法にて行った。
マウス抗ラットFR-βモノクローナル4A67の免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域(VL)の125番目のアミノ酸をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した。
センス:taa gaa gga gat ata cat atg CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT配列番号7(このプライマーは制限酵素NdeI切断可能な塩基catatgを含むため、この部位でクローニングすることにより、atgを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である)
アンチセンス:gct ttg tta gca gcc gaa ttc cta TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC ACA GCC GAA CGT配列番号8(このプライマーは125番目のアミノ酸をシステイン(tgt)に変異させ、終始コドンtagに続いて制限酵素EcoRI切断可能な塩基gaattcが来るようにデザインしてある)
前記の変異導入VHを組み込んだプラスミドpRSET-4A67VHPE、変異導入VLを組み込んだプラスミドpRSET-VL4A67を50 ng調製し、タンパク質発現用大腸菌BL21(DE3)に遺伝子導入した。遺伝子が導入された大腸菌の選抜は0.1mg/mlのアンピシリンを含むLB培地にて37℃15〜18時間の培養で行った。
前記で調製した4A67-VHPEと4A67-VLを混和させ、リコンビナント二重鎖Fv抗FR-βイムノトキシンを作製した。
SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミド電気泳動)は0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む12%ポリアクリルアミドの平板ゲルを用い、移動相には終濃度0.1%のSDS、130 mM グリシン、25 mMトリスを含む水溶液を用いた。各サンプルは終濃度0.1%のSDSを含む100 mMトリス緩衝液pH6.5で調製し、5分間の煮沸処理を行った。煮沸終了後、平板ゲルにサンプルを投与し、30 mAの定電流で電気泳動を展開させた。展開後、0.05%のクマシーブリリアントブルーR溶液(ナカライテスク)でリコンビナントタイプイムノトキシンの染色を行った。
ラットFR-β発現B300-19細胞を24ウェルの細胞培養プレートに1ウェルあたり5×104個となるように添加し、更に終濃度0-1μg/mlとなるようにイムノトキシン及びVHPEを加え、37℃、CO2インキュベーターで培養した。培養24、48、72時間後における細胞増殖をCell Counting Kit-8(細胞毒性測定試薬、Dojindo社)を用いて測定した。測定方法は添付マニュアルに従い、マイクロプレートリーダー(Thermo社)にて測定した。
[メチル化ウシ血清アルブミン(メチル化BSA)誘発アジュバンドラット関節炎モデルの作製とイムノトキシンの投与]
メチル化BSA誘発アジュバンドラット関節炎モデルはNicolau Beckmannの方法(Nicolau Beckmann、Magnetic Resonance in Medicine (2003) 49 : 1047-1055)に従って行った。この関節炎においては、軟骨・骨破壊が生じることが知られている。まず50μlに調整したメチル化BSA(5mg/ml 、50%フロインド完全アジュバンドを含む)をLewisラット(♀、6-9週齢)の腹部皮下に投与した。更に投与7日後に同操作を行った。
投与後21日目にラットを安楽死させ、両脚を切除してアセトン固定を行った。アセトン固定後のラット関節は、0.5M EDTAを含むpH8.0の20mMトリス緩衝液にて脱灰処理を行った。脱灰処理後、純水で50%に希釈したO.T.C Compound(SAKURA社)で組織を包埋した。凍結組織切片の作製は川本らの方法に従い(Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 2003 May;66(2):123-43.)、粘着フィルムを用いて凍結切片を作製した。
(1)関節リウマチ骨破壊部位にはFR−β発現細胞が存在する(図7参照)。
骨を含む関節リウマチ滑膜をアセトン固定後、脱灰のため、1%EDTA/リン酸緩衝液(PBS)、pH7.0中で、毎日緩衝液を交換しながら、2週間置換した。その後、組織をパラフィン包埋し、免疫染色のため各5μmの切片をスライドに張り付けた。60℃で30分間処理後、脱パラフィン処理のため、切片スライドをキシレンで5分間、3回置換、脱水操作のため、エタノールで5分間、3回置換、90%エタノール、70%エタノールでそれぞれ3分間、置換した。
肝臓がんの骨転移部位をアセトン固定後、脱灰のため、1%EDTA/リン酸緩衝液(PBS)、pH7.0中で、毎日緩衝液を交換しながら、2週間置換した。その後、組織をパラフィン包埋し、免疫染色のため各5μmの切片をスライドに張り付けた。60℃で30分間処理後、脱パラフィン処理のため、切片スライドをキシレンで5分間、3回置換、脱水操作のため、エタノールで5分間、3回置換、90%エタノール、70%エタノールでそれぞれ3分間、置換した。
シュードモナス・エクソトキシン(緑膿菌毒素)イムノトキシンの静脈注射では、シュードモナス・エクソトキシンに対する中和抗体が高度に出現し、効果の減弱や副作用をおこすことが報告されている(Pastan I, Onda M, Weldon J, Fitzgerald D, Kreitman R. Leuk Lymphoma. 2011 Jun;52 Suppl 2:87-90)。
(a)0.1M炭酸緩衝液(pH9.6)で1μg/mlの濃度に調整したVH−PE38を、ELISAプレート(マキシソープ)に50μl(50ng)/ウェルの条件で滴下し、10℃で一晩インキュベートした。インキュベート終了後、溶液を除去してリン酸緩衝液(PBS)で3回洗浄した。洗浄後、3%スキムミルクを溶解させたPBSを200μl(50ng)/ウェルの条件で滴下し、37℃で1時間インキュベートした。
(b)インキュベート終了後、ラット血清サンプルの2倍希釈系列を3%スキムミルクPBSにて調整し、37℃で1時間インキュベートした。尚、抗イムノトキシン抗体の陽性コントロールは抗シュードモナス・エクソトキシンウサギ血清(シグマ社製)を用いた。インキュベート終了後、0.1%Tween20を含むPBSでプレートを3回洗浄した。
(c)洗浄後、3%スキムミルクPBSで2000倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体(抗ラットIgM−IgG、Southern Biotech社製、及び抗ウサギIgG、Southern Biotech社製)を50μl/ウェルの条件で滴下し、37℃で30分間インキュベートした。インキュベート終了後、0.1%Tween20を含むPBSでプレートを3回洗浄した。
(d)洗浄後、2,2’−Azino−bis発色基質溶液(シグマ社製)を50μl/ウェルの条件で滴下し、室温で15分間インキュベートした。インキュベート終了後、プレートリーダーにて波長415nmの吸光度を測定した。
関節炎誘発7、14、21日後に採取したラット血清のVH−PEに対する反応性を図10Bに示した。値は100倍希釈時における各群の吸光度を示す。イムノトキシンを投与しない関節炎ラット(N=6)血清の値はすべて0.1以下であった。14日後に採取した群では吸光度0.1以上が1個体存在した。7日及び21日後に採取した個体が示す吸光度は全て0.1以下であった。
配列番号2−人工配列の説明:プライマー
配列番号3−人工配列の説明:プライマー
配列番号4−人工配列の説明:プライマー
配列番号5−人工配列の説明:プライマー
配列番号6−人工配列の説明:プライマー
配列番号7−人工配列の説明:プライマー
配列番号8−人工配列の説明:プライマー
Claims (3)
- 葉酸リセプターβに対する抗体、又は該抗体と生物学的もしくは化学的活性物質との複合体を含有する、関節リウマチ、変形性関節症又は悪性腫瘍の骨転移による軟骨又は骨の破壊の診断薬。
- 葉酸リセプターβに対する抗体が一重鎖又は二重鎖である請求項1記載の診断薬。
- 葉酸リセプターβに対する抗体が放射性物質、蛍光物質又は磁気ナノ粒子で標識されている請求項1又は2記載の診断薬。
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