JP2010514700A - Dr6アンタゴニスト及び神経障害の治療におけるその使用法 - Google Patents
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Abstract
アルツハイマー病を含む神経障害の治療に使用するための、DR6アンタゴニストを含む方法と組成物が提供される。DR6アンタゴニストには、哺乳動物の神経細胞又は神経組織の成長、再生又は生存を増強する抗APP抗体、抗DR6抗体、DR6イムノアドヘシン及びDR6変異体(及びその融合タンパク質)が含まれる。
Description
(関連出願の相互参照)
この出願は、米国特許法第119条(e)に基づき、2006年12月22日出願の米国特許仮出願番号第60/871528号及び、2007年2月12日出願の米国特許仮出願番号第60/900848号の優先権を主張し、37 CFR 1.53(b)(1)の下に出願される通常出願である。
この出願は、米国特許法第119条(e)に基づき、2006年12月22日出願の米国特許仮出願番号第60/871528号及び、2007年2月12日出願の米国特許仮出願番号第60/900848号の優先権を主張し、37 CFR 1.53(b)(1)の下に出願される通常出願である。
(発明の分野)
本発明は概して、例えばDR6とその同族リンガドであるAPPとの相互作用を阻害するDR6アンタゴニストを使用した神経障害の治療法と、そのような方法において有用なDR6アンタゴニスト組成物とに関する。任意の実施形態において、DR6レセプター抗体、DR6レセプター変異体、DR6レセプターイムノアドヘシン又はAPP抗体などのDR6アンタゴニストが、アルツハイマー病の治療を含む神経障害の治療に使用される。
本発明は概して、例えばDR6とその同族リンガドであるAPPとの相互作用を阻害するDR6アンタゴニストを使用した神経障害の治療法と、そのような方法において有用なDR6アンタゴニスト組成物とに関する。任意の実施形態において、DR6レセプター抗体、DR6レセプター変異体、DR6レセプターイムノアドヘシン又はAPP抗体などのDR6アンタゴニストが、アルツハイマー病の治療を含む神経障害の治療に使用される。
(発明の背景)
腫瘍壊死因子(TNF)スーパーファミリに属する様々なリガンドおよびレセプターが当分野で同定されている。そのようなリガンドの中には、腫瘍壊死因子-α(「TNF-α」)、腫瘍壊死因子-β(「TNF-β」又は「リンホトキシン-α」)、リンホトキシン-β(「LT-β」)、CD30リガンド、CD27リガンド、CD40リガンド、OX-40リガンド、4-1BBリガンド、LIGHT、Apo-1リガンド(Fasリガンド又はCD95リガンドとも称される)、Apo-2リガンド(Apo2L又はTRAILとも称される)、Apo-3リガンド(TWEAKとも称される)、APRIL、OPGリガンド(RANKリガンド、ODF又はTRANCEとも称される)、及びTALL-1(BlyS、BAFF又はTHANKとも称される)が含まれる。[例えば、Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002);AshkenaziおよびDixit, Science, 281:1305-1308 (1998);AshkenaziおよびDixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000);Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, pages 377-411;Locksley 等, Cell, 104:487-501 (2001);GrussおよびDower, Blood, 85:3378-3404 (1995);Schmid 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986);Dealtry 等, Eur. J. Immunol., 17:689 (1987);Pitti 等, J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996);Wiley 等, Immunity, 3:673-682 (1995);Browning 等, Cell, 72:847-856 (1993);Armitage 等 Nature, 357:80-82 (1992);1997年1月16日公開のWO97/01633;1997年7月17日公開のWO97/25428;Marstersら, Curr. Biol., 8:525-528(1998);Chicheporticheら, Biol. Chem., 272:32401-32410(1997);Hahneら, J. Exp. Med., 188:1185-1190(1998);1998年7月2日公開のWO98/28426;1998年10月22日公開のWO98/46751;1998年5月7日公開のWO/98/18921;Mooreら, Science, 285:260-263(1999);Shuら, J. Leukocyte Biol., 65:680(1999);Schneiderら, J. Exp. Med., 189:1747-1756(1999);Mukhopadhyayら, J. Biol. Chem., 274:15978-15981(1999)参照]。
腫瘍壊死因子(TNF)スーパーファミリに属する様々なリガンドおよびレセプターが当分野で同定されている。そのようなリガンドの中には、腫瘍壊死因子-α(「TNF-α」)、腫瘍壊死因子-β(「TNF-β」又は「リンホトキシン-α」)、リンホトキシン-β(「LT-β」)、CD30リガンド、CD27リガンド、CD40リガンド、OX-40リガンド、4-1BBリガンド、LIGHT、Apo-1リガンド(Fasリガンド又はCD95リガンドとも称される)、Apo-2リガンド(Apo2L又はTRAILとも称される)、Apo-3リガンド(TWEAKとも称される)、APRIL、OPGリガンド(RANKリガンド、ODF又はTRANCEとも称される)、及びTALL-1(BlyS、BAFF又はTHANKとも称される)が含まれる。[例えば、Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002);AshkenaziおよびDixit, Science, 281:1305-1308 (1998);AshkenaziおよびDixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000);Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, pages 377-411;Locksley 等, Cell, 104:487-501 (2001);GrussおよびDower, Blood, 85:3378-3404 (1995);Schmid 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986);Dealtry 等, Eur. J. Immunol., 17:689 (1987);Pitti 等, J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996);Wiley 等, Immunity, 3:673-682 (1995);Browning 等, Cell, 72:847-856 (1993);Armitage 等 Nature, 357:80-82 (1992);1997年1月16日公開のWO97/01633;1997年7月17日公開のWO97/25428;Marstersら, Curr. Biol., 8:525-528(1998);Chicheporticheら, Biol. Chem., 272:32401-32410(1997);Hahneら, J. Exp. Med., 188:1185-1190(1998);1998年7月2日公開のWO98/28426;1998年10月22日公開のWO98/46751;1998年5月7日公開のWO/98/18921;Mooreら, Science, 285:260-263(1999);Shuら, J. Leukocyte Biol., 65:680(1999);Schneiderら, J. Exp. Med., 189:1747-1756(1999);Mukhopadhyayら, J. Biol. Chem., 274:15978-15981(1999)参照]。
このようなTNFファミリリガンドによって媒介される様々な細胞性応答の誘導は、一般的に特定の細胞レセプターへの結合によって開始される。今日までに同定されたTNFレセプタースーパーファミリのメンバーには、TNFR1、TNFR2、p75−NGFR、TACI、GITR、CD27、OX−40、CD30、CD40、HVEM、Fas (Apo−1またはCD95とも称される)、DR4 (TRAIL−R1とも称される)、DR5 (Apo−2またはTRAIL−R2とも称される)、DR6 (TR9とも称され、文献においてTNFレセプタースーパーファミリーメンバー21又はTNFRSF21としても知られる)、DcR1、DcR2、破骨細胞分化抑制因子(OPG)、RANKおよびApo−3 (DR3またはTRAMPとも称される)が含まれる。(例えば、Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002);AshkenaziおよびDixit, Science, 281:1305-1308 (1998);AshkenaziおよびDixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000);Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, 377-411頁;Locksley 等., Cell, 104:487-501 (2001);Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995);Hohman 等, J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989);Brockhaus 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990);1991年3月20日出願の欧州特許第417563;Loetscher 等, Cell, 61:351 (1990);Schall 等, Cell, 61:361 (1990);Smith 等, Science, 248:1019-1023 (1990);Lewis 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991);Goodwin 等, Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991);Stamenkovic 等, EMBO J., 8:1403-1410 (1989);Mallett 等, EMBO J., 9:1063-1068 (1990);Anderson 等, Nature, 390:175-179 (1997);Chicheportiche 等, J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997);Pan 等, Science, 276:111-113 (1997);Pan 等, Science, 277:815-818 (1997);Sheridan 等, Science, 277:818-821 (1997);Degli-Esposti 等, J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997);Marsters 等, Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997);Tsuda 等, BBRC, 234:137-142 (1997);Nocentini 等, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997);vonBulow 等, Science, 278:138-141 (1997);Johnson等, Cell, 47:545-554 (1986);Radeke等, Nature, 325:593-597 (1987);Pan等, FEBS Lett., 431:351-356 (1998))。
これらTNFレセプターファミリーメンバーの多くは、細胞外領域、膜貫通領域および細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有しており、一方、他のメンバーは膜貫通領域と細胞内ドメインを欠いた可溶性タンパク質として天然にみられる。典型的なTNFRの細胞外部位には、NH2-末端から始まる複数のシステインリッチドメイン(CRD)の反復性のアミノ酸配列パターンを含有する。
リガンド及びレセプターのTNFファミリーの一般的な参考文献としては、例えば、Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, 377-411頁;Locksley等, Cell, 104:487-501 (2001);Ware, Cytokine & Growth Factor Reviews, 14:181-184 (2003);Liu等, Immunity, 15(1):23-34 (2001)及びBossen等, J Biol Chem. 281(20):13964-71 (2006)を参照されたい。
DR6レセプターと呼ばれるTNFRファミリーメンバー(文献において、「TR9」とも呼ばれ、またTNFレセプタースーパーファミリーメンバー21又はTNFRSF21として知られる)は、4つの細胞外システインリッチモチーフ及び1つの細胞質デスドメイン構造を有するI型膜貫通レセプターとして紹介されている(Pan等, FEBS Lett., 431:351-356 (1998);更には米国特許第6358508号、同第6667390号、同第6919078号、同第6949358号参照のこと)。形質移入された特定の細胞株におけるDR6の過剰発現により、NF−kB及びJNK両方のアポトーシス及び活性化が引き起こされることが報告されている(Pan等, FEBS Letters, 431:351-356 (1998))。DR6を欠損するマウスモデルでは、T細胞はJNK活性化において実質的に正常に機能せず、DR6(−/−)マウスにタンパク質抗原を投与すると、それらのT細胞は過剰増殖し、Th2応答への強い偏向を示すことが分かった(一方で、Th1分化には同等の影響は無かった)(Zhao等, J. Exp. Med., 194:1441-1448 (2001)。更に、DR6の標的とされた破壊により、インビトロでのTヘルパー2(Th2)の分化が強まった(Zhao等、上掲)。B細胞によって媒介される状態の調節におけるDRYアゴニスト又はアンタゴニストの様々な使用法は、2005年3月1日公開の米国特許出願公開第2005/0069540号に記載されている。
DR6レセプターは、OVAによって誘発された喘息のマウスモデルにおける気道炎症の制御に関与していると思われる(Venkataraman等, Immunol. Lett., 106:42-47 (2006))。
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG(35−55))によって誘発された実験的自己免疫性脳脊髄炎のモデルを使用したところ、DR6−/−マウスは、野生型(WT)の同腹仔と比較して、CNS疾患の発症及び進行の両方に高い耐性を示した。つまり、DR6は、白血球の浸潤に関与し、実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発と進行に機能している可能性がある(Schmidt等, J. Immunol., 175:2286-2292 (2005))。
様々なTNFリガンド及びレセプターファミリーメンバーが逆の生物学的活性及び特性を持つものとして同定されている一方で、神経学に関連する機能に関与するこのようなリガンド及びレセプターはこれまで殆ど報告されていない。例えば、2004年8月26日公開の国際公開第2004/071528号には、脊髄の傷害を治療するための、マウスモデルにおけるCD95(Fas)リガンド/レセプター複合体の阻害が開示されている。
本発明の実施態様では、単離されたデスレセプター6(「DR6」)アンタゴニストが提供される。ここに開示されるアンタゴニストの特定の実施態様は、DR6及びその同族リガンドの一又は複数を阻害又は遮断する。好ましい実施態様では、ここに開示されるDR6アンタゴニストは、DR6とその同族リガンドであるアミロイド前駆体タンパク質(「APP」)との相互作用を阻害又は遮断する。DR6アンタゴニストの実施態様は、DR6又はAPP抗体のような抗体を含みうる。このようなDR6拮抗性抗体は、例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体でよい。本発明の特定の実施態様では、DR6アンタゴニストは、DR6細胞外ドメインポリペプチド又はその断片に結合する抗DR6抗体を含むことができ、随意で図1Aのアミノ酸1−349又は42−349を含むDR6ポリペプチドに結合することができる。或いは、DR6アンタゴニストは、APPポリペプチドに結合する抗APP抗体を含むことができ、随意で図1Bのアミノ酸66−81(配列番号6)を含むAPPポリペプチドに結合することができる。
考慮されるDR6アンタゴニストはまた、DR6イムノアドヘシン、DR6変異体、DR6断片、その共有結合性に変更された形態、又はその融合タンパク質、並びに小分子アンタゴニストを含む。例を挙げると、DR6アンタゴニストは、エピトープタブ、ヒトFc等の抗体断片、又はロイシンジッパーといった異種配列に融合したDR6の可溶性細胞外ドメイン形態又はペグ化されたDR6を含む。
本発明の例示的な実施態様はまた、APPに対するDR6の結合を阻害又は遮断する方法を含み、本方法は、APPに対するDR6の結合が阻害される条件下で、DR6ポリペプチド及び/又はAPPポリペプチドを一又は複数のDR6アンタゴニストに曝すことを含む。このような方法において使用される典型的なDR6アンタゴニストには、DR6又はAPP、並びに可溶性のDR6ポリペプチドに結合する抗体が含まれる。場合によっては、これらの方法に使用するDR6アンタゴニストは、DR6とAPPとの結合を阻害するそれらの能力を観察することにより選択される。本発明の特定の実施態様では、このような方法は、例えば、インビトロでの組織培養におけるアポトーシスの抑制及び/又は神経細胞の増殖及び/又は生存の強化に使用される。本方法では、一種類のDR6アンタゴニスト分子又は二種類以上のDR6アンタゴニストの組み合わせの使用を考慮する。
本発明の実施態様はまた、哺乳動物における神経細胞又は組織の増殖、再生又は生存を強化する方法を提供し、本方法は、哺乳動物に有効量のDR6アンタゴニストを投与することを含む。任意選択的な実施形態では、DR6アンタゴニストの投与により、哺乳動物の神経細胞又は組織の増殖が強化され、同細胞又は組織の細胞死及び変性が遮断される。神経細胞又は組織は、例えば、運動神経、感覚神経、交連神経、軸策、ミクログリア、及び/又はオリゴデンドロサイトを含みうる。本発明の一部の実施態様では、このような方法において使用されるDR6アンタゴニストはAPPに結合してDR6に対するその結合能を阻害する抗体を含みうる。本発明の他の実施態様では、このような方法に使用されるDR6アンタゴニストは、DR6に結合してAPPに対するその結合能を阻害する抗体を含みうる。或いは、DR6アンタゴニストは、DR6イムノアドヘシン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレンからなる群より選択される非タンパク質性ポリマーに連結するDR6ポリペプチド、又はDR6ポリペプチド変異体を含みうる。本方法において利用されるDR6イムノアドヘシンは、免疫グロブリンのFc領域に融合した可溶性のDR6レセプターを含みうる。また更に、本発明のDR6アンタゴニストは小分子を含むことができる。
本発明の実施態様はまた、神経障害の治療法を提供し、本方法は、哺乳動物に対し、有効量のDR6アンタゴニストを投与することを含む。任意選択的な実施態様では、本方法は、哺乳動物のアルツハイマー病を治療することを含む。このような方法に使用されるDR6アンタゴニストは、APPに結合してDR6に対するその結合能を阻害する抗体を含みうる。DR6アンタゴニストはDR6抗体も含むことができる。或いは、DR6アンタゴニストは、DR6イムノアドヘシン、DR6ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレンからなる群より選択される非タンパク質性ポリマーに連結するDR6ポリペプチド、DR6抗体又はDR6変異体を含みうる。本方法に利用されるDR6イムノアドヘシンは、免疫グロブリンのFc領域に融合した可溶性のDR6レセプターを含みうる。本方法に利用される抗DR6抗体は、図1Aのアミノ酸1−349又は42−349を含むDR6レセプターに結合しうる。
本発明の実施態様はまた、神経障害を有する患者又は神経障害を発症しそうな患者の診断方法を提供し、本方法は、患者から試料を採取し、配列番号1のDR6ポリペプチド配列とは異なるポリペプチド配列を有するDR6ポリペプチド変異体の存在について当該試料を試験することを含む。このような方法では、典型的には、ポリペプチド変異体が、配列番号1のDR6ポリペプチド配列に観察される親和性とは異なる親和性をAPPポリペプチドに対して持つことが同定される。
本発明の実施態様はまた、APPに対するDR6の結合を阻害する対象分子を同定する方法を提供する。このような方法は、対象分子の存在下又は不在下においてDR6とAPPとを組み合わせた後、前記対象分子の存在下におけるAPPに対するDR6の結合の阻害を検出することを含むことができる。随意で、このような方法は、細胞表面にDR6を発現する哺乳動物細胞を使用して実行され、更に、DR6活性又はシグナル伝達の阻害を検出することを含む。本発明の実施態様は更に、このような方法によって同定された分子を含む。随意で、対象分子はAPPに結合する抗体、DR6に結合する抗体又はDR6ポリペプチドである。
本発明の実施態様はまた、APPリガンド、DR6レセプターに特異的に結合することができる及び/又はDR6及び/又はそのリガンド及び/又は共受容体に関連する生物学的活性を調節することができる、様々な神経障害の治療に有用である抗体を提供する。特定の実施態様では、DR6ポリペプチドの細胞外ドメイン配列に特異的に結合する抗体が提供される(後述の実施例において更に説明する)。典型的な抗体は、APP又はDR6に結合するものであって、更にはDR6とAPPとの結合を阻害する能力があるとして選択されたものである。随意で、抗体はモノクローナル抗体である。随意で、モノクローナル抗体は、ATCCに受託番号PTA−8095、PTA−8094、又はPTA−8096としてそれぞれ寄託されているハイブリドーマによって分泌される3F4.4.8、4B6.9.7、又は1E5.5.7抗体を含む。
更には、それぞれATCC受託番号PTA−8095、PTA−8094、又はPTA−8096として寄託されているハイブリドーマ細胞株によって生成される3F4.4.8、4B6.9.7、又は1E5.5.7モノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体が提供される。一態様において、本発明は、3F4.4.8、4B6.9.7、又は1E5.5.7抗体を含む抗DR6抗体に関し、本抗体は、抗体3F4.4.8、4B6.9.7、又は1E5.5.7と同じ生物学的活性及び/又は作用強度を示し、及び/又はDR6に対して同じ親和性を示す。
また別の特定の実施態様では、モノクローナル抗体3F4.4.8、4B6.9.7、又は1E5.5.7を生成するハイブリドーマ細胞株であって、ATCCにそれぞれ受託番号PTA−8095、PTA−8094、又はPTA−8096として寄託されているハイブリドーマ細胞株と、ATCCにそれぞれ受託番号PTA−8095、PTA−8094、又はPTA−8096として寄託されているハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体3F4.4.8、4B6.9.7、又は1E5.5.7とが提供される。
更には、単離された抗DR6モノクローナル抗体が提供され、本抗体は、DR6ポリペプチドに結合し、ATCCにそれぞれ受託番号PTA−8095、PTA−8094、又はPTA−8096で寄託されているハイブリドーマにより生成されるモノクローナル抗体の、DR6ポリペプチドに対する結合を競合的に阻害する抗体を含む。また、キメラ又はヒト化抗DR6抗体が提供され、本抗体は、DR6ポリペプチドに特異的に結合し、(a)ATCCにそれぞれ受託番号PTA−8095、PTA−8094、又はPTA−8096で寄託されているハイブリドーマにより分泌される3F4.4.8、4B6.9.7、又は1E5.5.7抗体由来の配列を含む。
また別の態様では、本発明は、本明細書の抗DR6抗体又は抗体断片をコードする単離された核酸分子、そのような核酸分子を含むベクター、そのような核酸分子を含む宿主細胞、及び本明細書の抗DR6抗体又は抗体断片を生成する方法に関する。
本発明は更に、ここに定義するDR6アンタゴニストと担体とを含む組成物に関する。担体は、製薬的に許容可能な担体であり、組成物は更に一又は複数の薬剤を追加で含むことができる。
更なる態様では、本発明は、容器と、前記容器内に収容される組成物を含む製造品に関し、この組成物が本発明のDR6アンタゴニストを含む。製造品は更に、インビトロ又はインビボでDR6アンタゴニストを使用するための指示を含むことができる。好ましい実施態様では、この指示は、神経障害の治療に関するものである。
関連する態様では、本発明の実施態様は、第1の容器、前記容器に貼付されるラベル、及び前記容器内に収容される組成物を含むキットを含む。このようなキットにおいて、組成物は、少なくとも一種類の哺乳動物の神経細胞におけるアポトーシスを阻害するに有効なDR6アンタゴニストを含んでおり、前記容器に貼付されるラベル、又は前記容器内に収容されるパッケージ挿入物は、組成物を使用して、少なくとも一種類の哺乳動物の神経細胞におけるアポトーシスを阻害することができることが示される。
本発明は、更に、アルツハイマー病を含む哺乳動物の神経障害の治療に使用される薬物の調製又は製造に関して本明細書に開示されるDR6アンタゴニスト及び組成物の使用法を提供する。
(発明の詳細な説明)
本明細書中に記載又は参照の技術及び手順は一般的に十分理解されるものであり、例えばSambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載の広く利用される分子クローニング方法論などの、当分野の技術者による従来の方法論を用いて通常行われるものである。好ましくは、市販のキットや試薬の使用を伴う手順は、特に明記しない限り、プロトコル及び/又はパラメータを定義する製造者に従って一般的に行われる。
本方法やアッセイを開示する前に、本発明は、ここに記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種や属、コンストラクト及び試薬に限定されるものではなく、変更されてもよいことを理解されたい。また、本明細書中で用いる用語は特定の実施態様のみを開示するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の権利範囲を限定するものでないことを理解されたい。
本明細書中に記載又は参照の技術及び手順は一般的に十分理解されるものであり、例えばSambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載の広く利用される分子クローニング方法論などの、当分野の技術者による従来の方法論を用いて通常行われるものである。好ましくは、市販のキットや試薬の使用を伴う手順は、特に明記しない限り、プロトコル及び/又はパラメータを定義する製造者に従って一般的に行われる。
本方法やアッセイを開示する前に、本発明は、ここに記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種や属、コンストラクト及び試薬に限定されるものではなく、変更されてもよいことを理解されたい。また、本明細書中で用いる用語は特定の実施態様のみを開示するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の権利範囲を限定するものでないことを理解されたい。
本明細書で用いられる及び添付の特許請求の範囲中の単数形「a」、「and」及び「the」には、明らかな記載がない限り複数形も含まれる。ゆえに、例えば「一般的な変更」なる用語には複数の変更が含まれ、「プローブ」なる用語は一ないし複数のプローブ及び当分野の技術者に公知のその等価物などを含む。本明細書及び請求の範囲において引用される数字(例えば、アミノ酸22−81、1−354等)は全て、語頭に「約」という語が付くものとする。
本明細書中で引用するすべての出版物は、該出版物が引用される方法及び/又は材料を開示及び記載するために、出典明記によって本明細書中に組み込まれる。本明細書中で引用する出版物は、本出願の提出日前の開示について言及するものである。発明者等は、早い優先日又はより前の発明日のために先行する出版物に権利が与えられないことが認められると解釈されるものではない。さらに、実際の出版日は明記されているものと異なり、個々に検証が必要であろう。
本明細書中で引用するすべての出版物は、該出版物が引用される方法及び/又は材料を開示及び記載するために、出典明記によって本明細書中に組み込まれる。本明細書中で引用する出版物は、本出願の提出日前の開示について言及するものである。発明者等は、早い優先日又はより前の発明日のために先行する出版物に権利が与えられないことが認められると解釈されるものではない。さらに、実際の出版日は明記されているものと異なり、個々に検証が必要であろう。
I.定義
「アミロイド前駆体タンパク質」又は「APP」なる用語は、APP mRNA前駆体によりコードされているさまざまなポリペプチドイソフォーム、例えばそれぞれ図1B−1Dに記載されているAPP695、APP751及びAPP770イソフォーム(APP mRNA前駆体の選択的にスプライスされた転写産物から翻訳されたものであるイソフォーム)、及びAPPイソフォームの翻訳後にプロセスされた部分を含む。周知のように、APP遺伝子から転写されたAPP mRNA前駆体は、選択的エキソン・スプライシングを受けて、たくさんのイソフォームを産生する(例えば、Sandbrink等, Ann NY Acad. Sci. 777: 281-287 (1996); PubMed NCBI protein locus accession P05067に関連する情報を参照) 。この選択的エキソン・スプライシングは、695、751、及び770アミノ酸長の3つの主要なイソフォームを産生する(Kang等, Nature 325: 733-736 (1987); Kitaguchi等, Nature 331: 530-532 (1988); Ponte等, Nature 331: 525-527 (1988);及びTanzi 等, Nature 331: 528-532 (1988))。これらのイソフォームの2つ(APP751及びAPP770)は、セリンプロテアーゼインヒビター(KPI)のクーニッツ(Kunitz)ファミリーと高度に相同的である56残基の挿入を含み、偏在的に発現する。対照的に、KPIモチーフを欠いている短いイソフォームAPP695は神経系において、例えばニューロン及びグリア細胞において主に発現し、この理由により「ニューロンのAPP」と呼ばれる場合が多い(例えば、Tanzi等, Science 235: 880-884 (1988); Neve等, Neuron 1: 669-677 (1988); and Haas等, J. Neurosci 11: 3783-3793 (1991)を参照)。695、751及び770を含むAPPイソフォームは、著しい翻訳後のプロセッシングイベントを受ける(例えば、Esch等、1990 Science 248:1122-1124; Sisodia等、1990 Science 248:492-495)。例えば、これらのイソフォームの各々は、さまざまな分泌酵素及び/又は分泌酵素複合体により切断され、イベントはAPP外部ドメインを含むN末端分泌ポリペプチドを含むAPP断片を生じる(sAPPα及びsAPPβ)。α分泌酵素による、あるいはβ分泌酵素による切断は可溶性N末端APPポリペプチド、sAPPα及びsAPPβ、をそれぞれ生成して細胞外放出し、対応する膜アンカーC末端断片C83及びC99の保持を導く。γ分泌酵素によるC83の次のプロセッシングは、P3ポリペプチドを産出する。これは、主要な分泌経路であり、非アミロイド形成的である。あるいは、C99のプレセニリン/ニカストリン介在性γ分泌酵素プロセッシングは、アミロイドベータポリペプチドであるアミロイドベータ40(Aβ40)及びアミロイドベータ42(Aβ42)、アミロイドプラークの主要成分、及び細胞毒性C末端断片であるγCTF(50)、γCTF(57)及びγCTF(59)を放出する。エビデンスは、各切断イベントの相対的重要性が細胞型に依存することを示唆する。例えば、非神経細胞は、優先して、α分泌酵素経路によりAPPを処理してAβ配列内でAPPを切断し、それによりAβの形成を排除する(例えば、Esch等. 1990 Science 248:1122-1124; Sisodia等. 1990 Science 248:492- 495)。これに対して、神経細胞は、β分泌酵素経路によりAPP695の非常に大きな部分を処理し、少なくとも2つの酵素クラスの混合性活性により完全なAβを生成する。神経細胞では、β分泌酵素は、Aβドメインのアミノ末端でAPP695を切断し、独特なN末端断片(sAPPβ)を放出する。加えて、γ分泌酵素は、カルボキシ末端の選択的部位でAPPを切断し、40(Aβ40)又は42アミノ酸長(Aβ42)のAβの種を生成する(例えばSeubert等. 1993 Nature 361:260-263; Suzuki 等. 1994 Science 264:1336-1340; 及びTurner等. 1996 J. Biol. Chem. 271:8966-8970を参照)。
「アミロイド前駆体タンパク質」又は「APP」なる用語は、APP mRNA前駆体によりコードされているさまざまなポリペプチドイソフォーム、例えばそれぞれ図1B−1Dに記載されているAPP695、APP751及びAPP770イソフォーム(APP mRNA前駆体の選択的にスプライスされた転写産物から翻訳されたものであるイソフォーム)、及びAPPイソフォームの翻訳後にプロセスされた部分を含む。周知のように、APP遺伝子から転写されたAPP mRNA前駆体は、選択的エキソン・スプライシングを受けて、たくさんのイソフォームを産生する(例えば、Sandbrink等, Ann NY Acad. Sci. 777: 281-287 (1996); PubMed NCBI protein locus accession P05067に関連する情報を参照) 。この選択的エキソン・スプライシングは、695、751、及び770アミノ酸長の3つの主要なイソフォームを産生する(Kang等, Nature 325: 733-736 (1987); Kitaguchi等, Nature 331: 530-532 (1988); Ponte等, Nature 331: 525-527 (1988);及びTanzi 等, Nature 331: 528-532 (1988))。これらのイソフォームの2つ(APP751及びAPP770)は、セリンプロテアーゼインヒビター(KPI)のクーニッツ(Kunitz)ファミリーと高度に相同的である56残基の挿入を含み、偏在的に発現する。対照的に、KPIモチーフを欠いている短いイソフォームAPP695は神経系において、例えばニューロン及びグリア細胞において主に発現し、この理由により「ニューロンのAPP」と呼ばれる場合が多い(例えば、Tanzi等, Science 235: 880-884 (1988); Neve等, Neuron 1: 669-677 (1988); and Haas等, J. Neurosci 11: 3783-3793 (1991)を参照)。695、751及び770を含むAPPイソフォームは、著しい翻訳後のプロセッシングイベントを受ける(例えば、Esch等、1990 Science 248:1122-1124; Sisodia等、1990 Science 248:492-495)。例えば、これらのイソフォームの各々は、さまざまな分泌酵素及び/又は分泌酵素複合体により切断され、イベントはAPP外部ドメインを含むN末端分泌ポリペプチドを含むAPP断片を生じる(sAPPα及びsAPPβ)。α分泌酵素による、あるいはβ分泌酵素による切断は可溶性N末端APPポリペプチド、sAPPα及びsAPPβ、をそれぞれ生成して細胞外放出し、対応する膜アンカーC末端断片C83及びC99の保持を導く。γ分泌酵素によるC83の次のプロセッシングは、P3ポリペプチドを産出する。これは、主要な分泌経路であり、非アミロイド形成的である。あるいは、C99のプレセニリン/ニカストリン介在性γ分泌酵素プロセッシングは、アミロイドベータポリペプチドであるアミロイドベータ40(Aβ40)及びアミロイドベータ42(Aβ42)、アミロイドプラークの主要成分、及び細胞毒性C末端断片であるγCTF(50)、γCTF(57)及びγCTF(59)を放出する。エビデンスは、各切断イベントの相対的重要性が細胞型に依存することを示唆する。例えば、非神経細胞は、優先して、α分泌酵素経路によりAPPを処理してAβ配列内でAPPを切断し、それによりAβの形成を排除する(例えば、Esch等. 1990 Science 248:1122-1124; Sisodia等. 1990 Science 248:492- 495)。これに対して、神経細胞は、β分泌酵素経路によりAPP695の非常に大きな部分を処理し、少なくとも2つの酵素クラスの混合性活性により完全なAβを生成する。神経細胞では、β分泌酵素は、Aβドメインのアミノ末端でAPP695を切断し、独特なN末端断片(sAPPβ)を放出する。加えて、γ分泌酵素は、カルボキシ末端の選択的部位でAPPを切断し、40(Aβ40)又は42アミノ酸長(Aβ42)のAβの種を生成する(例えばSeubert等. 1993 Nature 361:260-263; Suzuki 等. 1994 Science 264:1336-1340; 及びTurner等. 1996 J. Biol. Chem. 271:8966-8970を参照)。
「APP」、「APPタンパク質」及び「APPポリペプチド」なる用語は、本明細書で使用される場合、天然APP配列及びAPP変異体及び処理されたその断片を含む。これらの用語は、ヒトを含めたさまざまな哺乳動物で発現するAPPを含む。APPは、さまざまなヒト組織系統で天然に存在する場合は内生的に発現されてもよく、又は組換え体又は合成方法によって発現されてもよい。「天然配列APP」は、天然由来のAPPと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む(例えば、695、751及び770イソフォーム又はその処理された部分)。従って、天然配列APPは、ヒトを含む任意の哺乳動物で天然に存在するAPPのアミノ酸配列を有することができる。当該天然配列APPは自然から単離されうるか、又は組換え体又は合成手段により製造されうる。「天然配列APP」なる用語は、特に、天然に存在する処理された及び/又は分泌された形態(例えば、細胞外ドメイン配列を含む可溶型)、天然に存在する変異体型(例えば、選択的にスプラスされた形態及び/又はタンパク質分解で処理された形態)及び天然に存在する対立遺伝子変異体を含む。APP変異体は、天然配列APPの断片又は欠失突然変異体を含んでもよい。
本発明の実施形態で有用なAPPポリペプチドは、上記のもの及び以下の非限定的な例を含む。これらの説明された形態は本発明のさまざまな実施形態に使用されるために選択されうる。本発明のいくつかの実施形態では、APPポリペプチドは、図1B−1Dに示すAPP695及び/又はAPP751及び/又はAPP770イソフォーム等の全長APPイソフォームを含む。本発明の他の実施形態では、APPポリペプチドは、APPの翻訳後に処理されたイソフォーム、例えばα分泌酵素、β分泌酵素又はγ分泌酵素のような分泌酵素により切断を受けたAPPポリペプチドを含む(例えば、sAPPα又はsAPPβのような可溶性N末端断片)。本発明の関係する実施形態において、APPポリペプチドは、N末端外部ドメイン(例えば、Quast等, FASEB J. 2003; 17(12):1739-41を参照)、ヘパリン結合ドメイン(例えば、Rossjohn等, Nat Struct Biol. 1999 Apr;6(4):327-31を参照)、銅タイプII(例えば、Hesse等, FEBS Letters 349(1): 109-116 (1994)を参照)又はクーニッツ(Kunitz)プロテアーゼ・インヒビター・ドメイン(例えば、Ponte等, Nature; 331(6156):525-7 (1988)を参照)のような1又は複数の特異的なドメインを含むように選択することができる。本発明のいくつかの実施形態において、APPポリペプチドは、抗体又はDR6イムノアドヘシンのような本明細書で開示されたDR6アンタゴニストによって認識されるエピトープ、例えばAPP695のアミノ酸22−81、を含むことが認められた配列、モノクローナル抗体22C11により結合されるエピトープを含む配列(例えば、Hilbich等, Journal of Biological Chemistry, 268(35): 26571-26577 (1993)を参照)を含む。
本発明のいくつかの実施形態において、例えば特定のN末端又はC末端アミノ酸を含まないAPPポリペプチド(例えば、実施例12で開示するヒト組換えN-APPポリペプチド)、クーニッツプロテアーゼ・インヒビター・ドメインを含まないAPPポリペプチド(例えば、APP695)、又はアルツハイマーのβアミロイドタンパク質(Aβ)配列を含まないAPPポリペプチド(例えば、sAPPβ、Aβ40及び/又はAβ42配列を含まないポリペプチド) (例えば、Bond等, J. Struct Biol. 2003 Feb;141(2):156-70を参照)のように、APPポリペプチドは1又は複数の特定のドメイン又は配列を含まない。本発明の他の実施形態において、本発明の実施形態で使用されるAPPポリペプチドは、1又は複数のドメイン又は配列を含むが、他のドメイン又は配列は含まず、例えば、βアミロイド(Aβ)配列のような1又は複数の分泌酵素切断部位について、APPポリペプチドはN末端外部ドメイン(又は、少なくとも、モノクローナル抗体22C11のようなDR6アンタゴニストにより結合されることが認められるその部分)を含むが、C末端であるドメイン又は配列を含まない(例えば、sAPPα又はsAPPβ)。
「細胞外ドメイン」「外部ドメイン」又は「ECD」なる用語は、APPの形態を指し、膜貫通又は細胞質ドメインを基本的に含まない。通常、可溶性ECDは、1%未満の当該膜貫通又は細胞質ドメインを有し、好ましくは0.5%未満の当該ドメインを有する。本発明のポリペプチドで確認されたあらゆる膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのタイプを同定するために当分野で通常使用されている判定基準に準じて同定されることが理解される。膜貫通ドメインの正確な境界は、最初に同定されたドメインのどちらの端でも、変化してもよいが、多くの場合、約5アミノ酸程度であるようだ。好ましい実施形態において、ECDは、ポリペプチドの可溶性細胞外ドメイン配列からなり、膜貫通及び細胞質又は細胞内ドメインを含まない(そして、膜結合型でない)。
「APP変異体」なる用語は、下に定義するように、図1B−1Dに示すアミノ酸配列を有するヒトAPPと、少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、より好ましくは約90%、91%、92%、93%、94%、もっとも好ましくは約95%、96%、97%、98%、又は99%のアミノ酸配列同一性を有するAPPポリペプチド、又はその可溶性断片、又はその可溶性細胞外ドメインを意味する。当該変異体は、例えば図1B−1Dの完全長又は成熟配列のN末端又はC末端に1又は複数のアミノ酸残基を付加した又は欠失させたAPPポリペプチド、又はポリペプチドの内部配列又はドメインに1又は複数のアミノ酸残基が挿入又は欠失させられたAPPポリペプチドを含み、他種由来の変異体を含んでいるが天然配列APPポリペプチドは除外される。
「DR6」又は「DR6レセプター」は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列が図1A-1−図1A-2に示される当分野で引用されるレセプターを含む。Pan等は、「DR6」又は「TR9」と称されるTNFレセプターファミリーの一員のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を記載した(Pan等, FEBS Lett., 431:351-356 (1998); 又、米国特許第6358508号; 6667390号; 6919078号; 6949358号)。ヒトDR6レセプターは、推定シグナル配列(アミノ酸1−41)、細胞外ドメイン(アミノ酸42―349)、膜貫通ドメイン(アミノ酸350−369)、続いて細胞質ドメイン(アミノ酸370−655)を有する655アミノ酸タンパク質(図1A-2)である。「DR6レセプター」なる用語は、本明細書で使用される場合、天然配列レセプター及びレセプター変異体を含む。これらの用語は、ヒトを含む、さまざまな哺乳動物において発現するDR6レセプターを含む。DR6レセプターは、さまざまなヒト組織系統において天然に存在するとき内生的に発現されてもよく、又は組換え体又は合成方法によって発現されてもよい。「天然配列DR6レセプター」は、天然由来のDR6レセプターと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。従って、天然配列DR6レセプターは、ヒトを含む任意の哺乳動物由来の天然に存在するDR6レセプターのアミノ酸配列を有しうる。当該天然配列DR6レセプターは、自然から単離されうるか、又は組換え体又は合成手段によって製造されうる。「天然配列DR6レセプター」なる用語は、特に、レセプターの天然に存在する切断型又は分泌型(例えば、細胞外ドメイン配列を含む可溶型)、天然に存在する変異体型(例えば、選択的にスプラスされた形態)及び天然に存在する対立遺伝子変異体を含む。レセプター変異体は、天然配列DR6レセプターの断片又は欠失突然変異体を含んでもよい。
「細胞外ドメイン」又は「ECD」なる用語は、DR6レセプターの形態を指し、膜貫通又は細胞質ドメインを基本的に含まない。通常、可溶性ECDは、1%未満の当該膜貫通又は細胞質ドメインを有し、好ましくは0.5%未満の当該ドメインを有する。本発明のポリペプチドで確認されたあらゆる膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのタイプを同定するために当分野で通常使用されている判定基準に準じて同定されることが理解される。膜貫通ドメインの正確な境界は、最初に同定されたドメインのどちらの端でも、変化してもよいが、多くの場合、約5アミノ酸程度であるようだ。好ましい実施形態において、ECDは、ポリペプチドの可溶性細胞外ドメイン配列からなり、膜貫通及び細胞質又は細胞内ドメインを含まない(そして、膜結合型でない)。
「DR6変異体」なる用語は、下に定義するように、図1Aに示すアミノ酸配列を有するヒトDR6と、少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、より好ましくは約90%、91%、92%、93%、94%、もっとも好ましくは約95%、96%、97%、98%、又は99%のアミノ酸配列同一性を有するAPPポリペプチド、又はその可溶性断片、又はその可溶性細胞外ドメインを意味する。当該変異体は、例えば図1Aの完全長又は成熟配列のN末端又はC末端に1又は複数のアミノ酸残基を付加した又は欠失させたDR6ポリペプチド、又はポリペプチドの内部配列又はドメインに1又は複数のアミノ酸残基が挿入又は欠失させられたDR6ポリペプチドを含み、他種由来の変異体を含むが、天然配列DR6ポリペプチドは除外される。場合によっては、DR6変異体は、最高10までの保存的なアミノ酸置換を有する図1Aのアミノ酸1−349又は42−349を含むDR6レセプターの可溶型を含む。好ましくは、下に定義するように、当該変異体はDR6アンタゴニストとして作動する。
「DR6アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味に使用され、インビトロ、インサイツ、インビボ又はエクスビボの何れかで、神経細胞又は組織において、1又は複数の細胞内シグナル又は細胞内シグナル伝達経路を活性化するか、又は同族リガンド、好ましくは同族リガンドAPPを結合するDR6レセプターの能力を、部分的に又は完全に、遮断、抑制、又は中和化する任意の分子を含む。例えば、DR6アンタゴニストは、神経細胞又は組織のアポトーシス又は細胞死に結果としてなる神経細胞又は組織において、1又は複数の細胞内シグナル又は細胞内シグナル伝達経路を活性化するDR6の能力を、部分的に又は完全に、遮断、抑制又は中和化してもよい。DR6アンタゴニストは、同族リガンドのDR6への結合の遮断、抑制、又は中和化、DR6と同族リガンド(例えば、APP)との間の複合体の形成、DR6レセプターのオリゴマー形成、DR6レセプターと異種コレセプターとの間の複合体の形成、同族リガンドのDR6レセプター/異種コレセプター複合体への結合、又はDR6レセプターと異種コレセプターとその同族リガンドとの間の複合体の形成を含むがこれに限定されないさまざまな機構によって、DR6を、部分的に又は完全に、遮断、抑制、又は中和化するために作動してもよい。DR6アンタゴニストは、直接的又は間接的な方法で機能してもよい。本発明により意図されるDR6アンタゴニストは、APP抗体、DR6抗体、イムノアドヘシン, DR6イムノアドヘシン、DR6融合タンパク質、DR6の共有結合修飾型、DR6変異体及びその融合タンパク質、又はDR6の高次オリゴマー型(二量体、凝集体)又はDR6のホモ又はヘテロポリマー型、JUN N末端キナーゼJNK活性の小分子及びペプチドインヒビター、信号変換経路においてJNKの上流で機能するタンパク質キナーゼMLKs及びMKKsの薬理的インヒビター、JNKの裏打ちタンパク質JIP-1への結合の薬理的インヒビター、c-Jun又はAP-1転写因子複合体のような基質へのJNKの結合の薬理的インヒビター、JNK結合性ドメイン(JBD)ペプチド及び/又はJNKの基質結合性ドメイン及び/又はJNK基質リン酸化部位を含むペプチドインヒビターのような基質のJNK介在性リン酸化の薬理的インヒビター、JNKへのATP結合を遮断する小分子、及びJNKへの基質の結合を遮断する小分子を含むJNKシグナル伝達カスケードの薬理的インヒビターのような小分子を含むがこれらに限定されない。
DR6アンタゴニストが、神経細胞又は組織において1又は複数の細胞内シグナル又は細胞内シグナル伝達経路を活性化するDR6レセプターの能力を部分的に又は完全に遮断、抑制又は中和化するか否かを調べるために、例えば(実施例に記載するように)さまざまな神経細胞又は組織において、及び脳卒中/脳虚血のインビボモデルにおいて、パーキンソン病のマウスモデル;アルツハイマー病のマウスモデル;筋萎縮性側索硬化症ALSのマウスモデル;脊髄筋肉萎縮症SMAのマウスモデル等の神経変性疾患のインビボモデルにおいて、局所的脳虚血及び全脳虚血のマウス/ラットモデル、例えば総頚動脈閉塞モデルまたは中大脳動脈閉塞モデルにおいて、又はエクスビボ全胚培養において、DR6アンタゴニストの効果を評価するためにアッセイを実施してもよい。さまざまなアッセイは、下記のように又は当該分野で知られており文献に記載されているような既知のインビトロ又はインビボアッセイフォーマットで実施されてもよい(例えば、McGowan等, TRENDS in Genetics, 22:281-289 (2006); Fleming等, NeuroRx, 2:495-503 (2005); Wong等, Nature Neuroscience, 5:633-639 (2002)を参照)。DR6アンタゴニストが、神経細胞又は組織において、1又は複数の細胞内シグナル又は細胞内シグナル伝達経路を活性化するDR6レセプターの能力を部分的に又は完全に遮断、抑制又は中和化するか否かを調べるためのアッセイの一実施形態は、DR6アンタゴニスト又は潜在的DR6アンタゴニスト(すなわち、興味がある分子)の存在下又は非存在下においてDR6とAPPとを結合させること;次にこのDR6アンタゴニスト又は潜在的DR6アンタゴニストの存在下でDR6のAPPへの結合の抑制を検出することを含む。
「核酸」は、任意のDNA又はRNAを含むことを意味する。例えば、染色体性核酸、ミトコンドリア核酸、ウイルス核酸及び/又は細菌性核酸が組織試料中に存在する。「核酸」なる用語は、二本鎖の核酸分子の何れか又は両鎖を包含し、原型の核酸分子の任意の断片又は部分を包含する。
「遺伝子」は、タンパク質をコードする又は転写する、あるいは他の遺伝子発現を調節する際に機能的に働く任意の核酸配列又はその一部を意味する。遺伝子は、機能的なタンパク質のコード化を担うすべての核酸又はタンパク質のコードあるいは発現を担う核酸の一部のみを構成してもよい。核酸配列は、エクソン、イントロン、開始領域又は終末領域、プロモータ配列、他の調節配列又は遺伝子に近接する特定の領域内に遺伝的な異常を含有してもよい。
「アミノ酸」及び「アミノ酸類(amino acids)」なる用語は、すべて天然に存在するL-α-アミノ酸を指す。この定義は、ノルロイシン、オルニチン、およびホモシステインを含むと定める。アミノ酸は、1文字又は3文字表記のどちらかで特定される:
Asp D アスパラギン酸 Ile I イソロイシン
Thr T トレオニン Leu L ロイシン
Ser S セリン Tyr Y チロシン
Glu E グルタミン酸 Phe F フェニルアラニン
Pro P プロリン His H ヒスチジン
Gly G グリシン Lys K リシン
Ala A アラニン Arg R アルギニン
Cys C システイン Trp W トリプトファン
Val V バリン Gln Q グルタミン
Met M メチオニン Asn N アスパラギン酸
図において、いくつかの他の1文字又は3文字表記が、配列中で所定の位置の2つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドを指すために又は識別するために使用されてもよい。
Asp D アスパラギン酸 Ile I イソロイシン
Thr T トレオニン Leu L ロイシン
Ser S セリン Tyr Y チロシン
Glu E グルタミン酸 Phe F フェニルアラニン
Pro P プロリン His H ヒスチジン
Gly G グリシン Lys K リシン
Ala A アラニン Arg R アルギニン
Cys C システイン Trp W トリプトファン
Val V バリン Gln Q グルタミン
Met M メチオニン Asn N アスパラギン酸
図において、いくつかの他の1文字又は3文字表記が、配列中で所定の位置の2つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドを指すために又は識別するために使用されてもよい。
「単離された」とは、ここで開示された種々のペプチド又はタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたペプチド又はタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ペプチド又はタンパク質は、(1)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、N末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分なほど、あるいは、(2)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性が得られるように十分なほど、又は(3)質量分光分析又はペプチドマッピング技術による均一性が得られるように十分なほど精製される。その自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された材料には、組換え細胞内のインサイツのペプチド又はタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたペプチド又はタンパク質は少なくとも一の精製工程により調製される。
ここで同定されている配列に対する「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法により達成可能であり、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のために、パーセントアミノ酸配列同一性値は、ジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている配列比較コンピュータプログラムALINE-2を用いて得ることができる。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, CAを通して公的に入手可能である。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェント」は、通常、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなればなる程、適切なアニーリングのために温度を高くする必要があり、プローブが短くなればなる程、温度を低くする必要が生じる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合、変性DNAの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より相対的に高い温度は、反応条件をよりストリンジェントにするが、低い温度はストリンジェントを低下させる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェントの更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここで定義される「高度のストリンジェント条件」は、(1)洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる;50℃で、0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの;(2)ハイブリダイゼーション中に変性剤を用いる;42℃で、50%(v/v)ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウムを用いるもの;又は(3)42℃で、50%ホルムアミド、5×SSC(0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5×デンハート液、超音波処理サケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、及び10%のデキストラン硫酸を用いて、42℃で0.2×SSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)及び55℃の50%ホルムアミド中にて洗浄、次いでEDTAを含む0.1×SSCにて55℃で高ストリンジェントな洗浄を行うことによって同定され得る。
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, New York:Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定され、20%ホルムアミド、5×SSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハート液、10%デキストラン硫酸、及び20mg/mLの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中にて37℃で終夜インキュベーション、次いで1×SSC中にておよそ37−50℃でのフィルターの洗浄を含む。当業者であれば、プローブ長等の因子に適合させるために必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
「プライマー」又は「複数のプライマー」なる用語は、相補的なRNA又はDNA標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズして、例えばポリメラーゼ連鎖反応で起こるような、ヌクレオチジルトランスフェラーゼの働きによってモノヌクレオチドからポリヌクレオチドの段階的な合成の開始点となるオリゴヌクレオチド配列を指す。
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なDNA配列を称す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのDNAに作用可能に結合している;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している;又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
本明細書中で用いられる「標識」なる用語は、核酸プローブや抗体などの試薬に直接的又は間接的にコンジュゲートないしは融合され、コンジュゲートないしは融合した試薬の検出を容易にする化合物又は組成物を指す。標識自体が検出可能なもの(例えば放射性標識又は蛍光性標識)であってもよく、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物ないしは組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。
本明細書で使用する場合、「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を示す。 構造的に、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(すなわち、「異種」である)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG-1、IgG-2、IgG-3又はIgG-4サブタイプ、IgA(IgA-1及びIgA-2を含む)、IgE、IgD又はIgM等の任意の免疫グロブリンから得ることができる。
「DRレセプター抗体」、「DR6抗体」、又は「抗DR6抗体」は、DR6レセプター、好ましくは、図1Aに示すDR6配列又はその細胞外ドメイン配列等のヒトDR6レセプターの少なくとも一形態に結合する抗体を指すために広義に使用される。場合によっては、DR6抗体は異種性配列又は分子に融合又は結合される。好ましくは、異種性配列は、抗体がより高次の又はオリゴマー複合体を形成することを許容又は補助する。「抗DR6抗体」なる用語及び文法的に相当する言葉は、特に、下の実施例に記載のDR6モノクローナル抗体を含む。場合によっては、DR6抗体はDR6レセプターに結合するが、腫瘍壊死因子ファミリーの任意の更なるレセプター(例えばDR4、DR5、TNF1、TNF2、Fas) と結合又は交差反応をしない。 場合によっては、本発明のDR6抗体は、BIAcore結合アッセイで測定した場合、約0.067nMから約0.033μMの濃度範囲で、DR6レセプターに結合する。
「抗APP抗体」、「APP抗体」なる用語及び文法的に相当する言葉は、広義に使用され、本明細書に特に記載するAPPポリペプチドイソフォーム等のAPP、好ましくはヒトAPPの少なくとも一形態に結合する抗体を指すために使用される。好ましくは、APP抗体はDR6アンタゴニスト抗体である。例えば、本願明細書に開示するDR6アンタゴニストを作成及び/又は同定する方法において、APP及び/又はそのタンパク質の1又は複数のイソフォームは、動物(例えば、モノクローナル抗体を作成するための方法の一環としてマウス)を免疫化するための免疫原として、及び/又は化合物のライブラリー(例えば、組換え抗体ライブラリー)をスクリーニングするためのプローブとして使用されうる。本発明の実施形態で有用である典型的なAPPポリペプチドは、以下の非限定的な例を含む。これら具体的な形態は、本発明のさまざまな実施形態において使用するために選択されうる。本発明のいくつかの実施形態において、APPポリペプチドは、図1に示すAPP695及び/又はAPP751及び/又はAPP770イソフォーム等の全長APPイソフォームを含む。本発明の他の実施形態において、APPポリペプチドは、APPの翻訳後に処理されたイソフォーム、例えば、α分泌酵素、β分泌酵素又はγ分泌酵素等の分泌酵素によって切断を受けたAPPポリペプチド(例えば、sAPPα又はsAPPβ等の可溶性N末端断片)を含む。本発明の関係する実施形態において、APPポリペプチドは、N末端外部ドメイン(例えば、Quast等, FASEB J. 2003; 17(12):1739-41を参照)、ヘパリン結合ドメイン(例えば、Rossjohn等, Nat Struct Biol. 1999 Apr;6(4):327-31を参照)、銅タイプII(例えば、Hesse等, FEBS Letters 349(1): 109-116 (1994)を参照)又はクーニッツ(Kunitz)プロテアーゼ・インヒビター・ドメイン(例えば、Ponte等, Nature; 331(6156):525-7 (1988)を参照)のような1又は複数の特異的なドメインを含むように選択されうる。本発明のいくつかの実施形態において、APPポリペプチドは、抗体又はDR6イムノアドヘシンのような本明細書で開示されたDR6アンタゴニストによって認識されるエピトープ、例えばAPP695のアミノ酸22−81、を含むことが認められた配列、モノクローナル抗体22C11により結合されるエピトープを含む配列(例えば、Hilbich等, Journal of Biological Chemistry, 268(35): 26571-26577 (1993)を参照)を含む。本発明のいくつかの実施形態において、例えば特定のN末端又はC末端アミノ酸を含まないAPPポリペプチド(例えば、実施例12で開示するヒト組換えN-APPポリペプチド)、クーニッツプロテアーゼ・インヒビター・ドメインを含まないAPPポリペプチド(例えば、APP695)、又はアルツハイマーのβアミロイドタンパク質(Aβ)配列を含まないAPPポリペプチド(例えば、sAPPβ、Aβ40及び/又はAβ42配列を含まないポリペプチド) (例えば、Bond等, J. Struct Biol. 2003 Feb;141(2):156-70を参照)のように、APPポリペプチドは1又は複数の特定のドメイン又は配列を含まない。本発明の他の実施形態において、本発明の実施形態で使用されるAPPポリペプチドは、1又は複数のドメイン又は配列を含むが、他のドメイン又は配列は含まず、例えば、βアミロイド(Aβ)配列(例えば、sAPPα又はsAPPβ)のような1又は複数の分泌酵素切断部位について、APPポリペプチドはN末端外部ドメイン(又は、少なくとも、モノクローナル抗体22C11のようなDR6アンタゴニストにより結合されることが認められるそれらの部分)を含むが、C末端であるドメイン又は配列を含まない。場合によっては、抗APP抗体はAPPポリペプチドのDR6への結合を阻害し、本明細書に記載のように、及び/又は定量的細胞ベース結合アッセイで測定した場合、10μg/mlから50μg/mlの濃度でAPPポリぺプチドに結合する。
ここで「抗体」なる用語は、広い意味で用いられ、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの無傷の抗体から形成した多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び所望の生物学的活性を有する限りにおける抗体断片の範囲にわたる。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab’、F(ab’)2及びFv断片;ダイアボディ;線形抗体;一本鎖抗体分子;及び抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。
「天然抗体」は、通常、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖からなる、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(VH)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(VL)を、他端に定常ドメインを有する;軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間のインターフェイスを形成すると考えられている。
「天然抗体」は、通常、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖からなる、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(VH)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(VL)を、他端に定常ドメインを有する;軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間のインターフェイスを形成すると考えられている。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域又は相補性決定領域と呼ばれる3つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、3つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる4つのFRをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、FRによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞媒介性障害活性(ADCC)への抗体の関与を示す。
抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Fc」断片と命名される。ペプシン処理はF(ab')2断片を生じ、それは2つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Fc」断片と命名される。ペプシン処理はF(ab')2断片を生じ、それは2つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Fv」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの3つの高頻度可変領域は相互に作用してVH-VL二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、6つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な3つの高頻度可変領域のみを含むFvの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またFab断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(CH1)を有する。Fab'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でFab断片とは異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を担持しているFab'に対するここでの命名である。F(ab')2抗体断片は、間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
またFab断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(CH1)を有する。Fab'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でFab断片とは異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を担持しているFab'に対するここでの命名である。F(ab')2抗体断片は、間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体は異なるクラスが割り当てられる。無傷の抗体には5つの主なクラスがある:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM、更にそれらは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、及びIgA2等のサブクラス(イソ型)に分かれる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
「一本鎖Fv」又は「scFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、FvポリペプチドはVH及びVLドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはscFvが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。scFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体は異なるクラスが割り当てられる。無傷の抗体には5つの主なクラスがある:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM、更にそれらは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、及びIgA2等のサブクラス(イソ型)に分かれる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
「一本鎖Fv」又は「scFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、FvポリペプチドはVH及びVLドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはscFvが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。scFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(VH−VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に重鎖可変ドメイン(VH)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第404,097号;国際公報93/11161;及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリンの混入がないという利点がある。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築したものであることを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えDNA法によって作ることができる(例えば米国特許第4816567号を参照のこと)。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks等, J. Mol. biol. 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから作成することもできる。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリンの混入がないという利点がある。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築したものであることを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えDNA法によって作ることができる(例えば米国特許第4816567号を参照のこと)。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks等, J. Mol. biol. 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから作成することもできる。
ここで言うモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体(免疫グロブリン)を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致する又は類似する重鎖及び/又は軽鎖の一部を含むものであり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致する又は類似するものである(米国特許第4,816,567号;及びMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界サル)由来の可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む(米国特許第5,693,780号)。
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒトイムノグロブリン(免疫グロブリン)に由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ヒト免疫グロブリン配列の高頻度可変ループがFRのすべて又は実質的にすべてである少なくとも一又は一般的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Fc)の一部、一般的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986);Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒトイムノグロブリン(免疫グロブリン)に由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ヒト免疫グロブリン配列の高頻度可変ループがFRのすべて又は実質的にすべてである少なくとも一又は一般的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Fc)の一部、一般的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986);Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般には「相補性決定領域」又は「CDR」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基24−34(L1)、50−56(L2)及び89−97(L3)、及び重鎖可変ドメインの31−35(H1)、50−65(H2)及び95−102(H3);Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び/又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基26−32(L1)、50−52(L2)及び91−96(L3)及び重鎖可変ドメインの残基26−32(H1)、53−55(H2)及び96−101(H3);Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含む。「フレームワーク」又は「FR」残基はここで定義するように高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
目的の抗原に「結合する」抗体とは、抗体が抗原発現細胞を標的とした治療薬又は診断剤として有用となるように十分な親和性及び/又は結合活性を有して抗原に結合することができるものである。
ここでの目的のための「免疫治療」とは、抗体を用いた哺乳動物(好ましくはヒト患者)の治療方法を意味し、この抗体はコンジュゲートされたもの又は「ネイキッド」抗体でもよいし、又は一又は複数の細胞障害性剤などの薬剤やヘテロ分子とコンジュゲート又は融合して、それによって「免疫コンジュゲート」を生成してもよい。
目的の抗原に「結合する」抗体とは、抗体が抗原発現細胞を標的とした治療薬又は診断剤として有用となるように十分な親和性及び/又は結合活性を有して抗原に結合することができるものである。
ここでの目的のための「免疫治療」とは、抗体を用いた哺乳動物(好ましくはヒト患者)の治療方法を意味し、この抗体はコンジュゲートされたもの又は「ネイキッド」抗体でもよいし、又は一又は複数の細胞障害性剤などの薬剤やヘテロ分子とコンジュゲート又は融合して、それによって「免疫コンジュゲート」を生成してもよい。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様においては、抗体は、(1)ローリー(Lowry)法により定量して、抗体が95重量%より多くなるほど、最も好ましくは99重量%より多くなるまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、N末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも15の残基を得るのに十分な程度まで、あるいは、(3)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性が得られるように十分な程度まで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも1つの精製工程により調製される。
ここで使用される場合の「タグ化」なる用語は、「タグポリペプチド」に融合した、抗体、又はポリペプチドを含有するキメラ分子を称す。タグポリペプチドは、その抗体が産生するエピトープを提供するか、又はオリゴマー化(例えば、ロイシンジッパードメインを有するペプチドと生じるような)等の他のいくつかの機能を提供するのに十分な残基を有しているが、その長さは、一般的に抗体又はポリペプチドの活性を阻害しないよう十分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、タグ特異性抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも6のアミノ酸残基、通常は約8〜約50のアミノ酸残基(好ましくは約10〜約20のアミノ酸残基)を有する。
ここで使用される場合の「タグ化」なる用語は、「タグポリペプチド」に融合した、抗体、又はポリペプチドを含有するキメラ分子を称す。タグポリペプチドは、その抗体が産生するエピトープを提供するか、又はオリゴマー化(例えば、ロイシンジッパードメインを有するペプチドと生じるような)等の他のいくつかの機能を提供するのに十分な残基を有しているが、その長さは、一般的に抗体又はポリペプチドの活性を阻害しないよう十分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、タグ特異性抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも6のアミノ酸残基、通常は約8〜約50のアミノ酸残基(好ましくは約10〜約20のアミノ酸残基)を有する。
「Fcレセプター」又は「FcR」は、抗体のFc領域に結合するレセプターを表す。好適なFcRは、天然配列ヒトFcRである。さらに好適なFcRは、IgG抗体(γレセプター)に結合し、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。FcγRIIレセプターは、FcγRIIA(「活性化レセプター」)及びFcγRIIB(「阻害レセプター」)を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターFcγRIIAは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ITAM)を有する。阻害レセプターFcγRIIBは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース阻害モチーフ(ITIM)を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)参照)。FcRはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991);Capelら, Immunomethods 4:25-34 (1994);及びde Hasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のFcRが、ここにおける「FcR」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性IgGの移動の原因である新生児レセプター、FcRnもまた含む(Guyerら, J. Immumol. 117:587 (1976)及びKimら, J. Immunol. 24:249 (1994))。本明細書中のFcRはFcγRIIIaをコードする遺伝子内に遺伝的二形性などの多型を含有し、それによってIgG1に結合するレセプターの領域内に位置するアミノ酸位置158がフェニルアラニン(F)又はバリン(V)となる。ホモ接合体バリンFcγRIIIa(FcγRIIIa-158V)は、ホモ接合体フェニルアラニンFcγRIIIa(FcγRIIIa-158F)又はヘテロ(FcγRIIIa-158F/V)レセプターと比較してインビトロでのADCC媒介を増加し、ヒトIgG1に対する親和性も高いことが示された。
ここで使用される場合の「ポリオール」という用語は広義に多価アルコール化合物を意味する。ポリオールは例えば任意の水可溶型ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーであり得、直鎖又は分枝鎖を有しうる。好適なポリオールには、一又は複数のヒドロキシル位置に化学基、例えば1から4の炭素を有するアルキル基が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールはポリ(アルキレングリコール)、好ましくはポリ(エチレングリコール)(PEG)である。しかし、当業者であれば、他のポリオール、例えばポリ(プロピレングリコール)及びポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーを、ここでPEGについて記載した抱合技術を使用して用いることができることが分かるであろう。ポリオールには当該分野でよく知られたもの及び公的に入手可能なもの、例えばNectar(登録商標) Corporationといった商業的に利用可能な供給源からのものが含まれる。
「抱合(コンジュゲート)」という用語は、ここではその最も広い定義で使用され、共に接合(joined)又は結合(linked)されていることを意味する。分子は、接合されているように作用又は機能する場合、「抱合」されている。
「有効量」という用語は、問題の疾患又は症状を予防、寛解又は治療するのに効果的な薬剤(例えば、DR6アンタゴニスト)の量を意味する。本発明のDR6アンタゴニストは、神経変性疾患の進行の遅延又は停止、或いは損傷した神経細胞又は組織の修復促進に有用であり、適切な神経機能の回復を助けると考えられる。
ここで使用される「処置する」又は「処置」又は「治療」とは、治癒的治療、予防的治療又は防止的治療を称する。連続的治療又は投与とは、一又は複数の日数、治療を中断することなく、少なくとも毎日であることを基本とし治療を行うことを称する。断続的治療又は投与、もしくは断続的な方法での治療又は投与とは、連続させることなく、むしろ本質的には周期的に治療することを称する。
ここで使用される場合、「疾患」なる用語は、本明細書に記載のDR6アンタゴニストによる治療により利益を得る任意の症状を指す。これには、慢性及び急性の疾患、並びに問題の疾患に哺乳動物を罹患させやすくする病理状態が含まれる。
「抱合(コンジュゲート)」という用語は、ここではその最も広い定義で使用され、共に接合(joined)又は結合(linked)されていることを意味する。分子は、接合されているように作用又は機能する場合、「抱合」されている。
「有効量」という用語は、問題の疾患又は症状を予防、寛解又は治療するのに効果的な薬剤(例えば、DR6アンタゴニスト)の量を意味する。本発明のDR6アンタゴニストは、神経変性疾患の進行の遅延又は停止、或いは損傷した神経細胞又は組織の修復促進に有用であり、適切な神経機能の回復を助けると考えられる。
ここで使用される「処置する」又は「処置」又は「治療」とは、治癒的治療、予防的治療又は防止的治療を称する。連続的治療又は投与とは、一又は複数の日数、治療を中断することなく、少なくとも毎日であることを基本とし治療を行うことを称する。断続的治療又は投与、もしくは断続的な方法での治療又は投与とは、連続させることなく、むしろ本質的には周期的に治療することを称する。
ここで使用される場合、「疾患」なる用語は、本明細書に記載のDR6アンタゴニストによる治療により利益を得る任意の症状を指す。これには、慢性及び急性の疾患、並びに問題の疾患に哺乳動物を罹患させやすくする病理状態が含まれる。
「神経細胞又は組織」は、通常、運動ニューロン、非限定的に交連ニューロンを含む介在ニューロン、非限定的に後根神経節ニューロンを含む感覚ニューロン、黒質のドーパミン(DA)ニューロン、線条体DAニューロン、皮質ニューロン、脳幹ニューロン、脊椎介在ニューロン及び運動ニューロン、非限定的に海馬のCAI錐体ニューロンを含む海馬ニューロン、及び前脳ニューロンを指す。神経細胞又は組織なる用語は、本明細書において細胞体、軸索および樹状突起からなる神経細胞、及び当該神経細胞の一部分を形成してもよい軸索又は樹状突起を指すことを意図する。
「神経疾患」は、本明細書において、神経変性病状、中枢又は末梢神経系の機能不全によって又は神経細胞又組織のネクローシス及び/又はアポトーシスによって特徴付けられる神経細胞又は組織傷害、栄養因子欠乏に関連した神経細胞又組織損傷を含む病状を指すために使用される。神経変性疾患の例には、家族性及び特発性筋萎縮性側索硬化症(それぞれ、FALS及びALS)、家族性及び特発性パーキンソン病、ハンチントン病(ハンチントン舞踏病)、家族性及び特発性アルツハイマー病、脊髄性筋萎縮症 (SMA)、緑内障又は網膜変性を伴う関連疾患等の視神経症、糖尿病性神経障害、又は黄斑変性症、内耳感覚細胞又はニューロンの変性による聴力損失、てんかん、顔面麻痺、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、多発性硬化症、びまん性大脳皮質萎縮症, レビー小体型認知症、ピック病、三塩基反復病、プリオン病、及びシャイ・ドレーガー症候群を含まれる。神経細胞又は組織の傷害又は損傷は、神経細胞又は組織の生存又は適切な機能を危険にさらすさまざまな異なる原因から生じてもよく、例えば、全脳虚血及び局所的脳虚血(脳卒中)の場合のような、血流を(一時的に又は恒久的に)制限する虚血状態;脳組織又は脊髄の切開又は切断;神経組織における病変又はプラーク;細胞の成長及び生存のために必要とされる栄養因子の欠乏;化学療法剤等の神経毒への暴露に由来する;及び糖尿病又は腎機能不全などの慢性代謝病のような他の疾患に付随してするものを含む、急性及び非急性傷害を含むがこれらに限定されるものではない。
「被検体」又は「患者」は、ヒトを含む、治療が望まれる任意の単一の被検体を意味する。また、臨床試験に用いられる疾患の臨床的な特徴を全く示さない任意の被検体、又は疫学的な研究に用いられる被検体、又はコントロールとして用いられる被検体も被検体に含まれる。
本明細書中で用いられる「哺乳動物」なる用語は、哺乳動物と分類される任意の哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを意味する。本発明の好適な実施態様では、哺乳動物がヒトである。
本明細書中で用いられる「哺乳動物」なる用語は、哺乳動物と分類される任意の哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを意味する。本発明の好適な実施態様では、哺乳動物がヒトである。
II.本発明の例示的方法及び材料
過去の研究は、神経系の発生の間の細胞死の現象を調査している(Hamburger等, J. Neurosci., 1:60-71 (1981); Oppenheim, Ann. Rev. Neurosci., 14:453-501 (1991); O’Leary等, J. Neurosci., 6:3692-3705 (1986); Henderson等, Nature, 363:266-270 (1993); Yuen等, Brain Dev., 18:362-368 (1996))。神経細胞の死は、家族性及び特発性筋萎縮性側索硬化症(それぞれ、FALS及びALS)、家族性及び特発性パーキンソン病、ハンチントン病、家族性及び特発性アルツハイマー病及び脊髄性筋萎縮症(SMA)等さまざまな神経疾患の発生及び/進行において役割を果たしていると考えられている(Price等, Science, 282:1079-1083 (1998))。
過去の研究は、神経系の発生の間の細胞死の現象を調査している(Hamburger等, J. Neurosci., 1:60-71 (1981); Oppenheim, Ann. Rev. Neurosci., 14:453-501 (1991); O’Leary等, J. Neurosci., 6:3692-3705 (1986); Henderson等, Nature, 363:266-270 (1993); Yuen等, Brain Dev., 18:362-368 (1996))。神経細胞の死は、家族性及び特発性筋萎縮性側索硬化症(それぞれ、FALS及びALS)、家族性及び特発性パーキンソン病、ハンチントン病、家族性及び特発性アルツハイマー病及び脊髄性筋萎縮症(SMA)等さまざまな神経疾患の発生及び/進行において役割を果たしていると考えられている(Price等, Science, 282:1079-1083 (1998))。
驚くべきことに、出願人は、TNFRファミリーの一員であるDR6は、脊髄の大脳皮質、海馬、運動ニューロン及び介在ニューロンを含む胚の及び成体の中枢神経系において、高度に発現することを発見した。下の実施例に記載するように、出願人は、DR6が神経細胞の生存又は死のレギュレーターとして果たしているその役割を調査するために、さまざまな実験分析を行った。交連ニューロンは、その中間標的の一つである脊髄の底板からの栄養支持にその生存を依存している。出願人は、インビトロでの外植片培養において、RNA干渉によるDR6発現の抑制が交連ニューロンの軸索変性を遮断したことを発見した。また、抗DR6モノクローナル抗体は、背側脊髄生存アッセイにおいて試験され、DR6特異的抗体3F4.4.8;4B6.9.7;及び1E5.5.7によるDR6レセプターシグナル伝達の抑制が、インビトロでの外植片培養における交連ニューロンの軸索変性を抑えることが見いだされた。DR6はJNKの活性化を介してシグナル伝達することが、文献で報告されている(Pan等, 上掲 1998; Zhao等, 上掲 2001)。それ故、軸索変性におけるDR6-JNKの役割を推定するために、交連ニューロンにおけるJNKシグナル伝達経路がペプチドインヒビターL-JNK-1により遮断された背側脊髄生存アッセイが実施された。JNKシグナル伝達のこの抑制は、背側脊髄生存アッセイにおいて、部分的に軸索変性を遮断した。従って、DR6は、少なくとも一部分ではJNK経路を介して軸索突起の変性にシグナルを伝達していると考えられる。発生中の神経細胞死の調節におけるDR6の生理学的役割をよりよく理解するために、DR6シグナル伝達を、全胚培養系において抗DR6抗体により遮断した。特筆すべきことに、この系において、特定のDR6特異的抗体によるDR6シグナル伝達の抑制は、天然に生じる発生上の細胞死に対して脊髄ニューロンを保護した。そのため、DR6アンタゴニスト抗体などのDR6アンタゴニストは、神経変性疾患(例えば、ALS、SMA、アルツハイマー及びパーキンソン病、FTDP-17、ハンチントン病)および脳卒中などの神経疾患において生じる神経細胞死を減らすために利用されてもよい。DR6がインビボで本物のプロアポトーシスレセプターとして機能するか否かを調べるために、出願人は発生ステージE15.5におけるDR6ノックアウト胚の表現型を解析した。DR6の神経細胞生存の負のレギュレータとしての提案された役割と一致して、DR6ヘテロ接合体同腹仔コントロールに比較して、DR6ヌル脊髄及び後根神経節では、神経細胞死の約40%から50%の減少が検出された。
また、出願人は、アミロイド前駆体タンパク質(APP)がDR6レセプターの同族リガンドであること、更にAPPはDR6レセプターを介して軸索変性を引き起す働きをすることを見い出した。アミロイド前駆体タンパク質は、完全にはわかっていないが、アルツハイマー病において何らかの役割を果たしていると、以前に仮説が立てられている(Selkoe, J. Biol. Chem. 271:18295 (1996); Scheuner等, Nature Med. 2:864 (1996); Goate等, Nature 349:704 (1991))。
特に、DR6アンタゴニストはさまざまな神経疾患の治療に有用であると考えられている。従って、本発明はDR6アンタゴニストの有効量の投与を含む、哺乳動物においてDR6活性を抑制、遮断又は中和化するためのDR6アンタゴニスト組成物及び方法を提供する。好ましくは、使用されるDR6アンタゴニストの量は、軸索変性及び神経細胞死を遮断するために効果的な量である。これは、例えば、以下及び実施例に記載の方法によって達成されうる。
特に、DR6アンタゴニストはさまざまな神経疾患の治療に有用であると考えられている。従って、本発明はDR6アンタゴニストの有効量の投与を含む、哺乳動物においてDR6活性を抑制、遮断又は中和化するためのDR6アンタゴニスト組成物及び方法を提供する。好ましくは、使用されるDR6アンタゴニストの量は、軸索変性及び神経細胞死を遮断するために効果的な量である。これは、例えば、以下及び実施例に記載の方法によって達成されうる。
この方法に使用されうるDR6アンタゴニストは、DR6及び/又はAPPイムノアドヘシン、DR6及び/又はAPPを含む融合タンパク質、DR6及び/APPの共有結合修飾形態、DR6及び/又はAPP変異体、その融合タンパク質、及びDR6及び/又はAPP抗体を含むが、これらに限定されるものではない。アンタゴニストを作成するために使用されうるさまざまな技術は、本明細書に記載される。例えば、DR6及びAPPポリペプチドを調製するための方法及び技術が記載される。また、DR6及びAPPポリペプチドの更なる修飾、及びDR6及びAPPに対する抗体も記載される。
本明細書で開示される本発明は、多くの実施形態を有する。本発明は、DR6のAPPへの結合が阻害される条件下で、1又は複数のDR6アンタゴニストにDR6ポリペプチド及び/又はAPPポリぺプチドを暴露することを含む、DR6のAPPへの結合を阻害する方法を提供する。本発明の関係する実施形態は、配列番号1のアミノ酸1−655を含むDR6ポリペプチドと配列番号6のアミノ酸66−81を含むAPPポリペプチド(例えば、sAPPβ)との結合を阻害する方法であり、DR6ポリペプチド及びAPPポリペプチドをDR6又はAPPを結合する単離されたアンタゴニストと組合わせることを含む方法であって、単離されたアンタゴニストはAPPを結合する抗体、DR6を結合する抗体、及び配列番号1のアミノ酸1−354を含むDR6ポリペプチドを含む可溶性DR6ポリペプチドの少なくとも1つから選択されること;及び単離されたアンタゴニストはDR6とAPPとの結合を阻害する能力により選択されることを含んで成り、それによりDR6のAPPへの結合が阻害される、方法を提供する。
本明細書で開示される本発明は、多くの実施形態を有する。本発明は、DR6のAPPへの結合が阻害される条件下で、1又は複数のDR6アンタゴニストにDR6ポリペプチド及び/又はAPPポリぺプチドを暴露することを含む、DR6のAPPへの結合を阻害する方法を提供する。本発明の関係する実施形態は、配列番号1のアミノ酸1−655を含むDR6ポリペプチドと配列番号6のアミノ酸66−81を含むAPPポリペプチド(例えば、sAPPβ)との結合を阻害する方法であり、DR6ポリペプチド及びAPPポリペプチドをDR6又はAPPを結合する単離されたアンタゴニストと組合わせることを含む方法であって、単離されたアンタゴニストはAPPを結合する抗体、DR6を結合する抗体、及び配列番号1のアミノ酸1−354を含むDR6ポリペプチドを含む可溶性DR6ポリペプチドの少なくとも1つから選択されること;及び単離されたアンタゴニストはDR6とAPPとの結合を阻害する能力により選択されることを含んで成り、それによりDR6のAPPへの結合が阻害される、方法を提供する。
当該方法では、場合によっては、1又は複数のDR6アンタゴニストが、DR6を結合する抗体(例えば、ATCC受入番号PTA-8095、PTA-8094、又はPTA-8096として寄託されているハイブリドーマ細胞株により製造される、それぞれ、3F4.4.8、4B6.9.7、1E5.5.7モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害するDR6を結合する抗体)、配列番号1のアミノ酸配列1−354を含む可溶性DR6ポリペプチド(例えば、DR6イムノアドヘシン)、又はAPPを結合する抗体(例えば、モノクローナル抗体22C11)から選択される。本発明のいくつかの実施形態において、DR6アンタゴニストは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びポリオキシアルキレンからなる群から選択される1又は複数の非タンパク性ポリマーに結合されるDR6を結合する抗体、APPを結合する抗体又は可溶性DR6ポリペプチドである。
これらの方法の任意の実施形態において、DR6ポリペプチドは1又は複数の哺乳動物の細胞(例えば、交連ニューロン細胞、感覚ニューロン細胞又は運動ニューロン細胞)の1又は複数の哺乳動物細胞の細胞表面上で発現し、当該1又は複数のDR6アンタゴニストの結合はDR6活性化又はシグナル伝達を阻害する。本発明の当該実施形態の一つにおいて、方法は、組織培養における神経細胞の成長及び/又は再生及び/又は生存を促進するために、DR6を発現する1又は複数の哺乳動物の細胞においてアポトーシスを阻害するためにインビトロで実施される。例えば、当該DR6アンタゴニストは、組織培地へのインビトロ添加物、例えば神経細胞培養を増殖させることを目的とするものとして有用である。特に、当該分野で知られているように、ある神経細胞培養の増殖は、当該細胞がアポトーシスが受ける傾向があるのために問題を有する場合がある。例えば、いくつか神経培養は神経成長因子等の外生因子の非存在下で死ぬ。本明細書で提供する開示は、DR6アンタゴニストが、当該神経細胞培養において、細胞の成長及び/又は再生及び/又は生存を促進するために、例えば、当該培養における神経成長因子の使用と同種の方法で、使用されうることを示す。
本発明の更なる実施形態において、DR6のAPPへの結合の阻害の方法は、神経学的病状又は疾患を有する哺乳動物において、インビボで実施されてもよい。場合によっては、神経学的病状又は疾患は、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病又はアルツハイマー病である。あるいは、神経学的病状又は疾患は、脳卒中、脳又は脊髄組織への外傷、又は神経組織の病変に由来する神経細胞又は組織傷害を含む。
本発明の更なる実施形態は、神経学的病状又は疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、前記哺乳動物に1又は複数のDR6アンタゴニストの有効量を投与することを含む方法を提供する。典型的には、当該方法において、1又は複数のDR6アンタゴニストは、DR6を結合する抗体、配列番号1のアミノ酸1−354を含む可溶性DR6ポリペプチド、及びAPPを結合する抗体から選択される。本発明の任意の実施形態において、神経学的病状又は疾患は筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病又はアルツハイマー病である。あるいは、神経学的病状又は疾患は、脳卒中、脳又は脊髄組織への外傷、又は神経組織の病変に由来する神経細胞又は組織傷害を含む。本発明のさまざまな実施形態において、1又は複数の更なる治療薬は上記哺乳動物に投与される。本発明のある例示的な実施形態において、1又は複数の更なる治療剤はNGF、アポトーシスインヒビター、EGFRインヒビター、β分泌酵素インヒビター、γ分泌酵素インヒビター、コリンエステラーゼインヒビター、抗Aβ抗体及びNMDAレセプターアンタゴニストから選択される。場合によっては、1又は複数のDR6アンタゴニスト及び/又は更なる治療薬は、哺乳動物に、注射、注入又は灌流を介して投与される。
本発明の更なる実施形態は、神経学的病状又は疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、前記哺乳動物に1又は複数のDR6アンタゴニストの有効量を投与することを含む方法を提供する。典型的には、当該方法において、1又は複数のDR6アンタゴニストは、DR6を結合する抗体、配列番号1のアミノ酸1−354を含む可溶性DR6ポリペプチド、及びAPPを結合する抗体から選択される。本発明の任意の実施形態において、神経学的病状又は疾患は筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病又はアルツハイマー病である。あるいは、神経学的病状又は疾患は、脳卒中、脳又は脊髄組織への外傷、又は神経組織の病変に由来する神経細胞又は組織傷害を含む。本発明のさまざまな実施形態において、1又は複数の更なる治療薬は上記哺乳動物に投与される。本発明のある例示的な実施形態において、1又は複数の更なる治療剤はNGF、アポトーシスインヒビター、EGFRインヒビター、β分泌酵素インヒビター、γ分泌酵素インヒビター、コリンエステラーゼインヒビター、抗Aβ抗体及びNMDAレセプターアンタゴニストから選択される。場合によっては、1又は複数のDR6アンタゴニスト及び/又は更なる治療薬は、哺乳動物に、注射、注入又は灌流を介して投与される。
本発明のまた更なる実施形態において、DR6のAPPへの結合を阻害する興味のある分子を同定する方法であり、上記興味のある分子の存在下又は非存在下でDR6とAPPとを組合せること;次に上記興味のある分子の存在下でDR6のAPPへの結合の抑制を検出することを含む方法を提供する。本発明の関係する実施形態は、組成物が、配列番号1のアミノ酸1−655(場合によっては、配列番号1のアミノ酸1―354)を含むDR6ポリペプチドと配列番号6のアミノ酸66−81を含むAPPポリペプチド(例えば、APP695、sAPPα又はsAPPβ)との間の結合を調節するかどうかを評価する方法であり、組成物をDR6及びAPPに組合わせること;次に組成物の非存在下でのDR6とAPPとの間の結合と、組成物の存在下でのDR6とAPPとの間の結合とを比較すること;それにより組成物がDR6とAPPとの間の結合を調節するかどうかを評価することを含む方法を提供する。場合によっては、当該方法における結合性の違いは、表面プラズモン共鳴(SPR)技術を介して測定される(例えば、Biacore Life Sciencesより入手可能である)。本発明の実施形態は、更に、これらの方法により同定された興味のある分子を含む。
本発明の更なる実施形態は、神経疾患を有するか、又は神経疾患が疑われる患者を診断する方法であって、患者から試料を採取すること及び配列番号1のDRポリペプチド配列と異なるポリペプチド配列を有するDR6ポリペプチド変異体の存在について試料を試験することを含む。場合によっては、方法は、更に、配列番号1のDR6ポリペプチド配列に対して認められた親和性とは異なるAPPポリペプチドに対する親和性を有するポリペプチド変異体を同定することを含む。本発明の関係する実施形態は、配列番号1のアミノ酸1−655を含むDR6のポリペプチド変異体が哺乳動物に存在するかどうかを調べる方法であり、哺乳動物においてDR6のポリペプチド変異体が存在するかどうかを調べるために、哺乳動物において発現されたDR6ポリペプチドの配列を配列番号1と比較することを含む方法である。これらの方法のいくつかの実施形態は、哺乳動物に存在すると認められたポリペプチド変異体をAPP結合性変異体として同定する更なる工程であって、APP結合性変異体は、配列番号6のアミノ酸66−81を含むアミロイド前駆体タンパク質(APP)(例えば、APP695、sAPPα又はsAPPβ)に対する結合親和性を有し、それは配列番号6のアミノ酸66−81を含むAPPポリペプチドに対する、配列番号1を含むDR6ポリペプチドの結合性親和性とは異なることを特徴とする工程を含んでもよい。場合によっては、上記方法において結合親和性の違いは、(例えば、Biacore Life Sciencesより入手可能である)表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって測定される。これらの方法のいくつかの実施形態は、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病又はアルツハイマー病で認められる症状又は病状を有する者を個々の患者として選択する工程を含んでもよい。
ここに開示される完全長天然配列DR6及びAPPポリペプチドに加え、DR6及び/又はAPPポリペプチド変異体が調製可能であることも考慮される。DR6及び/又はAPP変異体は、コード化DNAに適切なヌクレオチド変化を導入すること、及び/又は所望のポリペプチドを合成することにより調製できる。本技術分野の当業者が周知のように、例えばグリコシル化部位の数又は位置の変化、或いは膜固着特性の変更等のアミノ酸変化により、DR6及び/又はAPPの翻訳後のプロセスが変化し得る。
ここに開示されるDR6及び/又はAPPポリペプチドの変異形態を、例えば米国特許第5364934号に記載されているような保存的及び非保存的突然変異のための技術及びガイドのいずれかを用いて作成することができる。変異とは、天然配列ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を生じさせるような、ポリペプチドをコードする1以上のコドンを置換、削除又は挿入することであってよい。場合によっては、少なくとも1つのアミノ酸を置換し、それ以外のアミノ酸がDR6及び/又はAPPポリペプチドの1以上のドメインにあると変異となる。所望の活性に逆効果を与えることなく、どのアミノ酸残基を挿入、置換又は削除したらよいかの判断は、DR6ポリペプチドの配列を既知の相同なタンパク質の配列と比較し、相同性の高い領域においてはアミノ酸配列の変更数を最小限にすれば指標となる。アミノ酸置換は、1つのアミノ酸を同様の構造及び/又はキメラ特性を有する別のアミノ酸で置き換えること、例えばロイシンをセリンに置き換える、つまり保存的なアミノ酸の置き換えとしてよい。場合によっては、挿入又は削除は約1−5のアミノ酸の範囲で行われる。可能な変異は、配列中のアミノ酸を体系的に挿入、削除又は置換し、DR6及び/又はAPPアンタゴニスト活性に関して結果的に生じる変異を試験することにより決定できる。
ここに開示されるDR6及び/又はAPPポリペプチドの変異形態を、例えば米国特許第5364934号に記載されているような保存的及び非保存的突然変異のための技術及びガイドのいずれかを用いて作成することができる。変異とは、天然配列ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を生じさせるような、ポリペプチドをコードする1以上のコドンを置換、削除又は挿入することであってよい。場合によっては、少なくとも1つのアミノ酸を置換し、それ以外のアミノ酸がDR6及び/又はAPPポリペプチドの1以上のドメインにあると変異となる。所望の活性に逆効果を与えることなく、どのアミノ酸残基を挿入、置換又は削除したらよいかの判断は、DR6ポリペプチドの配列を既知の相同なタンパク質の配列と比較し、相同性の高い領域においてはアミノ酸配列の変更数を最小限にすれば指標となる。アミノ酸置換は、1つのアミノ酸を同様の構造及び/又はキメラ特性を有する別のアミノ酸で置き換えること、例えばロイシンをセリンに置き換える、つまり保存的なアミノ酸の置き換えとしてよい。場合によっては、挿入又は削除は約1−5のアミノ酸の範囲で行われる。可能な変異は、配列中のアミノ酸を体系的に挿入、削除又は置換し、DR6及び/又はAPPアンタゴニスト活性に関して結果的に生じる変異を試験することにより決定できる。
ここにDR6及び/又はAPPポリペプチド断片が提供される。そのような断片は、完全長天然タンパク質と比較したとき、例えば、N末端又はC末端で切断されているか、又は内部残基を欠損している。一部の断片は所望のDR6ポリペプチドの生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
DR6及び/又はAPPポリペプチド断片は、多数の従来技術のいずれかにより調製できる。所望のペプチド断片を化学的に合性することができる。別の方法では、酵素消化、例えば特定のアミノ酸残基によって画定される部位においてタンパク質を切断することが知られている酵素を用いてタンパク質を処理すること、又は適切な制限酵素を用いてDNAを消化し、所望の断片を単離することにより、ポリペプチド断片を生成する。また別の適切な技術では、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により所望のポリペプチド断片をコードするDNA断片の単離と増幅を行う。PCRにおいて、DNA断片の所望の終端を画定するオリゴヌクレオチドを5'及び3'プライマーが使用される。
DR6及び/又はAPPポリペプチド断片は、多数の従来技術のいずれかにより調製できる。所望のペプチド断片を化学的に合性することができる。別の方法では、酵素消化、例えば特定のアミノ酸残基によって画定される部位においてタンパク質を切断することが知られている酵素を用いてタンパク質を処理すること、又は適切な制限酵素を用いてDNAを消化し、所望の断片を単離することにより、ポリペプチド断片を生成する。また別の適切な技術では、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により所望のポリペプチド断片をコードするDNA断片の単離と増幅を行う。PCRにおいて、DNA断片の所望の終端を画定するオリゴヌクレオチドを5'及び3'プライマーが使用される。
特定の実施形態における、対象となる保存的置換を以下の表の好ましい置換の欄に示す。このような置換の結果生物学的活性が変化すれば、表の例示的置換の欄に示した置換、又はアミノ酸の分類に関して後述するような置換をさらに導入し、産出物をスクリーニングする。
表
DR6及び/又はAPPポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的な修飾は、(a) 置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はヘリックス構造、(b) 標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は(c) 側鎖の嵩の維持に対して大きく効果を異にする置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる。
(1) 疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2) 中性の親水性:cys, ser, thr;
(3) 酸性:asp, glu;
(4) 塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(5) 鎖配向に影響する残基:gly, pro; 及び
(6) 芳香族:trp, tyr, phe
表
DR6及び/又はAPPポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的な修飾は、(a) 置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はヘリックス構造、(b) 標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は(c) 側鎖の嵩の維持に対して大きく効果を異にする置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる。
(1) 疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2) 中性の親水性:cys, ser, thr;
(3) 酸性:asp, glu;
(4) 塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(5) 鎖配向に影響する残基:gly, pro; 及び
(6) 芳香族:trp, tyr, phe
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。このようにして置換された残基も、保存的置換部位、又はさらに好ましくは残りの(非保存的)部位に挿入することができる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)変異、アラニンスキャンニング、及びPCR変異などの、この分野で知られた方法を用いて行うことができる。部位特異的変異[Carter等, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)]、カセット変異[Wells等, Gene, 34:315 (1985)]、制限選択変異[Wells等, Philos. Trans.R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)]又は他の周知の技術などをクローニングされたDNAに対して行ってDR6ポリペプチド変異DNAを生産することができる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)変異、アラニンスキャンニング、及びPCR変異などの、この分野で知られた方法を用いて行うことができる。部位特異的変異[Carter等, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)]、カセット変異[Wells等, Gene, 34:315 (1985)]、制限選択変異[Wells等, Philos. Trans.R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)]又は他の周知の技術などをクローニングされたDNAに対して行ってDR6ポリペプチド変異DNAを生産することができる。
また、隣接する配列に沿って1つ又は複数のアミノ酸を同定するのに、スキャニングアミノ酸分析も用いることができる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性のアミノ酸である。このようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し、変異体の主鎖高次構造を変える可能性が低いので、これらの群の中の典型的に好適なスキャンニングアミノ酸である[Cunningham及びWells, Science, 244:1081-1085(1989)]。また、アラニンは、最も普通のアミノ酸であるので典型的に好ましい。さらに、隠れた及び露出した位置の両方で頻繁に見いだされる[Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]。アラニン置換が適当な量の変異を生じない場合、アイソテリック(isoteric)なアミノ酸を用いることができる。
また、DR6及び/又はAPPポリペプチドの適当な構造を維持するのに関与しない任意のシステイン残基は、通常、セリンで置換することで、分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐことができる。逆に、システイン結合をDR6及び/又はAPPポリペプチドに付加することにより、その安定性を向上させることができる。
また、DR6及び/又はAPPポリペプチドの適当な構造を維持するのに関与しない任意のシステイン残基は、通常、セリンで置換することで、分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐことができる。逆に、システイン結合をDR6及び/又はAPPポリペプチドに付加することにより、その安定性を向上させることができる。
本願明細書で開示される発明の実施形態は、幅広くさまざまなAPPポリペプチドに適用する。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、APPは図1D−1Dに示す全長695、750又は770APPイソフォームである。本発明の他の実施形態において、APPは、APP外部ドメインを有するAPPのn末端部分を含み、翻訳後のプロセッシングイベントから生成される(例えば、sAPPα又はsAPPβ)。例えば、場合によっては、APPは、分泌酵素による切断の結果として生じる695、750又は770APPイソフォームの一つの可溶型、例えばβ分泌酵素による切断により生じる神経APP695の可溶型を含んでもよい。特定の例示的実施形態において、APPはAPP695のアミノ酸20−591を含む(例えば、Jin等, J. Neurosci., 14(9): 5461-5470 (1994)を参照)。本発明の別の実施形態において、APPはモノクローナル抗体22C11(例えば、Chemicon International Inc., Temecula, CA, U.S.A.より入手可能)により認識されるエピトープを有するポリペプチドを含む。場合によっては、APPは、APP695の22C11エピトープを含む領域である残基66−81を含む(例えば、Hilbrich, J.B.C. Vol. 268, No. 35: 26571-26577 (1993)を参照)。
以下の説明は、主として、DR6ポリペプチドコード化核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによるDR6及び/又はAPPポリペプチドの生産に関する。勿論、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてDR6及び/又はAPPポリペプチドを調製することができると考えられている。例えば、適切なアミノ酸配列、又はその一部分を、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生成してもよい[例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サンフランシスコ, カリフォルニア(1969);Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照]。手動技術を使用することによって又は自動によりインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(フォスター シティー, カリフォルニア)を用いて、製造者の指示によって実施してもよい。DR6及び/又はAPPポリペプチドの種々の部分を別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて所望するDR6及び/又はAPPポリペプチドを生成させてもよい。
開示される方法及び技術は、DR6及び/又はAPP変異体、DR6及び/又はAPP及びDR6及び/又はAPP抗体の修飾形態にも同様に適用可能である。
開示される方法及び技術は、DR6及び/又はAPP変異体、DR6及び/又はAPP及びDR6及び/又はAPP抗体の修飾形態にも同様に適用可能である。
DR6及び/又はAPPポリペプチドをコードするDNAの単離
DR6及び/又はAPPポリペプチドをコードするDNAは、DR6及び/又はAPPポリペプチドmRNAを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリーから得ることができる。従って、ヒトDR6及び/又はAPPポリペプチドDNAは、ヒトの組織から調製されたcDNAライブラリーから簡便に得ることができる。またDR6及び/又はAPPポリペプチド-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法(例えば、自動核酸合成法)により得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(少なくとも約20〜80塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(ニューヨーク: コールド スプリング ハーバー研究所出版, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。DR6ポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法は、PCR法を使用するものである[Sambrook等,上掲;Dieffenbach等, PCR Primer:A Laboratory Manual(コールド スプリング ハーバー研究所出版, 1995)]。
DR6及び/又はAPPポリペプチドをコードするDNAは、DR6及び/又はAPPポリペプチドmRNAを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリーから得ることができる。従って、ヒトDR6及び/又はAPPポリペプチドDNAは、ヒトの組織から調製されたcDNAライブラリーから簡便に得ることができる。またDR6及び/又はAPPポリペプチド-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法(例えば、自動核酸合成法)により得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(少なくとも約20〜80塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(ニューヨーク: コールド スプリング ハーバー研究所出版, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。DR6ポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法は、PCR法を使用するものである[Sambrook等,上掲;Dieffenbach等, PCR Primer:A Laboratory Manual(コールド スプリング ハーバー研究所出版, 1995)]。
cDNAライブラリーをスクリーニングするための技術は、当該分野で良く知られている。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、疑陽性が最小化されるよう十分な長さであり、十分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のDNAとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、32P標識ATPのような放射性標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用を含む。中程度のストリンジェンシー及び高度のストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrook等に示されている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBankらの公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され利用可能となっている他の周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内の又は完全長配列に渡っての(アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの)配列同一性は、当該分野で知られ、ここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、cDNAに逆転写されていないmRNAの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸長法を使用して、選択されたcDNA又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBankらの公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され利用可能となっている他の周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内の又は完全長配列に渡っての(アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの)配列同一性は、当該分野で知られ、ここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、cDNAに逆転写されていないmRNAの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸長法を使用して、選択されたcDNA又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したDR6及び/又はAPPポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に修正された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、pH等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実際の技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び上掲のSambrook等に見出すことができる。
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、CaCl2、CaPO4、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315(1983)及び1989年6月29日公開の国際公開89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4399216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞との細菌プロトプラスト融合、又は例えばポリブレン、ポリオルニチン等のポリカチオンもまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
宿主細胞を、ここに記載したDR6及び/又はAPPポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に修正された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、pH等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実際の技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び上掲のSambrook等に見出すことができる。
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、CaCl2、CaPO4、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315(1983)及び1989年6月29日公開の国際公開89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4399216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞との細菌プロトプラスト融合、又は例えばポリブレン、ポリオルニチン等のポリカチオンもまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
ここに記載のベクターにDNAをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば大腸菌のような腸内細菌科が含まれる。種々の大腸菌株が公に利用可能であり、例えば、大腸菌K12株MM294(ATCC31446);大腸菌X1776(ATCC31537);大腸菌株W3110(ATCC27325)及びK5772(ATCC53635)である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌属、例えば大腸菌(E. coli)、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、1989年4月12日公開のDD266710に記載されたバチルス・リチェニフォルミス41P)、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス、などの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株W3110は、組換えDNA生成物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株W3110を、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異をもたらすように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型tonAを有する大腸菌W3110株1A2;完全な遺伝子型tonA ptr3を有する大腸菌W3110株9E4;完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (argF−lac)169 degP ompT kanrを有する大腸菌W3110株27C7(ATCC 55,244);完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanrを有する大腸菌W3110株37D6;非カナマイシン耐性degP欠失変異を持つ37D6株である大腸菌W3110株40B4;及び1990年8月7日発行の米国特許第4946783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばPCR又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、DR6ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981];1985年5月2日公開の欧州特許第139383号);クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)(米国特許第4943529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991))、例えばクリュイベロミセスラクチス(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983])、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)(ATCC12424)、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC16045)、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)(ATCC24178)、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)(ATCC56500)、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)(ATCC36906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus);ヤロウィア(yarrowia)(欧州特許第402226号);ピシア・パストリス(Pichia pastoris)(欧州特許第183070号; Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]);カンジダ;トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)(欧州特許第244234号);アカパンカビ(Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]);シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公開の欧州特許第394538号);及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(1991年1月10日公開の国際公開91/00357);及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス(Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983];Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983];Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984])及びアスペルギルス・ニガー(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(C1化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピシア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、DR6ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981];1985年5月2日公開の欧州特許第139383号);クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)(米国特許第4943529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991))、例えばクリュイベロミセスラクチス(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983])、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)(ATCC12424)、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC16045)、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)(ATCC24178)、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)(ATCC56500)、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)(ATCC36906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus);ヤロウィア(yarrowia)(欧州特許第402226号);ピシア・パストリス(Pichia pastoris)(欧州特許第183070号; Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]);カンジダ;トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)(欧州特許第244234号);アカパンカビ(Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]);シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公開の欧州特許第394538号);及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(1991年1月10日公開の国際公開91/00357);及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス(Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983];Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983];Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984])及びアスペルギルス・ニガー(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(C1化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピシア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
グリコシル化DR6及び/又はAPPポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物由来のものである。非脊椎動物細胞の例には、植物細胞、例えば綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの細胞培養と同様に、ショウジョウバエS2及びヨトウ(spodoptera)Sf9等の昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及び変異体、及びヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(幼虫(caterpillar))、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウジョウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコ等の宿主に対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。種々のトランスフェクション用のウィルス株、例えばオートグラファ・カルフォルニカ(Autographa californica)NPVのL−1変異株、カイコNPVのBm-5株が公に入手でき、このようなウィルスは、本発明に係るウィルスとして、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養(組織培養)した脊椎動物細胞の増殖がルーチン作業となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、SV40(COS-7,ATCC CRL1651)で形質転換させたサル腎CV1細胞株;ヒト胚芽腎細胞株(293又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された293細胞,Graham等,J.Gen Virol.,36:59(1977));ベビーハムスター腎細胞(BHK,ATCC CCL10);チヤイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO,Urlaub等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251 (1980));サル腎細胞(CV1 ATCC CCL70);アフリカミドリザル腎細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);ヒト頚管腫瘍細胞(HELA,ATCC CCL2);イヌ腎細胞(MDCK,ATCC CCL34);バッファローラット肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL1442);ヒト肺細胞(W138,ATCC CCL75);ヒト肝細胞(Hep G2,HB 8065);マウス乳房腫瘍細胞(MMT 060562,ATCC CCL51);TRI細胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982));MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝臓癌細胞(HepG2)である。
宿主細胞は、DR6及び/又はAPPポリペプチド生成のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養(組織培養)した脊椎動物細胞の増殖がルーチン作業となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、SV40(COS-7,ATCC CRL1651)で形質転換させたサル腎CV1細胞株;ヒト胚芽腎細胞株(293又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された293細胞,Graham等,J.Gen Virol.,36:59(1977));ベビーハムスター腎細胞(BHK,ATCC CCL10);チヤイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO,Urlaub等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251 (1980));サル腎細胞(CV1 ATCC CCL70);アフリカミドリザル腎細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);ヒト頚管腫瘍細胞(HELA,ATCC CCL2);イヌ腎細胞(MDCK,ATCC CCL34);バッファローラット肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL1442);ヒト肺細胞(W138,ATCC CCL75);ヒト肝細胞(Hep G2,HB 8065);マウス乳房腫瘍細胞(MMT 060562,ATCC CCL51);TRI細胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982));MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝臓癌細胞(HepG2)である。
宿主細胞は、DR6及び/又はAPPポリペプチド生成のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
複製可能なベクターの選択及び使用
DR6及び/又はAPPポリペプチドをコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、クローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、DNAはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の1つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
DR6及び/又はAPPは組換え手法によって直接産生されるだけではなく、シグナル配列、あるいは成熟タンパク質ないしポリペプチドのN-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである、異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても産生される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるDR6及び/又はAPPポリペプチド-コード化DNAの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクリュイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5010182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行の欧州特許第362179号)、又は1990年11月15日に公開された国際公開90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
DR6及び/又はAPPポリペプチドをコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、クローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、DNAはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の1つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
DR6及び/又はAPPは組換え手法によって直接産生されるだけではなく、シグナル配列、あるいは成熟タンパク質ないしポリペプチドのN-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである、異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても産生される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるDR6及び/又はAPPポリペプチド-コード化DNAの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクリュイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5010182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行の欧州特許第362179号)、又は1990年11月15日に公開された国際公開90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスについてよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a) アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b) 栄養要求性欠陥を補い、又は(c) 例えばバチルスのD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子などの、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質、をコードする。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a) アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b) 栄養要求性欠陥を補い、又は(c) 例えばバチルスのD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子などの、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質、をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例は、DHFRあるいはチミジンキナーゼのように、DR6及び/又はAPPポリペプチド-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたDHFR活性に欠陥のあるCHO株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である[Stinchcomb等, Nature, 282: 39(1979);Kingsman等, Gene, 7: 141(1979);Tschemper等, Gene, 10: 157(1980)]。trp1遺伝子は、例えば、ATCC番号44076あるいはPEP4-1のようなトリプトファンで成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する[Jones, Genetics, 85:12 (1977)]。
発現及びクローニングベクターは、通常、DR6及び/又はAPPポリペプチド-コード化核酸配列に作用可能に結合し、mRNA合成を方向付けるプロモーターを含む。種々の有能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主との使用に適したプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系[Chang等, Nature, 275:615 (1978);Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)]、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980);欧州特許第36,776号]、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーター[deBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]を含む。細菌系で使用するプロモーターもまたDR6及び/又はAPPポリペプチドをコードするDNAと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
発現及びクローニングベクターは、通常、DR6及び/又はAPPポリペプチド-コード化核酸配列に作用可能に結合し、mRNA合成を方向付けるプロモーターを含む。種々の有能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主との使用に適したプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系[Chang等, Nature, 275:615 (1978);Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)]、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980);欧州特許第36,776号]、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーター[deBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]を含む。細菌系で使用するプロモーターもまたDR6及び/又はAPPポリペプチドをコードするDNAと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主との使用に適したプロモーター配列の例としては、3-ホスホグリセラートキナーゼ[Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)]又は他の糖分解酵素[Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968);Holland, Biochemistry, 17: 4900(1978)]、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第73657号に更に記載されている。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第73657号に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのDR6及び/又はAPPポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開の英国特許第2211504号)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及びサルウィルス40(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及びヒートショックプロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物によるDR6及び/又はAPPポリペプチドをコードするDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約10から300塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するDNAのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、DR6及び/又はAPPポリペプチドコード化配列の5'又は3'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5'位に位置している。
より高等の真核生物によるDR6及び/又はAPPポリペプチドをコードするDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約10から300塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するDNAのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、DR6及び/又はAPPポリペプチドコード化配列の5'又は3'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5'位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの通常は5'、時には3'の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、DR6ポリペプチドをコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのDR6及び/又はAPPポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981);Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979);欧州特許第117060号;及び欧州特許第117058号に記載されている。
組換え脊椎動物細胞培養でのDR6及び/又はAPPポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981);Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979);欧州特許第117060号;及び欧州特許第117058号に記載されている。
宿主細胞の培養
本発明のDR6及び/又はAPPポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のF10(シグマ)、最小必須培地((MEM),シグマ)、RPMI-1640(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4767704号;同4657866号;同4927762号;同4560655号;又は同5122469号;国際公開第90/03430号;国際公開第87/00195号;又は米国特許再発行第30985号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び/又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン(商品名)薬)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
本発明のDR6及び/又はAPPポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のF10(シグマ)、最小必須培地((MEM),シグマ)、RPMI-1640(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4767704号;同4657866号;同4927762号;同4560655号;又は同5122469号;国際公開第90/03430号;国際公開第87/00195号;又は米国特許再発行第30985号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び/又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン(商品名)薬)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
遺伝子増幅/発現の検出
遺伝子の増幅及び/又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)]、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、DNA二本鎖、RNA二本鎖、及びDNA−RNAハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果、表面での二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量化する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び/又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列DR6ポリペプチドに対して、又はここで提供されるDR6配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はDR6 DNAに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
遺伝子の増幅及び/又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)]、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、DNA二本鎖、RNA二本鎖、及びDNA−RNAハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果、表面での二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量化する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び/又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列DR6ポリペプチドに対して、又はここで提供されるDR6配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はDR6 DNAに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
DR6ポリペプチドの精製
DR6及び/又はAPPポリペプチドの様々な形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)を用いて又は酵素的切断により膜から引き離すことができる。DR6ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
DR6及び/又はAPPポリペプチドは、組換え細胞タンパク質又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される:すなわち、イオン交換カラムでの分画;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEによるクロマトグラフィ;クロマトフォーカシング;SDS-PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばセファデックスG-75を用いるゲル濾過;IgGのような汚染物を除くプロテインAセファロースカラム;及びDR6及び/又はAPPポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990);Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, ニューヨーク (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生成方法及び特に生成される特定のDR6ポリペプチドの性質に依存する。
DR6及び/又はAPPポリペプチドの様々な形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)を用いて又は酵素的切断により膜から引き離すことができる。DR6ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
DR6及び/又はAPPポリペプチドは、組換え細胞タンパク質又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される:すなわち、イオン交換カラムでの分画;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEによるクロマトグラフィ;クロマトフォーカシング;SDS-PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばセファデックスG-75を用いるゲル濾過;IgGのような汚染物を除くプロテインAセファロースカラム;及びDR6及び/又はAPPポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990);Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, ニューヨーク (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生成方法及び特に生成される特定のDR6ポリペプチドの性質に依存する。
DR6及び/又はAPPの可溶性型を本方法においてDR6アンタゴニストとして使用することができる。このようなDR6及び/又はAPPの可溶性型は、以下に示すような変形を含む(イムノグロブリン、エピトープタグ又はロイシンジッパーへの融合によるものなど)。イムノアドヘシン分子は、ここに開示の方法におけるさらなる使用が考慮される。DR6及び/又はAPPイムノアドヘシンは、完全長ポリペプチド、並びにDR6及び/又はAPPの可溶性の、細胞外ドメイン型又はその断片のような、DR6及び/又はAPPの様々な形体を含んでもよい。ある実施態様において、分子は、DR6及び/又はAPPポリペプチドと免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含んでもよい。イムノアドヘシンの二価の形体に対して、そのような融合は、IgG分子のFc領域に対して行われてもよい。Ig融合は、好適には、Ig分子の少なくとも1の可変領域に代えて、ポリペプチドの可溶性型(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化型)で置換することを含む。特に好適な実施態様において、イムノグロブリンの融合は、IgG1分子のヒンジ、CH2及びCH3、又はヒンジ、CH1、CH2及びCH3領域を含む。イムノグロブリン融合体の生産については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号、及びChamow等, TIBTECH, 14:52-60(1996)も参照のこと。
随意的なイムノアドヘシン設計は、アドヘシン(例えばDR6及び/又はAPP外部ドメイン)の結合ドメインと免疫グロブリン重鎖のFc領域を組み合わせる。通常、本発明のイムノアドヘシンを調整する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸をC末端でイムノグロブリン定常ドメイン配列のN末端をコードする核酸に融合させるが、N末端融合は不可能である。
随意的なイムノアドヘシン設計は、アドヘシン(例えばDR6及び/又はAPP外部ドメイン)の結合ドメインと免疫グロブリン重鎖のFc領域を組み合わせる。通常、本発明のイムノアドヘシンを調整する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸をC末端でイムノグロブリン定常ドメイン配列のN末端をコードする核酸に融合させるが、N末端融合は不可能である。
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、CH2及びCH3ドメインを保持する。融合はまた定常ドメインのFc領域のC末端、又は重鎖のCH1又は軽鎖の対応する領域にN末端に直ぐになされる。融合がなされる正確な部位は重要なものではない;特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択されうる。
好ましい実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンG1(IgG1)のFc領域のN末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、IgGのFcを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を114として残基216)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はIgG重鎖の(a)ヒンジ領域及びCH2及びCH3又は(b)CH1、ヒンジ、CH2及びCH3ドメインに融合される。
好ましい実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンG1(IgG1)のFc領域のN末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、IgGのFcを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を114として残基216)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はIgG重鎖の(a)ヒンジ領域及びCH2及びCH3又は(b)CH1、ヒンジ、CH2及びCH3ドメインに融合される。
二重特異的イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として組み立てられる。一般には、これらの組み立てられた免疫グロブリンは既知の単位構造を有している。基本的な四鎖構造単位はIgG、IgD及びIgEが存在する型である。四鎖単位はより高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される;IgMは一般にジスルフィド結合によって一緒に保持される四つの基本単位の五量体として存在する。IgAグロブリン、そして時折IgGグロブリンが血清中に多量体型で存在しうる。多量体の場合、四つの単位の各々は同じでも異なっていてもよい。
ここに記載した範囲内の様々な組み立てられたイムノアドヘシンの例は以下に概略的に模式化される:
(a) ACL-ACL;
(b) ACH-(ACH, ACL-ACH, ACL-VHCH, 又はVLCL-ACH);
(c) ACL-ACH-(ACL-ACH, ACL-VHCH, VLCL-ACH, 又はVLCL-VHCH);
(d) ACL-VHCH-(ACH, 又はACL-VHCH, 又はVLCL-ACH);
(e) VLCL-ACH-(ACL-VHCH, 又はVLCL-ACH);及び
(f) (A-Y)n-(VLCL-VHCH)2;
ここで、各Aは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し;
VLは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CHは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり;
nは1より大きい整数であり;
Yは共有結合架橋剤の残基を示す。
ここに記載した範囲内の様々な組み立てられたイムノアドヘシンの例は以下に概略的に模式化される:
(a) ACL-ACL;
(b) ACH-(ACH, ACL-ACH, ACL-VHCH, 又はVLCL-ACH);
(c) ACL-ACH-(ACL-ACH, ACL-VHCH, VLCL-ACH, 又はVLCL-VHCH);
(d) ACL-VHCH-(ACH, 又はACL-VHCH, 又はVLCL-ACH);
(e) VLCL-ACH-(ACL-VHCH, 又はVLCL-ACH);及び
(f) (A-Y)n-(VLCL-VHCH)2;
ここで、各Aは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し;
VLは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり;
VHは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり;
CLは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり;
CHは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり;
nは1より大きい整数であり;
Yは共有結合架橋剤の残基を示す。
簡略化のため、先の構造はキーとなる特徴を示しているのみである;これらは、免疫グロブリンの結合する(J)又は他のドメインを示していないしジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の3'末端に、ヒンジとCH2ドメインの間、又はCH2とCH3ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等, Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の3'末端に、ヒンジとCH2ドメインの間、又はCH2とCH3ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等, Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするDNAと同時発現される。分泌時にハイブリッドの重鎖及び軽鎖が共有結合的に結合されて、2つのジスルフィド結合で結合した免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば1989年3月28日に発行された米国特許第4,816,567号に開示されている。
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンcDNA配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするcDNA配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等,Cell61:1303-1313(1990);及びStamenkovic等,Cell66:1133-1144(1991)を参照されたい)。融合の後者のタイプは、発現に対してIg調節配列の存在を必要とする。IgG重鎖定常領域をコードするcDNAは、脾臓又は末梢血リンパ球から取り出されたcDNAライブラリーからの公開されている配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応(PCR)法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするcDNAとイムノアドヘシンの免疫グロブリンが、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムに挿入される。
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンcDNA配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするcDNA配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等,Cell61:1303-1313(1990);及びStamenkovic等,Cell66:1133-1144(1991)を参照されたい)。融合の後者のタイプは、発現に対してIg調節配列の存在を必要とする。IgG重鎖定常領域をコードするcDNAは、脾臓又は末梢血リンパ球から取り出されたcDNAライブラリーからの公開されている配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応(PCR)法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするcDNAとイムノアドヘシンの免疫グロブリンが、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムに挿入される。
他の実施態様において、DR6アンタゴニストは、米国特許第4,640,835号;第4,496,689号;第4,301,144号;第4,670,417号;第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法で、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのうち一つに、又はポリグルタミン酸のような同様の分子に、ポリペプチドを連結させることにより共有結合的に修飾される。このようなペグ化形態は当該技術分野において既知の方法を用いて調製してもよい。
また、これらの分子のロイシンジッパー形態も本発明によって考慮される。「ロイシンジッパー」は当該技術分野において、その融合相手(例えば、ロイシンジッパーが融合するか、又は連結する配列又は分子)の二量体化又は三量体化を増強し、促進し、又は引き起こすロイシンに富む配列のことを意味するために使用される語句である。様々なロイシンジッパーポリペプチドは当該分野において記述されている。例えば、Landschulz等, Science 240:1759 (1988);米国特許第5,716,805号;国際公開公報94/10308;Hoppe等, FEBS Letters 344:1991 (1994);Maniateis等, Nature, 341:24 (1989);Maniatis等, Nature 341:24 (1989)を参照されたい。当業者であれば、ロイシンジッパー配列をDR6分子の5'末端又は3'末端に融合しうることは理解するであろう。
また、これらの分子のロイシンジッパー形態も本発明によって考慮される。「ロイシンジッパー」は当該技術分野において、その融合相手(例えば、ロイシンジッパーが融合するか、又は連結する配列又は分子)の二量体化又は三量体化を増強し、促進し、又は引き起こすロイシンに富む配列のことを意味するために使用される語句である。様々なロイシンジッパーポリペプチドは当該分野において記述されている。例えば、Landschulz等, Science 240:1759 (1988);米国特許第5,716,805号;国際公開公報94/10308;Hoppe等, FEBS Letters 344:1991 (1994);Maniateis等, Nature, 341:24 (1989);Maniatis等, Nature 341:24 (1989)を参照されたい。当業者であれば、ロイシンジッパー配列をDR6分子の5'末端又は3'末端に融合しうることは理解するであろう。
また、本発明のDR6及び/又はAPPポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に該ポリペプチドを融合することによりキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。好ましくは、そのような異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列は、キメラ分子をオリゴマー化するように作用するものである。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと本発明のDR6及び/又はAPPポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には本発明のポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってWISPポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン(poly-his)又はポリ−ヒスチジン−グリシン(poly-his-gly)タグ;flu HAタグポリペプチド及びその抗体12CA5[Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)];c-mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)];及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)];KT3エピトープペプチド[Martin等, Science, 255:192-194 (1992)];α-チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)];及びT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad
. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]を含む。
. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]を含む。
抗DR6及び抗APP抗体
本発明の他の実施形態において、DR6及び/又はAPP抗体が提供される。例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びヘテロコンジュゲート抗体を含む。これらの抗DR6及び/又はAPP抗体は、好ましくはDR6アンタゴニスト抗体である。
本発明の他の実施形態において、DR6及び/又はAPP抗体が提供される。例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びヘテロコンジュゲート抗体を含む。これらの抗DR6及び/又はAPP抗体は、好ましくはDR6アンタゴニスト抗体である。
ポリクローナル抗体
本発明の抗体はポリクローナル抗体を含んでよい。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び/又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、DR6及び/又はAPPポリペプチド(例えば、DR6及び/又はAPP ECD)又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に結合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例には、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコルは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。次いで、哺乳動物から採血し、血清のアッセイによりDR6及び/又はAPP抗体価を求めることができる。必要に応じて、抗体かが増大又は安定するまで哺乳動物を免疫追加することができる。
本発明の抗体はポリクローナル抗体を含んでよい。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び/又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、DR6及び/又はAPPポリペプチド(例えば、DR6及び/又はAPP ECD)又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に結合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例には、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコルは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。次いで、哺乳動物から採血し、血清のアッセイによりDR6及び/又はAPP抗体価を求めることができる。必要に応じて、抗体かが増大又は安定するまで哺乳動物を免疫追加することができる。
モノクローナル抗体
あるいは、本発明の抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫剤は、典型的には対象とするDR6及び/又はAPPポリペプチド(例えば、DR6及び/又はAPP ECD)又はその融合タンパク質、例えばDR6 ECD−IgG及び/又はAPP sAPP−IgG融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBL」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は増殖を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「HAT培地」)、この物質がHGPRT欠乏性細胞の増殖を阻止する。
あるいは、本発明の抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫剤は、典型的には対象とするDR6及び/又はAPPポリペプチド(例えば、DR6及び/又はAPP ECD)又はその融合タンパク質、例えばDR6 ECD−IgG及び/又はAPP sAPP−IgG融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBL」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は増殖を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「HAT培地」)、この物質がHGPRT欠乏性細胞の増殖を阻止する。
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、HAT培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。そのようなマウス骨髄腫細胞株の一例は、P3X63Ag8U.1(ATCC CRL 1580)である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている[Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク, (1987) pp. 51-63]。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、DR6及び/又はAPPに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって、又はBiaCore分析によって、測定することができる。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、DR6及び/又はAPPに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって、又はBiaCore分析によって、測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる[Goding, 上掲]。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地又はRPMI-1640倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として増殖させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィ等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィ等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
また、モノクローナル抗体は、組換えDNA法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、常套的な方法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、DNAは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、DNAは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより[Morrison等, Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984)]、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このようにして、ここに開示される抗DR6モノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体が調製される。
このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、DR6の特異性を持つ1つの抗原結合部位、及び異なる抗原に対する特異性を持つ部位を有するキメラ性二価抗体を生成する。
このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、DR6の特異性を持つ1つの抗原結合部位、及び異なる抗原に対する特異性を持つ部位を有するキメラ性二価抗体を生成する。
キメラ又はハイブリッド抗体も、架橋剤を用いる合成タンパク質化学における既知の方法を用いてインビトロで調製できる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いることにより、又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を構築できる。この目的のための適切な試薬の例は、イミノチオラート及びメチル-4-メルカプトブチルイミダートである。
一本鎖Fv断片を、Iliades等, FEBS Letters, 409:437-441 (1997)に記載に従って生産できる。様々なリンカーを使用したこのような一本鎖断片の結合は、Kortt等, Protein Engineering, 10:423-433 (1997)に開示されている。抗体の組換え生産及び操作の様々な技術が当技術分野において既知である。当業者によって利用されるそのような技術の例示的実施例を以下に詳述する。
一本鎖Fv断片を、Iliades等, FEBS Letters, 409:437-441 (1997)に記載に従って生産できる。様々なリンカーを使用したこのような一本鎖断片の結合は、Kortt等, Protein Engineering, 10:423-433 (1997)に開示されている。抗体の組換え生産及び操作の様々な技術が当技術分野において既知である。当業者によって利用されるそのような技術の例示的実施例を以下に詳述する。
ヒト化抗体
一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、基本的に、ウィンター(Winter)及び共同研究者(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従って、齧歯類CDR又はCDR配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。
よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのCDR残基及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、FR残基をコンセンサス及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、CDR残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、基本的に、ウィンター(Winter)及び共同研究者(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従って、齧歯類CDR又はCDR配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。
よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのCDR残基及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、FR残基をコンセンサス及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、CDR残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ヒト抗体
ヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法により作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の生成のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫の細胞系は、例えば、Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984), 及びBrodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク, 1987)に記載されている。
内在性の免疫グロブリン産生がない状態で、免疫化によりヒト抗体のレパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが現在では可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の移入は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993);Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)を参照のこと。
ヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法により作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の生成のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫の細胞系は、例えば、Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984), 及びBrodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク, 1987)に記載されている。
内在性の免疫グロブリン産生がない状態で、免疫化によりヒト抗体のレパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが現在では可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の移入は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993);Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)を参照のこと。
Mendez等(Nature Genetics 15: 146-156 [1997年])はこの技術をさらに改良し、抗原を投与すると親和性の高い完全ヒト抗体を生成する「ゼノマウスII(Xenomouse II)」と称する系列のトランスジェニックマウスを生成した。これは、上述のように、内因性JHセグメントに欠陥を有するマウスに、メガベースのヒト重鎖遺伝子座及び軽鎖遺伝子座を生殖系に統合組み込みすることにより達成された。ゼノマウスIIは、約66VH遺伝子、完全なDH及びJH領域及び3つの異なる定常領域(μ、δ及びχ)を含む1,020kbのヒト重鎖遺伝子座を有し、また32Vκ遺伝子、Jκセグメント及びCκ遺伝子を含む800kbのヒトκ遺伝子座を有する。これらのマウスに生成された抗体は、遺伝子再配列、構成、及びレパートリーを含め、ヒトに見られる抗体に全ての面で非常に類似している。ヒト抗体は、好ましくは、マウス座における遺伝子再配列を抑制する内因性JHセグメントの欠損により、内因性抗体全体にわたって発現する。
別法として、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348:552-553, 1990)を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(V)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を生産させることができる。この技術によれば、抗体Vドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばM13又はfdの、メジャー又はマイナーコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択によっても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはB細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる;例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993)を参照せよ。V-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clackson等, Nature, 352:624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のV遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのV遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12:725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。自然な免疫応答において、抗体遺伝子は高い率で突然変異を蓄積する(体細胞過剰変異)。導入された変化の一部は高い親和性を提供し、親和性の高い表面免疫グロブリンを示すB細胞は、その後の抗原曝露の間に優先的に複製され、分化される。このような自然の工程を、「チェーンシャフリング」として知られる技術(Marks等, Bio/Technol. 10, 779-783, 1992)を使用することにより模倣することができる。この方法では、重鎖V領域遺伝子と軽鎖V領域遺伝子を、順に、非免疫化ドナーから取得したVドメイン遺伝子の自然に生じる変異体(レパートリー)のレパートリーで置換することにより、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性を改善することができる。この技術により、nM範囲での親和性を有する抗体及び抗体断片の生産が可能である。非常に大きなファージ抗体のレパートリー(「マザーオブオール ライブラリー(the Mother-of-all libraries)」とも呼ばれる)を作る方法が、WaterhouseらによるNucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993)に開示されている。また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が元になっている齧歯類の抗体と類似した親和性及び特性を有している場合、齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」と呼ばれるこの方法により、ファージディスプレイ技術により得られた齧歯類抗体の重鎖Vドメイン遺伝子と軽鎖Vドメイン遺伝子をヒトVドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、齧歯類−ヒトキメラを作成する。抗原を選択することにより、機能的抗原結合部位を回復することができるヒト可変部が単離される、つまり、エピトープがパートナーの選択をつかさどる(インプリントする)。残りの齧歯類Vドメインを置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる(1993年4月1日公開のPCT特許出願国際公開公報93/06213を参照)。伝統的なCDR移植による齧歯類抗体のヒト化と異なり、この技術により、齧歯類起源のフレームワーク又はCDR残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
下記に詳述するように、本発明の抗体は、状況に応じて、一量体抗体、二量体抗体、ならびに抗体の多価形態を含んでよい。当業者は、当分野で既知の技術により、ここに開示されるDR6及び/又はAPP抗体を用いて、そのような二量体又は多価形態を構築することができる。一価抗体を調製する方法もまた、当技術分野で周知である。例えば、一方法では、免疫グロブリン軽鎖と修飾された重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般にFc領域の任意の点で切断され、重鎖の架橋が形成されることが防止される。あるいは、関連するシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換するか、又は削除し、よって架橋結合を防止する。
別法として、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348:552-553, 1990)を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(V)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を生産させることができる。この技術によれば、抗体Vドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばM13又はfdの、メジャー又はマイナーコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択によっても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはB細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる;例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993)を参照せよ。V-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clackson等, Nature, 352:624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のV遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのV遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12:725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。自然な免疫応答において、抗体遺伝子は高い率で突然変異を蓄積する(体細胞過剰変異)。導入された変化の一部は高い親和性を提供し、親和性の高い表面免疫グロブリンを示すB細胞は、その後の抗原曝露の間に優先的に複製され、分化される。このような自然の工程を、「チェーンシャフリング」として知られる技術(Marks等, Bio/Technol. 10, 779-783, 1992)を使用することにより模倣することができる。この方法では、重鎖V領域遺伝子と軽鎖V領域遺伝子を、順に、非免疫化ドナーから取得したVドメイン遺伝子の自然に生じる変異体(レパートリー)のレパートリーで置換することにより、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性を改善することができる。この技術により、nM範囲での親和性を有する抗体及び抗体断片の生産が可能である。非常に大きなファージ抗体のレパートリー(「マザーオブオール ライブラリー(the Mother-of-all libraries)」とも呼ばれる)を作る方法が、WaterhouseらによるNucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993)に開示されている。また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が元になっている齧歯類の抗体と類似した親和性及び特性を有している場合、齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」と呼ばれるこの方法により、ファージディスプレイ技術により得られた齧歯類抗体の重鎖Vドメイン遺伝子と軽鎖Vドメイン遺伝子をヒトVドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、齧歯類−ヒトキメラを作成する。抗原を選択することにより、機能的抗原結合部位を回復することができるヒト可変部が単離される、つまり、エピトープがパートナーの選択をつかさどる(インプリントする)。残りの齧歯類Vドメインを置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる(1993年4月1日公開のPCT特許出願国際公開公報93/06213を参照)。伝統的なCDR移植による齧歯類抗体のヒト化と異なり、この技術により、齧歯類起源のフレームワーク又はCDR残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
下記に詳述するように、本発明の抗体は、状況に応じて、一量体抗体、二量体抗体、ならびに抗体の多価形態を含んでよい。当業者は、当分野で既知の技術により、ここに開示されるDR6及び/又はAPP抗体を用いて、そのような二量体又は多価形態を構築することができる。一価抗体を調製する方法もまた、当技術分野で周知である。例えば、一方法では、免疫グロブリン軽鎖と修飾された重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般にFc領域の任意の点で切断され、重鎖の架橋が形成されることが防止される。あるいは、関連するシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換するか、又は削除し、よって架橋結合を防止する。
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合、結合特異性の一方はDR6レセプターに対してであり、他方は他の任意の抗原に対して、好ましくは別のレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。例えば、WISP-1又はWISP-1変異体及び別のCNNファミリーメンバー(例えばWISP-2、WISP-3、CTGF、Cyr61、又はNov)に特異的に結合する二重特異性抗体は、本発明に含まれる。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の発現に基づく。Millstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィ工程によって通常達成されるが、幾分扱いにくく、生産性が低い。同様の手順が1993年5月13日公開の国際公開公報93/08829、及びTraunecker等, EMBO,10:3655-3659 (1991)に開示されている。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合、結合特異性の一方はDR6レセプターに対してであり、他方は他の任意の抗原に対して、好ましくは別のレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。例えば、WISP-1又はWISP-1変異体及び別のCNNファミリーメンバー(例えばWISP-2、WISP-3、CTGF、Cyr61、又はNov)に特異的に結合する二重特異性抗体は、本発明に含まれる。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の発現に基づく。Millstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィ工程によって通常達成されるが、幾分扱いにくく、生産性が低い。同様の手順が1993年5月13日公開の国際公開公報93/08829、及びTraunecker等, EMBO,10:3655-3659 (1991)に開示されている。
さらに好ましい別の方法により、所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、CH2及びCH3領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコード化するDNA、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、組立に使用される3つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所最適な収率をもたらす実施態様において、3つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性がもたらされる。しかし、少なくとも2つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、2又は3個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を1つの発現ベクターに挿入することが可能である。この手法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、1994年3月3日公開の国際公開公報94/04690に開示されている。
二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
ヘテロ抱合抗体
ヘテロ抱合抗体も本発明の範囲に含まれる。ヘテロ抱合抗体は、2つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第4,676,980号)及びHIV感染の治療のために(国際公開公報91/00360;国際公開公報92/200373;欧州特許第03089号)提案されている。ヘテロ抱合抗体は、任意の簡便な架橋法を使用して、調製することができる。適切な架橋剤は当技術分野において既知であり、複数の架橋技術と共に、米国特許第4,676,980号に開示されている。
ヘテロ抱合抗体も本発明の範囲に含まれる。ヘテロ抱合抗体は、2つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第4,676,980号)及びHIV感染の治療のために(国際公開公報91/00360;国際公開公報92/200373;欧州特許第03089号)提案されている。ヘテロ抱合抗体は、任意の簡便な架橋法を使用して、調製することができる。適切な架橋剤は当技術分野において既知であり、複数の架橋技術と共に、米国特許第4,676,980号に開示されている。
抗体断片
一部の実施態様においては、抗DR6及び/又はAPP抗体(マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び抗体変異体を含む)は抗体断片である。抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されている(例えば、Morimoto等, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')2断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他の実施態様では、ロイシンジッパーGCN4を使用してF(ab')2を形成し、F(ab')2分子の構築を促進する。別の実施態様では、組換え宿主細胞の培地からFv、Fab又はF(ab')2断片を直接分離することができる。抗体断片を生産するための他の技術は当業者には明らかである。例えば、パパインを使用して消化を行うことができる。パパイン消化の例は、1994年12月22日公開の国際公開公報94/29348及び米国特許第4342566号に開示されている。抗体のパパイン消化は、通常、Fab断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片を生成する。各Fab断片は単一の抗原結合部位、及び残存性Fc断片を持つ。ペプシン処理により、2つ抗原結合部位を持ち、抗原に架橋結合する能力のあるF(ab')2が生成される。
抗原消化で生成されるFab断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン(CH1)も含む。Fab’断片は、それに加えて、抗原ヒンジ領域由来の1以上のシステインを含む重鎖のCH1ドメインのカルボキシ末端に少数の残基を持つ点においてFab断片と異なる。本発明では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つFab'として、ここではFab'-SHと記載する。F(ab')2抗体断片は、もともとそれらの間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生成されたものである。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
一部の実施態様においては、抗DR6及び/又はAPP抗体(マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び抗体変異体を含む)は抗体断片である。抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されている(例えば、Morimoto等, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')2断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他の実施態様では、ロイシンジッパーGCN4を使用してF(ab')2を形成し、F(ab')2分子の構築を促進する。別の実施態様では、組換え宿主細胞の培地からFv、Fab又はF(ab')2断片を直接分離することができる。抗体断片を生産するための他の技術は当業者には明らかである。例えば、パパインを使用して消化を行うことができる。パパイン消化の例は、1994年12月22日公開の国際公開公報94/29348及び米国特許第4342566号に開示されている。抗体のパパイン消化は、通常、Fab断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片を生成する。各Fab断片は単一の抗原結合部位、及び残存性Fc断片を持つ。ペプシン処理により、2つ抗原結合部位を持ち、抗原に架橋結合する能力のあるF(ab')2が生成される。
抗原消化で生成されるFab断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン(CH1)も含む。Fab’断片は、それに加えて、抗原ヒンジ領域由来の1以上のシステインを含む重鎖のCH1ドメインのカルボキシ末端に少数の残基を持つ点においてFab断片と異なる。本発明では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つFab'として、ここではFab'-SHと記載する。F(ab')2抗体断片は、もともとそれらの間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生成されたものである。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
抗体のグリコシル化変異体
抗体をその定常領域の保存位置でグリコシル化する(Jefferis及びLund, Chem. Immunol. 65:111-128, 1997年; Wright及びMorrison, TibTECH 15:26-32, 1997)。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能(Boyd他., Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996年; Wittwe及びHoward, Biochem. 29:4175-4180, 1990)、及び、糖タンパク質の高次構造及び提示される三次元表面に影響しうる糖タンパク質の部分同士の分子内相互作用(Hefferis及びLund, 上掲; Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416, 1996)に作用する。オリゴ糖はまた、特異的な認識構造に基づいて任意の糖タンパク質を特定の分子に標的化するのに役立つ。例えば、アガラクトシル化IgGにおいて、オリゴ糖部分はCH2内空間の外に「とび出し(flip)」、末端N−アセチルグリコサミン残基がマンノース結合タンパク質に結合できるようになることが報告されている(Malhotra等, Nature Med. 1:237-243, 1995)。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において、オリゴ糖のグリコペプチダーゼによるCAMPATH-1H(ヒトリンパ球のCDw52抗原を認識する組換えヒト化マウスモノクローナルIgG1抗体)からの除去を実行した結果、補体媒介性溶解(CMCL)が完全に低減したが(Boyd等, Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996)、ノイラミニダーゼを使用してシアル酸残基を選択的に除去した結果、DMCLの低減は見られなかった。抗体のグリコシル化はまた、抗体依存性の細胞の細胞障害性(ADCC)に影響することが報告されている。特に、バイセクティングGlcNAcの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼである、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII)のテトラサイクリン制御発現を持つCHO細胞で、ADCC活性が向上したことが報告されている(Umana等, Mature Biotech. 17:176-180, 1999)。
抗体のグリコシル化変異体は、抗体のグリコシル化のパターンが変更された変異体である。変更するとは、抗体に見られる1以上の炭水化物部分を除去し、抗体に1以上の炭水化物部分を加え、グリコシル化の組成(グリコシル化パターン)、グリコシル化の範囲、その他を変更することを意味する。グリコシル化変異体は、例えば、抗体をコードする核酸配列について、1以上のグリコシル化部位の、除去、変更、及び/又は付加を行うことにより調製することができる。
抗体をその定常領域の保存位置でグリコシル化する(Jefferis及びLund, Chem. Immunol. 65:111-128, 1997年; Wright及びMorrison, TibTECH 15:26-32, 1997)。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能(Boyd他., Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996年; Wittwe及びHoward, Biochem. 29:4175-4180, 1990)、及び、糖タンパク質の高次構造及び提示される三次元表面に影響しうる糖タンパク質の部分同士の分子内相互作用(Hefferis及びLund, 上掲; Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416, 1996)に作用する。オリゴ糖はまた、特異的な認識構造に基づいて任意の糖タンパク質を特定の分子に標的化するのに役立つ。例えば、アガラクトシル化IgGにおいて、オリゴ糖部分はCH2内空間の外に「とび出し(flip)」、末端N−アセチルグリコサミン残基がマンノース結合タンパク質に結合できるようになることが報告されている(Malhotra等, Nature Med. 1:237-243, 1995)。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において、オリゴ糖のグリコペプチダーゼによるCAMPATH-1H(ヒトリンパ球のCDw52抗原を認識する組換えヒト化マウスモノクローナルIgG1抗体)からの除去を実行した結果、補体媒介性溶解(CMCL)が完全に低減したが(Boyd等, Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996)、ノイラミニダーゼを使用してシアル酸残基を選択的に除去した結果、DMCLの低減は見られなかった。抗体のグリコシル化はまた、抗体依存性の細胞の細胞障害性(ADCC)に影響することが報告されている。特に、バイセクティングGlcNAcの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼである、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII)のテトラサイクリン制御発現を持つCHO細胞で、ADCC活性が向上したことが報告されている(Umana等, Mature Biotech. 17:176-180, 1999)。
抗体のグリコシル化変異体は、抗体のグリコシル化のパターンが変更された変異体である。変更するとは、抗体に見られる1以上の炭水化物部分を除去し、抗体に1以上の炭水化物部分を加え、グリコシル化の組成(グリコシル化パターン)、グリコシル化の範囲、その他を変更することを意味する。グリコシル化変異体は、例えば、抗体をコードする核酸配列について、1以上のグリコシル化部位の、除去、変更、及び/又は付加を行うことにより調製することができる。
抗体のグリコシル化は、通常、N−結合かO−結合である。N−結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物成分の付与を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−X−セリン及びアスパラギン−X−スレオニン(ここで、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸)は、炭水化物成分のアスパラギン側鎖への酵素的付与の認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的グリコシル化部位が創造される。O−結合のグリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの、N−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの糖類のうち1つの付着を指す。5−ヒロドキシプロリン、又は5−ヒドロキシリジンを使用してもよい。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、(N−結合グリコシル化部位について)上述のトリペプチド配列の1又は複数を有するようにアミノ酸配列を変更することにより常套的に達成される。変更は、また、(O−結合グリコシル化部位について)元の抗体の配列に対して1以上のセリン又はスレオニン残基を付加又は置換することにより行ってもよい。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、(N−結合グリコシル化部位について)上述のトリペプチド配列の1又は複数を有するようにアミノ酸配列を変更することにより常套的に達成される。変更は、また、(O−結合グリコシル化部位について)元の抗体の配列に対して1以上のセリン又はスレオニン残基を付加又は置換することにより行ってもよい。
抗体のグリコシル化(グリコシル化パターンを含む)は、内在するヌクレオチド配列を変更することなく変更可能である。グリコシル化は抗体を発現するために使用される宿主細胞に大きく依存する。潜在的治療剤として、抗体などの組換え糖タンパク質の発現に使用される細胞の種類が、まれに天然の細胞であることから、抗体のグリコシル化パターンは大きく変化することが予想される(例えばHse等, J. Biol. Chem. 272:9062-9070, 1997年参照)。宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生の間のグリコシル化に影響を与える因子には、増殖形態、媒地組成、培養密度、酸素添加、pH、精製スキームなどが含まれる。オリゴ等製造に関わるある種の酵素の導入又は過剰発現を含む、特定の宿主生物においてなされたグリコシル化パターンを変えるための様々な方法が提案されている(米国特許第5047335号、米国特許第5510261号及び米国特許第5278299号)。グリコシル化、又は特定の種類のグリコシル化は、例えばエンドグリコシダーゼH(Endo H)の使用により、糖タンパク質から酵素学的に除去することができる。加えて、組換え宿主細胞を遺伝学的に設計することができ、例えば多糖類の特定種のプロセシングにおいて欠損をつくることができる。これら同様の技術は当技術分野において既知である。
抗体のグリコシル化構造は、レクチンクロマトグラフィ、NMR、質量分析、HPLC、GPC、単糖成分分析、連続酵素消化、及び高pHアニオン交換クロマトグラフィを使用して電荷に基づきオリゴ糖を分離するHPAEC-PADなどの、炭水化物分析を行う従来技術により容易に分析できる。分析的な目的のためにオリゴ糖を遊離させる方法も知られており、それらには、限定はしないが、酵素的処理(通常ペプチド−N−グリコシダーゼ F/エンド−β−ガラクトシダーゼを使用して行う)、主にO−結合構造を遊離するための強アルカリ環境を使用しての除去、及びN−結合とO−結合両方のオリゴ糖を遊離させるための無水ヒドラジンを使用する化学的方法が含まれる。
抗体のグリコシル化構造は、レクチンクロマトグラフィ、NMR、質量分析、HPLC、GPC、単糖成分分析、連続酵素消化、及び高pHアニオン交換クロマトグラフィを使用して電荷に基づきオリゴ糖を分離するHPAEC-PADなどの、炭水化物分析を行う従来技術により容易に分析できる。分析的な目的のためにオリゴ糖を遊離させる方法も知られており、それらには、限定はしないが、酵素的処理(通常ペプチド−N−グリコシダーゼ F/エンド−β−ガラクトシダーゼを使用して行う)、主にO−結合構造を遊離するための強アルカリ環境を使用しての除去、及びN−結合とO−結合両方のオリゴ糖を遊離させるための無水ヒドラジンを使用する化学的方法が含まれる。
例示的抗体
下の実施例に記載のとおり、抗DR6モノクローナル抗体が同定された。任意の実施形態において、本発明のDR6抗体は、本明細書で特に開示された抗DR6及び/又はAPP抗体の何れかと同じ生物学的特性を有する。
「生物学的特性」なる用語は、DR6に特異的に結合する能力又はDR6活性を遮断、抑制又は中和化する能力等の、モノクローナル抗体のインビトロ及び/又はインビボ活性又は特性を指すために使用される。DR6及び/又はAPP抗体の特性及び活性化は、下の実施例において更に記載される。
場合によっては、本発明のモノクローナル抗体は、下の実施例で具体的に特徴づけられた抗体の何れかと同じ生物学的特性を有し、及び/又はこれらの抗体と同じエピトープに結合する。これは、本明細書及び実施例に記載したようなさまざまなアッセイによって測定することができる。例えば、モノクローナル抗体が特に本明細書で言及したDR6及び/又はAPP抗体と同じ特異性を有するかどうかを測定するために、競合的結合アッセイでその活性を比較することができる。加えて、特定の抗DR6及び/又はAPP抗体が結合するエピトープは、問題のDR6及び/又はAPPと抗体との間の複合体の結晶学的研究によって測定することができる。
下の実施例に記載のとおり、抗DR6モノクローナル抗体が同定された。任意の実施形態において、本発明のDR6抗体は、本明細書で特に開示された抗DR6及び/又はAPP抗体の何れかと同じ生物学的特性を有する。
「生物学的特性」なる用語は、DR6に特異的に結合する能力又はDR6活性を遮断、抑制又は中和化する能力等の、モノクローナル抗体のインビトロ及び/又はインビボ活性又は特性を指すために使用される。DR6及び/又はAPP抗体の特性及び活性化は、下の実施例において更に記載される。
場合によっては、本発明のモノクローナル抗体は、下の実施例で具体的に特徴づけられた抗体の何れかと同じ生物学的特性を有し、及び/又はこれらの抗体と同じエピトープに結合する。これは、本明細書及び実施例に記載したようなさまざまなアッセイによって測定することができる。例えば、モノクローナル抗体が特に本明細書で言及したDR6及び/又はAPP抗体と同じ特異性を有するかどうかを測定するために、競合的結合アッセイでその活性を比較することができる。加えて、特定の抗DR6及び/又はAPP抗体が結合するエピトープは、問題のDR6及び/又はAPPと抗体との間の複合体の結晶学的研究によって測定することができる。
DR6及び/又はAPP抗体は、本明細書で記載されたとおり、好ましくは所望のDR6アンタゴニスト活性を有する。当該DR6抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及び親和性成熟抗体を含むがこれらに限定されるものではない。上に記載のとおり、DR6及び/又はAPP抗体は、これらの所望の活性又は特性を達成するためにさまざまな技術を使用して構築または設計されてもよい。
本発明の追加の実施形態は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレンからなる群から選択される1又は複数の非タンパクポリマーに結合された、本明細書に開示する抗DR6レセプター及び/又はAPPリガンド抗体を含む。場合によっては、本明細書に開示する抗DR6レセプター及び/又はAPPリガンド抗体は、グリコシル化あるいは非グリコシル化される。
本発明の追加の実施形態は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレンからなる群から選択される1又は複数の非タンパクポリマーに結合された、本明細書に開示する抗DR6レセプター及び/又はAPPリガンド抗体を含む。場合によっては、本明細書に開示する抗DR6レセプター及び/又はAPPリガンド抗体は、グリコシル化あるいは非グリコシル化される。
本発明の抗体は、「架橋結合」DR6及び/又はAPP抗体を含む。「架橋結合」なる用語は本明細書で使用される場合、少なくとも2つのIgG分子を一つに結合し、一つの(又は単一の)分子を形成することを指す。DR6及び/又はAPP抗体は、さまざまなリンカー分子を使用して共有結合されてもよく、好ましくはDR6及び/又はAPP抗体は抗IgG分子、補体、化学的修飾又は分子工学を使用して共有結合されてもよい。ひとたび抗体が細胞表面膜に結合すると、補体が抗体分子に比較的高い親和性を有することは当業者に重宝されている。従って、補体は、細胞表面膜に結合する2以上の抗DR6抗体を結合するための共有結合分子として使用されてもよいと考えられる。
また、本発明は、本明細書に開示されるDR6及び/又はAPP抗体をコードする単離された核酸、核酸を含むベクター及び宿主細胞、及び抗体を作成するための組換え体技術を提供する。
抗体の組換え体作成のために、それをコードする核酸は単離され、更なるクローニング(DNAの増幅)のため又は発現のために複製可能なベクターに挿入される。抗体をコードするDNAは容易に単離され、従来の手順を使用して(例えば、抗体をコードする遺伝子に特に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクターの構成は、通常、以下の1つ又は複数を含むがこれらに限定されない:シグナル配列、複製起点、1又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列。
抗体の組換え体作成のために、それをコードする核酸は単離され、更なるクローニング(DNAの増幅)のため又は発現のために複製可能なベクターに挿入される。抗体をコードするDNAは容易に単離され、従来の手順を使用して(例えば、抗体をコードする遺伝子に特に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクターの構成は、通常、以下の1つ又は複数を含むがこれらに限定されない:シグナル配列、複製起点、1又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列。
本明細書の方法は、抗DR6及び/又はAPP抗体軽鎖又は重鎖(又は軽鎖及び重鎖の両方)をコードするDNA配列を含むベクターを提供する工程、宿主細胞にベクターを形質移入又は形質転換する工程、及び組換え体抗DR6抗体及び/又はAPP抗体産生物を作成するために十分な条件下で宿主細胞を培養する工程を含む、キメラ又は組換え体抗DR6及び/又はAPP抗体を作成する方法を含む。
DR6アンタゴニストの製剤
本明細書の典型的な製剤の調製において、使用される成分の推奨の量又は「グレード」は製剤の最終的使用に依存する。治療的使用のために、医薬品への添加物として、許容可能なグレード(「GRAS」等)の成分が好ましい。
ある実施形態において、DR6アンタゴニスト及び、DR6アンタゴニストの溶解性及び/又は安定性を促進するために十分なイオン強度を提供する1又は複数の賦形剤を含む組成物であって、pH6(又は約6)からpH9(又は約9)を有する組成物が提供される。DR6アンタゴニストは、例えば、上の方法に従って、タンパク質の所望の純度を達成するのに適した任意の方法によって調整されてもよい。いくつかの実施形態において、DR6アンタゴニストは宿主細胞において組換えにより発現されるか、又は化学的合成により調製される。製剤中のDR6アンタゴニストの濃度は、例えば、製剤の意図する使用に大いに依存してもよい。当業者は、過度の実験をすることなく、DR6アンタゴニストの所望の濃度を決定することができる。
本明細書の典型的な製剤の調製において、使用される成分の推奨の量又は「グレード」は製剤の最終的使用に依存する。治療的使用のために、医薬品への添加物として、許容可能なグレード(「GRAS」等)の成分が好ましい。
ある実施形態において、DR6アンタゴニスト及び、DR6アンタゴニストの溶解性及び/又は安定性を促進するために十分なイオン強度を提供する1又は複数の賦形剤を含む組成物であって、pH6(又は約6)からpH9(又は約9)を有する組成物が提供される。DR6アンタゴニストは、例えば、上の方法に従って、タンパク質の所望の純度を達成するのに適した任意の方法によって調整されてもよい。いくつかの実施形態において、DR6アンタゴニストは宿主細胞において組換えにより発現されるか、又は化学的合成により調製される。製剤中のDR6アンタゴニストの濃度は、例えば、製剤の意図する使用に大いに依存してもよい。当業者は、過度の実験をすることなく、DR6アンタゴニストの所望の濃度を決定することができる。
DR6アンタゴニストの溶解性及び/又は安定性を促進するために十分なイオン強度を提供する製剤中の1又は複数の賦形剤は、場合により、多イオン有機又は無機酸、アスパラギン酸、硫酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、CaptisolTM、トリス、アルギニン塩又は他のアミノ酸、糖及びトレハロース及びショ糖などのポリオールである。好ましくは、十分なイオン強度を提供する製剤中の1又は複数の賦形剤は塩である。使用されてもよい塩は、ナトリウム塩及びアルギニン塩を含むがこれらに限定されるものではない。使用されてもよい塩の種類及び塩の濃度は、好ましくは、製剤が比較的高いイオン強度を有し、製剤中のDR6アンタゴニストが安定であることを可能にするものである。場合によっては、塩は製剤中に約20mMから約0.5Mの濃度で存在する。
組成物は、好ましくは、pH6(又は約6)から9(又は約9)、より好ましくは約6.5から約8.5、さらにより好ましくは約7から約7.5を有する。この実施形態の好ましい態様において、組成物は、組成物のpHを少なくとも約6から約8に維持するためのバッファーを更に含む。使用されてもよいバッファーの例は、トリス、HEPES、及びヒスチジンを含むがこれらに限定されるものではない。トリスを使用する場合、pHは、場合により、約7から8.5に調節されてもよい。Hepes又はヒスチジンを使用する場合、pHは、場合により、約6.5から7に調節されてもよい。場合によっては、バッファーは製剤中、約5mMから約50mMの濃度で使用される。
特に液剤(又は、再構成された凍結乾燥製剤)の場合は、組成物中に1又は複数の界面活性剤を含むことが望ましい場合がある。例えば、当該界面活性剤は、TWEENTM又はPLURONICSTM等の非イオン界面活性剤(例えば、ポリソルベート又はポロキサマー)を含んでもよい。好ましくは、界面活性剤はポリソルベート20(「Tween20」)を含む。場合によっては、界面活性剤は約0.005%から約0.2%の濃度で使用される。
特に液剤(又は、再構成された凍結乾燥製剤)の場合は、組成物中に1又は複数の界面活性剤を含むことが望ましい場合がある。例えば、当該界面活性剤は、TWEENTM又はPLURONICSTM等の非イオン界面活性剤(例えば、ポリソルベート又はポロキサマー)を含んでもよい。好ましくは、界面活性剤はポリソルベート20(「Tween20」)を含む。場合によっては、界面活性剤は約0.005%から約0.2%の濃度で使用される。
本発明の製剤は、DR6アンタゴニスト及び上記の成分に加えて、更にさまざまな他の賦形剤または成分を含んでもよい。場合によっては、製剤は、非経口的投与のために、薬学的に又は非経口的に許容可能な担体、すなわち使用される用量及び濃度において受容者に対し非毒性であって製剤の他の材料と適合する物を含んでもよい。場合によっては、担体は、受容者の血液と等浸透圧である溶液等の非経口担体である。当該担体ビヒクルの例は、水、生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)等の緩衝溶液、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液を含む。さまざまな任意の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤は、更にRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.編. (1980)に記載されている。
また、本明細書の製剤は、1又は複数の防腐剤を含んでもよい。例には、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム(アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチル塩化アンモニウムの混合物)、及び塩化ベンゼトニウムが含まれる。防腐剤の他の種類には、芳香族アルコール、メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン、及びm-クレゾールを含む。抗酸化剤はアスコルビン酸及びメチオニン;防腐剤(塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;ブチルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール; シクロへキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性重合体;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖、二糖類、及び他の炭水化物;ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖;又はポリエチレングリコール(PEG)を含む。
本発明の組成物は、液剤(液体溶液又は液体懸濁液)及び、凍結乾燥製剤、及び懸濁製剤を含む。
最終製剤は、液体ならば、好ましくは、<−20℃で凍結保存される。あるいは、製剤は凍結乾燥されて、場合によっては2−30℃で保存されてもよい、注射用の水でもどされる粉末として提供されうる。
治療的投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。無菌性は、除菌膜(例えば、0.2ミクロンの膜)を介して濾過することにより、容易に達成できる。治療用組成物は、通常、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で穴を開けることができるストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルの中に入れられる。
組成物は、通常、水性溶液として又は再構成のための凍結乾燥製剤として、一単位で又は複数回投与容器に、例えば密封されたアンプル又はバイアルに保存される。容器は、当分野で入手可能な何れの容器であってもよく、従来の方法を使用して注入される。場合によっては、製剤は、製剤の治療用送達に適した、当技術分野で入手可能であるような(例えば、米国特許第5370629号を参照)注射用ペン型装置(又はペン型装置に合うカートリッジ)中に含められる。注射溶液は、例えば注射用の水を使用して、凍結乾燥DR6アンタゴニスト製剤をもどすことによって調製することができる。
最終製剤は、液体ならば、好ましくは、<−20℃で凍結保存される。あるいは、製剤は凍結乾燥されて、場合によっては2−30℃で保存されてもよい、注射用の水でもどされる粉末として提供されうる。
治療的投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。無菌性は、除菌膜(例えば、0.2ミクロンの膜)を介して濾過することにより、容易に達成できる。治療用組成物は、通常、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で穴を開けることができるストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルの中に入れられる。
組成物は、通常、水性溶液として又は再構成のための凍結乾燥製剤として、一単位で又は複数回投与容器に、例えば密封されたアンプル又はバイアルに保存される。容器は、当分野で入手可能な何れの容器であってもよく、従来の方法を使用して注入される。場合によっては、製剤は、製剤の治療用送達に適した、当技術分野で入手可能であるような(例えば、米国特許第5370629号を参照)注射用ペン型装置(又はペン型装置に合うカートリッジ)中に含められる。注射溶液は、例えば注射用の水を使用して、凍結乾燥DR6アンタゴニスト製剤をもどすことによって調製することができる。
DR6アンタゴニストを使用する治療
本発明のDR6アンタゴニストはさまざまな効用を有する。DR6アンタゴニストは神経疾患の診断及び治療に有用である。本明細書に記載のさまざまな病的状態の哺乳動物の診断は、医師によって行われる。診断技術は、例えば、哺乳動物のさまざまな神経疾患の診断又は検出を可能にする当分野の技術を利用可能である。
本発明により治療が意図される神経疾患は、家族性及び特発性筋萎縮性側索硬化症(それぞれ、FALS及びALS)、家族性及び特発性パーキンソン病、ハンチントン病、家族性及び特発性アルツハイマー病及び脊髄性筋萎縮症(SMA)(Price等,上掲)を含む。これらの疾患の多くは、成人期中期に発病し、神経系内のニューロンの特定サブセットの急速な変性につながり、最終的に早死となるという特徴を示す。
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、もっとも多く診断される進行性運動ニューロン疾患である。この疾患は、皮質、脳幹及び脊髄の運動ニューロンの変性を特徴とする(Siddique等, J. Neural Transm. Suppl., 49:219-233 (1997); Siddique等, Neurology, 47: (4 Suppl 2):S27-34; discussion S34-5 (1996); Rosen等, Nature, 362:59-62 (1993); Gurney等, Science, 264:1772-1775 1994))。
本発明のDR6アンタゴニストはさまざまな効用を有する。DR6アンタゴニストは神経疾患の診断及び治療に有用である。本明細書に記載のさまざまな病的状態の哺乳動物の診断は、医師によって行われる。診断技術は、例えば、哺乳動物のさまざまな神経疾患の診断又は検出を可能にする当分野の技術を利用可能である。
本発明により治療が意図される神経疾患は、家族性及び特発性筋萎縮性側索硬化症(それぞれ、FALS及びALS)、家族性及び特発性パーキンソン病、ハンチントン病、家族性及び特発性アルツハイマー病及び脊髄性筋萎縮症(SMA)(Price等,上掲)を含む。これらの疾患の多くは、成人期中期に発病し、神経系内のニューロンの特定サブセットの急速な変性につながり、最終的に早死となるという特徴を示す。
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、もっとも多く診断される進行性運動ニューロン疾患である。この疾患は、皮質、脳幹及び脊髄の運動ニューロンの変性を特徴とする(Siddique等, J. Neural Transm. Suppl., 49:219-233 (1997); Siddique等, Neurology, 47: (4 Suppl 2):S27-34; discussion S34-5 (1996); Rosen等, Nature, 362:59-62 (1993); Gurney等, Science, 264:1772-1775 1994))。
パーキンソン病 (振戦麻痺)は、中年から晩年に現われる一般的な神経変性疾患である。家族性及び特発性の症例があるが、家族性症例は認められた症例のたった1−2パーセントの割合を占める。患者は、高頻度に、黒質及び脳幹の青斑核における反応性神経膠症及びレビー小体を伴う神経細胞消失を有する。クラスとしては、黒質線条体ドーパミンニューロンが最も侵される(Uhl等, Neurology, 35:1215-1218 (1985); Levine等, Trends Neurosci., 27:691-697 (2004); Fleming等, NeuroRx, 2:495-503 (2005))。
近位型脊髄性筋萎縮症(SMA)は、脊髄の運動ニューロンの消失及び四肢及び体幹筋肉の萎縮を特徴とするヒトの一般的な常染色体劣性神経変性疾患である(Monani等, Hum. Mol. Genet., 9:2451-2457 (2000); Monani等, J. Cell Biol., 160:41-52 (2003))。10,000人に1人の頻度で発病し、乳児死亡率で最も一般的な遺伝的原因である。疾患の表現型の重症度及び発病時の年齢に基づいて、近位型SMAは1型(急性)、2型(中間型)及び3型(慢性型)SMAに分類されている。この疾患の全3形態は、運動ニューロン遺伝子(SMN1)のテロメア生存の消失又は突然変異によるものである(Monani等, 上掲, 2000; Monani等, 上掲, 2003))。
近位型脊髄性筋萎縮症(SMA)は、脊髄の運動ニューロンの消失及び四肢及び体幹筋肉の萎縮を特徴とするヒトの一般的な常染色体劣性神経変性疾患である(Monani等, Hum. Mol. Genet., 9:2451-2457 (2000); Monani等, J. Cell Biol., 160:41-52 (2003))。10,000人に1人の頻度で発病し、乳児死亡率で最も一般的な遺伝的原因である。疾患の表現型の重症度及び発病時の年齢に基づいて、近位型SMAは1型(急性)、2型(中間型)及び3型(慢性型)SMAに分類されている。この疾患の全3形態は、運動ニューロン遺伝子(SMN1)のテロメア生存の消失又は突然変異によるものである(Monani等, 上掲, 2000; Monani等, 上掲, 2003))。
神経細胞消失は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、及び脊髄性筋萎縮症(SMA)を含む多くの神経変性疾患で報告されている。
場合によっては、患者におけるアルツハイマー病の診断は、精神疾患の診断・統計マニュアル第4版(DSM-IV-TR)(例えば、American Psychiatric Association. Diagnostic and statistical manual of mental disorders, 4th Edition- text revised. Washington, DC: 2000を参照)の診断基準に基づいてもよい。簡単には、DSM-IV-TR診断基準は、(A)(1)失語症;(2)失行症;(3)失認;又は(4)実行機能の混乱の1つ以上と記憶障害の両方が認められる複数の認知障害の発生;(B)認知障害が従前の機能の減退を示し、社会的又は職業上の機能に重大な障害を起こす;(C)進行が漸進的発病及び継続的減退を特徴とする;(D)認知障害が、記憶及び認知の進行性障害を引き起す他の中枢神経系の、全身性の、又は物質-誘発性の病状によるものではない;及び(E)混乱が他の神経障害によるものより多くの割合を占めていない、を含む。アルツハイマー病の診断の別の診断基準は、National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke-Alzheimer’s Disease and Related Disorder Association(NINDS-ADRDA)研究班のアルツハイマー病の診断基準に基づくものを含んでもよい(例えば、McKhann等, Neurology 1984; 34: 939-944を参照)。簡単に言うとは、アルツハイマー病の可能性についてのNINDS-ADRDA診断基準は、非定型の発病、発症、又は進行を有しており、且つ認知症を生じる可能性がある合併疾患の何れもが原因でないと思われる既知の病因を有さない認知症症候群を含む。アルツハイマー病の可能性が高い場合のNINDS-ADRDA診断基準は、臨床的及び神経心理学的検査により診断された認知症を含み、(a)記憶を含む認知の2以上の領域における進行性障害;(b)年齢40から90才の間の発症;(c)幻覚症状を含む認知症症候群を生じる可能性がある全身的な疾患又は他の脳疾患の非存在、を伴う。確定的なアルツハイマー病のNINDS-ADRDA診断基準は、アルツハイマー病の可能性が高い場合の診断基準の合致を含み、且つ培検又は生検による病理組織学的エビデンスを有する。
場合によっては、患者におけるアルツハイマー病の診断は、精神疾患の診断・統計マニュアル第4版(DSM-IV-TR)(例えば、American Psychiatric Association. Diagnostic and statistical manual of mental disorders, 4th Edition- text revised. Washington, DC: 2000を参照)の診断基準に基づいてもよい。簡単には、DSM-IV-TR診断基準は、(A)(1)失語症;(2)失行症;(3)失認;又は(4)実行機能の混乱の1つ以上と記憶障害の両方が認められる複数の認知障害の発生;(B)認知障害が従前の機能の減退を示し、社会的又は職業上の機能に重大な障害を起こす;(C)進行が漸進的発病及び継続的減退を特徴とする;(D)認知障害が、記憶及び認知の進行性障害を引き起す他の中枢神経系の、全身性の、又は物質-誘発性の病状によるものではない;及び(E)混乱が他の神経障害によるものより多くの割合を占めていない、を含む。アルツハイマー病の診断の別の診断基準は、National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke-Alzheimer’s Disease and Related Disorder Association(NINDS-ADRDA)研究班のアルツハイマー病の診断基準に基づくものを含んでもよい(例えば、McKhann等, Neurology 1984; 34: 939-944を参照)。簡単に言うとは、アルツハイマー病の可能性についてのNINDS-ADRDA診断基準は、非定型の発病、発症、又は進行を有しており、且つ認知症を生じる可能性がある合併疾患の何れもが原因でないと思われる既知の病因を有さない認知症症候群を含む。アルツハイマー病の可能性が高い場合のNINDS-ADRDA診断基準は、臨床的及び神経心理学的検査により診断された認知症を含み、(a)記憶を含む認知の2以上の領域における進行性障害;(b)年齢40から90才の間の発症;(c)幻覚症状を含む認知症症候群を生じる可能性がある全身的な疾患又は他の脳疾患の非存在、を伴う。確定的なアルツハイマー病のNINDS-ADRDA診断基準は、アルツハイマー病の可能性が高い場合の診断基準の合致を含み、且つ培検又は生検による病理組織学的エビデンスを有する。
改訂版NINDS-ADRDA診断基準は、Dubois等(The Lancet Neurology, Volume 6, Issue 8, August 2007, Pages 734-746)によって提案された。下に簡単に概説すると、アルツハイマー病の可能性が高い場合の診断基準に合致するには、罹患者は診断基準A(コアの臨床診断基準)及び少なくとも1又は複数の支持的バイオマーカー診断基準B、C、D、又はEを満たさなければならない。この場合において、診断基準Aは以下の特性を含む初期の著しいエピソード記憶障害の存在を特徴とする:(1)6ヶ月以上におよぶ患者又は通知者により報告された記憶機能の段階的及び進行性変化;(2)テストにおける著しく低下したエピソード記憶の客観的証拠:これは、通常、手がかり(cueing)又は再認識テストにより、及び以前は制御されていた情報の効果的なエンコードの後、著しく改善されないか又は正常化されないリコール障害からなる;(3)エピソード記憶障害は、ADの発症時又はAD進行時、他の認知変化から分離されるか又は関連づけられることができる。診断基準Bは、例えば、視覚的スコアリングを使用した定性的評価(よく特徴付けられた年齢基準による集団を基準とする)又は興味のある領域の定量的容積測定(よく特徴付けられた年齢基準による集団を基準とする)を伴うMRIにおいて証明された海馬、嗅内皮質、へんとう体の容積減少により示される内側側頭葉萎縮の存在を特徴とする。診断基準Cは、異常な脳脊髄液バイオマーカー、例えば低アミロイドβ1−42濃度、上昇した総タウ濃度、又は上昇したリン酸化タウ濃度、又はその3つの組合せを特徴とする。診断基準Cは、PETによる機能的神経画像の特異的なパターン、例えば両側の頭頂側頭領域における減少したグルコース代謝を特徴とする。診断基準Eは、近親で証明されたAD常染色体優性突然変異を特徴とする。ADは以下が存在するならば、確定的であると考えられる:(1)ADの死後診断のNIA-Reagan診断基準で要求されるような、疾患の臨床的および組織病理学的(脳の生検又は培検)エビデンス(例えば、Neurobiol Aging 1997; 18: S1-S2を参照);及び(2)ADの臨床的及び遺伝的エビデンス(第1、14、又は21番染色体における突然変異)の両方;診断基準は存在しなければならない。
本発明の方法において、DR6アンタゴニストは哺乳動物に、好ましくは担体で;好ましくは薬学的に許容可能な担体で投与される。適した担体及びその製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., Osol等編に記載されている。典型的には、適切な量の薬学的に許容可能な塩が、製剤の等張性を与えるために、製剤中に使用される。担体の例は、生理食塩水、リンガル溶液及びブトウ糖液を含む。溶液のpHは好ましくは約5から約8であり、より好ましくは約7から約7.5である。更に担体は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス等の除放性製剤を含み、マトリックスは造形品、例えばフィルム、リポソーム又は微粒子である。例えば投与されるDR6アンタゴニストの投与経路及び濃度に応じて、特定の担体がより好ましいことは当業者にとっては明らかである。
DR6アンタゴニストは哺乳動物に注射(例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、門脈内)により、経口的に、又は注入のような効率的形態で血流に送達されることが保証される他の方法により、投与することができる。また、DR6アンタゴニストは、局所的治療効果を発揮させるために、分離組織灌流などの分離灌流技術により、くも膜下腔内に、眼内に、又は腰椎穿刺により投与されてもよい。血液脳関門を容易に渡らないDR6アンタゴニストは直接的に、例えば脳内に又は脊髄腔中に又は他に与えられ、それらを関門を超えて輸送する。DR6アンタゴニストを投与するための効果的な用量及びスケジュールは実験的に決定されてもよく、当該決定を行うことは当業者の守備範囲である。投与しなければならないDR6アンタゴニストの用量が、例えばアンタゴニストを受ける哺乳動物、投与経路、使用されるアンタゴニストの特定の種類及び哺乳動物に投与される他の薬物に、大いに依存することを、当業者であれば理解する。適切な用量を選択するための指針は、例えば抗体の治療的使用に関する文献、例えば、Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone等編, Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 及びpp. 303-357; Smith等, Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber等編, Raven Press, New York (1977) pp. 365-389を参照されたい。単独で使用されるDR6抗体の典型的な1日用量は、上記の要因に応じて、1日あたり体重につき約1μg/kgから100mg/kg又はそれ以上の範囲である。
また、DR6アンタゴニストは1又は複数の他の治療薬と組合わせて哺乳動物に投与されてもよい。当該他の治療薬の例は、上皮増殖因子受容体(EGFR)インヒビター、例えばTarceva、C225のような抗体、cetuximab及びErbitux(登録商標)(ImClone Systems Inc.)、完全ヒトABX−EGF (panitumumab, Abgenix Inc.)、及びUS6235883に記載されているE1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3及びE7.6.3として知られている完全ヒト抗体等のEGFRに結合するか又は直接作用してシグナル伝達活性を防ぐか又は減じる化合物;MDX−447(Medarex Inc)、及びUS5616582, US5457105, US5475001, US5654307, US5679683, US6084095, US6265410, US6455534, US6521620, US6596726, US6713484, US5770599, US6140332, US5866572, US6399602, US6344459, US6602863, US6391874, WO9814451, WO9850038, WO9909016, WO9924037, US6344455, US5760041, US6002008, US5747498に記載されているようなEGFR小分子インヒビター;OSI−774(CP-358774, erlotinib, OSI Pharmaceuticals)を含む特定の小分子EGFRインヒビター;PD183805(CI1033、2-プロペンアミド、N-[4-[(3-クロロ-4-フルオロフェニル)アミノ]-7-[3-(4-モルホリニル)プロポキシ]-6-キナゾリニル]-、ジハイドロクロリド、ファイザーInc.);Iressa(ZD1839、ゲフィチニブ、4-(3'-クロロ-4'-フルオロアニリノ)-7-メトキシ-6-(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン、アストラゼネカ);ZM105180((6-アミノ-4-(3-メチルフェニル-アミノ)キナゾリン、ゼネカ);BIBX−1382(N8-(3-クロロ-4-フルオロ-フェニル)-N2-(1-メチル-ピペリジン-4-イル)-ピリミド[5,4-d]ピリミジン-2,8-ジアミン、ベーリンガーインゲルハイム);PKI−166((R)-4-[4-[(1-フェニルエチル)アミノ]-1H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-6-イル]フェノール);(R)-6-(4-ヒドロキシフェニル)-4-[(1-フェニルエチル)アミノ]-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン);CL−387785(N[4-[(3-ブロモフェニル)アミノ]-6-キナゾリニル]-2-ブチンアミド);及びEKB−569(N[4-[(3-クロロ-4-フルオロフェニル)アミノ]-3-シアノ-7-エトキシ-6-キナゾリニル]-4-(ジメチルアミノ)-2-ブテンアミド)を含む。使用されてもよい他の治療薬は、アポトーシスインヒビター、特に細胞内アポトーシスインヒビター、例えばカスパーゼ3、カスパーゼ6、又はカスパーゼ8インヒビター等のカスパーゼインヒビター、Bidインヒビター、Baxインヒビター又はそれらの組合せを含む。適切なインヒビターの例は、通常はカスパーゼインヒビター、ジペプチドインヒビター、カルバミン酸インヒビター、置換アスパラギン酸アセタール、ヘテロシクリルジカルバミド、キノリン(ジ-、トリ-、テトラペプチド)誘導体、置換2-アミノベンズアミド・カスパーゼ・インヒビター、置換a-ヒドロキシ酸カスパーゼインヒビター、ニトロシル化による阻害;CASP-1;CASP-3:タンパク質インヒビター、アンチセンス分子、ニコチニル-アスパルチル-ケトン、y-ケト酸ジペプチド誘導体、CASP−8:アンチセンス分子、相互作用タンパク質CASP-9、CASP2:アンチセンス分子;CASP-6:アンチセンス分子;CASP-7:アンチセンス分子;及びCASP-12インヒビターである。更なる例は、Bcl-2調節因子、Bad由来ののBcl-2突然変異ペプチド、Bad、BH3相互作用ドメイン・デス・アゴニスト、Baxインヒビタータンパク質及びBLK遺伝子及び遺伝子産物などのミトコンドリアインヒビターである。アポトーシスの適切な細胞内修飾因子は、CASP9/Apaf-1会合、Apaf-1発現のアンチセンス修飾因子、アポトーシス阻害用ペプチド、ヘルペス・シンプレクス(Herpes Simplex)ウイルスのR1サブセットを含む抗アポトーシス組成物、MEKK1及びその断片、スルビビン修飾因子、アポトーシス及びHIAP2のヒンヒビターの修飾因子である。これらの作用剤の更なる例は、ミトコンドリアからのチトクロームC放出を抑制し、カスパーゼ3 mRNA上方制御を制御するミノサイクリン(Neuroapoptosis Laboratory)、p53インヒビターであるピフィスリンα(UIC)、JNK経路インヒビターであるCEP-1346(Cephalon Inc.)、プロアポトーシスのGAPDHシグナル伝達を阻害するTCH346(Novartis)、汎カスパーゼインヒビターであるIDN6556(Idun Pharmaceuticals);カスパーゼ3インヒビターであるAZQs(アストラゼネカ)、カスパーゼ1/4インヒビターであるHMR-3480(Aventis Pharma)、血栓を溶解するActivase/TPA(ジェネンテック)(血栓溶解薬)である。
DR6アンタゴニストに加えて投与されてもよい適切な作用剤は、コリンエステラーゼインヒビター(ドネペジル、ガランタミン、リバスチグミン、タクリン等)、NMDAレセプターアンタゴニスト(メマンチン)Aβ凝集インヒビター、抗酸化剤、γ分泌酵素修飾因子、NGF模倣体又はNGF遺伝子治療、PPARγアンタゴニスト、HMG-CoA還元酵素インヒビター(スタチン)、アンパカイン、カルシウムチャネル遮断薬、GABAレセプターアンタゴニスト、グリコーゲン合成酵素キナーゼインヒビター、免疫グロブリン静注、ムスカリンレセプターアゴニスト、ニコチン受容体修飾因子、能動的又は受動的Aβ免疫化、ホスホジエステラーゼインヒビター、セロトニンレセプターアンタゴニスト及び抗Aβ抗体(例えば、WO2007/062852;WO2007/064972;WO2003/040183;WO1999/06066;WO2006/081171;WO1993/21526;EP0276723B1;WO2005/028511;WO2005/082939を参照)を含む。
DR6アンタゴニストは1又は複数の他の治療薬と連続して又は同時に投与されてもよい。DR6アンタゴニスト及び治療薬の量は、例えば使用される薬剤がどんな種類か、治療される病的状態、及び投与のスケジュール及び経路に依存するが、それぞれを個々に使用する場合よりも通常は少ない。
哺乳動物へのDR6アンタゴニストの投与に続いて、哺乳動物の生理学的状態が臨床医がよく知っているさまざまな方法でモニターされうる。
DR6アンタゴニストは1又は複数の他の治療薬と連続して又は同時に投与されてもよい。DR6アンタゴニスト及び治療薬の量は、例えば使用される薬剤がどんな種類か、治療される病的状態、及び投与のスケジュール及び経路に依存するが、それぞれを個々に使用する場合よりも通常は少ない。
哺乳動物へのDR6アンタゴニストの投与に続いて、哺乳動物の生理学的状態が臨床医がよく知っているさまざまな方法でモニターされうる。
本発明のDR6アンタゴニストの治療的効果は、インビトロアッセイで、およびインビボ動物モデルを使用して調べられうる。さまざまな周知のアッセイ及び動物モデルを候補治療薬の効果を試験するために使用することができる。当該モデルのインビボの性質は、特にヒト患者での応答の予測をする。さまざまな神経変性疾患の動物モデル及び神経変性のこれらのモデルに関連する病理学的過程を(例えば、DR6アンタゴニストの存在下及び非存在下で)検査するための関連技術は、下の実施例14において議論する。
さまざまな神経疾患の動物モデルは、非組換え体及び組換え体(トランスジェニック)動物の両方を含む。非組換え体動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。当該モデルは、標準的な技術、例えば皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹腔内移植、及び腎被膜下移植を使用して、同系マウスに細胞を導入することによって作成されうる。インビボモデルは脳卒中/脳虚血のモデル、パーキンソン病のマウスモデル;アルツハイマー病のマウスモデル;筋萎縮性側索硬化症ALSのマウスモデル;脊髄性筋萎縮症SMAのマウスモデル等の神経変性疾患のインビボモデル、局所的脳虚血及び全脳虚血マウス/ラットモデル、例えば、一般的な頸動脈閉塞モデル又は中大脳動脈閉塞モデル;又はエキソビボ全胚培養を含む。さまざまなアッセイは、下記のように又は当分野で既知であり文献に記載されている既知のインビトロ又はインビボ形式で実施されてもよい(例えば、McGowan等, TRENDS in Genetics, 22:281-289 (2006);Fleming等, NeuroRx, 2:495-503 (2005);Wong等, Nature Neuroscience, 5:633-639 (2002)を参照)。また、さまざまな当該動物モデルは、Jackson Laboratory (http://jaxmice.jax.org参照)等の業者から入手可能である。
さまざまな神経疾患の動物モデルは、非組換え体及び組換え体(トランスジェニック)動物の両方を含む。非組換え体動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。当該モデルは、標準的な技術、例えば皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹腔内移植、及び腎被膜下移植を使用して、同系マウスに細胞を導入することによって作成されうる。インビボモデルは脳卒中/脳虚血のモデル、パーキンソン病のマウスモデル;アルツハイマー病のマウスモデル;筋萎縮性側索硬化症ALSのマウスモデル;脊髄性筋萎縮症SMAのマウスモデル等の神経変性疾患のインビボモデル、局所的脳虚血及び全脳虚血マウス/ラットモデル、例えば、一般的な頸動脈閉塞モデル又は中大脳動脈閉塞モデル;又はエキソビボ全胚培養を含む。さまざまなアッセイは、下記のように又は当分野で既知であり文献に記載されている既知のインビトロ又はインビボ形式で実施されてもよい(例えば、McGowan等, TRENDS in Genetics, 22:281-289 (2006);Fleming等, NeuroRx, 2:495-503 (2005);Wong等, Nature Neuroscience, 5:633-639 (2002)を参照)。また、さまざまな当該動物モデルは、Jackson Laboratory (http://jaxmice.jax.org参照)等の業者から入手可能である。
当分野で既知の多くの動物モデルが、AD等の神経疾患における本明細書で開示されるDR6アンタゴニストの活性を検査するために使用されうる(例えば、Rakover等, Neurodegener Dis. 2007; 4(5): 392-402; Mouri等, FASEB J. 2007 Jul;21(9):2135-48; Minkeviciene等, J Pharmacol Exp Ther. 2004 Nov;311(2):677-82 and Yuede等, Behav Pharmacol. 2007 Sep;18(5-6):347-63を参照)。例えば、マウスの認知機能における本願明細書で開示されるDR6アンタゴニストの効果は、物体再認知テストを使用して検査されうる(例えば、Ennaceur等, Behav. Brain Res. 1988; 31:47-59を参照)。例えば、脳の炎症における本明細書で開示されるDR6アンタゴニストの活性は、マウスで、例えば組織化学的解析によって、及びマウス血漿分画でIL-1β及びTNF-α及び抗炎症サイトカインIL-10等の炎症マーカーのレベルを測定することを目的とするELISAプロトコルによって、検査されうる(例えば、Rakover等, Neurodegener Dis. 2007;4(5):392-402を参照)。
アルツハイマー病(AD)等の神経疾患における本明細書で開示されたDR6アンタゴニストのヒトでの効果は、例えば全体的評価と併せて認知結果判定法の使用を通して検査されうる(例えば、Leber P: Guidelines for the Clinical Evaluation of Antidementia Drugs, 1st draft, Rockville, MD, US Food and Drug Administration, 1990を参照)。AD等の神経疾患における効果は、例えば、単一又は複数の判断基準を使用して検査されうる。例えば、欧州医薬品審査庁 (EMEA)は、機能的及び全体的活動の両方における認知及び安定の改善の事前に設定した程度に対応する応答者の定義を導入した(例えば、European Medicine Evaluation Agency (EMEA): Note for Guidelines on Medicinal Products in the Treatment of Alzheimer’s Disease. London, EMEA, 1997)。作用剤への患者の応答性を評価するために、単独で又は組合わせて使用されうる特定の確立された検査の多くは、当分野で既知である(例えば、Van Dyke等, AM J Geriatr. Psychiatry 14:5 (2006)を参照)。例えば、作用剤への反応性は、より重度のADを有する患者での認知の変化を測定する為に使用する試験である、the Severe Impairment Battery(SIB)を使用して評価されうる (例えば、Schmitt等, Alzheimer Dis Assoc Disord 1997; 11(suppl 2):51-56を参照)。また、作用剤への応答性は、認知症の後期を対象とし且つ有効である、日常生活で行われる活動に独立のレベルを測定する19項目インベントリーであるthe 19-item Alzheimer’s Disease Cooperative Study Activities of Daily Living inventory (ADCSADL19)を使用して測定されうる(例えば、Galasko等, J Int Neuropsychol Soc 2005; 11:446 453を参照)。また、作用剤へ応答性は、患者と介護士の両方への構造化インタビューに基づいて評価される7ポイントの全体変化である、the Clinician's Interview-Based Impression of Change Plus Caregiver Input (CIBIC-Plus)を使用して測定されうる(例えば、Schneider等, Alzheimer Dis Assoc Disord 1997; 11(suppl 2):22 32を参照)。また、作用剤への応答性は、介護士のインタビューに基づいて12の行動上の症状の頻度及び重症度を評価する、the Neuropsychiatric Inventory (NPI)を使用して測定されうる(例えば、Cummings等., Neurology 1994; 44:2308-2314)。
さまざまなコリンエステラーゼインヒビター(ドネペジル、ガランタミン、リバスチグミン及びタクリン、並びにメマンチン、N-メチル-D-アスパレート(NMDA)レセプター・アンタゴニスト)は、アルツハイマー病の治療のための規制認可を受けている(例えば、Roberson等, Science 314: 781-784 (2006)を参照)。軽度から中等度の重症度のADを有する患者におけるコリンエステラーゼ・インヒビターの臨床試験において、治療反応の共通の定義は、6ヶ月を超えるthe Alzheimer’s Disease Assessment Scale-Cognitive Subscale (ADAS-cog)における少なくとも4ポイントの改善を含む(例えば、Winblad等, Int J Geriatr Psychiatry 2001; 16: 653-666; Cummings J., Am J Geriatr Psychiatry 2003; 11: 131-145; 及び Lanctot等, CMAJ 2003; 169: 557-564を参照)。また、これらの結果は、それぞれ約6ヶ月又は1年までに、反転する疾患過程と比較される(例えば、Doraiswamy等, Alzheimer Dis Assoc Disord (2001) 15: 174-183を参照)。メマンチンの臨床試験において、治療の応答者は、全体的能力の低下を示さず、且つ機能的能力かまたは認知能力に低下を示さない患者として事前に指定されている (例えば、Reisberg等, N. Engl. J. Med. 2003; 348: 1333-1341を参照)。コリンエステラーゼ・インヒビター・ドネベジルの安定的用量を摂取した患者におけるメマンチンの別の試験は、メマンチンが、the Severe Impairment Battery (SIB)及び修正した19-item AD Cooperative Study-Activities of Daily Living Inventory (ADCS-ADL19)、a Clinician's Interview-Based Impression of Change Plus Caregiver Input (CIBIC-Plus)、the Neuropsychiatric Inventory (NPI)、及びthe Behavioral Rating Scale for Geriatric Patients (BGP Care Dependency Subscale)のベースラインからの差を含む結果測定において、ブラセボを超える効果を示すことを特徴とする(例えば、Tariot等, JAMA 2004; 291:317-324)。メマンチンは、更に複数のSIB、ADCS-ADL19、CIBIC-Plus及びNPI結果測定にわたって症状の改善及び安定化の両方を生じることによって、効果的であると特徴づけられる(例えば、van Dyck等, AM J Geriatr. Psychiatry 14:5 (2006)を参照)。
DR6アンタゴニスト診断的適用
家族性アルツハイマー病 (FAD)又は常染色体優性早期発症型アルツハイマー病 (ADEOAD)は、常染色体優性形式で遺伝しうる、通常は、65歳前(通常は、20歳と65歳の間)と定義された一生の早期に襲うアルツハイマー病のまれな型を指す。アミロイド前駆体タンパク質(APP)、プレセニリン1(PSEN1)、及びプレセニリン2(PSEN2)遺伝子の研究は、これらの遺伝子における突然変異がADEOADが認められた症例の大多数に関与しているというエビデンスを提供する(例えば、Raux等., Journal of Medical Genetics 2005;42:793-795を参照)。しかしながら、この症候群が認められた症例の多くは、説明が付かないままである。本明細書に提示するデータは、デスレセプター6のポリペプチド及び/又はポリヌクレオチド変異体が、FAD及び/又は他の神経疾患のいくつかの症例に関与している可能性を示唆する。本発明の実施形態は、配列番号1を含むデスレセプター6(DR6)ポリペプチドが個体に存在するかどうかを決定する方法であり、DR6のポリペプチドが個体に存在するかどうかを決定するために、個体に存在するDR6ポリペプチドの配列と配列番号1を比較することを含む方法を含む。当該方法において、場合によっては、患者は、FAD及び/又は他の神経疾患を有するか、又は有することが疑われている。
家族性アルツハイマー病 (FAD)又は常染色体優性早期発症型アルツハイマー病 (ADEOAD)は、常染色体優性形式で遺伝しうる、通常は、65歳前(通常は、20歳と65歳の間)と定義された一生の早期に襲うアルツハイマー病のまれな型を指す。アミロイド前駆体タンパク質(APP)、プレセニリン1(PSEN1)、及びプレセニリン2(PSEN2)遺伝子の研究は、これらの遺伝子における突然変異がADEOADが認められた症例の大多数に関与しているというエビデンスを提供する(例えば、Raux等., Journal of Medical Genetics 2005;42:793-795を参照)。しかしながら、この症候群が認められた症例の多くは、説明が付かないままである。本明細書に提示するデータは、デスレセプター6のポリペプチド及び/又はポリヌクレオチド変異体が、FAD及び/又は他の神経疾患のいくつかの症例に関与している可能性を示唆する。本発明の実施形態は、配列番号1を含むデスレセプター6(DR6)ポリペプチドが個体に存在するかどうかを決定する方法であり、DR6のポリペプチドが個体に存在するかどうかを決定するために、個体に存在するDR6ポリペプチドの配列と配列番号1を比較することを含む方法を含む。当該方法において、場合によっては、患者は、FAD及び/又は他の神経疾患を有するか、又は有することが疑われている。
この場合、患者試料のDR6ポリペプチド及び/又はポリヌクレオチドは、臨床試料および細胞株の組織免疫学的解析、インサイツハイブリダイゼーション、RT-PCR解析、ウエスタンブロット解析、及び組織アレイ解析を非限定的に含む当技術分野でよく知られた多くの手段によって、(例えば、DR6の天然に存在する変異体を同定するために)解析されてもよい。DR6遺伝子の配列(例えば、DR6 5’及び3’調節配列、イントロン、エキソン及びその類)及びDR6遺伝子産物を評価するための典型的なプロトコルは、例えば、Ausubel等編集, 2007, Current Protocols In Molecular Biology, 第2部 (ノザンブロット法)、4部(サザンブロット法)、15部(イムノブロット法)及び18部(PCR解析)を参照することができる。
当該解析の例示的な実施形態において、DR6ポリペプチド及び/又はそこで発現するmRNA配列を、イムノアッセイ、ノザンブロットアッセイ又はポリヌクレオチド配列解析等の手順によって解析できる(例えば、Lane等, Laryngoscope. 2002; 112(7 Pt 1):1183-9;及びSilani等, Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord. 200; 2 Suppl 1:S69-76を参照)ように、神経細胞は神経疾患を有する患者又は神経疾患が疑われている患者から採取される。発明のいくつかの実施形態において、患者の神経細胞(場合により、インビトロ培養で継代されうる)から採取されたDR6ポリペプチドは、ウエスタンブロット解析などのイムノアッセイによって解析されうる(例えば、Pettermann等, J Neurosci. (10): 3624-3632 (1988)を参照)。あるいは、DR6遺伝子のコード領域の部分又は全部が、例えば、患者の神経細胞から抽出したmRNA配列の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって解析されうる。本発明の他の実施形態において、DR6ゲノム配列は、神経細胞以外の細胞、例えば線維芽細胞又は末梢血白血球から採取され、次にこれらのゲノム配列がDR6のポリペプチドをコードするか、及び/又はDR6のポリヌクレオチド変異体(例えば、細胞におけるDR6発現のレベルに影響する、5’及び3’調節配列変異体を含む)をもっているかどうかを決定するために解析される。本発明のいくつかの実施形態において、当該解析は、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、プレセニリン1(PSEN1)、及びプレセニリン2(PSEN2)遺伝子の解析で模倣されうる(例えば、Nagasaka等, Proc Natl Acad Sci USA. 2005;102(41):14854-9;及びFinckh等, Neurogenetics. 2005;6(2):85-9を参照)。
DR6アンタゴニストを同定する為のスクリーニング方法
本発明の実施形態はDR6のAPPへの結合を阻害する興味のある分子を同定する方法であり、興味のある分子の存在下又は非存在下でDR6及びAPPを組合わせること;次に前記興味のある分子の存在下でDR6のAPPへの結合の阻害を検出することを含む方法を含む。特に、本発明で提供される開示を使用して、DR6及び/又はAPPと相互作用し、DR6とAPPとの間の相互作用を阻害するタンパク質、小分子、及び他の分子を同定することができる。この方法の例示的な実施形態において、DR6はマトリックス上に固定化されうる。次に、遊離したAPP(例えば、発色マーカー、蛍光タグ、放射性標識、磁性タグ、または酵素反応製品などで標識化されたAPP)の固定化DR6に結合する能力が、興味のある分子の存在下及び非存在下で観察されうる。DR6に結合するAPPの減少(例えば、検出可能なマーカーのレベル及び/又は位置の変化を介して認められる)は、次にDR6を結合するAPPの能力を阻害するような分子を同定するために使用されうる。本発明の別の実施形態において、APPは、興味のある分子の存在下及び非存在下で、遊離したDR6(例えば、検出可能なマーカーで標識化されたDR6)を結合するAPPの能力を検出する為にマトリックス上に固定化されうる。当該実施形態において、場合によっては、興味のある分子は抗体でありうる。
本発明の実施形態はDR6のAPPへの結合を阻害する興味のある分子を同定する方法であり、興味のある分子の存在下又は非存在下でDR6及びAPPを組合わせること;次に前記興味のある分子の存在下でDR6のAPPへの結合の阻害を検出することを含む方法を含む。特に、本発明で提供される開示を使用して、DR6及び/又はAPPと相互作用し、DR6とAPPとの間の相互作用を阻害するタンパク質、小分子、及び他の分子を同定することができる。この方法の例示的な実施形態において、DR6はマトリックス上に固定化されうる。次に、遊離したAPP(例えば、発色マーカー、蛍光タグ、放射性標識、磁性タグ、または酵素反応製品などで標識化されたAPP)の固定化DR6に結合する能力が、興味のある分子の存在下及び非存在下で観察されうる。DR6に結合するAPPの減少(例えば、検出可能なマーカーのレベル及び/又は位置の変化を介して認められる)は、次にDR6を結合するAPPの能力を阻害するような分子を同定するために使用されうる。本発明の別の実施形態において、APPは、興味のある分子の存在下及び非存在下で、遊離したDR6(例えば、検出可能なマーカーで標識化されたDR6)を結合するAPPの能力を検出する為にマトリックス上に固定化されうる。当該実施形態において、場合によっては、興味のある分子は抗体でありうる。
本発明で提供される開示は、当技術分野で使用されるさまざまなプロトコルにより、DR6とAPPとの間の結合相互作用を阻害する分子を同定するために使用されるDR6及びAPPのようなポリペプチド間の結合を特徴付けることを可能にする。本発明の当該実施形態は、ELISAアッセイ(例えば、米国特許第6855508号;6113897号及び7241803号で開示されるような競合的又はサンドイッチELISAアッセイ)、(例えば、Pettermann等, J Neurosci. (10): 3624-3632 (1988)及び下の実施例10で開示されるような)ウエスタンブロットアッセイ、(例えば、下の実施例10で開示されるような)免疫組織学的アッセイ、IAsys解析及びCM-5(BIAcore)センサーチップ解析(例えば、米国特許第6720156号及び7101851号)を使用するものを含む。本発明のいくつかの実施形態において、DR6のAPPへの結合を阻害する興味のある分子の同定方法はタンパク質マイクロアレイを使用する。タンパク質マイクロアレイは、典型的には、定義済みの場所で表面上に固定化された興味のあるタンパク質分子(例えば、DR6及び/又はAPP)を使用し、小分子結合タンパク質を同定するために使用される(例えば、Wilson等, Curr. Opinion in Chemical Biology 2001, 6, 81-85;及びZhu, H.等, Science 2001, 293, 1201-2105を参照)。
キット及び製造品
本発明の更なる実施形態において、神経疾患を治療する為に有用な材料を含む製造品及びキットが提供される。製造品は、ラベルを有する容器を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチック等のさまざまな材料から形成されてもよく、好ましくは滅菌される。容器には、アルツハイマー病を含む神経疾患を治療するために効果的な活性剤を有する組成物が入る。組成物中の活性剤は、DR6アンタゴニストであり、好ましくは抗DR6モノクローナル抗体又は抗APPモノクローナル抗体である。容器のラベルは、組成物が神経疾患を治療する為に使用されることを表示し、また上記のようなインビボまたはインビトロの使用の指示が表示されてもよい。製造品またはキットは、場合によっては、適応症、用途、用量、投与、禁忌、包装された製品と組合わされている他の治療用製品、及び/または当該治療用製品の使用に関する警告などについての情報を含む、治療用製品の商業用パッケージに習慣的に含まれる指示を示す添付文書を更に含む。本発明のキットは、上記の容器及びバッファーを含む第2の容器を含む。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上の及び利用者の立場から望ましい他の材料を含んでもよい。
本発明の更なる実施形態において、神経疾患を治療する為に有用な材料を含む製造品及びキットが提供される。製造品は、ラベルを有する容器を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチック等のさまざまな材料から形成されてもよく、好ましくは滅菌される。容器には、アルツハイマー病を含む神経疾患を治療するために効果的な活性剤を有する組成物が入る。組成物中の活性剤は、DR6アンタゴニストであり、好ましくは抗DR6モノクローナル抗体又は抗APPモノクローナル抗体である。容器のラベルは、組成物が神経疾患を治療する為に使用されることを表示し、また上記のようなインビボまたはインビトロの使用の指示が表示されてもよい。製造品またはキットは、場合によっては、適応症、用途、用量、投与、禁忌、包装された製品と組合わされている他の治療用製品、及び/または当該治療用製品の使用に関する警告などについての情報を含む、治療用製品の商業用パッケージに習慣的に含まれる指示を示す添付文書を更に含む。本発明のキットは、上記の容器及びバッファーを含む第2の容器を含む。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上の及び利用者の立場から望ましい他の材料を含んでもよい。
さらに、本発明の様々な態様を以下の実施例によって記載し、例示する。これらは本発明の権利範囲を減縮するためのものではない。
実施例1:胚の及び成体の中枢神経系におけるDR6発現
マウス胚組織におけるTNFレセプタースーパーファミリー発現パターンのRNAインサイツスクリーニングを実施した。より具体的には、インサイツハイブリダイゼーション実験を、mRNAロケーターキット(Ambion, Cat. No.1803)を使用して、製造者のプロトコルに従って行った。以下のDR6 cDNAの一次配列は、これらの実験のリボプローブの作成に使用した:
GAGCAGAAACGGCTCCTTTATTACCAAAGAAAAGAAGGACACAGTGTTGCGGCAGGTCCGCCTGGACCCCTGTGACTTGCAGCCCATCTTTGATGACATGCTGCATATCCTGAACCCCGAGGAGCTGCGGGTGATTGAAGAGATTCCCCAGGCTGAGGACAAACTGGACCGCCTCTTCGAGATCATTGGGGTCAAGAGCCAAGAAGCCAGCCAGACCCTCTTGGACTCTGTGTACAGTCATCTTCCTGACCTATTGTAGAACACAGGGGCACTGCATTCTGGGAATCAACCTACTGGCGG(配列番号:3)
リボプローブのインビトロ合成のために、マキシスクリプト(Maxiscript)キット(Ambion, Cat. No. 1308)を、製造者のプロトコルに従って使用した。
マウス胚組織におけるTNFレセプタースーパーファミリー発現パターンのRNAインサイツスクリーニングを実施した。より具体的には、インサイツハイブリダイゼーション実験を、mRNAロケーターキット(Ambion, Cat. No.1803)を使用して、製造者のプロトコルに従って行った。以下のDR6 cDNAの一次配列は、これらの実験のリボプローブの作成に使用した:
GAGCAGAAACGGCTCCTTTATTACCAAAGAAAAGAAGGACACAGTGTTGCGGCAGGTCCGCCTGGACCCCTGTGACTTGCAGCCCATCTTTGATGACATGCTGCATATCCTGAACCCCGAGGAGCTGCGGGTGATTGAAGAGATTCCCCAGGCTGAGGACAAACTGGACCGCCTCTTCGAGATCATTGGGGTCAAGAGCCAAGAAGCCAGCCAGACCCTCTTGGACTCTGTGTACAGTCATCTTCCTGACCTATTGTAGAACACAGGGGCACTGCATTCTGGGAATCAACCTACTGGCGG(配列番号:3)
リボプローブのインビトロ合成のために、マキシスクリプト(Maxiscript)キット(Ambion, Cat. No. 1308)を、製造者のプロトコルに従って使用した。
図2Aに示すように、神経細胞死が起こることがわかっているステージであるE10からE12ステージで、発生中の脊髄及び後根神経節細胞において、DR6は、成長中の前駆体よりも、分化したニューロンで、ほとんど独占的に発現していた。95
図2Bに示すように、DR6タンパク質は、ニューロンの細胞体及び軸索の両方において発現している。
図2Bでは、上段の2つの写真は、DR6(左)又はコントロールタンパク質(右)を可視化した正常なマウスのニューロンを示す。対比して、下段の2つの写真は、DR6(左)又はコントロールタンパク質(右)を可視化したDR6ノックアウトマウスのニューロンを示す。
この図で示したデータを作成するために使用した材料と方法は以下の通りである。例えば図2Bで示したように感覚軸索において、DR6タンパク質発現の可視化のためには、DR6特異的マウスモノクローナル抗体を、ヒト組換え体DR6を免疫原として使用してジェネンテックにおいて作成した(下の実施例3を参照)。さらに、これらの抗体は、細胞表面上で発現する全長マウスDR6及びヒトDR6を認識する能力に関して免疫蛍光によってスクリーニングした。「RA.3」(「3F4.8.8」mAbとしても知られており、さらに下の実施例3および実施例7に記載されている)と呼ばれる上記の抗体のひとつは、ヒト及びマウスDR6ポリペプチドの両方と交差反応するものであり、図2Bで示すように軸索におけるDR6発現を可視化するために使用した。免疫蛍光染色手順は、当該分野で既知の標準的プロトコルを使用して実施した(Nikolaev等, 2003, Cell, 112(1), 29-40)。軸索におけるDR6発現を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージング・ツァイス顕微鏡で写真を撮った。
図2Bに示すように、DR6タンパク質は、ニューロンの細胞体及び軸索の両方において発現している。
図2Bでは、上段の2つの写真は、DR6(左)又はコントロールタンパク質(右)を可視化した正常なマウスのニューロンを示す。対比して、下段の2つの写真は、DR6(左)又はコントロールタンパク質(右)を可視化したDR6ノックアウトマウスのニューロンを示す。
この図で示したデータを作成するために使用した材料と方法は以下の通りである。例えば図2Bで示したように感覚軸索において、DR6タンパク質発現の可視化のためには、DR6特異的マウスモノクローナル抗体を、ヒト組換え体DR6を免疫原として使用してジェネンテックにおいて作成した(下の実施例3を参照)。さらに、これらの抗体は、細胞表面上で発現する全長マウスDR6及びヒトDR6を認識する能力に関して免疫蛍光によってスクリーニングした。「RA.3」(「3F4.8.8」mAbとしても知られており、さらに下の実施例3および実施例7に記載されている)と呼ばれる上記の抗体のひとつは、ヒト及びマウスDR6ポリペプチドの両方と交差反応するものであり、図2Bで示すように軸索におけるDR6発現を可視化するために使用した。免疫蛍光染色手順は、当該分野で既知の標準的プロトコルを使用して実施した(Nikolaev等, 2003, Cell, 112(1), 29-40)。軸索におけるDR6発現を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージング・ツァイス顕微鏡で写真を撮った。
図2Cで示すように、DR6 mRNAは分化したニューロンで発現している。図2Cの左から右において、3枚の写真は、それぞれ、発生ステージE10.5、E11.5およびE12.5における正常マウスのニューロンの脳スキャンを示す。
この図で示したデータを作成するために使用した材料及び方法は以下の通りである。発生中のマウス胚におけるDR6 mRNA発現を可視化するために、DR6 3’UTR特異的放射標識化RNAプローブによるインサイツmRNAハイブリダイゼーション(ISH)を、E10.5−E12.5マウス胚の胸部軸レベルで取られた20μm組織横断切片上で実施した。mRNAロケーター・インサイツ・ハイブリダイゼーションキットを、ISH実験を行うために、mRNAロケータ使用説明書に沿って、製造者のプロトコルに従って使用した(Ambion Inc., Cat. No. 1803)。マウスDR6 3’UTRのアンチセンス配列に対応する放射標識化mRNAプローブは、マキシスクリプトキットを使用して、製造者の指示マニュアルに従って、インビトロ翻訳反応で作成された(Ambion Inc., Cat. No. 1308-1326)。DR6 mRNA発現データは、肺組織横断切片を有するスライドに塗られたコダック・オートラジオグラフィー乳剤(コダック)を使用して可視化した。写真は、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージング・ツァイス顕微鏡で暗視野で撮影した。
これらの実験でリボプローブを作成するために使用したDR6 cDNAの一次配列は以下のとおりである:
GAGCAGAAACGGCTCCTTTATTACCAAAGAAAAGAAGGACACAGTGTTGCGGCAGGTCCGCCTGGACCCCTGTGACTTGCAGCCCATCTTTGATGACATGCTGCATATCCTGAACCCCGAGGAGCTGCGGGTGATTGAAGAGATTCCCCAGGCTGAGGACAAACTGGACCGCCTCTTCGAGATCATTGGGGTCAAGAGCCAAGAAGCCAGCCAGACCCTCTTGGACTCTGTGTACAGTCATCTTCCTGACCTATTGTAGAACACAGGGGCACTGCATTCTGGGAATCAACCTACTGGCGG (配列番号: 3)
Allen Brain Atlas(http://www.brainatlas.org/aba/; the Allen Brain Atlasはマウス脳における約20,000遺伝子の発現のマップを提供する公的に利用可能な科学的リソースである)を使用した更なる解析は、DR6は成体脳の大脳皮質で高度に発現することを明らかにした。DR6 mRNAは、例えば皮質ニューロン、海馬CA1−CA4錐体ニューロン及び歯状回で発現する。DR6タンパク質は、成体の皮質及び海馬のニューロン細胞体で発現する。
このパターンの発現は、発生における役割の他に、DR6がニューロン細胞消失を伴う神経変性疾患の進行で機能する可能性もあるというエビデンスを提供する。
この図で示したデータを作成するために使用した材料及び方法は以下の通りである。発生中のマウス胚におけるDR6 mRNA発現を可視化するために、DR6 3’UTR特異的放射標識化RNAプローブによるインサイツmRNAハイブリダイゼーション(ISH)を、E10.5−E12.5マウス胚の胸部軸レベルで取られた20μm組織横断切片上で実施した。mRNAロケーター・インサイツ・ハイブリダイゼーションキットを、ISH実験を行うために、mRNAロケータ使用説明書に沿って、製造者のプロトコルに従って使用した(Ambion Inc., Cat. No. 1803)。マウスDR6 3’UTRのアンチセンス配列に対応する放射標識化mRNAプローブは、マキシスクリプトキットを使用して、製造者の指示マニュアルに従って、インビトロ翻訳反応で作成された(Ambion Inc., Cat. No. 1308-1326)。DR6 mRNA発現データは、肺組織横断切片を有するスライドに塗られたコダック・オートラジオグラフィー乳剤(コダック)を使用して可視化した。写真は、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージング・ツァイス顕微鏡で暗視野で撮影した。
これらの実験でリボプローブを作成するために使用したDR6 cDNAの一次配列は以下のとおりである:
GAGCAGAAACGGCTCCTTTATTACCAAAGAAAAGAAGGACACAGTGTTGCGGCAGGTCCGCCTGGACCCCTGTGACTTGCAGCCCATCTTTGATGACATGCTGCATATCCTGAACCCCGAGGAGCTGCGGGTGATTGAAGAGATTCCCCAGGCTGAGGACAAACTGGACCGCCTCTTCGAGATCATTGGGGTCAAGAGCCAAGAAGCCAGCCAGACCCTCTTGGACTCTGTGTACAGTCATCTTCCTGACCTATTGTAGAACACAGGGGCACTGCATTCTGGGAATCAACCTACTGGCGG (配列番号: 3)
Allen Brain Atlas(http://www.brainatlas.org/aba/; the Allen Brain Atlasはマウス脳における約20,000遺伝子の発現のマップを提供する公的に利用可能な科学的リソースである)を使用した更なる解析は、DR6は成体脳の大脳皮質で高度に発現することを明らかにした。DR6 mRNAは、例えば皮質ニューロン、海馬CA1−CA4錐体ニューロン及び歯状回で発現する。DR6タンパク質は、成体の皮質及び海馬のニューロン細胞体で発現する。
このパターンの発現は、発生における役割の他に、DR6がニューロン細胞消失を伴う神経変性疾患の進行で機能する可能性もあるというエビデンスを提供する。
実施例2:RNA干渉によるDR6発現の阻害は外植片培養における交連ニューロンの軸索変性を防ぐ
交連ニューロンは、発生ステージE9.5からE11.5の間の背側脊髄に生じる長突起脊髄介在ニューロンの群である。交連ニューロンは、その中間標的の一つである脊髄の底板からの栄養支持にその生存を依存していると考えられている。軸索が底板に沿って伸びた時、それらが追加の栄養の要求を起こした後に、この依存は数日間生じる。ついでながら中間軸索標的に由来する栄養支持へのニューロンの依存は、間違って突出したニューロンを急速に除去する機構を提供し、それは神経系の発生の間の異常な神経回路の形成を防ぐことを助ける可能性がある(Wang等, Nature, 401:765-769 (1999)。
交連ニューロンのプログラム細胞死及び軸索変性におけるDR6の機能的役割を調べるために、RNAiに基づく背側脊髄生存アッセイ(Kennedy等, Cell, 78:425-435 (1994); Wang等, supra, 1999)を実施した(図3参照)。E13ラット又はE11.5マウスの胚は、L15培地(ギブコ)に置き、緑色蛍光タンパク質(「GFP」)をコードするプラスミドと一緒にsiRNA(IDT)は神経管中に注入した。そして、siRNA及びプラスミドは、エレクトロポーレーションによって背側前駆細胞に投与された。背側脊髄外植片をばらばらにし、3Dコラーゲンゲル基質中に埋め、組換え体ネトリン1(R&D Pharmaceuticals)及び5%馬血清(シグマ)を有するOpti−MEM/F12培地(インビトロジェン)中で、37℃、5%CO2環境で培養した。化学誘因物質ネトリン1に応答して16時間以内に、交連軸索は外植片からコラーゲン・マトリックス・ゲル中に伸びる(Kennedy等, 上掲, 1994)。交連軸索は、倒立顕微鏡を使用した観察により、GFP蛍光で可視化される。
交連ニューロンは、発生ステージE9.5からE11.5の間の背側脊髄に生じる長突起脊髄介在ニューロンの群である。交連ニューロンは、その中間標的の一つである脊髄の底板からの栄養支持にその生存を依存していると考えられている。軸索が底板に沿って伸びた時、それらが追加の栄養の要求を起こした後に、この依存は数日間生じる。ついでながら中間軸索標的に由来する栄養支持へのニューロンの依存は、間違って突出したニューロンを急速に除去する機構を提供し、それは神経系の発生の間の異常な神経回路の形成を防ぐことを助ける可能性がある(Wang等, Nature, 401:765-769 (1999)。
交連ニューロンのプログラム細胞死及び軸索変性におけるDR6の機能的役割を調べるために、RNAiに基づく背側脊髄生存アッセイ(Kennedy等, Cell, 78:425-435 (1994); Wang等, supra, 1999)を実施した(図3参照)。E13ラット又はE11.5マウスの胚は、L15培地(ギブコ)に置き、緑色蛍光タンパク質(「GFP」)をコードするプラスミドと一緒にsiRNA(IDT)は神経管中に注入した。そして、siRNA及びプラスミドは、エレクトロポーレーションによって背側前駆細胞に投与された。背側脊髄外植片をばらばらにし、3Dコラーゲンゲル基質中に埋め、組換え体ネトリン1(R&D Pharmaceuticals)及び5%馬血清(シグマ)を有するOpti−MEM/F12培地(インビトロジェン)中で、37℃、5%CO2環境で培養した。化学誘因物質ネトリン1に応答して16時間以内に、交連軸索は外植片からコラーゲン・マトリックス・ゲル中に伸びる(Kennedy等, 上掲, 1994)。交連軸索は、倒立顕微鏡を使用した観察により、GFP蛍光で可視化される。
図4Aに示すように、底板に由来する栄養因子支持の非存在下での培養の48時間後、交連ニューロンはプログラム細胞死及び軸索変性を受ける(Wang等, 上掲, 1999を参照)。交連ニューロンにおけるDR6発現がDR6特異的siRNA分子により下方制御された場合、当該軸索変性は著しく遮断される(図4、下段パネル参照)。この軸索変性の阻害は、非標的siRNA分子を有するコントロール実験では観察されなかった。データは、DR6が、その中間標的である脊髄の底板からの栄養支持の離脱時の、交連ニューロンの軸索変性に必要な重要なプロアポトーシスレセプターであることを示唆する。
その中間標的の一つである脊髄の底板からの栄養支持にその生存を依存していると考えられている
図4Bに示すように、RNAi抵抗性DR6 cDNAは、DR6 siRNAにより遮断された変性表現型を救済する。
図4Bの左から右において、上段の4つの写真は、(1)コントロールRNAi;(2)DR6 siRNA#3に暴露された野生型DR6;(3)DR6 siRNA#2に暴露されたミスマッチDR6の存在下でのニューロンを示す。下段の2つの写真は、(1)コントロールsiRNA、siRNA#2、及びsiRNA#3の存在下での野生型DR6 mRNA;及び(2)コントロールsiRNA、siRNA#2、及びsiRNA#3の存在下でのミスマッチDR6 mRNAのオートラジオグラムを示す。
この図に示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下のとおりである。交連ニューロンのプログラム細胞死及び軸策変性におけるDR6レセプターの生理学的な役割を推定するために、当分野で既知のプロトコルに従った背側脊髄生存アッセイ(Kennedy等, Cell, 78:425-435 (1994); Wang等, Nature, 401:765-769 (1999))を実施した(データは図4Bに示す)。E13ラット胚を、L15培地(ギブコ)に置き、以下のsiRNAコンストラクトをそれらの神経管中に注入した(図4B):
野生型又はミスマッチDR6 cDNAのどちらか及びGFPをコードするプラスミドと合わせた、コントロール非標的、又は標的DR6 siRNA#2、又は標的DR6 siRNA#3(IDT)。DR6 cDNA及びGFP cDNAは、pCAGGSベクター・バックボーン(BCCM/LMBPから市販されている)にサブクローニングした。siRNA及びプラスミドは、エレクトロポーレーションによって、背側前駆細胞に投与された。背側脊髄外植片をばらばらにし、3Dコラーゲン・ゲル・マトリックス中に埋め、組換え体ネトリン1及び5%馬血清(シグマ)を有するOpti−MEM/F12培地(インビトロジェン)中で、37℃、5%CO2環境で培養した。化学誘因物質ネトリン1に応答して16時間以内に、交連軸索は外植片からコラーゲン・マトリックス・ゲル中に伸びる(Kennedy等, 上掲, 1994)。交連軸索は、倒立顕微鏡を使用した観察により、GFP蛍光で可視化される。底板に由来する栄養因子支持の非存在下での培養の48時間後、交連ニューロンはプログラム細胞死及び軸索変性を受ける(Wang等., Nature, 401:765-769 (1999)) (図4B)。しかしながら、軸索変性プログラムは標的DR6特異的siRNA#3の導入によって、遮断されうる(図4B)。DR6特異的siRNA#3の特異的で的確な効果は、軸索変性表現型が、DR6 siRNA#3と一緒のsiRNA#3抵抗性ミスマッチDR6 cDNAコンストラクトの共発現によって回復する救済実験において、さらに確認される(図4B)。提示した実験のエビデンスは、DR6レセプター機能が、その中間標的である脊髄の底板からの離脱時に、軸索変性及び交連ニューロンの死に必須であることを立証する。
上記のアッセイで使用したDR6 siRNAs#2及び#3の配列(センス鎖)、及びDR6 siRNA#3配列に相補的なDR6 cDNAのミスマッチ断片は以下のとおりである:
ラットDR6 siRNAs#2 5’−AAU CUG UUG AGU UCA UGC CUU −3’ (配列番号11)
ラットDR6 siRNAs#3 5’− CAA UAG GUC AGG AAG AUG GCU −3’ (配列番号12)
DR6 siRNA#3配列に相補的なラットDR6 cDNAのミスマッチ断片:5’−GGACTCTGTGTACAGTCACCTCCCAGATCTGTTATAG −3’(配列番号13)
その中間標的の一つである脊髄の底板からの栄養支持にその生存を依存していると考えられている
図4Bに示すように、RNAi抵抗性DR6 cDNAは、DR6 siRNAにより遮断された変性表現型を救済する。
図4Bの左から右において、上段の4つの写真は、(1)コントロールRNAi;(2)DR6 siRNA#3に暴露された野生型DR6;(3)DR6 siRNA#2に暴露されたミスマッチDR6の存在下でのニューロンを示す。下段の2つの写真は、(1)コントロールsiRNA、siRNA#2、及びsiRNA#3の存在下での野生型DR6 mRNA;及び(2)コントロールsiRNA、siRNA#2、及びsiRNA#3の存在下でのミスマッチDR6 mRNAのオートラジオグラムを示す。
この図に示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下のとおりである。交連ニューロンのプログラム細胞死及び軸策変性におけるDR6レセプターの生理学的な役割を推定するために、当分野で既知のプロトコルに従った背側脊髄生存アッセイ(Kennedy等, Cell, 78:425-435 (1994); Wang等, Nature, 401:765-769 (1999))を実施した(データは図4Bに示す)。E13ラット胚を、L15培地(ギブコ)に置き、以下のsiRNAコンストラクトをそれらの神経管中に注入した(図4B):
野生型又はミスマッチDR6 cDNAのどちらか及びGFPをコードするプラスミドと合わせた、コントロール非標的、又は標的DR6 siRNA#2、又は標的DR6 siRNA#3(IDT)。DR6 cDNA及びGFP cDNAは、pCAGGSベクター・バックボーン(BCCM/LMBPから市販されている)にサブクローニングした。siRNA及びプラスミドは、エレクトロポーレーションによって、背側前駆細胞に投与された。背側脊髄外植片をばらばらにし、3Dコラーゲン・ゲル・マトリックス中に埋め、組換え体ネトリン1及び5%馬血清(シグマ)を有するOpti−MEM/F12培地(インビトロジェン)中で、37℃、5%CO2環境で培養した。化学誘因物質ネトリン1に応答して16時間以内に、交連軸索は外植片からコラーゲン・マトリックス・ゲル中に伸びる(Kennedy等, 上掲, 1994)。交連軸索は、倒立顕微鏡を使用した観察により、GFP蛍光で可視化される。底板に由来する栄養因子支持の非存在下での培養の48時間後、交連ニューロンはプログラム細胞死及び軸索変性を受ける(Wang等., Nature, 401:765-769 (1999)) (図4B)。しかしながら、軸索変性プログラムは標的DR6特異的siRNA#3の導入によって、遮断されうる(図4B)。DR6特異的siRNA#3の特異的で的確な効果は、軸索変性表現型が、DR6 siRNA#3と一緒のsiRNA#3抵抗性ミスマッチDR6 cDNAコンストラクトの共発現によって回復する救済実験において、さらに確認される(図4B)。提示した実験のエビデンスは、DR6レセプター機能が、その中間標的である脊髄の底板からの離脱時に、軸索変性及び交連ニューロンの死に必須であることを立証する。
上記のアッセイで使用したDR6 siRNAs#2及び#3の配列(センス鎖)、及びDR6 siRNA#3配列に相補的なDR6 cDNAのミスマッチ断片は以下のとおりである:
ラットDR6 siRNAs#2 5’−AAU CUG UUG AGU UCA UGC CUU −3’ (配列番号11)
ラットDR6 siRNAs#3 5’− CAA UAG GUC AGG AAG AUG GCU −3’ (配列番号12)
DR6 siRNA#3配列に相補的なラットDR6 cDNAのミスマッチ断片:5’−GGACTCTGTGTACAGTCACCTCCCAGATCTGTTATAG −3’(配列番号13)
実施例3:抗DR6抗体によるDR6レセプター・シグナル伝達の阻害は外植片培養における交連ニューロンの軸索変性を防ぐ
(上の実施例2に記載のとおり)背側脊髄生存アッセイを抗DR6抗体を使用して実施した。(GFP用の緑色蛍光チャンネルを使用した)顕微鏡観察を交連軸索を可視化するために使用した。背側脊髄生存アッセイは、上の実施例2に概説した変更を加えて、当分野で既知のプロトコルに従って実施した(Kennedy等, Cell, 78:425-435 (1994); Wang等, Nature, 401:765-769 (1999))。E13ラット胚は、GFP発現プラスミドコンストラクトと共に神経管中に注入した(GFP cDNAは、BCCM/LMBPから市販されているpCAGGSベクターバックボーン中にサブクローニングした)。GFP発現プラスミドは、次にエレクトロポーレーションによって、背側前駆細胞に投与した。抗DR6遮断抗体又はコントロール正常マウスIgGを、交連外植片に、プレーティング24時間後、40μg/mlで加えた。交連外植片の写真を、下に概説するように、プレーティング48時間後、撮影した。GFPを発現する交連軸索を可視化するために、写真は、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxiovert 200ツァイス倒立顕微鏡(GFP用の緑色蛍光チャンネル)で撮影した。
この実験で使用した抗DR6抗体は以下のように作成した。
Fcに融合したヒトDR6細胞外ドメイン配列(hDR6-ECD-Fc)を免疫原として抗DR6マウスモノクローナル抗体を作成するために使用した。使用したhDR6-ECD-Fc免疫原は以下のとおりである。
MGTSPSSSTALASCSRIARRATATMIAGSLLLLGFLSTTTAQPEQKASNLIGTYRHVDRATGQVLTCDKCPAGTYVSEHCTNTSLRVCSSCPVGTFTRHENGIEKCHDCSQPCPWPMIEKLPCAALTDRECTCPPGMFQSNATCAPHTVCPVGWGVRKKGTETEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAYTDCLSQNLVVIKPGTKETDNVCGTLPSFSSSTSPSPGTAIFPRPEHMETHEVPSSTYVPKGMNSTESNSSASVRPKVLSSIQEGTVPDNTSSARGKEDVNKTLPNLQVVNHQQGPHHRHILKLLPSMEATGGEKSSTPIKGPKRGHPRQNLHKHFDINEHLPWMIPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号4)
(上の実施例2に記載のとおり)背側脊髄生存アッセイを抗DR6抗体を使用して実施した。(GFP用の緑色蛍光チャンネルを使用した)顕微鏡観察を交連軸索を可視化するために使用した。背側脊髄生存アッセイは、上の実施例2に概説した変更を加えて、当分野で既知のプロトコルに従って実施した(Kennedy等, Cell, 78:425-435 (1994); Wang等, Nature, 401:765-769 (1999))。E13ラット胚は、GFP発現プラスミドコンストラクトと共に神経管中に注入した(GFP cDNAは、BCCM/LMBPから市販されているpCAGGSベクターバックボーン中にサブクローニングした)。GFP発現プラスミドは、次にエレクトロポーレーションによって、背側前駆細胞に投与した。抗DR6遮断抗体又はコントロール正常マウスIgGを、交連外植片に、プレーティング24時間後、40μg/mlで加えた。交連外植片の写真を、下に概説するように、プレーティング48時間後、撮影した。GFPを発現する交連軸索を可視化するために、写真は、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxiovert 200ツァイス倒立顕微鏡(GFP用の緑色蛍光チャンネル)で撮影した。
この実験で使用した抗DR6抗体は以下のように作成した。
Fcに融合したヒトDR6細胞外ドメイン配列(hDR6-ECD-Fc)を免疫原として抗DR6マウスモノクローナル抗体を作成するために使用した。使用したhDR6-ECD-Fc免疫原は以下のとおりである。
MGTSPSSSTALASCSRIARRATATMIAGSLLLLGFLSTTTAQPEQKASNLIGTYRHVDRATGQVLTCDKCPAGTYVSEHCTNTSLRVCSSCPVGTFTRHENGIEKCHDCSQPCPWPMIEKLPCAALTDRECTCPPGMFQSNATCAPHTVCPVGWGVRKKGTETEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAYTDCLSQNLVVIKPGTKETDNVCGTLPSFSSSTSPSPGTAIFPRPEHMETHEVPSSTYVPKGMNSTESNSSASVRPKVLSSIQEGTVPDNTSSARGKEDVNKTLPNLQVVNHQQGPHHRHILKLLPSMEATGGEKSSTPIKGPKRGHPRQNLHKHFDINEHLPWMIPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号4)
融合ポリペプチドは、前に記載されたイムノアドヘシンプロトコルを使用して作成した(Ashkenazi等, Curr Opin Immunol.,9(2):195-200 (1997); Haak-Frendscho等, J Immunol., 152(3):1347-53 (1994))。9週齢Balb/cマウスを、約8週間にわたって、100μlのhDR6-ECD-Fcの注射により免疫化した。次に、免疫化した全てのマウスのリンパ節(11×106細胞/ml、5ml)をPU.1骨髄腫細胞(ATCCからのマウス骨髄腫細胞)と、濃度5×106細胞/ml、5mlで融合した。細胞は、2×106細胞/mlで4プレートにまいた。
捕捉ELISAを、上記のhDR6-ECD-Fcポリペプチドに特異的に結合するハイブリドーマをスクリーニングするために使用した。プレートは、4℃で一晩、50μlの2μg/mlヤギ抗ヒトIgG Fc specific(Cappel Cat. No. 55071)でコートした。プレートをBrijを加えたPBSで3回洗浄し、プレートは200μlの2%BSAで、1時間室温でブロックした。次にプレートはBrijを加えたPBSで3回洗浄した。100μlの第1抗体をウェルに入れ、シェーカー上で1時間インキュベートした。再度、プレートをBrijを加えたPBSで3回洗浄した。100μlのヒツジ抗マウスIgG HRP(ヒトへの交差なし、Cappel Cat. No. 55569)抗体、1:1000で1時間。プレートはBrijを加えたPBSで3回洗浄した。50μlの基質(TMBマイクロウェル・ペルオキシダーゼKPL#50-76-05)を加え、プレートを5分間インキュベートした。反応は50μl/ウェルのストップ溶液(KPL #50-85-05)で止めた。吸光度は450nmで読んだ。使用したアッセイ・バッファーはPBS、5%BSA、及び0.05%Tween20を含んでいた。
捕捉ELISAでhDR6-ECD-Fcポリペプチドへの結合性が陽性と検査されたハイブリドーマは、次に限界希釈法によりクローニングした(10%HCF、10%FCSを含むSCDME培地)。10日後のプレートを取り出し、1つのコロニーを有するウェルを上記の捕捉ELISAでアッセイした。さまざまな選択されたモノクローナル抗体がイソタイプを検査され、IgG1イソタイプであることが示された。
「3B11.7.7」;「3F4.4.8」;「4B6.9.7」;及び「1E5.5.7」として同定された4つの抗DR6mAbsは、軸索変性を阻害する能力について、背側脊髄生存アッセイで試験された。
特に、いくつかのこれらの抗DR6mAbs(3F4.4.8;4B6.9.7;及び1E5.5.7)は、培養において、48時間の栄養欠乏により誘導された交連ニューロンの軸索変性を部分的に抑制できた(図5参照)。当該抗体は、例えば、推定DR6リガンドとDR6レセプターとの間の相互作用を遮断することによって、又はリガンド非依存性DR6シグナル伝達を阻害することによって、ニューロンの生存を促進する可能性があると考えられている。3B11.7.7DR6抗体は、軸索変性の誘導において、わずかな促進作用を有していた。
捕捉ELISAを、上記のhDR6-ECD-Fcポリペプチドに特異的に結合するハイブリドーマをスクリーニングするために使用した。プレートは、4℃で一晩、50μlの2μg/mlヤギ抗ヒトIgG Fc specific(Cappel Cat. No. 55071)でコートした。プレートをBrijを加えたPBSで3回洗浄し、プレートは200μlの2%BSAで、1時間室温でブロックした。次にプレートはBrijを加えたPBSで3回洗浄した。100μlの第1抗体をウェルに入れ、シェーカー上で1時間インキュベートした。再度、プレートをBrijを加えたPBSで3回洗浄した。100μlのヒツジ抗マウスIgG HRP(ヒトへの交差なし、Cappel Cat. No. 55569)抗体、1:1000で1時間。プレートはBrijを加えたPBSで3回洗浄した。50μlの基質(TMBマイクロウェル・ペルオキシダーゼKPL#50-76-05)を加え、プレートを5分間インキュベートした。反応は50μl/ウェルのストップ溶液(KPL #50-85-05)で止めた。吸光度は450nmで読んだ。使用したアッセイ・バッファーはPBS、5%BSA、及び0.05%Tween20を含んでいた。
捕捉ELISAでhDR6-ECD-Fcポリペプチドへの結合性が陽性と検査されたハイブリドーマは、次に限界希釈法によりクローニングした(10%HCF、10%FCSを含むSCDME培地)。10日後のプレートを取り出し、1つのコロニーを有するウェルを上記の捕捉ELISAでアッセイした。さまざまな選択されたモノクローナル抗体がイソタイプを検査され、IgG1イソタイプであることが示された。
「3B11.7.7」;「3F4.4.8」;「4B6.9.7」;及び「1E5.5.7」として同定された4つの抗DR6mAbsは、軸索変性を阻害する能力について、背側脊髄生存アッセイで試験された。
特に、いくつかのこれらの抗DR6mAbs(3F4.4.8;4B6.9.7;及び1E5.5.7)は、培養において、48時間の栄養欠乏により誘導された交連ニューロンの軸索変性を部分的に抑制できた(図5参照)。当該抗体は、例えば、推定DR6リガンドとDR6レセプターとの間の相互作用を遮断することによって、又はリガンド非依存性DR6シグナル伝達を阻害することによって、ニューロンの生存を促進する可能性があると考えられている。3B11.7.7DR6抗体は、軸索変性の誘導において、わずかな促進作用を有していた。
実施例4:JUN N末端キナーゼ(JNKI)の特異的ペプチドインヒビターによるDR6レセプターシグナル伝達の阻害
DR6レセプターはJNKの活性化を介してシグナル伝達されることが報告されており、JNK活性はDR6ヌルマウスモデルで損なわれていることが認められた(Pan等, FEBS Lett., 431:351-356 (1998); Zhao等, Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001))。軸索変性におけるDR6-JNKシグナル伝達の役割を調べるために、JNKシグナル伝達経路が、ペプチドインヒビターであるL-JNK-I((L)-HIV-TAT48-57-PP-JBD20; Calbiochem)を1μM濃度で使用することによって、交連ニューロンにおいて遮断されたことを除いて、(上の実施例2に記載のとおり)背側脊髄生存アッセイを実施した。DMSO(シグマ)及び正常マウスIgGをコントロールとして試験した。
図6に示したように、このJNKシグナル伝達の阻害は背側脊髄生存アッセイで軸索変性を部分的に遮断した。データは、DR6は、少なくとも一部分においてはJNK経路を介して軸索突起の変性に信号をおくることを示唆する。
DR6レセプターはJNKの活性化を介してシグナル伝達されることが報告されており、JNK活性はDR6ヌルマウスモデルで損なわれていることが認められた(Pan等, FEBS Lett., 431:351-356 (1998); Zhao等, Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001))。軸索変性におけるDR6-JNKシグナル伝達の役割を調べるために、JNKシグナル伝達経路が、ペプチドインヒビターであるL-JNK-I((L)-HIV-TAT48-57-PP-JBD20; Calbiochem)を1μM濃度で使用することによって、交連ニューロンにおいて遮断されたことを除いて、(上の実施例2に記載のとおり)背側脊髄生存アッセイを実施した。DMSO(シグマ)及び正常マウスIgGをコントロールとして試験した。
図6に示したように、このJNKシグナル伝達の阻害は背側脊髄生存アッセイで軸索変性を部分的に遮断した。データは、DR6は、少なくとも一部分においてはJNK経路を介して軸索突起の変性に信号をおくることを示唆する。
実施例5:抗DR6抗体によるDR6レセプターシグナル伝達の阻害はマウス胚の脊髄における神経細胞死を防ぐ
DR6シグナル伝達が全胚培養系において抗DR6mAbsによって遮断されるアッセイを実施した。下に記載するように、この系により、全マウス胚を発生ステージE9.5〜E11.5から、2日間バイアル中でインビボで培養することができる。E9.5胚は、胚に付着する卵黄嚢を有する子宮から切り出され、100%ラット血清(Harlan)中、37℃で、第一日目は65%酸素雰囲気で及び第2日目95%酸素で培養した。(上の実施例に記載の)抗DR6mAbsを、10μg/mlの最終濃度でアッセイに加え、濃度10μg/mlの正常マウスIgG抗体をコントロールとして使用した。
切断されたカスパーゼ3を認識する抗体(R&D Systemsより購入したマウス切断カスパーゼ3の抗体)による免疫蛍光染色を検出に使用し、顕微鏡によってアポトーシス細胞を観察した。結果は図7に図示する。特に、抗DR6mAbs 3F4.4.8;4B6.9.7;及び1E5.5.7によるDR6の阻害は、この系において、天然に生じる発生上の細胞死に対して脊髄ニューロンを保護する。
DR6シグナル伝達が全胚培養系において抗DR6mAbsによって遮断されるアッセイを実施した。下に記載するように、この系により、全マウス胚を発生ステージE9.5〜E11.5から、2日間バイアル中でインビボで培養することができる。E9.5胚は、胚に付着する卵黄嚢を有する子宮から切り出され、100%ラット血清(Harlan)中、37℃で、第一日目は65%酸素雰囲気で及び第2日目95%酸素で培養した。(上の実施例に記載の)抗DR6mAbsを、10μg/mlの最終濃度でアッセイに加え、濃度10μg/mlの正常マウスIgG抗体をコントロールとして使用した。
切断されたカスパーゼ3を認識する抗体(R&D Systemsより購入したマウス切断カスパーゼ3の抗体)による免疫蛍光染色を検出に使用し、顕微鏡によってアポトーシス細胞を観察した。結果は図7に図示する。特に、抗DR6mAbs 3F4.4.8;4B6.9.7;及び1E5.5.7によるDR6の阻害は、この系において、天然に生じる発生上の細胞死に対して脊髄ニューロンを保護する。
実施例6:DR6ヌルマウスにおける神経細胞死の減少
DR6ノックアウト胚の表現型(Zhao等., Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001)を、発生ステージE15.5で解析した。切断されたカスパーゼ3はアポトーシス細胞のマーカーであり、胚の脊髄における神経細胞死の範囲を調べるために、切断されたカスパーゼ3の免疫染色(R&D Systemsより購入したマウス切断カスパーゼ3の抗体)を使用した。また、DR6非相同同腹仔をコントロールとして分析した。パラホルムアルデヒド(PFA)固定された胚組織切片を1時間、ブロッキング溶液(2%加熱不活性化ヤギ血清(Sigma)/PBS(Gibco)/0.1%トリトン(Sigma))中でブロックし、1次抗体(R&D Systemsより購入したマウス切断カスパーゼ3の抗体の1:500希釈)により、ブロッキング溶液中で、1晩4℃でインキュベートした。切片は、室温で1時間ブロッキング溶液により3回洗浄し、2次抗体(ヤギ抗ウサギAlexa488、Molecular Probes, Invitrogen、の1:500希釈)で室温で1時間、インキュベートした。次に、切片は室温で1時間、ブロッキング溶液により洗浄し、緑色チャネルで免疫蛍光により可視化した。
胚につき脊髄切片ごとのカスパーゼ3陽性の核の数を数値化した(図8及び9A参照)。DR6ヘテロ接合同腹仔コントロールと比較して、DR6ヌルマウス脊髄および後根神経節(「DRG」)における神経細胞死の約40から50%の減少を検出した(図8及び9A参照)。従って、DR6シグナル伝達は、インビボで、発生中の神経系における神経細胞死を促進する可能性があると考えられる。
DR6ノックアウト胚の表現型(Zhao等., Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001)を、発生ステージE15.5で解析した。切断されたカスパーゼ3はアポトーシス細胞のマーカーであり、胚の脊髄における神経細胞死の範囲を調べるために、切断されたカスパーゼ3の免疫染色(R&D Systemsより購入したマウス切断カスパーゼ3の抗体)を使用した。また、DR6非相同同腹仔をコントロールとして分析した。パラホルムアルデヒド(PFA)固定された胚組織切片を1時間、ブロッキング溶液(2%加熱不活性化ヤギ血清(Sigma)/PBS(Gibco)/0.1%トリトン(Sigma))中でブロックし、1次抗体(R&D Systemsより購入したマウス切断カスパーゼ3の抗体の1:500希釈)により、ブロッキング溶液中で、1晩4℃でインキュベートした。切片は、室温で1時間ブロッキング溶液により3回洗浄し、2次抗体(ヤギ抗ウサギAlexa488、Molecular Probes, Invitrogen、の1:500希釈)で室温で1時間、インキュベートした。次に、切片は室温で1時間、ブロッキング溶液により洗浄し、緑色チャネルで免疫蛍光により可視化した。
胚につき脊髄切片ごとのカスパーゼ3陽性の核の数を数値化した(図8及び9A参照)。DR6ヘテロ接合同腹仔コントロールと比較して、DR6ヌルマウス脊髄および後根神経節(「DRG」)における神経細胞死の約40から50%の減少を検出した(図8及び9A参照)。従って、DR6シグナル伝達は、インビボで、発生中の神経系における神経細胞死を促進する可能性があると考えられる。
図9Bに示すように、DR6は、DR6ヌルマウスで証明されたように、運動軸索変性に必要である。発生ステージE13.5における正常及びDR6ノックアウト胚由来の腹側脊髄外植片(運動ニューロン)(Zhao等, Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001)を、脳由来神経栄養因子(BDBF)及びニューロトロフィン3(NT3)(Chemiconから得たBDNF及びNT-3)の存在下及び非存在下で分析した。
図9Bにおいて、上段左パネルは、BDNF及びNT-3の存在下での正常マウス由来の腹側脊髄外植片を示し、下段左パネルはBDNF及びNT-3の存在下でのDR6ノックアウト(KO)マウス由来の腹側脊髄外植片を示す。同様に、上段右パネルはこれらの成長因子の非存在下の正常マウス由来の腹側脊髄外植片を示し、下段右パネルはこれらの成長因子の非存在下のDR6ノックアウト(KO)マウスの腹側脊髄外植片を示す。
この図9Bに示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下のとおりである。運動ニューロン腹側脊髄生存アッセイを、わずかな変更を加えてHenderson等, Nature, 363:266-270 (1993)に記載のとおり実施した。DR6ヘテロ接合又はDR6ヌルマウスE13.5胚を、アルコール処理したはさみを使用してばらばらにし、暖かいL15培地(ギブコ)に置いた。同じはさみ及び鉗子を使用して、胚の腹側領域を広げ、器官を除き、肋骨を切除し、全脊髄をばらばらにし、取り囲んでいる髄膜組織を鉗子で除去した。蓋板を除去し、脊髄のオープンブックプレップを得た。MMC及びLMC運動柱を含む脊髄の腹側半分を分離し、残りの底板組織を注意深く切除した。腹側脊髄を、更にタングステン針を使用して外植片に切り分けるために、L15で覆われているイエローチップで、L15+5%FBS(シグマ)血清を有する新しい小皿に移した。PDL/ラミニンで覆われた8ウェルスライド(Becton, Dickinson and Company)をウェルにつき500μlのニューロベーサル培地(Invitrogen)+それぞれ50ng/mlの組換えBDNF及びNT-3(Chemicon)、+B-27サプリメントX50(Invitrogen);+ペンストリップグルタミンX100(Cat. No. 10378-016; ギブコ)+グルコースX100で満たした。腹側脊髄外植片切片を各ウェルに置き(ウェルにつき2-3外植片)、成長のため48時間37℃においた。2日後、栄養因子欠乏が、以下の通りに実施された:古い培地を取り除き、ウェルをニューロベーサル培地(栄養因子なし)で、優しく2回洗浄した。
抗BDNF及び抗NT3ブロッキング抗体(Genentech, Inc.)を加えた、前もって暖めた(栄養因子なしで上記のとおり調製した)ニューロベーサル培地/B−27 (Invitrogen) を20μg/mlで加えた。外植片を有するスライドは、次に37℃で、別に24−48時間、インキュベートした。
2日後、外植片を4%PFAのPBS中で固定し、0℃で10分間ネットゲル(Nikolaev等, 2003, Cell, 112(1), 29-40)中で0.2%トリトンで浸透し、ネットゲルで2回洗浄した。非特異的結合部位をブロックするために、スライドは1%BSAのPBS中で4℃でインキュベートした。変性した運動軸索を可視化するために、抗p75NTR特異的抗体(1:500希釈、Chemicon)による免疫染色を、翌日、実施した(1次Ab 1:500 1%BSA/PBS中で一晩4℃、2次Ab 1:500 室温で1時間)。ウェルは引き出され、フルオロマウントGがスライドをカバーガラスでマウントするために使用された。p75NTR発現運動軸索を可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージング ツァイス顕微鏡で撮影した。
図9Bにおいて、上段左パネルは、BDNF及びNT-3の存在下での正常マウス由来の腹側脊髄外植片を示し、下段左パネルはBDNF及びNT-3の存在下でのDR6ノックアウト(KO)マウス由来の腹側脊髄外植片を示す。同様に、上段右パネルはこれらの成長因子の非存在下の正常マウス由来の腹側脊髄外植片を示し、下段右パネルはこれらの成長因子の非存在下のDR6ノックアウト(KO)マウスの腹側脊髄外植片を示す。
この図9Bに示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下のとおりである。運動ニューロン腹側脊髄生存アッセイを、わずかな変更を加えてHenderson等, Nature, 363:266-270 (1993)に記載のとおり実施した。DR6ヘテロ接合又はDR6ヌルマウスE13.5胚を、アルコール処理したはさみを使用してばらばらにし、暖かいL15培地(ギブコ)に置いた。同じはさみ及び鉗子を使用して、胚の腹側領域を広げ、器官を除き、肋骨を切除し、全脊髄をばらばらにし、取り囲んでいる髄膜組織を鉗子で除去した。蓋板を除去し、脊髄のオープンブックプレップを得た。MMC及びLMC運動柱を含む脊髄の腹側半分を分離し、残りの底板組織を注意深く切除した。腹側脊髄を、更にタングステン針を使用して外植片に切り分けるために、L15で覆われているイエローチップで、L15+5%FBS(シグマ)血清を有する新しい小皿に移した。PDL/ラミニンで覆われた8ウェルスライド(Becton, Dickinson and Company)をウェルにつき500μlのニューロベーサル培地(Invitrogen)+それぞれ50ng/mlの組換えBDNF及びNT-3(Chemicon)、+B-27サプリメントX50(Invitrogen);+ペンストリップグルタミンX100(Cat. No. 10378-016; ギブコ)+グルコースX100で満たした。腹側脊髄外植片切片を各ウェルに置き(ウェルにつき2-3外植片)、成長のため48時間37℃においた。2日後、栄養因子欠乏が、以下の通りに実施された:古い培地を取り除き、ウェルをニューロベーサル培地(栄養因子なし)で、優しく2回洗浄した。
抗BDNF及び抗NT3ブロッキング抗体(Genentech, Inc.)を加えた、前もって暖めた(栄養因子なしで上記のとおり調製した)ニューロベーサル培地/B−27 (Invitrogen) を20μg/mlで加えた。外植片を有するスライドは、次に37℃で、別に24−48時間、インキュベートした。
2日後、外植片を4%PFAのPBS中で固定し、0℃で10分間ネットゲル(Nikolaev等, 2003, Cell, 112(1), 29-40)中で0.2%トリトンで浸透し、ネットゲルで2回洗浄した。非特異的結合部位をブロックするために、スライドは1%BSAのPBS中で4℃でインキュベートした。変性した運動軸索を可視化するために、抗p75NTR特異的抗体(1:500希釈、Chemicon)による免疫染色を、翌日、実施した(1次Ab 1:500 1%BSA/PBS中で一晩4℃、2次Ab 1:500 室温で1時間)。ウェルは引き出され、フルオロマウントGがスライドをカバーガラスでマウントするために使用された。p75NTR発現運動軸索を可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージング ツァイス顕微鏡で撮影した。
図9Cに開示するデータに示すように、傷害誘導性変性はDR6ノックアウトマウスで遅延した。
図9Cの左から右において、上段4パネルは、神経成長因子(NGF)の存在下;傷害後、それぞれ4、8又は17時間後の正常マウス由来のニューロンを示す。図9Cの左から右において、下段4パネルは、外因性神経成長因子(NGF)の存在下;傷害後、それぞれ4、8又は16時間後のDR6KOマウス由来のニューロンを左から右に示す。
図9Cに示すようにインビトロ感覚軸索病変アッセイを以下のように実施した。DR6ヘテロ接合又はDR6ヌルマウスE12.5胚を切り出し、暖めたL15培地(ギブコ)に置いた。同じはさみ及び鉗子を使用して、胚の腹側領域を広げ、器官を除き、肋を切除し、脊髄に付着した後根神経節(DRGs)は鉗子によりばらばらにした。次にDRGは、更にタングステン針を使用して1/4DRG外植片に切り分けるために、L15で覆われているイエローチップで、L15+5%FBS(シグマ)血清を有する新しい小皿に移した。
PDL/ラミニンで事前に覆われたプラスチック8ウェルスライド(Becton, Dickinson and Company)を、ウェルにつき500μlのニューロベーサル培地(Invitrogen)+50ng/mlのNGF(Roche Molecular Biochemicals)、+B-27サプリメントX50(Invitrogen);+ペンストリップグルタミンX100;+グルコースX100で満たした。DRG外植片切片を各ウェルに置き(ウェルにつき2-3DRG外植片)、成長のため48時間37℃においた。2日後、軸索病変アッセイが、以下の通りに実施された:傷害は、マイクロナイフ(Fine Science Tools)によるDRG外植片の真上と真下の感覚軸索の2つの平行な切れ込みを作ることによる誘導した。DRG外植片の右側と左側の切られていない軸索は病変のない内在性コントロールとして保存した。切られたDRG外植片を有するスライドは、傷害後0、4、8、16及び24時間後、4%PFAのPBS中、0℃で10分間ネットゲル(Nikolaev等, 2003, Cell, 112(1), 29-40)中で0.2%トリトンで浸透し、ネットゲルで2回洗浄した。非特異的結合部位をブロックするために、スライドは1%BSAのPBS中、4℃でインキュベートした。変性した感覚軸索を可視化するために、神経のクラスIIIβチューブリン (TUJ1)特異的抗体(1:500希釈、Covance)による免疫染色を、翌日、実施した(1次Ab 1:500 1%BSA/PBS中で一晩4℃、2次Ab 1:500 室温で1時間)。ウェルは引き出され、フルオロマウントGがスライドをカバーガラスでマウントするために使用された。免疫蛍光により感覚軸索を可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージング ツァイス顕微鏡で撮影した。
図9Cの左から右において、上段4パネルは、神経成長因子(NGF)の存在下;傷害後、それぞれ4、8又は17時間後の正常マウス由来のニューロンを示す。図9Cの左から右において、下段4パネルは、外因性神経成長因子(NGF)の存在下;傷害後、それぞれ4、8又は16時間後のDR6KOマウス由来のニューロンを左から右に示す。
図9Cに示すようにインビトロ感覚軸索病変アッセイを以下のように実施した。DR6ヘテロ接合又はDR6ヌルマウスE12.5胚を切り出し、暖めたL15培地(ギブコ)に置いた。同じはさみ及び鉗子を使用して、胚の腹側領域を広げ、器官を除き、肋を切除し、脊髄に付着した後根神経節(DRGs)は鉗子によりばらばらにした。次にDRGは、更にタングステン針を使用して1/4DRG外植片に切り分けるために、L15で覆われているイエローチップで、L15+5%FBS(シグマ)血清を有する新しい小皿に移した。
PDL/ラミニンで事前に覆われたプラスチック8ウェルスライド(Becton, Dickinson and Company)を、ウェルにつき500μlのニューロベーサル培地(Invitrogen)+50ng/mlのNGF(Roche Molecular Biochemicals)、+B-27サプリメントX50(Invitrogen);+ペンストリップグルタミンX100;+グルコースX100で満たした。DRG外植片切片を各ウェルに置き(ウェルにつき2-3DRG外植片)、成長のため48時間37℃においた。2日後、軸索病変アッセイが、以下の通りに実施された:傷害は、マイクロナイフ(Fine Science Tools)によるDRG外植片の真上と真下の感覚軸索の2つの平行な切れ込みを作ることによる誘導した。DRG外植片の右側と左側の切られていない軸索は病変のない内在性コントロールとして保存した。切られたDRG外植片を有するスライドは、傷害後0、4、8、16及び24時間後、4%PFAのPBS中、0℃で10分間ネットゲル(Nikolaev等, 2003, Cell, 112(1), 29-40)中で0.2%トリトンで浸透し、ネットゲルで2回洗浄した。非特異的結合部位をブロックするために、スライドは1%BSAのPBS中、4℃でインキュベートした。変性した感覚軸索を可視化するために、神経のクラスIIIβチューブリン (TUJ1)特異的抗体(1:500希釈、Covance)による免疫染色を、翌日、実施した(1次Ab 1:500 1%BSA/PBS中で一晩4℃、2次Ab 1:500 室温で1時間)。ウェルは引き出され、フルオロマウントGがスライドをカバーガラスでマウントするために使用された。免疫蛍光により感覚軸索を可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージング ツァイス顕微鏡で撮影した。
実施例7:抗DR6抗体アンタゴニストはニューロンの変性を阻害する
図10Aに示すように、抗DR6抗体は、(軸索変性のアッセイにおいて)さまざまな栄養因子欠乏性ニューロンの変性を阻害する。
図10Aの左から右において、上段及び下段の最初の2つ写真は交連ニューロンのデータを示す。これら最初の4つの写真では、上段の2つの写真はそれぞれコントロールIgG及びRA.5 DR6抗体の存在下の交連ニューロンを示し、さらに下段の2つの写真はそれぞれRA.1 DR6抗体及びRA.3 DR6抗体の存在下の交連ニューロンを示す。図10Aの上段及び下段の中央の2つの写真は、感覚ニューロンのデータを示す。これら中央の4つの写真では、上段2つの写真がそれぞれNGF存在下及び非存在下の感覚ニューロンを示し、さらに下段2つの写真がNGFの非存在下だが、それぞれRA.1 DR6抗体及びRA.3 DR6抗体の存在下の感覚ニューロンを示す。図10Aの右側の上段及び下段の2つは、運動ニューロンのデータを示す。これら右の4つの写真では、上段2つの写真はそれぞれ成長因子の存在下及び非存在下の運動ニューロンを示し、さらに下段2つの写真が成長因子の非存在下だが、それぞれRA.1 DR6抗体及びRA.3 DR6抗体の存在下の運動ニューロンを示す。
この図で示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下のとおりである。マウスモノクローナルRA.1−RA.5 DR6抗体は、上の実施例3で記載の通り、DR6外部ドメインでマウスを免疫化することによって作成した。この実施例及び図で「RA.1」及び「RA.3」抗体と称されるDR6抗体は、実施例3に記載の、それぞれ「1E5.5.7」及び「3F4.4.8」抗体である(例えば、単純に別の命名の使用を参照する)。同様に、この実施例及び図で「RA.5」抗体と称されるDR6抗体は、実施例3に記載の、「3B11.7.7」抗体である(例えば、別の命名の使用を参照している)。
感覚、運動、及び交連外植片培養を、以下の変更を加えて、実施例2及び実施例6に記載のとおり、実施した。交連外植片生存アッセイの場合、DR6抗体RA.1又はRA.3、又はコントロールIgGを、播種24時間後、最終濃度20μg/mlで、交連外植片培養に加えた(図10A)。感覚外植片培養の場合、NGF欠乏アッセイを、播種48時間後、実施した。NGF遮断抗体(ジェネンテック、インク)と共に明記のDR6抗体(RA.1又はRA.3)又はコントロールIgGを含む新鮮なニューロベーサル培地を、播種48時間後、最終濃度20μg/mlで、感覚外植片培養に加えた(図10A)。運動外植片培養の場合、栄養因子欠乏アッセイは播種後48時間実施した。NT3/BDNFなしで、且つBDNF遮断及びNT3遮断抗体(機能遮断栄養因子mAbs、ジェネンテック、インク)と共に明記のDR6抗体(RA.1又はRA.3)又はコントロールIgGを含む新鮮なニューロベーサル培地を、播種48時間後、最終濃度20μg/mlで、感覚外植片培養に加えた(図10A)。抗TUJI(Covance)及び抗p75NTR(Chemicon/Millipore)抗体で免疫蛍光染色により標識化された感覚及び運動軸索を然るべく可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージングツァイス顕微鏡で撮影した。GFP発現交連軸索を可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxiovert 200ツァイス倒立顕微鏡で(GFP用緑色蛍光チャネルで)撮影した。
図10Bで示すように、抗DR6抗体は、(TUNEL染色によるアポトーシス細胞体のアッセイにおいて)さまざまな栄養因子欠乏性ニューロンの変性を阻害する。図10Bの左から順番に、上段及び下段の2つの写真は交連ニューロンのデータを示す。これら最初の4つの写真では、上段の2つの写真は、それぞれコントロールIgG及びRA.5 DR6抗体の存在下の交連ニューロンを示し、更に下段の2つの写真はそれぞれRA.1 DR6抗体及びRA.3 DR6抗体の存在下の交連ニューロンを示す。図10Bの上段及び下段の中央セットの2つの写真は、感覚ニューロンのデータを示す。これら中央の4つの写真では、上段2つの写真がそれぞれNGF存在下及び非存在下の感覚ニューロンを示し、さらに下段2つの写真はNGFの非存在下だが、それぞれRA.1 DR6抗体及びRA.3 DR6抗体の存在下の感覚ニューロンを示す。図10Bの右側の上段及び下段の2つは、運動ニューロンのデータを示す。これら4つの写真では、上段2つの写真はそれぞれ成長因子の存在下及び非存在下の運動ニューロンを示し、さらに下段2つの写真は成長因子の非存在下だが、それぞれRA.1 DR6抗体及びRA.3 DR6抗体の存在下の運動ニューロンを示す。
図10の開示は、リガンドが軸索変性におけるDR6機能にとって重要な役割を果たす可能性を示唆する。
この図で示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下の通りである。上記のとおり、マウスモノクローナル抗体RA.1−RA.5 DR6抗体は、上の実施例3に記載のようにDR6外部ドメインでの免疫化により作成された。感覚、運動及び交連外植片培養は、以下に概説する変更を加えて、上記の実施例2及び実施例6のように実施された。交連外植片生存アッセイの場合には、上の実施例3に記載のように、DR6抗体RA.1及びRA.3、抗体RA.5(あるいは「1B11.7.7」と称される、ジェネンテック、インク)、又はコントロールIgG(ジェネンテック、インク)を播種24時間後、最終濃度20μg/mlで、それぞれ加えた(図10B、左)。
感覚外植片培養の場合、NGF欠乏アッセイを播種48時間後、実施した。NGFなしで、且つDR6抗体 RA.1又はRA.3、又はコントロールIgG(ジェネンテック、インク)と共にNGF遮断抗体(ジェネンテック、インク)を有する新鮮なニューロベーサル培地を播種48時間後、最終濃度20μg/mlで感覚外植片培養に加えた。運動外植片培養の場合、栄養因子欠乏アッセイを播種48時間後、実施した。NT3/BDNFなしで、 RA.1又はRA.3、又はコントロールIgG(ジェネンテック、インク)と共にNT3遮断抗体(機能遮断栄養因子mAbs、ジェネンテック、インク)を有する新鮮なニューロベーサル培地を播種48時間後、最終濃度20μg/mlで感覚外植片培養に加えた(図10B、右)。
外植片は、4%PFA/PBS中で固定し、インサイツ細胞死検出キット(Cat. No. 11 684 795 910, ロッシュ)を使用して、製造者の指示書(ロッシュ)に従って、DNA鎖切断の標識化(TUNNEL技術)に基づいて、単一の細胞レベルでアポトーシスを検出するために処理した。運動外植片培養及び交連感覚の細胞体におけるアポトーシスを蛍光顕微鏡で解析した(図10B)。蛍光標識化TUNNEL陽性アポトーシス細胞体の可視化のために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージングツァイス顕微鏡で(赤色蛍光チャネルで)撮影した。
図10Aに示すように、抗DR6抗体は、(軸索変性のアッセイにおいて)さまざまな栄養因子欠乏性ニューロンの変性を阻害する。
図10Aの左から右において、上段及び下段の最初の2つ写真は交連ニューロンのデータを示す。これら最初の4つの写真では、上段の2つの写真はそれぞれコントロールIgG及びRA.5 DR6抗体の存在下の交連ニューロンを示し、さらに下段の2つの写真はそれぞれRA.1 DR6抗体及びRA.3 DR6抗体の存在下の交連ニューロンを示す。図10Aの上段及び下段の中央の2つの写真は、感覚ニューロンのデータを示す。これら中央の4つの写真では、上段2つの写真がそれぞれNGF存在下及び非存在下の感覚ニューロンを示し、さらに下段2つの写真がNGFの非存在下だが、それぞれRA.1 DR6抗体及びRA.3 DR6抗体の存在下の感覚ニューロンを示す。図10Aの右側の上段及び下段の2つは、運動ニューロンのデータを示す。これら右の4つの写真では、上段2つの写真はそれぞれ成長因子の存在下及び非存在下の運動ニューロンを示し、さらに下段2つの写真が成長因子の非存在下だが、それぞれRA.1 DR6抗体及びRA.3 DR6抗体の存在下の運動ニューロンを示す。
この図で示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下のとおりである。マウスモノクローナルRA.1−RA.5 DR6抗体は、上の実施例3で記載の通り、DR6外部ドメインでマウスを免疫化することによって作成した。この実施例及び図で「RA.1」及び「RA.3」抗体と称されるDR6抗体は、実施例3に記載の、それぞれ「1E5.5.7」及び「3F4.4.8」抗体である(例えば、単純に別の命名の使用を参照する)。同様に、この実施例及び図で「RA.5」抗体と称されるDR6抗体は、実施例3に記載の、「3B11.7.7」抗体である(例えば、別の命名の使用を参照している)。
感覚、運動、及び交連外植片培養を、以下の変更を加えて、実施例2及び実施例6に記載のとおり、実施した。交連外植片生存アッセイの場合、DR6抗体RA.1又はRA.3、又はコントロールIgGを、播種24時間後、最終濃度20μg/mlで、交連外植片培養に加えた(図10A)。感覚外植片培養の場合、NGF欠乏アッセイを、播種48時間後、実施した。NGF遮断抗体(ジェネンテック、インク)と共に明記のDR6抗体(RA.1又はRA.3)又はコントロールIgGを含む新鮮なニューロベーサル培地を、播種48時間後、最終濃度20μg/mlで、感覚外植片培養に加えた(図10A)。運動外植片培養の場合、栄養因子欠乏アッセイは播種後48時間実施した。NT3/BDNFなしで、且つBDNF遮断及びNT3遮断抗体(機能遮断栄養因子mAbs、ジェネンテック、インク)と共に明記のDR6抗体(RA.1又はRA.3)又はコントロールIgGを含む新鮮なニューロベーサル培地を、播種48時間後、最終濃度20μg/mlで、感覚外植片培養に加えた(図10A)。抗TUJI(Covance)及び抗p75NTR(Chemicon/Millipore)抗体で免疫蛍光染色により標識化された感覚及び運動軸索を然るべく可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージングツァイス顕微鏡で撮影した。GFP発現交連軸索を可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxiovert 200ツァイス倒立顕微鏡で(GFP用緑色蛍光チャネルで)撮影した。
図10Bで示すように、抗DR6抗体は、(TUNEL染色によるアポトーシス細胞体のアッセイにおいて)さまざまな栄養因子欠乏性ニューロンの変性を阻害する。図10Bの左から順番に、上段及び下段の2つの写真は交連ニューロンのデータを示す。これら最初の4つの写真では、上段の2つの写真は、それぞれコントロールIgG及びRA.5 DR6抗体の存在下の交連ニューロンを示し、更に下段の2つの写真はそれぞれRA.1 DR6抗体及びRA.3 DR6抗体の存在下の交連ニューロンを示す。図10Bの上段及び下段の中央セットの2つの写真は、感覚ニューロンのデータを示す。これら中央の4つの写真では、上段2つの写真がそれぞれNGF存在下及び非存在下の感覚ニューロンを示し、さらに下段2つの写真はNGFの非存在下だが、それぞれRA.1 DR6抗体及びRA.3 DR6抗体の存在下の感覚ニューロンを示す。図10Bの右側の上段及び下段の2つは、運動ニューロンのデータを示す。これら4つの写真では、上段2つの写真はそれぞれ成長因子の存在下及び非存在下の運動ニューロンを示し、さらに下段2つの写真は成長因子の非存在下だが、それぞれRA.1 DR6抗体及びRA.3 DR6抗体の存在下の運動ニューロンを示す。
図10の開示は、リガンドが軸索変性におけるDR6機能にとって重要な役割を果たす可能性を示唆する。
この図で示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下の通りである。上記のとおり、マウスモノクローナル抗体RA.1−RA.5 DR6抗体は、上の実施例3に記載のようにDR6外部ドメインでの免疫化により作成された。感覚、運動及び交連外植片培養は、以下に概説する変更を加えて、上記の実施例2及び実施例6のように実施された。交連外植片生存アッセイの場合には、上の実施例3に記載のように、DR6抗体RA.1及びRA.3、抗体RA.5(あるいは「1B11.7.7」と称される、ジェネンテック、インク)、又はコントロールIgG(ジェネンテック、インク)を播種24時間後、最終濃度20μg/mlで、それぞれ加えた(図10B、左)。
感覚外植片培養の場合、NGF欠乏アッセイを播種48時間後、実施した。NGFなしで、且つDR6抗体 RA.1又はRA.3、又はコントロールIgG(ジェネンテック、インク)と共にNGF遮断抗体(ジェネンテック、インク)を有する新鮮なニューロベーサル培地を播種48時間後、最終濃度20μg/mlで感覚外植片培養に加えた。運動外植片培養の場合、栄養因子欠乏アッセイを播種48時間後、実施した。NT3/BDNFなしで、 RA.1又はRA.3、又はコントロールIgG(ジェネンテック、インク)と共にNT3遮断抗体(機能遮断栄養因子mAbs、ジェネンテック、インク)を有する新鮮なニューロベーサル培地を播種48時間後、最終濃度20μg/mlで感覚外植片培養に加えた(図10B、右)。
外植片は、4%PFA/PBS中で固定し、インサイツ細胞死検出キット(Cat. No. 11 684 795 910, ロッシュ)を使用して、製造者の指示書(ロッシュ)に従って、DNA鎖切断の標識化(TUNNEL技術)に基づいて、単一の細胞レベルでアポトーシスを検出するために処理した。運動外植片培養及び交連感覚の細胞体におけるアポトーシスを蛍光顕微鏡で解析した(図10B)。蛍光標識化TUNNEL陽性アポトーシス細胞体の可視化のために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージングツァイス顕微鏡で(赤色蛍光チャネルで)撮影した。
実施例8:DR6イムノアドヘシン・アンタゴニストはニューロンの変性を阻害する
図11Aに示すように、交連軸索変性はhDR6-ECD-Fcにより遅延した。このアッセイで使用したhDR6-ECD-Fcイムノアドヘシンタンパク質は上の実施例3に記載されている。
図11Aの左から右において、最初の写真は、48時間時点の交連軸索変性を示すコントロールを提供する。2番目の写真は、48時間時点の30μg/mlのhDR6-ECD-Fcの存在下の交連軸索変性を示す。3番目の写真は、48時間時点の10μg/mlのhDR6-ECD-Fcの存在下の交連軸索変性を示す。
この図で示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下のとおりである。交連外植片培養及び生存アッセイを調節し、上の実施例2−6に記載のとおり実施した。このアッセイで使用したhDR6-ECD-Fcイムノアドヘシンタンパク質配列は上の実施例3に記載されている。GFP標識化交連軸索を可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxiovert 200ツァイス倒立顕微鏡で(緑色蛍光チャネルで)撮影した。
図11Aに示すように、交連軸索変性はhDR6-ECD-Fcにより遅延した。このアッセイで使用したhDR6-ECD-Fcイムノアドヘシンタンパク質は上の実施例3に記載されている。
図11Aの左から右において、最初の写真は、48時間時点の交連軸索変性を示すコントロールを提供する。2番目の写真は、48時間時点の30μg/mlのhDR6-ECD-Fcの存在下の交連軸索変性を示す。3番目の写真は、48時間時点の10μg/mlのhDR6-ECD-Fcの存在下の交連軸索変性を示す。
この図で示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下のとおりである。交連外植片培養及び生存アッセイを調節し、上の実施例2−6に記載のとおり実施した。このアッセイで使用したhDR6-ECD-Fcイムノアドヘシンタンパク質配列は上の実施例3に記載されている。GFP標識化交連軸索を可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxiovert 200ツァイス倒立顕微鏡で(緑色蛍光チャネルで)撮影した。
図11Bで示すように、hDR6-ECD-Fcは神経成長因子(NGF)離脱により誘導された感覚軸索変性を遅延させる。図11Bの左から右において、上の3つの写真はそれぞれ0、6及び24時間時点のコントロールFcの存在下における、NGFの欠乏した感覚ニューロンを示し、さらに下段の3つの写真はそれぞれ0、6及び24時間時点のDR6 Fcコンストラクトの存在下における、NGFの欠乏した感覚ニューロンを示す。
図11に提供される開示は、リガンドが軸索変性におけるDR6機能に重要な役割を果たす可能性があるという更なる示唆を提供する。
この図に示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下のとおりである。リガンドが感覚軸索変性におけるDR6機能に必要であるか否かを調べるために、感覚軸索成長及び変性の区画培養分析を以下のとおりに実施した。Campenot神経細胞チャンバー系を、別の区画(別々の液体環境)の細胞体から神経突起(軸索)を単離するために使用し、これは、神経系のある位置の神経細胞体が別の場所の遠位の標的に軸索を突き出すことに似ている。アッセイは、以下の変更を加えて、Campenot (Campenot等, .J Neurosci. 11(4): 1126-39 (1991))により最初に記載されたとおりに実施された。簡単には、35-mm組織培養皿をPDL/ラミニンでコートし、例えばCampenot等(上掲)の図1及び4で図説されているように、ピンレーキ(Tyler Research)で跡を作成するために引っ掻いた。
培養培地(B27サプリメント、25ng/mlのNGF、及び4g/Lのメチルセルロースを有するニューロベーサル培地)の一滴を引っ掻いた基質に置いた。テフロン分割機(Tyler Research)をシリコングリース上に置き、少量のシリコングリースを中央のスロットの口につけた。E12.5マウスDRGに由来する解離感覚ニューロンは、メチルセルロースで濃厚化した培地に懸濁し、22ゲージの針で使い捨て滅菌シリンジ中に入れた。この細胞懸濁は解剖顕微鏡下で、各区画皿の中央スロット中に注入した。ニューロンは、一晩、定着させた。皿の外周辺(細胞体分割)及び内部軸索区画を、メチルセルロース含有培地で充填した。インビトロで3−5日以内に、軸索は、例えばCampenot等,上掲の図1及び4で図説されているように、右及び左区画中に出現し始めた。
局所的軸索変性を誘発するために、軸索区画由来のNGF含有培地を、NGF遮断抗体を有するニューロベーサル培地で置換した(抗NGF、ジェネンテック、インク、20μg/ml)。
NGF欠乏後ゼロ時間、6時間、又は24から48時間で、感覚ニューロンを室温で30分間、4%PFAで固定し、蛍光顕微鏡で変性した軸索を可視化するために、軸索マーカーTUJ-1(Covance、1:500希釈)で免疫蛍光染色のために(上の実施例7に記載のとおり)処理した(図11B)。Campenotチャンバーの軸索区画中の免疫蛍光的に標識化した感覚軸索を可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージングツァイス顕微鏡で撮影した。
リガンドがNGF離脱により誘発した軸索変性プログラムにおいてDR6機能が必要であるか否かを調べるために、30μg/mlの(上の実施例3に記載の)hDR6-ECD-Fcイムノアドヘシンタンパク質又は30μg/mlのコントロールFc(ジェネンテック、インク)を、Campenotチャンバーの軸索区画中で、抗NGF処理と共にインキュベートした。NGF欠乏ゼロから24時間後、Campenotチャンバー中の軸索を4%PFA/PBSで固定し、蛍光発色基Alexa488(分子プローブ、BD)にコンジュゲートしたTUJ-1(1:500、Covance)/二次抗体で免疫蛍光染色により可視化した(図11B)。
図11Bに示したように、NGF欠乏は軸索変性の著しいパターンを誘発した。hDR6-ECD-Fcイムノアドヘシンタンパク質の添加は、この系で、有意に、軸索変性の開始を遅らせた(図11B、下段パネル)。従って、これらのデータは、可溶性リガンドが、成長因子の離脱によって誘導された局所的軸索変性でのDR6レセプター機能に必要である可能性があることを示唆する。
図11に提供される開示は、リガンドが軸索変性におけるDR6機能に重要な役割を果たす可能性があるという更なる示唆を提供する。
この図に示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下のとおりである。リガンドが感覚軸索変性におけるDR6機能に必要であるか否かを調べるために、感覚軸索成長及び変性の区画培養分析を以下のとおりに実施した。Campenot神経細胞チャンバー系を、別の区画(別々の液体環境)の細胞体から神経突起(軸索)を単離するために使用し、これは、神経系のある位置の神経細胞体が別の場所の遠位の標的に軸索を突き出すことに似ている。アッセイは、以下の変更を加えて、Campenot (Campenot等, .J Neurosci. 11(4): 1126-39 (1991))により最初に記載されたとおりに実施された。簡単には、35-mm組織培養皿をPDL/ラミニンでコートし、例えばCampenot等(上掲)の図1及び4で図説されているように、ピンレーキ(Tyler Research)で跡を作成するために引っ掻いた。
培養培地(B27サプリメント、25ng/mlのNGF、及び4g/Lのメチルセルロースを有するニューロベーサル培地)の一滴を引っ掻いた基質に置いた。テフロン分割機(Tyler Research)をシリコングリース上に置き、少量のシリコングリースを中央のスロットの口につけた。E12.5マウスDRGに由来する解離感覚ニューロンは、メチルセルロースで濃厚化した培地に懸濁し、22ゲージの針で使い捨て滅菌シリンジ中に入れた。この細胞懸濁は解剖顕微鏡下で、各区画皿の中央スロット中に注入した。ニューロンは、一晩、定着させた。皿の外周辺(細胞体分割)及び内部軸索区画を、メチルセルロース含有培地で充填した。インビトロで3−5日以内に、軸索は、例えばCampenot等,上掲の図1及び4で図説されているように、右及び左区画中に出現し始めた。
局所的軸索変性を誘発するために、軸索区画由来のNGF含有培地を、NGF遮断抗体を有するニューロベーサル培地で置換した(抗NGF、ジェネンテック、インク、20μg/ml)。
NGF欠乏後ゼロ時間、6時間、又は24から48時間で、感覚ニューロンを室温で30分間、4%PFAで固定し、蛍光顕微鏡で変性した軸索を可視化するために、軸索マーカーTUJ-1(Covance、1:500希釈)で免疫蛍光染色のために(上の実施例7に記載のとおり)処理した(図11B)。Campenotチャンバーの軸索区画中の免疫蛍光的に標識化した感覚軸索を可視化するために、写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージングツァイス顕微鏡で撮影した。
リガンドがNGF離脱により誘発した軸索変性プログラムにおいてDR6機能が必要であるか否かを調べるために、30μg/mlの(上の実施例3に記載の)hDR6-ECD-Fcイムノアドヘシンタンパク質又は30μg/mlのコントロールFc(ジェネンテック、インク)を、Campenotチャンバーの軸索区画中で、抗NGF処理と共にインキュベートした。NGF欠乏ゼロから24時間後、Campenotチャンバー中の軸索を4%PFA/PBSで固定し、蛍光発色基Alexa488(分子プローブ、BD)にコンジュゲートしたTUJ-1(1:500、Covance)/二次抗体で免疫蛍光染色により可視化した(図11B)。
図11Bに示したように、NGF欠乏は軸索変性の著しいパターンを誘発した。hDR6-ECD-Fcイムノアドヘシンタンパク質の添加は、この系で、有意に、軸索変性の開始を遅らせた(図11B、下段パネル)。従って、これらのデータは、可溶性リガンドが、成長因子の離脱によって誘導された局所的軸索変性でのDR6レセプター機能に必要である可能性があることを示唆する。
実施例9:NGF欠乏に続く軸索からのDR6リガンド結合部位の切断
図12A及び図12Bに示すように、DR6-APコンストラクトは感覚軸索上のDR6結合部位を可視化するために使用した。
図12Aの左から右において、上段の2つの写真は、それぞれ低倍率及び高倍率でこれらの軸索を可視化するために、48時間時点、NGF存在下、発生ステージE12.5における、感覚軸索上のDR6結合部位の可視化を示し、さらに下段2つの写真は、それぞれ低倍率及び高倍率で、APコントロールコンストラクトを使用した感覚軸索の可視化を示す。
図12Bに示すように、DR6リガンド結合部位はNGF欠乏に続いて感覚軸索から消失した。
図12Bの左から右において、上段の2つの写真は感覚軸索上のDR6結合部位の可視化を示しており、最初の写真はNGF及びBAXインヒビターの存在下の感覚ニューロンを示し、さらに2番目の写真はNGF存在下でのBaxヌル感覚ニューロンを示す。下段の2つの写真は、それぞれNGF非存在下であるがBAXインヒビターの存在下の感覚ニューロン、及びNGF非存在下のBaxヌル感覚ニューロンを示す。等しい結果が、ニューロトロフィンの存在下及び非存在下の運動軸索で観察された。
図12A及び図12Bで示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下の通りである。DR6-APコンストラクトは、pRK5−APクローニングベクター (例えばYan等, Nature Immunology 1, 37-41 (2000)を参照)を使用して、ヒト胎盤アルカリホスファターゼにマウスDR6外部ドメインを融合すること(DR6-AP)によって作成した。親クローニングベクターPRK5は、the Becton, Dickinson and Company, Pharmingen divisionから入手可能である。DR6-APコンストラクト融合タンパク質を作成するために使用したマウスDR6外部ドメイン配列は以下の通りである:
MGTRASSITALASCSRTAGQVGATMVAGSLLLLGFLSTITAQPEQKTLSLPGTYRHVDRTTGQVLTCDKCPAGTYVSEHCTNMSLRVCSSCPAGTFTRHENGIERCHDCSQPCPWPMIERLPCAALTDRECICPPGMYQSNGTCAPHTVCPVGWGVRKKGTENEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAHTDCLGQNLEVVKPGTKETDNVCGMRLFFSSTNPPSSGTVTFSHPEHMESHDVPSSTYEPQGMNSTDSNSTASVRTKVPSGIEEGTVPDNTSSTSGKEGTNRTLPNPPQVTHQQAPHHRHILKLLPSSMEATGEKSSTAIKAPKRGHPRQNAHKHFDINEH (配列番号14)
Baxヌルマウス系統(Bax-R1)は以前に記載されており(Deckwerth等, Neuron, Vol. 17, 401-411, 1996)、Jackson Laboratoriesから入手可能である。Bax阻害性ペプチドは、神経細胞死を遮断するために10μMで使用した(Bax-V5, Tocris Inc)。
図12A及び図12Bに示すように、DR6-APコンストラクトは感覚軸索上のDR6結合部位を可視化するために使用した。
図12Aの左から右において、上段の2つの写真は、それぞれ低倍率及び高倍率でこれらの軸索を可視化するために、48時間時点、NGF存在下、発生ステージE12.5における、感覚軸索上のDR6結合部位の可視化を示し、さらに下段2つの写真は、それぞれ低倍率及び高倍率で、APコントロールコンストラクトを使用した感覚軸索の可視化を示す。
図12Bに示すように、DR6リガンド結合部位はNGF欠乏に続いて感覚軸索から消失した。
図12Bの左から右において、上段の2つの写真は感覚軸索上のDR6結合部位の可視化を示しており、最初の写真はNGF及びBAXインヒビターの存在下の感覚ニューロンを示し、さらに2番目の写真はNGF存在下でのBaxヌル感覚ニューロンを示す。下段の2つの写真は、それぞれNGF非存在下であるがBAXインヒビターの存在下の感覚ニューロン、及びNGF非存在下のBaxヌル感覚ニューロンを示す。等しい結果が、ニューロトロフィンの存在下及び非存在下の運動軸索で観察された。
図12A及び図12Bで示すデータを作成するために使用した材料及び方法は以下の通りである。DR6-APコンストラクトは、pRK5−APクローニングベクター (例えばYan等, Nature Immunology 1, 37-41 (2000)を参照)を使用して、ヒト胎盤アルカリホスファターゼにマウスDR6外部ドメインを融合すること(DR6-AP)によって作成した。親クローニングベクターPRK5は、the Becton, Dickinson and Company, Pharmingen divisionから入手可能である。DR6-APコンストラクト融合タンパク質を作成するために使用したマウスDR6外部ドメイン配列は以下の通りである:
MGTRASSITALASCSRTAGQVGATMVAGSLLLLGFLSTITAQPEQKTLSLPGTYRHVDRTTGQVLTCDKCPAGTYVSEHCTNMSLRVCSSCPAGTFTRHENGIERCHDCSQPCPWPMIERLPCAALTDRECICPPGMYQSNGTCAPHTVCPVGWGVRKKGTENEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAHTDCLGQNLEVVKPGTKETDNVCGMRLFFSSTNPPSSGTVTFSHPEHMESHDVPSSTYEPQGMNSTDSNSTASVRTKVPSGIEEGTVPDNTSSTSGKEGTNRTLPNPPQVTHQQAPHHRHILKLLPSSMEATGEKSSTAIKAPKRGHPRQNAHKHFDINEH (配列番号14)
Baxヌルマウス系統(Bax-R1)は以前に記載されており(Deckwerth等, Neuron, Vol. 17, 401-411, 1996)、Jackson Laboratoriesから入手可能である。Bax阻害性ペプチドは、神経細胞死を遮断するために10μMで使用した(Bax-V5, Tocris Inc)。
マウスDR外部ドメイン-AP融合タンパク質(DR bv6-AP)を作成するために、DMEM/10%FBS(ギブコ)培地で培養したCOS-1細胞は、FuGeneトランスフェクション試薬(ロッシュ)を使用して、製造者のプロトコルに従って、15μgのDR6-AP融合発現コンストラクトで形質転換した。 形質転換12時間後、COS-1細胞培地を、OPTI-MEM(インビトロジェン)に変えた。形質転換48時間後、DR6-APタンパク質を含むCOS-1条件培地を集めて、濾過した。培地中のDR6-APタンパク質の量は以下のように定量化した:
100μlの2×APバッファー(15mlの2MジエタノールアミンpH9.8に100mgのパラニトロフェニルホスフェート(シグマ)及び15μlの1M MgCl2を加えて調節した)を、等量の形質転換したCOS細胞条件培地又は形質転換していないCOS-1細胞由来のコントロール条件培地と混合した。反応液の色は12−15分の間発色し、O.D.は線形範囲(0.1−1)となった。反応液の体積は、800μlの蒸留水を加えて調節し、O.D.を405nm吸光度波長で測定した。濃度(nM)は、式(100μlに対して):C(nM)= O.D.×100×(60/発現時間)/30に従って計算した。
インサイツDR6-AP感覚軸索結合アッセイの場合、野生型か又はBaxヌル感覚外植片を上の実施例7−8に概説したようにニューロべーサル培地/B27(インビトロジェン)中で、50ng/mlNGF(ロッシュ)と共に、培養した。播種2日後、DRG外植片は、上の実施例7−8に記載のように、処理されないままか、あるいはNGFを欠乏させた。Bax阻害性ペプチドは、図12B(10μM、Bax−V5, Tocris)に明記されている所では、加えた。NGF欠乏12時間後、DRG外植片は結合バッファー(0.2%のBSA、0.1%のNaN3、5mMのCaCl2、1mMのMgCl2、20mMのHEPES、pH=7.0を有するHBSS、Gibco Cat. No. 14175-095)で2回洗浄した。次に、AP結合アッセイは、DR6-AP条件培地と結合バッファー(又はコントロールAP条件培地と結合バッファー)の1:1混合液を作成し、8ウェルの培養スライドにDRG外植片を直接注いて、室温で90分間インキュベートすることによって、実施した。
インキュベートに続いて、非結合DR6-APタンパク質を、結合バッファーで5回DRG外植片をリンスすることによって洗い流した。次に、DRG外植片を、PBSで希釈した3.7%フォルムアルデヒドで、12分間室温で、固定した。残存するフォルムアルデヒドをHBSバッファー(20mMのHEPES pH=7.0、150mMのNaCl)で3回DRG外植片をリンスすることで除去した。内生的AP活性は、30分間、HBSバッファー中で、65℃で、熱不活性化して遮断した。次に、DRG外植片は、AP反応バッファー(100mMのTRIS pH=9.5、100mMのNaCl、50mMのMgCl2)で3回リンスした。感覚軸索に結合しているDR6-AP融合タンパク質は、次に、室温で1晩、AP反応バッファー中で、DRG外植片上で、1/50(体積)のNBT/BCIPストック溶液(ロッシュ、Cat. No. 1681451)により、染色を発現させることにより可視化した(図12A及びB)。対応するコントロール実験において、AP-形質転換したCOS細胞からの条件培地をAP軸索結合アッセイに使用した(図12A、下段パネル)。
図12Bから分かるように、DR6-AP結合部位は、NGF欠乏に続いて感覚軸索表面から消失し、DR6リガンドが栄養欠乏後軸索条件培地中に放出されることを示唆する。
図12Cに示すように、発生ステージE12.5におけるBAXヌル感覚軸索の研究は、β分泌酵素(BACE)インヒビターが、NGF離脱後、感覚軸索からのDR6-AP結合部位の消失を遮断できることを示す。図12Cの左から右において、上段の3つの写真は、それぞれDMSOコントロール;OM99−2(BACE−Iインヒビター)及びTAP1(α分泌酵素−Iインヒビター)の存在下のこれらのニューロンを示す。下段の写真は、NGF存在下のこれらのニューロンを示す。
このデータを作成する為に使用したマウスDR6外部ドメイン-AP融合タンパク質は、上に記載する。Baxヌルマウス系統(Bax-R1)は、以前に記載されており(Deckwerth 等., Neuron, Vol. 17, 401-411, 1996) 、Jackson Laboratoriesから取得した。DRG外植片培養及びDR6-AP軸索結合アッセイは、図12A及び図12Bで上に記載のとおり実施した。アッセイで使用したBACEインヒビターは、最終濃度1μMである(InSolution OM99-2, Calbiochem/Merck)。α分泌酵素インヒビターTAP1は、アッセイで、最終濃度10μMで使用した(TAPI-1, Calbiochem)。DR6-AP陽性感覚軸索(上の実施例9に概説したAP比色分析染色反応により染色した)を可視化するために、明視野の写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージングツァイス顕微鏡で撮影した。
100μlの2×APバッファー(15mlの2MジエタノールアミンpH9.8に100mgのパラニトロフェニルホスフェート(シグマ)及び15μlの1M MgCl2を加えて調節した)を、等量の形質転換したCOS細胞条件培地又は形質転換していないCOS-1細胞由来のコントロール条件培地と混合した。反応液の色は12−15分の間発色し、O.D.は線形範囲(0.1−1)となった。反応液の体積は、800μlの蒸留水を加えて調節し、O.D.を405nm吸光度波長で測定した。濃度(nM)は、式(100μlに対して):C(nM)= O.D.×100×(60/発現時間)/30に従って計算した。
インサイツDR6-AP感覚軸索結合アッセイの場合、野生型か又はBaxヌル感覚外植片を上の実施例7−8に概説したようにニューロべーサル培地/B27(インビトロジェン)中で、50ng/mlNGF(ロッシュ)と共に、培養した。播種2日後、DRG外植片は、上の実施例7−8に記載のように、処理されないままか、あるいはNGFを欠乏させた。Bax阻害性ペプチドは、図12B(10μM、Bax−V5, Tocris)に明記されている所では、加えた。NGF欠乏12時間後、DRG外植片は結合バッファー(0.2%のBSA、0.1%のNaN3、5mMのCaCl2、1mMのMgCl2、20mMのHEPES、pH=7.0を有するHBSS、Gibco Cat. No. 14175-095)で2回洗浄した。次に、AP結合アッセイは、DR6-AP条件培地と結合バッファー(又はコントロールAP条件培地と結合バッファー)の1:1混合液を作成し、8ウェルの培養スライドにDRG外植片を直接注いて、室温で90分間インキュベートすることによって、実施した。
インキュベートに続いて、非結合DR6-APタンパク質を、結合バッファーで5回DRG外植片をリンスすることによって洗い流した。次に、DRG外植片を、PBSで希釈した3.7%フォルムアルデヒドで、12分間室温で、固定した。残存するフォルムアルデヒドをHBSバッファー(20mMのHEPES pH=7.0、150mMのNaCl)で3回DRG外植片をリンスすることで除去した。内生的AP活性は、30分間、HBSバッファー中で、65℃で、熱不活性化して遮断した。次に、DRG外植片は、AP反応バッファー(100mMのTRIS pH=9.5、100mMのNaCl、50mMのMgCl2)で3回リンスした。感覚軸索に結合しているDR6-AP融合タンパク質は、次に、室温で1晩、AP反応バッファー中で、DRG外植片上で、1/50(体積)のNBT/BCIPストック溶液(ロッシュ、Cat. No. 1681451)により、染色を発現させることにより可視化した(図12A及びB)。対応するコントロール実験において、AP-形質転換したCOS細胞からの条件培地をAP軸索結合アッセイに使用した(図12A、下段パネル)。
図12Bから分かるように、DR6-AP結合部位は、NGF欠乏に続いて感覚軸索表面から消失し、DR6リガンドが栄養欠乏後軸索条件培地中に放出されることを示唆する。
図12Cに示すように、発生ステージE12.5におけるBAXヌル感覚軸索の研究は、β分泌酵素(BACE)インヒビターが、NGF離脱後、感覚軸索からのDR6-AP結合部位の消失を遮断できることを示す。図12Cの左から右において、上段の3つの写真は、それぞれDMSOコントロール;OM99−2(BACE−Iインヒビター)及びTAP1(α分泌酵素−Iインヒビター)の存在下のこれらのニューロンを示す。下段の写真は、NGF存在下のこれらのニューロンを示す。
このデータを作成する為に使用したマウスDR6外部ドメイン-AP融合タンパク質は、上に記載する。Baxヌルマウス系統(Bax-R1)は、以前に記載されており(Deckwerth 等., Neuron, Vol. 17, 401-411, 1996) 、Jackson Laboratoriesから取得した。DRG外植片培養及びDR6-AP軸索結合アッセイは、図12A及び図12Bで上に記載のとおり実施した。アッセイで使用したBACEインヒビターは、最終濃度1μMである(InSolution OM99-2, Calbiochem/Merck)。α分泌酵素インヒビターTAP1は、アッセイで、最終濃度10μMで使用した(TAPI-1, Calbiochem)。DR6-AP陽性感覚軸索(上の実施例9に概説したAP比色分析染色反応により染色した)を可視化するために、明視野の写真をCarl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40リリース4.5.0.0SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを使用するAxioplan-2イメージングツァイス顕微鏡で撮影した。
実施例10:DR6の同族リガンドであるアミロイド前駆体タンパク質(APP)
図13に示すように、N−APPは、DR6外部ドメイン結合リガンドであることが明らかとなった。
図13Aの左から右の順で、最初の2つのブロットは、DR6−APコンストラクトを用いて、増殖因子の存在下と非存在下において感覚ニューロンと運動ニューロンから得たタンパク質を探索した実験のデータを示す。これらのブロットでは、およそ35kDAに強力なバンドを含むAPPポリペプチドは、増殖因子を除去した(かつバックス(Bax)インヒビターの存在下)感覚ニューロン及び運動ニューロンにおいて観察される。図13Aの中央のブロットは、およそ35kDAに強力なバンドを有するAPPポリペプチドが、増殖因子を除去した感覚ニューロンから得たポリペプチドの抗N−APP抗体プローブによって同様に観察されることを示す。1:100希釈のウエスタンブロット実験のために用いたポリクローナル抗N−APP抗体は、Thermo Scientific(カタログ番号RB−9023−P1)から入手した。バックスインヒビターペプチドP5は10μMで用いた(Tocris Biosciences、カタログ番号1786、ミトコンドリアに対するバックス転座の細胞透過性合成ペプチドインヒビター)。
APPがDR6外部ドメイン結合リガンドであるという所見は、図13Aの右に示すブロットに表されたデータによってさらに確認された。一般的なプルダウンプロトコール(例えばNikolaev et al., 2004, BBRC, 323, 1216-1222)を用いて、NGF欠乏条件下のCampenotチャンバーの軸索区画から回収した感覚性軸索条件培地からDR6-ECD外部ドメイン結合因子を精製した。DR6−ECD−His外部ドメイン(以下に記載のコンストラクト)結合NiNTAビーズ(Sigma)を、以下の条件下で50mlの感覚軸索条件培地にてインキュベートした。150mM NaCl、0.2%NP-40(Calbiochem)、1×PBSバッファ、4℃で終夜。次いで、DR6−ECD−His外部ドメイン結合NiNTAビーズ(Sigma)を、10倍量の結合バッファ(150mM NaCl、0.2%NP−40(Calbiochem)を含む1×PBSバッファ)にて5回洗浄し、DR6−ECD結合タンパク質複合体を、1×SDS試料ローディングバッファ(Invitrogen)にて溶出し、次いでゲル電気泳動にて分離し、抗N−APP抗体にて探索した。このDR6−ECDプルダウン実験のデータにより、同様に、およそ35kDAに強力なバンドを有するAPPポリペプチドが識別される。
軸索条件培地のDR6−APブロットアッセイは、先に記載された(Pettmann et al., 1988, J. Neurosci., 8(10): 3624-3632)プロトコールに従って行った。ウエスタンブロット実験に使用したポリクローナル抗N−APP抗体は、Thermo Scientific(カタログ番号RB−9023−P1)から入手した。使用したマウスDR6外部ドメイン−AP融合タンパク質は実施例9に記載した。マウス組み換えDR6−ECD−Hisを発現させ、その後CHO細胞培養物から精製した。マウスのDR6−ECD−Hisのアミノ酸配列は以下の通りである。
MGTRASSITALASCSRTAGQVGATMVAGSLLLLGFLSTITAQPEQKTLSLPGTYRHVDRTTGQVLTCDKCPAGTYVSEHCTNMSLRVCSSCPAGTFTRHENGIERCHDCSQPCPWPMIERLPCAALTDRECICPPGMYQSNGTCAPHTVCPVGWGVRKKGTENEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAHTDCLGQNLEVVKPGTKETDNVCGMRLFFSSTNPPSSGTVTFSHPEHMESHDVPSSTYEPQGMNSTDSNSTASVRTKVPSGIEEGTVPDNTSSTSGKEGTNRTLPNPPQVTHQQAPHHRHILKLLPSSMEATGEKSSTAIKAPKRGHPRQNAHKHFDINEHHHHHH(配列番号:15)
図13に示すように、N−APPは、DR6外部ドメイン結合リガンドであることが明らかとなった。
図13Aの左から右の順で、最初の2つのブロットは、DR6−APコンストラクトを用いて、増殖因子の存在下と非存在下において感覚ニューロンと運動ニューロンから得たタンパク質を探索した実験のデータを示す。これらのブロットでは、およそ35kDAに強力なバンドを含むAPPポリペプチドは、増殖因子を除去した(かつバックス(Bax)インヒビターの存在下)感覚ニューロン及び運動ニューロンにおいて観察される。図13Aの中央のブロットは、およそ35kDAに強力なバンドを有するAPPポリペプチドが、増殖因子を除去した感覚ニューロンから得たポリペプチドの抗N−APP抗体プローブによって同様に観察されることを示す。1:100希釈のウエスタンブロット実験のために用いたポリクローナル抗N−APP抗体は、Thermo Scientific(カタログ番号RB−9023−P1)から入手した。バックスインヒビターペプチドP5は10μMで用いた(Tocris Biosciences、カタログ番号1786、ミトコンドリアに対するバックス転座の細胞透過性合成ペプチドインヒビター)。
APPがDR6外部ドメイン結合リガンドであるという所見は、図13Aの右に示すブロットに表されたデータによってさらに確認された。一般的なプルダウンプロトコール(例えばNikolaev et al., 2004, BBRC, 323, 1216-1222)を用いて、NGF欠乏条件下のCampenotチャンバーの軸索区画から回収した感覚性軸索条件培地からDR6-ECD外部ドメイン結合因子を精製した。DR6−ECD−His外部ドメイン(以下に記載のコンストラクト)結合NiNTAビーズ(Sigma)を、以下の条件下で50mlの感覚軸索条件培地にてインキュベートした。150mM NaCl、0.2%NP-40(Calbiochem)、1×PBSバッファ、4℃で終夜。次いで、DR6−ECD−His外部ドメイン結合NiNTAビーズ(Sigma)を、10倍量の結合バッファ(150mM NaCl、0.2%NP−40(Calbiochem)を含む1×PBSバッファ)にて5回洗浄し、DR6−ECD結合タンパク質複合体を、1×SDS試料ローディングバッファ(Invitrogen)にて溶出し、次いでゲル電気泳動にて分離し、抗N−APP抗体にて探索した。このDR6−ECDプルダウン実験のデータにより、同様に、およそ35kDAに強力なバンドを有するAPPポリペプチドが識別される。
軸索条件培地のDR6−APブロットアッセイは、先に記載された(Pettmann et al., 1988, J. Neurosci., 8(10): 3624-3632)プロトコールに従って行った。ウエスタンブロット実験に使用したポリクローナル抗N−APP抗体は、Thermo Scientific(カタログ番号RB−9023−P1)から入手した。使用したマウスDR6外部ドメイン−AP融合タンパク質は実施例9に記載した。マウス組み換えDR6−ECD−Hisを発現させ、その後CHO細胞培養物から精製した。マウスのDR6−ECD−Hisのアミノ酸配列は以下の通りである。
MGTRASSITALASCSRTAGQVGATMVAGSLLLLGFLSTITAQPEQKTLSLPGTYRHVDRTTGQVLTCDKCPAGTYVSEHCTNMSLRVCSSCPAGTFTRHENGIERCHDCSQPCPWPMIERLPCAALTDRECICPPGMYQSNGTCAPHTVCPVGWGVRKKGTENEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAHTDCLGQNLEVVKPGTKETDNVCGMRLFFSSTNPPSSGTVTFSHPEHMESHDVPSSTYEPQGMNSTDSNSTASVRTKVPSGIEEGTVPDNTSSTSGKEGTNRTLPNPPQVTHQQAPHHRHILKLLPSSMEATGEKSSTAIKAPKRGHPRQNAHKHFDINEHHHHHH(配列番号:15)
図13Bは、DR6-APブロッティングによる軸索条件培地中のDR6リガンドの他の可視化を示す。このブロッティングデータから、35kDaのN末端APP、並びにC99−APP及びC83/C89 APPのポリペプチドを含む多くのAPPポリペプチドが識別される。軸索条件培地のDR6−APブロットアッセイは、先に記載された(Pettmann et al., 1988, J. Neurosci., 8(10): 3624-3632)プロトコールに従って実行した。マウスDR6外部ドメイン−AP融合タンパク質は実施例8に記載した通りに生成した。マウス組み換えDR6−ECD−Hisを発現させ、その後CHO細胞培養から精製した。DR6−ECD−Hisのアミノ酸配列は上に示す。ウエスタンブロット実験に使用したポリクローナル抗N−APP抗体は、Thermo Scientific(カタログ番号RB−9023−P1)から入手した。メンブランに繋留されたAPP C末端断片(CTF)C99−APPおよびC83/C89−APPを可視化するために、Aβの中心部分内のエピトープを認識する4G8抗体(モノクローナル4G8、1:500、Covance)を用いて、軸索の溶解物のウェスタンブロット分析を行った。
図14Aは、APP外部ドメインの脱落(shedding)がNGF欠乏後の早期に生じることを示す写真である。図14Aでは、増殖因子除去後の様々な時間のニューロンを、軸索変性をブロックするために添加したバックスインヒビターの存在下でN−APPポリクローナル抗体にて染色した。左から右の順に、これらの写真は、0時間並びに、NGFの除去(かつ抗NGF抗体の添加)の3、6、12および24時間後の軸索変性を示す。
APP軸索脱落実験において表面APP発現を可視化するために用いたポリクローナル抗−N−APP抗体は、Thermo Scientific(カタログ番号RB−9023−P1)から入手した。上記実施例6及び7のように感覚外植片培養を行った。以下の点を変更して上記の実施例7のように、NGF欠乏アッセイを行った。NGF欠乏後、0時間、3時間、6時間、12時間および24時間の間隔をおいてDRG外植片培養物を4%PFA/PBSに固定した。表面APP発現を可視化するために、DRG軸索を、トリトン透過化処理工程を含まない実施例6及び7の免疫蛍光染色のために、上記の抗−N−APP一次抗体を用いて処理した。
感覚軸索上で表面APP発現を可視化するために(抗−N−APP抗体(Thermo Scientific(カタログ番号RB−9023−P1)にて標識した免疫蛍光性)、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡(赤色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
図14Bは、DR6外部ドメインが培養した細胞によって発現されるAPPを結合することを示す写真である。図14Bの左から右の順に、上の2つの写真は、DR6−APP(DR6外部ドメインを有する)にてプローブした、それぞれコントロールCos細胞およびAPP発現細胞を示す。下の2つの写真は、DR6−APにてプローブしたp75NTRレセプター及びDR6レセプターを発現する細胞を示す。DR6外部ドメインは、p75NTRレセプター発現細胞にもDR6レセプター発現細胞にも結合しない。
APP軸索脱落実験において表面APP発現を可視化するために用いたポリクローナル抗−N−APP抗体は、Thermo Scientific(カタログ番号RB−9023−P1)から入手した。上記実施例6及び7のように感覚外植片培養を行った。以下の点を変更して上記の実施例7のように、NGF欠乏アッセイを行った。NGF欠乏後、0時間、3時間、6時間、12時間および24時間の間隔をおいてDRG外植片培養物を4%PFA/PBSに固定した。表面APP発現を可視化するために、DRG軸索を、トリトン透過化処理工程を含まない実施例6及び7の免疫蛍光染色のために、上記の抗−N−APP一次抗体を用いて処理した。
感覚軸索上で表面APP発現を可視化するために(抗−N−APP抗体(Thermo Scientific(カタログ番号RB−9023−P1)にて標識した免疫蛍光性)、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡(赤色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
図14Bは、DR6外部ドメインが培養した細胞によって発現されるAPPを結合することを示す写真である。図14Bの左から右の順に、上の2つの写真は、DR6−APP(DR6外部ドメインを有する)にてプローブした、それぞれコントロールCos細胞およびAPP発現細胞を示す。下の2つの写真は、DR6−APにてプローブしたp75NTRレセプター及びDR6レセプターを発現する細胞を示す。DR6外部ドメインは、p75NTRレセプター発現細胞にもDR6レセプター発現細胞にも結合しない。
この図に示されるデータを生成するために使用した材料と方法は以下の通りである。APPがDR6細胞外ドメインと直接相互作用するか否かを試験するために、細胞ベースのAP結合実験を行った(図14B)。DR6外部ドメイン−AP融合タンパク質(DR6−AP)を生成するために、DMEM/10%FBS(Gibco)培地にて培養したCOS−1細胞に、FuGene形質移入試薬(Roche)を製造業者のプロトコールに従って用いて15μgのDR6−AP融合発現コンストラクトを形質移入した。形質移入の12時間後に、COS−1細胞培地をOPTI−MEM(Invitrogen)に変えた。形質移入の48時間後に、DR6−APタンパク質を含むCOS−1細胞条件培地を回収して濾過した。
培地中のDR6−APタンパク質の量は、以下の手順に従って定量化した。100μlの2×APバッファ(100mgのパラ−ニトロフェニルリン酸(Sigma)と15μlの1M MgCl2を15mlの2M ジエタノールアミンpH9.8に加えることによって調製する)を、等量の形質移入されたCOS細胞条件培地又は形質移入されなかったCOS−1細胞のコントロール条件培地と混合した。反応の色は12〜15分間発色し、O.D.は線形範囲(0.1−1)となった。次いで、反応量を、800μlの蒸留水を加えて調整し、405nmの吸光度波長でO.D.を測定した。nMの濃度は、式(100μlの場合):C(nM)=O.D. ×100×(60/発色時間)/30に従って算出した。
APP AP結合アッセイのために、6ウェル培養ディッシュに入れたDMEM/10%FBS(Gibco)培地中で培養したCOS−1細胞に、FuGene形質移入試薬(Roche)を製造業者のプロトコールに従って用いて、1ウェル当たり2μgのAPP発現ベクターを形質移入した。形質移入の2日後に、結合バッファ(0.2%BSA、0.1%NaN3、5mM CaCl2、1mM MgCl2、20mM HEPES、pH=7.0を含む、HBSS(Gibcoカタログ番号14175−095))にて細胞を2回洗浄した。次いで、AP結合アッセイは、DR6−AP条件培地と結合バッファの1:1混合物を作って行った。この混合物はAPPを過剰発現するCOS−1細胞に直接用いて室温で90分間インキュベートしたものである。インキュベートの後に、結合バッファにてCOS−1細胞を5回すすぐことによって結合していないDR6−APタンパク質を洗い流した。次いで、細胞を、PBSにて希釈した3.7%ホルムアルデヒドにて、室温で12分かけて固定した。残りのホルムアルデヒドは、HBSバッファ(20mM HEPES pH=7.0、150mM NaCl)にて細胞を3回すすぐことによって除去した。内在性AP活性は、HBSバッファ中、65℃で30分間の熱不活性化によってブロックした。次いで、COS-1細胞をAP反応バッファ(100mM トリスpH=9.5、100mM NaCl、50mM MgCl2)にて3回すすいだ。次いで、膜貫通APPに結合するDR6−AP融合タンパク質は、室温で終夜をかけて、1/50(量)のNBT/BCIP貯蔵溶液を有するAP結合バッファ中のCOS−1細胞上で呈色反応させることによって可視化した(Roche、カタログ番号1681451)(図14B)。平行コントロール実験では、形質移入されなかったCOS細胞からの条件培地をAP結合アッセイに用いた。COS−1細胞において発現される膜貫通p75NTRおよびDR6レセプターは、同じ実験条件下でDR6−AP融合タンパク質に特異的な結合を示さなかった(図14B)。これは、DR6外部ドメインとAPPとの間の相互作用が特異的であることを示す。
培地中のDR6−APタンパク質の量は、以下の手順に従って定量化した。100μlの2×APバッファ(100mgのパラ−ニトロフェニルリン酸(Sigma)と15μlの1M MgCl2を15mlの2M ジエタノールアミンpH9.8に加えることによって調製する)を、等量の形質移入されたCOS細胞条件培地又は形質移入されなかったCOS−1細胞のコントロール条件培地と混合した。反応の色は12〜15分間発色し、O.D.は線形範囲(0.1−1)となった。次いで、反応量を、800μlの蒸留水を加えて調整し、405nmの吸光度波長でO.D.を測定した。nMの濃度は、式(100μlの場合):C(nM)=O.D. ×100×(60/発色時間)/30に従って算出した。
APP AP結合アッセイのために、6ウェル培養ディッシュに入れたDMEM/10%FBS(Gibco)培地中で培養したCOS−1細胞に、FuGene形質移入試薬(Roche)を製造業者のプロトコールに従って用いて、1ウェル当たり2μgのAPP発現ベクターを形質移入した。形質移入の2日後に、結合バッファ(0.2%BSA、0.1%NaN3、5mM CaCl2、1mM MgCl2、20mM HEPES、pH=7.0を含む、HBSS(Gibcoカタログ番号14175−095))にて細胞を2回洗浄した。次いで、AP結合アッセイは、DR6−AP条件培地と結合バッファの1:1混合物を作って行った。この混合物はAPPを過剰発現するCOS−1細胞に直接用いて室温で90分間インキュベートしたものである。インキュベートの後に、結合バッファにてCOS−1細胞を5回すすぐことによって結合していないDR6−APタンパク質を洗い流した。次いで、細胞を、PBSにて希釈した3.7%ホルムアルデヒドにて、室温で12分かけて固定した。残りのホルムアルデヒドは、HBSバッファ(20mM HEPES pH=7.0、150mM NaCl)にて細胞を3回すすぐことによって除去した。内在性AP活性は、HBSバッファ中、65℃で30分間の熱不活性化によってブロックした。次いで、COS-1細胞をAP反応バッファ(100mM トリスpH=9.5、100mM NaCl、50mM MgCl2)にて3回すすいだ。次いで、膜貫通APPに結合するDR6−AP融合タンパク質は、室温で終夜をかけて、1/50(量)のNBT/BCIP貯蔵溶液を有するAP結合バッファ中のCOS−1細胞上で呈色反応させることによって可視化した(Roche、カタログ番号1681451)(図14B)。平行コントロール実験では、形質移入されなかったCOS細胞からの条件培地をAP結合アッセイに用いた。COS−1細胞において発現される膜貫通p75NTRおよびDR6レセプターは、同じ実験条件下でDR6−AP融合タンパク質に特異的な結合を示さなかった(図14B)。これは、DR6外部ドメインとAPPとの間の相互作用が特異的であることを示す。
図14Cは、DR6が感覚軸索上のN−APPの主要なレセプターであること及び、APP結合部位がDR6ヌルマウスの神経細胞において有意に減少することを示している写真である。図14Cの左から右の順に、上の3つの写真は、それぞれ、APコントロール、N−APP−APおよびSema3A−APにてプローブした、DR6+/−(het)マウスから得たニューロンを示す。下の3つの写真は、同様に、それぞれ、APコントロール、N−APP−APおよびSema3A−APにてプローブした、DR6−/−(KO)マウスから得たニューロンを示す。
図14Cに示されるデータを生成するために用いた材料と方法は以下の通りである。マウスDR6外部ドメイン−AP融合タンパク質は、上の実施例9で述べた通りに生成した。先に(Feiner et al., 1997, Neuron, Vol. 19, 539-545)記載されたように、マウスSema3A外部ドメイン−AP(Sema3A−AP)融合タンパク質を生成した。DR6ヌルマウス系統(DR6.KO)は、先に(Zhao et al., Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001)記載されている。DRG外植片培養およびDR6−AP軸索結合アッセイは、図12Aおよび12Bの実施例9で述べた通りに実行した。
図14Cに示されるデータを生成するために用いた材料と方法は以下の通りである。マウスDR6外部ドメイン−AP融合タンパク質は、上の実施例9で述べた通りに生成した。先に(Feiner et al., 1997, Neuron, Vol. 19, 539-545)記載されたように、マウスSema3A外部ドメイン−AP(Sema3A−AP)融合タンパク質を生成した。DR6ヌルマウス系統(DR6.KO)は、先に(Zhao et al., Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001)記載されている。DRG外植片培養およびDR6−AP軸索結合アッセイは、図12Aおよび12Bの実施例9で述べた通りに実行した。
図14Dは、アンタゴニストDR6抗体がDR6外部ドメインと神経系APPとの間の相互作用を崩壊させたことを示す写真である。これらの研究では、N−APPは、DR6を発現している神経細胞に加え、その後抗−N−APP抗体にて可視化した。左から右の順に、始めの4つの写真は、それぞれ、コントロールIgG;RA.4抗DR6抗体;RA.3抗DR6抗体;及びRA.1抗DR6抗体の存在下におけるニューロン表面上のDR6を結合するN−APPの能力を示す。右の写真は、コントロールIgGを用いた細胞上のDR6の染色を示す。
この図に示されるデータを生成するために用いた材料と方法は以下の通りである。図14Dに示すデータを得るために用いた細胞ベースのリガンド結合アッセイは、以下の変更を加えて、先に(Okada et al., Nature, 2006, Vol. 444, 369-373)記載されているように、行った。N末端増殖因子様ドメインAPP−His融合タンパク質(N−APP−His)を生成するために、DMEM/10%FBS(Gibco)培地にて培養したCOS−1細胞に、FuGene形質移入試薬(Roche)を製造業者のプロトコールに従って用いて15μgのN−APP−His融合発現コンストラクトを形質移入した。形質移入の12時間後に、COS−1細胞培地をOPTI−MEM(Invitrogen)に変えた。形質移入の48時間後に、N−APP−Hisタンパク質を含むCOS−1細胞条件培地を回収して濾過した。N−APP−Hisの濃度は、上記の抗−N−APP抗体を用いたウエスタンブロット分析によって測定した。
この結合アッセイに使用したヒトN−APP−Hisのアミノ酸配列は以下の通りである:
MLPGLALLLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFCGRLNMHMNVQNGKWDSDPSGTKTCIDTKEGILQYCQEVYPELQITNVVEANQPVTIQNWCKRGRKQCKTHPHFVIPYRCLVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNVDSADAEEDHHHHHH(配列番号:10)
次いで、N−APP−His結合アッセイは、N−APP−His条件培地と結合バッファの1:1混合物を作って行った。この混合物はDR6レセプターを過剰発現するCOS−1細胞に直接用いて、室温で90分間インキュベートしたものである。ここに示すDR6 mAb RA.1、RA.3又はRA.4(上記の実施例3および7)を、N−APP−His条件培地と結合バッファとともに20ug/mlで個々に添加した。コントロール実験では、正常なマウスIgG (Genentech Inc)を、N−APP−His条件培地と結合バッファとともに20ug/mlで添加した。
DR6レセプター発現細胞に結合するN−APPは、実施例6および7に記載の公知のプロトコール(Okada et al., Nature, 2006, Vol. 444, 369-373)に従って、抗−N−APP抗体(Thermo Scientific カタログ番号RB−9023−P1)を用いた免疫蛍光染色によって可視化した。細胞表面上のDR6レセプターに結合したN−APPタンパク質を可視化するために(抗−N−APP抗体にて標識した免疫蛍光性、Thermo Scientific(カタログ番号RB−9023−P1))、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡(赤色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
この図に示されるデータを生成するために用いた材料と方法は以下の通りである。図14Dに示すデータを得るために用いた細胞ベースのリガンド結合アッセイは、以下の変更を加えて、先に(Okada et al., Nature, 2006, Vol. 444, 369-373)記載されているように、行った。N末端増殖因子様ドメインAPP−His融合タンパク質(N−APP−His)を生成するために、DMEM/10%FBS(Gibco)培地にて培養したCOS−1細胞に、FuGene形質移入試薬(Roche)を製造業者のプロトコールに従って用いて15μgのN−APP−His融合発現コンストラクトを形質移入した。形質移入の12時間後に、COS−1細胞培地をOPTI−MEM(Invitrogen)に変えた。形質移入の48時間後に、N−APP−Hisタンパク質を含むCOS−1細胞条件培地を回収して濾過した。N−APP−Hisの濃度は、上記の抗−N−APP抗体を用いたウエスタンブロット分析によって測定した。
この結合アッセイに使用したヒトN−APP−Hisのアミノ酸配列は以下の通りである:
MLPGLALLLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFCGRLNMHMNVQNGKWDSDPSGTKTCIDTKEGILQYCQEVYPELQITNVVEANQPVTIQNWCKRGRKQCKTHPHFVIPYRCLVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNVDSADAEEDHHHHHH(配列番号:10)
次いで、N−APP−His結合アッセイは、N−APP−His条件培地と結合バッファの1:1混合物を作って行った。この混合物はDR6レセプターを過剰発現するCOS−1細胞に直接用いて、室温で90分間インキュベートしたものである。ここに示すDR6 mAb RA.1、RA.3又はRA.4(上記の実施例3および7)を、N−APP−His条件培地と結合バッファとともに20ug/mlで個々に添加した。コントロール実験では、正常なマウスIgG (Genentech Inc)を、N−APP−His条件培地と結合バッファとともに20ug/mlで添加した。
DR6レセプター発現細胞に結合するN−APPは、実施例6および7に記載の公知のプロトコール(Okada et al., Nature, 2006, Vol. 444, 369-373)に従って、抗−N−APP抗体(Thermo Scientific カタログ番号RB−9023−P1)を用いた免疫蛍光染色によって可視化した。細胞表面上のDR6レセプターに結合したN−APPタンパク質を可視化するために(抗−N−APP抗体にて標識した免疫蛍光性、Thermo Scientific(カタログ番号RB−9023−P1))、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡(赤色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
実施例11:軸索変性を誘導するためのアミロイド前駆体タンパク質(APP)によるDR6の活性化
図15Aは、交連軸索アッセイにおいてN末端APPに対するポリクローナル抗体が軸索変性をブロックすることを示す写真である。左から右の順に、図15Aの写真は、それぞれコントロールIgG;30μg/mlの抗NAPP抗体;及び、1.1μg/mlの抗NAPP抗体の存在下における交連軸索変性を示す。
図15Aに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。交連外植片生存アッセイは、実施例2のプロトコール及び図4Bに生成されたデータを示すように、示した量のポリクローナル抗−N−APP抗体(Thermo Scientific カタログ番号RB−9023−P1、大規模に透析されたもの)又はコントロールIgG(ウサギIgG、R&D systems)を用いて行った。GFPで標識した交連軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxiovert 200 Zeiss倒立顕微鏡(GFPの場合緑色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
図15Bは、N末端APP抗体がNGF除去によって誘導される感覚軸索変性を阻害したことを示す写真である。左から右の順に、図15Bの上の3つの写真は、NGFと、それぞれコントロール抗体;抗APPモノクローナル抗体22C11;及び抗APPポリクローナル抗体との存在下における感覚軸索を示す。下の3つの写真は、NGF(並びに抗NGF抗体)と、それぞれコントロール抗体;抗APPモノクローナル抗体22C11;及び抗APPポリクローナル抗体との存在下における感覚軸索を同様に示す。
この図15Bに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。NGF欠乏アッセイは、実施例8に記載のCampenotチャンバーにおいて行った。アッセイにおいて使用したN末端APPに対する抗体は、ポリクローナル抗−N−APP抗体(Thermo Scientific カタログ番号RB−9023−P1、大規模に透析されたもの)又は22C11モノクローナル抗体(22C11、Chemicon、大規模に透析されたもの)とした。正常なIgG(ウサギIgG、R&D systems)をコントロール実験として加えた。TUJ1抗体(1:500、Covance)を用いた感覚軸索の免疫蛍光標識法は、実施例1、7および8に記載したように行った。Campenotチャンバーの軸索区画における免疫蛍光性標識をした感覚軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡にて写真を撮った。
図15Aは、交連軸索アッセイにおいてN末端APPに対するポリクローナル抗体が軸索変性をブロックすることを示す写真である。左から右の順に、図15Aの写真は、それぞれコントロールIgG;30μg/mlの抗NAPP抗体;及び、1.1μg/mlの抗NAPP抗体の存在下における交連軸索変性を示す。
図15Aに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。交連外植片生存アッセイは、実施例2のプロトコール及び図4Bに生成されたデータを示すように、示した量のポリクローナル抗−N−APP抗体(Thermo Scientific カタログ番号RB−9023−P1、大規模に透析されたもの)又はコントロールIgG(ウサギIgG、R&D systems)を用いて行った。GFPで標識した交連軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxiovert 200 Zeiss倒立顕微鏡(GFPの場合緑色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
図15Bは、N末端APP抗体がNGF除去によって誘導される感覚軸索変性を阻害したことを示す写真である。左から右の順に、図15Bの上の3つの写真は、NGFと、それぞれコントロール抗体;抗APPモノクローナル抗体22C11;及び抗APPポリクローナル抗体との存在下における感覚軸索を示す。下の3つの写真は、NGF(並びに抗NGF抗体)と、それぞれコントロール抗体;抗APPモノクローナル抗体22C11;及び抗APPポリクローナル抗体との存在下における感覚軸索を同様に示す。
この図15Bに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。NGF欠乏アッセイは、実施例8に記載のCampenotチャンバーにおいて行った。アッセイにおいて使用したN末端APPに対する抗体は、ポリクローナル抗−N−APP抗体(Thermo Scientific カタログ番号RB−9023−P1、大規模に透析されたもの)又は22C11モノクローナル抗体(22C11、Chemicon、大規模に透析されたもの)とした。正常なIgG(ウサギIgG、R&D systems)をコントロール実験として加えた。TUJ1抗体(1:500、Covance)を用いた感覚軸索の免疫蛍光標識法は、実施例1、7および8に記載したように行った。Campenotチャンバーの軸索区画における免疫蛍光性標識をした感覚軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡にて写真を撮った。
図15Cは、β-分泌酵素(BACE)活性の阻害によってブロックされる軸索変性が、N−APPの添加によって回復しうることを示す写真である。左から右の順に、図15Cの上の3つの写真は、退化が観察したニューロン(培養されたNGFがない場合)および軸索のを示す:それぞれDMSOコントロール、BACEインヒビターおよびN−APP(かつBACE−I)の存在下で観察される軸索変性とニューロン(NGFの非存在下で培養したもの)を示す。図15Cの下の3つの写真は、ニューロン(NGF存在下で培養したもの)と、それぞれDMSOコントロール、BACEインヒビターおよびN−APP(かつBACE−I)を同様に示す。
この図15Cに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。NGF欠乏アッセイは、実施例8に記載のCampenotチャンバーにおいて行った。このアッセイに使用したヒトの組み換えN−APPアミノ酸19−306は、Novus(Novus Biologicals、カタログ番号H00000351−P01)から購入した。NGF欠乏の時に、3μg/mlのN−APPを、BACEインヒビター(1uM終濃度、InSolution OM99−2、Calbiochem/Merck)とともに添加した。このアッセイではBACEインヒビターを1uM終濃度で用いた(InSolution OM99−2、Calbiochem/Merck)。TUJ1抗体(1:500、Covance)による感覚軸索の免疫蛍光標識法を、実施例1、7および8に記載のように行った。Campenotチャンバーの軸索の区画の免疫蛍光標識された感覚軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡にて写真を撮った。
図15Dは、RNAiによるAPP除去により、N−APPによって誘導される細胞死に対する、BACEインヒビター存在下で生育させた神経細胞の感受性が高まることを示す写真である。図15Dの左から右の順に、上の3つの写真は、コントロールRNAiの存在下で培養したニューロンを示す。これらの上の写真は、それぞれ3μg/mlのN−APP又は0.1μg/mlのN−APPとともに培養したコントロール並びにニューロンを示す。下の3つの写真は、APP RNAiの存在下で培養したニューロンを示す。これらの下の写真は、それぞれ3μg/mlのN−APP又は0.1μg/mlのN−APPとともに培養したコントロール並びにニューロンを示す。
この図15Dに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。交連外植片培養物におけるAPP RNAiは実施例2に記載のように行った。このアッセイに使用したヒトの組み換えN−APPアミノ酸19−306は、Novus(Novus Biologicals、カタログ番号H00000351−P01)から購入した。このアッセイでは予め設定したラット特異的APP ON−TARGET+siRNAプールを製造業者の指示に従って使用し、E13ラット交連外植片においてAPP発現を下方制御した(APP ON−TARGET+siRNAプール、GeneID:54226、カタログ番号088191、Dharmacon Inc.)。GFP標識及びRFP標識の交連軸索を可視化するために(実施例2および7に記載)、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxiovert 200 Zeiss倒立顕微鏡(GFPの場合緑色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
この図15Cに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。NGF欠乏アッセイは、実施例8に記載のCampenotチャンバーにおいて行った。このアッセイに使用したヒトの組み換えN−APPアミノ酸19−306は、Novus(Novus Biologicals、カタログ番号H00000351−P01)から購入した。NGF欠乏の時に、3μg/mlのN−APPを、BACEインヒビター(1uM終濃度、InSolution OM99−2、Calbiochem/Merck)とともに添加した。このアッセイではBACEインヒビターを1uM終濃度で用いた(InSolution OM99−2、Calbiochem/Merck)。TUJ1抗体(1:500、Covance)による感覚軸索の免疫蛍光標識法を、実施例1、7および8に記載のように行った。Campenotチャンバーの軸索の区画の免疫蛍光標識された感覚軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡にて写真を撮った。
図15Dは、RNAiによるAPP除去により、N−APPによって誘導される細胞死に対する、BACEインヒビター存在下で生育させた神経細胞の感受性が高まることを示す写真である。図15Dの左から右の順に、上の3つの写真は、コントロールRNAiの存在下で培養したニューロンを示す。これらの上の写真は、それぞれ3μg/mlのN−APP又は0.1μg/mlのN−APPとともに培養したコントロール並びにニューロンを示す。下の3つの写真は、APP RNAiの存在下で培養したニューロンを示す。これらの下の写真は、それぞれ3μg/mlのN−APP又は0.1μg/mlのN−APPとともに培養したコントロール並びにニューロンを示す。
この図15Dに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。交連外植片培養物におけるAPP RNAiは実施例2に記載のように行った。このアッセイに使用したヒトの組み換えN−APPアミノ酸19−306は、Novus(Novus Biologicals、カタログ番号H00000351−P01)から購入した。このアッセイでは予め設定したラット特異的APP ON−TARGET+siRNAプールを製造業者の指示に従って使用し、E13ラット交連外植片においてAPP発現を下方制御した(APP ON−TARGET+siRNAプール、GeneID:54226、カタログ番号088191、Dharmacon Inc.)。GFP標識及びRFP標識の交連軸索を可視化するために(実施例2および7に記載)、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxiovert 200 Zeiss倒立顕微鏡(GFPの場合緑色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
実施例12:APPが誘導する軸索変性には必要であるが、Aβによって引き起こされる変性には必要でないDR6
図16Aに示すように、DR6活性化は、N−APPが誘導する軸索変性に必要である。
図16Aの左から右の順に、上の3つの写真は、DR6+/−(het)マウスから得たニューロンを示す。一つ目の写真はAβにもN−APPにも曝されていないコントロールニューロンを示し、二つ目の写真はAβに曝されたニューロンを示し、三つ目の写真はN−APPに曝されたニューロンを示す。下の3つの写真は、DR6−/−(KO)マウスから得たニューロンを示す。左から右の順に下の一つ目の写真はAβにもN−APPにも曝されていないコントロールニューロンを示し、二つ目の写真はAβに曝されたニューロンを示し、三つ目の写真はN−APPに曝されたニューロンを示す。
この図16Aに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。交連外植片培養および生存アッセイは実施例2に記載のように行った。DR6ヌルマウス系統(DR6.KO)は、先に(Zhao et al., Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001)記載されている。このアッセイに使用したヒトの組み換えN−APPアミノ酸19−306は、Novus(Novus Biologicals、カタログ番号H00000351−P01)から購入した。このアッセイに使用した組み換えヒトβアミロイドアミノ酸1−42は、Chemicon(超高純度ヒAβ1−42、カタログ番号AG912、Chemicon)から購入した。プレーティングの24時間後に、3μg/mlのN−APPを、BACEインヒビターとともに交連外植片に添加した。プレーティングの24時間後に、3μMの組み換えヒトβアミロイドアミノ酸1−42を、BACEインヒビターとともに交連外植片に添加した。このアッセイではBACEインヒビターを1uM終濃度で用いた(InSolution OM99−2、Calbiochem/Merck)。さらに24時間の間、交連外植片を、示した量のN−APP又はAβとともにインキュベートした。交連外植片プレーティングの48時間後にデータを採取した。交連軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxiovert 200 Zeiss倒立顕微鏡(明視野)にて写真を撮った。
図16Bに示すように、アンタゴニストDR6抗体は、Aβによって誘発される軸索変性をブロックしなかった。図16Bの左から右の順に、上の3つの写真は、コントロールニューロン、BACE−Iの存在下でのニューロンと、BACE−IおよびAβの存在下でのニューロンを示す。図16Bにおいて、下の2つの写真は、BACE−I、Aβおよび抗DR6抗体RA.1の存在下でのニューロンと、BACE−I、Aβおよび抗DR6抗体RA.3の存在下でのニューロンを示す。
この図16Bに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。交連外植片培養および生存アッセイは、実施例2に記載のように行った。このアッセイに使用した組み換えヒトβアミロイドアミノ酸1−42はChemicon(超高純度ヒトAβ1−42、カタログ番号AG912、Chemicon)から購入した。このアッセイではBACEインヒビターを1uM終濃度で用いた(InSolution OM99−2、Calbiochem/Merck)。プレーティングの24時間後に、3μMの組み換えヒトβアミロイドアミノ酸1−42を、BACEインヒビターと40ug/mlの示した抗DR6 mAbとともに交連外植片に添加した。このアッセイではBACEインヒビターを1uM終濃度で用いた(InSolution OM99−2、Calbiochem/Merck)。交連外植片は、示した量のAβとともにさらに24時間インキュベートした。交連外植片プレーティングの48時間後にデータを採取した。
マウスモノクローナルRA.1−RA.5 DR6抗体は、上の実施例3に記載したように、DR6外部ドメインにてマウスを免疫化することによって生成した。上記したように、本明細書中でRA.1およびRA.3抗体と称するDR6抗体は、それぞれ「1E5.5.7」および「3F4.4.8」であり、実施例3に記載のDR6抗体である。GFPで標識した交連軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxiovert 200 Zeiss倒立顕微鏡(GFPの場合緑色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
図16Aに示すように、DR6活性化は、N−APPが誘導する軸索変性に必要である。
図16Aの左から右の順に、上の3つの写真は、DR6+/−(het)マウスから得たニューロンを示す。一つ目の写真はAβにもN−APPにも曝されていないコントロールニューロンを示し、二つ目の写真はAβに曝されたニューロンを示し、三つ目の写真はN−APPに曝されたニューロンを示す。下の3つの写真は、DR6−/−(KO)マウスから得たニューロンを示す。左から右の順に下の一つ目の写真はAβにもN−APPにも曝されていないコントロールニューロンを示し、二つ目の写真はAβに曝されたニューロンを示し、三つ目の写真はN−APPに曝されたニューロンを示す。
この図16Aに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。交連外植片培養および生存アッセイは実施例2に記載のように行った。DR6ヌルマウス系統(DR6.KO)は、先に(Zhao et al., Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001)記載されている。このアッセイに使用したヒトの組み換えN−APPアミノ酸19−306は、Novus(Novus Biologicals、カタログ番号H00000351−P01)から購入した。このアッセイに使用した組み換えヒトβアミロイドアミノ酸1−42は、Chemicon(超高純度ヒAβ1−42、カタログ番号AG912、Chemicon)から購入した。プレーティングの24時間後に、3μg/mlのN−APPを、BACEインヒビターとともに交連外植片に添加した。プレーティングの24時間後に、3μMの組み換えヒトβアミロイドアミノ酸1−42を、BACEインヒビターとともに交連外植片に添加した。このアッセイではBACEインヒビターを1uM終濃度で用いた(InSolution OM99−2、Calbiochem/Merck)。さらに24時間の間、交連外植片を、示した量のN−APP又はAβとともにインキュベートした。交連外植片プレーティングの48時間後にデータを採取した。交連軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxiovert 200 Zeiss倒立顕微鏡(明視野)にて写真を撮った。
図16Bに示すように、アンタゴニストDR6抗体は、Aβによって誘発される軸索変性をブロックしなかった。図16Bの左から右の順に、上の3つの写真は、コントロールニューロン、BACE−Iの存在下でのニューロンと、BACE−IおよびAβの存在下でのニューロンを示す。図16Bにおいて、下の2つの写真は、BACE−I、Aβおよび抗DR6抗体RA.1の存在下でのニューロンと、BACE−I、Aβおよび抗DR6抗体RA.3の存在下でのニューロンを示す。
この図16Bに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。交連外植片培養および生存アッセイは、実施例2に記載のように行った。このアッセイに使用した組み換えヒトβアミロイドアミノ酸1−42はChemicon(超高純度ヒトAβ1−42、カタログ番号AG912、Chemicon)から購入した。このアッセイではBACEインヒビターを1uM終濃度で用いた(InSolution OM99−2、Calbiochem/Merck)。プレーティングの24時間後に、3μMの組み換えヒトβアミロイドアミノ酸1−42を、BACEインヒビターと40ug/mlの示した抗DR6 mAbとともに交連外植片に添加した。このアッセイではBACEインヒビターを1uM終濃度で用いた(InSolution OM99−2、Calbiochem/Merck)。交連外植片は、示した量のAβとともにさらに24時間インキュベートした。交連外植片プレーティングの48時間後にデータを採取した。
マウスモノクローナルRA.1−RA.5 DR6抗体は、上の実施例3に記載したように、DR6外部ドメインにてマウスを免疫化することによって生成した。上記したように、本明細書中でRA.1およびRA.3抗体と称するDR6抗体は、それぞれ「1E5.5.7」および「3F4.4.8」であり、実施例3に記載のDR6抗体である。GFPで標識した交連軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxiovert 200 Zeiss倒立顕微鏡(GFPの場合緑色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
実施例13:細胞内DR6シグナル伝達
カスパーゼはプログラムされた細胞死経路の重要な因子であり(例としてGrutter et al., Curr Opin Struct Biol. 10(6): 649-55 (2000);Kuida et al., Nature 384(6607): 368-72 (1996):Finn et al., J Neurosci. 20(4): 1333-41 (2000)を参照)、いくつかのカスパーゼは、ハンチントン舞踏病およびADを含む神経変性疾患の細胞内シグナル伝達と関係している(例としてWellington et al., J Neurosci. 22(18): 7862-72 (2002);Graham et al., Cell 125(6): 1179-91 (2006);Guo et al., Am J Pathol. (2): 523-31 (2004);Horowitz et al., J Neurosci. 24(36): 7895-902 (2004)を参照)。
図17Aは、5日間培養した後に、様々な異なる培養条件に24時間曝した感覚ニューロンの写真を示す。図17Aに示すように、下流のカスパーゼ−3でなく、JNKと上流のカスパーゼ−8の阻害によって軸索変性が遅延される。
図17Aでは、左の2つの写真は、上から下の順に、それぞれNGFおよび抗NGF抗体に曝された感覚ニューロンを示す。図17Aでは、右の4つの写真は、上から下の順に、それぞれ、抗NGF抗体とJNKインヒビター;抗NGF抗体とカスパーゼ−8インヒビター;抗NGF抗体とBAXインヒビター;そして、抗NGF抗体とカスパーゼ−3インヒビターに曝した感覚ニューロンを示す。
この図17Aに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。CampenotチャンバーのNGF欠失アッセイは実施例8に記載のように行った。小分子JNKインヒビターであるSP600125は、1uM終濃度でこのアッセイに用いた(SP 600125、カタログ番号1496、Tocris Bioscience)。カスパーゼ-3インヒビターであるZ−DEVD−FMKは、10uMでこのアッセイに用いた(Z-DEVD-FMK、カタログ番号264155、Calbiochem)。カスパーゼ−8インヒビターであるZ−IETD−FMKは10uMでこのアッセイに用いた(Z-IETD-FMK、カタログ番号FMK007、R&D Systems)。BAXインヒビターペプチドは10uMで用いて神経系細胞死をブロックした(バックス−V5、Tocris Inc)。バックスヌルマウス系統(Bax−R1)は、先に(Deckwerth et al., Neuron, Vol. 17, 401-411, 1996)記載されており、Jackson Labから入手した。TUJ1抗体(1:500、Covance)を用いた感覚軸索の免疫蛍光標識法は、実施例1、7および8に記載したように行った。Campenotチャンバーの軸索区画における免疫蛍光性標識をした感覚軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡にて写真を撮った。
図17Bは、E12.5運動ニューロン外植片培養物からの運動ニューロンの写真であり、カスパーゼ−3が細胞体において機能するのに対して、カスパーゼ−6が軸索において機能することを示す。
図17Bの左から右の順に、4つの写真は、それぞれ(1) 増殖因子とともに、(2) 増殖因子がなく、カスパーゼインヒビターの非存在下で(コントロール)、(3) 増殖因子がなく、カスパーゼ−3インヒビターの存在下で、そして、(4) 増殖因子がなく、カスパーゼ−6インヒビターの存在下で、培養したニューロンを示す。
この図17Bに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。カスパーゼ-3インヒビターであるZ−DEVD−FMKは、10uMでこのアッセイに使用した(Z-DEVD-FMK、カタログ番号264155、Calbiochem)。カスパーゼ-6インヒビターであるZ−VEID−FMKは、10uMでこのアッセイに使用した(Z-VEID-FMK、カタログ番号550379、Becton, Dickinson and Company PHARMINGEN Division)。運動ニューロン腹側脊髄生存アッセイは、上記の実施例6のように行った。TUJ1抗体(1:500、Covance)を用いた運動軸索の免疫蛍光標識法は、実施例1、7および8に記載したように行った。免疫蛍光性標識をした運動軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡にて写真を撮った。
カスパーゼはプログラムされた細胞死経路の重要な因子であり(例としてGrutter et al., Curr Opin Struct Biol. 10(6): 649-55 (2000);Kuida et al., Nature 384(6607): 368-72 (1996):Finn et al., J Neurosci. 20(4): 1333-41 (2000)を参照)、いくつかのカスパーゼは、ハンチントン舞踏病およびADを含む神経変性疾患の細胞内シグナル伝達と関係している(例としてWellington et al., J Neurosci. 22(18): 7862-72 (2002);Graham et al., Cell 125(6): 1179-91 (2006);Guo et al., Am J Pathol. (2): 523-31 (2004);Horowitz et al., J Neurosci. 24(36): 7895-902 (2004)を参照)。
図17Aは、5日間培養した後に、様々な異なる培養条件に24時間曝した感覚ニューロンの写真を示す。図17Aに示すように、下流のカスパーゼ−3でなく、JNKと上流のカスパーゼ−8の阻害によって軸索変性が遅延される。
図17Aでは、左の2つの写真は、上から下の順に、それぞれNGFおよび抗NGF抗体に曝された感覚ニューロンを示す。図17Aでは、右の4つの写真は、上から下の順に、それぞれ、抗NGF抗体とJNKインヒビター;抗NGF抗体とカスパーゼ−8インヒビター;抗NGF抗体とBAXインヒビター;そして、抗NGF抗体とカスパーゼ−3インヒビターに曝した感覚ニューロンを示す。
この図17Aに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。CampenotチャンバーのNGF欠失アッセイは実施例8に記載のように行った。小分子JNKインヒビターであるSP600125は、1uM終濃度でこのアッセイに用いた(SP 600125、カタログ番号1496、Tocris Bioscience)。カスパーゼ-3インヒビターであるZ−DEVD−FMKは、10uMでこのアッセイに用いた(Z-DEVD-FMK、カタログ番号264155、Calbiochem)。カスパーゼ−8インヒビターであるZ−IETD−FMKは10uMでこのアッセイに用いた(Z-IETD-FMK、カタログ番号FMK007、R&D Systems)。BAXインヒビターペプチドは10uMで用いて神経系細胞死をブロックした(バックス−V5、Tocris Inc)。バックスヌルマウス系統(Bax−R1)は、先に(Deckwerth et al., Neuron, Vol. 17, 401-411, 1996)記載されており、Jackson Labから入手した。TUJ1抗体(1:500、Covance)を用いた感覚軸索の免疫蛍光標識法は、実施例1、7および8に記載したように行った。Campenotチャンバーの軸索区画における免疫蛍光性標識をした感覚軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡にて写真を撮った。
図17Bは、E12.5運動ニューロン外植片培養物からの運動ニューロンの写真であり、カスパーゼ−3が細胞体において機能するのに対して、カスパーゼ−6が軸索において機能することを示す。
図17Bの左から右の順に、4つの写真は、それぞれ(1) 増殖因子とともに、(2) 増殖因子がなく、カスパーゼインヒビターの非存在下で(コントロール)、(3) 増殖因子がなく、カスパーゼ−3インヒビターの存在下で、そして、(4) 増殖因子がなく、カスパーゼ−6インヒビターの存在下で、培養したニューロンを示す。
この図17Bに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。カスパーゼ-3インヒビターであるZ−DEVD−FMKは、10uMでこのアッセイに使用した(Z-DEVD-FMK、カタログ番号264155、Calbiochem)。カスパーゼ-6インヒビターであるZ−VEID−FMKは、10uMでこのアッセイに使用した(Z-VEID-FMK、カタログ番号550379、Becton, Dickinson and Company PHARMINGEN Division)。運動ニューロン腹側脊髄生存アッセイは、上記の実施例6のように行った。TUJ1抗体(1:500、Covance)を用いた運動軸索の免疫蛍光標識法は、実施例1、7および8に記載したように行った。免疫蛍光性標識をした運動軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡にて写真を撮った。
図17Cは、5日間培養した後に、様々な異なる培養条件に24時間曝した感覚ニューロンの写真を示す。図17Cのデータは、カスパーゼ−3が軸索変性に必要であるようではないのに対して、BAXは必要であることを示す。
図17Cの左から右の順に、上の4つの写真は、NGF、そして抗NGF抗体(すなわちNGF欠乏)のそれぞれ16、24および48時間の存在下において培養したBAX+/+ニューロンを示す。下の4つの写真は、同様に、NGF、そして抗NGF抗体のそれぞれ16、24および48時間の存在下において培養したBAX−/−ニューロンを示す。
この図17Cに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。CampenotチャンバーのNGF欠失アッセイは、上の実施例8に記載のように行った。バックスヌルマウス系統(Bax−R1)は、先に(Deckwerth et al., Neuron, Vol. 17, 401-411, 1996)記載されており、Jackson Labから入手した。NGF抗体は、Campenotチャンバーの軸索区画のNGF欠失アッセイに用いた(モノクローナル機能-ブロッキング抗NGF#911、Genentech、20ug/ml)。TUJ1抗体(1:500、Covance)を用いた感覚軸索の免疫蛍光標識法は、実施例1、7および8に記載したように行った。Campenotチャンバーの軸索区画における免疫蛍光性標識をした感覚軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡(緑色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
図17Dは、異なる培養条件下で24時間培養したE13ラット外植片交連ニューロンの培養物の写真である。図17Dのデータは、カスパーゼ−3が細胞体において機能するのに対して、カスパーゼ−6が軸索において機能することを示す。
図17Dの左から右の順に、上の3つの写真は、カスパーゼ−3又はカスパーゼ−6のインヒビターのそれぞれと培養したニューロンと比較したときの、コントロールニューロンのGFP分析を示す。下の3つの写真は、同様に、カスパーゼ−3又はカスパーゼ−6のインヒビターのそれぞれと培養したニューロンと比較したときの、コントロールニューロンのTUNEL(細胞死)分析を示す。
この図17Dに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。交連外植片培養および生存アッセイは実施例2に記載のように行った。交連細胞体のプログラムされた細胞死は、上の実施例7に記載のように、TUNNELアッセイによって交連外植片培養において可視化した。交連外植片は、4%PFA/PBSにて固定し、インサイツ細胞死検出キット(カタログ番号11 684 795 910、Roche)を製造業者の指示マニュアル(Roche)に従って使用し、DNA鎖遮断(TUNNEL技術)の標識に基づいて、単一細胞レベルでプログラムされた細胞死(アポトーシス)の検出のために処理した。交連感覚及び運動の外植片培養物の細胞体におけるアポトーシスは、蛍光電子顕微鏡法によって分析した(図17D)。カスパーゼ−3インヒビターであるZ−DEVD−FMKは、10uMでこのアッセイに用いた(Z-DEVD-FMK、カタログ番号264155、Calbiochem)。カスパーゼ-6インヒビターであるZ−VEID−FMKは、10uMでこのアッセイに用いた(Z−VEID−FMK、カタログ番号550379、Becton, Dickinson and Company, PHARMINGEN Division)。GFP標識の交連軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxiovert 200 Zeiss倒立顕微鏡(GFPの場合に緑色蛍光チャネル)にて写真を撮った。蛍光標識したTUNNELポジティブアポトーシスの細胞体を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡(TUNNELの場合に赤色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
図17Cの左から右の順に、上の4つの写真は、NGF、そして抗NGF抗体(すなわちNGF欠乏)のそれぞれ16、24および48時間の存在下において培養したBAX+/+ニューロンを示す。下の4つの写真は、同様に、NGF、そして抗NGF抗体のそれぞれ16、24および48時間の存在下において培養したBAX−/−ニューロンを示す。
この図17Cに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。CampenotチャンバーのNGF欠失アッセイは、上の実施例8に記載のように行った。バックスヌルマウス系統(Bax−R1)は、先に(Deckwerth et al., Neuron, Vol. 17, 401-411, 1996)記載されており、Jackson Labから入手した。NGF抗体は、Campenotチャンバーの軸索区画のNGF欠失アッセイに用いた(モノクローナル機能-ブロッキング抗NGF#911、Genentech、20ug/ml)。TUJ1抗体(1:500、Covance)を用いた感覚軸索の免疫蛍光標識法は、実施例1、7および8に記載したように行った。Campenotチャンバーの軸索区画における免疫蛍光性標識をした感覚軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡(緑色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
図17Dは、異なる培養条件下で24時間培養したE13ラット外植片交連ニューロンの培養物の写真である。図17Dのデータは、カスパーゼ−3が細胞体において機能するのに対して、カスパーゼ−6が軸索において機能することを示す。
図17Dの左から右の順に、上の3つの写真は、カスパーゼ−3又はカスパーゼ−6のインヒビターのそれぞれと培養したニューロンと比較したときの、コントロールニューロンのGFP分析を示す。下の3つの写真は、同様に、カスパーゼ−3又はカスパーゼ−6のインヒビターのそれぞれと培養したニューロンと比較したときの、コントロールニューロンのTUNEL(細胞死)分析を示す。
この図17Dに示されるデータを生成するために使用した材料と方法は、以下の通りである。交連外植片培養および生存アッセイは実施例2に記載のように行った。交連細胞体のプログラムされた細胞死は、上の実施例7に記載のように、TUNNELアッセイによって交連外植片培養において可視化した。交連外植片は、4%PFA/PBSにて固定し、インサイツ細胞死検出キット(カタログ番号11 684 795 910、Roche)を製造業者の指示マニュアル(Roche)に従って使用し、DNA鎖遮断(TUNNEL技術)の標識に基づいて、単一細胞レベルでプログラムされた細胞死(アポトーシス)の検出のために処理した。交連感覚及び運動の外植片培養物の細胞体におけるアポトーシスは、蛍光電子顕微鏡法によって分析した(図17D)。カスパーゼ−3インヒビターであるZ−DEVD−FMKは、10uMでこのアッセイに用いた(Z-DEVD-FMK、カタログ番号264155、Calbiochem)。カスパーゼ-6インヒビターであるZ−VEID−FMKは、10uMでこのアッセイに用いた(Z−VEID−FMK、カタログ番号550379、Becton, Dickinson and Company, PHARMINGEN Division)。GFP標識の交連軸索を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxiovert 200 Zeiss倒立顕微鏡(GFPの場合に緑色蛍光チャネル)にて写真を撮った。蛍光標識したTUNNELポジティブアポトーシスの細胞体を可視化するために、Carl Zeiss Imaging SolutionsのAxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1(03/2006)コンピュータソフトウェアを用いたAxioplan-2 ImagingZeiss顕微鏡(TUNNELの場合に赤色蛍光チャネル)にて写真を撮った。
実施例14:動物モデルにおけるDR6アンタゴニスト活性
異なる神経変性疾患と関係する多くの動物モデルは、インビボでのDR6アンタゴニストの効果を調べるために、当業者によって用いられうる。例えば、APP/RKトランスジェニックマウスは、変異アミロイド前駆体タンパク質ポリペプチドを発現し、重症な神経変性およびアポトーシスを表す。したがって、APP/RKトランスジェニックマウスはアルツハイマー病のモデルとなり、この動物モデルは、この動物モデルにおいて観察されるこの症候群に伴う病理学的プロセスに対するDR6アンタゴニストの効果を調べるために用いられる(例としてMoechars et al., Neuroscience 91(3): 819-830 (1999)を参照)。APP23およびJNPL3トランスジェニック系統などの様々な他のトランスジェニックマウス系統は、変異アルツハイマー関連ポリペプチドを発現し、さらに神経細胞消失を表す。ゆえに、APP23およびJNPL3のトランスジェニックマウスは、DR6アンタゴニストが投与されうるアルツハイマー病の代替モデルとなる(例としてMcGowan et al., TRENDS in Genetics Vol. 22 No. 5 (2006)を参照)。
G93A SOD1トランスジェニックマウスは、ヒトのスーパーオキシドジスムターゼ変異型ポリペプチドを発現し、高いレベルのカスパーゼ−3発現と運動ニューロンアポトーシスを表す。G93A SOD1トランスジェニックマウスは、DR6アンタゴニストの効果を調べるために用いられうる筋萎縮性側索硬化症のモデルとなる(例としてTokuda et al., Brain Res. 1148: 234-242 (2007);及びWang et al., Eur. J. Neurosci. 26(3): 633-641 (2007)を参照)。R6/2トランスジェニックマウスは、その天然のプロモーターの制御下に拡張されたN末端ポリグルタメートリピートを有するhuntingtonのエキソン−1を発現し、ヒトのハンチントン病によく似た進行性神経病理的変化を表す(例としてMangarini et a1., Cell, 87, 493-506 (1996);Chen et al., Nat. Med. 6, 797-801 (2000)を参照)。R6/2トランスジェニックマウスはハンチントン病のモデルとなり、この動物モデルは、この動物モデルにおいて観察されるこの症候群に伴う病理学的プロセスに対するDR6アンタゴニストの効果を調べるために用いられうる(例としてWang et al., European Journal of Neuroscience, 26: 633-641 (2007)を参照)。PK−KOトランスジェニックマウスは、Park−2遺伝子のタンパク質産物を発現せず、パーキンソン病に似ている異常を表し、野生型マウスよりアポトーシスを起こしやすいニューロンを保持する(例としてCasarejos et al., J Neurochem. 97(4): 934-46 (2006)を参照)。PK−KOトランスジェニックマウスはパーキンソン病のモデルとなり、この動物モデルは、この動物モデルにおいて観察されるこの症候群に伴う病理学的プロセスに対するDR6アンタゴニストの効果を特徴付けるために用いられうる。さらに、多くのトランスジェニックマウス系統、例えばSmn−/−SMN2マウス、ヒトARプロモーター下に純粋な239トリヌクレオチドCAGリピートを持つトランスジェニックマウス、並びに、マウスのバックグラウンドにおいて機能するヒトのSMNC遺伝子の少なくとも一コピーを有する天然のマウスSmn遺伝子のトランスジェニックダブルノックアウトのすべては、生存運動ニューロン遺伝子のタンパク質産物を発現しない、もしくはその変更したバージョンを発現し、そのために、脊髄性筋萎縮症に似ている異常を表す(例としてHsiu et al., Nature Genetics 24, 66 - 70 (2000);Ferri et al., Neuroreport 15(2): 275-280 (2004);Ferri et al., Curr Biol. 2003 Apr 15;13(8): 669-73;及びRossol et al., Journal of Cell Biology, Volume 163, Number 4, 801-812 (2003)を参照)。結果として、このようなトランスジェニックマウス系統は、脊髄性筋萎縮症のモデルとなり、この動物モデルは、この動物モデルにおいて観察されるこの症候群に伴う病理学的プロセスに対するDR6アンタゴニストの効果を特徴付けるために用いられうる。
異なる神経変性疾患と関係する多くの動物モデルは、インビボでのDR6アンタゴニストの効果を調べるために、当業者によって用いられうる。例えば、APP/RKトランスジェニックマウスは、変異アミロイド前駆体タンパク質ポリペプチドを発現し、重症な神経変性およびアポトーシスを表す。したがって、APP/RKトランスジェニックマウスはアルツハイマー病のモデルとなり、この動物モデルは、この動物モデルにおいて観察されるこの症候群に伴う病理学的プロセスに対するDR6アンタゴニストの効果を調べるために用いられる(例としてMoechars et al., Neuroscience 91(3): 819-830 (1999)を参照)。APP23およびJNPL3トランスジェニック系統などの様々な他のトランスジェニックマウス系統は、変異アルツハイマー関連ポリペプチドを発現し、さらに神経細胞消失を表す。ゆえに、APP23およびJNPL3のトランスジェニックマウスは、DR6アンタゴニストが投与されうるアルツハイマー病の代替モデルとなる(例としてMcGowan et al., TRENDS in Genetics Vol. 22 No. 5 (2006)を参照)。
G93A SOD1トランスジェニックマウスは、ヒトのスーパーオキシドジスムターゼ変異型ポリペプチドを発現し、高いレベルのカスパーゼ−3発現と運動ニューロンアポトーシスを表す。G93A SOD1トランスジェニックマウスは、DR6アンタゴニストの効果を調べるために用いられうる筋萎縮性側索硬化症のモデルとなる(例としてTokuda et al., Brain Res. 1148: 234-242 (2007);及びWang et al., Eur. J. Neurosci. 26(3): 633-641 (2007)を参照)。R6/2トランスジェニックマウスは、その天然のプロモーターの制御下に拡張されたN末端ポリグルタメートリピートを有するhuntingtonのエキソン−1を発現し、ヒトのハンチントン病によく似た進行性神経病理的変化を表す(例としてMangarini et a1., Cell, 87, 493-506 (1996);Chen et al., Nat. Med. 6, 797-801 (2000)を参照)。R6/2トランスジェニックマウスはハンチントン病のモデルとなり、この動物モデルは、この動物モデルにおいて観察されるこの症候群に伴う病理学的プロセスに対するDR6アンタゴニストの効果を調べるために用いられうる(例としてWang et al., European Journal of Neuroscience, 26: 633-641 (2007)を参照)。PK−KOトランスジェニックマウスは、Park−2遺伝子のタンパク質産物を発現せず、パーキンソン病に似ている異常を表し、野生型マウスよりアポトーシスを起こしやすいニューロンを保持する(例としてCasarejos et al., J Neurochem. 97(4): 934-46 (2006)を参照)。PK−KOトランスジェニックマウスはパーキンソン病のモデルとなり、この動物モデルは、この動物モデルにおいて観察されるこの症候群に伴う病理学的プロセスに対するDR6アンタゴニストの効果を特徴付けるために用いられうる。さらに、多くのトランスジェニックマウス系統、例えばSmn−/−SMN2マウス、ヒトARプロモーター下に純粋な239トリヌクレオチドCAGリピートを持つトランスジェニックマウス、並びに、マウスのバックグラウンドにおいて機能するヒトのSMNC遺伝子の少なくとも一コピーを有する天然のマウスSmn遺伝子のトランスジェニックダブルノックアウトのすべては、生存運動ニューロン遺伝子のタンパク質産物を発現しない、もしくはその変更したバージョンを発現し、そのために、脊髄性筋萎縮症に似ている異常を表す(例としてHsiu et al., Nature Genetics 24, 66 - 70 (2000);Ferri et al., Neuroreport 15(2): 275-280 (2004);Ferri et al., Curr Biol. 2003 Apr 15;13(8): 669-73;及びRossol et al., Journal of Cell Biology, Volume 163, Number 4, 801-812 (2003)を参照)。結果として、このようなトランスジェニックマウス系統は、脊髄性筋萎縮症のモデルとなり、この動物モデルは、この動物モデルにおいて観察されるこの症候群に伴う病理学的プロセスに対するDR6アンタゴニストの効果を特徴付けるために用いられうる。
上記のものを含む神経学的状態又は疾患の動物モデルを用いて、本明細書において開示するDR6アンタゴニスト、例えばDR6を結合する一又は複数の抗体(例えば3F4.4.8、4B6.9.7又は1E5.5.7モノクローナル抗体)、および/またはAPPを結合するDR6の一又は複数の可溶型(例えば、配列番号:1のアミノ酸1−354を含むもの)、および/またはAPPを結合する一又は複数の抗体(例えば22C11モノクローナル抗体)、並びに互いに組み合わせた及び/又は当分野で公知の他の治療薬と組み合わせたこれら薬剤の効果を調べることができる。
本明細書において開示するDR6アンタゴニストの一又は複数を実験的に試験するための例示的なプロトコールでは、動物モデルの中から多くの月齢及び性別が一致する動物(例えば6か月齢の雌APP/RKトランスジェニックマウス)を、複数の試験及び/又はコントロール群の一つに割り当ててもよい。次いで、これらの動物の第一実験群に、特定の投与プロトコール(例えば、各注入につき20mg/kg体重のDR6アンタゴニスト抗体を2週間ごとに6か月間腹腔内注入)に従って、選択されたDR6アンタゴニストを投与してもよい。他の実験群の条件は、標準的な方法に従って変更することができる。例えば、異なる用量のDR6アンタゴニストを投与(例えば1、5、10、15mg/kg体重)、異なる計画のDR6アンタゴニストを投与(例えば、毎週、12か月間注入)、異なるDR6アンタゴニストを投与(例えば、DR6イムノアドヘシン)、薬剤を組み合わせて使用(例えば、コリンエステラーゼインヒビターと組み合わせたDR6アンタゴニスト)、異なる投与経路を使用(例えば静脈内投与)など。一又は複数の動物群を、コントロールとして、例えばDR6アンタゴニストを摂取する実験群と同じ投与クールに従って、滅菌リン酸緩衝生理食塩水を摂取する群としてもよい。
その後、DR6アンタゴニストを摂取した後のいくつかの時点で、これら試験動物群と一致するコントロール動物群を比較して、例えばインビボでのDR6アンタゴニストの効果を調べる、及び/又は特徴付けることができる。例えば、これらの試験動物群及びコントロール動物群の特定の組織又は器官(例えば脳)からの神経細胞を含む試料を、これらの群の神経細胞の状態を比較するために、磁気共鳴電子顕微鏡法および/または免疫組織化学分析のような技術によって評価することができる(例としてPetrik et al., Neuromolecular Med. 9(3): 216-29 (2007)を参照)。あるいは、これらの群から得た試料は、神経突起軌道の変更、樹状突起棘消失又は樹状突起の細線化のような現象を示すために、多光子電子顕微鏡法のような技術によって評価されてもよい(例としてTsai et al., Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004):及びSpires et al., J. Neurosci. 25, 7278-7287 (2005)を参照)。あるいは、これらの群から採取した血液又は他の組織試料は、炎症及び/又はアポトーシスのマーカー、例えば、IL−1β、TNF−α、IL−10、p53タンパク質、インターフェロン−γ又はNF−κBのレベルを測定するように設計されたELISAプロトコールに用いることができる(例としてRakover et al., Neurodegener. Dis. 4(5): 392-402 (2007);及びMogi et al., Neurosci Lett. 414(1): 94-7 (2007)を参照)。あるいは、試験群及び対応するコントロール群の動物を、当分野で公知の行動試験パラダイム、例えばモーリス水迷路又はオブジェクト認識試験において比較することができる(例としてHsiao et al., Science 274, 99-102 (1996);Janus et al., Nature 408, 979-982 (2000);Morgan et al., Nature 408, 982-985 (2000);及びEnnaceur et al., Behav. Brain Res. 1988; 31:47-59を参照)。試験動物群及び対応するコントロール動物群の比較の結果から、当業者は、動物モデルにおけるDR6アンタゴニストの効果を試験することができるであろう。
実施例1−13、ここに含まれるデータおよびこのデータの関連する特徴は、DR6アンタゴニストが例えばインビボで神経細胞のアポトーシスを阻害するということを証明するものである。特に、上の実施例1−13は、(1) DR6は多種多様な神経細胞のアポトーシスを誘導する、(2) APPはDR6を結合するDR6の同族リガンドであり、DR6が媒介するアポトーシスを誘発する、そして(3) インビトロのDR6/APP結合相互作用を阻害するDR6アンタゴニストは結果として、インビトロでDR6が媒介するアポトーシスを阻害する、ということを教示する。出願人の所見および開示により、一当業者は、DR6アンタゴニストがインビボでDR6が媒介するアポトーシスを阻害すると合理的に予測できるであろう。したがって、当業者は、上記のような動物モデル及び、これら動物モデルに観察される様々な病理学的プロセスを調べるための関連技術によって、本明細書に記載のように、DR6アンタゴニストの生物活性を確認することができると合理的に予測できるであろう。
本明細書において開示するDR6アンタゴニストの一又は複数を実験的に試験するための例示的なプロトコールでは、動物モデルの中から多くの月齢及び性別が一致する動物(例えば6か月齢の雌APP/RKトランスジェニックマウス)を、複数の試験及び/又はコントロール群の一つに割り当ててもよい。次いで、これらの動物の第一実験群に、特定の投与プロトコール(例えば、各注入につき20mg/kg体重のDR6アンタゴニスト抗体を2週間ごとに6か月間腹腔内注入)に従って、選択されたDR6アンタゴニストを投与してもよい。他の実験群の条件は、標準的な方法に従って変更することができる。例えば、異なる用量のDR6アンタゴニストを投与(例えば1、5、10、15mg/kg体重)、異なる計画のDR6アンタゴニストを投与(例えば、毎週、12か月間注入)、異なるDR6アンタゴニストを投与(例えば、DR6イムノアドヘシン)、薬剤を組み合わせて使用(例えば、コリンエステラーゼインヒビターと組み合わせたDR6アンタゴニスト)、異なる投与経路を使用(例えば静脈内投与)など。一又は複数の動物群を、コントロールとして、例えばDR6アンタゴニストを摂取する実験群と同じ投与クールに従って、滅菌リン酸緩衝生理食塩水を摂取する群としてもよい。
その後、DR6アンタゴニストを摂取した後のいくつかの時点で、これら試験動物群と一致するコントロール動物群を比較して、例えばインビボでのDR6アンタゴニストの効果を調べる、及び/又は特徴付けることができる。例えば、これらの試験動物群及びコントロール動物群の特定の組織又は器官(例えば脳)からの神経細胞を含む試料を、これらの群の神経細胞の状態を比較するために、磁気共鳴電子顕微鏡法および/または免疫組織化学分析のような技術によって評価することができる(例としてPetrik et al., Neuromolecular Med. 9(3): 216-29 (2007)を参照)。あるいは、これらの群から得た試料は、神経突起軌道の変更、樹状突起棘消失又は樹状突起の細線化のような現象を示すために、多光子電子顕微鏡法のような技術によって評価されてもよい(例としてTsai et al., Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004):及びSpires et al., J. Neurosci. 25, 7278-7287 (2005)を参照)。あるいは、これらの群から採取した血液又は他の組織試料は、炎症及び/又はアポトーシスのマーカー、例えば、IL−1β、TNF−α、IL−10、p53タンパク質、インターフェロン−γ又はNF−κBのレベルを測定するように設計されたELISAプロトコールに用いることができる(例としてRakover et al., Neurodegener. Dis. 4(5): 392-402 (2007);及びMogi et al., Neurosci Lett. 414(1): 94-7 (2007)を参照)。あるいは、試験群及び対応するコントロール群の動物を、当分野で公知の行動試験パラダイム、例えばモーリス水迷路又はオブジェクト認識試験において比較することができる(例としてHsiao et al., Science 274, 99-102 (1996);Janus et al., Nature 408, 979-982 (2000);Morgan et al., Nature 408, 982-985 (2000);及びEnnaceur et al., Behav. Brain Res. 1988; 31:47-59を参照)。試験動物群及び対応するコントロール動物群の比較の結果から、当業者は、動物モデルにおけるDR6アンタゴニストの効果を試験することができるであろう。
実施例1−13、ここに含まれるデータおよびこのデータの関連する特徴は、DR6アンタゴニストが例えばインビボで神経細胞のアポトーシスを阻害するということを証明するものである。特に、上の実施例1−13は、(1) DR6は多種多様な神経細胞のアポトーシスを誘導する、(2) APPはDR6を結合するDR6の同族リガンドであり、DR6が媒介するアポトーシスを誘発する、そして(3) インビトロのDR6/APP結合相互作用を阻害するDR6アンタゴニストは結果として、インビトロでDR6が媒介するアポトーシスを阻害する、ということを教示する。出願人の所見および開示により、一当業者は、DR6アンタゴニストがインビボでDR6が媒介するアポトーシスを阻害すると合理的に予測できるであろう。したがって、当業者は、上記のような動物モデル及び、これら動物モデルに観察される様々な病理学的プロセスを調べるための関連技術によって、本明細書に記載のように、DR6アンタゴニストの生物活性を確認することができると合理的に予測できるであろう。
実施例15:脊髄性筋萎縮症の動物モデルにおけるRA.1(「1E5.5.7」)、RA.2、RA.3(「3F4.4.8」) 及びRA.4抗体処置
脊髄性筋萎縮症(SMA)は、脊髄の前角にある運動ニューロンに作用する劣性の運動ニューロン疾患であって、SMN(生存運動ニューロン)タンパク質の減少から生じると考えられている。SMAの動物モデルは、系統名称:FVB.Cg-Tg(SMN2*delta7)4299Ahmb Tg(SMN2)89Ahmb Smn1tm1Msd/J(JAX5025)を有するトランスジェニックマウス系統である(例としてLe et al., Human Molecular Genetics 14(6): 845-857 (2005)を参照)。この3重変異型マウスは、2つのトランスジェニック対立遺伝子と単一の標的変異体を有している。Tg(SMN2*delta7)4299Ahmb対立遺伝子はエキソン7を欠いているSMA cDNAからなるのに対して、Tg(SMN2)89Ahmb対立遺伝子はヒトSMN2遺伝子全長からなる。下記の記載では、この系統もまた、デルタ7 SMA KO モデルと称する。
標的とする変異型Smn対立遺伝子のホモ接合体および2つのトランスジェニック対立遺伝子のホモ接合体であるマウスは、近位の脊髄性筋萎縮症(SMA)に罹患している患者に類似する症状および神経病理学を表す。3重の変異体は、出生時、正常な同腹仔より顕著に小さい。5日までに、筋力低下の徴候が現れ、週を経るにつれ次第に顕著になり、マウスは異常歩行、後四肢の震えおよび転倒傾向を表す。平均生存率はおよそ13日である。3重の変異型マウスはさらに、触覚刺激に対する反応は障害されていないが、表面立ち直り、負の走地性および断崖回避に対する反応が障害されていることを表す。自発運動活性および握力もまた、これらのマウスにおいて有意に障害されている(例としてButchbach et al., Neurobiol Dis. 27(2): 207-19 (2007)を参照)。以下のプロトコールは、DR6アンタゴニスト抗体などの特定の抗体の効果、及びデルタ7SMAモデルマウス(KO)の生存率、体重及び緊張力に対する用量を決定するために設定される。
上記したように、この研究において使用したマウスは、デルタ-7 SMA(JA×5025) KOモデル(smn−/−;SMN2+/+;d7+/+)であってもよい。出生時に、同腹仔を、例えば雄と雌を等数に分けるなどによってランダムに10匹(又は他の数)に選別してもよい。このプロトコールに次いで、同腹仔を、第一投薬(P3)の時間までに8匹のマウスに選別してもよい。6匹未満のいずれかの同腹仔を試験から除いてもよい。月曜日から水曜日に生まれる同腹仔のマウスの尾部を出生時(P0)に切断してもよい。当分野で公知の様々な方法によって、例えば、Transnetyx社などの分子診断会社から市販されている、トランスジェニック、ノックアウトおよびノックイン突然変異について生検において自動化した遺伝子タイピングサービススクリーニングを用いて、遺伝子タイピングがなされてもよい。このような遺伝子型データは一般的に出生後の48時間以内に利用可能である。
例えば月曜日−水曜日に生まれるマウスを例示する実験に用いてもよい。マウスは、P3にIP投薬を始めてもよい。試験における代表的な数は以下の通りである。(1) 滅菌PBSなどのベヒクルによる、例えば平均して、10匹のKO(雄5、雌5)、(2) 20mg/kgを含む第一用量のそれぞれの抗体による、例えば平均して、10匹のKO(雄5、雌5)、そして、(3) 5mg/kgを含む第二用量のそれぞれのDR6抗体による、例えば平均して、10匹のKO(雄5、雌5)。各々の動物に、RA.1、RA.2、RA.3およびRA.4抗体をそれぞれ週2回IP投与してもよい。「RA.1抗体」は「1E5.5.7」に対応し、「RA.3抗体」は「3F4.4.8」に対応する。「RA.2抗体」は「4B6.9.7」に対応し、「RA.4抗体」は「2C7.3.7」(Genentech, Inc.、DR6に結合するが機能をブロックするものではない抗体)に対応する。「RA.5抗体」は「3B11.7.7」(Genentech, Inc.、DR6に結合するがDR6活性を亢進又は刺激しうる抗体)に対応する。
RA.1、RA.2、RA.3およびRA.4抗体は4℃で保存されてもよい。これらの抗体は、必要に応じて投薬の前に室温に暖められてもよい。PBSのような代表的なベヒクルが使われてもよい。この実施例のRA.1、RA.2、RA.3およびRA.4モノクローナル抗体はヒトDR6ポリペプチド配列を免疫原として用いて生成したが、実施例7に記載の軸索変性及びアポトーシスアッセイなどのプロトコールによって示されるように、これらすべての抗体はヒトだけでなくラットやマウスのDR6と反応する。
ある例示的な実施態様では、評価したDR6アンタゴニストは、アンタゴニスト抗体RA.1、RA.2、RA.3およびRA.4であり、抗体当たりの治療群の数は2(1群につき10匹の動物)であってもよく、投与の手段はIPであってもよく、そして、用量範囲は5〜20mg/kgであってもよい。場合によって、群は以下の通りでもよい。(1) RA.1:5mg/kgのIP、(2) RA.1:20mg/kgのIP、(3) RA.2:5mg/kgのIP、(4) RA.2:20mg/kgのIP、(5) RA.3:5mg/kgのIP、(6) RA.3:20mg/kgのIP、(7) RA.4:5mg/kgのIP、(8) RA.4:20mg/kgのIP、そして、(9) ベヒクル(PBS)のIP。このプロトコールでは、マウスを毎日計測してもよい。出生後日数(PND)10、12および14に、同腹仔中の各仔の体重を測定してもよい。PND6、8、10、12、14および16に、試験中の各動物について筋張力評価を行ってもよい。(例として以下に示す例示的な表現型タイピングプロトコールを参照)。
出生時(P0)に、仔の皮下に毒性のないインクを用いて刻印してもよく、遺伝子タイピングのために尾部切断試料を採取する(結果は、通常48時間以内に利用可能である)。試験日(P3)に、新生仔を有する母マウスを毎日同じ時間に実験室に連れて行き、試験を始める前の少なくとも10分の間そっとしておいてもよい。仔は、まず走地性試験、その後チューブ試験(チューブ試験の2つの連続的な実験)を行ってもよい。同腹仔のすべての仔を試験してその後すべての仔を母マウスに戻すまで、仔を温めたパッドに置いてもよい(子犬は、ケージ寝具と混合して扱い後に母マウスによる拒絶を最小限にしてもよい)。生存および体重は出生から離乳まで毎日点検してもよい。新生仔軸体温に対する薬剤の作用は通常、既に行われた慢性MTD試験の間に評価される。体温:特定の月齢時に軸体温を読み取ってもよい。
試験群およびコントロール群のマウスは、Geotaxisを含む試験プロトコールによって、相違について調べられてもよい。走地性は、傾斜した台上に伏臥位に置いて正しい方向に向く動物の能力を試験する。この試験は運動協調性および前庭系を測定する。
事後試験(post-hoc test)として、Mantel−Coxを有するカプラン・マイヤー分析を使用して生存率評価を行ってもよい。
経時的に測定を繰り返したデータを分析するために、Mixed Effects Models(混合ANOVAモデルとしても知られる)を用いてもよい。この手法は、代表的な繰り返し計測ANOVA分析法などの瞬間評価よりむしろ可能性評価に基づいているが、経時的なマウス死亡による値の欠落にも強い。すべてのモデルは、SAS 9.1.3. (SAS Institute, Cary, NC)のPROC MIXED手順を用いて合わせて(fit)もよい。処置はモデルにおいて最も重要な因子である。性別及び日数、並びに処置との相互作用を考慮してもよい。
試験エンドポイントは死であってもよい。
動物は、実施例14、例えば組織学的分析に記載のような方法によって、さらに評価されてもよい。さらに、血清/血液を評価して、RA.1、RA.2、RA.3およびRA.4の血清中濃度を決定してもよい。
脊髄性筋萎縮症(SMA)は、脊髄の前角にある運動ニューロンに作用する劣性の運動ニューロン疾患であって、SMN(生存運動ニューロン)タンパク質の減少から生じると考えられている。SMAの動物モデルは、系統名称:FVB.Cg-Tg(SMN2*delta7)4299Ahmb Tg(SMN2)89Ahmb Smn1tm1Msd/J(JAX5025)を有するトランスジェニックマウス系統である(例としてLe et al., Human Molecular Genetics 14(6): 845-857 (2005)を参照)。この3重変異型マウスは、2つのトランスジェニック対立遺伝子と単一の標的変異体を有している。Tg(SMN2*delta7)4299Ahmb対立遺伝子はエキソン7を欠いているSMA cDNAからなるのに対して、Tg(SMN2)89Ahmb対立遺伝子はヒトSMN2遺伝子全長からなる。下記の記載では、この系統もまた、デルタ7 SMA KO モデルと称する。
標的とする変異型Smn対立遺伝子のホモ接合体および2つのトランスジェニック対立遺伝子のホモ接合体であるマウスは、近位の脊髄性筋萎縮症(SMA)に罹患している患者に類似する症状および神経病理学を表す。3重の変異体は、出生時、正常な同腹仔より顕著に小さい。5日までに、筋力低下の徴候が現れ、週を経るにつれ次第に顕著になり、マウスは異常歩行、後四肢の震えおよび転倒傾向を表す。平均生存率はおよそ13日である。3重の変異型マウスはさらに、触覚刺激に対する反応は障害されていないが、表面立ち直り、負の走地性および断崖回避に対する反応が障害されていることを表す。自発運動活性および握力もまた、これらのマウスにおいて有意に障害されている(例としてButchbach et al., Neurobiol Dis. 27(2): 207-19 (2007)を参照)。以下のプロトコールは、DR6アンタゴニスト抗体などの特定の抗体の効果、及びデルタ7SMAモデルマウス(KO)の生存率、体重及び緊張力に対する用量を決定するために設定される。
上記したように、この研究において使用したマウスは、デルタ-7 SMA(JA×5025) KOモデル(smn−/−;SMN2+/+;d7+/+)であってもよい。出生時に、同腹仔を、例えば雄と雌を等数に分けるなどによってランダムに10匹(又は他の数)に選別してもよい。このプロトコールに次いで、同腹仔を、第一投薬(P3)の時間までに8匹のマウスに選別してもよい。6匹未満のいずれかの同腹仔を試験から除いてもよい。月曜日から水曜日に生まれる同腹仔のマウスの尾部を出生時(P0)に切断してもよい。当分野で公知の様々な方法によって、例えば、Transnetyx社などの分子診断会社から市販されている、トランスジェニック、ノックアウトおよびノックイン突然変異について生検において自動化した遺伝子タイピングサービススクリーニングを用いて、遺伝子タイピングがなされてもよい。このような遺伝子型データは一般的に出生後の48時間以内に利用可能である。
例えば月曜日−水曜日に生まれるマウスを例示する実験に用いてもよい。マウスは、P3にIP投薬を始めてもよい。試験における代表的な数は以下の通りである。(1) 滅菌PBSなどのベヒクルによる、例えば平均して、10匹のKO(雄5、雌5)、(2) 20mg/kgを含む第一用量のそれぞれの抗体による、例えば平均して、10匹のKO(雄5、雌5)、そして、(3) 5mg/kgを含む第二用量のそれぞれのDR6抗体による、例えば平均して、10匹のKO(雄5、雌5)。各々の動物に、RA.1、RA.2、RA.3およびRA.4抗体をそれぞれ週2回IP投与してもよい。「RA.1抗体」は「1E5.5.7」に対応し、「RA.3抗体」は「3F4.4.8」に対応する。「RA.2抗体」は「4B6.9.7」に対応し、「RA.4抗体」は「2C7.3.7」(Genentech, Inc.、DR6に結合するが機能をブロックするものではない抗体)に対応する。「RA.5抗体」は「3B11.7.7」(Genentech, Inc.、DR6に結合するがDR6活性を亢進又は刺激しうる抗体)に対応する。
RA.1、RA.2、RA.3およびRA.4抗体は4℃で保存されてもよい。これらの抗体は、必要に応じて投薬の前に室温に暖められてもよい。PBSのような代表的なベヒクルが使われてもよい。この実施例のRA.1、RA.2、RA.3およびRA.4モノクローナル抗体はヒトDR6ポリペプチド配列を免疫原として用いて生成したが、実施例7に記載の軸索変性及びアポトーシスアッセイなどのプロトコールによって示されるように、これらすべての抗体はヒトだけでなくラットやマウスのDR6と反応する。
ある例示的な実施態様では、評価したDR6アンタゴニストは、アンタゴニスト抗体RA.1、RA.2、RA.3およびRA.4であり、抗体当たりの治療群の数は2(1群につき10匹の動物)であってもよく、投与の手段はIPであってもよく、そして、用量範囲は5〜20mg/kgであってもよい。場合によって、群は以下の通りでもよい。(1) RA.1:5mg/kgのIP、(2) RA.1:20mg/kgのIP、(3) RA.2:5mg/kgのIP、(4) RA.2:20mg/kgのIP、(5) RA.3:5mg/kgのIP、(6) RA.3:20mg/kgのIP、(7) RA.4:5mg/kgのIP、(8) RA.4:20mg/kgのIP、そして、(9) ベヒクル(PBS)のIP。このプロトコールでは、マウスを毎日計測してもよい。出生後日数(PND)10、12および14に、同腹仔中の各仔の体重を測定してもよい。PND6、8、10、12、14および16に、試験中の各動物について筋張力評価を行ってもよい。(例として以下に示す例示的な表現型タイピングプロトコールを参照)。
出生時(P0)に、仔の皮下に毒性のないインクを用いて刻印してもよく、遺伝子タイピングのために尾部切断試料を採取する(結果は、通常48時間以内に利用可能である)。試験日(P3)に、新生仔を有する母マウスを毎日同じ時間に実験室に連れて行き、試験を始める前の少なくとも10分の間そっとしておいてもよい。仔は、まず走地性試験、その後チューブ試験(チューブ試験の2つの連続的な実験)を行ってもよい。同腹仔のすべての仔を試験してその後すべての仔を母マウスに戻すまで、仔を温めたパッドに置いてもよい(子犬は、ケージ寝具と混合して扱い後に母マウスによる拒絶を最小限にしてもよい)。生存および体重は出生から離乳まで毎日点検してもよい。新生仔軸体温に対する薬剤の作用は通常、既に行われた慢性MTD試験の間に評価される。体温:特定の月齢時に軸体温を読み取ってもよい。
試験群およびコントロール群のマウスは、Geotaxisを含む試験プロトコールによって、相違について調べられてもよい。走地性は、傾斜した台上に伏臥位に置いて正しい方向に向く動物の能力を試験する。この試験は運動協調性および前庭系を測定する。
事後試験(post-hoc test)として、Mantel−Coxを有するカプラン・マイヤー分析を使用して生存率評価を行ってもよい。
経時的に測定を繰り返したデータを分析するために、Mixed Effects Models(混合ANOVAモデルとしても知られる)を用いてもよい。この手法は、代表的な繰り返し計測ANOVA分析法などの瞬間評価よりむしろ可能性評価に基づいているが、経時的なマウス死亡による値の欠落にも強い。すべてのモデルは、SAS 9.1.3. (SAS Institute, Cary, NC)のPROC MIXED手順を用いて合わせて(fit)もよい。処置はモデルにおいて最も重要な因子である。性別及び日数、並びに処置との相互作用を考慮してもよい。
試験エンドポイントは死であってもよい。
動物は、実施例14、例えば組織学的分析に記載のような方法によって、さらに評価されてもよい。さらに、血清/血液を評価して、RA.1、RA.2、RA.3およびRA.4の血清中濃度を決定してもよい。
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA(ATCC)に寄託した:
材料 ATCC寄託番号 寄託日
3D11.D7 PTA−4624 2002年9月4日
11C2.C10 PTA−4628 2002年9月4日
9C10.F5 PTA−4626 2002年9月4日
5D4.F6 PTA−4625 2002年9月4日
9C11.C7 PTA−4627 2002年9月4日
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA(ATCC)に寄託した:
材料 ATCC寄託番号 寄託日
3D11.D7 PTA−4624 2002年9月4日
11C2.C10 PTA−4628 2002年9月4日
9C10.F5 PTA−4626 2002年9月4日
5D4.F6 PTA−4625 2002年9月4日
9C11.C7 PTA−4627 2002年9月4日
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から30年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテック社とATCCとの間の合意に従い、ATCCから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第122条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886 OG 638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許商標庁長官が決定した者に後代を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものに即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による開示は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。ここに例示した実施例により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、請求の範囲内に入るものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものに即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による開示は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。ここに例示した実施例により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、請求の範囲内に入るものである。
Claims (65)
- アミロイド前駆体タンパク質(APP)に対するデスレセプター6(DR6)の結合が阻害される条件下で、DR6ポリペプチド及び/又はAPPポリペプチドを一又は複数のDR6アンタゴニストに曝すことを含む、APPに対するDR6の結合を阻害する方法。
- 前記一又は複数のDR6アンタゴニストが、DR6を結合する抗体、配列番号:1のアミノ酸1−354を含む可溶性DR6ポリペプチド及び、APPを結合する抗体から選択される、請求項1に記載の方法。
- 可溶性DR6ポリペプチドがDR6イムノアドヘシンを含む、請求項2に記載の方法。
- 可溶性DR6ポリペプチドが、イムノアドヘシンのFc領域に融合したDR6細胞外ドメイン配列を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記のDR6を結合する抗体が、図1(配列番号:1)のアミノ酸1−349又は42−349を含むDR6ポリペプチドを結合する、請求項2に記載の方法。
- 前記のDR6を結合する抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項2に記載の方法。
- 前記のDR6を結合する抗体が、ATCCに受託番号PTA−8095、PTA−8094、又はPTA−8096としてそれぞれ寄託されているハイブリドーマによって産生される3F4.4.8、4B6.9.7、又は1E5.5.7モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する、請求項2に記載の方法。
- 前記のDR6又は可溶性DR6ポリペプチドを結合する抗体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレンからなる群より選択される一又は複数の非タンパク質性ポリマーに連結されている、請求項2に記載の方法。
- 前記のAPPを結合する抗体がモノクローナル抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記のAPPを結合するモノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項9に記載の方法。
- 前記のAPPを結合するモノクローナル抗体が、3F4.4.8、4B6.9.7、又は1E5.5.7抗体の結合を競合的に阻害する、請求項9に記載の方法。
- 前記のAPPを結合する抗体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレンからなる群より選択される一又は複数の非タンパク質性ポリマーに連結されている、請求項9に記載の方法。
- 前記DR6ポリペプチドが一又は複数の哺乳類細胞の細胞表面上で発現され、前記の一又は複数のDR6アンタゴニストの結合がDR6の活性化ないしはシグナル伝達を阻害する、請求項1に記載の方法。
- DR6を発現する一又は複数の哺乳類細胞のアポトーシスを阻害するためにインビトロで行われる、請求項13に記載の方法。
- DR6を発現する一又は複数の哺乳類細胞のアポトーシスを阻害するためにインビボで行われる、請求項13に記載の方法。
- 細胞表面上に発現されるDR6ポリペプチドを有する一又は複数の哺乳類細胞の少なくとも一が、交連神経細胞、感覚神経細胞又は運動神経細胞である、請求項13に記載の方法。
- 神経学的状態又は障害を有する哺乳動物においてインビボで行われる、請求項13に記載の方法。
- 神経学的状態又は障害が、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病又はアルツハイマー病である、請求項17に記載の方法。
- 神経学的状態又は障害が、脳卒中による神経細胞又は組織の損傷、大脳又は脊髄組織に対する外傷又は神経系組織の病変を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記の一又は複数のDR6アンタゴニストの少なくとも一が、配列番号:6のアミノ酸66−81を含むAPPポリペプチドに対するDR6の結合を阻害する、請求項1に記載の方法。
- 前記の一又は複数のDR6アンタゴニストの少なくとも一が、配列番号:1のアミノ酸1−655を含むDR6ポリペプチドに対するAPPの結合を阻害する、請求項1に記載の方法。
- 神経学的状態又は障害を有する哺乳動物の治療方法であって、一又は複数のDR6アンタゴニストの有効量を該哺乳動物に投与することを含む方法。
- 前記の一又は複数のDR6アンタゴニストが、DR6を結合する抗体、配列番号:1のアミノ酸1−354を含む可溶性DR6ポリペプチド、及びAPPを結合する抗体から選択される、請求項22に記載の方法。
- 可溶性DR6ポリペプチドがDR6イムノアドヘシンを含む、請求項23に記載の方法。
- 可溶性DR6ポリペプチドが、イムノアドヘシンのFc領域に融合したDR6細胞外ドメイン配列を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記のDR6を結合する抗体が、図1(配列番号:1)のアミノ酸1−349又は42−349を含むDR6ポリペプチドを結合する、請求項23に記載の方法。
- 前記のDR6を結合する抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項23に記載の方法。
- 前記のDR6を結合する抗体が、ATCCに受託番号PTA−8095、PTA−8094、又はPTA−8096としてそれぞれ寄託されているハイブリドーマによって産生される3F4.4.8、4B6.9.7、又は1E5.5.7モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する、請求項23に記載の方法。
- DR6又は可溶性DR6ポリペプチドを結合する抗体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレンからなる群より選択される一又は複数の非タンパク質性ポリマーに連結されている、請求項23に記載の方法。
- 前記のAPPを結合する抗体がモノクローナル抗体である、請求項22に記載の方法。
- 前記のAPPを結合するモノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項30に記載の方法。
- 前記のAPPを結合するモノクローナル抗体が、モノクローナル抗体22C11の結合を競合的に阻害する、請求項30に記載の方法。
- 前記のAPPを結合するモノクローナル抗体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレンからなる群より選択される一又は複数の非タンパク質性ポリマーに連結されている、請求項30に記載の方法。
- 前記の一又は複数のDR6アンタゴニストの少なくとも一が、配列番号:6のアミノ酸66−81を含むAPPポリペプチドに対するDR6の結合を阻害する、請求項22に記載の方法。
- 前記の一又は複数のDR6アンタゴニストの少なくとも一が、配列番号:1のアミノ酸1−655を含むDR6ポリペプチドに対するAPPの結合を阻害する、請求項22に記載の方法。
- 神経学的状態又は障害が、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病又はアルツハイマー病である、請求項22に記載の方法。
- 神経学的状態又は障害が、脳卒中による神経細胞又は組織の損傷、大脳又は脊髄組織に対する外傷又は神経系組織の病変を含む、請求項22に記載の方法。
- 一又は複数の更なる治療剤が前記哺乳動物に投与される、請求項22に記載の方法。
- 一又は複数のDR6アンタゴニストが注射、注入又は灌流により哺乳動物に投与される、請求項22に記載の方法。
- 前記の一又は複数の更なる治療剤が、NGF、アポトーシスインヒビター、EGFRインヒビター、β-分泌酵素インヒビター、γ-分泌酵素インヒビター、コリンエステラーゼインヒビター、抗Aβ抗体、及びNMDAレセプターアンタゴニストから選択される、請求項38に記載の方法。
- APPに対するDR6の結合を阻害する対象分子を同定する方法であって、
対象分子の存在下又は不在下においてDR6とAPPとを組み合わせた後、該対象分子の存在下におけるAPPに対するDR6の結合の阻害を検出することを含む方法である。 - 対象分子が、APPを結合する抗体、DR6又は配列番号:1のアミノ酸1−354を含む可溶性DR6ポリペプチドを結合する抗体である、請求項41に記載の方法。
- 対象分子の存在下でAPPに対するDR6の結合の阻害を検出することが、無細胞アッセイにおいて行われる、請求項41に記載の方法。
- さらに、細胞表面上にDR6を発現する哺乳類細胞を用いて前記方法を行い、DR6の活性化又はシグナル伝達の阻害を検出することを含む、請求項41に記載の方法。
- 請求項40に記載の方法に従って同定された対象分子を含む組成物。
- 担体を含む、請求項45に記載の組成物。
- 担体が薬学的に許容される担体である、請求項46に記載の組成物。
- DR6に対するAPPの結合を阻害する、(a) 配列番号:1を含むDR6ポリペプチドを結合するモノクローナル抗体、又は(b) 可溶性DR6ポリペプチド、又は(c) 配列番号:6を含むAPPを結合するモノクローナル抗体を含む、単離されたDR6アンタゴニスト。
- 可溶性DR6ポリペプチドがDR6イムノアドヘシンを含む、請求項48に記載の単離されたDR6アンタゴニスト。
- 可溶性DR6ポリペプチドが、イムノアドヘシンのFc領域に融合したDR6細胞外ドメイン配列を含む、請求項49に記載の単離されたDR6アンタゴニスト。
- 前記のDR6を結合する抗体が、図1(配列番号:1)のアミノ酸1−349又は42−349を含むDR6ポリペプチドを結合する、請求項48に記載の単離されたDR6アンタゴニスト。
- 前記のDR6を結合する抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項48に記載の単離されたDR6アンタゴニスト。
- 前記のDR6を結合する抗体が、ATCCに受託番号PTA−8095、PTA−8094、又はPTA−8096としてそれぞれ寄託されているハイブリドーマによって産生される3F4.4.8、4B6.9.7、又は1E5.5.7モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する、請求項48に記載の単離されたDR6アンタゴニスト。
- 前記のDR6又は可溶性DR6ポリペプチドを結合する抗体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレンからなる群より選択される一又は複数の非タンパク質性ポリマーに連結されている、請求項48に記載の単離されたDR6アンタゴニスト。
- 前記DR6アンタゴニストが、配列番号:6のアミノ酸66−81を含むAPPポリペプチドに対するDR6の結合を阻害する、請求項48に記載の単離されたDR6アンタゴニスト。
- アンタゴニストが、立体的な阻害によってAPPに対するDR6の結合を阻害するエピトープを結合する、請求項48に記載の単離されたDR6アンタゴニスト。
- 前記のAPPを結合するモノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項48に記載の単離されたDR6アンタゴニスト。
- 前記のAPPを結合する抗体が、22C11モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する、請求項48に記載の単離されたDR6アンタゴニスト。
- 前記のAPPを結合する抗体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレンからなる群より選択される一又は複数の非タンパク質性ポリマーに連結されている、請求項48に記載の単離されたDR6アンタゴニスト。
- 前記アンタゴニストが、配列番号:6のアミノ酸66−81を含むAPPポリペプチドに対するDR6の結合を阻害する、請求項48に記載の単離されたDR6アンタゴニスト。
- 請求項47−60に記載のDR6アンタゴニストと薬学的に許容可能な担体とを含有してなる薬剤組成物。
- 神経学的障害を有する患者又は神経学的障害に罹りやすい患者の診断方法であって、患者から試料を採取し、配列番号:1のDR6ポリペプチド配列とは異なるポリペプチド配列を有するDR6ポリペプチド変異体の存在について試料を試験することを含む方法。
- さらに、前記ポリペプチド変異体が配列番号:1のDR6ポリペプチド配列に対して観察される親和性とは異なるAPPポリペプチドに対する親和性を有すると同定することを含む、請求項62に記載の方法。
- (a) 請求項47−60に記載のDR6アンタゴニストの有効量を含有する組成物と、
(b) 該組成物を含む容器と、
(c) 神経学的状態又は障害の治療においての該DR6アンタゴニストの使用についての指示を示す、該容器に貼付されるラベル、又は該容器内に収容されるパッケージ挿入物
とを具備する製造品。 - 第一の容器と、該容器上のラベルと、該容器内に収容される組成物と、
薬学的に許容可能なバッファを具備する第二の容器と、少なくとも一種類の哺乳類の神経細胞のアポトーシスを阻害するためにDR6アンタゴニストを使用するための指示、
とを具備するキットであり、
このとき、該組成物が少なくとも一種類の哺乳類の神経細胞のアポトーシスを阻害するために有効な活性剤を含有するものであり、該容器上のラベル、又は該容器内に収容されるパッケージ挿入物が、該組成物が少なくとも一種類の哺乳類の神経細胞のアポトーシスを阻害するために用いられうるということを示しており、該組成物中の活性剤が請求項47−60に記載の少なくとも一のDR6アンタゴニストを含むものである、キット。
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121225 |
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A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130528 |