TW201739768A - 新穎抗tnfrsf21抗體及使用方法 - Google Patents

新穎抗tnfrsf21抗體及使用方法

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羅拉 桑德斯
迪普堤 羅肯姆
大衛 劉
曼蒂 布坦瑞特
亞利山德 約翰 班寇維奇
伊凡 畢夏普
蒙奈特 歐傑
照 黃
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艾伯維史坦森特瑞斯有限責任公司
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Abstract

本文提供新穎抗TNFRSF21抗體，及抗體藥物偶聯物，以及使用該等抗TNFRSF21抗體及抗體藥物偶聯物以治療癌症之方法。

Description

新穎抗TNFRSF21抗體及使用方法
本申請案概言之係關於新穎抗TNFRSF21抗體或其免疫反應性片段、及包含其之組合物(包括抗體藥物偶聯物)，其用於治療、診斷或預防癌症及其任何復發或轉移。本發明之所選實施例提供該等抗TNFRSF21抗體或抗體藥物偶聯物用於治療癌症之用途，包含減小致瘤細胞頻率。
幹細胞及祖細胞之分化及增殖係在器官形成、細胞修復及細胞替代期間協同起支持組織生長作用之正常持續過程。該系統受嚴密調控以確保僅產生基於生物體需要之適當信號。細胞增殖及分化通常僅視需要發生用於替代受損或死亡細胞或用於生長。然而，許多因素可引起該等過程中斷，包括多種信號傳導化學物質過少或過多、存在改變的微環境、遺傳突變或其組合。正常細胞增殖及/或分化之中斷可導致多種病症，包括增殖性疾病，例如癌症。 癌症之習用治療性治療包括化學療法、放射性療法及免疫療法。通常，該等治療無效且手術切除可能無法提供可行的臨床替代方案。當前標準護理之限制在患者經受第一線治療且隨後復發之彼等情形下尤其明顯。在該等情形下，通常出現難治性腫瘤，通常攻擊性及不可治癒性腫瘤。許多腫瘤之總存活率多年來幾乎保持不變，此至少部分歸因於現有療法無法防止復發、腫瘤復發及轉移。因此，業內極大地需要研發出對增殖性病症更具針對性且更強效之療法。本發明解決了此需要。
在廣泛態樣中，本發明提供經分離之抗體及相應抗體藥物或診斷性偶聯物(ADC)、或其組合物，其特異性結合至人類TNFRSF21決定子。在某些實施例中，TNFRSF21決定子係在腫瘤細胞上表現之TNFRSF21蛋白，而在其他實施例中，TNFRSF21決定子在腫瘤起始細胞上表現。在其他實施例中，本發明抗體結合至TNFRSF21蛋白且與結合至人類TNFRSF21蛋白(hTNFRSF21)之表位之抗體競爭結合。 在所選實施例中，本發明包含抗體，該抗體包含結合至人類TNFRSF21 (SEQ ID NO: 1)之經分離之抗體或與其競爭結合，或包含以下或與包含以下之抗體競爭結合：(1) SEQ ID NO: 21之輕鏈可變區(VL)及SEQ ID NO: 23之重鏈可變區(VH)；或(2) SEQ ID NO: 25之VL及SEQ ID NO: 27之VH；或(3) SEQ ID NO: 29之VL及SEQ ID NO: 31之VH；或(4) SEQ ID NO: 33之VL及SEQ ID NO: 35之VH；或(5) SEQ ID NO: 37之VL及SEQ ID NO: 39之VH；或(6) SEQ ID NO: 41之VL及SEQ ID NO: 43之VH；或(7) SEQ ID NO: 45之VL及SEQ ID NO: 47之VH；或(8) SEQ ID NO: 49之VL及SEQ ID NO: 51之VH；或(9) SEQ ID NO: 53之VL及SEQ ID NO: 55之VH；或(10) SEQ ID NO: 57之VL及SEQ ID NO: 59之VH；或(11) SEQ ID NO: 61之VL及SEQ ID NO: 63之VH；或(12) SEQ ID NO: 65之VL及SEQ ID NO: 67之VH；或(13) SEQ ID NO: 69之VL及SEQ ID NO: 71之VH；或(14) SEQ ID NO: 73之VL及SEQ ID NO: 75之VH；或(15) SEQ ID NO: 77之VL及SEQ ID NO: 79之VH；或(16) SEQ ID NO: 81之VL及SEQ ID NO: 83之VH；或(17) SEQ ID NO: 85之VL及SEQ ID NO: 87之VH；或(18) SEQ ID NO: 89之VL及SEQ ID NO: 91之VH；或(19) SEQ ID NO: 93之VL及SEQ ID NO: 95之VH；或(20) SEQ ID NO: 97之VL及SEQ ID NO: 99之VH；或(21) SEQ ID NO: 101之VL及SEQ ID NO: 103之VH；或(22) SEQ ID NO: 105之VL及SEQ ID NO: 107之VH；或(23) SEQ ID NO: 109之VL及SEQ ID NO: 111之VH；或(24) SEQ ID NO: 113之VL及SEQ ID NO: 115之VH； SEQ ID NO: 117之VL及SEQ ID NO: 119之VH；或(25) SEQ ID NO: 121之VL及SEQ ID NO: 123之VH；或(26) SEQ ID NO: 125之VL及SEQ ID NO: 127之VH；或(27) SEQ ID NO: 129之VL及SEQ ID NO: 131之VH；或(28) SEQ ID NO: 133之VL及SEQ ID NO: 135之VH；或(29) SEQ ID NO: 137之VL及SEQ ID NO: 139之VH；或(30) SEQ ID NO: 141之VL及SEQ ID NO: 143之VH；或(31) SEQ ID NO: 145之VL及SEQ ID NO: 147之VH；或(32) SEQ ID NO: 149之VL及SEQ ID NO: 151之VH；或(33) SEQ ID NO: 153之VL及SEQ ID NO: 155之VH；或(34) SEQ ID NO: 157之VL及SEQ ID NO: 159之VH；或(35) SEQ ID NO: 161之VL及SEQ ID NO: 163之VH；或(36) SEQ ID NO: 165之VL及SEQ ID NO: 167之VH；或(37) SEQ ID NO: 169之VL及SEQ ID NO: 171之VH；或(38) SEQ ID NO: 173之VL及SEQ ID NO: 175之VH；或(39) SEQ ID NO: 177之VL及SEQ ID NO: 179之VH；或(40) SEQ ID NO: 181之VL及SEQ ID NO: 183之VH；或(41) SEQ ID NO: 185之VL及SEQ ID NO: 187之VH；或(42) SEQ ID NO: 189之VL及SEQ ID NO: 191之VH；或(43) SEQ ID NO: 193之VL及SEQ ID NO: 195之VH；或(44) SEQ ID NO: 197之VL及SEQ ID NO: 199之VH；或(45) SEQ ID NO: 201之VL及SEQ ID NO: 203之VH；或(46) SEQ ID NO: 205之VL及SEQ ID NO: 207之VH；或(47) SEQ ID NO: 209之VL及SEQ ID NO: 211之VH；或(48) SEQ ID NO: 213之VL及SEQ ID NO: 215之VH；或(49) SEQ ID NO: 217之VL及SEQ ID NO: 219之VH；或(50) SEQ ID NO: 221之VL及SEQ ID NO: 223之VH；或(51) SEQ ID NO: 225之VL及SEQ ID NO: 227之VH；或(52) SEQ ID NO: 229之VL及SEQ ID NO: 231之VH；或(53) SEQ ID NO: 233之VL及SEQ ID NO: 235之VH；或(54) SEQ ID NO: 237之VL及SEQ ID NO: 239之VH；或(55) SEQ ID NO: 241之VL及SEQ ID NO: 243之VH；或(56) SEQ ID NO: 245之VL及SEQ ID NO: 247之VH；或(57) SEQ ID NO: 249之VL及SEQ ID NO: 251之VH；或(58) SEQ ID NO: 253之VL及SEQ ID NO: 255之VH；或(59) SEQ ID NO: 257之VL及SEQ ID NO: 259之VH；或(60) SEQ ID NO: 261之VL及SEQ ID NO: 263之VH；或(61) SEQ ID NO: 33之VL及SEQ ID NO: 265之VH；或(62) SEQ ID NO: 65之VL及SEQ ID NO: 267之VH；或(63) SEQ ID NO: 269之VL及SEQ ID NO: 103之VH；或(64) SEQ ID NO: 271之VL及SEQ ID NO: 175之VH。 在又一態樣中，本發明包含結合至包含輕鏈可變區及重鏈可變區之TNFRSF21之抗體，其中該輕鏈可變區具有3個如以下中所述之輕鏈可變區之CDR：SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 105 SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 189、SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 205 SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 245、SEQ ID NO: 249、SEQ ID NO: 253、SEQ ID NO: 257、SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 269或SEQ ID NO: 271，且該重鏈可變區具有3個如以下中所述之重鏈可變區之CDR：SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO:59及SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 191、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO: 255、SEQ ID NO: 259、SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 265或SEQ ID NO: 267。 在其他態樣中，本發明包含人類化抗體，其具有(1) 包含SEQ ID NO: 281之VL及包含SEQ ID NO: 283之VH；(2) 包含SEQ ID NO: 285之VL及包含SEQ ID NO: 287之VH；(3) 包含SEQ ID NO: 289之VL及包含SEQ ID NO: 291之VH；或(4) 包含SEQ ID NO: 293之VL及包含SEQ ID NO: 295之VH。在某些實施例中，該等人類化抗體將包含位點特異性抗體。在其他實施例中，該等抗體將包含N297A突變(MJ突變)。在又一些實施例中，本發明抗體可包含具有MJ突變之位點特異性抗體。 在其他所選實施例中，本發明將包含選自由以下組成之群之人類化抗體：hSC39.2 (SEQ ID NO: 300及301)、hSC39.4 (SEQ ID NO: 302及303)、hSC39.4ss1 (SEQ ID NO: 302及311)、hSC39.28 (SEQ ID NO: 304及305)、hSC39.126 (SEQ ID NO: 306及307)及hSC39.126ss1 (SEQ ID NO: 306及309)。 在本發明之一些態樣中，抗體包含嵌合、CDR移植、人類化或人類抗體或其免疫反應性片段。在本發明之其他態樣中，較佳包含上文所提及序列之全部或部分之抗體係內化抗體。在其他實施例中，抗體將包含位點特異性抗體。在某些實施例中，抗TNFRSF21抗體將抑制TNFRSF21配體與TNFRSF21結合。在其他所選實施例中，本發明包含納入上文所提及之抗體中之任一者之抗體藥物偶聯物。 在某些態樣中，本發明包含編碼本發明之抗TNFRSF21抗體或其片段之核酸。在其他實施例中，本發明包括包含上述核酸中之一或多者之載體或包含該等核酸或載體之宿主細胞。 如上文所提到，本發明進一步提供抗TNFRSF21抗體藥物偶聯物，其中如本文中揭示之抗體偶聯至酬載。在某些態樣中，本發明包含與hTNFRSF21免疫優先締合或結合之ADC。本發明之相容向抗TNFRSF21抗體藥物偶聯物(ADC)通常可包含下式： Ab-[L-D]n或其醫藥上可接受之鹽，其中 a) Ab包含抗TNFRSF21抗體； b) L包含可選連接體； c) D包含藥物；且 d) n係約1至約20之整數。 在某些態樣中，本發明之該ADC包含抗TNFRSF21抗體，例如上述所述彼等，或其免疫反應性片段。在其他實施例中，本發明之ADC包含選自以下之細胞毒性化合物：放射性同位素、卡奇黴素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮呯(PBD)、苯并二氮呯衍生物、奧裡斯他汀(auristatin)、尾海兔素(dolastatin)、多卡米星(duocarmycin)、類美登素(maytansinoid)或本文所述之其他治療性部分。在某些較佳實施例中，所揭示之ADC將包含卡奇黴素。在其他所選實施例中，ADC將包含尾海兔素，且在又一些所選實施例中，ADC將包含奧裡斯他汀。 進一步提供包含如本文中揭示之抗TNFRSF21 ADC之醫藥組合物。在某些實施例中，組合物將包含所選藥物-抗體比率(DAR)，其中主要ADC物質佔所存在物質之大於約50%、大於約60%、大於約70%、大於約80%、大於約90%或甚至大於約95%。在一些實施例中，所選DAR將為2，而在其他實施例中，所選DAR將為4，且在其他實施例中，所選DAR將為6，且在其他實施例中，所選DAR將為8。 本發明之另一態樣係治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與醫藥組合物(例如本文所述彼等)。在某些態樣中，癌症包含血液惡性病，例如急性骨髓性白血病或瀰漫性大B細胞淋巴瘤。在其他態樣中，個體將患有實體腫瘤。關於該等實施例，癌症較佳選自由以下組成之群：腎上腺癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、前列腺癌、胰臟癌、肺癌(小細胞及非小細胞二者)、甲狀腺癌及神經膠母細胞瘤。在某些實施例中，個體將患有肺癌，且在所選實施例中肺腺癌。在某些其他實施例中，個體將患有胰臟癌。在其他實施例中，個體將患有膀胱癌。此外，在所選實施例中，治療上述癌症之方法包含向個體投與至少一種除本發明抗TNFRSF21 ADC以外之其他治療性部分。 在又一實施例中，本發明包含減少腫瘤細胞群體中之腫瘤起始細胞之方法，其中該方法包含使腫瘤起始細胞群體與如本文所述之ADC接觸(例如活體外或活體內)，藉此減小腫瘤起始細胞之頻率。 在一態樣中，本發明包含向細胞遞送細胞毒素之方法，其包含使細胞與上述ADC中之任一者接觸。 在另一態樣中，本發明包含檢測、診斷或監測個體之癌症(例如膀胱癌或肺癌)之方法，該方法包含使腫瘤細胞與TNFRSF21檢測劑接觸(例如活體外或活體內)及檢測與腫瘤細胞相關之TNFRSF21試劑之步驟。在所選實施例中，檢測劑將包含抗TNFRSF21抗體或與TNFRSF21基因型決定子相關聯之核酸探針。在相關實施例中，診斷方法將包含免疫組織化學(IHC)或原位雜交(ISH)。在其他實施例中，方法將包含使循環腫瘤細胞與抗TNFRSF21抗體接觸。熟習此項技術者將進一步瞭解，該等TNFRSF21檢測劑可經如下文揭示之效應物、標記物或報導基因標記或與其相關聯且使用多種標準活體內成像技術(例如，MRI、CAT掃描、PET掃描等)中之任一者進行檢測。 在相似靜脈中，本發明亦提供可用於診斷、監測或治療TNFRSF21相關病症(例如癌症)之套組或器件及相關方法。為此，本發明較佳提供可用於檢測、診斷或治療TNFRSF21相關病症之製品，其包含含有TNFRSF21 ADC之貯器及使用該TNFRSF21 ADC以治療、監測或診斷TNFRSF21相關病症或提供其劑量方案的說明材料。在所選實施例中，器件及相關方法將包含接觸至少一個循環腫瘤細胞之步驟。在其他實施例中，所揭示套組將包含說明書、標籤、插頁、閱讀器或諸如此類，其指示套組或器件用於診斷、監測或治療TNFRSF21相關癌症或提供其劑量方案。 前述內容為發明內容，且因此必須含有細節之簡化、概述及省略；因此，熟習此項技術者應瞭解，發明內容僅具有說明性且不欲以任何方式進行限制。在本文所述之教示中將明瞭本文所述方法、組合物及/或器件及/或其他標的物之其他態樣、特徵及優點。提供該發明內容以按簡化形式引入下文在實施方式中進一步闡述之概念精選。
交叉參考申請案 本申請案主張於2016年5月6日提出申請之美國臨時申請案第62/332,721號及於2017年4月28日提出申請之美國臨時申請案第62/491,897號之權益，其各自之全文以引用方式併入本文中。序列表 本申請案含有以ASCII格式經由EFS-Web呈送且其全文以引用方式併入本文中之序列表。該ASCII拷貝於2017年5月3日創建，命名為S69697_1420WO_SC3901WOO1_ST25.txt且大小為280 KB (287,356個字節)。 本發明可以許多不同形式來體現。本文揭示本發明之例示其原理之非限制性、說明性實施例。本文所用之任一部分標題僅出於組織目的，且不應理解為限制所述標的物。出於本發明之目的，除非另有說明，否則所有鑑別序列登錄號皆可參見NCBI參考序列(RefSeq)資料庫及/或NCBI GenBank® 檔案序列資料庫。 已驚人地發現，TNFRSF21表型決定子在臨床上與多種增殖性病症(包括贅瘤)相關，且TNFRSF21家族蛋白及其變體或亞型提供可用於治療相關疾病之有用腫瘤標記物。就此而言，本發明提供新穎抗TNFRSF21抗體及包含抗TNFRSF21抗體靶向劑及細胞毒性酬載之抗體藥物偶聯物。如下文更詳細論述且如隨附實例中所述，所揭示之抗TNFRSF21 ADC在消除腫瘤生成細胞中尤其有效，且因此可用於治療及預防某些增殖性病症或其進展或復發。另外，所揭示之ADC組合物可經改造以展現在與包含相同組份之習用ADC組合物比較時相對高之DAR=2百分比及意外的穩定性，其可提供改良之治療指數。 此外，已發現，TNFRSF21標記物或決定子(例如細胞表面TNFRSF21蛋白)在治療上與癌症幹細胞(亦稱為腫瘤永存細胞)相關且可有效地用於將其消除或沉默。經由使用如本文所揭示之抗TNFRSF21偶聯物選擇性減少或消除癌症幹細胞之能力令人驚奇之處在於，已知該等細胞通常抵抗許多習用治療。即，傳統以及最新靶向治療方法之有效性通常受限於即使在該等不同治療方法下仍能夠使腫瘤生長永存之抗性癌症幹細胞之存在及/或出現。另外，與癌症幹細胞相關之決定子通常因低或不一致表現、無法保持與腫瘤生成細胞締合或無法存在於細胞表面而使治療靶較差。與先前技術之教示明顯不同，本發明所揭示之ADC及方法可有效地克服此固有抗性，且特異性消除、清除、沉默或促進該等癌症幹細胞之分化，由此抵消其持續或再誘導潛在腫瘤生長之能力。 因此，尤其應注意TNFRSF21偶聯物(例如本文所揭示之彼等)可有利地用於治療及/或預防所選增殖性(例如贅瘤性)病症或其進展或復發。應瞭解，儘管下文將尤其在特定結構域、區或表位方面或在癌症幹細胞及其與所揭示抗體藥物偶聯物相互作用之背景下廣泛論述本發明之較佳實施例，但彼等熟習此項技術者應瞭解該等實例性實施例並不限制本發明之範疇。相反，本發明及隨附申請專利範圍之最廣泛實施例廣泛且明確地針對所揭示之抗TNFRSF21抗體及偶聯物及其在治療和/或預防各種TNFRSF21相關或介導之病症(包括贅瘤性或細胞增殖性病症，而不管任何特定作用機制或特異性靶向之腫瘤、細胞或分子組份)中的用途。 I.TNFRSF21 生理學 腫瘤壞死因子受體超家族成員21 (TNFRSF21；亦稱為死亡受體6、DR6、CD358、BM-108及UNQ437/PRO868)係細胞表面單次跨膜I型跨膜蛋白。代表性TNFRSF21蛋白直向同源物包括(但不限於)人類(NP_0055267；圖1A，SEQ ID NO: 1)、黑猩猩(XP_001145645)、恒河猴(XP_001103782)、大鼠(NP_001101677)及小鼠(NP_848704)。在人類中，TNFRSF21基因由染色體6p21.1上跨越約78.4 kBp之6個外顯子組成。人類TNFRSF21基因座之轉錄產生編碼655胺基酸前體蛋白(NP_055267)之經處理3.65 kBp轉錄物(NM_014452)。預測前體蛋白之處理涉及去除包含分泌信號肽之前41個胺基酸，且藉由在膜近端半胱胺酸添加N-及O-醣基化以及S-棕櫚醯化對蛋白質進行廣泛轉譯後修飾。在結構上，蛋白質在其細胞外結構域(ECD)中含有4個TNFR-Cys結構域，其存在將蛋白質表徵為TNF受體超家族之成員。TNFR-Cys結構域包括約40個胺基殘基，其包括6個參與互鎖鏈間二硫鍵之半胱胺酸。TNFRSF21亦含有通常促進與其他含有死亡結構域之蛋白質均-或異-二聚化的細胞質死亡結構域(圖1B)。在圖1A中，對前導序列加下劃線，細胞外結構域係以大寫字母，跨膜結構域加粗且細胞內結構域係以小寫字母。 TNFRSF21分類為孤兒受體，此乃因未知其精確配體，但已報導可在發育過程中結合β-類澱粉前體蛋白(APP)以調節神經元密度(Nikoaev等人，2009；PMID: 19225519；Olsen等人，2014；PMID:24806670)。含有死亡結構域之蛋白質係細胞凋亡信號傳導路徑之主要成員，且已顯示TNFRSF21與TRADD (一種參與各種細胞凋亡信號傳導路徑之銜接蛋白)締合以活化NF-κB及JNK路徑。然而，哺乳動物細胞中TNFRSF21之過表現不會均勻地誘導細胞凋亡，相反，似乎隨細胞類型而變化(Nikoaev等人，2009；PMID: 19225519；Pan等人，1998；PMID: 9714541)。最近研究已表明，TNFRSF21可經由Bax而非更習用之細胞凋亡路徑來介導細胞凋亡(Zeng等人，2010；PMID: 22761420)。相反，矛盾的是，TNFRSF21轉錄物在多種癌細胞系中及在自晚期前列腺及乳癌患者生檢之癌症中升高，但假設該等系及腫瘤亦可顯示抗細胞凋亡蛋白亦上調(Benschop等人，2009；PMID:19760075)。 TNFRSF21亦與發炎及免疫調節過程相關聯。剔除小鼠係活的、能育的，且展現TNFRSF21並非發育所需。該等小鼠顯示增強之CD4+ T細胞增殖及Th2細胞介素產生、以及增強之B-細胞增殖、存活及體液性反應。另外，已顯示通常自身在腫瘤中過表現之MMP-14可自腫瘤細胞表面裂解TNFRSF21，導致ECD調節不成熟及形成樹突細胞以誘導死亡或改變其表面表型，此表明腫瘤逃避免疫監督之潛在機制。 儘管TNFRSF21信號傳導路徑、其配體及其在癌症發生及進展中之確切作用之細節仍有待充分闡明，但很明顯，癌細胞及如本文中揭示之癌症幹細胞過表現此蛋白質。因此，靶向TNFRSF21之抗體-藥物偶聯物之使用可為治療癌症患者之腫瘤之有效治療策略。 II.癌症幹細胞 根據當前模型，腫瘤包含非腫瘤生成細胞及腫瘤生成細胞。即使在以過量細胞數移植至免疫受損小鼠中時，非腫瘤生成細胞仍不具自我更新能力且不能可再生地形成腫瘤。通常構成腫瘤細胞群體之0.01-10%之分數之腫瘤生成細胞(在本文中亦稱為「腫瘤起始細胞」(TIC))具有形成腫瘤之能力。對於造血惡性病而言，TIC可具體而言在急性骨髓性惡性病(AML)中在1:104 至1:107 之極罕見範圍內，或在(例如) B細胞譜系之淋巴瘤中極為豐富。腫瘤生成細胞涵蓋兩種腫瘤永存細胞(TPC)，可互換地稱為癌症幹細胞(CSC)及腫瘤祖細胞(TProg)。 支持正常組織中之細胞分級之CSC (如正常幹細胞)能夠無限地自我複製，同時維持多向分化之能力。就此而言，CSC能夠生成腫瘤生成子代及非腫瘤生成子代二者，且能夠完全重演親代腫瘤之異質細胞組成，如藉由連續分離並將少數經分離CSC移植至免疫受損小鼠中所展示。證據指示，除非該等「種子細胞」被消除，否則腫瘤更有可能轉移或復發，此導致疾病之復發及最終進展。 TProg (如CSC)具有推動一次移植中之腫瘤生長之能力。然而，與CSC不同，其無法重演親代腫瘤之細胞異質性，且在重起始後續移植中之腫瘤生成方面不夠有效，此乃因TProg通常僅能夠使有限數量之細胞分裂，如藉由將少數經高度純化之TProg連續移植至免疫受損小鼠中所展示。TProg可進一步分成早期TProg及晚期TProg，其可藉由表型(例如細胞表面標記物)及其不同的重演腫瘤細胞架構之能力來區分。儘管二者重演腫瘤之程度皆不與CSC相同，但早期TProg具有強於晚期TProg之重演親代腫瘤特徵之能力。儘管具有前述不同，但已顯示，一些TProg群體可在個別情況下獲得通常歸因於CSC之自我更新能力且其本身可變成CSC。 CSC與下列各項相比展現更高之腫瘤生成性且通常相對更靜止：(i) TProg (早期及晚期TProg二者)；及(ii) 可源自CSC且通常構成腫瘤本體之非腫瘤生成細胞，例如終末分化之腫瘤細胞及腫瘤浸潤細胞，例如纖維母細胞/間質、內皮及造血細胞。鑒於習用療法及方案在很大程度上已經設計以減積腫瘤並攻擊快速增殖之細胞，CSC因此比更快速增殖之TProg及其他本體腫瘤細胞群體(例如非腫瘤生成細胞)對習用療法及方案更具抗性。可使CSC對習用療法具有相對化學抗性之其他特徵係增加的多重抗藥性運輸體表現、增強的DNA修復機制及抗-細胞凋亡基因表現。該等CSC性質涉及標準治療方案無法為晚期贅瘤形成之患者提供持久的反應，此乃因標準化學療法不能有效地靶向實際上促進持續腫瘤生長及復發之CSC。 已驚人地發現，TNFRSF21表現與各種致瘤細胞亞群體相關，其方式使得該等致瘤細胞亞群體易受如本文所述治療影響。本發明提供尤其可用於靶向腫瘤生成細胞且可用於沉默、敏化、中和、減小頻率、阻斷、廢除、干擾、減少、阻礙、限制、控制、清除、緩和、介導、減小、再程式化、消除、殺死或以其他方式抑制(統稱為「抑制」)腫瘤生成細胞，由此有利於治療、管控及/或預防增殖性病症(例如癌症)之抗TNFRSF21抗體。有利地，本發明之抗TNFRSF21抗體可經選擇，以使其在投與個體後較佳減小腫瘤生成細胞之頻率或腫瘤生成性而與TNFRSF21決定子(例如表型或基因型)無關。腫瘤生成細胞頻率之減小可因以下各項所致：(i) 腫瘤生成細胞之抑制或消滅；(ii) 控制腫瘤生成細胞之生長、擴增或復發；(iii) 中斷腫瘤生成細胞之起始、繁殖、維持或增殖；或(iv) 藉由其他方式阻礙腫瘤生成細胞之存活、再生及/或轉移。在一些實施例中，腫瘤生成細胞之抑制可因一或多個生理路徑改變所致。無論藉由抑制或消除腫瘤生成細胞、改變其潛能(例如，藉由誘導分化或生態位破壞)抑或以其他方式干擾腫瘤生成細胞影響腫瘤環境或其他細胞之能力造成的路徑改變允許藉由抑制腫瘤生成、腫瘤維持及/或轉移及復發來更有效地治療TNFRSF21相關病症。進一步應理解，所揭示抗體之相同特徵使得其在治療已證明對標準治療方案具有抗性或難治性之復發性腫瘤方面特別有效。 可用於評價腫瘤生成細胞頻率之減小之方法包括(但不限於)細胞術或免疫組織化學分析，較佳藉助活體外或活體內限制性稀釋分析(Dylla等人， 2008, PMID: PMC2413402及Hoey等人 2009, PMID: 19664991)。 活體外限制稀釋分析可藉由在培養群落形成之固體培養基上培養分級或未分級腫瘤細胞(例如分別來自經處理及未經處理之腫瘤)及對生長之群落進行計數及表徵來實施。另一選擇為，可將腫瘤細胞連續稀釋至具有含液體培養基之孔之板上且可在接種後之任何時間、但較佳在接種後10天以上將每一孔評分為對群落形成呈陽性或陰性。 活體內限制稀釋係藉由將來自未經處理對照或來自暴露於選擇治療劑之腫瘤之腫瘤細胞以連續稀釋物移植至免疫受損小鼠中且隨後將每一小鼠評分為對腫瘤形成呈陽性或陰性來實施。評分可在植入腫瘤可檢測後之任何時間發生，但較佳係在移植後60或更多天進行。用以測定致瘤細胞之頻率之限制稀釋實驗之結果的分析較佳係使用帕松分佈(Poisson distribution)統計學或評價預定義之明確事件(例如是否活體內生成腫瘤之能力)之頻率來進行(Fazekas等人，1982, PMID: 7040548)。 流式細胞術及免疫組織化學法亦可用於測定腫瘤生成細胞頻率。兩種技術採用一或多種結合已知富集腫瘤生成細胞之業內公認細胞表面蛋白質或標記物之抗體或試劑(參見WO 2012/031280)。如業內已知，流式細胞術(例如螢光活化細胞分選(FACS))亦可用於表徵、分離、純化、富集或分選包括腫瘤生成細胞之多個細胞群體。流式細胞術藉由使其中懸浮有混合細胞群體之流體流通過能夠每秒量測高達數千個粒子之物理及/或化學特徵的電子檢測裝置來量測腫瘤生成細胞含量。免疫組織化學法所提供之其他資訊在於，其使得能夠藉由用結合至腫瘤生成細胞標記物之經標記抗體或試劑對組織樣品染色使腫瘤生成細胞在原位(例如在組織切片中)可視化。 因此，本發明抗體可用於經由諸如流式細胞術、磁性活化細胞分選(MACS)、雷射介導之切片或FACS等方法鑑別、表徵、監測、分離、切片或富集致瘤細胞之群體或亞群體。FACS係用於基於特異性細胞表面標記物以超過99.5%之純度分離細胞亞群體之可靠方法。用於表徵及操縱致瘤細胞(包括CSC)之其他相容技術可參見(例如) U.S.P.N. 12/686,359、12/669,136及12/757,649。 下文列舉與CSC群體相關聯且用於分離或表徵CSC之標記物：ABCA1、ABCA3、ABCB5、ABCG2、ADAM9、ADCY9、ADORA2A、ALDH、AFP、AXIN1、B7H3、BCL9、Bmi-1、BMP-4、C20orf52、C4.4A、羧肽酶M、CAV1、CAV2、CD105、CD117、CD123、CD133、CD14、CD16、CD166、CD16a、CD16b、CD2、CD20、CD24、CD29、CD3、CD31、CD324、CD325、CD33、CD34、CD38、CD44、CD45、CD46、CD49b、CD49f、CD56、CD64、CD74、CD9、CD90、CD96、CEACAM6、CELSR1、CLEC12A、CPD、CRIM1、CX3CL1、CXCR4、DAF、核心蛋白聚醣、easyh1、easyh2、EDG3、EGFR、ENPP1、EPCAM、EPHA1、EPHA2、FLJ10052、FLVCR、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、GD2、GJA1、GLI1、GLI2、GPNMB、GPR54、GPRC5B、HAVCR2、IL1R1、IL1RAP、JAM3、Lgr5、Lgr6、LRP3、LY6E、MCP、mf2、mllt3、MPZL1、MUC1、MUC16、MYC、N33、NANOG、NB84、NES、NID2、NMA、NPC1、OSM、OCT4、OPN3、PCDH7、PCDHA10、PCDHB2、PPAP2C、PTPN3、PTS、RARRES1、SEMA4B、SLC19A2、SLC1A1、SLC39A1、SLC4A11、SLC6A14、SLC7A8、SMARCA3、SMARCD3、SMARCE1、SMARCA5、SOX1、STAT3、STEAP、TCF4、TEM8、TGFBR3、TMEPAI、TMPRSS4、TFRC、TRKA、WNT10B、WNT16、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、YY1及CTNNB1。參見(例如) Schulenburg等人，2010, PMID: 20185329、U.S.P.N. 7,632,678及U.S.P.N. 2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416及2011/0020221。 相似地，與某些腫瘤類型之CSC相關之細胞表面表型之非限制性實例包括CD44hi CD24低 、ALDH+ 、CD133+ 、CD123+ 、CD34+ CD38− 、CD44+ CD24− 、CD46hi CD324+ CD66c− 、CD133+ CD34+ CD10− CD19− 、CD138− CD34− CD19+ 、CD133+ RC2+ 、CD44+ α2 β1 hi CD133+ 、CD44+ CD24+ ESA+ 、CD271+ 、ABCB5+ 以及業內已知之其他CSC表面表型。參見(例如) Schulenburg等人，2010，見上文，Visvader等人，2008, PMID: 18784658及U.S.P.N. 2008/0138313。關於本發明尤其感興趣的是包含實體腫瘤中之CD46hi CD324+ 表型及中白血病之CD34+ CD38- 之CSC製劑。 「陽性」、「低」及「陰性」表現程度在其應用於標記物或標記物表型時定義如下。具有陰性表現(即「-」)之細胞在本文中定義為表現小於或等於在螢光通道中在標記其他螢光發射通道中之其他所關注蛋白質之完全抗體染色混合劑存在下利用同型對照抗體所觀察到表現之第95百分位數的彼等細胞。彼等熟習此項技術者應瞭解，用於定義陰性事件之此程序稱為「螢光減一」或「FMO」染色。表現大於使用上述FMO染色程序利用同型對照抗體所觀察到表現之第95百分位數的細胞在本文中定義為「陽性」(即「+」)。如本文所定義，多個細胞群體在廣義上定義為「陽性」。若抗原之所觀察到之平均表現大於如上文所述使用FMO染色利用同型對照抗體測定的第95百分位數，則細胞定義為陽性。若所觀察到之平均表現大於藉由FMO染色測定之第95百分位數且在第95百分位數之一個標准偏差內，則陽性細胞可稱為具有低表現(即「lo」)之細胞。另一選擇為，若所觀察到之平均表現大於藉由FMO染色測定之第95百分位數且大於第95百分位數以上之一個標准偏差，則陽性細胞可稱為具有高表現(即「hi」)之細胞。在其他實施例中，較佳可使用第99百分位數作為陰性與陽性FMO染色之間之區別點，且在一些實施例中，百分位數可大於99%。 CD46hi CD324+ 或CD34+ CD38- 標記物表型及上文剛剛例示之彼等可與標準流式細胞術分析及細胞分選技術聯合使用來表徵、分離、純化或富集TIC及/或TPC細胞或細胞群體以供進一步分析。 因此，可使用上述技術及標記物來測定本發明抗體減小腫瘤生成細胞頻率之能力。在一些情況下，抗TNFRSF21抗體可將致瘤細胞之頻率減小10%、15%、20%、25%、30%或甚至35%。在其他實施例中，致瘤細胞之頻率減小可為約40%、45%、50%、55%、60%或65%。在某些實施例中，所揭示之化合物可使腫瘤生成細胞之頻率減小70%、75%、80%、85%、90%或甚至95%。應瞭解，腫瘤生成細胞頻率之任何減小皆可能引起贅瘤之腫瘤生成性、持久性、復發及攻擊性的相應減小。 III.抗體 A.抗體結構 抗體及其變體及衍生物(包括公認之命名及編號系統)已廣泛闡述於以下中：例如，Abbas等人 (2010),Cellular and Molecular Immunology (第6版), W.B. Saunders Company；或Murphey等人 (2011),Janeway’s Immunobiology (第8版), Garland Science。 「抗體」或「完整抗體」通常係指包含藉由共價二硫鍵及非共價相互作用保持在一起之兩條重多肽鏈(H)及兩條輕多肽鏈(L)之Y形四聚體蛋白質。每一輕鏈係由一個可變結構域(VL)及一個恆定結構域(CL)構成。每一重鏈包含一個可變結構域(VH)及恆定區，在IgG、IgA及IgD抗體之情形下其包含三個結構域，稱為CH1、CH2及CH3 (IgM及IgE具有第四個結構域CH4)。在IgG、IgA及IgD類別中，CH1與CH2結構域藉由撓性鉸鏈區分開，該撓性鉸鏈區係可變長度(在不同IgG子類中為約10個至約60個胺基酸)之富含脯胺酸及半胱胺酸之區段。輕鏈及重鏈二者中之可變結構域藉由約12個或更多個胺基酸之「J」區接合至恆定結構域，且重鏈亦具有約10個另外胺基酸之「D」區。每一類抗體進一步包含由成對半胱胺酸殘基形成之鏈間及鏈內二硫鍵。 如本文所用術語「抗體」包括多株抗體(polyclonal antibodies、multiclonal antibodies)、單株抗體、嵌合抗體、人類化及靈長化抗體、CDR移植抗體、人類抗體(包括重組產生之人類抗體)、重組產生之抗體、胞內抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價抗體、多價抗體、抗個體基因型抗體、合成抗體(包括突變蛋白及其變體)、免疫特異性抗體片段(例如Fd、Fab、F(ab')2 、F(ab')片段)、單鏈片段(例如scFv及ScFvFc)；及其衍生物，包括Fc融合物及其他修飾形式，及任何其他免疫反應性分子，只要其展現與決定子優先締合或結合即可。另外，除非上下文約束另外指示，否則該術語進一步包含所有類別之抗體(即IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)及所有子類(即，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。對應於不同抗體類別之重鏈恆定結構域通常分別由相應的小寫希臘字母α、δ、ε、γ及μ表示。基於來自任何脊椎動物物種之抗體之恆定結構域之胺基酸序列，可將該等抗體之輕鏈指配為兩種完全不同的類型(稱為卡帕型(κ)及拉姆達型(λ))之一。 抗體之可變結構域顯示抗體之間胺基酸組成之顯著變化，且主要負責抗原識別及結合。每一輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點，使得完整IgG抗體具有兩個結合位點(即其為二價)。VH及VL結構域包含三個極端可變區，其稱為超變區，或更通常稱為互補決定區(CDR)，其藉由四個較不可變區(稱為框架區(FR))構架並分開。VH區與VL區之間之非共價締合形成含有抗體之兩個抗原結合位點中之一者之Fv片段(對於「可變片段」)。 如本文所用，除非另有說明，否則可根據由以下提供之方案之一將胺基酸分配至每一結構域、框架區及CDR：Kabat等人 (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest (第5版), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH公開案第91-3242號；Chothia等人，1987, PMID: 3681981；Chothia等人，1989, PMID: 2687698；MacCallum等人，1996, PMID: 8876650；或Dubel編輯(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies, 第3版， Wily-VCH Verlag GmbH及Co或AbM (Oxford Molecular/MSI Pharmacopia)。如業內所熟知，可變區殘基編號通常係如Chothia或Kabat中所述。包含如藉由如自Abysis網站資料庫(見下文)獲得之Kabat、Chothia、MacCallum (亦稱為Contact)及AbM定義之CDR的胺基酸殘基闡述於下表1中。注意，MacCallum使用Chothia編號系統。表 1 抗體序列中之可變區及CDR可根據業內已研發出之一般規則(如上文所闡釋，例如Kabat編號系統)或藉由比對該等序列與已知可變區之資料庫來鑑別。用於鑑別該等區域之方法闡述於以下文獻中：Kontermann及Dubel編輯，Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001；以及Dinarello等人，Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc，Hoboken, NJ, 2000。抗體序列之實例性資料庫闡述於以下網站中且可經由其存取：「Abysis」網站www.bioinf.org.uk/abs (由Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London, London, England之A. C. Martin維護)及VBASE2網站www.vbase2.org，如Retter等人，Nucl. Acids Res., 33 (資料庫期號):D671 -D674 (2005)中所述。 較佳使用Abysis資料庫來分析序列，該Abysis資料庫將來自Kabat、IMGT及蛋白質資料庫(PDB)之序列數據與來自PDB之結構數據整合在一起。參見Andrew C. R. Martin博士之書本章節Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains . 於以下中：Antibody Engineering Lab Manual (編輯：Duebel, S.及Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547，在網站bioinforg.uk/abs上亦可見)。Abysis資料庫網站進一步包括經研發用於鑑別可根據本文教示使用之CDR之一般規則。隨附圖7G - 7J顯示在SC39.2、SC39.4、SC39.28及SC39.126抗體之實例性重鏈及輕鏈可變區(VH及VL)之注釋中顯示該等分析之結果。除非另外指明，否則本文所述之所有CDR皆係根據Kabat等人根據Abysis資料庫網站衍生而來。 對於本發明中所論述之重鏈恆定區胺基酸位置，根據首次闡述於Edelman等人，1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1): 78-85中之Eu索引來編號，該文獻闡述經報導為第一個經測序之人類IgG1之骨髓瘤蛋白Eu之胺基酸序列。Edelman之Eu索引亦闡述於Kabat等人，1991 (見上文)中。因此，術語「如Kabat中所述之Eu索引」或「Kabat之Eu索引」或「Eu索引」或「Eu編號」在重鏈背景下係指基於Edelman等人之人類IgG1 Eu抗體之殘基編號系統，如Kabat等人，1991 (見上文)中所述。用於輕鏈恆定區胺基酸序列之編號系統以相似方式闡述於Kabat等人(見上文)中。與本發明相容之實例性κ (SEQ ID NO: 5)及λ (SEQ ID NO: 8)輕鏈恆定區胺基酸序列緊接闡述於下文中： RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5)。 QPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 8)。 相似地，與本發明相容之實例性IgG1重鏈恆定區胺基酸序列緊接闡述於下文中： ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 2)。 熟習此項技術者應瞭解，野生型(例如，參見SEQ ID NO: 2、5或8)或如本文中揭示之經改造以提供未配對半胱胺酸(例如，參見SEQ ID NO: 3、4、6、7、9或10)之該等重鏈及輕鏈恆定區序列可使用標準分子生物技術可操作地與所揭示之重鏈及輕鏈可變區締合，以提供可納入本發明之TNFRSF21抗體藥物偶聯物中之全長抗體。包含本發明之所選抗體(hSC39.2、hSC39.4、hSC39.4ss1、hSC39.28、hSC39.126及hSC39.126ss1)之全長重鏈及輕鏈的序列闡述於附圖7F中。 熟習此項技術者應瞭解，免疫球蛋白分子中存在兩種類型之二硫橋或鍵：鏈間及鏈內二硫鍵。如業內熟知，鏈間二硫鍵之位置及編號根據免疫球蛋白類別及物種變化。儘管本發明並不限於任何特定類別或子類之抗體，但出於闡釋目的，將貫穿本發明使用IgG1免疫球蛋白。在野生型IgG1分子中，存在12個鏈內二硫鍵(每一重鏈上有4個且每一輕鏈上有2個)及4個鏈間二硫鍵。鏈內二硫鍵通常較鏈間鍵稍微受保護且相對不易於還原。相反，鏈間二硫鍵位於免疫球蛋白之表面上，可溶於溶劑且通常相對易於還原。重鏈之間存在2個鏈間二硫鍵，且自每一重鏈至其各別輕鏈存在一個。已展現，鏈間二硫鍵並非鏈締合所必需。IgG1鉸鏈區在重鏈中含有形成鏈間二硫鍵之半胱胺酸，其提供結構支撐以及有利於Fab運動之撓性。重/重IgG1鏈間二硫鍵位於殘基C226及C229 (Eu編號)，而在κ或λ輕鏈之C214與重鏈之上鉸鏈區中之C220之間形成IgG1 (重/輕)之輕鏈及重鏈之間之IgG1鏈間二硫鍵。 B.抗體生成及產生 本發明抗體可使用業內已知之各種方法產生。 1.宿主動物中多株抗體之生成 各種宿主動物中多株抗體之產生為業內熟知(參見例如Harlow及Lane (編輯) (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press；及Harlow等人(1989) Antibodies, NY, Cold Spring Harbor Press)。為了生成多株抗體，用抗原蛋白或包含抗原蛋白之細胞或製劑對免疫勝任動物(例如小鼠、大鼠、兔、山羊、非人類靈長類動物等)進行免疫。一段時間後，藉由採血或殺死動物獲得含有多株抗體之血清。血清可以自動物獲得之形式使用或抗體可經部分或完全純化以提供免疫球蛋白部分或經分離之抗體製劑。 就此而言，本發明抗體可自任何在免疫勝任動物中誘導免疫反應之TNFRSF21決定子生成。如本文所用「決定子」或「靶」意指可鑑別地與特定細胞、細胞群體或組織締合或特別發現於特定細胞、細胞群體或組織中或其上之任何可檢測性狀、性質、標記物或因子。決定子或靶之性質可為形態的、功能的或生物化學的且較佳係表型的。在較佳實施例中，決定子係由特定細胞類型或由細胞在某些條件下(例如，在細胞週期之特定點期間或具體生態位之細胞)差異表現(過表現或過少表現)之蛋白質。出於本發明之目的，決定子較佳在異常癌細胞上差異表現，且可包含TNFRSF21蛋白、或其剪接變體、亞型、同源物或家族成員中之任一者、或其特定結構域、區或表位。「抗原」、「免疫原性決定子」、「抗原決定子」或「免疫原」意指在引入免疫勝任動物中時可刺激免疫反應且由自該免疫反應產生之抗體識別的任何TNFRSF21蛋白質或其任何片段、區或結構域。可利用本文所涵蓋TNFRSF21決定子之存在或不存在來鑑別細胞、細胞亞群或組織(例如、腫瘤、腫瘤生成細胞或CSC)。 可使用任何形式之抗原或含有該抗原之細胞或製劑來生成對TNFRSF21決定子具有特異性之抗體。如所提到術語「抗原」係以廣義使用且可包含所選靶之任何免疫原性片段或決定子，包括單一表位、多表位、單一或多結構域或整個細胞外結構域(ECD)或蛋白質。抗原可係經分離之全長蛋白、細胞表面蛋白(例如，用在其表面上表現抗原之至少一部分之細胞免疫)或可溶性蛋白(例如，僅用蛋白質之ECD部分免疫)或蛋白構築體(例如，Fc-抗原)。抗原可在經遺傳修飾之細胞中產生。上文所提及抗原中之任一者可單獨使用或與一或多種業內已知之免疫原性增強佐劑組合使用。編碼抗原之DNA可為基因組DNA或非基因組DNA (例如cDNA)，且可編碼足以誘發免疫原性反應之ECD之至少一部分。可採用任何載體來轉化其中表現抗原之細胞，包括(但不限於)腺病毒載體、慢病毒載體、質體及非病毒載體(例如陽離子脂質)。 2.單株抗體 在所選實施例中，本發明涵蓋單株抗體之用途。如業內已知，術語「單株抗體」或「mAb」係指自實質上同源之抗體群體獲得之抗體，即，除可能存在極少量可能突變(例如天然存在之突變)外，構成該群體之個別抗體皆相同。 單株抗體可使用業內已知之眾多種技術來製備，包括雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、轉基因動物(例如XenoMouse® )或其一些組合。舉例而言，單株抗體可使用例如詳細闡述於以下中之雜交瘤及生物化學及基因改造技術產生：An, Zhigiang (編輯)Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic , John Wiley and Sons, 第1版，2009；Shire等人(編輯)Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing , Springer Science + Business Media LLC, 第1版，2010；Harlow等人，Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版，1988；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)。在產生多種特異性結合至決定子之單株抗體後，可基於例如對決定子之親和力或內化速率經由多個篩選過程選擇尤其有效之抗體。如本文所述產生之抗體可用作「來源」抗體且進一步經修飾以(例如)改良對靶之親和力，改良其在細胞培養物中之產生，降低活體內免疫原性，產生多特異性構築體等。單株抗體產生及篩選之更詳細說明闡釋於下文及隨附實例中。 3.人類抗體 在另一實施例中，抗體可包含完全人類抗體。術語「人類抗體」係指具有對應於由人類產生之抗體之胺基酸序列的胺基酸序列及/或已使用製備下文所述人類抗體之任一技術製備的抗體。 人類抗體可使用業內已知之各種技術產生。一種技術係噬菌體展示，其中在噬菌體上合成(較佳人類)抗體之文庫，利用所關注抗原或其抗原結合部分篩選文庫，且分離結合抗原之噬菌體，自其可獲得免疫反應性片段。製備及篩選該等文庫之方法為業內熟知且用於生成噬菌體展示文庫之套組有市售(例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目錄號27-9400-01；及Stratagene SurfZAPTM 噬菌體展示套組，目錄號240612)。亦存在可用於生成及篩選抗體展示文庫之其他方法及試劑(參見(例如)U.S.P.N. 5,223,409；PCT公開案第WO 92/18619號、第WO 91/17271號、第WO 92/20791號、第WO 92/15679號、第WO 93/01288號、第WO 92/01047號、第WO 92/09690號；及Barbas等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991))。 在一個實施例中，可藉由篩選如上文所述製備之重組組合抗體文庫來分離重組人類抗體。在一個實施例中，文庫係使用自B細胞分離之mRNA製備之人類VL及VH cDNA生成的scFv噬菌體展示文庫。 由未經處理之文庫(天然存在或合成)產生之抗體可具有中等親和力(Ka 為約106 至107 M-1 )，但亦可如業內所述藉由自二級文庫構築及再選擇在活體外模擬親和力成熟。舉例而言，可藉由使用易錯聚合酶在活體外隨機引入突變(報導於Leung等人，Technique , 1: 11-15 (1989)中)。另外，親和力成熟可藉由使用(例如) PCR利用攜帶跨越所關注CDR之隨機序列之引子在所選個別Fv純系中隨機突變一或多個CDR及針對較高親和力純系進行篩選來實施。WO 9607754闡述在免疫球蛋白輕鏈之CDR中誘導誘變以產生輕鏈基因文庫之方法。另一有效方法係使藉由噬菌體展示選擇之VH或VL結構域與自未經免疫之供體獲得之天然存在之V結構域變體譜重組及在若干輪鏈重改組中針對較高親和力進行篩選，如Marks等人，Biotechnol ., 10: 779-783 (1992)中所述。此技術容許產生解離常數KD (koff /kon )為約10-9 M或更小之抗體及抗體片段。 在其他實施例中，可使用包含在其表面上表現結合對之真核細胞(例如，酵母)之文庫採用相似程序。參見(例如) U.S.P.N. 7,700,302及U.S.S.N. 12/404,059。在一個實施例中，人類抗體選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表現人類抗體(Vaughan等人 NatureBiotechnology 14:309-314 (1996): Sheets等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6157-6162 (1998))。在其他實施例中，可自真核細胞(例如酵母)中生成之組合抗體文庫分離人類結合對。參見(例如) U.S.P.N. 7,700,302。該等技術有利地容許篩選大量候選者調節劑並提供候選者序列之相對容易操縱(例如，藉由親和力成熟或重組體改組)。 人類抗體亦可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入其中內源免疫球蛋白基因已部分或完全失活且已引入人類免疫球蛋白基因之轉基因動物(例如小鼠)中來製備。在攻擊時，觀察到人類抗體產生，其在所有方面非常類似於在人類中可見之情形，包括基因重排、組裝及抗體譜。此方法闡述於以下中：例如關於XenoMouseâ 技術之U.S.P.N. 5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016及U.S.P.N. 6,075,181及6,150,584；及Lonberg及Huszar,Intern. Rev. Immunol . 13:65-93 (1995)。另一選擇為，可經由使產生針對靶抗原之抗體之人類B淋巴球(該等B淋巴球可自患有贅瘤性病症之個體回收或可已在活體外經免疫)永生來製備人類抗體。參見(例如) Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy , Alan R. Liss, 第77頁(1985)；Boerner等人，J. Immunol , 147 (l):86-95 (1991)；及U.S.P.N. 5,750,373。 無論來源如何，應理解，人類抗體序列可使用業內已知之分子改造技術製作並引入如本文所述之表現系統及宿主細胞中。該等非天然存在重組產生之人類抗體(及標的組合物)與本揭示內容之教示完全相容且明確地保持在本發明之範疇內。在某些所選態樣中，本發明之TNFRSF21 ADC將包含用作細胞結合劑之重組產生之人類抗體。 4.衍生之抗體 ： 一旦如上文所述生成、選擇及分離來源抗體，可進一步對其進行改變以提供具有改良醫藥特徵之抗TNFRSF21抗體。較佳地，使用已知分子改造技術修飾或改變來源抗體以提供具有期望治療性質之源抗體。 4.1.嵌合及人類化抗體 本發明之所選實施例包含免疫特異性結合至TNFRSF21且可視為「來源」抗體之鼠類單株抗體。在所選實施例中，本發明抗體可經由來源抗體之恆定區及/或表位結合胺基酸序列之可選修飾源自該等「來源」抗體。在某些實施例中，若經由缺失、突變、取代、整合或組合來改變來源抗體之所選胺基酸，則抗體「源自」來源抗體。在另一實施例中，「衍生之」抗體係其中將來源抗體之片段(例如，一或多個CDR或結構域或整個重鏈及輕鏈可變區)組合或納入受體抗體序列中以提供衍生性抗體(例如，嵌合、CDR移植或人類化抗體)者。該等「衍生之」抗體可使用如下文所述來自產生抗體之細胞之遺傳物質及標準分子生物技術來生成，以(例如)改良對決定子之親和力；改良抗體穩定性；改良細胞培養物中之產生及產率；降低活體內免疫原性；降低毒性；促進活性部分之偶聯；或產生多特異性抗體。該等抗體亦可藉由化學方式或轉譯後修飾來修飾成熟分子(例如糖基化模式或聚乙二醇化)源自來源抗體。 在一個實施例中，本發明之抗體包含源自共價接合之至少兩個不同種類或類別之抗體之蛋白質區段的嵌合抗體。術語「嵌合」抗體係指如下構築體：其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來自具體物種或屬具體抗體類別或子類之抗體中之相應序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分與來自另一物種或屬另一抗體類別或子類之抗體以及該等抗體之片段的相應序列一致或同源(U.S.P.N. 4,816,567)。在一些實施例中，本發明之嵌合抗體可包含可操作地連接至人類輕鏈及重鏈恆定區之全部或大部分所選鼠類重鏈及輕鏈可變區。在其他所選實施例中，抗TNFRSF21抗體可「源自」本文揭示之小鼠抗體且包含小於整個重鏈及輕鏈可變區。 在其他實施例中，本發明之嵌合抗體係「CDR移植」抗體，其中CDR (如使用Kabat、Chothia、McCallum等所定義)源自具體物種或屬具體抗體類別或子類，而抗體之其餘部分主要源自來自另一物種或屬另一抗體類別或子類之抗體。對於在人類中之應用，可將一或多個所選齧齒類動物CDR (例如小鼠CDR)移植至人類受體抗體中，從而替代人類抗體之天然存在之CDR中之一或多者。該等構築體通常具有提供全強度人類抗體功能(例如，補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC))、同時降低由個體對抗體之不期望免疫反應的優點。在一個實施例中，CDR移植抗體將包含一或多個自小鼠獲得之納入人類框架序列中之CDR。 「人類化」抗體與CDR移植抗體相似。如本文所用，「人類化」抗體係包含一或多個源自一或多種非人類抗體(供體或來源抗體)之胺基酸序列(例如CDR序列)的人類抗體(受體抗體)。在某些實施例中，可將「回復突變」引入人類化抗體中，其中接受者人類抗體之可變區之一或多個FR之殘基經來自非人類物種供體抗體之相應殘基替代。該等回復突變可幫助維持移植CDR之適當三維構形且由此改良親和力及抗體穩定性。可使用來自多個供體物種之抗體，包括(但不限於)小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物。另外，人類化抗體可包含未在接受者抗體或供體抗體中發現之新殘基，以例如進一步細化抗體性能。可如下文實例中所述提供與本發明相容之包含來自來源抗體之鼠類組份及來自受體抗體之人類組份的CDR移植及人類化抗體。 可使用多種業內公認技術來確定使用哪個人類序列作為受體抗體來提供本發明之人類化構築體。相容性人類種系序列之編譯及測定其作為受體序列之適合性的方法揭示於以下中：例如Dubel及Reichert (編輯) (2014)Handbook of Therapeutic Antibodies , 第2版， Wiley-Blackwell GmbH；Tomlinson, I. A.等人 (1992)J. Mol. Biol . 227:776-798；Cook, G. P.等人 (1995)Immunol. Today 16: 237-242；Chothia, D.等人(1992)J. Mol. Biol. 227:799-817；及Tomlinson等人(1995)EMBO J 14:4628-4638)。亦可使用V-BASE名錄(VBASE2 - Retter等人，Nucleic Acid Res. 33；671-674, 2005)，其提供人類免疫球蛋白可變區序列之綜合性名錄(由Tomlinson, I. A.等人，MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK編譯)，以鑑別相容性受體序列。另外，例如U.S.P.N. 6,300,064中所述之共有人類框架序列亦可證明為相容性受體序列且可根據本發明教示使用。一般而言，基於與鼠類來源框架序列之同源性以及來源及受體抗體之CDR規範結構之分析來選擇人類框架受體序列。然後可使用業內公認技術合成衍生之抗體之重鏈及輕鏈可變區之衍生序列。 舉例而言，CDR移植及人類化抗體以及相關方法闡述於U.S.P.N. 6,180,370及5,693,762中。關於其他詳情，參見例如Jones等人，1986, (PMID: 3713831)；及U.S.P.N. 6,982,321及7,087,409。 CDR移植或人類化抗體可變區與人類受體可變區之序列一致性或同源性可如本文所論述來測定，且在如此量測時將較佳共享至少60%或65%序列一致性，更佳至少70%、75%、80%、85%或90%序列一致性，甚至更佳至少93%、95%、98%或99%序列一致性。較佳地，不同殘基位置因保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」係胺基酸殘基由具有具有相似化學性質(例如，電荷或疏水性)之側鏈(R基團)的另一胺基酸殘基取代者。一般而言，保守胺基酸取代不會實質上改變蛋白質之功能性質。倘若兩個或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同，則可向上調節序列一致性%或相似性程度以校正取代之保守性質。 應瞭解，如附圖7A及7B中所提供之經注釋CDR及框架序列係根據Kabat等人使用專有Abysis資料庫來定義。然而，如本文所論述及圖7G - 7J中所示，熟習此項技術者可容易地根據Chothia等人、ABM或MacCallum等人以及Kabat等人所提供之定義來鑑別CDR。因此，包含一或多個根據上文所提及系統中之任一者衍生而來之CDR之抗TNFRSF21人類化抗體明確保持在本發明之範疇內。 4.2.位點特異性抗體 本發明抗體可經改造以有利於偶聯至細胞毒素或其他抗癌劑(如下文更詳細論述)。就細胞毒素在抗體上之位置及藥物對抗體比率(DAR)而言，抗體藥物偶聯物(ADC)製劑包含ADC分子之均質群體係有利的。基於本發明，熟習此項技術者可容易地製作如本文所述位點特異性改造之構築體。如本文所用，「位點特異性抗體」或「位點特異性構築體」意指抗體、或其免疫反應性片段，其中使重鏈或輕鏈中之至少一個胺基酸缺失、改變或取代(較佳經另一胺基酸)以提供至少一個游離半胱胺酸。相似地，「位點特異性偶聯物」應認為意指包含位點特異性抗體及至少一種偶聯至未成對或游離半胱胺酸之細胞毒素或其他化合物(例如，報導基因分子)之ADC。在某些實施例中，未配對半胱胺酸殘基將包含未成對鏈內半胱胺酸殘基。在其他實施例中，游離半胱胺酸殘基將包含未成對鏈間半胱胺酸殘基。在又一些實施例中，可將游離半胱胺酸改造成抗體之胺基酸序列(例如，在CH3結構域中)。無論如何，位點特異性抗體可屬不同同型，例如IgG、IgE、IgA或IgD；且在彼等類別內，抗體可屬不同子類，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。對於IgG構築體而言，抗體之輕鏈可包含κ或λ同型，其各自納入在所選實施例中可能由於IgG1重鏈中缺少C220殘基而未成對之C214。 因此，除非上下文另外指示，否則如本文所用術語「游離半胱胺酸」或「未配對半胱胺酸」可互換使用且應意指抗體之任何半胱胺酸(或含有硫醇)成份(例如，半胱胺酸殘基)，不管係天然存在或使用分子改造技術在所選殘基位置中特異性納入，其並非生理條件下天然存在(或「天然」)之二硫鍵之部分。在某些所選實施例中，游離半胱胺酸可包含天然存在之半胱胺酸，其天然鏈間或鏈內二硫橋配偶體經取代、消除或以其他方式經改變以破壞生理條件下天然存在之二硫橋，藉此使得未配對半胱胺酸適於位點特異性偶聯。在其他較佳實施例中，游離或未配對半胱胺酸將包含選擇性置於抗體重鏈或輕鏈胺基酸序列內之預定位點之半胱胺酸殘基。應瞭解，在偶聯之前，游離或未配對半胱胺酸可作為硫醇(經還原半胱胺酸)、作為經封端半胱胺酸(經氧化)或端視系統之氧化態作為與相同或不同分子上之另一半胱胺酸或硫醇基團之非天然分子內或分子間二硫鍵之一部分(經氧化)存在。如下文更詳細論述，經適當改造之抗體構築體之輕度還原將提供可用於位點特異性偶聯之硫醇。因此，在尤佳實施例中，游離或未配對半胱胺酸(不管天然存在或納入)將經受選擇性還原及隨後偶聯以提供均質DAR組合物。 應瞭解，預測由所揭示之經改造偶聯物製劑展現之有利性質至少部分在於特異性引導偶聯及在偶聯位置及組合物之絕對DAR值方面大大限制所製作偶聯物的能力。與大部分習用ADC製劑不同，本發明無需完全依賴於抗體之部分或全部還原以提供隨機偶聯位點及相對未受控制之DAR物質生成。相反，在某些態樣中，本發明較佳藉由改造靶向抗體以破壞天然存在(即，「天然」)鏈間或鏈內二硫橋中之一或多者或在任何位置引入半胱胺酸殘基提供一或多個預定未成對(或游離)半胱胺酸位點。為此，應瞭解，在所選實施例中，可使用標準分子改造技術沿著抗體(或其免疫反應性片段)重鏈或輕鏈或其附著之任何地方納入半胱胺酸殘基。在其他較佳實施例中，破壞天然二硫鍵可與引入非天然半胱胺酸(其隨後將包含游離半胱胺酸)組合來實現，其隨後可用作偶聯位點。 在某些實施例中，經改造抗體包含鏈內或鏈間半胱胺酸殘基之至少一個胺基酸缺失或取代。如本文所用「鏈間半胱胺酸殘基」意指參與抗體之輕鏈與重鏈之間或抗體之兩條重鏈之間之天然二硫鍵的半胱胺酸殘基，而「鏈內半胱胺酸殘基」係與同一重鏈或輕鏈中之另一半胱胺酸天然配對者。在一個實施例中，缺失或經取代之鏈間半胱胺酸殘基參與在輕鏈與重鏈之間形成二硫鍵。在另一實施例中，缺失或經取代之半胱胺酸殘基參與兩條重鏈之間之二硫鍵。在典型實施例中，由於抗體之互補結構(其中輕鏈與重鏈之VH及CH1結構域配對且其中一條重鏈之CH2及CH3結構域與互補重鏈之CH2及CH3結構域配對)，輕鏈或重鏈中單一半胱胺酸之突變或缺失將在經改造抗體中產生兩個未配對半胱胺酸殘基。 在一些實施例中，缺失鏈間半胱胺酸殘基。在其他實施例中，鏈間半胱胺酸取代另一胺基酸(例如，天然存在之胺基酸)。舉例而言，胺基酸取代可引起用中性殘基(例如絲胺酸、蘇胺酸或甘胺酸)或親水殘基(例如甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸)替代鏈間半胱胺酸。在所選實施例中，鏈間半胱胺酸經絲胺酸替代。 在本發明涵蓋之一些實施例中，缺失或經取代之半胱胺酸殘基係在輕鏈(κ或λ)上，藉此在重鏈上留下游離半胱胺酸。在其他實施例中，缺失或經取代之半胱胺酸殘基係在重鏈上，從而在輕鏈恆定區上留下游離半胱胺酸。在裝配時，應瞭解，完整抗體之輕鏈或重鏈中之單一半胱胺酸之缺失或取代產生具有兩個未配對半胱胺酸殘基之位點特異性抗體。 在一個實施例中，IgG輕鏈(κ或λ)之位置214之半胱胺酸(C214)缺失或經取代。在另一實施例中，IgG重鏈之位置220之半胱胺酸(C220)缺失或經取代。在其他實施例中，重鏈上位置226或位置229之半胱胺酸缺失或經取代。在一個實施例中，重鏈上之C220經絲胺酸(C220S)取代以在輕鏈中提供期望游離半胱胺酸。在另一實施例中，輕鏈中之C214經絲胺酸(C214S)取代以在重鏈中提供期望游離半胱胺酸。下文實例中更詳細闡述該等位點特異性構築體。相容性位點特異性構築體之概述緊接示於下表2中，其中編號通常係根據如Kabat中所述之Eu索引，WT代表無改變之「野生型」或天然恆定區序列且德爾塔(Δ)命名胺基酸殘基之缺失(例如，C214Δ指示位置214之半胱胺酸殘基缺失)。表 2 與本發明之位點特異性構築體相容之實例性經改造之輕鏈及重鏈恆定區緊接闡述於下文中，其中SEQ ID NO: 3及4分別包含C220S IgG1及C220Δ IgG1重鏈恆定區，SEQ ID NO: 6及7分別包含C214S及C214Δ κ輕鏈恆定區，且SEQ ID NO: 9及10分別包含實例性C214S及C214Δ λ輕鏈恆定區。在每一情形下，經改變或缺失之胺基酸(以及側接殘基)之位點加下劃線。 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 3) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 4) RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES (SEQ ID NO: 6) RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE (SEQ ID NO: 7) QPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTESS (SEQ ID NO: 9) QPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTES (SEQ ID NO: 10) 如上文所論述，重鏈及輕鏈變體中之每一者皆可操作地與所揭示重鏈及輕鏈可變區(或其衍生物，例如人類化或CDR移植構築體)締合以提供如本文中揭示之位點特異性抗TNFRSF21抗體。該等經改造之抗體尤其適用於所揭示之ADC。 關於引入或添加一或多個半胱胺酸殘基以提供游離半胱胺酸(與破壞天然二硫鍵相反)，熟習此項技術者可容易地辨別抗體或抗體片段上之相容位置。因此，在所選實施例中，根據期望DAR、抗體構築體、所選酬載及抗體靶，可在CH1結構域、CH2結構域或CH3結構域或其任一組合中引入半胱胺酸。在其他較佳實施例中，可將半胱胺酸引入κ或λ CL結構域中，且在尤佳實施例中，引入CL結構域之c-末端區中。在每一情形下，可改變、去除或取代半胱胺酸插入位點近端之其他胺基酸殘基以有利於分子穩定性、偶聯效率或在酬載附接後為其提供保護環境。在特定實施例中，經取代殘基在抗體之任何可及位點出現。藉由用半胱胺酸取代該等表面殘基，反應性硫醇基團由此定位於抗體上之容易可及位點且可如本文進一步闡述經選擇性還原。在特定實施例中，經取代殘基在抗體之可及位點出現。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團由此位於抗體之可及位點且可用於選擇性偶聯抗體。在某些實施例中，下列殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)；重鏈之A118 (Eu編號)；及重鏈Fc區之S400 (Eu編號)。其他取代位置及製作相容性位點特異性抗體之方法闡述於U.S.P.N. 7,521,541中，該案件之全文併入本文中。 用於生成如本文中揭示之具有界定位點及載藥量之化學計量之抗體藥物偶聯物的策略廣泛適用於所有抗TNFRSF21抗體，此乃因其主要涉及抗體之保守恆定結構域之改造。由於每一類別及子類之抗體之胺基酸序列及天然二硫橋皆充分記載，故熟習此項技術者可容易地製作各種抗體之經改造構築體而無需過度實驗，且因此，該等構築體明確涵蓋於本發明之範疇內。 4.3.恆定區修飾及改變之醣基化 本發明之所選實施例亦可包含恆定區(即Fc區)之取代或修飾，包括但不限於胺基酸殘基取代、突變及/或修飾，其產生具有包括但不限於以下之特徵之化合物：改變之藥物動力學、延長之血清半衰期、增加之結合親和性、降低之免疫原性、增加之產生、Fc配體與Fc受體(FcR)之改變之結合、增強或降低之ADCC或CDC、改變之醣基化及/或二硫鍵及經修飾之結合特異性。 具有改良Fc效應物功能之化合物可經由(例如)參與Fc結構域與Fc受體(例如，FcγRI、FcγRIIA及B、FcγRIII及FcRn)之間之相互作用之胺基酸殘基變化而生成，該等變化可導致增加之細胞毒性及/或改變之藥物動力學，例如延長之血清半衰期(參見(例如) Ravetch及Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34 (1994)；及de Haas等人，J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)。 在本發明之實施例中，亦可包含恆定區(即Fc區)之取代或修飾，包括但不限於胺基酸殘基取代、突變及/或修飾，其產生具有包括但不限於以下之特徵之化合物：改變之藥物動力學、延長之血清半衰期、增加之結合親和性、降低之免疫原性、增加之產生、Fc配體與Fc受體(FcR)之改變之結合、增強或降低之ADCC或CDC、改變之醣基化及/或二硫鍵及經修飾之結合特異性。 具有改良Fc效應物功能之化合物可經由(例如)參與Fc結構域與Fc受體(例如，FcγRI、FcγRIIA及B、FcγRIII及FcRn)之間之相互作用之胺基酸殘基變化而生成，該等變化可導致增加之細胞毒性及/或改變之藥物動力學，例如延長之血清半衰期(參見(例如) Ravetch及Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34 (1994)；及de Haas等人，J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)。 在某些實施例中，包含N297A突變(稱為「MJ突變」)之變體可經構築以改良所揭示抗體之性質。為此，可向TNFRSF21抗體中引入N297A突變(EU編號)以降低抗體及ADC與Fc受體之結合，據信其係脫靶毒性之來源。 在所選實施例中，可藉由修飾(例如，取代、缺失或添加)鑑別為參與Fc結構域與FcRn受體之間之相互作用之胺基酸殘基來生成具有延長之活體內半衰期之抗體(例如，參見國際公開案第WO 97/34631號；第WO 04/029207號；U.S.P.N. 6,737,056及U.S.P.N. 2003/0190311)。關於該等實施例，Fc變體可在哺乳動物(較佳人類)中提供大於5天、大於10天、大於15天、較佳大於20天、大於25天、大於30天、大於35天、大於40天、大於45天、大於2個月、大於3個月、大於4個月或大於5個月之半衰期。延長之半衰期產生較高血清效價，其由此降低抗體之投與頻率及/或降低欲投與之抗體之濃度。可在(例如)表現人類FcRn之轉基因小鼠或經轉染人類細胞系中或在投與具有變體Fc區之多肽之靈長類動物中分析人類FcRn高親和力結合多肽之與人類FcRn之活體內結合及血清半衰期。WO 2000/42072闡述具有改良或減小之與FcRn之結合的抗體變體。亦參見(例如) Shields等人，J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)。 在其他實施例中，Fc改變可導致增強或降低之ADCC或CDC活性。如業內所知，CDC係指在補體存在下靶細胞之溶解，且ADCC係指細胞毒性之形式，其中結合至某些細胞毒性細胞(例如，天然存在殺手細胞、嗜中性球及巨噬細胞)上存在之FcR上之所分泌Ig使得該等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合至帶有抗原之靶細胞且隨後用細胞毒素殺死靶細胞。在本發明之上下文中，提供具有「改變之」FcR結合親和性之抗體變體，與親代或未經修飾之抗體或包含天然序列FcR之抗體相比，其係增強或減小之結合。展現減小之結合之該等變體可具有極小或不可觀察之結合，例如與天然序列相比，0-與FcR之20%結合，例如如藉由業內熟知之技術所測定。在其他實施例中，與天然免疫球蛋白Fc結構域相比，變體將展現增強之結合。應瞭解，該等類型之Fc變體可有利地用於增強所揭示抗體之有效抗贅瘤性性質。在其他實施例中，該等改變導致增加之結合親和性、降低之免疫原性、增加之產生、改變之醣基化及/或二硫鍵(例如，對於偶聯位點)、經修飾之結合特異性、增加之吞噬作用；及/或細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)之下調等。 又一些實施例包含一或多種經改造之糖型，例如包含改變之醣基化模式或改變之碳水化合物組合物(其共價附接至蛋白質(例如，在Fc結構域中))之位點特異性抗體。參見(例如) Shields, R. L.等人 (2002)J. Biol. Chem. 277:26733-26740。經改造之糖型可用於各種目的，包括但不限於增強或降低效應物功能、增加抗體對靶標之親和力或有利於抗體之產生。在期望降低之效應物功能之某些實施例中，分子可經改造以表現無醣基化形式。眾所周知消除一或多個可變區框架醣基化位點以藉此消除該位點之醣基化之取代(參見例如U.S.P.N. 5,714,350及6,350,861)。相反，可藉由在一或多個其他醣基化位點中進行改造賦予含有Fc之分子增強之效應物功能或改良之結合。 其他實施例包括具有改變之醣基化組成之Fc變體，例如具有減少量之岩藻糖基殘基之低岩藻糖基化抗體或具有增加之平分型GlcNAc結構之抗體。已展現，該等改變之糖基化模式增加抗體之ADCC能力。經改造之糖型可藉由熟習此項技術者已知之任何方法、例如藉由使用經改造或變體表現菌株、藉由與一或多種酶(例如N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶III(GnTIII))共表現、藉由在各種生物體或來自各種生物體之細胞系中表現包含Fc區之分子或藉由在包含Fc區之分子表現後修飾碳水化合物來生成(參見(例如) WO 2012/117002)。 4.4.片段 無論選擇哪種形式之抗體(例如嵌合、人類化等)來實踐本發明，應瞭解，根據本文教示，可使用其免疫反應性片段自身或作為抗體藥物偶聯物之部分。「抗體片段」包含完整抗體之至少一部分。如本文所用術語抗體分子之「片段」包括抗體之抗原結合片段，且術語「抗原結合片段」係指與所選抗原或其免疫原性決定子免疫特異性結合或反應或與衍生片段之完整抗體競爭特異性抗原結合的免疫球蛋白或抗體之多肽片段。 實例性位點特異性片段包括：可變輕鏈片段(VL)、可變重鏈片段(VH)、scFv、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、單一結構域抗體片段、雙價抗體、線性抗體、單鏈抗體分子及自抗體片段形成之多特異性抗體。另外，活性位點特異性片段包含抗體中保留其與抗原/受質或受體相互作用並以與完整抗體相似之方式對其進行修飾(但可能效率稍微較低)的能力之部分。該等抗體片段可進一步經改造以包含一或多個如本文所述游離半胱胺酸。 在其他實施例中，抗體片段係包含Fc區且保留通常與存在於完整抗體中之Fc區相關之生物學功能中之至少一者(例如FcRn結合、抗體半衰期調節、ADCC功能及補體結合)者。在一個實施例中，抗體片段係活體內半衰期實質上與完整抗體相似之單價抗體。舉例而言，此一抗體片段可包含連接至包含至少一個游離半胱胺酸且能賦予片段活體內穩定性之Fc序列的抗原結合臂。 如彼等熟習此項技術者將容易地認識到，片段可藉由分子改造或經由完整或完全抗體或抗體鏈之化學或酶促處理(例如木瓜酶或胃蛋白酶)或藉由重組方式來獲得。關於抗體片段之更詳細說明，參見例如Fundamental Immunology, W. E. Paul編輯，Raven Press, N.Y. (1999)。 4.5.多價構築體 在其他實施例中，本發明之抗體及偶聯物可為單價或多價(例如，二價、三價等)。如本文所用術語「化合價」係指與抗體締合之潛在靶結合位點之數目。每一靶結合位點特異性結合一個靶分子或靶分子上之特異性位置或基因座或表位。在抗體係單價時，分子之每一結合位點將特異性結合至單一抗原位置或表位。在抗體包含一個以上靶結合位點(多價)時，每一靶結合位點可特異性結合相同或不同分子(例如，可結合至不同配體或不同抗原、或相同抗原上之不同表位或位置)。參見(例如) U.S.P.N. 2009/0130105。 在一個實施例中，抗體係雙特異性抗體，其中雙鏈具有不同特異性，如Millstein等人，1983,Nature , 305:537-539及WO 2014/124326中所述。其他實施例包括具有另外特異性之抗體，例如三特異性抗體。其他更複雜之相容性多特異性構築體及其製作方法闡述於以下中：U.S.P.N. 2009/0155255、以及WO 94/04690；Suresh等人，1986,Methods in Enzymology , 121:210；及WO96/27011。 多價抗體可免疫特異性結合至期望靶分子之不同表位或可免疫特異性結合至靶分子以及異源表位，例如異源多肽或固體載體材料。儘管所選實施例可僅結合兩種抗原(即雙特異性抗體)，本發明亦涵蓋具有另外特異性之抗體(例如三特異性抗體)。雙特異性抗體亦包括交聯或「異偶聯物」抗體。舉例而言，異偶聯物中之抗體之一可偶合至抗生物素蛋白，其他偶合至生物素。例如，已提出該等抗體將免疫系統細胞靶向不期望之細胞(U.S.P.N. 4,676,980)，且用於治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。異偶聯物抗體可使用任何方便之交聯方法來製得。適宜交聯劑為業內熟知，且與多種交聯技術一起揭示於U.S.P.N. 4,676,980中。 5.抗體之重組體產生 抗體及其片段可使用自產生抗體之細胞獲得之遺傳物質及重組體技術來產生或修飾(參見例如Dubel及Reichert (編輯) (2014)Handbook of Therapeutic Antibodies , 第2版, Wiley-Blackwell GmbH；Sambrook及Russell (編輯) (2000)Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版), NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel等人 (2002)Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology , Wiley, John & Sons, Inc.；及U.S.P.N. 7,709,611)。 本發明之另一態樣係關於編碼本發明之抗體之核酸分子。該等核酸可存在於完整細胞中，存在於細胞溶解物中，或以部分純化或實質上純之形式存在。當藉由標準技術(包括鹼/SDS處理、CsCl顯帶、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及業內所熟知之其他技術)將核酸與其他細胞組份或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)分離時，該核酸「經分離」或使其實質上純的。本發明之核酸可係例如 DNA (例如基因組DNA、cDNA)、RNA及其人工變體(例如肽核酸)，無論係單鏈或雙鏈或RNA、RNA及可含有或可不含有內含子。在所選實施例中，核酸係cDNA分子。 本發明之核酸可使用標準分子生物學技術獲得。對於由雜交瘤(例如，如下文實例中所述製備之雜交瘤)表現之抗體，可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術獲得編碼抗體之輕鏈及重鏈之cDNA。對於自免疫球蛋白基因文庫(例如使用噬菌體展示技術)獲得之抗體，可自該文庫回收編碼該抗體之核酸分子。 可藉由標準重組DNA技術進一步操縱編碼VH及VL區段之DNA片段，以例如將可變區基因轉換成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在該等操縱中，編碼VL或VH之DNA片段可操作地連接至編碼另一蛋白質之另一DNA片段，例如抗體恆定區或撓性連接體。如在此上下文中所使用之術語「可操作地連接」意指接合兩個DNA片段，使得由該兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保留在框內。 可藉由將編碼VH之DNA可操作地連接至編碼重鏈恆定區(在IgG1之情形下，CH1、CH2及CH3)之另一DNA分子，將編碼VH區之經分離DNA轉換成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為業內已知(例如，參見Kabat等人 (1991) (見上文 ))且涵蓋該等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳係IgG1或IgG4恆定區。實例性IgG1恆定區闡述於SEQ ID NO: 2中。對於Fab片段重鏈基因，編碼VH之DNA可操作地連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。 可藉由將編碼VL之DNA可操作地連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子，將編碼VL區之經分離DNA轉化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列為業內已知(例如，參見Kabat等人 (1991) (見上文 ))且涵蓋該等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可係κ或λ恆定區，但最佳係κ恆定區。實例性相容κ性輕鏈恆定區闡述於SEQ ID NO: 5中，而實例性相容性λ輕鏈恆定區闡述於SEQ ID NO: 8中。 在每一情形下，VH或VL結構域可操作連接至其各別恆定區(CH或CL)，其中恆定區係位點特異性恆定區且提供位點特異性抗體。在所選實施例中，所得位點特異性抗體將在重鏈上包含兩個未配對半胱胺酸，而在其他實施例中，位點特異性抗體將CL結構域在中包含兩個未配對半胱胺酸。 本文涵蓋展現與本發明多肽之「序列一致性」、「序列相似性」或「序列同源性」之某些多肽(例如抗原或抗體)。舉例而言，衍生之人類化抗體VH或VL結構域可展現與來源(例如，鼠類)或受體(例如，人類) VH或VL結構域之序列相似性。「同源」多肽可展現65%、70%、75%、80%、85%或90%序列一致性。在其他實施例中，「同源」多肽可展現93%、95%或98%序列一致性。如本文所用，兩個胺基酸序列之間之同源性%等效於兩個序列之間之一致性%。兩個序列之間之一致性%隨該等序列共有之一致位置數而變化(即同源性% = 一致位置數/總位置數乘以100)，考慮為達成兩個序列最佳比對而需要引入之缺口數及各缺口長度。兩個序列之間之序列比較及一致性%測定可使用數學算法來完成，如下文非限制性實例中所述。 兩個胺基酸序列之間之一致性%可使用已納入ALIGN程式(2.0版)中之E. Meyers及W. Miller之演算法(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))、使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4來測定。另外，兩個胺基酸序列之間之一致性%可使用已納入GCG軟體包(在www.gcg.com上獲得)中之GAP程式中之Needleman及Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))演算法、使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣及空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6來測定。 另外或另一選擇為，本發明之蛋白質序列可進一步用作「詢問序列」來實施針對公共資料庫之檢索，以例如鑑別相關序列。該等檢索可使用Altschul等人 (1990)J. Mol. Biol. 215:403-10之XBLAST程式(2.0版)來實施。BLAST蛋白質檢索可利用XBLAST程式、評分=50、字長=3來實施以獲得與本發明抗體分子同源之胺基酸序列。為獲得空位比對用於比較目的，可如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402中所述使用空位BLAST。當使用BLAST及空位BLAST程式時，可使用各別程式(例如XBLAST及NBLAST)之缺省參數。 不一致之殘基位置可因保守胺基酸取代或不保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」係其中胺基酸殘基經具有相似化學性質(例如電荷或疏水性)之側鏈之另一胺基酸殘基取代者。一般而言，保守胺基酸取代不會實質上改變蛋白質之功能性質。倘若兩個或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同，則可向上調節序列一致性%或相似性程度以校正取代之保守性質。倘若用不保守胺基酸取代，在實施例中，展現序列一致性之多肽將保留本發明多肽(例如抗體)之期望功能或活性。 本文亦涵蓋展現與本發明核酸之「序列一致性」、「序列相似性」或「序列同源性」之核酸。「同源序列」意指展現至少約65%、70%、75%、80%、85%或90%序列一致性之核酸分子序列。在其他實施例中，核酸之「同源序列」可展現與參考核酸93%、95%或98%之序列一致性。 本發明亦提供包含上述該等核酸之載體，該等核酸可操作連接至啟動子(例如，參見WO 86/05807；WO 89/01036；及U.S.P.N. 5,122,464)；及真核分泌路徑之其他轉錄調節及處理控制元件。本發明亦提供具有彼等載體及宿主表現系統之宿主細胞。 如本文所用術語「宿主表現系統」包括任何種類之系統，其可經改造以生成本發明之核酸或多肽及抗體。該等宿主表現系統包括(但不限於)經重組體噬菌體DNA或質體DNA轉變或轉染之微生物(例如，大腸桿菌(E. coli )或枯草芽孢桿菌(B. subtilis ))；經重組體酵母表現載體轉染之酵母(例如，酵母菌數(Saccharomyces ))；或具有含有源自哺乳動物細胞或病毒之基因體之啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子)之重組體表現構築體的哺乳動物細胞(例如，COS、CHO-S、HEK293T、3T3細胞)。宿主細胞可經兩種表現載體共轉染，例如，第一載體編碼重鏈衍生之多肽且第二載體編碼輕鏈衍生之多肽。 轉變哺乳動物細胞之方法為業內所熟知。參見(例如) U.S.P.N. 4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455。宿主細胞亦可經改造以容許產生具有各種特徵(例如經修飾糖型或具有GnTIII活性之蛋白質)之抗原結合分子。 對於重組體蛋白之長期、高產率產生而言，穩定表現較佳。因此，穩定表現所選抗體之細胞系可使用標準業內公認之技術經改造且構成本發明之部分。不使用含有病毒複製起點之表現載體，可利用由適當表現控制元件(例如，啟動子或增強子序列、轉錄終止子、多聚腺苷酸化位點等)控制之DNA及可選標記物轉變宿主細胞， 可使用業內熟知之選擇系統中之任一者，包括麩醯胺酸合成酶基因表現系統(GS系統)，其提供在所選條件下增強表現之有效方法。完全或部分結合EP 0 216 846、EP 0 256 055、EP 0 323 997及EP 0 338 841及U.S.P.N. 5,591,639及5,879,936論述GS系統。用於形成穩定細胞系之另一相容性表現系統係Freedom™ CHO-S Kit (Life Technologies)。 一旦本發明抗體已藉由重組表現或任一其他所揭示技術產生，即可藉由業內已知之方法對其進行純化或分離，就此而言其可經鑑別及自其天然環境分離及/或回收並分離可干擾抗體或相關ADC之診斷或治療用途之污染物。經分離之抗體包括重組細胞內之原位抗體。 可使用各種業內公認之技術(例如離子交換及粒徑篩析層析、透析、滲濾及親和層析，特定而言蛋白質A或蛋白質G親和層析)純化該等分離之製劑。相容性方法更完全論述於下文實例中。 6.產生後選擇 不管如何獲得，抗體產生細胞(例如，雜交瘤、酵母群落等)皆可針對合意的特徵(包括例如穩健生長、高抗體產生及合意的抗體特徵，例如對所關注抗原之高親和力)經選擇、選殖並進一步經篩選。雜交瘤可在細胞培養物中進行活體外擴增或在同基因免疫受損動物中進行活體內擴增。選擇、選殖及擴增雜交瘤及/或群落之方法為彼等熟習此項技術者已知。一旦鑑別出期望抗體，可使用常用業內公認分子生物學及生物化學技術分離、操縱及表現相關遺傳物質。 由未經處理之文庫(天然或合成)產生之抗體可具有中等親和力(Ka 為約106 M-1 至107 M-1 )。為增強親和力，可藉由構築抗體文庫(例如，藉由使用易錯聚合酶在活體外引入隨機突變)及自彼等二級文庫重新選擇對抗原具有高親和力之抗體(例如藉由使用噬菌體或酵母展示)在活體外模擬親和力成熟。WO 9607754闡述在免疫球蛋白輕鏈之CDR中誘導誘變以產生輕鏈基因文庫之方法。 可使用多種技術來選擇抗體，包括(但不限於)噬菌體或酵母展示，其中在噬菌體或酵母上合成人類組合抗體或scFv片段之文庫，用所關注抗原或其抗體結合部分篩選該文庫，並自可獲得抗體或免疫反應性片段者分離結合該抗原之噬菌體或酵母(Vaughan等人，1996, PMID: 9630891；Sheets等人，1998, PMID: 9600934；Boder等人，1997, PMID: 9181578；Pepper等人，2008, PMID: 18336206)。用於產生噬菌體或酵母展示文庫之套組在市面上有售。業內亦存在可用於生成及篩選抗體展示文庫之其他方法及試劑(參見U.S.P.N. 5,223,409；WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；及Barbas等人，1991, PMID: 1896445)。該等技術有利地容許篩選大量候選抗體且提供序列之相對較容易的操縱(例如藉由重組體改組)。 Ⅳ.抗體之特徵 在某些實施例中，可針對有利性質(包括例如穩健生長、高抗體產生及如下文更詳細論述之合意的位點特異性抗體特徵)選擇、選殖並進一步篩選抗體產生細胞(例如，雜交瘤、酵母群落等)。在其他情形下，可藉由選擇用於接種動物之特定抗原(例如特異性TNFRSF21亞型)或靶抗原之免疫反應性片段來賦予抗體之特徵。在其他實施例中，所選抗體可如上文所述經改造以增強或細化諸如親和力或藥物動力學等免疫化學特徵。 A.中和抗體 在所選實施例中，本發明抗體可為「拮抗劑」或「中和」抗體，此意味著抗體可與決定子締合且直接或藉由防止決定子與結合配偶體(例如配體或受體)締合來阻斷或抑制該決定子之活性，藉此干擾原本可自分子之相互作用產生之生物反應。在過量抗體將結合至決定子之結合配偶體之量減少至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多(如藉由例如靶分子活性或在活體外競爭性結合分析中所量測)時，中和或拮抗劑抗體將實質上抑制決定子與其配體或受質之結合。應瞭解，經修飾之活性可使用業內公認之技術直接量測或可藉由改變之活性對下游之影響(例如，腫瘤形成或細胞存活)來量測。 B.內化抗體 在某些實施例中，抗體可包含內化抗體，使得抗體將結合至決定子且將內化(與任何偶聯醫藥活性部分一起)至所選靶細胞(包括致瘤細胞)中。內化之抗體分子之數目可足以殺死抗原表現細胞，尤其抗原表現致瘤細胞。端視抗體或在一些情況下抗體藥物偶聯物之功效而定，單一抗體攝取至細胞中可足以殺死抗體結合之靶細胞。關於本發明，有證據表明，表現TNFRSF21蛋白之一大部分仍與致瘤細胞表面締合，藉此容許定位及內化所揭示抗體或ADC。在所選實施例中，該等抗體將與在內化後殺死細胞之一或多種藥物締合或偶聯。在一些實施例中，本發明之ADC將包含內化位點特異性ADC。 如本文所用，「內化」之抗體係在結合至締合決定子後由靶細胞攝取(與任何偶聯之細胞毒素一起)者。該等內化ADC之數目將較佳足以殺死決定子表現細胞，尤其決定子表現癌症幹細胞。端視細胞毒素或ADC整體之功效而定，在一些情況下，幾個抗體分子攝取至細胞中足以殺死抗體結合之靶細胞。舉例而言，某些藥物(例如PBD或卡奇黴素(calicheamicin))如此強效以致於偶聯至抗體之幾個毒素分子之內化足以殺死靶細胞。可藉由各種業內公認之分析(例如，肥皂草毒素分析，例如Mab-Zap及Fab-Zap；Advanced Targeting Systems) (包括下文實例中所述之彼等)確定抗體在結合至哺乳動物細胞後是否內化。檢測抗體是否內化至細胞中之方法亦闡述於U.S.P.N. 7,619,068中。 C.消耗抗體 在其他實施例中，本發明抗體係消耗抗體。術語「消耗」抗體係指較佳結合至細胞表面上或附近之抗原且誘導、促進或引起細胞死亡(例如，藉由CDC、ADCC或細胞毒性劑之引入)之抗體。在實施例中，所選消耗抗體將偶聯至細胞毒素。 較佳地，消耗抗體將能夠殺死界定細胞群體中之至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或99%之TNFRSF21表現細胞。如本文所用術語「表觀IC50」係指連接至毒素之一級抗體殺死50%表現由一級抗體識別之抗原之細胞的濃度。毒素可直接偶聯至一級抗體，或可經由識別一級抗體之二級抗體或抗體片段與一級抗體締合，且該二級抗體或抗體片段直接偶聯至毒素。較佳地，消耗抗體之IC50為小於5 mM、小於1 mM、小於100 nM、小於50 nM、小於30 nM、小於20 nM、小於10 nM、小於5 nM、小於2 nM或小於1 nM。在一些實施例中，細胞群體可包含富集、經切片、純化或分離之致瘤細胞，包括癌症幹細胞。在其他實施例中，細胞群體可包含全腫瘤樣品或包含癌症幹細胞之異質腫瘤萃取物。可根據本文教示使用標準生物化學技術以監測並量化致瘤細胞之消耗。 D.結合親和性 本文揭示對特定決定子(例如TNFRSF21)具有高結合親和力之抗體。術語「KD 」係指特定抗體-抗原相互作用之解離常數或表觀親和力。在解離常數KD (koff /kon )係≤ 10-7 M時，本發明抗體可免疫特異性結合其靶抗原。在KD 係≤ 5×10-9 M時，抗體以高親和力特異性結合抗原，且在KD 係≤ 5×10-10 M時以極高親和力特異性結合抗原。在本發明之一個實施例中，抗體之KD 為≤ 10-9 M且裂解速率為約1×10-4 /sec。在本發明之一個實施例中，裂解速率係＜ 1x10-5 /sec。在本發明之其他實施例中，抗體將以介於約10-7 M與10-10 M之間之KD 結合至決定子，且在又一實施例中，其將以KD ≤ 2×10-10 M結合。本發明之又一些所選實施例包含具有以下KD (koff /kon )之抗體：小於10-6 M、小於5×10-6 M、小於10-7 M、小於5×10-7 M、小於10-8 M、小於5×10-8 M、小於10-9 M、小於5×10-9 M、小於10-10 M、小於5×10-10 M、小於10-11 M、小於5×10-11 M、小於10-12 M、小於5×10-12 M、小於10-13 M、小於5×10-13 M、小於10-14 M、小於5×10-14 M、小於10-15 M或小於5×10-15 M。 在某些實施例中，免疫特異性結合至決定子(例如TNFRSF21)之本發明抗體可具有至少105 M-1 s-1 、至少2×105 M-1 s-1 、至少5×105 M-1 s-1 、至少106 M-1 s-1 、至少5×106 M-1 s-1 、至少107 M-1 s-1 、至少5×107 M-1 s-1 或至少108 M-1 s-1 之裂解速率常數或kon (或ka) 速率(抗體 + 抗原(Ag)k on ←抗體-Ag)。 在另一實施例中，免疫特異性結合至決定子(例如TNFRSF21)之本發明抗體可具有小於10-1 s-1 、小於5×10-1 s-1 、小於10-2 s-1 、小於5×10-2 s-1 、小於10-3 s-1 、小於5×10-3 s-1 、小於10-4 s-1 、小於5×104 s-1 、小於10-5 s-1 、小於5×10-5 s-1 、小於10-6 s-1 、小於5×10-6 s-1 、小於10-7 s-1 、小於5×10-7 s-1 、小於10-8 s-1 、小於5×10-8 s-1 、小於10-9 s-1 、小於5×10-9 s-1 或小於10-10 s-1 之裂解速率常數或koff (或kd) 速率(抗體 + 抗原(Ag)k off ←抗體-Ag)。 結合親和力可使用業內已知之各種技術來測定，例如表面電漿子共振、生物層干涉術、雙極化干涉術、靜態光散射、動態光散射、等溫滴定量熱法、ELISA、分析超速離心及流式細胞術。 E.分倉及表位定位 本文揭示之抗體可在與其締合之離散表位方面進行表徵。「表位」係抗體或免疫反應性片段特異性結合之決定子之部分。可基於如上文所述結合親和性或藉由蛋白質及/或巨分子之複雜混合物中之其靶抗原之抗體優先識別(例如在競爭分析中)來確認及定義免疫特異性結合。「線性表位」係由抗原中容許抗體之免疫特異性結合之鄰接胺基酸形成。即使在抗原變性時，通常亦維持優先結合線性表位之能力。相反，「構象表位」通常包含抗原之胺基酸序列中之非鄰接胺基酸，但在抗原之二級、三級或四級結構之上下文中，足夠靠近以同時由單一抗體結合。在具有構象表位之抗原變性時，抗體通常不再識別抗原。表位(鄰接或非鄰接)通常包括至少3個、且更通常至少5個或8-10個或12-20個呈獨特空間構象之胺基酸。 亦可在本發明抗體屬之組或「倉」方面對本發明抗體進行表徵。「分倉」係指使用競爭性抗體結合分析以鑑別不能同時結合免疫原性決定子之抗體對，藉此鑑別「競爭」結合之抗體。競爭抗體可藉由所測試之抗體或免疫功能片段防止或抑制參考抗體與共用抗原特異性結合之分析來測定。通常，此一分析涉及使用結合至固體表面或細胞之經純化抗原(例如TNFRSF21或其結構域或片段)、未經標記之測試抗體及經標記參考抗體。藉由測定在測試抗體存在下結合至固體表面或細胞之標記之量來量測競爭性抑制。關於測定競爭性結合之方法之其他細節提供於本文實例中。通常，在存在過量競爭性抗體時，其將抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%的參考抗體與共用抗原之特異性結合。在一些情況下，抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多之結合。相反，當結合參考抗體時，其較佳將抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%的隨後添加之測試抗體(即，TNFRSF21抗體)之結合。在一些情況下，抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多之測試抗體之結合。 通常，分倉或競爭性結合可使用多種業內公認技術來測定，例如免疫分析，例如西方墨點(western blot)、放射性免疫分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、「夾心式」免疫分析、免疫沈澱分析、沈澱素反應、凝膠擴散沈澱素反應、免疫擴散分析、凝集分析、補體固定分析、免疫放射量測定分析、螢光免疫分析及蛋白質A免疫分析。該等免疫分析係常規的且為業內所熟知(參見Ausubel等人編輯(1994)Current Protocols in Molecular Biology ，第1卷，John Wiley & Sons, Inc.，New York)。另外，可使用交叉阻斷分析(參見(例如) WO 2003/48731；及Harlow等人 (1988)Antibodies, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及David Lane)。 用於測定競爭性抑制(且因此「倉」)之其他技術包括：表面電漿子共振，其使用例如BIAcore™ 2000系統(GE Healthcare)；生物層干涉術，其使用例如ForteBio® Octet RED (ForteBio)；或流式細胞術珠陣列，其使用例如FACSCanto II (BD Biosciences)或多樣性LUMINEX™檢測分析(Luminex)。 Luminex係使得能夠進行大規模多樣性抗體配對之基於珠之免疫分析平臺。該分析比較抗體對與靶抗原之同時結合模式。該對之一種抗體(捕獲mAb)結合至Luminex珠，其中每一捕獲mAb結合至不同顏色之珠。另一抗體(檢測mAb)結合至螢光信號(例如藻紅素(PE))。該分析分析抗體與抗原之同時結合(配對)且將具有相似配對特徵之抗體分組在一起。檢測mAb及捕獲mAb之相似特徵指示兩種抗體結合至相同或緊密相關之表位。在一個實施例中，配對特徵可使用皮爾森相關係數(Pearson correlation coefficient)以鑑別與測試抗體組上之任何特定抗體最緊密相關之抗體。在實施例中，若抗體對之皮爾森相關係數為至少0.9，則測試/檢測mAb經測定與參考/捕獲mAb在同一倉中。在其他實施例中，皮爾森相關係數為至少0.8、0.85、0.87或0.89。在其他實施例中，皮爾森相關係數為至少0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1。分析自Luminex分析獲得之數據之其他方法闡述於U.S.P.N. 8,568,992中。Luminex同時分析100種不同類型之珠(或更多)之能力提供幾乎無限的抗原及/或抗體表面，從而在抗體表位剖析中產生相對於生物感測器分析改良之通量及解析度(Miller等人，2011, PMID: 21223970)。 相似地，包含表面電漿共振之分倉技術與本發明相容。如本文所用「表面電漿子共振」係指容許藉由檢測生物感測器基質內蛋白質濃度之變化分析實時特異性相互作用之光學現象。使用諸如BIAcore™ 2000系統等市售設備，可容易地確定所選抗體是否彼此競爭結合至界定抗原。 在其他實施例中，可用於確定測試抗體是否與參考抗體「競爭」結合之技術係「生物層干涉術」，其係一種分析自以下兩個表面反射之白光之干涉圖案的光學分析技術：固定在生物感測器尖端上之蛋白質層及內部參考層。結合至生物感測器尖端之分子之任何數量變化使可實時量測之干涉圖案發生移位。該等生物層干涉術分析可使用ForteBio® Octet RED機器如下實施。將參考抗體(Ab1)捕獲至抗小鼠捕獲晶片上，然後使用高濃度之非結合抗體封阻晶片且收集基線。然後藉由特異性抗體(Ab1)捕獲單體重組體靶蛋白，且將尖端浸至含有與對照相同之抗體(Ab1)之孔中或浸至含有不同測試抗體(Ab2)之孔中。若如藉由比較與對照Ab1之結合量所測定未發生進一步結合，則Ab1及Ab2經測定為「競爭性」抗體。若利用Ab2觀察到另外結合，則Ab1及Ab2經測定不彼此競爭。可擴大此過程以使用96孔板中代表獨特倉之一整列抗體篩選獨特抗體之大文庫。在實施例中，若參考抗體抑制至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%的測試抗體與共用抗原之特異性結合，則測試抗體將與參考抗體競爭。在其他實施例中，將抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多之結合。 在定義涵蓋一組競爭性抗體之倉後，可立即實施進一步表徵以確定抗原上抗體組所結合之特異性結構域或表位。可使用Cochran等人，2004, PMID: 15099763所述方案之修改形式實施結構域層級表位定位。精細表位定位係確定抗原上包含抗體所結合之決定子表位之特定胺基酸的過程。 在某些實施例中，精細表位定位可使用噬菌體或酵母展示來實施。其他相容性表位定位技術包括丙胺酸掃描突變體、肽墨點(Reineke, 2004, PMID: 14970513)或肽裂解分析。另外，可採用諸如抗原之表位切除、表位萃取及化學修飾等方法(Tomer, 2000, PMID: 10752610)，其使用酶，例如蛋白水解酶(例如、胰蛋白酶、內蛋白酶Glu-C、內蛋白酶Asp-N、胰凝乳蛋白酶等)；化學試劑、例如琥珀醯亞胺基酯及其衍生物、含有一級胺之化合物、肼及碳肼、游離胺基酸等。在另一實施例中，可使用修飾輔助之剖析(亦稱為基於抗原結構之抗體剖析(ASAP))根據每一抗體之結合特徵與經化學或酶修飾之抗原表面之相似性以分類大量針對相同抗原之單株抗體(U.S.P.N. 2004/0101920)。 在確定抗原上之期望表位後，可立即例如藉由使用本文所述技術用包含所選表位之肽免疫來生成針對該表位之其他抗體。 V.抗體偶聯物 在一些實施例中，可使本發明抗體與醫藥活性或診斷部分偶聯以形成「抗體藥物偶聯物」 (ADC)或「抗體偶聯物」。術語「偶聯物」係廣泛使用且意指任何醫藥活性或診斷部分與本發明抗體之共價或非共價締合，而與締合方法無關。在某些實施例中，締合係經由抗體之離胺酸或半胱胺酸殘基來實現。在一些實施例中，醫藥活性或診斷部分可經由一或多個位點特異性游離半胱胺酸偶聯至抗體。所揭示之ADC可用於治療及診斷目的。 應瞭解，本發明之ADC可用於選擇性遞送預定彈頭至靶位置(例如，致瘤細胞及/或表現TNFRSF21之細胞)。如本文所述，術語「藥物」或「彈頭」可互換使用且將意指在引入個體時具有生理效應或報導基因功能之任何生物活性(例如，醫藥活性化合物或治療性部分)或可檢測分子或化合物。為避免產生疑問，該等彈頭包括如下文所述抗癌劑或細胞毒素。「酬載」可包含與可選連接體化合物(例如，治療性酬載)組合之藥物或彈頭，其較佳提供相對穩定之醫藥複合物直至ADC到達靶標。舉例而言，偶聯物上之彈頭或藥物可包含肽、蛋白質或在活體內代謝成活性劑之前藥、聚合物、核酸分子、小分子、結合劑、模擬劑、合成藥物、無機分子、有機分子及放射性同位素。在某些實施例中，藥物或彈頭將經由連接體共價偶聯至抗體。在其他實施例中，(例如，放射性同位素)藥物或彈頭將直接偶聯至或納入抗體中。 在較佳實施例中，所揭示之ADC將結合之酬載(例如，藥物連接體)在釋放及活化彈頭(例如，奧裡斯他汀、尾海兔素、卡奇黴素、PBD等)之前以相對未反應、非毒性狀態引導至靶位點。彈頭之此靶向釋放較佳係經由酬載之穩定偶聯(例如，經由抗體上之一或多個半胱胺酸或離胺酸)及最小化過偶聯毒性ADC物質之ADC製劑之相對均質組合物來達成。加上經設計以在遞送至腫瘤位點後大大釋放彈頭之藥物連接體，本發明之偶聯物可實質上降低不期望非特異性毒性。此有利地在腫瘤位點提供相對高含量之活性細胞毒素，同時最小化非靶向細胞及組織之暴露，藉此提供增強之治療指數。 應瞭解，儘管本發明之一些實施例包含納入治療性部分(例如，細胞毒素)之酬載，但納入診斷劑及生物相容性改質劑之其他酬載可受益於由所揭示偶聯物提供之靶向遞送。因此，除非上下文另外指示，否則針對實例性治療性酬載之任何揭示內容亦適於如本文所論述之包含診斷劑或生物相容性改質劑之酬載。所選酬載可共價或非共價連接至抗體且至少部分根據用於實現偶聯之方法，展現不同化學計量莫耳濃度比。 本發明之偶聯物通常可由下式代表： Ab-[L-D]n或其醫藥上可接受之鹽，其中： a) Ab包含抗TNFRSF21抗體； b) L包含可選連接體； c) D包含藥物；且 d) n係約1至約20之整數。 熟習此項技術者應瞭解，根據上文所提及之式之偶聯物可使用多種不同連接體及藥物來製作且偶聯方法將根據組份之選擇而變化。因此，與所揭示抗體之反應性殘基(例如，半胱胺酸或離胺酸)締合之任何藥物或藥物連接體化合物皆與本文教示相容。相似地，容許所選藥物與抗體偶聯(包括位點特異性偶聯)之任何反應條件皆在本發明之範疇內。儘管上文所述，但本發明之一些較佳實施例包含使用穩定劑與如本文所述輕度還原劑之組合選擇性偶聯藥物或藥物連接體與游離半胱胺酸。該等反應條件往往提供具有較少非特異性偶聯及污染物及相應地較小毒性之均質製劑。 A.彈頭 1.治療劑 如本文所論述，本發明抗體可與任何醫藥活性化合物偶聯、連接或融合或以其他方式締合，該醫藥活性化合物包含治療性部分或藥物，例如抗癌劑，包括(但不限於)細胞毒性劑(或細胞毒素)、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減積劑、化學治療劑、放射性治療劑、靶向抗癌劑、生物反應改質劑、癌症疫苗、細胞介素、激素療法、抗轉移劑及免疫治療劑。 實例性抗癌劑或細胞毒素(包括其同系物及衍生物)包含1-去氫睪固酮、安麯黴素(anthramycin)、放線菌素D (actinomycin D)、博來黴素(bleomycin)、卡奇黴素(包括n-乙醯基卡奇黴素)、秋水仙鹼(colchicin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、細胞鬆弛素B (cytochalasin B)、放線菌素D (dactinomycin) (先前稱作放線菌素(actinomycin))、二羥基炭疽菌素、二酮、多卡米星(duocarmycin)、吐根素(emetine)、泛艾黴素(epirubicin)、溴乙錠(ethidium bromide)、依託泊苷(etoposide)、糖皮質激素、短桿菌素D (gramicidin D)、利多卡因(lidocaine)、類美登素(maytansinoid) (例如DM-1及DM-4 (Immunogen))、苯并二氮呯衍生物(Immunogen)、光輝黴素(mithramycin)、絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、普魯卡因(procaine)、普萘洛爾(propranolol)、嘌呤黴素(puromycin)、替尼泊苷(tenoposide)、四卡因(tetracaine)及上述任一者之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。在某些所選實施例中，細胞毒素將包含卡奇黴素(包括n-乙醯基卡奇黴素)、尾海兔素、奧裡斯他汀或吡咯并苯并二氮呯(PBD)。 其他相容性細胞毒素包含尾海兔素及奧裡斯他汀、包括單甲基奧裡斯他汀E (MMAE)及單甲基奧裡斯他汀F (MMAF) (Seattle Genetics)、瓢菌素(amanitin) (例如α-瓢菌素、β-瓢菌素、γ-瓢菌素或ε-瓢菌素(Heidelberg Pharma))、DNA小溝結合劑(例如多卡米星衍生物(Syntarga))、烷基化劑(例如經修飾或二聚體吡咯并苯并二氮呯(PBD)、甲基二氯乙基胺、塞替派(thioepa)、氮芥苯丁酸、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine) (BCNU)、洛莫司汀(lomustine) (CCNU)、環磷醯胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C及順式二氯二胺鉑(II) (DDP)順鉑)、剪接抑制劑(例如米亞黴素(meayamycin)類似物或衍生物(例如、FR901464、如U.S.P.N. 7,825,267中所述))、管狀結合劑(例如埃博黴素類似物及微管溶素)、太平洋紫杉醇及DNA損害劑(例如卡奇黴素及埃斯波黴素(esperamicin))、抗代謝物(例如胺甲喋呤(methotrexate)、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷及5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪(decarbazine))、抗有絲分裂劑(例如長春鹼(vinblastine)及長春新鹼(vincristine))及蒽環(例如道諾黴素(daunorubicin) (先前稱作道諾黴素(daunomycin))及多柔比星(doxorubicin))及上述中之任一者之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。 在所選實施例中，本發明抗體可與抗CD3結合分子締合以招募細胞毒性T細胞並使其靶向致瘤細胞(BiTE technology；參見例如Fuhrmann等人(2010) Annual Meeting of AACR摘要編號5625)。 在其他實施例中，本發明ADC可包括包含使用適當連接體偶聯之治療性放射性同位素的細胞毒素。可與該等實施例相容之實例性放射性同位素包括(但不限於)碘(131 I、125 I、123 I、121 I)、碳(14 C)、銅(62 Cu、64 Cu、67 Cu)、硫(35 S)、鐳(223 R)、氚(3 H)、銦(115 In、113 In、112 In、111 In、)、鉍(212 Bi、213 Bi)、鍀(99 Tc)、鉈(201 Ti)、鎵(68 Ga、67 Ga)、鈀(103 Pd)、鉬(99 Mo)、氙(133 Xe)、氟(18 F)、153 Sm、177 Lu、159 Gd、149 Pm、140 La、175 Yb、166 Ho、90 Y、47 Sc、186 Re、188 Re、142 Pr、105 Rh、97 Ru、68 Ge、57 Co、65 Zn、85 Sr、32 P、153 Gd、169 Yb、51 Cr、54 Mn、75 Se、113 Sn、117 Sn、76 Br、211 At及225 Ac。其他放射性核種亦可用作診斷及治療劑，尤其在60至4,000 keV之能量範圍內之彼等。 在一些實施例中，本發明之ADC可包含PBD、及其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物作為彈頭。PBD係藉由在小溝中共價結合至DNA並抑制核酸合成發揮抗腫瘤活性之烷基化劑。已顯示PBD具有強效抗腫瘤性質，同時展現最小骨髓抑制。可使用若干類型之連接體(例如，包含具有游離硫氫基之馬來醯亞胺基部分之肽基連接體)將與本發明相容之PBD連接至抗體，且在某些實施例中，該等PBD呈二聚體形式(即，PBD二聚體)。可偶聯至所揭示抗體之相容性PBD (及可選連接體)闡述於(例如) U.S.P.N. 6,362,331、7,049,311、7,189,710、7,429,658、7,407,951、7,741,319、7,557,099、8,034,808、8,163,736、2011/0256157及PCT文件WO2011/130613、WO2011/128650、WO2011/130616、WO2014/057073及WO2014/057074中。 在其他所選實施例中，本發明之ADC將偶聯至細胞毒性苯并二氮呯衍生物彈頭。可偶聯至所揭示抗體之相容性苯并二氮呯衍生物(及可選連接體)闡述於(例如) U.S.P.N. 8,426,402及PCT文件WO2012/128868及WO2014/031566中。關於PBD，據信相容性苯并二氮呯衍生物在DNA之小溝中結合並抑制核酸合成。該等化合物據報導具有強效抗腫瘤性質，且因此，尤其適用於本發明之ADC中。 如上文所指示，在某些態樣中，本發明之ADC將包含尾海兔素彈頭。相容性尾海兔素包含尾海兔素10及尾海兔素15二者，其各自可呈單甲基類似物(例如單甲基尾海兔素10)形式。尾海兔素10及尾海兔素15係自印度洋海兔龍骨海鹿(Dollabella auricularia )分離之海洋天然產物。認為小的線性肽分子尾海兔素10及15二者皆係具有針對各種腫瘤之所示活性之有前景之抗癌藥物。尾海兔素係干擾微管裝配且藉此導致形成微管蛋白聚集物並抑制有絲分裂之有絲分裂抑制劑。該試劑亦經由涉及bcl-2 (一種在一些癌症中過表之癌蛋白)之機制誘導腫瘤細胞細胞凋亡。下文緊接顯示相容性彈頭單甲基尾海兔素10及尾海兔素15之結構：單甲基尾海兔素10彈頭(MMD10)：尾海兔素15彈頭(DMD15)： 應瞭解，二甲基及單甲基尾海兔素彈頭二者皆與所揭示之ADC相容且明確涵蓋於本發明之範疇內(例如，單甲基尾海兔素10、單甲基尾海兔素15、二甲基尾海兔素10及二甲基尾海兔素15)。 應進一步瞭解，除尾海兔素外，與本文教示相容之彈頭亦可包含奧裡斯他汀。如業內所熟知，尾海兔素已在結構上經修飾以提供緊密相關之奧裡斯他汀，在某些情形下，其係適於臨床研發之等效衍生物。該等合成劑與α-微管蛋白上之長春花生物鹼結合位點相互作用且阻斷其聚合並防止形成有絲分裂裝置。尤其相容之奧裡斯他汀包含單甲基奧裡斯他汀E (MMAE)及單甲基奧裡斯他汀F (MMAF)，下文緊接顯示其結構：MMAE彈頭MMAF彈頭 關於尾海兔素應瞭解，二甲基及單甲基奧裡斯他汀彈頭二者皆與所揭示之ADC相容且明確涵蓋於本發明之範疇內(例如，單甲基奧裡斯他汀E、單甲基奧裡斯他汀F、二甲基奧裡斯他汀E及二甲基奧裡斯他汀F)。 根據本文教示，應瞭解，上文所提及之尾海兔素及奧裡斯他汀彈頭中之每一者較佳在由靶細胞內化及破壞連接體後釋放。如下文更詳細闡述，某些連接體將包含可裂解連接體，其可納入容許釋放活性彈頭(例如，MMD10或MMAE)而不保留連接體之任何部分之自殺部分。 在其他較佳實施例中，彈頭將包含卡奇黴素。亦即，本發明之TNFRSF21 ADC可包含式Ab-[L-D]n或其醫藥上可接受之鹽，其中D係本文提供之式中之任一者中之卡奇黴素或其類似物。如業內已知，卡奇黴素係一類源自細菌棘孢小單孢菌 (Micromonospora echinospora)之烯二炔抗腫瘤抗生素、包括卡奇黴素γ1 I 、卡奇黴素β1 Br 、卡奇黴素γ1 Br 、卡奇黴素α2 I 、卡奇黴素α3 I 、卡奇黴素β1 i 及卡奇黴素δ1 i ，其經分離並表徵。上述卡奇黴素類似物中之每一者之結構為業內熟知(例如，參見Lee等人，Journal of Antibiotics，1989年7月，其全文以引用方式併入本文中)且與本文揭示之卡奇黴素藥物連接體構築體及抗體藥物偶聯物相容。 一般而言，卡奇黴素γ1 含有兩個不同結構區，其各自在化合物之生物活性中起特異性作用。二者中之較大者由延長之糖殘基組成，包含4個單醣單元及1個六取代之苯環；該等經由高度不常見之醣苷、硫酯及羥基胺連接系列接合在一起。第二結構區，即苷元(亦稱作卡奇黴素酮)，含有緊湊、高度官能化二環核心，其在橋接10員環中容納應變烯二炔單元。此苷元亞單元進一步包含烯丙型三硫化物，如下文所述，其用作活化劑以生成分子之細胞毒性形式。 舉例而言，下文緊接顯示三硫化物卡奇黴素γ1 I 之結構：卡奇黴素γ1 如本文所用術語「卡奇黴素」應認為意指卡奇黴素γ1 I 、卡奇黴素β1 Br 、卡奇黴素γ1 Br 、卡奇黴素α2 I 、卡奇黴素α3 I 、卡奇黴素β1 i 及卡奇黴素δ1 以及N-乙醯基衍生物、硫化物類似物及其類似物中之任一者。因此，如本文所用術語「卡奇黴素」應理解為涵蓋自然界中發現之任何卡奇黴素以及具有含與另一分子(例如，抗體藥物偶聯物)之附接點之二硫化物部分之卡奇黴素分子及其類似物。舉例而言，如本文所用，卡奇黴素γI 應理解為解釋為包含以下分子：及。 其中R1 係如下文定義。 應瞭解，上文所提及之化合物中之任一者皆與本文教示相容且可用於製作所揭示之卡奇黴素藥物連接體構築體及抗體藥物偶聯物。在某些實施例中，所揭示之抗體藥物偶聯物之卡奇黴素組份將包含N-乙醯基卡奇黴素γ1 I 。 卡奇黴素靶向核酸且引起鏈切斷，藉此殺死靶細胞。更具體而言，已發現卡奇黴素結合DNA之小溝，其中其隨後經歷與Bergman 環化 類似之反應以生成雙自由基物質。就此而言，芳基四糖亞單元用於遞送藥物至其靶標，從而緊緊結合至雙螺旋DNA之小溝，如由Crothers等人 (1999)所展現。在親核劑(例如麩胱甘肽)攻擊三硫化物基團之中心硫原子時，其引起結構幾何學顯著變化且對10員烯二炔環強加相當大之應力。此應力由經歷環芳構化反應之烯二炔完全減輕，從而生成高度反應性1,4-苯環型雙自由基且藉由自去氧核糖DNA主鏈吸引氫原子最終導致DNA裂解，從而引起鏈切斷。注意，在本發明之卡奇黴素二硫化物類似物構築體中，親核劑使保護之二硫鍵裂解以產生期望雙自由基。 更特定而言，應理解，D明確包含如業內已知卡奇黴素之類別之任一成員，其中末端--S-S-S-CH3 部分可經-S-S-替代，其中符號代表與連接體之附接點。 因此，在某些實施例中，D具有下式：R1 係氫、鹵素、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之雜環烷基、經取代或未經取代之芳基、或經取代或未經取代之雜芳基、-CF3 、-CCl3 、-CBr3 、-CI3 、-CN、-C(O)R1E 、-OR1A 、-NR1B R1C 、-C(O)OR1A 、-C(O)NR1B R1C 、-SR1D 、-SOn1 R1B 或-SOv1 NR1B R1C 。在某些所選實施例中，R1 將包含H。在其他所選實施例中，R1 將包含-C(O)CH3 。 R1A 、R1B 、R1C 、R1D 及R1E 獨立地係氫、鹵素、-CF3 、-CCl3 、-CBr3 、-CI3 、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-N(O)2 、-SH、-S(O)3 H、-S(O)4 H、-S(O)2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHS(O)2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3 、-OCCl3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHF2 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之雜環烷基、經取代或未經取代之芳基、或經取代或未經取代之雜芳基。 在實施例中，R1B 及R1C 取代基鍵結至相同氮原子且可視情況經接合以形成經取代或未經取代之雜環烷基或經取代或未經取代之雜芳基。符號n1獨立地係0至4之整數，符號v1獨立地係1或2且符號代表與連接體之附接點。 關於緊接上文之式應瞭解，所闡釋化合物包含較佳結合至二硫化物保護基團(在由代表之附接點)之二硫化物卡奇黴素類似物(例如，N-乙醯基卡奇黴素類似物)，該二硫化物保護基團共價結合至連接體之其餘部分。二硫化物保護基團改良二硫鍵在血流中之穩定性並容許有效合成所揭示之卡奇黴素-連接體構築體。在到達靶標(例如，癌細胞)後，連接體將較佳切斷以釋放經由二硫化物保護基團附接至連接體之部分之卡奇黴素。在某些實施例中，一旦連接體在遠離二硫化物保護基團處(即卡奇黴素遠端)裂解，則附接至卡奇黴素之連接體之其餘部分將在生理條件下降解至二硫鍵被切斷(較佳細胞內)之程度，之後重排並形成活性雙游離基卡奇黴素物質。此形式之卡奇黴素彈頭結合至細胞DNA之小溝且誘導期望細胞毒性效應(參見Walker等人，Biochemistry 89: 4608-4612, 5/92，其全文以引用方式併入本文中)。 更特定而言，卡奇黴素二硫化物基團較佳由提供穩定性(例如，血漿穩定性)直至ADC到達靶細胞之短鏈經取代或未經取代之雙官能脂肪族或芳基(「二硫化物保護基團」)保護。就此而言，二硫化物保護基團共價連接卡奇黴素二硫化物基團與任何連接體之其餘部分(可裂解或不可裂解)。這樣一來，二硫化物保護基團為二硫鍵提供一定程度之立體阻礙，藉此降低其對經由硫醇-二硫化物交換反應裂解之易感性。鑒於本發明，熟習此項技術者可容易地選擇提供期望穩定性且最佳化卡奇黴素ADC之治療指數之相容性二硫化物保護基團(參見Kellogg等人，Bioconj. Chem, 2011, 22, 717-727)。提供穩定二硫鍵之其他方法可參見USPN 20010036926，其以引用方式併入本文中。 除上文所提及之細胞毒性劑外，本發明抗體亦可偶聯至生物反應調節劑。舉例而言，在一些實施例中，藥物部分可為具有期望生物活性之多肽。該等蛋白質可包括(例如)毒素、例如相思子素、蓖麻毒蛋白A、抗腫瘤核糖核酸酶(或另一細胞毒性RNase)、假單胞菌屬(pseudomonas)外毒素、霍亂毒素、白喉毒素；細胞凋亡劑，例如腫瘤壞死因子(例如TNF- α或TNF-β)、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板源生長因子、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、AIM I (WO 97/33899)、AIM II (WO 97/34911)、Fas配體(Takahashi等人，1994, PMID: 7826947)、及VEGI (WO 99/23105)；血栓劑、抗血管生成劑(例如血管抑素或內皮抑素)、淋巴介質(例如介白素-1 (IL-1)、介白素-2 (IL-2)、介白素-6 (IL-6)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、及顆粒球群落刺激因子(G-CSF))或生長因子(例如生長激素(GH))。 2.診斷或檢測劑 在其他實施例中，本發明抗體或其片段或衍生物偶聯至診斷或可檢測試劑、標記物或報導基因，其可為(例如)生物分子(例如，肽或核苷酸)、小分子、螢光團或放射性同位素。經標記之抗體可用於監測過度增殖病症之發生或進展或用作臨床測試程序之部分以測定包括所揭示抗體(即治療診斷劑)之特定療法之效能，或以確定將來療程。該等標記物或報導基因亦可用於純化所選抗體以用於抗體分析學(例如，表位結合或抗體分倉)，分離或隔離致瘤細胞或用於臨床前程序或毒理學研究。 該診斷、分析及/或檢測可藉由使抗體與可檢測物質偶合來完成、該等可檢測物質包括但不限於各種酶、包含(例如)辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基、例如但不限於鏈黴抗生物素蛋白生物素及抗生物素蛋白/生物素；螢光材料、例如但不限於傘形酮、螢光黃、異硫氰酸螢光黃、玫瑰紅、二氯三嗪基胺螢光黃、丹磺醯氯或藻紅素；發光材料、例如但不限於發光胺；生物發光材料、例如但不限於螢光素酶、螢光素及水母素；放射性材料、例如但不限於碘(131 I、125 I、123 I、121 I)、碳(14 C)、硫(35 S)、氚(3 H)、銦(115 In、113 In、112 In、111 In、)、及鍀(99 Tc)、鉈(201 Ti)、鎵(68 Ga、67 Ga)、鈀(103 Pd)、鉬(99 Mo)、氙(133 Xe)、氟(18 F)、153 Sm、177 Lu、159 Gd、149 Pm、140 La、175 Yb、166 Ho、90 Y、47 Sc、186 Re、188 Re、142 Pr、105 Rh、97 Ru、68 Ge、57 Co、65 Zn、85 Sr、32 P、89 Zr、153 Gd、169 Yb、51 Cr、54 Mn、75 Se、113 Sn及117 Tin；使用各種正電子發射斷層掃描之正電子發射金屬、非放射性順磁金屬離子及經放射標記或偶聯至特定放射性同位素之分子。在該等實施例中，適當檢測方法為業內熟知且可如自多種商業來源容易地獲得。 在其他實施例中，抗體或其片段可融合或偶聯至標記物序列或化合物(例如肽或螢光團)以有利於純化或診斷或分析程序(例如免疫組織化學、生物層干涉術、表面電漿共振、流式細胞術、競爭性ELISA、FAC等)。在一些實施例中，標記物包含例如由pQE載體(Qiagen)提供之組胺酸標識，其中之許多尤其有市售。可用於純化之其他肽標識包括(但不限於)對應於源自流行性感冒血球凝集素蛋白之表位的血球凝集素「HA」標識(Wilson等人，1984, Cell 37:767)及「flag」標識(U.S.P.N. 4,703,004)。 3.生物相容性改質劑 在所選實施例中，本發明抗體可與生物相容性改質劑偶聯，該等生物相容性改質劑可用於調節、改變、改良或緩和所期望之抗體特徵。舉例而言，具有延長活體內半衰期之抗體或融合構築體可藉由附接相對高分子量聚合物分子(例如市售聚乙二醇(PEG)或相似生物相容性聚合物)來生成。熟習此項技術者應瞭解，PEG可以許多不同分子量及分子構形獲得，該等分子量及分子構形可經選擇以賦予抗體具體性質(例如可調整半衰期)。PEG可在具有或無多官能連接體情況下經由PEG偶聯至該等抗體或抗體片段之N-或C-末端或經由離胺酸殘基上存在之ε-胺基附接至抗體或抗體片段或衍生物。可使用線性或具支鏈聚合物衍生，其引起最小生物活性損失。可藉由SDS-PAGE及質譜緊密監測偶聯程度以確保PEG分子與抗體分子之最佳偶聯。可藉由(例如)粒徑篩析或離子交換層析自抗體-PEG偶聯物分離未反應之PEG。以相似方式，所揭示抗體可偶聯至白蛋白以使得抗體或抗體片段在活體內更穩定或在活體內具有更長半衰期。該等技術為業內熟知，參見(例如) WO 93/15199、WO 93/15200及WO 01/77137；及EP 0 413, 622。其他生物相容性偶聯物對於彼等熟習此項技術者係顯而易見的且可容易地根據本文教示鑑別。 B.連接體化合物及藥物連接體 如上文所指示，與本發明相容之酬載包含一或多種彈頭及視情況使彈頭與抗體靶向劑締合之連接體。可使用多種連接體化合物以將本發明抗體偶聯至相關彈頭。連接體僅需要與抗體上之反應性殘基(較佳半胱胺酸或離胺酸)及所選藥物化合物共價結合。因此，與所選抗體殘基反應且可用於提供相對穩定之本發明偶聯物(位點特異性或其他)之任何連接體與本文教示相容。 相容性連接體可有利地結合至經還原半胱胺酸及離胺酸，其係親核的。涉及經還原半胱胺酸及離胺酸之偶聯反應包括(但不限於)硫醇-馬來醯亞胺、硫醇-鹵基(醯鹵)、硫醇-烯、硫醇-炔、硫醇-乙烯基碸、硫醇-二碸、硫醇-硫代磺酸酯、硫醇-吡啶基二硫化物及硫醇-對氟反應。如本文進一步論述，硫醇-馬來醯亞胺生物偶聯由於其快速反應速率及輕度偶聯條件而係最廣泛使用之方法之一。關於此方法之一個問題係逆-麥可反應(retro-Michael reaction)之可能性及馬來醯亞胺基連接之酬載之損失或其自抗體至血漿中之其他蛋白質(例如人類血清白蛋白)之轉移。然而，在一些實施例中，如本文以下實例中所述之選擇性還原及位點特異性抗體之使用可用於穩定偶聯物並減少此不期望轉移。硫醇-醯鹵反應提供不經歷逆-麥可反應且因此更穩定之生物偶聯物。然而，硫醇-鹵化物反應與基於馬來醯亞胺之偶聯相比通常具有較慢反應速率且因此在提供不期望藥物對抗體比率中並不有效。硫醇-吡啶基二硫化物反應係另一流行之生物偶聯途徑。吡啶基二硫化物經歷與游離硫醇之快速交換從而產生混合二硫化物及釋放吡啶-2-硫酮。可在還原性細胞環境中裂解混合二硫化物，從而釋放酬載。在生物偶聯中得到更多關注之其他方法係硫醇-乙烯基碸及硫醇-二碸反應，其各自與本文教示相容且明確包括於本發明範疇內。 在所選實施例中，相容性連接體將在細胞外環境中賦予ADC穩定性，防止ADC分子聚集並保持ADC易溶於水性介質中且呈單體狀態。在輸送或遞送至細胞中之前，ADC較佳穩定且保持完整，即抗體保持連接至藥物部分。儘管連接體在靶細胞外面穩定，但其可經設計以一定有效速率在細胞內部裂解或降解。因此，有效連接體將：(i) 維持抗體之特異性結合性質；(ii) 容許細胞內遞送偶聯物或藥物部分；(iii) 保持穩定且完整，即不裂解或降解，直至偶聯物遞送或輸送至其靶向位點；及(iv) 維持藥物部分之細胞毒性、細胞殺死效應或細胞生長抑制效應(在一些情形下，包括任何旁觀者效應)。ADC之穩定性可藉由標準分析技術(例如HPLC/UPLC、質譜術、HPLC及分離/分析技術LC/MS及LC/MS/MS)來量測。如上文素數，抗體及藥物部分之共價附接需要連接體具有兩個反應性官能基，即在反應性含義上為二價。已知可用於附接兩個或更多個功能或生物活性部分(例如MMAE及抗體)之二價連接體試劑，且已闡述提供與本文教示相容之所得偶聯物之方法。 與本發明相容之連接體可廣泛分類為可裂解及不可裂解之連接體。將可裂解之連接體(其可包括酸不穩定之連接體(例如肟及腙)、蛋白酶可裂解之連接體及二硫化物連接體)內化至靶細胞中且在細胞內部之胞內體-溶酶體路徑中裂解。細胞毒素之釋放及活化取決於胞內體/溶酶體酸性隔室，其促進酸不穩定之化學連接(例如腙或肟)之裂解。若將溶酶體特異性蛋白酶裂解位點改造至連接體中，細胞毒素將靠近其細胞內靶標釋放。替代地，含有混合二硫化物之連接體提供一種細胞內釋放細胞毒性酬載之方法，因其在細胞之還原環境中而非在血流之富氧環境中選擇性裂解。相比之下，在靶細胞內ADC之溶酶體降解期間，含有醯胺連接之聚乙二醇或烷基間隔體之相容性不可裂解連接體釋放毒性酬載。在一些方面中，連接體之選擇將取決於偶聯物中所用之特定藥物、特定適應症及抗體靶標。 因此，本發明之某些實施例包含可由存在於細胞內環境中(例如在溶酶體或胞內體或胞膜窖內)之裂解劑裂解的連接體。該連接體可為例如藉由細胞內肽酶或蛋白酶(包括(但不限於)溶酶體或胞內體蛋白酶)裂解之肽基連接體。在一些實施例中，肽基連接體係至少兩個胺基酸長或至少三個胺基酸長。裂解劑可包括細胞自溶酶B及D及胞漿素，已知其各自可水解二肽藥物衍生物，造成在靶細胞內部釋放活性藥物。可由硫醇依賴性蛋白酶細胞自溶酶-B裂解之實例性肽基連接體係包含Phe-Leu之肽，因已發現細胞自溶酶-B在癌組織中高度表現。該等連接體之其他實例闡述於例如 U.S.P.N. 6,214,345中。在特定實施例中，可由細胞內蛋白酶裂解之肽基連接體係Val-Cit連接體、Val-Ala連接體或Phe-Lys連接體。使用細胞內蛋白分解釋放治療劑之一個優點在於該藥劑在偶聯時通常減弱且偶聯物之血清穩定性相對較高。 在其他實施例中，可裂解連接體係pH敏感的。通常，pH敏感性連接體將可在酸性條件下水解。舉例而言，可使用可在溶酶體中水解之酸不穩定連接體(例如腙、肟、縮胺基脲、縮胺基硫脲、順烏頭醯胺、原酸酯、縮醛、縮酮或諸如此類)(參見例如U.S.P.N. 5,122,368；5,824,805；5,622,929)。該等連接體在中性pH條件(例如在血液中條件)下相對穩定，但在低於pH 5.5或5.0 (其係溶酶體之近似pH)下不穩定(例如可裂解)。 在其他實施例中，連接體可在還原條件下裂解(例如，二硫化物連接體)。多種二硫化物連接體為業內已知，包括(例如)可使用以下物質形成之彼等：SATA (S-乙醯基硫代乙酸N-琥珀醯亞胺基酯)、SPDP (3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺基酯)、SPDB (3-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀醯亞胺基酯)及SMPT (N-琥珀醯亞胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)。在其他具體實施例中，連接體係丙二酸酯連接體(Johnson等人，1995,Anticancer Res. 15:1387-93)、馬來醯亞胺基苯甲醯基連接體(Lau等人，1995,Bioorg -Med -Chem. 3(10):1299-1304)、或3′-N-醯胺類似物(Lau等人，1995,Bioorg -Med -Chem. 3(10):1305-12)。 在本發明之某些態樣中，所選連接體將包含下式化合物：其中星號指示與藥物之附接點，CBA (即細胞結合劑)包含抗TNFRSF21抗體，L1 包含連接體單元及視情況可裂解連接體單元，A係將L1 連接至抗體上之反應性殘基之連接基團(視情況包含間隔體)，L2 較佳係共價鍵，且U (其可存在或可不存在)可包含有利於在腫瘤位點自彈頭清潔分離連接體之自消性單元之全部或部分。 在一些實施例中(例如U.S.P.N. 2011/0256157中所述之彼等)，相容性連接體可包含：其中星號指示與藥物之附接點，CBA (即細胞結合劑)包含抗TNFRSF21抗體，L1 包含連接體及視情況可裂解連接體，A係將L1 連接至抗體上之反應性殘基之連接基團(視情況包含間隔體)，且L2 係共價鍵或與-OC(=O)-一起形成自消性部分。 應瞭解，L1 及L2 (若存在)之性質可廣泛變化。該等基團係基於其裂解特徵選擇，該等裂解特徵係由偶聯物遞送至之位點之條件指示。藉由酶之作用裂解之彼等連接體較佳，但亦可使用可因pH (例如酸或鹼不穩定)、溫度變化或在輻照後(例如光不穩定)裂解之連接體。亦可發現可在還原或氧化條件下裂解之連接體可用於本發明。 在某些實施例中，L1 可包含胺基酸之鄰接序列。胺基酸序列可為用於酶裂解之靶受質，藉此容許釋放藥物。 在一個實施例中，L1 可藉由酶之作用裂解。在一個實施例中，酶係酯酶或肽酶。 在另一實施例中，L1 係細胞自溶酶不穩定之連接體。 在一個實施例中，L1 包含二肽。二肽可表示為-NH-X1 -X2 -CO-，其中-NH-及-CO-分別代表胺基酸基團X1 及X2 之N-及C-末端。二肽中之胺基酸可為天然胺基酸之任一組合。在連接體係細胞自溶酶不穩定之連接體之情況下，則二肽可為細胞自溶酶介導之裂解之作用位點。 另外，對於具有羧基或胺基側鏈官能基之彼等胺基酸(例如分別Glu及Lys)，CO及NH可代表該側鏈官能基。 在一個實施例中，二肽-NH-X1 -X2 -CO-中之基團-X1 -X2 -選自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-、-Val-Cit-、-Phe-Cit-、-Leu-Cit-、-Ile-Cit-、-Phe-Arg-及-Trp-Cit-，其中Cit係瓜胺酸。 較佳地，二肽-NH-X1 -X2 -CO-中之基團-X1 -X2 -選自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-及-Val-Cit-。 最佳地，二肽-NH-X1 -X2 -CO-中之基團-X1 -X2 -係-Phe-Lys-或-Val-Ala-或Val-Cit。在某些所選實施例中，二肽將包含-Val-Ala-。 在一個實施例中，L2 係以共價鍵形式存在。 在一個實施例中，L2 係存在的且與-C(=O)O-一起形成自消性連接體。在一個實施例中，L2 係酶活性之受質，藉此容許釋放彈頭。 在一個實施例中，在L1 可因酶之作用裂解且L2 存在之情況下，酶裂解L1 與L2 之間之鍵。 L1 及L2 (若存在)可由選自以下之鍵連接：-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-及-NHC(=O)NH-。 連接至L2 之L1 之胺基可為胺基酸之N-末端或可源自胺基酸側鏈(例如離胺酸胺基酸側鏈)之胺基。 連接至L2 之L1 之羧基可為胺基酸之C-末端或可源自胺基酸側鏈(例如麩胺酸胺基酸側鏈)之羧基。 連接至L2 之L1 之羥基可源自胺基酸側鏈(例如絲胺酸胺基酸側鏈)之羥基。 術語「胺基酸側鏈」包括以下中發現之彼等基團：(i) 天然存在之胺基酸，例如丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸；(ii) 次要胺基酸，例如鳥胺酸及瓜胺酸；(iii) 非天然存在之胺基酸、β-胺基酸、天然存在之胺基酸之合成類似物及衍生物；及(iv) 所有鏡像異構物、非鏡像異構物、異構富集、同位素標記(例如2 H、3 H、14 C、15 N)、經保護形式及其外消旋混合物。 在一個實施例中，-C(=O)O-與L2 一起形成以下基團：其中星號指示與藥物或細胞毒性劑位置之附接點，波形線指示與連接體L1 之附接點，Y係-N(H)-、-O-、-C(=O)N(H)-或-C(=O)O-，且n係0至3。伸苯基環視情況經1個、2個或3個取代基取代。在一個實施例中，伸苯基視情況經鹵基、NO2 、烷基或羥基烷基取代。 在一個實施例中，Y係NH。 在一個實施例中，n係0或1。較佳地，n係0。 在Y係NH且n係0之情況下，自消性連接體可稱作對胺基苄基羰基連接體(PABC)。 在其他實施例中，連接體可包括自消性連接體，且二肽一起形成基團-NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-。在其他所選實施例中，連接體可包含基團-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-，其指示於下文：其中星號指示與所選細胞毒性部分之附接點，且波形線指示與可偶聯至抗體之連接體之其餘部分(例如，間隔體-抗體結合區段)的附接點。在二肽之酶裂解後，在活化遠端位點時，自消性連接體將容許清潔釋放所保護化合物(即，細胞毒素)，如沿下文所示線進行：其中星號指示與所選細胞毒性部分之附接點且L* 係包含現裂解肽基單元之連接體之其餘部分之活化形式。彈頭之清潔釋放確保其將維持期望毒性活性。 在一個實施例中，A係共價鍵。因此，L1 及抗體直接連接。舉例而言，在L1 包含鄰接胺基酸序列之情況下，序列之N-末端可直接連接至抗體殘基。 在另一實施例中，A係間隔基團。因此，L1 及抗體間接連接。 在某些實施例中，L1 及A可由選自以下之鍵連接：-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-及-NHC(=O)NH-。 如下文將更詳細論述，本發明之藥物連接體較佳連接至半胱胺酸(包括游離半胱胺酸)上之反應性硫醇親核劑。為此，可藉由用如本文所述各種還原劑(例如DTT或TCEP或輕度還原劑)處理使得抗體之半胱胺酸對與連接體試劑之偶聯具有反應性。在其他實施例中，本發明之藥物連接體將較佳連接至離胺酸。 較佳地，連接體含有用於與抗體上之親核官能基反應之親電子官能基。抗體上之親核基團包括(但不限於)：(i) N-末端胺基團，(ii) 側鏈胺基團，例如離胺酸，(iii) 側鏈硫醇基團，例如半胱胺酸，及(iv) 糖羥基或胺基，其中抗體經醣基化。胺、硫醇及羥基係親核的且能夠與連接體部分及連接體試劑上之親電子基團形成共價鍵，該等親電子基團包括：(i) 馬來醯亞胺基團，(ii) 活化二硫化物，(iii) 活性酯，例如NHS (N-羥基琥珀醯亞胺)酯、HOBt (N-羥基苯并三唑)酯、鹵代甲酸酯及醯鹵；(iv) 烷基及苄基之鹵化物，例如鹵代乙醯胺；及(v) 醛、酮及羧基。 緊接下文闡釋與本發明相容之實例性官能基：在一些實施例中，半胱胺酸(包括位點特異性抗體之游離半胱胺酸)與藥物連接體部分之間之連接係經由連接體上存在之硫醇殘基及末端馬來醯亞胺基團。在該等實施例中，抗體與藥物連接體之間之連接可為：其中星號指示與藥物連接體之其餘部分之附接點且波形線指示與抗體之其餘部分之附接點。在該等實施例中，S原子可較佳源自位點特異性游離半胱胺酸。 關於其他相容性連接體，結合部分可包含可與抗體上之活化殘基反應以提供期望偶聯物之末端溴或碘乙醯胺。無論如何，鑒於本發明，熟習此項技術者可容易地偶聯所揭示藥物連接體化合物中之每一者與相容性抗TNFRSF21抗體(包括位點特異性抗體)。 根據本發明，本發明提供製備相容性抗體藥物偶聯物之方法，其包含偶聯抗TNFRSF21抗體與選自由以下組成之群藥物-連接體化合物(即，所揭示式Ab-[L-D]n中之[L-D])： DL1 (MMD10) ， DL2 (MMD10) ， DL3 (MMD10) ， DL4 (MMD10) ， DL5 (MMD10) ， DL6 (MMAE) ， DL7 (MMAF) ， 及 DL8 (MMAF) 。 出於本申請案之目的，DL將用作「藥物-連接體」(或「式Ab-[L-D]n中之連接體-藥物」)之縮寫且將包含如上文所述藥物連接體1 - 8 (即，DL1、DL2、DL3、DL4 DL5、DL6、DL7及DL8)。注意，DL1至DL5包含相同彈頭(MMD10)，其將在裂解後自連接體釋放。相同模式亦適於DL7及DL8，其中在每一情形下皆釋放MMAF。 應瞭解，可使用業內公認之技術將連接體附加末端馬來醯亞胺基部分偶聯至所選TNFRSF21抗體上之游離硫氫基。上文所提及之化合物之合成途徑為業內所熟知，同時偶聯該等藥物連接體組合之具體方法闡述於下文實例中。 因此，在所選態樣中，本發明係關於偶聯至所揭示DL部分(DL1 - DL8)之TNFRSF21抗體以提供緊接下文實質上如ADC 1 - 8中所述之式Ab-[L-D]n之TNFRSF21免疫偶聯物。 因此，在某些態樣中，本發明係針對式Ab-[L-D]n之ADC，其包含選自由以下組成之群之結構： ADC1 (MMD10) ， ADC2 (MMD10) ， ADC3 (MMD10) ， ADC4 (MMD10) ， ADC5 (MMD10) ， ADC6 (MMAE) ， ADC7 (MMAF) ， 及 ADC8 (MMAF) ， 其中Ab包含抗TNFRSF21抗體或其免疫反應性片段且n係約1至約20之整數。在較佳實施例中，n將包含1至8之整數且在某些實施例中n將包含2或4。 熟習此項技術者應瞭解，上文所提及之ADC結構係由式Ab-[L-D]n定義且如其中繪示之一個以上藥物連接體分子可共價偶聯至TNFRSF21抗體(例如，n可為約1至約20之整數)。更特定而言，如下文更詳細論述，應瞭解，一個以上酬載可偶聯至每一抗體，且上文示意性代表圖應如此解釋。舉例而言，如上文所述ADC可包含偶聯至1、2、3、4、5、6、7或8或更多個酬載之TNFRSF21抗體且該等ADC之組合物將通常包含藥物負載之物質之混合物。 在其他態樣中，本發明之ADC將包含卡奇黴素。就此而言，提供具有下式之化合物(例如，式Ab-[L-D]n之抗體藥物偶聯物)：其中Ab係TNFRSF21抗體且z1、z2、L3 、L4 、W、M、P、R1及n係如本文中所述進行定義。在所選實施例中，Ab係嵌合抗體、CDR移植抗體、人類化抗體或人類抗體或其免疫反應性片段。 若存在，L3 係共價鍵、-O-、-S-、-NR3B -、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2 、-C(O)NR3B -、-NR3B C(O)-、-NR3B C(O)NH-、-NHC(O)NR3B -、經取代或未經取代之伸烷基或經取代或未經取代之伸雜烷基。 若存在，L4 係共價鍵、-O-、-S-、-NR4B -、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2 -、-C(O)NR4B -、-NR4B C(O)-、-NR4B C(O)NH-、-NHC(O)NR4B -、經取代或未經取代之伸烷基或經取代或未經取代之伸雜烷基。 R1 係氫、鹵素、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之雜環烷基、經取代或未經取代之芳基、或經取代或未經取代之雜芳基、-CF3 、-CCl3 、-CBr3 、-CI3 、-CN、-C(O)R1E 、-OR1A 、-NR1B R1C 、-C(O)OR1A 、-C(O)NR1B R1C 、-SR1D 、-SOn1 R1B 或-SOv1 NR1B R1C 。在某些所選實施例中，R1 將包含H。在其他所選實施例中，R1 將包含-C(O)CH3 。 P係共價鍵或係-O-、-S-、-NR2B -、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2 -、-C(O)NR2B -、-NR2B C(O)-、-NR2B C(O)NH-、-NHC(O)NR2B -、經取代或未經取代之雙官能脂肪族或芳基、經取代或未經取代之伸烷基、經取代或未經取代之伸雜烷基、經取代或未經取代之伸環烷基、經取代或未經取代之伸雜環烷基、經取代或未經取代之伸芳基或經取代或未經取代之伸雜芳基。 在某些實施例中，二硫化物保護基團P將包含環狀或非環狀直鏈或具支鏈C1 -C12 飽和或不飽和脂肪族部分。在某些較佳實施例中，脂肪族部分可經取代。在其他較佳實施例中，脂肪族部分可未經取代。其他二硫化物保護基團實施例包含具有一個或兩個結合至靠近二硫化物部分之碳之甲基之脂肪族部分。在其他實施例中，脂肪族部分將包含結合至靠近二硫化物部分之碳之單一甲基。其他較佳實施例將包含具有一或多個甲基、1個、2個或3個遠離近端碳之碳之脂肪族部分。由每一該構築體賦予之穩定性可使用業內公認之技術容易地量測。在每一情況下，所選二硫化物保護基團將用於增加二硫鍵之穩定性並延長卡奇黴素ADC之活體內半衰期。 M係共價鍵或係-O-、-S-、-NR5B -、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O) -、-S(O)2 -、-C(O)NR5B -、-NR5B C(O)-、-NR5B C(O)NH-、-NHC(O)NR5B -、-[NR5B C(R5E )(R5F )C(O)]n2 -、經取代或未經取代之伸烷基、經取代或未經取代之伸雜烷基、經取代或未經取代之伸環烷基、經取代或未經取代之伸雜環烷基、經取代或未經取代之伸芳基、經取代或未經取代之伸雜芳基或M1A -M1B -M1C 。 W係共價鍵或係-O-、-S-、-NR6B -、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O) -、-S(O)2 -、-C(O)NR6B -、-NR6B C(O)-、-NR6B C(O)NH-、-NHC(O)NR6B -、經取代或未經取代之伸烷基、經取代或未經取代之伸雜烷基、經取代或未經取代之伸環烷基、經取代或未經取代之伸雜環烷基、經取代或未經取代之伸芳基、經取代或未經取代之伸雜芳基或W1A -W1B -W1C 。 M1A 較佳鍵結至L3 。M1C 較佳鍵結至L4 。 M1A 係共價鍵、-O-、-S-、-NR5AB -、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O) -、-S(O)2 -、-C(O)NR5AB -、-NR5AB C(O)-、-NR5AB C(O)NH-、-NHC(O)NR5AB -、-[NR5AB CR5AE R5AF C(O)]n3 -、經取代或未經取代之伸烷基、經取代或未經取代之伸雜烷基、經取代或未經取代之伸環烷基、經取代或未經取代之伸雜環烷基、經取代或未經取代之伸芳基或經取代或未經取代之伸雜芳基。 M1B 係共價鍵、-O-、-S-、-NR5BB -、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2 -、-C(O)NR5BB -、-NR5BB C(O)-、-NR5BB C(O)NH-、-NHC(O)NR5BB -、-[NR5BB C(R5BE )(R5BF )C(O)]n4 -、經取代或未經取代之伸烷基、經取代或未經取代之伸雜烷基、經取代或未經取代之伸環烷基、經取代或未經取代之伸雜環烷基、經取代或未經取代之伸芳基或經取代或未經取代之伸雜芳基。 M1C 係共價鍵、-O-、-S-、-NR5CB -、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2 -、-C(O)NR5CB -、-NR5CB C(O)-、-NR5CB C(O)NH-、-NHC(O)NR5CB -、-[NR5CB CR5CE R5CF C(O)]n5 -、經取代或未經取代之伸烷基、經取代或未經取代之伸雜烷基、經取代或未經取代之伸環烷基、經取代或未經取代之伸雜環烷基、經取代或未經取代之伸芳基或經取代或未經取代之伸雜芳基。 W1A 較佳鍵結至Ab。W1C 較佳鍵結至L3 。 W1A 係共價鍵、-O-、-S-、-NR6BA -、-C(O)-、C(O)O-、-S(O) -、-S(O)2 -、-C(O)NR6BA -、-NR6BA C(O)-、-NR6BA C(O)NH-、-NHC(O)NR6BA -、經取代或未經取代之伸烷基、經取代或未經取代之伸雜烷基、經取代或未經取代之伸環烷基、經取代或未經取代之伸雜環烷基、經取代或未經取代之伸芳基或經取代或未經取代之伸雜芳基。 W1B 係共價鍵、-O-、-S-、-NR6BB -、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O) -、-S(O)2 -、-C(O)NR6BB -、-NR6BB C(O)-、-NR6BB C(O)NH-、-NHC(O)NR6BB -、經取代或未經取代之伸烷基、經取代或未經取代之伸雜烷基、經取代或未經取代之伸環烷基、經取代或未經取代之伸雜環烷基、經取代或未經取代之伸芳基或經取代或未經取代之伸雜芳基。 W1C 係共價鍵、-O-、-S-、-NR6BC -、-C(O)-、-C(O)O-、-S(O) -、-S(O)2 -、-C(O)NR6BC -、-NR6BC C(O)-、-NR6BC C(O)NH-、-NHC(O)NR6BC -、經取代或未經取代之伸烷基、經取代或未經取代之伸雜烷基、經取代或未經取代之伸環烷基、經取代或未經取代之伸雜環烷基、經取代或未經取代之伸芳基或經取代或未經取代之伸雜芳基。 R1A 、R1B 、R1C 、R1D 、R1E 、R2B 、R3B 、R4B 、R5B 、R5E 、R5F 、R5AB 、R5AE 、R5AF 、R5BB 、R5BE 、R5BF 、R5CB 、R5CE 、R5CF 、R6B 、R6BA 、R6BB 及R6BC 獨立地係氫、鹵素、-CF3 、-CCl3 、-CBr3 、-CI3 、-OH、-NH2 、-COOH、-CONH2 、-N(O)2 、-SH、-S(O)3 H、-S(O)4 H、-S(O)2 NH2 、-NHNH2 、-ONH2 、-NHC(O)NHNH2 、-NHC(O)NH2 、-NHS(O)2 H、-NHC(O)H、-NHC(O)-OH、-NHOH、-OCF3 、-OCCl3 、-OCBr3 、-OCI3 、-OCHF2 、-OCHCl2 、-OCHBr2 、-OCHI2 、經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基、經取代或未經取代之環烷基、經取代或未經取代之雜環烷基、經取代或未經取代之芳基、或經取代或未經取代之雜芳基。 在某些實施例中，鍵結至相同氮原子之R1B 及R1C 取代基可視情況經接合以形成經取代或未經取代之雜環烷基或經取代或未經取代之雜芳基。 且其中z1及z2可為0或可獨立地包含1至10之整數且n包含1至20之整數。在某些所選實施例中，n將包含1至8之整數且在其他較佳實施例中n將包含2或4。 緊接下文闡述包含肽基可裂解部分之相容性卡奇黴素-連接體構築體之尤佳實施例。應瞭解，構築體可實質上如PCT/US2016/028530中所述製作，該案件關於該合成明確併入本文中。此外，鑒於本發明，熟習此項技術者可使用相似合成方案容易地製作其他肽基連接體卡奇黴素構築體。 因此，根據本發明，本發明提供製備相容性抗體藥物偶聯物之方法，其包含偶聯抗TNFRSF21抗體與選自由以下組成之群藥物-連接體化合物(即，所揭示式Ab-[L-D]n中之[L-D])： DL9 (Val-Cit) ， DL10 (Val-Ala) ， DL11 (Phe-Ala) ， DL12 (Ile-Ala) ， DL13 (Trp-Ala) ， DL14 (Phe-Cit) ， DL15 (Ile-Cit) ， DL16 (Trp-Cit) ， DL17 (Phe-Lys) ， 式 17 DL18 (Val-Cit - 10 Peg) ， 及 式 16 DL19 (Val-Cit - 2 Peg) 。 應瞭解，可使用業內公認之技術將連接體附加末端馬來醯亞胺基部分偶聯至所選TNFRSF21抗體上之游離硫氫基。上文所提及之化合物之合成途徑為業內所熟知，同時偶聯該等藥物連接體組合之具體方法闡述於下文實例中。 因此，在所選態樣中，本發明係關於偶聯至所揭示DL部分(DL9 - DL19)之TNFRSF21抗體以提供緊接下文實質上如ADC 9 - 19中所述之式Ab-[L-D]n之TNFRSF21免疫偶聯物。 就此而言，本發明之某些態樣係針對式Ab-[L-D]n之ADC，其包含選自由以下組成之群之結構： ADC9 (Val-Cit) ， ADC10 (Val-Ala) ， ADC11 (Phe-Ala) ， ADC12 (Ile-Ala) ， ADC13 (Trp-Ala) ， ADC14 (Phe-Cit) ， ADC15 (Ile-Cit) ， ADC16 (Trp-Cit) ， ADC17 (Phe-Lys) ， ADC18 (Val-Cit - 10 Peg) ， 及 ADC19 (Val-Cit - 2 Peg) 。 其中Ab包含抗TNFRSF21抗體或其免疫反應性片段且n係約1至約20之整數。在較佳實施例中，n將包含1至8之整數且在某些實施例中n將包含2或4。 C.偶聯 應瞭解，可使用多種熟知反應以將藥物部分及/或連接體附接至所選抗體。舉例而言，可使用利用半胱胺酸之硫氫基之各種反應以偶聯期望部分。一些實施例將包括包含如下文詳細論述之一或多個游離半胱胺酸之抗體的偶聯。在其他實施例中，本發明ADC可經由藥物與所選抗體中存在之離胺酸殘基之溶劑暴露之胺基的偶聯來生成。又一些實施例包含活化N-末端蘇胺酸及絲胺酸殘基，隨後可使用其以將所揭示酬載附接至抗體。所選偶聯方法較佳經調整以最佳化附接至抗體之藥物數目且提供相對高之治療指數。 業內已知用於將治療性化合物偶聯至半胱胺酸殘基之各種方法且其將為熟習此項技術者所明瞭。在鹼性條件下，半胱胺酸殘基將去質子化以生成硫醇鹽親核劑，其可與軟親電子劑(例如馬來醯亞胺及碘乙醯胺)反應。通常，用於該等偶聯之試劑可直接與半胱胺酸硫醇反應以形成偶聯蛋白或與連接體-藥物反應以形成連接體-藥物中間體。在連接體之情形下，採用有機化學反應、條件及試劑之若干途徑為熟習此項技術者已知，包括：(1) 經由共價鍵使本發明之蛋白質之半胱胺酸基團與連接體試劑反應，以形成蛋白質-連接體中間體，之後與活化化合物反應；及(2) 經由共價鍵使化合物之親核基團與連接體試劑反應以形成藥物連接體中間體，之後與本發明之蛋白質之半胱胺酸基團反應。如熟習此項技術者自上文所明瞭，雙官能(或二價)連接體可用於本發明中。舉例而言，雙官能連接體可包含用於共價連接至半胱胺酸殘基之硫醇修飾基團及至少一個用於共價或非共價連接至化合物之附接部分(例如，第二硫醇修飾部分)。 在偶聯之前，可藉由用還原劑(例如二硫蘇糖醇(DTT)或(參 ( 2-羧基乙基)膦(TCEP))處理使得抗體對於與連接體試劑偶聯具有反應性。在其他實施例中，經由使離胺酸與試劑(包括但不限於2-亞胺基四氫噻吩(喬特試劑(Traut’s reagent))、SATA、SATP或SAT(PEG)4)反應從而使胺轉化成硫醇而向抗體中引入其他親核基團。 關於該等偶聯，半胱胺酸硫醇或離胺酸胺基係親核性的且能夠與連接體試劑或化合物-連接體中間體或藥物上之親電子基團反應以形成共價鍵，該等親電子基團包括：(i) 活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯及醯鹵；(ii) 烷基及苄基之鹵化物，例如鹵代乙醯胺；(iii) 醛、酮、羧基及馬來醯亞胺基團；及(iv) 二硫化物，包括吡啶基二硫化物，其係經由硫化物交換。化合物或連接體上之親核基團包括(但不限於)胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、縮胺基硫脲、肼羧酸酯及芳基醯肼基團，其能夠與連接體部分及連接體試劑上之親電子基團反應以形成共價鍵。 偶聯試劑通常包括馬來醯亞胺、鹵代乙醯基、碘乙醯胺琥珀醯亞胺基酯、異硫氰酸酯、磺醯氯、2,6-二氯三嗪基、五氟苯基酯及亞磷醯胺，但亦可使用其他官能基。在某些實施例中，方法包括(例如)使用馬來醯亞胺、碘乙醯亞胺或鹵代乙醯基/鹵代烷、氮雜環丙烷、丙烯醯基衍生物以與半胱胺酸之硫醇反應以產生可與化合物反應之硫醚。游離硫醇與活化吡啶基二硫化物之二硫化物交換亦可用於產生偶聯物(例如，使用5-硫基-2-硝基苯甲酸(TNB))。較佳地，使用馬來醯亞胺。 如上文所指示，離胺酸亦可用作反應性殘基以實現偶聯，如本文中所述。通常經由胺-反應性琥珀醯亞胺基酯靶向親核離胺酸殘基。為獲得最佳數目之去質子化離胺酸殘基，水溶液之pH必須低於離胺酸銨基團之pKa (其係約10.5)，因此，反應之典型pH係約8及9。用於偶合反應之常見試劑係NHS-酯，其經由離胺酸醯化機制與親核離胺酸反應。其他經歷相似反應之相容性試劑包含異氰酸酯及異硫氰酸酯，其亦可結合本文教示使用以提供ADC。一旦離胺酸經活化，上文所提及之連接基團中之許多可用於將彈頭共價結合至抗體。 業內亦已知用於將化合物偶至蘇胺酸或絲胺酸殘基(較佳N-末端殘基)之方法。舉例而言，已闡述方法，其中羰基前體源自絲胺酸或蘇胺酸之1,2-胺基醇，其可藉由高碘酸鹽氧化選擇性且快速轉化成醛形式。醛與欲附接至本發明之蛋白質之化合物中之半胱胺酸之1,2-胺基硫醇的反應形成穩定之噻唑啶產物。此方法尤其可用於標記N-末端絲胺酸或蘇胺酸殘基處之蛋白質。 在一些實施例中，可藉由引入1個、2個、3個、4個或更多個游離半胱胺酸殘基(例如，製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之抗體)向所選抗體(或其片段)中引入反應性硫醇基團。該等位點特異性抗體或經改造抗體容許展現增強之穩定性及實質均質性偶聯物製劑，此至少部分係由於提供如本文所述之經改造游離半胱胺酸位點及/或新穎偶聯程序。與完全或部分還原鏈內或鏈間抗體二硫鍵中之每一者以提供偶聯位點(且完全與本發明相容)之習用偶聯方法不同，本發明另外提供某些製備游離半胱胺酸位點之選擇性還原及藥物連接體與其附接。 就此而言，應瞭解，由經改造位點及選擇性反應促進之偶聯特異性容許在期望位置處高百分比之定點偶聯。顯著地，該等偶聯位點中之一些(例如輕鏈恆定區之末端區中存在之彼等)通常難以有效偶聯，此乃因其往往與其他游離半胱胺酸交叉反應。然而，經由所得游離半胱胺酸之分子改造及選擇性還原，可獲得有效偶聯率，其顯著減少不期望之高-DAR污染物及非特異性毒性。更通常地，經改造之構築體及所揭示新穎偶聯方法(其包含選擇性還原)提供具有改良之藥物動力學及/或藥效學及潛在地改良之治療指數的ADC製劑。 在某些實施例中，位點特異性構築體提供游離半胱胺酸，在經還原時，其包含親核且能夠與連接體部分(例如上文揭示之彼等)上之親電子基團形成共價鍵之硫醇基團。如上文所論述，本發明抗體可具有可還原之未成對鏈間或鏈內半胱胺酸或引入之非天然半胱胺酸，即提供該等親核基團之半胱胺酸。因此，在某些實施例中，經還原游離半胱胺酸之游離硫氫基與所揭示藥物連接體之末端馬來醯亞胺基或鹵代乙醯胺基團的反應將提供期望偶聯。在該等情形下，可藉由用還原劑(例如二硫蘇糖醇(DTT)或(參(2-羧基乙基)膦(TCEP))處理使抗體之游離半胱胺酸對與連接體試劑之偶聯具有反應性。因此，每一游離半胱胺酸將理論上提供反應性硫醇親核劑。儘管該等試劑尤其與本發明相容，但應瞭解，可使用熟習此項技術者通常已知之各種反應、條件及試劑實現位點特異性抗體之偶聯。 另外，已發現，可選擇性還原經改造抗體之游離半胱胺酸以提供增強之定點偶聯及減少不期望之潛在毒性污染物。更具體而言，已發現「穩定劑」(例如精胺酸)可調節蛋白質中之分子內及分子間相互作用且可結合所選還原劑(較佳相對輕度)使用以選擇性還原游離半胱胺酸並有利於如本文所述位點特異性偶聯。如本文所用術語「選擇性還原」(「selective reduction」或「selectively reducing」)可互換使用且應意指還原游離半胱胺酸而不實質上破壞經改造抗體中存在之天然二硫鍵。在所選實施例中，此選擇性還原可藉由使用某些還原劑或某些還原劑濃度來實現。在其他實施例中，經改造構築體之選擇性還原將包含使用穩定劑與還原劑(包括輕度還原劑)之組合。應瞭解，術語「選擇性偶聯」應意指在如本文所述細胞毒素存在下經選擇性還原之經改造抗體之偶聯。就此而言，使用該等穩定劑(例如，精胺酸)與所選還原劑之組合可顯著改良位點特異性偶聯之效率，如藉由重及輕抗體鏈上之偶聯程度及製劑之DAR分佈來測定。相容性抗體構築體及選擇性偶聯技術及試劑廣泛揭示於WO2015/031698中，其關於該等方法及構築體明確併入本文中。 儘管不希望受限於任何特定理論，但該等穩定劑可用於調節靜電微環境及/或調節期望偶聯位點之構象變化，藉此容許相對輕度還原劑(其不會實質上還原完整天然二硫鍵)以有利於在期望游離半胱胺酸位點偶聯。已知該等試劑(例如，某些胺基酸)可形成鹽橋(經由氫鍵結及靜電相互作用)且可以賦予穩定效應之方式調節蛋白質-蛋白質相互作用，該穩定效應可產生有利之構象變化及/或減少不利之蛋白質-蛋白質相互作用。此外，該等試劑可用於抑制還原後不期望分子內(及分子間)半胱胺酸-半胱胺酸鍵之形成，由此有利於期望偶聯反應，其中經改造之位點特異性半胱胺酸結合至藥物(較佳經由連接體)。由於選擇性還原條件不提供完整天然二硫鍵之顯著還原，故將隨後偶聯反應天然驅動至游離半胱胺酸上之相對較少反應性硫醇(例如，較佳2個游離硫醇/抗體)。如先前所提到，該等技術可用於顯著減少根據本發明製作之偶聯物製劑中之非特異性偶聯及相應不期望DAR物質之含量。 在所選實施例中，與本發明相容之穩定劑通常將包含具有至少一個具有鹼性pKa之部分之化合物。在某些實施例中，該部分將包含一級胺，而在其他實施例中，胺部分將包含二級胺。在又一些實施例中，胺部分將包含三級胺或胍鎓基團。在其他所選實施例中，胺部分將包含胺基酸，而在其他相容性實施例中，胺部分將包含胺基酸側鏈。在其他實施例中，胺部分將包含蛋白胺基酸。在又一些實施例中，胺部分包含非蛋白胺基酸。在一些實施例中，相容性穩定劑可包含精胺酸、離胺酸、脯胺酸及半胱胺酸。在某些較佳實施例中，穩定劑將包含精胺酸。另外，相容性穩定劑可包括具有鹼性pKa之含胍及氮之雜環。 在某些實施例中，相容性穩定劑包含具有至少一個pKa為大於約7.5之胺部分的化合物，在其他實施例中，標的胺部分之pKa為大於約8.0，在其他實施例中，胺部分之pKa為大於約8.5，且在又一些實施例中，穩定劑將包含pKa為大於約9.0之胺部分。其他實施例將包含胺部分之pKa為大於約9.5之穩定劑，而某些其他實施例將包含展現至少一個pKa為大於約10.0之胺部分的穩定劑。在又一些實施例中，穩定劑將包含具有pKa為大於約10.5之胺部分之化合物，在其他實施例中，穩定劑將包含具有pKa為大於約11.0之胺部分之化合物，而在又一些實施例中，穩定劑將包含pKa大於約11.5之胺部分。在其他實施例中，穩定劑將包含具有pKa大於約12.0之胺部分之化合物，而在又一些實施例中，穩定劑將包含pKa大於約12.5之胺部分。熟習此項技術者應理解，相關pKa可容易地使用標準技術計算或測定且可用於測定使用所選化合物作為穩定劑之適用性。 顯示所揭示穩定劑在與某些還原劑組合時在靶向偶聯至游離位點特異性半胱胺酸中尤其有效。出於本發明之目的，相容性還原劑可包括產生用於偶聯之位點特異性半胱胺酸而不顯著破壞經改造抗體之天然二硫鍵的任何化合物。在較佳由所選穩定劑及還原劑之組合提供之該等條件下，活化藥物連接體大大受限於與期望游離位點特異性半胱胺酸位點之結合。相對輕度還原劑或以相對低濃度使用以提供輕度條件之還原劑尤佳。如本文所用術語「輕度還原劑」或「輕度還原條件」應認為意指由在游離半胱胺酸位點提供硫醇而不實質上破壞經改造抗體中存在之天然二硫鍵之還原劑(視情況在穩定劑存在下)實現之任何試劑或狀態。亦即，輕度還原劑或條件(較佳與穩定劑組合)能有效還原游離半胱胺酸(提供硫醇)而不顯著破壞蛋白質之天然二硫鍵。期望還原條件可由多種基於硫氫基之化合物提供，該等化合物確立選擇性偶聯之適當環境。在實施例中，輕度還原劑可包含具有一或多個游離硫醇之化合物，而在一些實施例中，輕度還原劑將包含具有單一游離硫醇之化合物。與本發明之選擇性還原技術相容之還原劑之非限制性實例包含麩胱甘肽、n-乙醯基半胱胺酸、半胱胺酸、2-胺基乙烷-1-硫醇及2-羥基乙烷-1-硫醇。 應瞭解，上文所述選擇性還原過程在靶向偶聯至游離半胱胺酸中尤其有效。就此而言，可藉由各種業內公認之技術測定位點特異性抗體中與期望靶位點之偶聯程度(此處定義為「偶聯效率」)。藥物與抗體之位點特異性偶聯之效率可藉由評價相對於所有其他偶聯位點之靶偶聯位點(例如每一輕鏈之c-末端上之游離半胱胺酸)上之偶聯之百分比來測定。在某些實施例中，本文之方法可將藥物有效偶聯至包含游離半胱胺酸之抗體。在一些實施例中，偶聯效率係至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或更大，如藉由靶偶聯相對於所有其他偶聯位點之百分比來量測。 應進一步瞭解，能夠偶聯之經改造抗體可含有游離半胱胺酸殘基，其包含在產生或儲存抗體時經封阻或封蓋之硫氫基。該等蓋包括與硫氫基相互作用且防止或抑制偶聯物形成之小分子、蛋白質、肽、離子及其他材料。在一些情形下，未偶聯之經改造抗體可包含結合相同或不同抗體上之其他游離半胱胺酸之游離半胱胺酸。如本文所論述，該交叉反應性可在製作程序期間導致各種污染物。在一些實施例中，經改造抗體可能需要在偶聯反應之前脫帽。在具體實施例中，本文中之抗體經脫帽且展現能夠偶聯之游離硫氫基。在具體實施例中，本文中之抗體經受脫帽反應，其不擾亂或重排天然存在之二硫鍵。應瞭解，在大部分情形下，脫帽反應將在正常還原反應(還原或選擇性還原)期間發生。 D.DAR 分佈及純化 在所選實施例中，與本發明相容之偶聯及純化方法有利地提供生成包含窄DAR分佈之相對均質ADC製劑的能力。就此而言，所揭示構築體(例如，位點特異性構築體)及/或選擇性偶聯在藥物與經改造抗體之間之化學計量比方面及關於毒素位置提供樣品內之ADC物質之均質性。如上文簡單論述，術語「藥物對抗體比率」或「DAR」係指ADC製劑中之藥物對抗體之莫耳濃度比率。在某些實施例中，偶聯物製劑可關於其DAR分佈實質上均質，此意味著在ADC製劑內係具有特定載藥量(例如，載藥量為2或4)之位點特異性ADC之主要物質，該載藥量亦關於荷載(即，在游離半胱胺酸上)均勻。在本發明之其他某些實施例中，可經由使用位點特異性抗體及/或選擇性還原及偶聯達成期望均質性。在其他實施例中，可經由使用位點特異性構築體與選擇性還原之組合達成期望均質性。在其他實施例中，可使用分析型或製備型層析技術純化相容性製劑以提供期望均質性。在該等實施例中之每一者中，可使用業內已知之各種技術(包括但不限於質譜、HPLC (例如粒徑篩析HPLC、RP-HPLC、HIC-HPLC等)或毛細管電泳)分析ADC樣品之均質性。 關於ADC製劑之純化，應瞭解，可採用標準醫藥製備方法以獲得期望純度。如本所論述，液相層析方法(例如反相(RP)及疏水相互作用層析(HIC))可藉由載藥量值分離混合物中之化合物。在一些情形下，亦可使用離子交換(IEC)或混合模式層析(MMC)以分離具有特定載藥量之物質。 無論如何，根據抗體之構形及至少部分根據用於實現偶聯之方法，所揭示之ADC及其製劑可包含各種化學計量莫耳濃度比之藥物及抗體部分。在某些實施例中，每ADC之載藥量可包含1-20個彈頭(即，n係1-20)。其他所選實施例可包含載藥量為1至15個彈頭之ADC。在又一些實施例中，ADC可包含1-12個彈頭、或更佳1-10個彈頭。在一些實施例中，ADC將包含1至8個彈頭。 儘管理論載藥量可相對較高，但由於聚集物及其他污染物，實際限制(例如游離半胱胺酸交叉反應性及彈頭疏水性)往往限制包含該DAR之均質之製劑生成。亦即，根據酬載，較高載藥量(例如＞8或10)可引起某些抗體-藥物偶聯物之聚集、不溶性、毒性或細胞滲透性損失。鑒於該等問題，由本發明提供之載藥量較佳介於1至8個藥物/偶聯物之範圍內，即其中1、2、3、4、5、6、7或8個藥物共價附接至每一抗體(例如，對於IgG1，根據二硫鍵之數目，其他抗體可具有不同荷載能力)。較佳地，本發明組合物之DAR將為約2、4或6，且在一些實施例中，DAR將包含約2。 儘管由本發明提供之相對高程度之均質性，但所揭示組合物實際上包含偶聯物與多種藥物化合物(在IgG1之情形下，潛在地1至8)之混合物。因此，所揭示之ADC組合物包括偶聯物之混合物，其中大部分構成抗體共價連接至一或多個藥物部分且(儘管由經改造構築體提供之相對偶聯物特異性及選擇性還原) 其中藥物部分可由各種硫醇基團附接至抗體。亦即，在偶聯後，本發明組合物將包含不同濃度(與主要由游離半胱胺酸交叉反應性引起之某些反應污染物一起)之具有不同載藥量(例如，1至8個藥物/IgG1抗體)之ADC的混合物。然而，使用選擇性還原及製作後純化，可將偶聯物組合物驅動至其大大含有單一主要期望ADC物質(例如，載藥量為2)且其他ADC物質(例如，載藥量為1、4、6等)之含量相對較低的程度。平均DAR值代表整體組合物(即，所有ADC物質放在一起)之載藥量之加權平均數。由於所用量化方法中之固有不確定度及完全去除商業環境中非主要ADC物質之困難，通常將可接受之DAR值或規格提供為平均值、範圍或分佈(即，平均DAR為2 +/- 0.5)。較佳地，包含在範圍(即，1.5至2.5)內之量測平均DAR之組合物可用於醫藥環境中。 因此，在一些實施例中，本發明將包含平均DAR為1、2、3、4、5、6、7或8 (各自+/- 0.5)之組合物。在其他實施例中，本發明將包含2、4、6或8 +/- 0.5之平均DAR。最後，在所選實施例中，本發明將包含2 +/- 0.5或4 +/- 0.5之平均DAR。應瞭解，在一些實施例中，範圍或偏差可為小於0.4。因此，在其他實施例中，組合物將包含1、2、3、4、5、6、7或8 (各自+/- 0.3)之平均DAR、2、4、6或8 +/- 0.3之平均DAR、甚至更佳地2或4 +/- 0.3之平均DAR或甚至2 +/- 0.3之平均DAR。在其他實施例中，IgG1偶聯物組合物較佳將包含平均DAR為1、2、3、4、5、6、7或8 (各自+/- 0.4)及相對較低含量(即，小於30%)之非主要ADC物質的組合物。在其他實施例中，ADC組合物將包含2、4、6或8 (各自+/- 0.4)之平均DAR及相對較低含量(＜ 30%)之非主要ADC物質。在一些實施例中，ADC組合物將包含2 +/- 0.4之平均DAR及相對較低含量(＜ 30%)之非主要ADC物質。在其他實施例中，在針對組合物中存在之所有其他DAR物質量測時，主要ADC物質(例如，載藥量為2或載藥量為4)將以大於50%之濃度、大於55%之濃度、大於60%之濃度、大於65%之濃度、大於70%之濃度、大於75%之濃度、大於80%之濃度、大於85%之濃度、大於90%之濃度、大於93%之濃度、大於95%之濃度或甚至大於97%之濃度存在。 如下文實例中所詳述，可藉由習用方式(例如UV-Vis分光光度法、反相HPLC、HIC、質譜術、ELISA及電泳)表徵來自偶聯反應之ADC製劑中之每抗體之藥物分佈。亦可測定就每抗體之藥物而言ADC之量化分佈。藉由ELISA，可測定ADC之特定製劑中每抗體之藥物之平均值。然而，每抗體之藥物分佈值不可由ELISA之抗體-抗原結合及檢測限制辨別。用於檢測抗體-藥物偶聯物之ELISA分析亦不確定藥物部分是否附接至抗體，例如重鏈或輕鏈片段或特定胺基酸殘基。 Ⅵ.診斷及篩選 A．診斷 本發明提供用於檢測、診斷或監測增殖性病症之活體外及活體內方法及自患者篩選細胞以鑑別包括致瘤細胞之腫瘤細胞的方法。該等方法包括鑑別患有癌症之個體用於治療癌症或監測其進展，其包含使患者或自患者獲得之樣品(活體內或活體外)與能夠特異性識別TNFRSF21決定子並與其締合之檢測劑(例如，抗體或核酸探針)接觸，及檢測樣品中檢測劑之存在或不存在或締合程度。在所選實施例中，檢測劑將包含與如本文所述可檢測標記或報導基因分子締合之抗體。在某些其他實施例中，將使用二級經標記抗體(例如，抗鼠類抗體)投與及檢測TNFRSF21抗體。在其他實施例(例如，原位雜交或ISH)中，將使用與基因組TNFRSF21決定子反應之核酸探針來檢測、診斷或監測增殖性病症。 更通常地，TNFRSF21決定子之存在及/或含量可使用熟習此項技術者可獲得之多種技術中之任一者來量測用於蛋白質或核酸分析，該等技術為例如直接物理量測(例如質譜)、結合分析(例如免疫分析、凝集分析及免疫層析分析)、聚合酶鏈反應(PCR、RT-PCR；RT-qPCR)技術、具支鏈寡核苷酸技術、北方墨點(Northern blot)技術、寡核苷酸雜交技術及原位雜交技術。該方法亦可包含量測源自化學反應之信號，例如吸光度之變化、螢光之變化、化學發光或電化學發光之產生、反射率、折射率或光散射之變化、可檢測標記自表面之累積或釋放、氧化或還原或氧化還原物質、電流或電位、磁場之變化等。適宜檢測技術可經由標記之光致發光(例如，經由量測螢光、時間解析螢光、衰減波螢光、上轉換磷光體、多光子螢光等)、化學發光、電化學發光、光散射、吸光度、放射性、磁場、酶活性(例如，經由引起吸光度或螢光之變化或引起化學發光發射之酶反應來量測酶活性)量測該等標記以量測經標記結合試劑之參與來檢測結合事件。另一選擇為，可使用無需使用標記之檢測技術，例如基於量測質量(例如表面聲波量測)、折射率(例如表面電漿子共振量測)或分析物之固有發光之技術。 在一些實施例中，檢測劑與樣品中之特定細胞或細胞組份之締合指示該樣品可含有腫瘤生成細胞，由此表示可使用如本文所述之抗體或ADC有效地治療患有癌症之個體。 在某些較佳實施例中，分析可包含免疫組織化學(IHC)分析或其變化形式(例如，螢光、發色、標準ABC、標準LSAB等)、免疫化學或其變化形式(例如，直接、間接、螢光、發色等)或原位雜交(ISH)或其變化形式(例如，發色原位雜交(CISH)或螢光原位雜交(DNA-FISH或RNA-FISH))。 就此而言，本發明之某些態樣包含使用經標記之TNFRSF21用於免疫組織化學(IHC)。更特定而言，可使用TNFRSF21 IHC作為診斷工具來幫助診斷多種增殖性病症及監測對治療(包括TNFRSF21抗體療法)之潛在反應。在某些實施例中，TNFRSF21抗體將偶聯至一或多個報導基因分子。在其他實施例中，TNFRSF21抗體將未經標記且將利用與一或多個報導基因分子締合之單獨試劑(例如，抗鼠類抗體)檢測。如本文所論述且如下文實例中所顯示，可對已經化學固定(包括(但不限於)：甲醛、戊二醛、四氧化鋨、重鉻酸鉀、乙酸、醇、鋅鹽、氯化汞、四氧化鉻及苦味酸)及包埋(包括(但不限於)：乙二醇甲基丙烯酸酯、石蠟及樹脂)或經由冷凍保藏之組織實施相容性診斷分析。該等分析可用於指導治療決策及確定劑量方案及時刻。 本發明之其他尤其相容之態樣涉及使用原位雜交來檢測或監測TNFRSF21決定子。原位雜交技術或ISH為彼等熟習此項技術者所熟知。簡言之，將細胞固定且將含有特定核苷酸序列之可檢測探針添加至經固定細胞中。若該等細胞含有互補核苷酸序列，則可檢測到之探針將與其雜交。可使用本文所述之序列資訊設計探針來鑑別表現基因型TNFRSF21決定子之細胞。探針較佳與對應於該等決定子之核苷酸序列雜交。雜交條件可以常規方式最佳化以藉由不完全互補雜交使背景信號最小化，但較佳地探針較佳與所選TNFRSF21決定子完全互補。在所選實施例中，探針經附接至可容易地藉由標準螢光方法檢測之探針之螢光染料標記。 相容性活體內治療診斷劑或診斷分析可包含業內公認成像或監測技術，例如磁共振成像、電腦化斷層掃描(例如CAT掃描)、正電子斷層掃描(例如PET掃描)、放射線攝影、超音波等，如彼等熟習此項技術者將已知。 在某些實施例中，本發明抗體可用於檢測並量化患者樣品(例如，血漿或血液)中之特定決定子(例如，TNFRSF21蛋白)之含量，其又可用於檢測、診斷或監測與相關決定子相關之增殖性病症。舉例而言，血液及骨髓樣品可結合流式細胞術使用以檢測並量測TNFRSF21表現(或另一共表現標記物)並監測疾病之進展及/或對治療之反應。在相關實施例中，本發明抗體可用於檢測、監測及/或量化活體內或活體外循環腫瘤細胞(WO 2012/0128801)。在其他實施例中，循環腫瘤細胞可包含腫瘤生成細胞。 在本發明之某些實施例中，可在療法或方案之前使用所揭示之抗體評價或表徵個體或個體樣品中之腫瘤生成細胞來確立基線。在其他實例中，可評價源自所治療個體之樣品之腫瘤生成細胞。 在另一實施例中，本發明提供活體內分析癌症進展及/或致病性之方法。在另一實施例中，活體內癌症進展及/或致病性之分析包含測定腫瘤進展之程度。在另一實施例中，分析包含鑑別腫瘤。在另一實施例中，對原發性腫瘤實施腫瘤進展之分析。在另一實施例中，如熟習此項技術者已知，根據癌症類型，隨時間實施分析。在另一實施例中，在活體內執行源自原發性腫瘤之轉移細胞之繼發性腫瘤之進一步分析。在另一實施例中，分析繼發性腫瘤之大小及形狀。在一些實施例中，實施進一步離體分析。 在另一實施例中，本發明提供活體內分析癌症進展及/或致病性之方法，其包括測定細胞轉移或檢測及量化循環腫瘤細胞之含量。在又一實施例中，細胞轉移之分析包含測定在與原發性腫瘤不連續之位點之細胞之進行性生長。在一些實施例中，採取程序以監測經由血管系統、淋巴管、在體腔內或其組合分散之腫瘤細胞。在另一實施例中，鑒於細胞遷移、散佈、外滲、增殖或其組合實施細胞轉移分析。 在某些實例中，可在療法之前使用所揭示抗體評價或表徵個體或個體之樣品中之致瘤細胞以確立基線。在其他實例中，樣品係源自經治療之個體。在一些實例中，在個體開始或終止治療後至少約1、2、4、6、7、8、10、12、14、15、16、18、20、30、60、90天、6個月、9個月、12個月、或＞12個月取樣品。在某些實例中，在特定數目之劑量後(例如，在療法之2、5、10、20、30或更多個劑量後)評價或表徵致瘤細胞。在其他實例中，在接受一或多個療法後1週、2週、1個月、2個月、1年、2年、3年、4年或更長時間表徵或評價致瘤細胞。 B.篩選 在某些實施例中，本發明抗體可用於篩選樣品以鑑別藉由與決定子相互作用改變腫瘤細胞之功能或活性之化合物或試劑(例如，抗體或ADC)。在一個實施例中，使腫瘤細胞與抗體或ADC接觸且抗體或ADC可用於篩選腫瘤用於表現特定靶標(例如TNFRSF21)之細胞，以鑑別該等細胞用於出於目的(包括但不限於診斷目的)以監測該等細胞以測定治療效能或富集用於該等表現靶標之細胞之細胞群體。 在又一實施例中，方法包括使腫瘤細胞與測試試劑或化合物直接或間接接觸並確定測試試劑或化合物是否調節決定子相關之腫瘤細胞之活性或功能，例如細胞形態或存活率變化、標記物之表現、分化或去分化、細胞呼吸、粒線體活性、膜完整性、成熟、增殖、存活率、細胞凋亡或細胞死亡。直接相互作用之一個實例係物理相互作用，而間接相互作用包括(例如)組合物對中間分子之作用，該中間分子又作用於參照實體(例如，細胞或細胞培養物)。 篩選方法包括高通量篩選，可包括視情況位於或放置於預定位置(例如在培養皿、管、燒瓶、滾瓶或板上)之細胞之陣列(例如，微陣列)。高通量機器或人工操作方法可探測化學相互作用並測定短時間段內許多基因之表現程度。已研發利用分子信號之技術，例如經由螢光團或微陣列(Mocellin及Rossi, 2007, PMID: 17265713)及以極快速率處理資訊之自動化分析(例如，參見Pinhasov等人，2004, PMID: 15032660)。可篩選之文庫包括(例如)小分子文庫、噬菌體展示文庫、完全人類抗體酵母展示文庫(Adimab)、siRNA文庫及腺病毒轉染載體。 VII.醫藥製劑及治療用途 A.調配物及投與途徑 可以各種方式使用業內公認之技術調配本發明之抗體或ADC。在一些實施例中，本發明之治療組合物可單獨或與最少量其他組份一起投與，而其他可視情況經調配以含有適宜醫藥上可接受之載劑。如本文所用「醫藥上可接受之載劑」包含業內熟知且可自商業來源獲得用於醫藥製劑之賦形劑、媒劑、佐劑及稀釋劑(例如，參見Gennaro (2003)Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus , 第20版, Mack Publishing；Ansel等人 (2004)Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 第7版, Lippencott Williams及Wilkins；Kibbe等人(2000)Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第3版，Pharmaceutical Press.) 適宜醫藥上可接受之載劑包含呈相對惰性且可有利於投與抗體或ADC或可幫助將活性化合物處理成經醫藥上最佳化以遞送至作用位點之製劑的物質。 該等醫藥上可接受之載劑包括可改變調配物之形式、稠度、黏性、pH、張力、穩定性、滲透度、藥物動力學、蛋白質聚集或溶解性之藥劑，且包括緩衝劑、潤濕劑、乳化劑、稀釋劑、囊封劑及皮膚增滲劑。載劑之某些非限制性實例包括鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、精胺酸、蔗糖、水、甘油、乙醇、山梨醇、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉及其組合。用於全身投與之抗體可經調配用於經腸、非經腸或局部投與。實際上，可同時使用所有三種類型之調配物來達成活性成份之全身投與。用於非經腸及經腸藥物遞送之賦形劑以及調配物闡述於Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000)，第20版，Mack Publishing中。 適於經腸投與之調配物包括硬質或軟質明膠膠囊、丸劑、錠劑(包括包衣錠劑)、酏劑、懸浮液、糖漿或吸入劑及其控制釋放形式。 適於非經腸投與(例如，藉由注射)之調配物包括水性或非水性、等滲、無熱原、無菌液體(例如溶液、懸浮液)，其中活性成份溶解、懸浮或以其他方式提供(例如於脂質體或其他微粒中)。該等液體可另外含有使調配物與預期接受者之血液(或其他相關體液)等滲之其他醫藥上可接受之載劑，例如抗氧化劑、緩衝劑、防腐劑、穩定劑、抑菌劑、懸浮劑、增稠劑及溶質。賦形劑之實例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油及諸如此類。適用於該等調配物中之醫藥上可接受之等滲載劑之實例包括氯化鈉注射液、林格氏溶液(Ringer's Solution)或乳酸化林格氏注射液。 在尤佳實施例中，本發明之調配組合物可經凍乾以提供抗體或ADC之粉末化形式，隨後在投與之前可將其重構。可藉由凍乾包含所揭示抗體或ADC之溶液以產生包含活性成分以及任何可選共溶解相容成分之粉末來生成用於製備可注射溶液之無菌粉末。通常，藉由向含有鹼性分散介質或溶劑(例如，稀釋劑)之無菌媒劑中納入活性化合物及視情況其他生物相容性成分製備分散液或溶液。相容性稀釋劑係醫藥上可接受(對投與至人類安全且無毒)且可用於製備液體調配物(例如在凍乾後重構之調配物)者。實例性稀釋劑包括無菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。在替代實施例中，稀釋劑可包括鹽及/或緩衝劑之水溶液。 在某些較佳實施例中，抗TNFRSF21抗體或ADC將與醫藥上可接受之糖組合凍乾。「醫藥上可接受之糖」係在與所關注蛋白組合時顯著防止或減少蛋白質在儲存時之化學及/或物理不穩定性的分子。此時意欲凍乾且隨後重構調配物。如本文所用醫藥上可接受之糖亦可稱作「凍乾保護劑」。實例性糖及其相應糖醇包括：胺基酸，例如麩胺酸單鈉或組胺酸；甲胺，例如甜菜鹼；易溶鹽，例如硫酸鎂；多元醇，例如三羥或更高分子量糖醇，例如甘油、聚葡萄糖、赤藻糖醇、甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇及甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；PLURONICS® ；及其組合。其他實例性凍乾保護劑包括甘油及明膠、及糖蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖及水蘇糖。還原糖之實例包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖及乳果糖。非還原糖之實例包括選自糖醇及其他直鏈多元醇之多羥基化合物的非還原醣苷。較佳糖醇係單醣苷、尤其藉由還原二醣(例如乳糖、麥芽糖、乳果糖及麥芽酮糖)獲得之彼等化合物。醣苷側基可為葡萄糖苷或半乳糖苷。糖醇之其他實例係葡萄糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇及異麥芽酮糖。較佳醫藥上可接受之糖係非還原糖海藻糖或蔗糖。向調配物中添加「保護量」之醫藥上可接受之糖(例如凍乾前)，保護量意指在儲存期間(例如，在重構及儲存後)，蛋白質基本上保留其物理及化學穩定性及完整性。 熟習此項技術者應瞭解，可以如下範圍內之濃度向液體或經凍乾調配物中添加相容性凍乾保護劑：約1 mM至約1000 mM、約25 mM至約750 mM、約50 mM至約500 mM、約100 mM至約300 mM、約125 mM至約250 mM、約150 mM至約200 mM或約165 mM至約185 mM。在某些實施例中，可添加凍乾保護劑以提供約10 mM、約25 mM、約50 mM、約75 mM、約100 mM、約125 mM、約130 mM、約140 mM、約150 mM、約160 mM、約165 mM、約170 mM、約175 mM、約180 mM、約185 mM、約190 mM、約200 mM、約225 mM、約250 mM、約300 mM、約400 mM、約500 mM、約600 mM、約700 mM、約800 mM、約900 mM或約1000 mM之濃度。在某些較佳實施例中，凍乾保護劑可包含醫藥上可接受之糖。在尤佳態樣中，醫藥上可接受之糖將包含海藻糖或蔗糖。 在其他所選實施例中，本發明之液體及經凍乾之調配物可包含某些化合物，包括胺基酸或其醫藥上可接受之鹽，以用作穩定或緩衝劑。該等化合物可以如下範圍內之濃度添加：約1 mM至約100 mM、約5 mM至約75 mM、約5 mM至約50 mM、約10 mM至約30 mM或約15 mM至約25 mM。在某些實施例中，可添加緩衝劑以提供約1 mM、約5 mM、約10 mM、約15 mM、約20 mM、約25 mM、約30 mM、約35 mM、約40 mM、約50 mM、約60 mM、約70 mM、約80 mM、約90 mM或約100 mM之濃度。在其他所選實施例中，可添加緩衝劑以提供約5 mM、約10 mM、約15 mM、約20 mM、約25 mM、約30 mM、約35 mM、約40 mM、約50 mM、約60 mM、約70 mM、約80 mM、約90 mM或約100 mM之濃度。在某些較佳實施例中，緩衝劑將包含組胺酸鹽酸鹽。 在又一些所選實施例中，本發明之液體及經凍乾調配物可包含作為穩定劑之非離子型表面活性劑，例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80。該等化合物可以如下範圍內之濃度添加：約0.1 mg/ml至約2.0 mg/ml、約0.1 mg/ml至約1.0 mg/ml、約0.2 mg/ml至約0.8 mg/ml、約0.2 mg/ml至約0.6 mg/ml或約0.3 mg/ml至約0.5 mg/ml。在某些實施例中，可添加表面活性劑以提供約0.1 mg/ml、約0.2 mg/ml、約0.3 mg/ml、約0.4 mg/ml、約0.5 mg/ml、約0.6 mg/ml、約0.7 mg/ml、約0.8 mg/ml、約0.9 mg/ml或約1.0 mg/ml之濃度。在其他所選實施例中，可添加表面活性劑以提供約1.1 mg/ml、約1.2 mg/ml、約1.3 mg/ml、約1.4 mg/ml、約1.5 mg/ml、約1.6 mg/ml、約1.7 mg/ml、約1.8 mg/ml、約1.9 mg/ml或約2.0 mg/ml之濃度。在某些較佳實施例中，表面活性劑將包含聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯40。 用於非經腸投與(例如，靜脈內注射)之所揭示抗體或ADC之相容性調配物可包含約10 μg/mL至約100 mg/mL之ADC或抗體濃度。在某些所選實施例中，抗體或ADC濃度將包含20 μg/ mL、40 μg/ mL、60 μg/ mL、80 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300、μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL、600 μg/mL、700 μg/mL、800 μg/mL、900 μg/mL或1 mg/mL。在其他實施例中，ADC濃度將包含2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL、12 mg/mL、14 mg/mL、16 mg/mL、18 mg/mL、20 mg/mL、25 mg/mL、30 mg/mL、35 mg/mL、40 mg/mL、45 mg/mL、50 mg/mL、60 mg/mL、70 mg/mL、80 mg/mL、90 mg/mL或100 mg/mL。 不管是否自凍乾粉末重構，液體TNFRSF21 ADC調配物(例如，如緊接上文所述)可在投與之前進一步經稀釋(較佳在水性載劑中)。舉例而言，可將上文所提及之液體調配物進一步稀釋至含有0.9%注射用氯化鈉(USP)或等效物(已作必要之修正)之輸注袋中，以達成供投與之期望劑量量。在某些態樣中，使用IV裝置經由靜脈內輸注投與完全稀釋之TNFRSF21 ADC溶液。較佳，投與之TNFRSF21 ADC藥物溶液(藉由靜脈內(IV)輸注或注射)係澄清、無色的且不含可見顆粒。 本發明之化合物及組合物可藉由各種途徑(包括但不限於經口、靜脈內、動脈內、皮下、非經腸、鼻內、肌內、心內、室內、氣管內、經頰、經直腸、腹膜內、真皮內、局部、經皮及鞘內或藉由植入或吸入)活體內投與有需要之個體。可將標的組合物調配成呈固體、半固體、液體或氣體形式之製劑；包括但不限於錠劑、膠囊、粉末、顆粒、軟膏劑、溶液、栓劑、灌腸劑、注射劑、吸入劑及氣溶膠。適當調配物及投與途徑可根據預期應用及治療方案進行選擇。 B.劑量及劑量方案 具體劑量方案(即，劑量、時刻及重複次數)將端視具體個體以及經驗考慮(例如藥物動力學(例如半衰期、清除速率等))而定。熟習此項技術者(例如主治醫師)可基於考慮病況及所治療病況之嚴重程度、所治療個體之年齡及一般健康狀況及諸如此類來確定投與頻率。投與頻率可在療法進程內基於所選組合物及投藥方案之效能之評價進行調整。該評價可基於特定疾病、病症或病況之標記物來進行。在個體患有癌症之實施例中，該等評價包括經由觸診或目測觀察直接量測腫瘤大小；藉由x射線或其他成像技術間接量測腫瘤大小；如藉由腫瘤樣品之直接腫瘤生檢及顯微鏡檢查評價之改良；量測根據本文所述方法鑑別之間接腫瘤標記物(例如用於前列腺癌之PSA)或抗原；增殖性或腫瘤生成細胞數量之減少、該等贅瘤性細胞減少之維持；贅瘤性細胞增殖之減少；或轉移之發展延遲。 本發明之TNFRSF21抗體或ADC可以各種範圍投與。該等範圍包括約5 μg/kg體重至約100 mg/kg體重/劑量；約50 μg/kg體重至約5 mg/kg體重/劑量；約100 μg/kg體重至約10 mg/kg體重/劑量。其他範圍包括約100 μg/kg體重至約20 mg/kg體重/劑量及約0.5 mg/kg體重至約20 mg/kg體重/劑量。在某些實施例中，劑量係至少約100 μg/kg體重、至少約250 μg/kg體重、至少約750 μg/kg體重、至少約3 mg/kg體重、至少約5 mg/kg體重、至少約10 mg/kg體重。 在所選實施例中，TNFRSF21抗體或ADC將以約10、20、30、40、50、60、70、80、90或100 μg/kg體重/劑量投與(較佳靜脈內)。其他實施例可包含投與約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000 μg/kg體重/劑量之抗體或ADC。在其他實施例中，所揭示偶聯物將以2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9或10 mg/kg投與。在又一些實施例中，偶聯物可以12、14、16、18或20 mg/kg體重/劑量投與。在其他實施例中，偶聯物可以25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90或100 mg/kg體重/劑量投與。利用本文教示，基於臨床前動物研究、臨床觀察及標準醫學及生物化學技術及量測，熟習此項技術者可容易地測定各種TNFRSF21抗體或ADC之適當劑量。 可利用如U.S.P.N. 7,744,877中揭示之體表面積(BSA)計算預測其他劑量方案。如眾所周知，BSA係使用患者之身高及體重計算且提供個體之大小之量度，如由其體表面積所代表。在某些實施例中，偶聯物可以1 mg/m2 至800 mg/m2 、50 mg/m2 至500 mg/m2 之劑量及以100 mg/m2 、150 mg/m2 、200 mg/m2 、250 mg/m2 、300 mg/m2 、350 mg/m2 、400 mg/m2 或450 mg/m2 之劑量投與。亦應瞭解，可使用業內公認之經驗技術以測定適當劑量。 可以具體時間表投與抗TNFRSF21抗體或ADC。通常，向個體投與一或多次有效劑量之TNFRSF21偶聯物。更特定而言，每月一次、每月一次以上或少於每月一次向個體投與有效劑量之ADC。在某些實施例中，可投與多次有效劑量之TNFRSF21抗體或ADC，包括持續至少1個月、至少6個月、至少1年、至少2年之時段或若干年之時段。在其他實施例中，在所揭示抗體或ADC之投與之間可經過若干天(2天、3天、4天、5天、6天或7天)、若干週(1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週或8週)或若干個月(1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月或8個月)或甚至一年或若干年。 在一些實施例中，涉及偶聯抗體之治療進程將包含在數週或數月之時段內多個劑量之所選藥物產物。更具體而言，本發明之抗體或ADC可每天一次、每兩天、每四天、每週、每十天、每兩週、每三週、每月、每六週、每兩個月、每十週或每三個月投與。就此而言，應瞭解，基於患者反應及臨床實踐，可改變各劑量或可調節間隔。本發明亦涵蓋不連續投與或分成若干部分投與之每日劑量。本發明組合物及抗癌劑可隔數天或數週交替投與；或可給出抗體治療之順序，之後進行一或多次抗癌劑療法治療。無論如何，如彼等熟習此項技術者應理解，化學治療劑之適當劑量通常為大約臨床療法中已採用之彼等，其中化學治療劑係單獨或與其他化學治療劑組合投與。 在另一實施例中，本發明之TNFRSF21抗體或ADC治療可用於維持療法中來減少或消除疾病初始呈現後腫瘤復發之機會。較佳地，將治療該病症且消除、減少或以其他方式改善初始腫瘤團塊，故患者為無症狀或處於緩解中。此時，即使使用標準診斷程序存在極少或無疾病之適應症，仍可向個體投與一或多次醫藥有效量之所揭示抗體。 在另一較佳實施例中，本發明之調節劑可以預防方式或作為輔助療法用於預防減積程序後之腫瘤轉移或降低其可能性。如本發明中所用，「減積程序」意指減小腫瘤團塊或改善腫瘤負荷或腫瘤增殖之任何程序、技術或方法。實例性減積程序包括(但不限於)手術、輻射治療(即，束輻射)、化學療法、免疫療法或燒蝕。可在由熟習此項技術者根據本發明容易確定之適宜時間，如臨床、診斷或治療診斷程序所建議投與所揭示之ADC來減少腫瘤轉移。 本發明之其他實施例包含向無症狀但具有罹患病症風險之個體投與所揭示之抗體或ADC。即，本發明之抗體或ADC可在真正預防意義下使用並給予已經檢查或測試且具有一或多個所述風險因子(例如基因組適應症、家族病史、活體內或活體外測試結果等)但尚未罹患贅瘤之患者。 對於已給予一或多次投與之個體中所揭示治療組合物，亦可憑經驗確定劑量及方案。舉例而言，可給予個體遞增劑量之如本文所述產生之治療組合物。在所選實施例中，可分別基於經驗確定或所觀察到之負作用或毒性逐漸增加或減少或減弱劑量。為評價所選組合物之效能，可如前文所述跟蹤特定疾病、病症或病況之標記物。對於癌症而言，該等評價包括經由觸診或目測觀察直接量測腫瘤大小；藉由x射線或其他成像技術間接量測腫瘤大小；如藉由腫瘤樣品之直接腫瘤生檢及顯微鏡檢查評價之改良；量測根據本文所述方法鑑別之間接腫瘤標記物(例如用於前列腺癌之PSA)或致瘤抗原、疼痛或麻痹減輕；改良與腫瘤相關之言語、視力、呼吸或其他失能；食欲增加；或如藉由所接受測試所量測生活品質提高或存活延長。熟習此項技術者應明瞭，劑量將根據個體、贅瘤性病況之類型、贅瘤性病況之階段、贅瘤性病況是否開始轉移至個體之其他位置及所使用之過去及當前治療而變。 C.組合療法 組合療法可尤其用於減少或抑制不期望贅瘤性細胞增殖、減少癌症發生、減少或預防癌症復發、或減少或預防癌症擴散或轉移。在該等情形下，本發明之調節劑可藉由去除原本可維持腫瘤團塊及使其永存之CSC用作增敏或化學增敏劑且藉此容許更有效使用當前標準護理減積或抗癌劑。亦即，在某些實施例中，所揭示抗體或ADC可提供增強另一投與治療劑之作用模式之增強之效應(例如，加和或協同性質)。在本發明上下文中，「組合療法」應寬泛解釋且僅係指投與抗TNFRSF21抗體或ADC及一或多種抗癌劑，該等抗癌劑包括但不限於細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減積劑、化學治療劑、放射療法及放射治療劑、靶向抗癌劑(包括單株抗體及小分子實體)、BRM、治療抗體、癌症疫苗、細胞介素、激素療法、放射療法及抗轉移劑及免疫治療劑，包括特異性及特異性方法。 無需組合結果係在單獨進行每一治療(例如抗體及抗癌劑)時觀察到之效應的加和。儘管通常期望至少加和效應，但高於單一療法之一之任何增加之抗腫瘤效應係有益的。此外，本發明無需組合治療以展現協同效應。然而，熟習此項技術者應瞭解，利用包含較佳實施例之某些所選組合，可觀察到協同作用。 因此，在某些態樣中，組合療法在癌症治療中相對於以下具有治療協同作用或改良可量測之治療效應：(i) 單獨使用之抗TNFRSF21抗體或ADC，或(ii) 單獨使用之治療性部分，或(iii) 使用治療性部分與另一治療性部分之組合而不添加抗TNFRSF21抗體或ADC。如本文所用術語「治療協同作用」意指抗TNFRSF21抗體或ADC及一或多個治療性部分之組合具有大於抗TNFRSF21抗體或ADC及一或多個治療性部分之組合之加和效應的治療效應。 藉由與對照或基線量測比較來量化所揭示組合之期望結果。如本文所用，諸如「改良」、「增加」或「減少」等相對術語指示相對於對照(例如在同一個體中在起始本文所述治療前之量測或在對照個體(或多個對照個體)中在不存在本文所述抗TNFRSF21抗體或ADC下但在存在其他治療性部分(例如標準護理治療)下之量測)的值。代表性對照個體係患有與所治療個體相同形式之癌症之個體，其與所治療個體之年齡大致相同(以確保所治療個體與對照個體之疾病階段相當)。 對療法之反應之變化或改良通常在統計學上顯著。如本文所用，術語「顯著性」或「顯著」係指兩個或更多個實體之間存在非隨機相關之可能性之統計學分析。為確定關係是否「顯著」或具有「顯著性」，可計算「p值」。低於使用者定義之截止點之p值視為顯著。小於或等於0.1、小於0.05、小於0.01、小於0.005或小於0.001之p值可視為顯著。 協同治療效應可係為由單一治療性部分或抗TNFRSF21抗體或ADC誘發之治療效應，或由給定組合之抗TNFRSF21抗體或ADC或單一治療性部分誘發之治療效應之和的至少約2倍、或至少約5倍、或至少約10倍、或至少約20倍、或至少約50倍、或至少約100倍之效應。協同治療效應亦可觀察為與由單一治療性部分或抗TNFRSF21抗體或ADC誘發之治療效應或由給定組合之抗TNFRSF21抗體或ADC或單一治療性部分誘發之治療效應之和相比，治療效應增加至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%、或更大。協同效應亦係在治療劑組合使用時容許減少治療劑之劑量之效應。 在實踐組合療法中，抗TNFRSF21抗體或ADC及治療性部分可以單一組合物或以兩種或更多種不同組合物使用相同或不同投與途徑同時投與個體。另一選擇為，使用抗TNFRSF21抗體或ADC之治療可在治療性部分治療之前或之後，例如間隔在數分鐘至數週之範圍內。在一個實施例中，治療性部分及抗體或ADC二者彼此係在約5分鐘至約兩週內投與。在其他實施例中，在投與抗體與治療性部分之間可經過若干天(2天、3天、4天、5天、6天或7天)、若干週(1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週或8週)或若干個月(1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月或8個月)。 組合療法可經投與直至病況按照不同時間表(例如每天一次、兩次或三次、每兩天一次、每三天一次、每週一次、每兩週一次、每月一次、每兩個月一次、每三個月一次、每六個月一次)被治療、減輕或治癒，或可連續投與。抗體及治療性部分可交替數天或數週投與；或可給出抗TNFRSF21抗體或ADC之順序，然後使用其他治療性部分治療一或多次。在一個實施例中，抗TNFRSF21抗體或ADC係與一或多個治療性部分組合投與用於短治療週期。在其他實施例中，投與該組合治療用於長治療週期。該組合療法可經由任何途徑來投與。 在所選實施例中，本發明之化合物及組合物可結合檢查點抑制劑(例如PD-1抑制劑或PD-L1抑制劑)使用。PD-1以及其配體PD-L1係抗腫瘤T淋巴球反應之負調控劑。在一個實施例中，組合療法可包含投與抗TNFRSF21抗體或ADC以及抗PD-1抗體(例如派姆單抗(pembrolizumab)、尼沃魯單抗(nivolumab)、匹利珠單抗(pidilizumab))及視情況一或多種其他治療性部分。在另一實施例中，組合療法可包含投與抗TNFRSF21抗體或ADC以及抗PD-L1抗體(例如阿維魯單抗(avelumab)、阿替珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab))及視情況一或多種其他治療性部分。在又一實施例中，組合療法可包含投與抗TNFRSF21抗體或ADC以及投與患者之抗PD-1抗體或抗PD-L1，該等患者在用檢查點抑制劑及/或靶向BRAF組合療法(例如威羅菲尼(vemurafenib)或達拉菲尼(dabrafinib))治療後繼續進展。 在一些實施例中，抗TNFRSF21抗體或ADC可與各種一線癌症治療組合使用。因此，在所選實施例中，組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及細胞毒性劑(例如異環磷醯胺(ifosfamide)、絲裂黴素C、長春地辛(vindesine)、長春鹼、依託泊苷、伊立替康(ironitecan)、吉西他濱(gemcitabine)、紫杉烷、長春瑞濱(vinorelbine)、胺甲喋呤及培美曲塞(pemetrexed)))及視情況一或多個其他治療性部分。在某些贅瘤性適應症(例如，血液適應症，例如AML或多發性骨髓瘤)中，所揭示之ADC可與細胞毒性劑組合使用，該等細胞毒性劑例如阿糖胞苷(AraC)加蒽環類抗生素(阿柔比星(aclarubicin)、安吖啶(amsacrine)、多柔比星、道諾黴素、伊達比星(idarubixcin)等)或米托蒽醌、氟達拉濱(fludarabine)；羥基脲(hydroxyurea)、氯法拉濱(clofarabine)、克羅拉濱(cloretazine)。在其他實施例中，本發明之ADC可與G-CSF或GM-CSF啟動、去甲基劑(例如阿紮胞苷或地西他濱(decitabine))、FLT3-選擇性酪胺酸激酶抑制劑(例如，米哚妥林(midostaurin)、來他替尼(lestaurtinib)及舒尼替尼(sunitinib))、全反式視黃酸(ATRA)及三氧化砷組合投與(其中後兩個組合可對於急性前骨髓細胞性白血病(APL)尤其有效)。 在另一實施例中，組合療法包含使用TNFRSF21抗體或ADC及基於鉑之藥物(例如卡鉑或順鉑)及視情況一或多個其他治療性部分(例如長春瑞濱；吉西他濱；紫杉烷，例如多西他賽(docetaxel)或太平洋紫杉醇；伊立替康；或培美曲塞)。 在某些實施例中，例如，在BR-ERPR、BR-ER或BR-PR癌症之治療中，組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及一或多個闡述為「激素療法」之治療性部分。如本文所用「激素療法」係指例如他莫昔芬(tamoxifen)；促性腺激素或促黃體激素釋放激素(GnRH或LHRH)；依維莫司(everolimus)及依西美坦(exemestane)；托瑞米芬(toremifene)；或芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、依西美坦或氟維司群(fulvestrant))。 在另一實施例中，例如，在BR-HER2之治療中，組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及曲妥珠單抗(trastuzumab)或阿多-曲妥珠單抗艾坦辛(ado-trastuzumab emtansine) (Kadcyla)及視情況一或多個其他治療性部分(例如帕妥珠單抗(pertuzumab)及/或多西他賽)。 在一些實施例中，例如，在轉移性乳癌之治療中，組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及紫杉烷(例如多西他賽或太平洋紫杉醇)及視情況其他治療性部分，例如蒽環類抗生素(例如多柔比星或泛艾黴素)及/或埃雷布林(eribulin)。 在另一實施例中，例如，在轉移性或復發性乳癌或BRCA突變體乳癌之治療中，組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及甲地孕酮(megestrol)及視情況其他治療性部分。 在其他實施例中，例如，在BR-TNBC之治療中，組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制劑(例如BMN-673、奧拉帕尼(olaparib)、瑞卡帕尼(rucaparib)及維利帕尼(veliparib))及視情況其他治療性部分。 在另一實施例中，組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及PARP抑制劑及視情況一或多個其他治療性部分。 在另一實施例中，例如，在乳癌之治療中，組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及環磷醯胺及視情況其他治療性部分(例如多柔比星、紫杉烷、泛艾黴素、5-FU及/或胺甲喋呤)。 在另一實施例中，用於治療EGFR陽性NSCLC之組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及阿法替尼(afatinib)及視情況一或多個其他治療性部分(例如厄洛替尼(erlotinib)及/或貝伐珠單抗(bevacizumab))。 在另一實施例中，用於治療EGFR陽性NSCLC之組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及厄洛替尼及視情況一或多個其他治療性部分(例如貝伐珠單抗)。 在另一實施例中，用於治療ALK陽性NSCLC之組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及色瑞替尼(ceritinib) (Zykadia)及視情況一或多個其他治療性部分。 在另一實施例中，用於治療ALK陽性NSCLC之組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及克唑替尼(crizotinib) (Xalcori)及視情況一或多個其他治療性部分。 在另一實施例中，組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及貝伐珠單抗及視情況一或多個其他治療性部分(例如吉西他濱或紫杉烷，例如多西他賽或太平洋紫杉醇；及/或鉑類似物)。 在另一實施例中，組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及貝伐珠單抗及視情況環磷醯胺。 在特定實施例中，用於治療鉑抗性腫瘤之組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及多柔比星及/或依託泊苷及/或吉西他濱及/或長春瑞濱及/或異環磷醯胺及/或甲硫四氫葉酸(leucovorin)調節之5-氟尿嘧啶及/或貝伐珠單抗及/或他莫昔芬；及視情況一或多個其他治療性部分。 在所選實施例中，所揭示抗體及ADC可與某些類固醇組合使用以潛在地使得療程更有效並減少副作用(例如發炎、噁心及過敏性)。可與本發明ADC組合使用之實例性類固醇包括(但不限於)氫化可體松(hydrocortisone)、地塞米松(dexamethasone)、甲基普賴蘇濃(methylprednisolone)及普賴蘇濃(prednisolone)。在尤佳態樣中，類固醇將包含地塞米松。 在一些實施例中，抗TNFRSF21抗體或ADC可與各種一線黑色素瘤治療組合使用。在一個實施例中，組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及達卡巴嗪及視情況一或多個其他治療性部分。在其他實施例中，組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及替莫唑胺(temozolamide)及視情況一或多個其他治療性部分。在另一實施例中，組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及基於鉑之治療性部分(例如卡鉑或順鉑)及視情況一或多個其他治療性部分。在一些實施例中，組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及長春花生物鹼治療性部分(例如長春鹼、長春瑞濱、長春新鹼或長春地辛)及視情況一或多個其他治療性部分。在一個實施例中，組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及介白素-2及視情況一或多種其他治療性部分。在另一實施例中，組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及干擾素-α及視情況一或多個其他治療性部分。 在其他實施例中，抗TNFRSF21抗體或ADC可與輔助黑色素瘤治療及/或手術程序(例如腫瘤切除術)組合使用。在一個實施例中，組合療法包含使用抗TNFRSF21抗體或ADC及干擾素-α及視情況一或多個其他治療性部分。 本發明亦提供抗TNFRSF21抗體或ADC與放射療法之組合。如本文所用術語「放射療法」意指誘導局部位於腫瘤細胞內之DNA損害之任一機制，例如γ-輻照、X射線、UV-輻照、微波、電子發射及諸如此類。亦涵蓋使用放射性同位素至腫瘤細胞之定向遞送之組合療法，且其可與組合使用或用作本文揭示之抗TNFRSF21抗體之偶聯物。通常，輻射療法係經約1週至約2週之時間段脈衝式投與。視情況，輻射療法可以單一劑量或以多個依序劑量投與。 在其他實施例中，抗TNFRSF21抗體或ADC可與下述化學治療劑中之一或多者組合使用。 D.抗癌劑 如本文所用術語「抗癌劑」係「治療性部分」之一個子集，該「治療性部分」又係闡述為「醫藥活性部分」之藥劑的子集。更特定而言，「抗癌劑」意指可用於治療細胞增殖性病症(例如癌症)之任何藥劑(或其醫藥上可接受之鹽)，且包括(但不限於)細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減積劑、化學治療劑、放射性治療劑、靶向抗癌劑、生物反應改質劑、治療性抗體、癌症疫苗、細胞介素、激素療法、抗轉移劑及免疫治療劑。注意，抗癌劑之上述分類並不彼此排斥且所選藥劑可屬一或多個類別。舉例而言，可將相容性抗癌劑分類為細胞毒性劑及化學治療劑。因此，上述術語中之每一者皆應根據本發明進行解釋，且然後根據其在醫學領域中之用途來解釋。 在較佳實施例中，抗癌劑可包括抑制或消除、或經設計以抑制或消除癌性細胞或可能變成癌性或產生腫瘤生成子代(例如，腫瘤生成細胞)之細胞的任何化學劑(例如，化學治療劑)。就此而言，所選化學劑(細胞週期依賴性試劑)通常針對為細胞生長或分裂所需之細胞內過程，且因此可尤其有效地針對通常快速生長及分裂之癌性細胞。例如，長春新鹼使微管解聚合，且因此抑制快速分裂之腫瘤細胞進入有絲分裂。在其他情形下，所選化學劑係細胞週期獨立地試劑，其在其壽命之任何時刻干擾細胞存活且可在定向治療劑(例如，ADC)中有效。舉例而言，某些吡咯并苯并二氮呯結合至細胞DNA之小溝並在遞送至核後抑制轉錄。關於組合療法或ADC組份之選擇，應瞭解，鑒於本發明，熟習此項技術者可容易地鑑別相容性細胞週期依賴性試劑及細胞週期獨立性試劑。 無論如何，且如上文所提到，應瞭解，除所揭示抗TNFRSF21抗體及本文揭示之ADC外，所選抗癌劑亦可彼此組合投與(例如，CHOP療法)。此外，應進一步瞭解，在所選實施例中，該等抗癌劑可包含偶聯物且可在投與之前與抗體締合。在某些實施例中，所揭示抗癌劑將連接至抗TNFRSF21抗體以提供如本文中揭示之ADC。 如本文所用術語「細胞毒性劑」 (或細胞毒素)通常意指對細胞具有毒性之物質，其毒性之處在於其降低或抑制細胞功能及/或引起腫瘤細胞破壞。在某些實施例中，該物質係源自活的生物體之天然存在之分子或其類似物(自天然來源純化或合成製備)。細胞毒性劑之實例包括(但不限於)細菌之小分子毒素或酶促活性毒素(例如，白喉毒素、假單胞菌屬內毒素及外毒素、葡萄球菌腸毒素A)、真菌之小分子毒素或酶促活性毒素(例如，α-帚麴菌素(α-sarcin)、侷限麴菌素)、植物之小分子毒素或酶促活性毒素(例如，相思子素、蓖麻毒素、莫迪素(modeccin)、槲寄生素、商陸抗病毒蛋白、皂草素、白樹毒素、苦瓜毒素、天花粉蛋白、大麥毒素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolacca mericana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、米特格林(mitegellin)、侷限麴菌素、酚黴素、新黴素及單端孢黴烯)或動物之小分子毒素或酶促活性毒素(例如細胞毒性RNA酶，例如細胞外胰臟RNA酶；DNA酶I，包括其片段及/或變體)。本文闡述其他相容性細胞毒性劑，包括某些放射性同位素、類美登素、奧裡斯他汀、尾海兔素、多卡米星、瓢菌素及吡咯并苯并二氮呯。 更通常地，可與本發明之抗體組合使用(或與其偶聯)之細胞毒性劑或抗癌劑之實例包括(但不限於)烷基化劑、磺酸烷基酯、阿那曲唑、瓢菌素、氮丙啶、乙烯亞胺及甲基蜜胺、多聚乙醯、喜樹鹼、BEZ-235、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚蟲素(bryostatin)、卡利斯他汀(callystatin)、CC-1065、色瑞替尼、克唑替尼、念珠藻素(cryptophycin)、尾海兔素、多卡米星、艾榴塞洛素(eleutherobin)、厄洛替尼、水鬼蕉鹼(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海綿抑制素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔達內黴素(enediyne dynemicin)、雙磷酸鹽、埃斯波黴素、色蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素C、坎磷醯胺(canfosfamide)、卡拉黴素(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、環磷醯胺、放線菌素D、柔紅黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星、泛艾黴素、依索比星(esorubicin)、依西美坦、氟尿嘧啶、氟維司群、吉非替尼(gefitinib)、伊達比星、拉帕替尼(lapatinib)、來曲唑、洛那法尼(lonafarnib)、麻西羅黴素(marcellomycin)、乙酸甲地孕酮、絲裂黴素、黴酚酸、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、帕唑帕尼(pazopanib)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、雷帕黴素(rapamycin)、羅多比星(rodorubicin)、索拉菲尼(sorafenib)、鏈黑黴素(鏈黑菌素)、鏈脲黴素(streptozocin)、他莫昔芬、檸檬酸他莫昔芬、替莫唑胺、塞替派(tepadina)、替吡法尼(tipifarnib)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凡德他尼(vandetanib)、伏氯唑(vorozole)、XL-147、淨司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝劑、葉酸類似物、嘌呤類似物、雄激素、抗腎上腺藥、葉酸補充劑(例如亞葉酸)、醋葡醛內酯(aceglatone)、醛磷醯胺醣苷(aldophosphamide glycoside)、胺基乙醯丙酸、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶、貝司特布斯(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依達曲沙(edatraxate)、地磷醯胺(defofamine)、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、依氟鳥胺酸(elfornithine)、伊利醋銨(elliptinium acetate)、埃博黴素(epothilone)、依託格魯(etoglucid)、硝酸鎵、羥基脲、香菇多醣、氯尼達明(lonidainine)、類美登素、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌、莫哌達醇(mopidanmol)、硝胺丙吖啶(nitraerine)、噴司他汀(pentostatin)、蛋胺氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌(losoxantrone)、鬼臼酸、2-乙基醯肼、丙卡巴肼(procarbazine)、多糖複合物、雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；SF-1126、西左非蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；單端孢黴烯(T-2毒素、黏液黴素A (verracurin A)、桿孢菌素A (roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷；環磷醯胺；噻替派；類紫杉醇(taxoid)、苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；胺甲喋呤；鉑類似物、長春鹼；鉑；依託泊苷；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞濱；能滅瘤；替尼泊苷；依達曲沙；道諾黴素；胺喋呤(aminopterin)；截瘤達(xeloda)；依班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康、拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸；類視色素；卡培他濱(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；甲硫四氫葉酸；奧沙利鉑(oxaliplatin)；XL518、減少細胞增殖之PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR及VEGF-A抑制劑及上述任一者之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。此定義亦包括用於調控或抑制激素對腫瘤之作用之抗激素劑，例如抗雌激素劑及選擇性雌激素受體抗體、抑制芳香酶、調控腎上腺中之雌激素產生之芳香酶抑制劑、及抗雄激素劑；以及曲沙他濱(troxacitabine，1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸、核酶(例如VEGF表現抑制劑及HER2表現抑制劑)；疫苗、PROLEUKIN® rIL-2；LURTOTECAN® 拓樸異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH；長春瑞濱及埃斯波黴素及上述任一者之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。 相容性細胞毒性劑或抗癌劑亦可包含商業上或臨床上可獲得之化合物，例如厄洛替尼(TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.)、多西他賽(TAXOTERE®, Sanofi-Aventis)、5-FU (氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶，CAS編號51-21-8)、吉西他濱(GEMZAR®, Lilly)、PD-0325901 (CAS編號391210-10-9, Pfizer)、順鉑(順式-二胺、二氯鉑(II)，CAS編號15663-27-1)、卡鉑(CAS編號41575-94-4)、太平洋紫杉醇(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、曲妥珠單抗(HERCEPTIN®, Genentech)、替莫唑胺(4-甲基-5-側氧基-2,3,4,6,8-五氮雜雙環[4.3.0]九-2,7,9-三烯-9-甲醯胺，CAS編號85622-93-1、TEMODAR®、TEMODAL®, Schering Plough)、他莫昔芬((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N ,N -二甲基乙胺、NOLVADEX®、ISTUBAL®、VALODEX®)及多柔比星(ADRIAMYCIN®)。其他商業上或臨床上可獲得之抗癌劑包含奧沙利鉑(ELOXATIN®, Sanofi)、硼替佐米(VELCADE®, Millennium Pharm.)、舒癌特(sutent，SUNITINIB®、SU11248, Pfizer)、來曲唑(FEMARA®, Novartis)、甲磺酸伊馬替尼(GLEEVEC®, Novartis)、XL-518 (Mek抑制劑，Exelixis, WO 2007/044515)、ARRY-886 (Mek抑制劑、AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca)、SF-1126 (PI3K抑制劑，Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235 (PI3K抑制劑，Novartis)、XL-147 (PI3K抑制劑，Exelixis)、PTK787/ZK 222584 (Novartis)、氟維司群(FASLODEX®, AstraZeneca)、甲硫四氫葉酸(亞葉酸)、雷帕黴素(西羅莫司(sirolimus)、RAPAMUNE®, Wyeth)、拉帕替尼(TYKERB®、GSK572016, Glaxo Smith Kline)、洛那法尼(SARASAR™、SCH 66336, Schering Plough)、索拉菲尼(NEXAVAR®、BAY43-9006, Bayer Labs)、吉非替尼(IRESSA®, AstraZeneca)、伊立替康(CAMPTOSAR®、CPT-11, Pfizer)、替比法尼(tipifarnib) (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson)、ABRAXANE™ (不含克列莫佛(Cremophor))、太平洋紫杉醇之白蛋白改造之奈米粒子調配物(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Il)、凡德他尼(rINN、ZD6474、ZACTIMA®, AstraZeneca)、苯丁酸氮芥、AG1478、AG1571 (SU 5271；Sugen)、替西羅莫司(temsirolimus，TORISEL®, Wyeth)、帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)、坎磷醯胺(TELCYTA®, Telik)、塞替派及環磷醯胺(CYTOXAN®, NEOSAR®)；長春瑞濱(NAVELBINE®)；卡培他濱(XELODA®, Roche)、他莫昔芬(包括NOLVADEX®；檸檬酸他莫昔芬、FARESTON® (檸檬酸托瑞米芬(toremifine citrate))、MEGASE® (乙酸甲地孕酮)、AROMASIN® (依西美坦；Pfizer)、福美坦(formestanie)、法曲唑(fadrozole)、RIVISOR® (伏氯唑)、FEMARA® (來曲唑；Novartis)及ARIMIDEX® (阿那曲唑；AstraZeneca))。 術語「醫藥上可接受之鹽」或「鹽」意指分子或大分子之有機或無機鹽。酸加成鹽可利用胺基形成。實例性鹽包括(但不限於)硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異菸酸鹽、乳酸鹽、柳酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽、富馬酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、糖二酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽及雙羥萘酸鹽(即1,1’亞甲基-雙-(2-羥基3-萘酸鹽))。醫藥上可接受之鹽可涉及納入另一分子，例如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其他抗衡離子。抗衡離子可為穩定母體化合物上之電荷之任一有機或無機部分。另外，醫藥上可接受之鹽可在其結構中具有一個以上之帶電原子。當多個帶電原子為醫藥上可接受之鹽之一部分時，該鹽可具有多個抗衡離子。因此，醫藥上可接受之鹽可具有一或多個帶電原子及/或一或多個抗衡離子。 相似地，「醫藥上可接受之溶劑合物」或「溶劑合物」係指一或多個溶劑分子及一個分子或大分子之締合。形成醫藥上可接受之溶劑合物之溶劑之實例包括(但不限於)水、異丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸及乙醇胺。 在其他實施例中，本發明之抗體或ADC可與目前臨床試驗中或市售之多種抗體(或免疫治療劑)中之任一者組合使用。所揭示抗體可與選自由以下組成之群之抗體組合使用：阿巴伏單抗(abagovomab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿福圖珠單抗(afutuzumab)、阿倫單抗(alemtuzumab)、阿托珠單抗(altumomab)、阿麥妥昔單抗(amatuximab)、麻安莫單抗(anatumomab)、阿西莫單抗(arcitumomab)、阿替珠單抗、阿維魯單抗、巴維昔單抗(bavituximab)、貝妥莫單抗(bectumomab)、貝伐珠單抗、比伐單抗(bivatuzumab)、布利莫單抗(blinatumomab)、貝倫妥單抗(brentuximab)、坎妥珠單抗(cantuzumab)、卡妥索單抗(catumaxomab)、西妥昔單抗(cetuximab)、西他珠單抗(citatuzumab)、西妥木單抗(cixutumumab)、克立瓦妥珠單抗(clivatuzumab)、可那木單抗(conatumumab)、達西珠單抗(dacetuzumab)、達洛珠單抗(dalotuzumab)、達雷木單抗(daratumumab)、地莫單抗(detumomab)、卓齊妥單抗(drozitumab)、度利戈妥單抗(duligotumab)、德瓦魯單抗、杜昔妥單抗(dusigitumab)、依美昔單抗(ecromeximab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、恩司昔單抗(ensituximab)、厄馬索單抗(ertumaxomab)、埃達珠單抗(etaracizumab)、衛材單抗(farletuzumab)、芬克拉妥珠單抗(ficlatuzumab)、芬妥木單抗(figitumumab)、弗蘭托單抗(flanvotumab)、弗妥昔單抗(futuximab)、蓋尼塔單抗(ganitumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、吉瑞妥昔單抗(girentuximab)、格萊木單抗(glembatumumab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、伊戈伏單抗(igovomab)、英加妥珠單抗(imgatuzumab)、英達妥昔單抗(indatuximab)、伊珠單抗( inotuzumab)、英妥木單抗(intetumumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、伊妥木單抗(iratumumab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、蘭布魯珠單抗(lambrolizumab)、來沙木單抗(lexatumumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、洛伏珠單抗(lorvotuzumab)、魯卡木單抗(lucatumumab)、馬帕木單抗(mapatumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、米拉珠單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗(minretumomab)、米妥莫單抗(mitumomab)、莫妥莫單抗(moxetumomab)、納那妥單抗(narnatumab)、那莫單抗(naptumomab)、奈昔木單抗( necitumumab) 、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、尼沃魯單抗、若莫單抗(nofetumomabn)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、奧卡妥珠單抗(ocaratuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉妥單抗(olaratumab)、奧拉帕尼(olaparib)、昂妥珠單抗(onartuzumab)、莫奧珠單抗(oportuzumab)、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕圖珠單抗(parsatuzumab)、帕圖單抗(patritumab)、派姆單抗、帕圖莫單抗(pemtumomab)、帕妥珠單抗、匹利珠單抗、平妥單抗(pintumomab)、普托木單抗(pritumumab)、拉妥木單抗(racotumomab)、拉圖單抗(radretumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、利妥木單抗(rilotumumab)、利妥昔單抗(rituximab)、羅妥木單抗(robatumumab)、沙妥莫單抗(satumomab)、司美替尼(selumetinib)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、司妥佐單抗(simtuzumab)、索利圖單抗(solitomab)、他妥珠單抗(tacatuzumab)、他妥莫單抗(taplitumomab)、替妥莫單抗(tenatumomab)、替普莫單抗(teprotumumab)、替加珠單抗(tigatuzumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗、托卡珠單抗(tucotuzumab)、烏妥昔單抗(ublituximab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、沃妥珠單抗(vorsetuzumab)、沃圖莫單抗(votumumab)、紮魯木單抗(zalutumumab)、CC49、3F8、MEDI0680、MDX-1105及其組合。 其他實施例包含使用經批准用於癌症療法之抗體，包括(但不限於)利妥昔單抗、吉妥珠單抗、阿倫單抗、替伊莫單抗、托西莫單抗、貝伐珠單抗、西妥昔單抗、帕替木單抗、奧法木單抗、伊匹單抗及貝倫妥單抗-維多汀(brentuximab vedotin)。彼等熟習此項技術者將能夠容易地鑑別與本文教示相容之其他抗癌劑。 E.放射療法 本發明亦提供抗體或ADC與放射性療法(即，用於誘導腫瘤細胞內之局部DNA損傷之任何機制，例如γ-輻照、X射線、UV-輻照、微波、電子發射及諸如此類)之組合。亦涵蓋使用將放射性同位素定向遞送至腫瘤細胞之組合療法，且所揭示抗體或ADC可與靶向抗癌劑或其他靶向方式結合使用。通常，輻射療法係經約1週至約2週之時間段脈衝式投與。輻射療法可投與患有頭頸癌之個體達約6至7週。視情況，輻射療法可以單一劑量或以多個依序劑量投與。 VIII.適應症 本發明提供本發明之抗體及ADC之用途，其用於診斷、治療診斷、治療及/或預防各種病症，包括贅瘤性、發炎性、血管生成及免疫病症及由病原體引起之病症。在某些實施例中，欲治療之疾病包含贅瘤性病況，包含實體腫瘤。在其他實施例中，欲治療之疾病包含血液惡性病。在某些實施例中，本發明之抗體或ADC將用於治療表現TNFRSF21決定子之腫瘤或致瘤細胞。較佳地，欲治療之「個體」或「患者」將係人類，但如本文所用該等術語明確包含任何哺乳動物物種。 應瞭解，本發明之化合物及組合物可用於治療處於不同疾病階段及在其治療週期之不同時刻之個體。因此，在某些實施例中，本發明之抗體及ADC將用作前線療法且投與先前未針對癌性病況進行治療之個體。在其他實施例中，本發明之抗體及ADC將用於治療第二及第三線患者(即，先前針對相同病況分別治療一次或兩次之彼等個體)。又一些實施例將包含利用所揭示TNFRSF21 ADC或利用不同治療劑治療第四線或更高線患者(例如，胃或結腸直腸癌患者)，其針對相同或有關病況治療三次或更多次。在其他實施例中，本發明之化合物及組合物將用於治療先前經治療(利用本發明之抗體或ADC或利用其他抗癌劑)且已復發或經確定對先前治療具有難治性之個體。在所選實施例中，本發明之化合物及組合物可用於治療患有復發性腫瘤之個體。 在某些態樣中，增殖性病症將包含實體腫瘤包括，但不限於腎上腺、肝、腎、膀胱、乳房、胃、卵巢、子宮頸、子宮、食道、結腸直腸、前列腺、胰臟、肺(小細胞及非小細胞)、甲狀腺、癌、肉瘤、神經膠母細胞瘤及各種頭頸腫瘤。在其他較佳實施例中，所揭示之ADC在治療胰臟癌及在所選態樣中肺腺癌中尤其有效。在某些實施例中，肺癌對於蒽環及/或紫杉烷(例如，多西他賽、太平洋紫杉醇、拉洛他賽(larotaxel)或卡巴他賽(cabazitaxel))具有難治性、復發性或抗性。在本發明之又一些態樣中，所揭示抗體及ADC可用於治療甲狀腺髓樣癌、大細胞神經內分泌癌(LCNEC)、神經膠母細胞瘤、神經內分泌前列腺癌(NEPC)、高級胃腸胰臟癌(GEP)及惡性黑色素瘤。在又一些較佳實施例，所揭示之ADC可用於治療膀胱癌。 關於胰臟癌，本文揭示之組合物可用於治療腺泡細胞胰臟癌、十二指腸胰臟癌、黏蛋白胰臟腺癌、神經內分泌胰臟癌、胰臟腺癌、外分泌型胰臟腺癌、導管胰臟腺癌及壺腹胰臟腺癌。 更通常地，根據本發明經歷治療之贅瘤性病況可為良性或惡性；實體腫瘤或血液惡性病；且可選自包括(但不限於)以下之群：腎上腺瘤、AIDS相關癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、自主神經節瘤、膀胱癌(鱗狀細胞癌及移行細胞癌)、囊胚腔病症、骨癌(釉質瘤、動脈瘤樣骨囊腫、骨軟骨瘤、骨肉瘤)、腦及脊髓癌症、轉移性腦瘤、乳癌、頸動脈體瘤、子宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色性腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、良性皮膚纖維組織細胞瘤、結締組織增生性小圓細胞腫瘤、室管膜瘤、上皮病症、尤恩氏腫瘤(Ewing's tumor)、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維生成不良、骨纖維發育不良、膽囊及膽管癌、胃癌、胃腸疾病、妊娠滋養細胞疾病、生殖細胞瘤、腺病、頭頸癌、下視丘癌、腸癌、胰島細胞瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、腎癌(腎胚細胞瘤、乳頭狀腎細胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤性腫瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤性腫瘤、肝癌(肝母細胞瘤、肝細胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小細胞癌、腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌等)、巨噬細胞病症、神經管胚細胞瘤、黑色素瘤、腦脊髓膜瘤、甲狀腺髓樣癌、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、神經胚細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、外周神經鞘膜瘤、嗜鉻細胞瘤、腦下垂體瘤、前列腺癌、後葡萄膜黑色素瘤、罕見血液病、腎轉移癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌症、胃癌、間質病症、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移癌及子宮癌(子宮頸癌、子宮內膜癌及平滑肌瘤)。在某些實施例中，本發明之化合物及組合物將用作前線療法且投與先前未針對癌性病況進行治療之個體。在其他實施例中，本發明之化合物及組合物將用於治療先前經治療(利用本發明之抗體或ADC或利用其他抗癌劑)且已復發或經確定對先前治療具有難治性之個體。在所選實施例中，本發明之化合物及組合物可用於治療患有復發性腫瘤之個體。 在某些實施例中，本發明之化合物及組合物將用作前線療法且投與先前未針對癌性病況進行治療之個體。在其他實施例中，本發明之化合物及組合物將用於治療先前經治療(利用本發明之抗體或ADC或利用其他抗癌劑)且已復發或經確定對先前治療具有難治性之個體。在所選實施例中，本發明之化合物及組合物可用於治療患有復發性腫瘤之個體。 關於血液惡性病，應進一步瞭解，本發明之化合物及方法可在治療各種白血病中尤其有效，該等白血病包括急性骨髓性白血病(AML，基於FAB命名(M0-M7)、WHO分類、分子標記物/突變、核型、形態及特徵識別其各種亞型)、譜系急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、毛細胞白血病(HCL)、慢性骨髓單核球性白血病(CMML)、幼年型骨髓單核球性白血病(JMML)及大顆粒淋巴球性白血病(LGL)以及B細胞淋巴瘤、包括霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma) (經典霍奇金氏淋巴瘤及結節性淋巴球-主要霍奇金氏淋巴瘤)、非霍奇金氏淋巴瘤(包括瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、低級/NHL濾泡細胞淋巴瘤(FCC)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、黏膜相關之淋巴組織(MALT)淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤(MCL)及柏基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma，BL))；中等級別/濾泡NHL、中等級別瀰漫性NHL、高級免疫母細胞NHL、高級淋巴母細胞性NHL、高級小非裂解細胞NHL、巨大疾病NHL、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia)、淋巴漿細胞樣淋巴瘤(LPL)、AIDS相關淋巴瘤、單核球性B細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞淋巴腺病、瀰漫性小裂解細胞、大細胞免疫母細胞淋巴母細胞瘤、小非裂解、柏基特及非柏基特、濾泡性、主要大細胞；濾泡性、主要小裂解細胞；及濾泡性、混合小裂解及大細胞淋巴瘤。參見Gaidono等人，「Lymphomas」, IN CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, 第2卷：2131-2145 (DeVita等人編輯，第5版增刊，1997)。熟習此項技術者應明瞭，由於分類之變化系統，該等淋巴瘤通常將具有不同名稱，且患有在不同名稱下分類之淋巴瘤之患者亦可受益於本發明之組合治療方案。 在某些所選態樣中，所揭示之ADC在治療胃癌(包括腸型、瀰漫型、胃賁門、胃基質型、類癌及戒環細胞胃腺癌)中尤其有效。在一個實施例中，胃癌對於輻射、5-氟尿嘧啶、基於鉑之藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)或其組合具有難治性、復發性或抗性。在所選實施例中，可向展現非轉移或轉移性胃癌之患者投與抗體及ADC。在其他實施例中，將向以下患者投與所揭示之偶聯抗體：難治性患者(即，在初始療法進程期間或在完成初始療法進程後不久疾病復發之彼等)；敏感患者(即，在一級療法後長於2-3個月復發之彼等)；或對於輻射、5-氟尿嘧啶及/或基於鉑之藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)展現抗性之患者。在每一情形下，應瞭解，根據所選劑量方案及臨床診斷，相容性ADC可與其他抗癌劑組合使用。 在其他所選態樣中，所揭示之ADC在治療結腸直腸癌(包括小腸、結腸及直腸之腺癌、黏液腺癌、腸類癌、腸基質、平滑肌肉瘤、鱗狀細胞癌、神經內分泌癌及戒環細胞癌)中尤其有效。在一個實施例中，結腸直腸癌對於輻射、5-氟尿嘧啶、基於鉑之藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)、VEGF-A靶向藥劑、VEGF受體靶向藥劑、EGFR靶向藥劑及其組合具有難治性、復發性或抗性。在所選實施例中，可向展現非轉移性或轉移性結腸直腸癌之患者投與抗體及ADC。在其他實施例中，將向以下患者投與所揭示之偶聯抗體：難治性患者(即，在初始療法進程期間或在完成初始療法進程後不久疾病復發之彼等)；敏感患者(即，在一級療法後長於2-3個月復發之彼等)；或對於輻射、5-氟尿嘧啶、基於鉑之藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)、VEGF-A靶向藥劑、VEGF受體靶向藥劑及/或EGFR靶向藥劑展現抗性之患者。在每一情形下，應瞭解，根據所選劑量方案及臨床診斷，相容性ADC可與其他抗癌劑組合使用。 在某些較佳實施例中，可向患有肺腺癌、胰臟癌或膀胱癌之前線患者投與本發明之TNFRSF21 ADC。在其他實施例中，可向遭受相同折磨之二線患者投與本發明之TNFRSF21 ADC。在又一些實施例中，向患有肺腺癌、胰臟癌或膀胱癌之三線患者投與本發明之TNFRSF21 ADC。 在又一些所選態樣中，所揭示之ADC在治療肺癌(包括肺腺癌、小肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC) (例如，鱗狀細胞非小細胞肺癌或鱗狀細胞小細胞肺癌))中尤其有效。在一個實施例中，肺癌對於基於鉑之藥劑(例如，卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)及/或紫杉烷(例如，多西他賽、太平洋紫杉醇、拉洛他賽或卡巴他賽)具有難治性、復發性或抗性。在另一實施例中，欲治療之個體患有大細胞神經內分泌癌(LCNEC)。 如所指示，所揭示之抗體或ADC在治療肺癌(包括以下亞型：小細胞肺癌及非小細胞肺癌(例如鱗狀細胞非小細胞肺癌或鱗狀細胞小細胞肺癌))中尤其有效。在其他實施例中，所揭示組合物可用於治療肺腺癌。在所選實施例中，可向展現侷限期疾病或擴散期疾病之患者投與抗體及ADC。在其他實施例中，將向以下患者投與所揭示之偶聯抗體：難治性患者(即，在初始療法進程期間或在完成初始療法進程後不久疾病復發之彼等)；敏感患者(即，在一級療法後長於2-3個月復發之彼等)；或對基於鉑之藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)及/或紫杉烷(例如多西他賽、太平洋紫杉醇、拉洛他賽或卡巴他賽)展現抗性之患者。在某些較佳實施例中，可向前線患者投與本發明之TNFRSF21 ADC。在其他實施例中，可向二線患者投與本發明之TNFRSF21 ADC。在又一些實施例中，可向三線患者投與本發明之TNFRSF21 ADC。 在尤佳實施例中，所揭示之ADC可用於治療小細胞肺癌。關於該等實施例，可向展現侷限期疾病之患者投與偶聯之調節劑。在其他實施例中，將向展現擴散期疾病之患者投與所揭示之ADC。在其他較佳實施例中，將向難治性患者(即，在初始療法進程期間或在完成初始療法進程後不久復發之彼等)或復發性小細胞肺癌患者投與所揭示之ADC。又一些實施例包含向敏感患者(即，在一級療法後長於2-3個月復發之彼等)投與所揭示之ADC。在每一情形下，應瞭解，根據所選劑量方案及臨床診斷，相容性ADC可與其他抗癌劑組合使用。 IX.製品 本發明包括包含一或多個容器或貯器之醫藥包裝及套組，其中容器可包含本發明之抗體或ADC之一或多個劑量。該等套組或包裝在性質上可為診斷的或治療的。在某些實施例中，包裝或套組含有單位劑量，意指預定量之包含(例如)本發明之抗體或ADC之組合物，具有或無一或多種其他藥劑及視情況一或多種抗癌劑。在某些其他實施例中，包裝或套組含有可檢測量之抗TNFRSF21抗體或ADC，具有或無相關報導基因分子及視情況一或多種用於檢測、量化及/或可視化癌細胞之其他試劑。 無論如何，本發明之套組通常將包含適宜容器或貯器中之本發明之抗體或ADC、相同或不同容器中之醫藥上可接受之調配物及視情況一或多種抗癌劑。該等套組亦可含有其他醫藥上可接受之調配物或器件，用於診斷或組合療法。診斷器件或儀器之實例包括可用於檢測、監測、量化或概述與增殖性病症相關之細胞或標記物之彼等(對於該等標記物之完全清單，參見上文)。在一些實施例中，該等器件可用於檢測、監測及/或量化活體內或活體外循環腫瘤細胞(例如，參見WO 2012/0128801)。在其他實施例中，循環腫瘤細胞可包含腫瘤生成細胞。本發明涵蓋之套組亦可含有適當試劑以組合本發明之抗體或ADC與抗癌劑或診斷劑(例如，參見U.S.P.N. 7,422,739)。 當在一或多種液體溶液中提供套組之組份時，液體溶液可為非水性，但通常水溶液較佳，且無菌水溶液尤佳。套組中之之調配物亦可以可在添加適當液體後經重構之乾燥粉末或凍乾形式提供。用於重構之液體可含於單獨容器中。該等液體可包含無菌、醫藥上可接受之緩衝劑或其他稀釋劑，例如抑菌注射用水、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液或右旋糖溶液。當該套組包含本發明之抗體或ADC與其他治療劑或試劑之組合時，溶液可以等莫耳濃度當量組合或以一種組份超過另一種組份之方式預混合。另一選擇為，在投與患者之前，本發明之抗體或ADC及任何可選抗癌劑或其他試劑(例如類固醇)可單獨維持在不同容器內。 在某些較佳實施例中，上文所提及之包含本發明組合物之套組將包含標籤、標記物、包裝插頁、條碼及/或閱讀器(reader)，其指示套組內容物可用於治療、預防及/或診斷癌症。在其他較佳實施例中，套組可包含標籤、標記物、包裝插頁、條碼及/或閱讀器，其指示套組內容物可根據特定劑量或劑量方案投與以治療患有癌症之個體。在尤佳態樣中，標籤、標記物、包裝插頁、條碼及/或閱讀器指示套組內容物可用於治療、預防及/或診斷血液惡性病(例如AML)或提供用於其治療之劑量或劑量方案。在其他尤佳態樣中，標籤、標記物、包裝插頁、條碼及/或閱讀器指示套組內容物可用於治療、預防及/或診斷肺癌(例如腺癌)或用於其治療之劑量方案。 適宜容器或貯器包括例如瓶、小瓶、注射器、輸注袋(i.v.袋)等。該等容器可自多種材料(例如玻璃或醫藥上相容之塑膠)形成。在某些實施例中，貯器可包含無菌輸液埠(access port)。舉例而言，容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞之靜脈內溶液袋或小瓶。 在一些實施例中，該套組可含有向患者投與抗體及任何可選組份之構件，例如一或多個針或注射器(預填充或空的)、滴管、吸管或其他可將調配物注射或引入個體中或施加至身體之患病區域之此類器件。本發明套組通常亦將包括含有小瓶或諸如此類及其他組件呈密封以用於商業銷售之構件，例如吹模成型塑膠容器，其中放置且保存所欲小瓶及其他裝置。 X.其他 除非本文另有定義，否則本發明使用之科學及技術術語應具有熟習此項技術者通常所理解之含義。另外，除非另有需要，否則單數術語應包括複數形式且複數術語應包括單數形式。另外，本說明書及隨附申請專利範圍中所提供之範圍包括兩個終點及該等終點之間之所有點。因此，2.0至3.0之範圍包括2.0、3.0及2.0與3.0之間之所有點。 通常，本文所述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及化學之技術係業內所熟知且常用者。本文結合該等技術使用之命名亦為業內所常用。除非另外指明，否則本發明之方法及技術通常係根據業內所熟知且如本說明書通篇所引用之多個參考文獻中所述之習用方法實施。 XI.參考文獻 無論片語「以引用方式併入」是否用於具體參考文獻中，本文所引用之所有專利、專利申請案及公開案以及可以電子方式獲得之材料的完整揭示內容(包括例如GenBank及RefSeq中之例如核苷酸序列提交，及例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中之胺基酸序列提交，及GenBank及RefSeq中之註解編碼區之轉譯)皆以引用方式併入本文中。前述詳細說明及隨附實例係僅出於清楚理解之目的給出。自此應理解無不必要限制。本發明並不限於所顯示及闡述之確切細節。熟習此項技術者所明瞭之變化形式包括在由申請專利範圍所定義之本發明中。本文所用之任一部分標題僅出於組織目的，且不應理解為限制所述標的物。 實例 藉由參照下列實例將更容易地理解上文通常闡述之本發明，該等實例係以說明方式提供且不欲對本發明加以限制。該等實例不欲表示下文實驗係所實施之所有實驗或唯一實驗。除非另外指明，否則份數係重量份數，分子量係重量平均分子量，溫度以℃表示，且壓力為大氣壓力或接近大氣壓力。序列表概述 表3提供本文中包括之胺基酸及核酸序列之概述。表 3 腫瘤細胞系概述 PDX腫瘤細胞類型係由縮寫加其後指示具體腫瘤細胞系之數字表示。所測試樣品之傳代次數指示為隨附樣品名稱之p0-p#，其中p0指示自患者腫瘤直接獲得之未傳代樣品，且p#指示在測試之前腫瘤經由小鼠傳代之次數。如本文所用，腫瘤類型及亞型之縮寫於表4中顯示如下：表 4 實例1 使用權轉錄體測序之TNFRSF21表現之鑑別 為表徵實體腫瘤(在其存在於癌症患者時)之細胞異質性並鑑別臨床上相關之治療靶標，使用業內公認之技術研發並維持大的PDX腫瘤庫。經由使最初自患有多種實體腫瘤惡性病之癌症患者獲得之腫瘤細胞多次傳代使包含大量離散腫瘤細胞系之PDX腫瘤庫在免疫受損小鼠中繁殖。低傳代PDX腫瘤代表其天然環境中之腫瘤，提供驅動腫瘤生長及對當前療法之抗性之基礎機制的臨床上相關見解。 如前文所提到，可將腫瘤細胞廣泛分成兩組類型之細胞亞群體：非致瘤細胞(NTG)及腫瘤起始細胞(TIC)。TIC在植入TNFRSF21免疫受損小鼠中時具有形成腫瘤之能力。癌症幹細胞(CSC)係能夠無限自我複製同時維持多譜系分化之能力之TIC的子集。NTG儘管有時能在活體內生長，但在植入時將不形成重演初始腫瘤之異質性的腫瘤。 為實施全轉錄體分析，在PDX腫瘤達到800 - 2,000 mm3 後自小鼠將其切除。使用業內公認之酶消解技術將切除之PDX腫瘤解離成單細胞懸浮液(參見(例如) U.S.P.N. 2007/0292414)。將解離之體腫瘤細胞與4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)一起培育以檢測死細胞，與抗小鼠CD45及H-2Kd 抗體一起培育以鑑別小鼠小時，並與抗人類EPCAM抗體一起培育以鑑別人類細胞。在鼠類細胞含量＞5%之一些情形下，使用生物素化抗小鼠CD45及H-2Kd 抗體及鏈黴抗生物素蛋白塗佈之亞鐵珠粒使體腫瘤樣品磁力缺失鼠類細胞。在缺失鼠類細胞後，將所解離細胞與螢光偶聯之抗人類CD46及/或CD324抗體一起培育以鑑別CD46hi CD324+ CSC或CD46lo/- CD324- NTG細胞且隨後使用FACSAria細胞分選器(BD Biosciences)進行分選(參見U.S.P.N 2013/0260385、2013/0061340及2013/0061342)。 藉由將所分選腫瘤細胞溶解於補充有1% 2-巰基乙醇之RLT加RNA溶解緩衝劑(Qiagen)中、於-80℃下冷凍溶解物且隨後解凍溶解物用於使用Rneasy分離套組(Qiagen)進行RNA萃取而自該等細胞萃取RNA。使用Nanodrop分光光度計(Thermo Scientific)及/或Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies)量化RNA。正常組織RNA係購自各種來源(Life Technology、Agilent、ScienCell、BioChain及Clontech)。藉由遺傳測序及基因表現分析評價所得總RNA製劑。 使用兩種不同系統實施高品質RNA之全轉錄體測序。更具體而言，使用Illumina HiSeq 2000或2500次世代定序系統(Illumina, Inc.)分析樣品。 利用cDNA實施Illumina全轉錄體分析，該cDNA係使用5 ng自如上文所述分離之CSC腫瘤群體萃取之總mRNA。文庫係使用TruSeq RNA樣品製備套組v2 (Illumina)生成。將所得cDNA文庫片段化並加條碼。使用定位於基因之外顯子區域之度量FPM (每百萬片段)或FPKM (每百萬每千鹼基片段)將來自Illumina平臺之測序數據標稱表示為片段表現值，此使得能夠將基本基因表現分析正規化且列舉為FPM_轉錄物或FPKM_轉錄物。 與NTG群體相比，在BL (BL25、BL38)、LU-Ad (LU123、LU134、LU135、LU244)、LU-SCC (LU139)及PA (PA20、PA26、PA40、PA49、PA4、PA54、PA55及PA89)之CSC腫瘤細胞亞群體評估TNFRSF21 mRNA之表現。與以下器官中之相關正常組織相比，CSC中之TNFRSF21 mRNA表現亦較高：結腸、食道、心臟、腎、肝、肺、胰臟、皮膚、脾、胃及氣管(圖2)。 BL、LU-Ad、LU-SCC及PA腫瘤中升高之TNFRSF21 mRNA表現之鑑別指示TNFRSF21值得進一步評估為潛在診斷及/或免疫治療靶標。此外，與LU-Ad、LU-SCC及PA腫瘤中之NTG相比，CSC中增加之TNFRSF21表現指示TNFRSF21係該等腫瘤類型中致瘤細胞之良好標記物。 實例2 使用q RT-PCR之腫瘤中之TNFRSF21m RNA之表現 為確認腫瘤細胞中之TNFRSF21 RNA表現，根據工業標準方案使用Fluidigm BioMark™ HD系統對各種PDX細胞系實施qRT-PCR。如實例1中所述自體PDX腫瘤細胞或分選之CSC及NTG亞群體萃取RNA。根據製造商之說明書使用High Capacity cDNA Archive套組(Life Technologies)將1.0 ng RNA轉化成cDNA。隨後使用利用TNFRSF21探針特異性Taqman分析預擴增之cDNA物質進行後續qRT-PCR實驗。 將正常組織(NormTox或Norm)中之TNFRSF21表現與AML、BL、BR、CR、GA、LU、OV及PA PDX細胞系中之表現進行比較(圖3A；每一點代表每一個別組織或PDX細胞系之平均相對表現，其中水平線代表每一適應症之幾何平均值)。在一些AML、BL、BR-基底樣、BR-LumB、CR、GA、LU-Ad、LU-SCC、OV及PA-PAC/PDAC PDX腫瘤以及正常膀胱、背根神經節、腎、胃、氣管及血管平滑肌細胞中觀察到TNFRSF21之高表現。「NormTox」代表如下各種正常組織之樣品：腎上腺、動脈、結腸、背根神經節、食道、心臟、腎、肝、肺、胰臟、骨骼肌、皮膚、小腸、脾、胃、胸腺、氣管、靜脈及血管平滑肌細胞。命名為「Norm」之另一組正常組織代表相對於ADC型藥物具有假定較低毒性風險之正常組織的以下樣品：B細胞、膀胱、乳房、子宮頸、單核球、正常骨髓、嗜中性球、NK細胞、卵巢、末梢血單核細胞(PBMC)、唾液腺、T細胞、胸腺及甲狀腺。 除體腫瘤表現之上述檢查外，亦藉由對來自各種PDX之CSC及NTG群體進行qRT-PCR確認升高之CSC表現。與NTG群體相比，TNFRSF21 mRNA之表現在LU-Ad (LU134、LU176)、LU-SCC (LU76、LU128)及PA (PA4、PA20、PA76及PA94MET)之CSC腫瘤細胞亞群體中升高(圖3B). 與匹配正常組織(分別肺及胰臟)相比，TNFRSF21 mRNA表現亦在CSC中較高。 該等數據展現，TNFRSF21在多種腫瘤中表現且可係用於研發該等適應症中基於抗體之治療劑之良好靶標。儘管PDX中之整體表現程度與正常組織相比顯示窄窗，但TNFRSF21尤其在所檢查之許多腫瘤中在CSC中相對於NTG群體表現至較高程度，此增加了希望靶向之腫瘤群體相對於正常組織之差異表現。 實例3 使用微陣列分析之腫瘤中TNFRSF21mRNA 之表現的測定 執行用以測定各種腫瘤細胞系中TNFRSF21之表現程度的微陣列實驗並如下分析數據。實質上如實例1中所述自包含多種癌症類型之PDX細胞系萃取1-2 µg全腫瘤總RNA。另外，自正常組織(例如，結腸、心臟、腎、肝、肺、卵巢、胰臟、皮膚、脾、PBMC及胃)之樣品萃取RNA。使用Agilent SurePrint GE Human 8x60 v2微陣列平臺分析RNA樣品，該平臺含有針對人類基因體中之27,958個基因及7,419個lncRNA設計之50,599個生物探針。使用標準工業實踐以正規化並轉變強度值以量化每一樣品之基因表現。將每一樣品中TNFRSF21表現之正規化強度繪示於圖4中且針對每一腫瘤類型衍生之幾何平均值由水平杠指示。 圖4之更密切綜述顯示與正常組織相比，TNFRSF21 mRNA表現在BL、BR、CR、GA、LIV、LU-Ad、LU-SCC、OV、PA-PAC/PDAC、PR及SK-MEL之子集中升高。在脾、乳房及腎中觀察到正常組織中之最高表現。所檢查之正常組織包括：乳房、結腸、心臟、腎、肝、肺、卵巢、胰臟、PBMC、皮膚、脾及胃。 BL、BR、CR、GA、LU-Ad、LU-SCC及PA-PAC/PDAC中升高之TNFRSF21表現之觀察確認實例1及2之結果且進一步支持TNFRSF21表現程度與腫瘤細胞之間之觀察相關性。 實例4 使用癌症基因體圖譜之腫瘤中之TNFRSF21表現 使用公開獲得之原發性腫瘤及正常樣品之大的資料集(稱作癌症基因體圖譜(TCGA))確認各種腫瘤中hTNFRSF21 mRNA之過表現。自TCGA Data Portal (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaDownload.jsp) 下載IlluminaHiSeq_RNASeqV2平臺之hTNFRSF21表現數據且對其進行分析以聚集來自每一基因之個別外顯子之讀數，以每百萬定位讀數每千鹼基外顯子(RPKM)生成單一值讀數。 圖5顯示與正常組織相比，TNFRSF21表現在一些LU-Ad、LU-SCC、BL及PA腫瘤中升高。該等數據進一步確認，可在各種腫瘤類型中發現升高含量之TNFRSF21 mRNA，此指示抗TNFRSF21抗體及ADC可為用於該等過表現腫瘤之有用治療劑。 實例5 重組TNFRSF21蛋白之選殖及表現及過表現細胞表面TNFRSF21蛋白之細胞系之改造人類 TNFRSF21 (hTNFRSF21) 為生成關於hTNFRSF21蛋白之本發明中所需之所有分子及細胞材料，自Origene (SC114967，對應於登錄號NM_014452)購得商業人類TNFRSF21 cDNA純系。將SC114967 cDNA純系用於表現成熟hTNFRF21蛋白或其片段之構築體之所有後續改造。 為生成針對hTNFRSF21蛋白之免疫反應性或免疫特異性調節劑，生成嵌合融合基因，其中hTNFRSF21蛋白之細胞外結構域(ECD)在框架內與9-組胺酸標識或人類IgG2 Fc標識融合。此係如下進行：使編碼hTNFRSF21之ECD (殘基Q42 - H349)之DNA片段自SC114967 cDNA純系進行PCR擴增並使用標準分子技術在框架內及IgK信號肽序列之下游及9-組胺酸標識或人類IgG2 Fc cDNA之上游亞選殖至CMV驅動之表現載體中。 CMV驅動之hTNFRSF21表現載體容許在HEK-293T及/或CHO-S細胞中高程度之瞬時表現。使用聚乙烯亞胺聚合物作為轉染試劑用編碼hTNFRSF21 ECD-His或hTNFRSF21 ECD-Fc蛋白之表現構築體轉染HEK-293T細胞之懸浮液或貼壁培養物、或CHO-S細胞之懸浮液。轉染後3至5天，使用AKTA探測器及分別鎳-EDTA (Qiagen)或MabSelect SuRe™ 蛋白A (GE Healthcare Life Sciences)管柱自澄清細胞-上清液純化hTNFRSF21-ECD-His或hTNFRSF21-ECD-Fc蛋白。大鼠 TNFRSF21 (rTNFRSF21) 為組裝編碼在框架內與9-組胺酸標識或人類IgG2 Fc標識融合之rTNFRSF21之ECD的構築體，自Origene (RR204317)購得cDNA純系，其對應於包含於NCBI登錄號NM_001108207中之序列。自RR204317模板擴增編碼成熟ECD (殘基Q42 - H349)之PCR片段並使用標準分子技術在框架中及IgK信號肽序列下游及9-組胺酸標識或人類IgG2 Fc cDNA上游將其選殖至CMV驅動之表現載體中。如上文針對hTNFRSF21蛋白所述產生重組體蛋白。細胞系改造 使用業內公認之技術使用慢病毒載體構築過表現hTNFRSF21之經改造細胞系以轉導HEK-293T細胞系。首先，使用標準分子選殖技術以引入編碼IgK信號肽之核苷酸序列，之後在pCDH-EF1-MCS-T2A-GFP (System Biosciences)之多個選殖位點之上游DDDK表位標識，從而生成載體pCEMT。pCEMT中之T2A序列促進肽鍵縮合之核糖體跳躍，導致兩種獨立蛋白之表現：在T2A肽上游編碼之DDDK標記之細胞表面蛋白的高程度表現，及在T2A肽下游編碼之GFP標記物蛋白之共表現。如下使用pCEMT以產生各種TNFRSF21載體：使用SC114967 cDNA純系作為模板藉由PCR擴增生成編碼成熟hTNFRSF21蛋白(殘基Q42-L655)的DNA片段，且將所得PCR產物亞選殖至pCEMT中之IgK信號肽 - DDDK表位標識之框架內下游。此產生pL120-hTNFRSF21慢病毒載體。使用熟習此項技術者熟知之標準慢病毒轉導技術使用此慢病毒載體以產生過表現hTNFRSF21蛋白之穩定之基於HEK-293T之細胞系，之後進行高表現HEK-293T亞純系(例如，對於GFP及FLAG表位強烈呈陽性之細胞)之TNFRSF21陽性細胞選擇及螢光活化之細胞分選(FACS)。 實例6 TNFRSF21抗體之生成 如下在兩個免疫活動中產生抗TNFRSF21鼠類抗體。用10 µg經等體積之TiterMax® 佐劑乳化之hTNFRSF21-Fc或hTNFRSF21-His蛋白接種來自品系Balb/c、CD-1及FVB之小鼠。在初始接種後，每週兩次持續4週向小鼠注射經等體積之明礬佐劑加CpG乳化之5 µg hTNFRSF21蛋白。 將小鼠殺死，且解剖引流淋巴結(膕、鼠蹊及髂骨肌)並將其用作抗體產生細胞之來源。產生B細胞之單細胞懸浮液，並藉由電細胞融合使用模型BTX Hybrimmune系統(BTX Harvard Apparatus)使(122.5×106 個細胞)與非分泌SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞(ATCC編號CRL-1581)以1:1之比率融合。將細胞再懸浮於雜交瘤選擇培養基中，該培養基由補充有偶氮絲胺酸、15%胎兒純系I血清(Thermo編號SH30080-03)、10% BM condimed (Roche編號10663573001)、1 mM非必需胺基酸(Corning編號25-025-CI)、1 mM HEPES (Corning編號25-060-CI)、100 IU青黴素-鏈黴素(Corning編號30-002-CI)、100 IU L-麩醯胺酸(Corning編號25-005-CI)之DMEM培養基組成，並將該等細胞在三個含有100 mL選擇培養基之T225燒瓶中培養。將燒瓶於含有7% CO2 及95%空氣之37℃加濕培育器中放置6天。 在融合後第6天，暫時向下冷凍雜交瘤文庫細胞。將細胞在雜交瘤選擇培養基中解凍並使其在加濕37℃培育器中靜置1天。自燒瓶分選細胞並將其以一個細胞/孔(使用BD FACSAria I細胞分選器)在90 μL補充雜交瘤選擇培養基(如上文所述)中平鋪於12 Falcon 384孔板中。將剩餘不用的雜交瘤文庫細胞冷凍於液氮中以供將來文庫測試及篩選。 將雜交瘤培養10天並使用流式細胞術及ELISA針對對hTNFRSF21具有特異性之抗體及與rTNFRSF21交叉反應之抗體篩選上清液。如下實施關於雜交瘤上清液之流式細胞術。將經hTNFRSF21轉導之HEK-293T細胞與25 μL雜交瘤上清液一起培育30 min。將細胞用PBS/2% FCS洗滌且隨後與在PBS/2%FCS中1:300稀釋之25 μL每樣品DyeLight 649標記之山羊-抗小鼠IgG、Fc片段特異性二級抗體一起培育15 min。將細胞用PBS/2%FCS洗滌兩次並再懸浮於具有DAPI之PBS/2%FCS中並藉由流式細胞術分析用於超過經同型對照抗體染色之細胞之螢光。 使用ELISA分析以篩選雜交瘤上清液用於結合至hTNFRSF21及rTNFRSF21之抗體。如下實施ELISA。將板用純化rTNFRSF21-His及hTNFRSF21-Fc或hTNFRSF21-His以0.5 μg/mL在PBS緩衝劑中塗佈並於4℃下培育過夜。隨後將板用PBST洗滌並於37℃下用具有5% FBS之PBS封阻30 min。去除封阻溶液並向孔中添加15 μl PBST。添加25 μl雜交瘤上清液並於室溫下培育1小時。在用PBST洗滌後，於室溫下添加30 μL/孔在PBSA中1:10,000稀釋之HRP標記之山羊抗小鼠IgG並保持30 min。將板洗滌並於室溫下藉由添加25 μL/孔之TMB受質溶液(Thermo Scientific)顯影約5 min。添加相等體積之0.2 M H2 SO4 以停止受質顯影。隨後藉由分光光度計於OD 450下分析樣品。認為具有比背景大3倍之OD 450之樣品具有交叉反應性。 hTNFRSF21-His免疫活動產生超過150種結合至表現hTNFRSF21之HEK-293T細胞之表面的鼠類抗體。 實例7 TNFRSF21抗體之特徵 使用各種方法以在同型、對TNFRSF21之親和力、與rTNFRSF21之交叉反應性、結合之動力學及確立由各別抗體佔據之獨特表位倉方面表徵實例6中生成之抗TNFRSF21小鼠抗體。圖6提供概述多種實例性鼠類抗體之上文所提及之特徵的表。在圖6中，blank細胞或「N/D」指示該情況下未產生數據。 使用Milliplex小鼠免疫球蛋白同型套組(Millipore)根據製造商之方案測定代表性數目之抗體之同型。實例性TNFRSF21特異性抗體之結果闡述於標記為「同型」之欄中。 如下自利用ForteBio RED生成之動力學曲線定性測定抗體對hTNFRSF21-His及rTNFRSF21-His之親和力。將抗TNFRSF21抗體固定至抗小鼠Fc捕獲生物感測器上，且接觸時間為3 min及流速為1000 rpm。距基線之所捕獲抗體載量以0.3-1單位恆定。在抗體捕獲及50秒基線後，將生物感測器浸入300 nM hTNFRSF21-His或rTNFRSF21-His溶液中達4 min.締合期，之後以1000 rpm之振盪速率進行4 min.解離期。藉由在每一週期後浸入10 mM甘胺酸(pH 1.7)中再生生物感測器。藉由自特異性抗體反應減去對照小鼠IgG表面反應處理數據並將數據截短至締合及解離期。使用締合及解離曲線以定性地估計所選抗體之親和力(數據未顯示)。鑑別以對rTNFRSF21蛋白之高親和力交叉反應的抗體(圖6)。利用活體外殺死分析確認與rTNFRSF21蛋白之交叉反應性(數據未顯示)。 使用表面電漿共振使用BIAcore 2000儀器(GE Healthcare)量化所選抗體對hTNFRSF21、cTNFRSF21 (購自Sino Biological；目錄號10175-H08H)或rTNFRSF21蛋白之親和力。使用抗小鼠抗體捕獲套組以將小鼠抗TNFRSF21抗體固定於CM5生物感測器晶片上。在每一抗原注射週期之前，將濃度為0.1 - 2 μg/mL之鼠類抗體捕獲於表面上且接觸時間為2 min.且流速為5 μL/min。距基線之所捕獲抗體載量以80-120反應單位恆定。在抗體捕獲及1 min.基線後，使實例5中生成之單體hTNFRSF21-His抗原在表面上以不同濃度流動4 min.締合期，之後以5 μL/min之流速進行4 min.解離期。使用相似方案量測人類化抗體之結合親和性(參見實例10)，只是使用抗人類抗體捕獲套組。藉由自特異性抗體表面反應減去對照非結合抗體表面反應處理數據並將數據截短至締合及解離期。使用所得反應曲線以擬合1:1蘭米爾(Langmuir)結合模型並使用BiaEvaluation軟體3.1 (GE Healthcare)使用所計算kon 及koff 動力學常數生成表觀親和力。抗體對奈莫耳濃度範圍內之hTNFRSF21、cTNFRSF21及rTNFRSF21展現親和力(數據未顯示)。 使用多樣性競爭免疫分析(Luminex)將抗體分組成倉。將濃度為10 mg/mL之100 ml每一獨特抗TNFRSF21抗體(捕獲mAb)與偶聯至抗小鼠κ抗體之磁珠(Luminex)一起培育1小時(Miller等人，2011, PMID: 21223970)。將捕獲mAb/偶聯珠複合物用PBSTA緩衝劑(1% BSA，於PBS中，具有0.05% Tween20)洗滌且隨後彙集。在去除殘餘洗滌緩衝劑後，將珠與2 mg/mL hTNFRSF21-His蛋白一起培育1小時，洗滌且隨後再懸浮於PBSTA中。將彙集之珠混合物分佈至96孔板中，每一孔皆含有獨特抗TNFRSF21抗體(檢測mAb)，並在振盪下培育1小時。在洗滌步驟後，向孔中添加5ug/ml之濃度偶聯至PE之抗小鼠κ抗體(與上文所用相同)，並培育1小時。將珠再次洗滌並再懸浮於PBSTA中。利用Luminex MAGPIX儀器量測平均螢光強度(MFI)值。將抗體配對可視化為自抗體對之皮爾森相關係數計算之距離矩陣的樹圖。基於抗體對之MFI值之樹圖及分析確定分倉。圖6顯示可在hTNFRSF21蛋白上將篩選之抗TNFRSF21抗體分組成至少四個獨特倉(A-D)。將具有低親和力結合且不可確定特異性倉之抗體表示為在倉X中。空白倉或N/D意指未實施相關抗體之分倉實驗。 實例8 TNFRSF21抗體之測序 如下文所述對實例6中生成之抗TNFRSF21小鼠抗體進行測序。根據製造商之說明書使用RNeasy Miniprep套組(Qiagen)自所選雜交瘤細胞純化總RNA。每個樣品使用104 至105 個細胞。將經分離RNA樣品儲存在-80℃下直至使用。 使用包含86個經設計以靶向完整小鼠VH譜之小鼠特定前導序列引子之兩種5’引子混合物與特異性針對所有小鼠Ig同型之3'小鼠Cγ引子的組合來擴增每一雜交瘤之Ig重鏈之可變區。相似地，使用含有64個經設計以擴增Vκ小鼠家族中之每一者之5' Vκ前導序列之兩種引子混合物與特異性針對小鼠κ恆定區之單一後置引子的組合來擴增κ輕鏈並測序。自100 ng總RNA使用Qiagen一步RT-PCR套組如下擴增VH及VL轉錄物。對每一雜交瘤運行總共四次RT-PCR反應，對Vκ輕鏈運行兩次，且對VH重鏈運行兩次。PCR反應混合物包括1.5 µL RNA、0.4 µL 100 µM重鏈或κ輕鏈引子(由Integrated DNA Technologies定製合成)、5 µL 5× RT-PCR緩衝劑、1 µL dNTP及0.6 µL含有逆轉錄酶及DNA聚合酶之酶混合物。熱循環儀程式是RT步驟50℃持續60 min.、95℃持續15 min.，之後35個(94.5℃持續30秒、57℃持續30秒、72℃持續1 min.)之循環。隨後於72℃下最終培育10 min。 使用如上文針對可變區之擴增所述之相同特異性可變區引子對所萃取PCR產物進行測序。將PCR產物發送至進行PCR純化及測序服務之外部測序供應商(MCLAB)。使用IMGT序列分析工具(http://www.imgt.org/IMGTmedical/sequence_analysis.html )分析核苷酸序列以鑑別具有最高序列同源性之種系V、D及J基因成員。藉由使用專有抗體序列資料庫針對小鼠種系資料庫進行VH及VL基因之比對來比較衍生之序列與Ig V-及J-區之已知種系DNA序列。 圖7A繪示抗TNFRSF21抗體之新穎鼠類輕鏈可變區的鄰接胺基酸序列，而圖7B繪示相同抗TNFRSF21抗體之新穎鼠類重鏈可變區的鄰接胺基酸序列。鼠類輕鏈及重鏈可變區胺基酸序列一起提供於SEQ ID NO: 21 - 271奇數中。 更特定而言，圖7A及7B提供鼠類抗TNFRSF21抗體之經注釋序列，其包含：(1) SEQ ID NO: 21之輕鏈可變區(VL)及SEQ ID NO: 23之重鏈可變區(VH)；或(2) SEQ ID NO: 25之VL及SEQ ID NO: 27之VH；或(3) SEQ ID NO: 29之VL及SEQ ID NO: 31之VH；或(4) SEQ ID NO: 33之VL及SEQ ID NO: 35之VH；或(5) SEQ ID NO: 37之VL及SEQ ID NO: 39之VH；或(6) SEQ ID NO: 41之VL及SEQ ID NO: 43之VH；或(7) SEQ ID NO: 45之VL及SEQ ID NO: 47之VH；或(8) SEQ ID NO: 49之VL及SEQ ID NO: 51之VH；或(9) SEQ ID NO: 53之VL及SEQ ID NO: 55之VH；或(10) SEQ ID NO: 57之VL及SEQ ID NO: 59之VH；或(11) SEQ ID NO: 61之VL及SEQ ID NO: 63之VH；或(12) SEQ ID NO: 65之VL及SEQ ID NO: 67之VH；或(13) SEQ ID NO: 69之VL及SEQ ID NO: 71之VH；或(14) SEQ ID NO: 73之VL及SEQ ID NO: 75之VH；或(15) SEQ ID NO: 77之VL及SEQ ID NO: 79之VH；或(16) SEQ ID NO: 81之VL及SEQ ID NO: 83之VH；或(17) SEQ ID NO: 85之VL及SEQ ID NO: 87之VH；或(18) SEQ ID NO: 89之VL及SEQ ID NO: 91之VH；或(19) SEQ ID NO: 93之VL及SEQ ID NO: 95之VH；或(20) SEQ ID NO: 97之VL及SEQ ID NO: 99之VH；或(21) SEQ ID NO: 101之VL及SEQ ID NO: 103之VH；或(22) SEQ ID NO: 105之VL及SEQ ID NO: 107之VH；或(23) SEQ ID NO: 109之VL及SEQ ID NO: 111之VH；或(24) SEQ ID NO: 113之VL及SEQ ID NO: 115之VH；SEQ ID NO: 117之VL及SEQ ID NO: 119之VH；或(25) SEQ ID NO: 121之VL及SEQ ID NO: 123之VH；或(26) SEQ ID NO: 125之VL及SEQ ID NO: 127之VH；或(27) SEQ ID NO: 129之VL及SEQ ID NO: 131之VH；或(28) SEQ ID NO: 133之VL及SEQ ID NO: 135之VH；或(29) SEQ ID NO: 137之VL及SEQ ID NO: 139之VH；或(30) SEQ ID NO: 141之VL及SEQ ID NO: 143之VH；或(31) SEQ ID NO: 145之VL及SEQ ID NO: 147之VH；或(32) SEQ ID NO: 149之VL及SEQ ID NO: 151之VH；或(33) SEQ ID NO: 153之VL及SEQ ID NO: 155之VH；或(34) SEQ ID NO: 157之VL及SEQ ID NO: 159之VH；或(35) SEQ ID NO: 161之VL及SEQ ID NO: 163之VH；或(36) SEQ ID NO: 165之VL及SEQ ID NO: 167之VH；或(37) SEQ ID NO: 169之VL及SEQ ID NO: 171之VH；或(38) SEQ ID NO: 173之VL及SEQ ID NO: 175之VH；或(39) SEQ ID NO: 177之VL及SEQ ID NO: 179之VH；或(40) SEQ ID NO: 181之VL及SEQ ID NO: 183之VH；或(41) SEQ ID NO: 185之VL及SEQ ID NO: 187之VH；或(42) SEQ ID NO: 189之VL及SEQ ID NO: 191之VH；或(43) SEQ ID NO: 193之VL及SEQ ID NO: 195之VH；或(44) SEQ ID NO: 197之VL及SEQ ID NO: 199之VH；或(45) SEQ ID NO: 201之VL及SEQ ID NO: 203之VH；或(46) SEQ ID NO: 205之VL及SEQ ID NO: 207之VH；或(47) SEQ ID NO: 209之VL及SEQ ID NO: 211之VH；或(48) SEQ ID NO: 213之VL及SEQ ID NO: 215之VH；或(49) SEQ ID NO: 217之VL及SEQ ID NO: 219之VH；或(50) SEQ ID NO: 221之VL及SEQ ID NO: 223之VH；或(51) SEQ ID NO: 225之VL及SEQ ID NO: 227之VH；或(52) SEQ ID NO: 229之VL及SEQ ID NO: 231之VH；或(53) SEQ ID NO: 233之VL及SEQ ID NO: 235之VH；或(54) SEQ ID NO: 237之VL及SEQ ID NO: 239之VH；或(55) SEQ ID NO: 241之VL及SEQ ID NO: 243之VH；或(56) SEQ ID NO: 245之VL及SEQ ID NO: 247之VH；或(57) SEQ ID NO: 249之VL及SEQ ID NO: 251之VH；或(58) SEQ ID NO: 253之VL及SEQ ID NO: 255之VH；或(59) SEQ ID NO: 257之VL及SEQ ID NO: 259之VH；或(60) SEQ ID NO: 261之VL及SEQ ID NO: 263之VH；或(61) SEQ ID NO: 33之VL及SEQ ID NO: 265之VH；或(62) SEQ ID NO: 65之VL及SEQ ID NO: 267之VH；或(63) SEQ ID NO: 269之VL及SEQ ID NO: 103之VH；或(64) SEQ ID NO: 271之VL及SEQ ID NO: 175之VH。 所揭示抗體(或產生其之純系)與其各別名稱(例如，SC39.1、SC39.2等)及可變區核酸或胺基酸SEQ ID NO的概述(參見圖7A - 7C)緊接下文示於表5中。表 5 圖7A及7B中之VL及VH胺基酸序列經注釋以鑑別框架區(即FR1 - FR4)及互補決定區(即，圖7A中之CDRL1 - CDRL3或圖7B中之CDRH1 - CDRH3)，其係根據Kabat等人定義。使用Abysis資料庫之專有版本分析可變區序列以提供CDR及FR名稱。儘管CDR係根據Kabat等人進行定義，但彼等熟習此項技術者應瞭解，CDR及FR名稱亦可根據Chothia、McCallum或任何其他公認命名系統來定義。另外，圖7C提供編碼圖7A及7B中所述之胺基酸序列之核酸序列(SEQ ID NO: 20-270，偶數)。 如圖7A及7B及表5中所見，每一特定鼠類抗體之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列之SEQ ID NO.通常係依序奇數。因此，單株抗TNFRSF21抗體SC39.1包含分別輕鏈及重鏈可變區之胺基酸SEQ ID NO: 21及23；SC39.2包含SEQ ID NO: 25及27；SC39.3包含SEQ ID NO: 29及31，等等。圖7A及7B中所述之依序編號方案之例外係SC39.27 (SEQ ID NO: 33及265)，其包含與抗體SC39.4中發現之相同之輕鏈可變區以及獨特重鏈；SC39.28 (SEQ ID NO: 65及267)，其包含與抗體SC39.24中發現之相同之輕鏈可變區以及獨特重鏈；SC39.153 (SEQ ID NO: 269及103)，其包含與抗體SC39.105中發現之相同之重鏈可變區以及獨特輕鏈；及SC39.161 (SEQ ID NO: 271及175)，其包含與抗體SC39.154中發現之相同之重鏈可變區以及獨特輕鏈。無論如何，編碼鼠類抗體胺基酸序列之相應核酸序列(闡述於圖7C中)具有緊接在相應胺基酸SEQ ID NO之前之SEQ ID NO。因此，例如，SC39.1抗體之VL及VH之核酸序列的SEQ ID NO分別為SEQ ID NO: 20及22。 除圖7A - 7C中之經注釋序列外，圖7G - 7J分別提供SC39.2、SC39.4、SC39.28及SC39.126之輕鏈及重鏈可變區之CDR名稱，如使用Kabat、Chothia、ABM及Contact方法所確定。圖7G - 7J中繪示之CDR名稱係使用如上文所論述之Abysis資料庫之專有版本衍生而來。如隨後實例中所示，熟習此項技術者應瞭解，可將所揭示鼠類CDR移植至人類框架序列中以提供根據本發明之CDR移植或人類化抗TNFRSF21抗體。此外，鑒於本發明，可容易地確定根據本文教示製得及測序之任何抗TNFRSF21抗體的CDR並使用衍生之CDR序列以提供本發明之CDR移植或人類化抗TNFRSF21抗體。此尤其適於具有圖7A - 7B中所述之重鏈及輕鏈可變區序列的抗體。 實例9 TNFRSF21抗體之結構域-等級表位定位 為表徵由所揭示抗TNFRSF21抗體結合之表位，使用基於FACS之方法使用酵母展示結構域實施結構域-等級表位定位(通常參見Cochran等人 2004, PMID: 15099763)。 hTNFRSF21中發現之結構域之示意性代表圖係在圖1B中。酵母展示質體構築體用於表現hTNFRSF21 cys重複1 (D1)，其包含胺基酸42-89；cys重複2 (D2)，其包含胺基酸90-132；cys重複3 (D3)，其包含胺基酸133-168；cys重複4 (D4)，其包含胺基酸169-211；包含胺基酸212-349之細胞外結構域(D5)之其餘部分，及D1、D2、D3、D4及D5之組合。該等結構域之編號包括胺基酸1-41，即hTNFRSF21之信號肽序列(在圖1A中加下劃線)。對於結構域資訊，通常參見UniProtKB/Swiss-Prot資料庫條目O75509。 將酵母展示質體轉變至酵母中，隨後使其生長並誘導，如Cochran等人中所述。為測試與特定構築體之結合，將200,000個表現期望構築體之誘導酵母細胞在PBS中用1 mg/mL BSA (PBSA)洗滌兩次，並在50 µL PBSA中以100 ng/mL及10 µg/mL純化抗體(鼠類或人類化)與雞抗c-Myc (Life Technologies)一起培育。將細胞在冰上培育90分鐘且隨後在PBSA中洗滌兩次。隨後將細胞在50 µL PBSA中與Alexa 488偶聯之抗雞及Alexa 647偶聯之山羊抗小鼠或山羊抗人類抗體(二者皆來自Life Technologies)各自以0.3 µg/mL一起培育。在冰上20分鐘培育後，將細胞用PBSA洗滌兩次並在FACSCanto II (BD Biosciences)上分析。 圖8A概述結構域-等級表位定位實驗之結果。表位定位數據顯示整個抗原之良好覆蓋率，且多個抗體結合至每一結構域。 為確定表位位置是否在抗體介導細胞殺死之能力中起作用，表現人類hTNFRSF21之293細胞之圖11A中所述之殺死數據(如下文實例13中所述測定)係由結構域繪圖以提供圖8B。圖8B之綜述顯示定位至結構域1 - 3之彼等抗體在如下文所述結合肥皂草毒素使用時展現較高細胞殺死活性。該等資料指示，結合至與結構域1 - 3相關之表位之抗體在用作如本文中揭示之抗體藥物偶聯物之組份時尤其有效。 實例10 嵌合及人類化抗TNFRSF21抗體之生成 使用業內公認技術如下生成嵌合抗TNFRSF21抗體。 使用實質上實例1中所述之方法自產生抗TNFRSF21抗體之雜交瘤萃取總RNA並使RNA進行PCR擴增。自本發明之抗TNFRSF21抗體之核酸序列(圖7C)獲得關於小鼠抗體之VH及VL鏈之V、D及J基因區段的數據。使用以下限制性位點設計特異性針對抗體VH及VL鏈之框架序列之引子集合：AgeI及XhoI用於VH片段，且XmaI及DraIII用於VL片段。使用Qiaquick PCR純化套組(Qiagen)純化PCR產物，之後用針對VH片段之限制酶AgeI及XhoI及針對VL片段之XmaI及DraIII消化。將VH及VL消化之PCR產物純化且分別連接至IgH或Igκ表現載體中。在含有200 U T4-DNA連接酶(New England Biolabs)、7.5 µL經消化且經純化之基因特異性PCR產物及25 ng線性化載體DNA之10 µL總體積中實施連接反應。經由在42℃下用3 µL連接產物熱休克來轉化勝任大腸桿菌DH10B細菌(Life Technologies)，且以100 µg/mL之濃度平鋪於胺苄青黴素(ampicillin)板上。純化並消化所擴增連接產物後，將VH片段選殖至包含HuIgG1之pEE6.4表現載體(Lonza) (pEE6.4HuIgG1)之AgeI-XhoI限制性位點中，且將VL片段選殖至包含人類κ輕鏈恆定區之pEE12.4表現載體(Lonza) (pEE12.4Hu-κ)之XmaI-DraIII限制性位點中。 藉由使用聚乙烯亞胺(PEI)作為轉染試劑將CHO-S細胞與pEE6.4HuIgG1及pEE12.4Hu-κ表現載體共轉染來表現包含鼠類VH及VL區及人類恆定區之嵌合抗體。在轉染後3至6天收穫上清液。藉由在800×g下離心10 min.自細胞碎片清除含有重組嵌合抗體之培養物上清液且儲存在4℃下。使用蛋白質A珠純化重組嵌合抗體。 另外，藉助專有分析程式(Abysis資料庫，UCL Business)及表現分子改造技術如下人類化所選鼠類抗TNFRSF21抗體(SC39.2、SC39.4及SC39.28、SC39.126)。基於人類種系抗體序列之框架序列與CDR規範結構之間以及相關小鼠抗體之框架序列與CDR之間的最高同源性選擇/設計可變區之人類框架區。出於分析之目的，根據Kabat等人之編號將胺基酸指配至每一CDR結構域。在選擇可變區後，其立即自合成基因區段生成(Integrated DNA Technologies)。使用上文針對嵌合抗體闡述之分子方法選殖及表現人類化抗體。 圖7D及7E中所示之人類化抗體hSC39.2之VL及VH序列(SEQ ID NO: 281及283，aa及SEQ ID NO: 280及282, na)、hSC39.4之VL及VH序列(SEQ ID NO: 285及287，aa及SEQ ID NO: 284及286，na)、hSC39.28之VL及VH序列(SEQ ID NO: 289及291，aa及SEQ ID NO: 288及290，na)及hSC39.126之VL及VH序列(SEQ ID NO: 293及295，aa及SEQ ID NO: 292及294，na)分別衍生自相應鼠類抗體SC39.2之VL及VH序列(aa SEQ ID NO: 25及27)、SC39.4之VL及VH序列(aa SEQ ID NO: 33及35)、SC39.28之VL及VH序列(aa SEQ ID NO: 65及267)及SC39.126之VL及VH序列(aa SEQ ID NO: 253及255)。 下表6顯示在重鏈可變區中之位置47及93 (hSC39.4)、94 (hSC39.2)及48 (hSC39.126)及SC39.2之輕鏈可變區之位置46及48進行框架變化，以維持人類化抗體之有利之結合性質。表 6 除人類化VH及VL胺基酸及核酸序列(圖7D及7E)外，圖7F亦提供表6中所述之實例性人類化抗體構築體之全長重鏈及輕鏈胺基酸序列。在圖7F中，VH及VL區以及位點特異性C220S突變加下劃線。另外，與人類化構築體中之每一者相關之核酸及胺基酸序列之概述緊接下文提供於表7中。注意，hSC39.4及hSC39.126構築體利用相同VL及VH區及相同輕鏈但不同重鏈，其不同之處在於一條重鏈納入為位點特異性偶聯提供游離半胱胺酸之突變(C220S)。表 7 此實例中所述之實例性人類化抗體展現可如本文中所揭示生成並衍生臨床上相容之抗體。在本發明之某些態樣中，可將該等抗體納入TNFRSF21 ADC中以提供包含有利之治療指數之組合物。 實例11 藉由MSD之腫瘤中之TNFRSF21蛋白質表現的檢測 鑒於與實例1-3中所述之各種腫瘤相關之TNFRSF21 mRNA轉錄物含量升高，採取工作以測試TNFRSF21蛋白表現亦在PDX腫瘤中升高。為檢測並量化TNFRSF21蛋白表現，使用MSD Discovery平臺(Meso Scale Discovery)研發電化學發光TNFRSF21夾心式ELISA分析。 自小鼠切除PDX腫瘤並在乾冰/乙醇上急凍。向解凍腫瘤片中添加蛋白質萃取緩衝劑(Biochain Institute)並使用TissueLyser系統(Qiagen)粉碎腫瘤。藉由離心(20,000 g，20 min.，4℃)清除溶解物並使用雙金雞寧酸量化每一溶解物中之總蛋白濃度。隨後將蛋白溶解物正規化至5 mg/mL並儲存於-80℃下直至使用。正常組織係購自商業來源。 藉由自標準蛋白濃度曲線內插值測定溶解物樣品之TNFRSF21蛋白濃度，該標準蛋白濃度曲線係使用純化重組體hTNFRSF21-His蛋白(來自實例5)生成。如下執行TNFRSF21蛋白標準曲線及蛋白量化分析。 於4℃下將MSD標準板用15 µL SC39.47抗體以2 µg/mL在PBS中塗佈過夜。將板在PBST中洗滌並在35 µL MSD 3%封阻劑A溶液中封阻1小時，同時振盪。在PBST中再次洗滌板。亦向孔中添加含有10%蛋白萃取緩衝劑之MSD 1%封阻劑A中之10 µL 10×經稀釋溶解物(或連續稀釋重組體TNFRSF21標準)並培育2小時，同時振盪。在PBST中再次洗滌板。隨後根據製造商之方案使用MSD® SULF0-TAG NHS酯對抗TNFRSF21檢測抗體(R&D Systems；AF144)進行磺基標記。MSD磺基-標籤NHS-酯係胺反應性N-羥基琥珀醯亞胺酯，其在輕度鹼性條件下易於偶合至一級胺基團以形成穩定醯胺鍵。於室溫下在攪拌的同時以0.5 µg/mL在MSD 1%封阻劑A中向洗滌板中添加10 µL經標記檢測抗體達1小時。在PBST中洗滌板。將具有表面活性劑之MSD讀取緩衝劑T在水中稀釋至1×並向每一孔中添加35 µL。使用積體軟體分析程式在MSD扇形成像儀2400上對板進行讀數以經由自標準曲線內插衍生PDX樣品中之TNFRSF21濃度。隨後將值除以總蛋白濃度以產生奈克TNFRSF21/毫克總溶解物蛋白。所得濃度闡述於圖9中，其中每一斑點代表源自單一PDX腫瘤系之TNFRSF21蛋白濃度。儘管每一斑點係源自單一PDX系，但在大多數情形下，自相同PDX系測試多個生物樣品並取平均值以提供數據點。 圖9顯示乳房、結腸、胃、肺、卵巢及胰臟腫瘤樣品之代表性樣品展現高TNFRSF21蛋白表現。所測試正常組織包括腎上腺、動脈、結腸、食道、膽囊、心臟、腎、肝、肺、外周及坐骨神經、胰臟、骨骼肌、皮膚、小腸、脾、胃、氣管、紅血球及白血球及血小板、膀胱、腦、乳房、眼、淋巴結、卵巢、垂體、前列腺及脊髓。以下組織繪示為「NormTox」以指示人類中之潛在毒性問題：氣管、胃、脾、小腸、皮膚、骨骼肌、紅/白血球、血小板、胰臟、神經、肺、肝、腎、心臟、膽囊、食道、結腸、動脈及腎上腺。正常組織中TNFRSF21之表現大部分高於NormTox組織。該等數據與上述TNFRSF21表現之mRNA表現數據的組合強烈強化如下主張：TNFRSF21決定子為治療性介入提供有吸引力之靶標。 實例12 藉由流式細胞術之腫瘤中TNFRSF21蛋白質表現之檢測 如下評價本發明抗體結合在PDX腫瘤細胞上表現之TNFRSF21之能力。 收穫PDX腫瘤並使用業內公認之酶組織消化技術解離以獲得PDX腫瘤細胞之單一細胞懸浮液(參見(例如) U.S.P.N. 2007/0292414)。將PDX腫瘤單一細胞懸浮液與抗小鼠CD45及H-2Kd 抗體一起培育以鑑別小鼠細胞，並與抗人類EPCAM抗體一起培育以鑑別人類細胞。另外，將腫瘤細胞與抗人類CD46 AlexaFluor-647及CD324 PerCP Cy5.5一起培育以鑑別CSC (參見U.S.P.N. 2013/0260385、2013/0061340及2013/0061342)。最後，將PDX腫瘤細胞與抗TNFRSF21生物素化純系SC39.23一起培育以測定TNFRSF21在PDX亞群體上之細胞表面表現。將經分離細胞與一級抗體或同型匹配對照抗體一起培育30 min.並在PBS/2% FCS中洗滌兩次。將細胞與每樣品50 μL藻紅素標記之鏈黴抗生物素蛋白二級抗體(其以1:200稀釋於PBS/2%FCS中)一起培育15 min.，用1 mL PBS/2% FCS洗兩次並再懸浮於具有4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)之PBS/2% FCS中用於區分活細胞及死細胞。隨後藉由流式細胞術使用BD FACS Canto II流式細胞計數器分析結合至PDX腫瘤細胞之抗體。 圖10A顯示PA PDX具有TNFRSF21蛋白在活的人類CSC亞群體上之表現(黑色實線；PA20、PA55、PA60及PA66)，而NTG細胞(不表現CD324或CD46) (虛線)展現顯著較少的經抗TNFRSF21抗體染色。採用螢光減一(FMO)及同型對照抗體以確認染色特異性(填充灰色)。概述在CSC及NTG細胞表面上觀察之抗TNFRSF21抗體之差異染色之表顯示於圖10A中，其中表現列舉為指示抗TNFRSF21抗體與各別腫瘤細胞亞群體之同型對照之間之幾何平均值螢光強度變化(ΔMFI)。此數據進一步確認TNFRSF21在致瘤細胞上之升高表現及本發明抗體選擇性結合至該等細胞之能力。 更特定而言，實例1及2 (圖2及3B)顯示與自LU-Ad、LU-SCC及PA PDX腫瘤系分離之NTG細胞相比，TNFRSF21 mRNA表現在CSC中升高。在兩個分析中測試LU134、PA20及PA4且顯示橫跨兩個平臺，CSC中之TNFRSF21 mRNA表現高於NTG亞群體。相似地，亦發現TNFRSF21蛋白表現在PA PDX腫瘤CSC亞群體中升高，如藉由此實例中之流式細胞術所測定。就此而言，圖10A中之結果(在PA20、PA55、PA60及PA66中升高)與CSC中升高之mRNA表現相關，如藉由全轉錄體分析(PA20、PA55)及qRT-PCR (PA20)所測定。 大部分PA PDX中之功能CSC亞群體係＜1:100個細胞，而包括CSC亞群體之細胞群體之表型細胞表面標記物介於1-94%之PA PDX腫瘤範圍內。由於TNFRSF21經常在CSC亞群體(其僅係體腫瘤之一部分)中升高，故與全PDX腫瘤表現相比於正常組織相比較，CSC群體與正常組織表現之間存在較大表現差異。此在腫瘤中之CSC及正常組織表現之間產生TNFRSF21之較大表現差異，指向有益地使用抗TNFRSF21調節劑治療在CSC亞群體中具有TNFRSF21之表現的腫瘤。 基於先前實例中所示之RNA數據，實質上如上文所述製備膀胱(BL) PDX腫瘤樣品。更具體而言，將PDX腫瘤單一細胞懸浮液與抗小鼠CD45及H-2Kd 抗體一起培育以鑑別小鼠細胞，並與抗人類EPCAM抗體一起培育以鑑別人類細胞。另外，將腫瘤細胞與抗人類CD111 AF647及抗人類CD324 PerCP Cy5.5 CSC一起培育。最後，將PDX腫瘤細胞與抗TNFRSF21 PE偶聯之SC39.107一起培育以測定TNFRSF21在PDX亞群體上之細胞表面表現。將經分離細胞與一級抗體或同型匹配對照抗體一起培育30 min.並在PBS/2% FCS中洗滌兩次。將細胞用1 mL PBS/2% FCS洗滌兩次並再懸浮於具有4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)之PBS/2% FCS中用於分化之活及死細胞。隨後藉由流式細胞術使用BD FACS Canto II流式細胞計數器分析結合至PDX腫瘤細胞之抗體。 圖10B顯示BLCA PDX具有TNFRSF21蛋白在活的人類CSC亞群體上之表現(黑色實線；BL38)，而NTG細胞(虛線)展現顯著較少的經抗TNFRSF21抗體染色。採用螢光減一(FMO)及同型對照抗體以確認染色特異性(填充灰色)。概述在CSC及NTG細胞表面上觀察之抗TNFRSF21抗體之差異染色之表顯示於圖10B中，其中表現列舉為指示抗TNFRSF21抗體與各別腫瘤細胞亞群體之同型對照之間之幾何平均值螢光強度變化(ΔMFI)。 此數據進一步確認TNFRSF21在致瘤細胞上之升高表現及本發明抗體選擇性結合至該等細胞之能力。 實例13 抗TNFRSF21抗體有利於細胞毒性劑之活體外遞送 為確定本發明之抗TNFRSF21抗體是否能內化以介導細胞毒性劑遞送至活的腫瘤細胞，使用連接至肥皂草毒素之所選抗TNFRSF21抗體及二級抗小鼠抗體FAB片段實施活體外細胞殺死分析。肥皂草毒素係使核糖體不活化藉此抑制蛋白質合成並引起細胞死亡之植物毒素。由於肥皂草毒素作用於核糖體，故其僅在細胞內具有細胞毒性，但不能自身內化。因此，此實例中所證明之肥皂草毒素介導之細胞毒性指示所揭示抗TNFRSF21抗體在結合至細胞表面上之靶蛋白後內化之能力。 將過表現hTNFRSF21之HEK293T細胞之單一細胞懸浮液以500個細胞/孔平鋪於BD組織培養板(BD Biosciences)中。一天後，向培養物中添加不同濃度之純化抗TNFRSF21抗體以及固定濃度之2 nM抗小鼠IgG FAB-肥皂草毒素構築體(Advanced Targeting Systems)用於測定小鼠抗體或2 nM抗人類IgG FAB-肥皂草毒素構築體用於測試人類化抗體。在培育96小時後，根據製造商之說明書使用CellTiter-Glo® (Promega)列舉活細胞。將使用含有僅與二級FAB-肥皂草毒素偶聯物一起培育之細胞之培養物的粗發光計數設定為100%參照值且將所有其他計數計算為參照值之百分比。 於10 pM之濃度下，抗TNFRSF21抗體之大子集有效殺死過表現hTNFRSF21之HEK-293T細胞(圖11A)，而相同濃度之小鼠IgG1同型對照抗體(muIgG1)卻不如此。另外，利用抗TNFRSF21抗體處理不表現靶蛋白之野生型HEK-293T細胞不引起任何細胞死亡，指示抗TNFRSF21抗體特異性結合至TNFRSF21蛋白(數據未顯示)。 使用嵌合及人類化抗TNFRSF21抗體以濃度依賴性方式重複上述實驗。就此而言，圖11B顯示抗TNFRSF21人類化抗體(hSC39.2、hSC39.4、hSC39.28及hSC39.126)有效殺死過表現TNFRSF21之HEK-293T細胞。應注意，人類化抗體顯示與其源自之嵌合抗體相當之效能。上述結果展現抗TNFRSF21抗體(包括人類化抗體)內化並遞送細胞毒性酬載之能力，藉此展現抗TNFRSF21抗體可有效地用作ADC之靶向部分。 實例14 位點特異性TNFRSF21抗體之生成 除天然人類化IgG1抗TNFRSF21抗體(hSC39.2、hSC39.4、hSC39.28及hSC39.126)外，亦構築包含經突變以提供未配對半胱胺酸之天然輕鏈(LC)恆定區及重鏈(HC)恆定區的經改造人類IgG1/κ抗TNFRSF21位點特異性抗體。就此而言，用絲胺酸(C220S)取代HC之上鉸鏈區中之半胱胺酸220 (C220)以提供hSC39.4ss1及hSC39.126ss1。在組裝時，HC與LC形成在適於偶聯至治療劑之輕鏈恆定區之c-末端包含兩個游離半胱胺酸的抗體。除非另有說明，否則恆定區殘基之所有編號係根據如Kabat等人中所述之EU編號方案。 為生成人類化天然IgG1抗體及位點特異性構築體，將VH核酸選殖至含有HC恆定區(例如，SEQ ID NO: 2)或其之C220S突變(例如，SEQ ID NO: 3)之表現載體上。將編碼天然hSC39.4 HC (圖7F，SEQ ID NO: 303)、hSC39.4之突變體C220S HC (圖7F，SEQ ID NO: 311)之所得載體在CHO-S細胞中用編碼可操作地與野生型IgG1 κ LC (SEQ ID NO: 5)相關之所選VL (hSC39.4)之載體共轉染以提供hSC39.4 LC (SEQ ID NO: 302)並使用哺乳動物瞬時表現系統表現。含有C220S突變體HC之所得抗TNFRSF21位點特異性抗體稱作hSC39.4ss1，而天然型式稱作hSC39.4。就此而言，全長hSC39.4位點特異性抗體重鏈及輕鏈之胺基酸序列示於圖7F中(以及天然人類化抗體hSC39.4)，其中hSC39.4ss1包含分別SEQ ID NO: 302及311之LC及HC且hSC39.4包含分別SEQ ID NO: 302及303之LC及HC。另外，使用實質上相同製程使用適當序列以提供表7中所示之hSC39.126類似物。重鏈上之可變區及位點特異性突變之位置加下劃線，在圖7F中適用於兩組分子。 藉由SDS-PAGE表徵經改造之抗TNFRSF21位點特異性抗體以確認生成正確突變體。在還原劑(例如DTT (二硫蘇糖醇))存在及不存在下在來自Life Technologies之預澆鑄10% Tris-甘胺酸微型凝膠上執行SDS-PAGE。在電泳後，將凝膠用膠狀考馬斯溶液(coomassie solution)染色(數據未顯示)。在還原條件下，觀察到對應於游離LC及游離HC之兩個帶。此圖案係還原條件中之IgG分子之特點。在非還原條件下，帶圖案不同於天然IgG分子，指示HC與LC之間不存在二硫鍵。觀察到對應於HC-HC二聚體之約98 kD之帶。另外，觀察到對應於游離LC之不明顯帶及對應於LC-LC二聚體之約48 kD之主要帶。由於每一LC之c-末端上之游離半胱胺酸，預計形成一定量之LC-LC物質。 實例15 抗TNFRSF21抗體藥物偶聯物之製備 根據本文教示製備抗TNFRSF21 ADC用於進一步活體外及活體內測試。 就此而言，經由具有游離硫氫基之末端馬來醯亞胺基部分將實例10及14之所選人類化抗TNFRSF21抗體(天然及位點特異性)偶聯至各種細胞毒素(奧裡斯他汀、尾海兔素及卡奇黴素)以產生實例性抗體藥物偶聯物(ADC)。 如下製備天然抗體抗TNFRSF21 ADC。於室溫下在具有5 mM EDTA之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中每mol抗體添加預定莫耳濃度之mol參(2-羧基乙基)-膦(TCEP)部分還原抗TNFRSF21抗體之半胱胺酸鍵達90 min。隨後於室溫下經由馬來醯亞胺連接體將所得部分還原製劑偶聯至所選細胞毒素(細胞毒素之結構提供於本說明書上文中)達最少30 min。隨後利用添加與連接體-藥物相比過量之N-乙醯基半胱胺酸(NAC)使用水中製備之10 mM原液淬滅反應。在20 min之最少淬滅時間後，利用添加0.5 M乙酸將pH調節至6.0。藉由使用30 kDa膜滲濾將ADC之製劑之緩衝劑更換成滲濾緩衝劑。隨後將經滲濾之抗TNFRSF21 ADC用蔗糖及聚山梨醇酯-20調配至最終靶濃度。分析所得抗TNFRSF21 ADC之蛋白濃度(藉由量測UV)、聚集(SEC)、藥物對抗體比(DAR) (藉由反相HPLC (RP-HPLC))及活性(活體外細胞毒性)。 使用經改良部分還原製程偶聯位點特異性人類化抗TNFRSF21 ADC (例如，hSC39.4ss1及hSC39.126ss1)。期望產物係ADC，其在每一LC恆定區上之未配對半胱胺酸(C214)上最大地偶聯並最小化載藥量大於2之ADC，同時最大化載藥量為2之ADC。為進一步改良偶聯之特異性，使用在與連接體-藥物偶聯之前包含穩定劑(例如L-精胺酸)及輕度還原劑(例如麩胱甘肽)、之後滲濾及調配步驟之製程選擇性還原抗體。 更具體而言，於室溫下在含有1M L-精胺酸/5mM EDTA與預定濃度之經還原麩胱甘肽(GSH) (pH 8.0)之緩衝劑中部分還原每一抗體之製劑達最少2小時。隨後使用30 kDa膜(Millipore Amicon Ultra)將所有製劑之緩衝劑更換成20 mM Tris/3.2 mM EDTA pH 7.0緩衝劑以去除還原緩衝劑。隨後於室溫下經由馬來醯亞胺連接體將所得部分還原製劑偶聯至PBD3達最少30 min。隨後利用添加與連接體-藥物相比過量之NAC使用水中製備之10 mM原液淬滅反應。在20 min之最少淬滅時間後，利用添加0.5 M乙酸將pH調節至6.0。藉由使用30 kDa膜滲濾將ADC之製劑之緩衝劑更換成滲濾緩衝劑。隨後將經滲濾之抗TNFRSF21 ADC用蔗糖及聚山梨醇酯-20調配至最終靶濃度。 分析所得抗TNFRSF21 ADC之蛋白濃度(藉由量測UV)、聚集(SEC)、藥物對抗體比(DAR) (藉由反相HPLC (RP-HPLC))及活性(活體外細胞毒性)。隨後將其冷凍並儲存直至使用。實例 16 TNFRSF21 抗體藥物偶聯物有利於細胞毒性劑活體外之 遞送 為確定本發明之抗TNFRSF21 ADC是否能內化以介導細胞毒性劑遞送至活的腫瘤細胞，使用各自實質上如上文實例15中所述產生之抗TNFRSF21 ADC hSC39.2 MMAE、hSC39.4 MMAE、hSC39.4ss1 MMAE、hSC39.28 MMAE、hSC39.126 MMAE、hSC39.136 MMAE、hSC39.4 Dola、hSC39.4ss1 Dola及hSC39.4ss1 Caliche (四種不同卡奇黴素藥物連接體)實施活體外細胞殺死分析。 將過表現hTNFRSF21之HEK293T細胞或未經處理之HEK293T細胞之單一細胞懸浮液以500個細胞/孔平鋪於BD組織培養板(BD Biosciences)中。一天後，向培養物中添加不同濃度之偶聯至MMAE、尾海兔素10、N-乙醯基卡奇黴素或乙醯化卡奇黴素之純化ADC或人類IgG1對照抗體。將細胞於37C/5% CO2下培育96小時。在培育後，根據製造商之說明書使用CellTiter-Glo® (Promega)列舉活細胞。將使用含有未經處理之細胞之培養物的粗發光計數設定為100%參照值且將所有其他計數計算為參照值之百分比。圖12A - 12D顯示與人類IgG1對照抗體相比，細胞對抗TNFRSF21 ADC遠更敏感。此係事實，儘管在查看位點特異性構築體與習用偶聯ADC (圖12A)時，其中兩種類型之TNFRSF21 MMAE ADC比IgG對照ADC更具有細胞毒性。相似地，圖12B顯示多種實例性TNFRSF21抗體在納入本發明之MMAE ADC中時有效殺死TNFRSF21+細胞。圖12C進一步展現此次納入尾海兔素細胞毒性劑之所揭示之TNFRSF21 ADC可有效且選擇性消除TNFRSF21+細胞。最後，圖12D圖解說明本發明之又一些實施例，此次納入四種不同卡奇黴素酬載(ADC9及ADC18之乙醯化及非乙醯化變體)，可用於有效消除TNFRSF21改造細胞。此外，在每一情形下，TNFRSF21 ADC對於不過表現TNFRSF21之未經處理之HEK293T細胞的效應極小，藉此重複展現ADC選擇性殺死靶細胞之能力，儘管納入各種相容性細胞毒性劑。 上文所提及之結果明確展現抗TNFRSF21 ADC特異性介導所選細胞毒性酬載(卡奇黴素、MMAE及尾海兔素)之內化及遞送至表現TNFRSF21之細胞的能力。實例 17 抗 TNFRSF21 抗體藥物偶聯物抑制活體內 腫瘤生長 基本上如下文所述使用業內公認之技術測試(例如)如上文實例15中所述生成之抗TNFRSF21 ADC，以展現其在免疫缺陷小鼠中抑制人類肺、胰臟及膀胱腫瘤生長的能力。 使用業內公認之技術使表現TNFRSF21之PDX腫瘤系(LU253、LU206、LU139、PA20、BL65及BL38)及不表現TNFRSF21之對照腫瘤系在雌性NOD/SCID小鼠之側腹中皮下生長。每週一次或兩次監測腫瘤體積及小鼠體重。在腫瘤體積達到150-250 mm3 時，將小鼠隨機分配至治療組並靜脈內注射單一劑量之包含尾海兔素10、MMAE或卡奇黴素酬載之hSC39.4ss1及hSC39.126ss1 ADC (圖13A - 13I)。在治療後，監測腫瘤體積及小鼠體重直至腫瘤超過800 mm3 或小鼠患病。 如圖13A - 13I中所示，所揭示TNFRSF21 ADC實質上延遲或抑制帶有展現TNFRSF21表現之肺、胰臟或膀胱腫瘤之小鼠中的腫瘤生長。就此而言，用人類化位點特異性TNFRSF21尾海兔素ADC治療小鼠在帶有肺、胰臟及膀胱腫瘤之小鼠中引起持續約60至100+天之腫瘤收縮(圖13A - 13F)。如圖13G及13H中可見，使用人類化位點特異性TNFRSF21 MMAE ADC獲得相似結果。更具體而言，所投與ADC抑制胰臟及肺腫瘤生長達延長時段，且在LU253中，展現劑量依賴性，其中10 mg/kg展現比3 mg/kg有效之抑制。最後，如圖13I中可見，包含此實例中所用之相同抗體中之一者(hSC39.4ss1)但納入卡奇黴素酬載之ADC於約8 mg/kg之劑量下顯示胰臟腫瘤之有效抑制。關於先前實例，利用包含不同細胞結合劑及三種不同細胞毒性酬載(具有不同作用機制)之TNFRSF21 ADC抑制腫瘤生長之能力展現根據本發明之本發明之寬泛適用性。 除圖12A - 12D中提供之數據外，圖13A - 13I中所述之數據亦一起提供如下強烈證據：所揭示TNFRSF21 ADC係可用於治療各種贅瘤性病況(包括肺、膀胱及胰臟癌)之可行臨床候選者。實例 18 藉由抗 TNFRSF21 抗體 - 藥物偶聯物之腫瘤起始細胞頻率之減少 如上文實例11及12中所展現，TNFRSF21表現與致瘤性相關。因此，為展現抗TNFRSF21 ADC治療減少已知具有抗藥性且推動腫瘤復發及轉移之腫瘤起始細胞(TIC)之頻率，例如基本上如下文所述實施活體內限制稀釋分析(LDA)。 使PDX腫瘤(例如結腸直腸或胃)在免疫缺陷小鼠中皮下生長。在腫瘤體積之大小平均為150 mm3 - 250 mm3 時，將小鼠隨機分成兩組。一組腹膜內注射偶聯至藥物之人類IgG1作為陰性對照；且另一組腹膜內注射抗TNFRSF21 ADC (例如，如上文實例中製備)。投藥一週後，將每一組之兩隻代表性小鼠安樂死並收穫其腫瘤並分散至單一細胞懸浮液。隨後如實例1中先前所述收穫、彙集並分解每一治療組之腫瘤細胞。將細胞用FITC偶聯之抗小鼠H2kD及抗小鼠CD45抗體標記以檢測小鼠細胞；用EpCAM標記以檢測人類細胞；並用DAPI標記以檢測死細胞。隨後藉由FACS使用BD FACS Canto II流式細胞計數器分選所得懸浮液並分離並收集活的人類腫瘤細胞。 向四組小鼠注射1250、375、115或35個來自經抗TNFRSF21 ADC治療之腫瘤之分選之活的人類細胞。作為陰性對照，向四組小鼠移植1000、300、100或30個來自經對照IgG1 ADC治療之腫瘤之分選的活的人類細胞。每週量測接受者小鼠中之腫瘤，且在腫瘤達到1500 mm3 之前將個別小鼠安樂死。將接受者小鼠評分為具有陽性或陰性腫瘤生長。陽性腫瘤生長定義為腫瘤生長超過100 mm3 。 使用帕松分佈統計學(L-Calc軟體，Stemcell Technologies)以計算每一群體中之TIC之頻率。 彼等熟習此項技術者將進一步瞭解，本發明可在不背離其精神或關鍵屬性的情況下以其他特定形式體現。鑒於本發明之先前說明僅揭示其實例性實施例，應理解其他變化形式亦涵蓋在本發明之範疇內。因此，本發明並不限於本文已詳細闡述之特定實施例。相反，應提及隨附申請專利範圍來指示本發明之範疇及內容。
圖1A及1B分別提供了具有出於解釋目的而描繪之個別分子組份之TNFRSF21之經注釋胺基酸序列(圖1A)以及其示意性代表圖(圖1B)； 圖2繪示TNFRSF21之表現程度，如使用Illumina平臺使用源自患者源異種移植物(PDX)癌幹細胞(CSC)及非致瘤(NTG)細胞以及正常組織之RNA的全轉錄體測序所量測； 圖3A及3B繪示TNFRSF21轉錄物之相對表現程度，如藉由qRT-PCR在分離自正常組織及多種PDX腫瘤之RNA樣品中(圖3A)及在分離自各種正常組織以及分離自各種PDX腫瘤之CSC及NTG細胞的RNA樣品中(圖3B)所量測； 圖4顯示TNFRSF21轉錄表現之正規化強度值，如藉由源自正常組織及各種PDX細胞系之RNA上之微陣列雜交所量測； 圖5顯示如源自癌症基因體圖譜(TCGA) (一個可公開獲得之資料集)之正常組織及原發性腫瘤中TNFRSF21轉錄物之表現程度； 圖6以表格形式提供如本文所述生成之實例性抗TNFRSF21抗體之抗體同型、分倉及大鼠交叉反應性； 圖7A-7J提供經注釋胺基酸及核酸序列，其中圖7A及7B顯示實例性鼠類抗TNFRSF21抗體之輕鏈(圖7A)及重鏈(圖7B)可變區之鄰接胺基酸序列(SEQ ID NO: 21-271，奇數)，圖7C顯示編碼上文所提及之輕鏈及重鏈可變區之核酸序列(SEQ ID NO: 20-270，偶數)，圖7D及7E分別繪示所選抗TNFRSF21抗體之人類化VL及VH結構域之胺基酸序列及核酸序列，圖7F顯示全長重鏈及輕鏈構築體之胺基酸序列，且圖7G - 7J繪示SC39.2、SC39.4、SC39.28及SC39.126鼠類抗體之輕鏈及重鏈可變區之CDR，如使用Kabat、Chothia、ABM及Contact方法所測定； 圖8A及8B分別以表格及圖表格式提供如經由結構域定位測定之實例性抗TNFRSF21抗體之表位位置(圖8A)及繪示為隨其結構域結合變化之圖之抗體之細胞殺死活性(圖8B)； 圖9顯示使用電化學發光夾心式ELISA分析量測之各種PDX細胞系及正常組織中人類TNFRSF21之相對蛋白質表現； 圖10A及10B顯示與同型對照染色之群體(灰色實線)相比，藉由流式細胞術在胰臟(圖10A)及膀胱PDX (圖10B) CSC亞群體(黑線)及NTG亞群體(虛線)中測定之TNFRSF21之表面蛋白質表現，同時概述該等群體之ΔMFI； 圖11A及11B顯示所選抗TNFRSF21鼠類抗體(圖11A)或人類化抗體(圖11B)經由引入肥皂草毒素內化並殺死表現TNFRSF21蛋白之細胞之能力； 圖12A - 12D展現所揭示TNFRSF21 ADC以濃度依賴方式活體外 殺死表現TNFRSF21之細胞；且 圖13A - 13I顯示實例性TNFRSF21 ADC抑制免疫受損小鼠中之腫瘤負荷。

Claims (45)

  1. 一種經分離之抗體，其結合至表現TNFRSF21之腫瘤起始細胞。
  2. 一種經分離之抗體，其結合至包含SEQ ID NO: 1之人類TNFRSF21。
  3. 一種經分離之抗體，其結合至TNFRSF21且包含以下或與包含以下之抗體競爭結合： SEQ ID NO: 21之輕鏈可變區(VL)及SEQ ID NO: 23之重鏈可變區(VH)；或 SEQ ID NO: 25之VL及SEQ ID NO: 27之VH；或 SEQ ID NO: 29之VL及SEQ ID NO: 31之VH；或 SEQ ID NO: 33之VL及SEQ ID NO: 35之VH；或 SEQ ID NO: 37之VL及SEQ ID NO: 39之VH；或 SEQ ID NO: 41之VL及SEQ ID NO: 43之VH；或 SEQ ID NO: 45之VL及SEQ ID NO: 47之VH；或 SEQ ID NO: 49之VL及SEQ ID NO: 51之VH；或 SEQ ID NO: 53之VL及SEQ ID NO: 55之VH；或 SEQ ID NO: 57之VL及SEQ ID NO: 59之VH；或 SEQ ID NO: 61之VL及SEQ ID NO: 63之VH；或 SEQ ID NO: 65之VL及SEQ ID NO: 67之VH；或 SEQ ID NO: 69之VL及SEQ ID NO: 71之VH；或 SEQ ID NO: 73之VL及SEQ ID NO: 75之VH；或 SEQ ID NO: 77之VL及SEQ ID NO: 79之VH；或 SEQ ID NO: 81之VL及SEQ ID NO: 83之VH；或 SEQ ID NO: 85之VL及SEQ ID NO: 87之VH；或 SEQ ID NO: 89之VL及SEQ ID NO: 91之VH；或 SEQ ID NO: 93之VL及SEQ ID NO: 95之VH；或 SEQ ID NO: 97之VL及SEQ ID NO: 99之VH；或 SEQ ID NO: 101之VL及SEQ ID NO: 103之VH；或 SEQ ID NO: 105之VL及SEQ ID NO: 107之VH；或 SEQ ID NO: 109之VL及SEQ ID NO: 111之VH；或 SEQ ID NO: 113之VL及SEQ ID NO: 115之VH；或 SEQ ID NO: 117之VL及SEQ ID NO: 119之VH；或 SEQ ID NO: 121之VL及SEQ ID NO: 123之VH；或 SEQ ID NO: 125之VL及SEQ ID NO: 127之VH；或 SEQ ID NO: 129之VL及SEQ ID NO: 131之VH；或 SEQ ID NO: 133之VL及SEQ ID NO: 135之VH；或 SEQ ID NO: 137之VL及SEQ ID NO: 139之VH；或 SEQ ID NO: 141之VL及SEQ ID NO: 143之VH；或 SEQ ID NO: 145之VL及SEQ ID NO: 147之VH；或 SEQ ID NO: 149之VL及SEQ ID NO: 151之VH；或 SEQ ID NO: 153之VL及SEQ ID NO: 155之VH；或 SEQ ID NO: 157之VL及SEQ ID NO: 159之VH；或 SEQ ID NO: 161之VL及SEQ ID NO: 163之VH；或 SEQ ID NO: 165之VL及SEQ ID NO: 167之VH；或 SEQ ID NO: 169之VL及SEQ ID NO: 171之VH；或 SEQ ID NO: 173之VL及SEQ ID NO: 175之VH；或 SEQ ID NO: 177之VL及SEQ ID NO: 179之VH；或 SEQ ID NO: 181之VL及SEQ ID NO: 183之VH；或 SEQ ID NO: 185之VL及SEQ ID NO: 187之VH；或 SEQ ID NO: 189之VL及SEQ ID NO: 191之VH；或 SEQ ID NO: 193之VL及SEQ ID NO: 195之VH；或 SEQ ID NO: 197之VL及SEQ ID NO: 199之VH；或 SEQ ID NO: 201之VL及SEQ ID NO: 203之VH；或 SEQ ID NO: 205之VL及SEQ ID NO: 207之VH；或 SEQ ID NO: 209之VL及SEQ ID NO: 211之VH；或 SEQ ID NO: 213之VL及SEQ ID NO: 215之VH；或 SEQ ID NO: 217之VL及SEQ ID NO: 219之VH；或 SEQ ID NO: 221之VL及SEQ ID NO: 223之VH；或 SEQ ID NO: 225之VL及SEQ ID NO: 227之VH；或 SEQ ID NO: 229之VL及SEQ ID NO: 231之VH；或 SEQ ID NO: 233之VL及SEQ ID NO: 235之VH；或 SEQ ID NO: 237之VL及SEQ ID NO: 239之VH；或 SEQ ID NO: 241之VL及SEQ ID NO: 243之VH；或 SEQ ID NO: 245之VL及SEQ ID NO: 247之VH；或 SEQ ID NO: 249之VL及SEQ ID NO: 251之VH；或 SEQ ID NO: 253之VL及SEQ ID NO: 255之VH；或 SEQ ID NO: 257之VL及SEQ ID NO: 259之VH；或 SEQ ID NO: 261之VL及SEQ ID NO: 263之VH；或 SEQ ID NO: 33之VL及SEQ ID NO: 265之VH；或 SEQ ID NO: 65之VL及SEQ ID NO: 267之VH；或 SEQ ID NO: 269之VL及SEQ ID NO: 103之VH；或 SEQ ID NO: 271之VL及SEQ ID NO: 175之VH。
  4. 如請求項1至3中任一項之經分離之抗體，其係內化抗體。
  5. 如請求項1至4中任一項之經分離之抗體，其係嵌合、CDR移植、人類化或人類抗體或其免疫反應性片段。
  6. 如請求項1至5中任一項之經分離之抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO: 281之輕鏈可變區(VL)及SEQ ID NO: 283之重鏈可變區(VH)；或SEQ ID NO: 285之VL及SEQ ID NO: 287之VH；或SEQ ID NO: 289之VL及SEQ ID NO: 291之VH。
  7. 如請求項1至5中任一項之經分離之抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO: 300之輕鏈及SEQ ID NO: 301之重鏈；或SEQ ID NO: 302之輕鏈及SEQ ID NO: 303之重鏈；或SEQ ID NO: 302之輕鏈及SEQ ID NO: 311之重鏈；或SEQ ID NO: 304之輕鏈及SEQ ID NO: 305之重鏈；或SEQ ID NO: 306之輕鏈及SEQ ID NO: 307之重鏈；或SEQ ID NO: 306之輕鏈及SEQ ID NO: 309之重鏈。
  8. 如請求項1至7中任一項之經分離之抗體，其中該抗體包含位點特異性抗體。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗體，其中該抗體偶聯至酬載(payload)。
  10. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至8中任一項之抗體。
  11. 一種核酸，其編碼如請求項1至8中任一項之抗體之全部或部分。
  12. 一種載體，其包含如請求項11之核酸。
  13. 一種宿主細胞，其包含如請求項11之核酸或如請求項12之載體。
  14. 一種式Ab-[L-D]n之ADC或其醫藥上可接受之鹽，其中： a) Ab包含抗TNFRSF21抗體； b) L包含可選連接體； c) D包含藥物；且 d) n係約1至約20之整數。
  15. 如請求項14之ADC，其中該抗TNFRSF21抗體包含嵌合、CDR移植、人類化或人類抗體或其免疫反應性片段。
  16. 如請求項14之ADC，其中Ab係如請求項1至8中任一項之抗TNFRSF21抗體。
  17. 如請求項14之ADC，其中n包含約2至約8之整數。
  18. 如請求項14之ADC，其中D包含選自由以下組成之群之化合物：尾海兔素(dolastatins)、奧裡斯他汀(auristatins)、類美登素(maytansinoids)、吡咯并苯并二氮呯(PBDs)、苯并二氮呯衍生物、卡奇黴素(calicheamicin)及瓢菌素(amanitins)。
  19. 一種醫藥組合物，其包含如請求項14至18中任一項之ADC。
  20. 一種治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與如請求項10之醫藥組合物或如請求項19之醫藥組合物。
  21. 如請求項20之方法，其中該癌症包含血液惡性病。
  22. 如請求項21之方法，其中該血液惡性病包含白血病或淋巴瘤。
  23. 如請求項20之方法，其中該癌症包含實體腫瘤。
  24. 如請求項23之方法，其中該癌症選自由以下組成之群：腎上腺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、胰臟癌、肺癌(小細胞及非小細胞二種)、甲狀腺癌及神經膠母細胞瘤。
  25. 如請求項24之方法，其中該癌症包含膀胱癌。
  26. 如請求項24之方法，其中該癌症包含肺腺癌。
  27. 如請求項20之方法，其進一步包含向該個體投與至少一種另外治療部分。
  28. 一種減少腫瘤細胞群體中腫瘤起始細胞之方法，其中該方法包含使包含腫瘤起始細胞及除腫瘤起始細胞外之腫瘤細胞的腫瘤細胞群體與如請求項14至18中任一項之ADC接觸，藉此減小腫瘤起始細胞之頻率。
  29. 如請求項28之方法，其中該接觸係在活體內實施。
  30. 如請求項28之方法，其中該接觸係在活體外實施。
  31. 一種遞送細胞毒素至細胞之方法，其包含使該細胞與如請求項14至18中任一項之ADC接觸。
  32. 診斷或監測個體癌症之方法，該方法包含如下步驟：(a) 使腫瘤細胞與如請求項1至9中任一項之抗體接觸；及(b) 檢測腫瘤細胞上之該抗體。
  33. 如請求項32之方法，其中該接觸係在活體外實施。
  34. 如請求項32之方法，其中該接觸係在活體內實施。
  35. 一種產生如請求項14之ADC之方法，其包含使抗TNFRSF21抗體(Ab)與藥物(D)偶聯之步驟。
  36. 一種套組，其包含一或多個含有如請求項19之醫藥組合物之容器。
  37. 如請求項36之套組，其進一步包含與該一或多個容器相結合之標籤或包裝插頁，其指示該組合物用於治療患有癌症之個體。
  38. 如請求項36之套組，其進一步包含與該一或多個容器相結合之標籤或包裝插頁，其指示用於患有癌症之個體之劑量方案。
  39. 如請求項36至38之套組，其中該癌症係胰臟癌、膀胱癌或肺癌。
  40. 一種產生如請求項14之ADC之方法，其包含使抗TNFRSF21抗體(Ab)與藥物(D)偶聯之步驟。
  41. 如請求項40之方法，其中該抗體包含位點特異性抗體。
  42. 如請求項41之方法，其包含選擇性還原該位點特異性抗體之步驟。
  43. 如請求項40至42中任一項之方法，其中該藥物(D)包含卡奇黴素。
  44. 如請求項40至42中任一項之方法，其中該藥物(D)包含尾海兔素。
  45. 如請求項40至44中任一項之方法，其進一步包含凍乾該ADC之步驟。
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