BRPI0719459A2 - "métodos para inibir a ligação do receptor de morte 6 (dr6) à proteína precursora amilóide (app), para o tratamento, para identificação de uma molécula de interesse que inibe a ligação do dr6 à app, para diagnosticar um paciente com, antagonista dr6 isolado, composição farmacêutica, artigo manufaturado e kit" - Google Patents

"métodos para inibir a ligação do receptor de morte 6 (dr6) à proteína precursora amilóide (app), para o tratamento, para identificação de uma molécula de interesse que inibe a ligação do dr6 à app, para diagnosticar um paciente com, antagonista dr6 isolado, composição farmacêutica, artigo manufaturado e kit" Download PDF

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Description

“MÉTODOS PARA INIBIR A LIGAÇÃO DO RECEPTOR DE MORTE 6 (DR6) À PROTEÍNA PRECÚRSORA AMILÓIDE (APP), PARA O TRATAMENTO, PARA IDENTIFICAÇÃO DE UMA MOLÉCULA DE INTERESSE QUE INIBE A LIGAÇÃO DO DR6 À APP, PARA DIAGNOSTICAR UM PACIENTE COM DISTÚRBIO NEUROLÓGICO OU SUSCETÍVEL A UM DISTÚRBIO
NEUROLÓGICO, COMPOSIÇÃO, ANTAGONISTA DR6 ISOLADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, ARTIGO MANUFATURADO E KIT” Referências Cruzadas Para Os Pedidos Relacionados Este pedido é um pedido não provisório depositado sob 37 CFR 1.53(b)(1), que reivindica a prioridade com base no 35 USC 119(e) para o pedido provisório n° 60/871.528 , depositado em 22 de Dezembro de 2006, e pedido provisório n° 60/900.848, depositado em 12 de Fevereiro de 2007, cujo conteúdo dos quais são integralmente incorporados ao presente pela referência.
Campo Da Invenção
A presente invenção refere-se de forma geral aos métodos de tratamento de distúrbios neurológicos utilizando antagonistas DR6 que, por exemplo, inibem a interação entre DR6 e seu Iigante cognato, APP, e a composições de antagonista de DR6 úteis em tais métodos. Em realizações 20 opcionais, antagonistas de DR6, tais como anticorpos para receptores de DR6, receptores DR6 variantes, imunoadesinas para receptores de DR6 ou anticorpos APP são uàados para tratar distúrbios neurológicos, incluindo o tratamento para a doença de Alzheimer.
Antecedentes Da Invenção Vários Iigantes e receptores que pertencem à superfamília do
fator de necrose tumoral (TNF) foram identificados no estado da técnica. Incluindo entre tais Iigantes está o fator de necrose tumoral- alfa ("TNF-alfa"), fator de necrose tumoral- beta ("TNF-beta" ou Iimfotoxina-alfa"), Iimfotoxina- beta ("LT-beta"), CD30 ligante, CD27 ligante, CD40 Iigante1 OX-40 ligante, 4- 1BB ligante, LIGHT, Apo-1 ligante (também referido como Fas ligante ou CD95 ligante), Apo-2 ligante (também referido como Apo2L ou TRAIL), Apo-3 ligante (também referido como TWEAK), APRIL1 OPG ligante (também referido como 5 RANK ligante, ODF, ou TRANCE), e TALL-1 (também referido como BIyS, BAFF ou THANK) (vide, por exemplo, Ashkenazi1 Nature Review, 2:420-430 (2002); Ashkenazi e Dixit1 Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi e Dixit1 Curr. Opin. CeIIBioI., 11:255-260 (2000); Golstein1 Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallac/?, Cytokine Rèference, Academic Press, 2000, páginas 377-411; 10 Locksley et ai, Cell, 104:487-501 (2001); Gruss e Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Sehmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al. Nature, 357:80-82 (1992); WO 97/01633 publicado em 15 16 de janeiro de 1997; WO 97/25428 publicado em 17 de julho de 1997; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); W098/28426 publicado em 2 de julho de 1998; W098/46751 publicado em 22 de outibro de 1998; WO/98/18921 publicado em 7 de maio de 1998; Moore et 20 al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)).
A indução de várias respostas celulares mediadas pelas citocinas da família do TNF é tipicamente iniciada por sua ligação aos receptores 25 específicos da célula.' Incluídos entre os membros da superfamília do receptor de TNF identificados até o momento estão TNFR1, TNFR2, p75-NGFR, TACI1 GITR11 CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (também referido como Apo-1 ou CD95), DR4 (também referido como TRAIL-R1), DR5 (também referido como Apo-2 ou TRAIL-R2), DR6 (também referido como TR9, também conhecido na literatura como membro 21 da superfamília do TNF ou TNFRSF21, DcR1, DcR2, osteoprotegerina (OPG), RANK e Apo-3 (também referido como DR3 ou TRAMP) (vide, por exemplo, Ashkenazi, Nature 5 Reviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi e Dixit1 Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi e Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein1 Curr. Biol., 7:750-753 (1997); Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, páginas 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss e Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 10 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); EP 417,563, publicado em’ 20 de março de 1991; Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361 (1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., MoL Cell. Biol., 77:3020-3026 (1991); Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403- 15 1410 (1989); Mallett et al., EMBO J., 9:1063-1068 (1990); Anderson et al., Nature, 390:175-179 (1997); Chicheportiche et al., J. Biol. Chem., 272:32401- 32410 (1997); Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Pan et al., Science, 277:815-818 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); Degli- Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); Marsters et al., Curr. Biol., 20 7:1003-1006 (1997); tsuda et al., BBRC, 234:137-142 (1997); Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997); vonBulow et al., Science, 278:138- 141 (1997), Johnson et al., Cell, 47:545-554 (1986); Radeke et al., Nature, 325:593-597 (1987); Pan et al., FEBS Lett., 431:351-356 (1998)).
A maioria destes membros da família do receptor de TNF compartilha a estrutura típica dos receptores de superfície celular incluindo as região extracelular, região transmembrana e região intracelular, enquanto outros são encontrados naturalmente como proteínas solúveis sem os domínios transmembrana e intracelular. A porção extracelular de TNFRs típicos contém uma seqüência repetitiva padrão de aminoácidos dos domínios ricos em cisteína (CDRs)1 partindo do NH2-terminal.
Para revisões da família de Iigantes e receptores do TNF em geral, vide, por exemplo, Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, 5 páginas 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Ware, Cytokine & Growth Factor Reviews, 14:181-184 (2003), Liu et al., Immunity, 15 (1) :23-34 (2001) e Bossen et al. J Biol Chem. 281 (20) :13964-71 (2006).
O membro da famíla TNFR denominado de receptor DR6 (também referido na literatura como "TR9", também conhecido na literatura como membro 21 da superfamília dos receptores de TNF ou TNFRSF21) foi descrito como um receptor transmembrana tipo I com quatro motivos ricos em cisteína extracelulares e uma estrutura domínio de morte citoplasmática (Pan et al., FEBS Lett., 431:351-356 (1998); vide também as Patentes US 6.358.508, US 6.667.390, US 6.919.078, US 6.949.358). Tem sido relatado que a superexpressão de DR6 em certas linhagens de células transfectadas resulta na apoptose e ativação de ambos NF-kB e JNK (Pan et al., FEBS Letters, 431:351-356 (1998)). Em um modelo de camundongo deficiente de DR6, as células T estavam substancialmente diminuídas na ativação de JNK, e quando camundongos DR6 (-/-) foram desafiados com proteínas antígenas, suas células T foram’encontrados por se hiperproliferarem e exibiram uma profunda polarização para uma resposta do tipo Th2 (ao passo que a diferenciação Th1 não foi afetada equivalentemente) (Zhao et al., J. Exp. Med., 194:1441-1448 (2001)). Além disso, foiVelatado que a interrupção direcionada de DR6 resultou em uma melhor diferenciação para o tipo T heíperl (Th2) in vitro (Zhao et al., Supra). Várias utilizações do agonistas ou antagonistas DR6 na modulação de condições mediadas por células B foram descritas na US 2005/0069540 publicada em 31 de março de 2005.
O receptor DR6 pode desempenhar um papel na regulação da inflamação das vias aéfôas em um modelo de asma em camundongos induzida por OVA (Venkataraman etal. Immunol. Lett., 106:42-47 (2006)).
Utilizando um modelo de encefalomielite auto-imune experimental induzido por glicoproteína da mielina do oligodendrócito (MOG (35-55)), camundongos DR6 -/- demonstraram ser altamente resistentes, tanto ao início quanto na progressão da doença CNS em comparação com as crias normais do tipo selvagem (WT).
Assim, o DR6 pode estar envolvido na regulação da infiltração leucocitária e função na indução e progressão da encefalomielite experimental autoimune (Schmidt etal., J. Immunol., 175:2286-2292 (2005)).
Embora vários membros da família de Iigantes e receptores do TNF foram identificados como tendo diversas atividades biológicas e propriedades, poucos desses Iigantes e receptores foram relatados por estarem envolvidos nas funções neuro relacionadas. Por exemplo, o documento W02004/071528 15 publicado em 26 de agósto de 2004 descreve inibição do CD95 (Fas) complexo Iigante/receptor em um modelo murino para tratar lesão da medula espinhal.
Breve Descrição Da Invenção Em realizações da presente invenção, são fornecidos antagonistas do receptor de morte 6 (“DR6”) isolados. Certas realizações dos antagonistas divulgado na presente invenção inibem ou bloqueiam a interação entre o DR6 e um ou'mais de seu(s) ligante(s) cognato(s). Em realizações preferidas, os antagonistas DR6 divulgados na presente invenção inibem ou bloqueiam a interação entre o DR6 e seu ligante cognato, proteína precursora do amilóide ("APP"). Realizações dos antagonistas de DR6 podem compreender anticorpos, tais como anticorpos DR6 ou APP. Tais anticorpos DR6 antagonísticos podem, por exemplo, ser anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. Em certos exemplos de realização da presente invenção, o DR6 antagonista pode compreender um anticorpo anti-DR6 que se liga ao domínio extracelular do polipeptídeo DR6 ou fragmento deste, e opcionalmente pode se ligar a um polipeptídeo DR6 que dompreende os aminoácidos 1-349 ou 42-349 da Figura 1A. Alternativamente, o antagonista DR6 pode compreender um anticorpo anti- 5 APP que se liga um polipeptídeo APP, e opcionalmente pode se ligar a um polipeptídeo APP compreendendo os aminoácidos 66-81 da Figura 1B (SEQ ID No: 6).
Antagonistas DR6 contemplados também incluem imunoadesinas de DR6, DR6 variantes, fragmentos de DR6, formas covalentemente 10 modificadas, òu proteínas de fusão, bem como pequenas moléculas antagonistas. A título de exemplo, antagonistas DR6 podem incluir DR6 peglicado ou formas solúveis de domínios extracelulares do DR6 fundidas a seqüências heterólogasí, como epítopo marcadores, fragmentos de anticorpos, tais como FC humano ou zíperes de leucina.
Exemplos de realização Ilustrativos da presente invenção também
incluem métodos para inibir ou bloquear a ligação do DR6 à APP compreendendo a exposição do polipeptídeo DR6 e/ou polipeptídeo APP a um ou mais antagonistas de DR6 sob condições onde a ligação do DR6 à APP é inibida. Antagonistas DR6 típicos utilizados em tais métodos incluem anticorpos 20 que se ligam a DR6 ou APP, bem como polipeptídeos DR6 solúveis. Opcionalmente, antagonistas de DR6 são selecionados para serem utilizados nesses métodos, observando sua capacidade de inibir a ligação entre DR6 e APP. Em certas realizações da presente invenção, tais métodos são utilizados, por exemplo, para inibir a apoptose e/ou para aumentar o crescimento e/ou 25 sobrevivência de células neuronais em uma cultura de tecidos in vitro. Os métodos contemplam o uso de um único tipo de molécula antagonista de DR6, ou uma combinação de dois ou mais tipos de antagonistas de DR6.
Realizações da presente invenção também fornecem métodos para melhorar o crescimento ou regeneração ou sobrevivência das células neuronais em tecidos de mamíferos, compreendendo em administrar a um mamífero uma quantidade eficaz do antagonista DR6. Em realizações opcionais, a administração do antagonista DR6 melhora o crescimento e 5 bloqueia a morte celular e degeneração de células neuronais ou tecidos do dito mamífero. As células neuronais ou tecidos podem incluir, por exemplo, neurônios motores, neurônios sensoriais, neurônios comissurais, axônios, microglia e/ou oligodendrócitos. Em algumas realizações da presente invenção, o antagonista DR6 utilizado em tais métodos pode incluir um anticorpo que se 10 liga a APP e inibe a sua capacidade de se ligar ao DR6. Em outras realizações da presente invenção, o antagonista DR6 utilizado nos presentes métodos, pode incluir um' anticorpo que se liga ao DR6 e inibe a sua capacidade de se ligar a APP. Alternativamente, o antagonista DR6 pode incluir uma imunoadesina DR6, polipeptídeo DR6 ligado a um polímero não proteináceo 15 selecionado do grupo constituído por polietileno glicol, polipropileno glicol, e polioxialquileno ou um variante do polipeptídeo DR6. As imunoadesinas DR6 empregadas nos métodos podem incluir um receptor DR6 solúvel fundido a uma região Fc de uma imunoglobulina. Ainda adicionalmente, os antagonistas DR6 da presente invenção podem incluir pequenas moléculas.
Realizações da presente invenção também fornecem métodos
para tratar distúrbios neurológicos compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do antagonista DR6 a um mamífero. Em realizações opcionais, os métodos incluem o tratamento a doença de Alzheimer em um mamífero. O antagonista DR6 utilizado em tais métodos pode 25 compreender um anticorpo que se liga a APP e inibe a sua capacidade de se ligar ao DR6. O antagonista de DR6 pode também compreender um anticorpo DR6. Alternativamente, o antagonista DR6 pode incluir uma imunoadesina DR6, polipeptídeos DR6 ligados a um polímero não proteináceo selecionado a partir do grupo constituído por polietileno glicol, polipropileno glicol, e polioxialquileno, anticorpo DR6 ou um variante de DR6. As imunoadesinas DR6 empregadas nos métodos podem incluir um receptor DR6 solúvel fundido a uma região Fc de uma imunoglobulina. Os anticorpos anti-DR6 empregados 5 nos métodos podem se ligar a um receptor DR6 que compreendem os aminoácidos 1-349 ou 42-349 da Figura 1A.
Realizaçõès da presente invenção também incluem métodos para diagnosticar um paciente com um distúrbio neurológico ou um paciente suscetível a um distúrbio neurológico, incluindo obtenção de uma amostra do 10 paciente e examinado a amostra pela presença de um polipeptídeo DR6 variante que possui uma seqüência polipeptídica que difere da seqüência polipeptídica do DR6 da SEQ ID No: 1. Normalmente em tais métodos o polipeptídeo variante é identificado como tendo uma afinidade para um polipeptídeo APP qué difere da afinidade observada para a seqüência 15 polipeptídica do DR6 da SEQ ID No: 1.
Realizações da invenção também fornecem métodos para a identificação de uma molécula de interesse, que inibe a ligação do DR6 à APP. Tais métodos podem compreender a combinação da DR6 e APP, na presença ou ausência de uma molécula de interesse, e, em seguida, a detecção da 20 inibição da ligação do' DR6 à APP, na presença da molécula de interesse mencionada. Opcionalmente tais métodos são realizados utilizando células de mamíferos expressando DR6 na superfície celular, e adicionalmente inclui a detecção de inibição da ativação ou sinalização do DR6. Realizações da invenção incluem adicionalmente moléculas identificadas por esses métodos. 25 Opcionalmente, a molécula de interesse é o anticorpo que se liga a APP, um anticorpo que se liga a DR6 ou um polipeptídeo DR6 solúvel.
Realizações da invenção também fornecem anticorpos que são capazes de se ligar especificamente ao ligante de APP, receptor DR6 e/ou são capazes de modular a atividade biológica associada com o DR6 e/ou seu(s) ligante(s) e/ou co-receptores, e são úteis no tratamento de diversas doenças neurológicas. Em realizações específicas, existem anticorpos fornecidos que se ligam especificamente a um domínio extracelular da seqüência do polipeptídeo 5 DR6 (descrito adicionalmente nos exemplos abaixo). Anticorpos típicos são aqueles que se ligam a APP ou DR6 e que são ainda selecionados pela sua capacidade de inibir a ligação entre DR6 e APP. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Opcionalmente, o anticorpo monoclonal compreende os anticorpos 3F4.4.8, 4B6.9.7, ou 1E5.5.7 secretados pelo hibridoma 10 depositado sob o número de acesso ATCC: PTA-8095, PTA-8094, ou PTA- 8096, respectivamente.
Também são fornecidos anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo como o epítopo ao qual os anticorpos monoclonais 3F4.4.8, 4B6.9.7, ou 1E5.5.7 produzidos pelas linhagens celular de hibridoma depositados como número de acesso ATCC: PTA-8095, PTA-8094, ou PTA-8096,
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respectivamente, se ligam. Em um aspecto, a invenção diz respeito a um anticorpo anti-DR6 compreendendo os anticorpos 3F4.4.8, 4B6.9.7, ou 1E5.5.7 que demonstra pelo menos a mesma afinidade ao DR6, e/ou exibe pelo menos, a mesma atividade biológica e/ou potência dos anticorpos 3F4.4.8, 4B6.9.7, ou 1E5.5.7.
Ainda em outras realizações específicas, existem linhagens de células de hibridoma fornecidas que produzem o anticorpo monoclonal 3F4.4.8, 4B6.9.7, ou 1E5.5.7 depositados sob os números de acesso ATCC: PTA-8095, PTA-8094, ou PTA-8096, respectivamente e, o anticorpo monoclonal 3F4.4.8, 25 4B6.9.7, ou 1E5.5.7 secretado pelos hibridomas depositados sob os números de acesso ATCC: PTA-8095, PTA-8094, ou PTA-8096, respectivamente.
São também fornecidos anticorpos monoclonais anti-DR6 isolados, compreendendo anticorpos que se ligam ao polipeptídeo DR6 e inibem competitivamente a ligação do anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma depositado sob o número de acesso ATCC: PTA-8095, PTA-8094 ou PTA-8096 ao dito polipeptídeo DR6. São também fornecidos anticorpos anti- DR6 quimérico ou humanizado que se ligam especificamente aos polipeptídeos 5 DR6 e compreendem (a) uma seqüência derivada do anticorpo 3F4.4.8, 4B6.9.7, ou 1E5.5.7 secretado pelo hibridoma depositado sob o número de acesso ATCC PTA-8095, PTA-8094, ou PTA-8096, respectivamente. Opcionalmente, tais anticorpos podem incluir uma cadeia pesada, cadeia leve ou regiões variáveis derivadas do anticorpo 3F4.4.8, 4B6.9.7, ou 1E5.5.7.
Em um aspecto adicional da presente invenção, a invenção diz
respeito a moléculas isoladas de ácido nucléico que codificam os anticorpos anti-DR6 ou fragmentos de anticorpos da presente invenção, vetores contendo tais moléculas de ácidos nucléicos, células hospedeiras contendo tais moléculas de ácido núcléico, e métodos para a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos da presente invenção.
A invenção ainda refere-se a composições compreendendo antagonista(s) de DR6', tal como os definido na presente invenção, e uma veículo. O veículo pode ser farmaceuticamente aceitável, e a composição pode ainda compreender um(alguns) agente(s) adicional(ais).
Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a artigos
manufaturados compreendendo um recipiente e composições contidas no recipiente mencionado, onde a composição inclui o antagonista de DR6 da presente invenção. O artigo manufaturado pode ainda incluir instruções para o uso in vitro ou in vivo do antagonista de DR6. Em uma realização preferida, as instruções estão relacionadas ao tratamento de distúrbios neurológicos.
Em um aspecto relacionado, realizações da presente invenção incluem kits compreendendo um primeiro recipiente, um rótulo no recipiente mencionado, e uma composição contida no recipiente mencionado. Em tais kits, a composição inclui um antagonista de DR6 eficaz para inibir apoptose em pelo menos um tipo de célula neuronal mamífera, o rótulo no recipiente mencionado, uma bula incluída no recipiente mencionado indicando que a composição pode ser usada para inibir a apoptose em pelo menos um tipo de 5 célula neuronal de mamífero. Opcionalmente o kit inclui elementos adicionais, tais como um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável e/ou instruções para o uso do antagonista DR6 para inibir a apoptose em pelo menos um tipo de célula neuronal de mamífero.
A invenção prevê ainda a utilização de antagonistas de DR6 e composições descritas na presente invenção para a preparação ou fabricação de um medicamento para uso no tratamento de distúrbios neurológicos em mamíferos, inclusive para uso no tratamento da doença de Alzheimer.
Breve descrição das figuras A Figura 1A exibe a seqüência nucleotídica de cDNA do DR6 humano (FIG 1A-1, SEQ ID No: 2), a sua seqüência de aminoácidos derivada (FIG 1A-2, SEQ ID No: 1), bem como um esquema da arquitetura de seu domínio (domain architecturé) (FIG 1A-3). No DR6 esquemático, estão indicados os limites dos domínios, incluindo o peptídeo sinal putativo, motivos do domínio rico em cisteína, domínio transmembrana e domínio de morte. Neste esquema, são indicados os limites do domínio putativo do peptídeo sinal putativo, motivos do domínio rico em cisteína, domínio transmembrana, domínio de morte. Figura 1B exibe a seqüência nucleotídica do cDNA da isoforma 695 da proteína precursora amilóide humana (APP) (FIG. 1B-1, SEQ ID No: 5) e suas seqüências de aminoácidos derivadas (FIG. 1B-2, SEQ ID No: 6). Figura 1C exibe a seqüência de aminoácidos da isoforma 751 da proteína precursora amilóide húmana (SEQ ID No: 7). Figura 1D exibe a seqüência nucleotídica de cDNA da isoforma 770 da proteína precursora amilóide humana (APP) (FIG. 1D-1, SEQ ID No: 8) e suas seqüência de aminoácidos derivadas (FIG. 1D-2, SEQ ID No: 9). Vide , por exemplo, UniProtKB/Swiss-Prot entrada P05067 e divulgações associadas incluindo aquelas relacionadas à isoforma ID P05067-1, isoforma ID P05067-4 e isoforma ID P05067-8, respectivamente (http://expasv.org/uniprot/P05067)·
A Figura 2A exibe que DR6 é fortemente expresso no
desenvolvimento do sistema nervoso central, incluindo os neurônios motor e comissural da medula espinhal e neurônios ganglionares das raízes dorsais, nas fases de desenvolvimento E10.5 - E12.5. Figura 2B exibe proteínas DR6 expressas em axônios e corpos celulares. Figura 2C mostra o RNAm do DR6 expresso na diferenciação de neurônios.
A Figura 3 exibe uma representação esquemática da degeneração axonal e neuronal e morte celular em um ensaio de sobrevida de explantes da medula espinhal; é indicado a introdução de agente interferente siRNA junto com um RNA de plasmídeo èxpressando GFP em neurônios comissurais embriônicos por eletroporação.
A figura 4A ilustra que a inibição da expressão de DR6 por RNAs interferentes pequenos que bloqueiam a degeneração do axônio comissural e previnem a morte de células neuronais na medula espinhal dorsal em um ensaio de sobrevida. Figura 4B exibe o cDNA de um DR6 resistente ao RNAi resgatando o fenótipos de degeneração bloqueado pelo siRNA do DR6.
A Figura 5 exibe que anticorpos DR6 antagonísticos ajudaram a bloquear a degeneração e morte celular neuronal axonal na da medula espinhal dorsal em uma ensaio de sobrevida.
A Figura 6 apresenta um esquema mecanístico e fotografias de neurônios exibindo a infra-regulação da sinalização intracelular a jusante de DR6 pela inibição farmacológica da quinase c-Jun n-terminal (JNK) prevenindo a degeneração axonal e morte celular neuronal no ensaio de sobrevida com o explante. A Figura 7 exibe o efeito neuro-protetor dos anticorpos DR6 antagonísticos na sobrevida de neurônios motores espinhais e interneurônios em uma cultura embrionária totalmente ex vivo.
A Figura 8 apresenta fotografias dos cortes da medular espinhal cervical E15.5 imuno-corada com anticorpo Caspase 3 clivada para mostrar que a perda do DR6 resulta na diminuição da morte celular neuronal na medula espinhal e nos neurônios ganglionares das raízes dorsais em embriões DR6 null.
A Figura SA exibe uma quantificação de células de neurônios nos 10 embriões E15.5 DR6 KO expressando caspase-3 clivada, que demonstra uma redução de aproximadamente 50% na morte celular neuronal em embriões DR6-null comparado com embriões descendentes DR6 +/- controle (DR6 hets). Figura 9B fornece imagens de células demonstrando que o DR6 é necessário para o a degeneração do axônio motor como foi verificado com as 15 comparações de camundongos normais e camundongos DR6 knock-out, na presença e ausência de fatores de crescimento neurotróficos. Figura 9C fornece imagens de células mostrando que degeneração axonal induzida por lesão é atrasada nos camundongos DR6 knock-out.
A Figura IOA fornece imagens de neurônios demonstrando que 20 anticorpos anti-DR6 inibem a degeneração de axônios resultante da retirada do fator de crescimento neural (NGF) de neurônios privados de diversos fatores tróficos. Figura 10B fornece dados fotográficos adicionais a partir da visualização pela coloração de TUNEL de corpos celulares apoptóticos em neurônios comissurais, sensoriais e motores, demonstrando que anticorpos 25 anti-DR6 inibem a degeneração de neurônios privados de diversos fatores tróficos.
A Figura 11A fornece imagens de neurônios comissurais mostrando que a degeneração do axônio comissural pode ser atrasada com o DR6-Fc. Figura 11B fornece imagens de neurônios sensoriais mostrando que a degeneração de axônios sensoriais induzida pela retirada do NGF pode ser atrasada pelo DR6-Fc.
A Figura 12A fornece fotografias de neurônios mostrando a 5 visualização dos sítios de ligação do DR6 em axônios utilizando a DR6-AP. Figura 12B fornece imagens de neurônios na presença e ausência de NGF mostrando que os sítios de ligação do DR6 ligante são perdidos a partir de axônios após a privação do NGF. Figura 12C fornece fotografias de estudos em axônios sensoriais BAX null nos estágios de desenvolvimento E12.5 10 mostrando que o inibidor da beta secretase (BACE) pode bloquear o desaparecimento dos sítios de ligação da DR6-AP dos axônios sensoriais após a retirada do NGF.
A Figura 13A fornece fotografias de dados obtidos a partir de vários procedimentos de Western blotting onde os polipeptídeos de células neuronais foram analisados com DR6-AP (superior esquerdo) ou anticorpo anti- N-APP (superior diréito), bem como polipeptídeos: (1), selecionados por possuírem capacidade de se ligar a DR6; e, em seguida, (2) sondados com anticorpo anti-N-APP (inferior, "DR6 DCE-pull-down"). Estes dados identificam a proteína precursora amilóide (APP), como um ligante associado ao ectodomínio DR6. Figura 13B fornece fotografias de dados obtidos a partir de vários experimentos dé blotting que permitem a visualização de DR6 Iigantes (incluindo polipeptídeos APP) no axônio condicionado no meio analisado com DR6-AP. Estes dados de blotting identificaram uma série de polipeptídeos APP incluindo o APP N-terminal a 35 kDa, bem como os polipeptídeos C99-APP e C83/C89 APP.
A Figura 14A fornece imagens de neurônios mostrando que a supressão do ectodomínio APP ocorre numa fase precoce após a privação do NGF. Figura 14B fornece imagens de células demonstrando que o ectodomínio DR6 se liga a APP produzida em cultura de células. Figura 14C fornece imagens de células exibindo que DR6 é o maior receptor para N-APP em axônios sensoriais e que sítios de ligação ao APP são significativamente depletados nas células neuronais de camundongos DR6 null. Figura 14D 5 fornece imagens de células demonstrando que anticorpo que bloqueiam a função de DR6 interrompem as interações entre o ectodomínio DR6 e N-APP.
A Figura 15A fornece imagens de neurônios demonstrando que o anticorpo policlonal para o APP N-terminal bloqueia a degeneração axonal em um ensaio com axônio comissural. Figura 15B fornece imagens de neurônios 10 demonstrando que anticorpos policlonais para o APP N-terminal, bem como os anticorpos monoclonais anti-22C11 APP inibem a degeneração axonal local induzida pela remoção do NGF. Figura 15C fornece imagens de neurônios demonstrando que a degeneração axonal que é bloqueada pela inibição da atividade da β-secretase (BACE) pode ser resgatada através pela adição de N- 15 APP. Figura 15D fornece imagens de neurônios demonstrando que a remoção de APP por RNAi sensibiliza células neuronais à morte induzida por N-APP.
A Figura 16A fornece imagens de neurônios demonstrando que a função DR6 é necessária para degeneração axonal induzida por N-APP, mas não para a degeneração desencadeada por Abeta. Figura 16B fornece imagens de neurônios demonstrando que a função de bloqueio de anticorpos DR6 falham no bloqueio da degeneração axonal desencadeada por Abeta.
A Figura 17A fornece imagens de neurônios demonstrando que a degeneração axonal é atrasada pela inibição do JNK e a montante da caspase-
8, mas não a jusante da caspase-3. Figura 17B fornece imagens de neurônios motores a partir de culturas de explantes E12.5 demonstrando funções da caspase-3 nos corpos celulares, e caspase-6 nos axônios. Figura 17C fornece imagens de neurônios'sensoriais demonstrando que enquanto a Caspase-3 não é necessária para a degeneração do axônio, a BAX é. Figura 17D fornece imagens de neurônios comissurais demonstrando funções da Caspase-3 nos corpos celulares e funções Caspase-6 nos axônios.
Descrição Detalhada das Realizações Preferidas As técnicas e os procedimentos descritos ou referenciados no presente são geralmente bem compreendidos e geralmente empregados usando a metodologia convencional por aqueles hábeis na técnica, como, por exemplo, as metodologias moleculares de clone extensamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual2 o Edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor1 N.Y. Como apropriado, os procedimentos que envolvem o uso de kits e de reagentes disponíveis comercialmente são realizados geralmente de acordo com os protocolos e/ou parâmetros definidos pelo fabricante a menos que sejam notáveis de outra maneira.
Antes dos métodos e ensaios da presente invenção serem 15 descritos, deve ser compreendido que esta invenção não está limitada à metodologia particular, protocolos, linhagem celular, espécie ou gênero de animais, construções, e reagentes descritos de modo que tais podem, naturalmente, variar. Deve também ser compreendido que a terminologia usada no presente tem apenas a finalidade de descrever realizações 20 específicas, e não pretende limitar o escopo da invenção atual que será limitada somente pelas reivindicações adicionadas.
Deve-se notar que como usado no presente e nas reivindicações adicionadas, a forma singular “um”, “e” e “O ou A” incluem os referentes plurais ao menos que o contexto ditar claramente de outra maneira. Assim, por 25 exemplo, a referência a "uma alteração genética" inclui uma variedade de tais alterações e referências a "uma sonda" inclui a referência a uma ou mais sondas e equivalentes conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto. Todos os números recitados no' relatório descritivo e reivindicações associadas (por exemplo, aminoácidos, 22-81, 1-354 e etc) são entendidos por serem modificados pelo termo "cerca de".
Todas as publicações mencionadas no presente estão incorporadas no presente pela referência para divulgar e descrever os métodos 5 e/ou os materiais em relação aos quais as publicações são citadas. As publicações citadas no presente são citadas para sua divulgação antes da data de arquivamento do pedido atual. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não estão intitulados na data anterior das publicações por virtude de uma data posterior da prioridade ou da data prévia 10 da invenção. Adicionalmente as datas reais da publicação podem ser diferentes daquelas mostradas e requerem verificação independente.
Definições
Os termos "proteína precursora do amilóide" ou "APP" incluem as várias isoformas polipeptídicas codificadas pelo pré-RNAm da APP, por 15 exemplo, o as isoformas APP695, APP751 e App770 exibidas nas Figuras 1B- 1D respectivamente (isoformas que são traduzidas a partir de transcrições de um splicing alternativo do pré-RNAm da APP), bem como porções processadas pós-traducionalmente das isoformas da APP. Como é conhecido no estado da técnica, o pré-RNAm transcritas a partir do gene da APP sofre splicing 20 alternativo dos exons para produzir uma variedade de isoformas (vide, por exemplo, Sandbrink et al. Ann.NYAcad.Sci. Sei. 777: 281-287 (1996), e as informações associadas com o número de acesso do Iocus de proteína no banco NCBI da PubMed: P05067). Este splicing alternativo do éxon origina três isoformas principais de 695, 751, e 770 aminoácidos (vide, por exemplo, Kang 25 etal., Nature 325: 733-736 (1987); Kitaguchi etal., Nature 331: 530-532 (1988), Ponte et al., Nature 331: 525-527 (1988) e Tanzi et al., Nature 331: 528-532 (1988)). Duas destas isoformas (App75i e APP770) contêm um resíduo 56 inserido que é altamente homólogo à família Kunitz de inibidores de serino protease (KPI) e são ubiquamente expressos. Em contrapartida, a isoforma mais curta não possui o motivo KPI1 APP695 é expressa predominantemente no sistema nervoso, por exemplo, em neurônios e células gliais e por esta razão é muitas vezes denominado "APP neuronal" (vide, por exemplo, Tanzi et al., 5 Science 235: 880-884 (1988); Neve et al. Neuron 1: 669-677 (1988) e Haas et al., J. Neurosci 11: 3783-3793 (1991)). As isoformas da APP, incluindo a 695, 751 e 770 sofrem significantes eventos de modificações pós-traducionais (vide, por exemplo, Esch et al. 1990 Science 248:1122-1124; Sisodia et al. 1990 Science 248:492 - 495). Por exemplo, cada uma destas isoformas é clivada por 10 várias secretases e/ou complexos de secretases, eventos que produzem fragmentos APP incluindo um N-terminal de polipeptídeos seçretados contendo o ectodomínio APP (sAPPa e εΑΡΡβ). A clivagem por alfa-secretases ou alternativamente por beta-secretases leva a geração e liberação extracelular de polipeptídeos APP N-terminal solúvel, sAPPa e εΑΡΡβ, respectivamente, e a 15 retenção dos fragmentos C-terminal ancorados a membrana correspondentes, C83 e C99. O processamento subseqüente de C83 pela gama-secretase produz polipeptídeos P3. Esta é a principal via secretora e é não amiloidogênica. Alternativamente, o processamento com gama-secretese mediada por presenilina/nicastrina de C99 libera o polipeptídeos beta amilóide, 20 beta-amilóide 40 (Abeta40) e beta-amilóide 42 (Abeta42), os principais componentes de placas amilóides, e os fragmentos C-terminal citotóxicos, gama-CTF(50), gama-CTF(57) e gama-CTF(59). Evidências sugerem que a importância relativa de cada evento de clivagem depende do tipo celular. Por exemplo, células não neuronais preferencialmente processam a APP pela(s) 25 via(s) da α-secretase que cliva a APP dentro da seqüência Abeta, impedindo assim a formação da Abeta (vide, por exemplo, Esch et al. 1990 Science 248:1122-1124; Sisodia et al. 1990 Science 248:492 - 495). Em contraste, células neuronais processam uma porção muito maior da APP695 pela(s) via(s) da β-secretase, o que gera Abeta intacta pela atividade combinada de pelo menos duas classes de enzimas. Em células neuronais a(s) P-secretase(s) clivam a APP695 no amino terminal do domínio Abeta liberando um fragmento N-terminal diferente (sAPPP). Além disso, y-secretase(s) clivam a APP em 5 sítios alternativos do carbóxi terminal gerando espécies de Abeta que são de 40 (Abeta^) ou 42 (Abeta42) aminoácidos de comprimento (vide, por exemplo, Seubert et al. 1993 Nature 361:260-263; Suzuki et al. 1994 Science 264:1336- 1340; e Turner ef al. 1996 J. Biol. Chem. 271:8966-8970).
Os termos "APP", "proteína APP" e "polipeptídeo APP" quando utilizados no presente abrangem seqüências APP nativas, APP variantes e fragmentos processados destas. Estes termos abrangem APP expressa em uma variedade de mamíferos, incluindo os seres humanos. APP pode ser endogenamente expressa como ocorre naturalmente em uma variedade de linhagens de tecidos humanos, ou podem ser expressas por métodos recombinantes ou sintéticos. Uma "seqüência APP nativa" compreende um polipeptídeo tendo a mesma seqüência de aminoácidos como a de uma APP derivada da natureza (por exemplo, as isoformas 695, 751 e 770 ou porções processadas destas). Assim, uma seqüência APP nativa pode ter a seqüência de aminoácidos de uma APP de ocorrência natural a partir de qualquer mamífero, inclusive humanos. Tal seqüência APP nativa pode ser isolada da natureza ou pode ser produzida por meios recombinantes ou sintéticos. O termo "seqüência APP nativa" abrange especificamente formas secretadas e/ou processadas de ocorrência natural (por exemplo, uma forma solúvel, contendo, por exemplo, uma seqüência do domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas processadas proteoliticamente e/ou que sofreram splicing alternativos) e variantes alélicos de ocorrência natural. Variantes da APP podem incluir fragmentos ou mutantes delecionais da seqüência APP nativa. Polipeptídeos APP úteis nas realizações da invenção incluem aqueles descritos acima e os exemplos não Iimitantes abaixo. Estas formas ilustrativas podem ser selecionadas para uso em varias realizações da presente invenção. Em algumas realizações da invenção, o polipeptídeo APP compreende uma isoforma da APP de comprimento total, tal como as isoformas APP695 e/ou APP751 e/ou APP770 exibidas nas Figs. 1B-1D. Em outras realizações da invenção, o polipeptídeo APP compreende uma isoforma processada pós-traducionalmente da APP, por exemplo, uma polipeptídeo APP que sofreu por uma clivagem por uma secretase, tal como uma a-secretase, uma α-secretase ou uma γ-secretase (por exemplo, um fragmento N-terminal solúvel, como uma sAPPa ou um εΑΡΡβ). Em realizações relacionadas da presente invenção, ú polipeptídeo APP pode ser selecionado para compreender um ou mais domínios específicos, tais como um ectodomínio N- terminal, (vide, por exemplo, Quast et al., FASEB J. 2003; 17 (12) : 1739-41), um domínio de ligação a heparina (vide por exemplo, Rossjohn et al., Nat Struct Biol. 6 de abril de 1999; (4) :327-31), um cobre tipo Il (vide, por exemplo, Hesse et al., FEBS Letters 349 (1): 109-116 (1994)) ou um domínio inibidor da protease Kunitz (vidé, por exemplo, Ponte et al., Nature, 331 (6156) :525-7 (1988)). Em algumas realizações da presente invenção, o polipeptídeo APP inclui uma seqüência observada por compreender um epítopo reconhecido por um antagonista de DR6 divulgado na presente invenção, tal como um anticorpo ou imunoadesina DR6, por exemplo, aminoácidos 22-81 da APP695, uma seqüência que inclui os epítopo de ligação pelo anticorpo monoclonal 22C11 (vide, por exemplo, Hilbich et al., Journal of Biological Chemistry, 268 (35): 26571-26577 (1993)).
Em certas realizações da presente invenção, o polipeptídeo APP não contém um ou mais domínios específicos ou seqüências, por exemplo, um polipeptídeo APP que não inclui certos aminoácidos N-terminal ou C-terminal (por exemplo, o polipeptídeo N-APP recombinante humano divulgado no Exemplo 12), um polipeptídeo APP que não inclui o domínio inibidor da protease Kunitz (por exemplo: APP695), ou um polipeptídeo APP que não inclui as seqüências da proteína beta amilóide (Abeta) de Alzheimer (por exemplo, 5 sAPPP, um polipeptídeo que não inclui as seqüências Αβ40 e/ou Ap42) (vide, por exemplo, Bond etal., J. Struct Biol. 2003;141(2):156-70). Em outras realizações da presente invenção, um polipeptídeo APP utilizado nos exemplos de realização da invenção compreende um ou mais domínios ou seqüências, mas não outros domínios ou seqüências, por exemplo, um polipeptídeo APP que 10 compreende um ectodomínio N-terminal (ou pelo menos uma parte deste observado por se ligar a um antagonista DR6, tal como um anticorpo monoclonal 22C11), mas não a um domínio ou seqüência que é C-terminal de um ou mais sítios de clivagem de secretases como uma seqüência beta amilóide (Abeta) (por exemplo, um sAPPa ou um sAPPp).
O termo “domínio extracelular”, “ectodomínio” ou “ECD” refere-se
a forma da APP que esta essencialmente livre dos domínios transmembrana e citoplasmático. Ordinariamente, o ECD solúvel terá menos de 1% de tais domínios transmembrana e citoplasmático, e preferivelmente, terá menos de 0,5% de tais domínios. Será compreendido que qualquer (quaisquer) 20 domínio(s) transmembrana(s) identificado(s) para o polipeptídeos da presente invenção é(são) identificado(s) sob os critérios rotineiramente empregados no estado da técnica para identificar qual o tipo de domínio hidrofóbico. O limite exato de um domínio transmembrana pode variar, mas muito provavelmente por não mais que cercá de 5 aminoácidos em cada extremidade do domínio 25 que foi inicialmente identificado. Em realizações preferidas, o ECD será composto por uma seqüência de domínio extracelular, solúvel, do polipeptídeo que está sem os domínios transmembrana, citoplasmático ou intracelular (e não está ligado à membrana). O termo "APP variante" refere-se a um polipeptídeo APP assim com definido a seguir/ tendo pelo menos cerca de 80%, preferencialmente, cerca de pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, mais preferencialmente cerca de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, e mais preferencialmente 5 ainda cerca de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade na seqüência de aminoácidos com uma APP humana que possui a seqüência de aminoácidos mostrada na Fig. 1B-1D, ou um fragmento solúvel deste, ou um domínio extracelular solúvel deste. Tais variantes incluem, por exemplo, polipeptídeos APP onde um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados 10 aos, ou deletados dos, N- ou C-terminal de seqüências maduras ou de comprimento total da Figura 1B-1D, ou polipeptídeo APP onde um ou mais resíduos de aminoácidòs são inseridos ou deletados de uma seqüência interna ou domínio do polipeptídeo, incluindo os variantes de outras espécies, mas exclui um polipeptídeo APP de seqüência nativa. "DR6" ou "receptor DR6" 15 inclui os receptores referidos no estado da técnica cuja a seqüência polinucleotídicas e polipeptídicas são exibidas na Figura 1A-1 - 1A-2. Pan et al. descreveram as seqüência polinucleotídicas e polipeptídicas para o membro de receptores da família do TNF referida como "DR6" ou "TR9" (Pan et al., FEBS Lett., 431:351-356 (199B); vide também Patentes US 6.358.508, US 6.667.390; 20 US 6919078 e US 6949358). O receptor DR6 humano é uma proteína de 655 aminoácidos (vide á Figura 1A-2) com uma seqüência sinal putativa (aminoácidos 1-41), um domínio extracelular (aminoácidos 42-349), um domínio transmembrana (aminoácidos 350-369 ), seguido por um domínio citoplasmático (aminoácidos 370-655). O termo "receptor DR6" quando 25 utilizado na presente invenção, abrange seqüências nativas do receptor e seqüências variantes do receptor. Estes termos abrangem o receptor DR6 expresso em uma variedade de mamíferos, incluindo os seres humanos. O receptor DR6 pode ser expresso de maneira endógena como ocorre naturalmente em uma variedade de linhagens de tecidos humanos, ou podem ser expressos por métodos recombinantes ou sintéticos. Um "receptor DR6 de seqüência nativa" compreende um polipeptídeo que tem a mesma seqüência de aminoácidos de um receptor DR6 derivado da natureza. Assim, um receptor DR6 de seqüência nativa pode ter a seqüência de aminoácidos de ocorrência natural do receptor DR6 de qualquer mamífero, inclusive do homem. Esse um receptor DR6 de seqüência nativa pode ser isolado da natureza ou pode ser produzido de maneira recombinante ou sintética. O termo "receptor DR6 de seqüência nativa" engloba especificamente formas truncadas ou secretadas de ocorrência natural do receptor (por exemplo, uma forma solúvel, contendo, por exemplo, uma seqüência do domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas que sofreram splicing alternativo) e variantes alélicas que ocorrem naturalmente. Variantes do receptor podem incluir fragmentos ou mutantes por deleção do receptor DR6 de seqüência nativa.
O termo “domínio extracelular” ou “ECD” refere-se à uma forma de receptor de DR6 que esta essencialmente livre dos domínios transmembrana e citoplasmático. Ordinariamente, o ECD solúvel terá menos de 1% de tais domínios transmembrana e citoplasmático, e preferivelmente, 20 terá menos de 0,5% de tais domínios. Será compreendido que qualquer (quaisquer) domínio(s) transmembrana(s) identificado(s) para o polipeptídeos da presente invenção é(são) identificado(s) sob os critérios rotineiramente empregados no estado da técnica para identificar qual o tipo de domínio hidrofóbico. O limite exato de um domínio transmembrana pode variar, mas 25 muito provavelmente por não mais que cerca de 5 aminoácidos em cada extremidade do domínio que foi inicialmente identificado. Em realizações preferidas, o ECD será composto por uma seqüência de domínio extracelular, solúvel, do polipeptídeo que está sem os domínios transmembrana, citoplasmático ou intracelular (e não está ligado à membrana).
O termo "DR6 variante" refere-se a um polipeptídeo DR6 assim com definido a seguir, tendo pelo menos cerca de 80%, preferencialmente, cerca de pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, mais preferencialmente 5 cerca de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, e mais preferencialmente ainda cerca de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade na seqüência de aminoácidos com uma APP humana que possui a seqüência de aminoácidos mostrada na Fig. 1A, ou um fragmento solúvel deste, ou um domínio extracelular solúvel deste. Tais variantes incluem, por exemplo, 10 polipeptídeos DR6 onde um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados aos, ou deletados dos, N- ou C-terminal de seqüências maduras ou de comprimento total da Figura 1A, ou polipeptídeo DR6 onde um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos ou deletados de uma seqüência interna ou domínio do polipeptídeo, incluindo os variantes de outras espécies, mas 15 exclui um polipeptídeo DR6 de seqüência nativa. Opcionalmente, o DR6 variante compreende uma forma solúvel do receptor DR6 compreendendo os aminoácidos 1-349 ou 42-349 da Figura 1A com até 10 substituições conservadoras de aminoácidos. Preferencialmente essa variante age como um antagonista de DR6, como definido abaixo.
O termo "àntagonista de DR6" é utilizado no sentido mais amplo,
e inclui qualquer molécula que bloqueia, iniba ou neutralize parcial ou totalmente a capacidade do receptor DR6 de se ligar o seu Iigante cognato, de preferência, o sua Iigante cognato APP, ou ativar um ou mais sinal(ais) intracelular ou via(s) de sinalização intracelular em células neuronais ou tecido, 25 de maneira in vitro, in situ, in vivo ou ex vivo. A título de exemplo, um antagonista de DR6 pode bloquear, inibir ou neutralizar parcial ou totalmente a capacidade do receptor DR6 ativar um ou mais sinal(is) intracelular(es) ou via(s) de sinalização intracelular em células neuronais ou tecido que resulta na apoptose ou morte em células neuronais ou tecidos. O antagonista de DR6 pode agir de modo a bloquear, inibir ou neutralizar parcialmente ou totalmente o DR6 por uma variedade de mecanismos, incluindo, mas não limitados a, bloqueio, inibição, neutralização da ligação do Iigante cognato ao DR6, 5 formação de um complexo entre DR6 e seus Iigante cognato (por exemplo, APP), oligomerização dos receptores DR6, formação de um complexo entre o receptor DR6 e co-receptores heterólogos, ligação de um Iigante cognato ao receptor DR6/complexo co-receptor heterólogo, ou formação de um complexo entre o receptor DR6, co-receptor heterólogo e seu Iigante cognato. 10 antagonistas de DR6 podem funcionar de maneira direta ou indireta. Antagonistas de DR6 contemplado pela presente invenção incluem, mas não estão limitados a, anticorpos APP, anticorpos DR6, imunoadesinas, imunoadesinas DR6, proteínas de fusão DR6, formas de DR6 modificadas covalentemente, variantes e proteínas de fusão DR6, ou formas superiores de 15 oligômeros DR6 (dímeros, agregados) ou formas de homo ou heteropolímero de DR6, pequenas moléculas, tais como inibidores farmacológicos da cascata de sinalização JNK, incluindo as pequenas moléculas e peptídeos inibidores da atividade JNK quinase Jun N-terminal, inibidores farmacológicos de proteínas quinases MLKs e atividades MKKs que tem função a montante de JNK na via 20 de transdução de sinal, inibidores farmacológicos da ligação do JNK a proteína adaptadora JIP-1, inibidores farmacológicos da ligação do JNK aos seus substratos como o c-jun ou complexos do fator de transcrição AP-1, inibidores farmacológicos da fosforilação mediada por JNK dos seus substratos, tal como o peptídeo do domínio de ligação do JNK (JBD) e/ou domínio de ligação do 25 substrato do JNK e/ou peptídeo inibidor compreendendo um sítio de fosforilação do substrato JNK, pequenas moléculas que bloqueiam a ligação do ATP ao JNK, e pequenas moléculas que bloqueiam a ligação do substrato a JNK. Para determinar se um antagonista de DR6 bloqueia, inibe ou neutraliza parcial ou totalmente a capacidade do receptor DR6 ativar um ou mais sinal(is) intracelular(es) ou via(s) de sinalização intracelular em células neuronais ou tecidos, testes podem ser realizados para avaliar o(s) efeito(s) do antagonista de DR6, por exemplo, em células neuronais ou tecidos (como descrito nos exemplos), bem como em modelos in vivo de isquemia cardíaca/cerebral, em modelos in vivo de doenças neurodegenerativas, tais como modelos de camundongos para a doença Parkinson; modelos de camundongos da doença de Alzheimer; modelos de camundongos da esclerose lateral amiotrófica ALS; modelos de camundongos da atrofia muscular espinhal SMA; modelos de camundongos de isquemia cerebral focal e total, por exemplo, modelo de oclusão da artéria carotídea comum ou modelo de oclusão da artéria cerebral média; ou culturas ex vivo de todo ò embrião. Os diversos ensaios podem ser realizados em formas de ensaios in vitro ou in vivo conhecidos, tais como descrito abaixo, ou conhecido no estado da técnica e descritos na literatura (vide, por exemplo, McGowan et ai., Trends in Genetics, 22:281-289 (2006); Fleming et al. NeuroRx, 2:495-503 (2005), Wong et al., Nature Neuroscience, 5:633-639 (2002)). Um exemplo de realização de um ensaio para determinar se um antagonista de DR6 bloqueia, inibe ou neutraliza parcial ou totalmente a capacidade do receptor DR6 ativar um ou mais sinal(ís) intracelular(es) ou via(s) de sinalização intracelular em células neuronais ou tecidos, compreende a combinação do DR6 e APP, na presença ou ausência de um antagonista de DR6 ou antagonista de DR6 em potencial (ou seja, uma molécula de interesse); e, em seguida, detectar a inibição da ligação do DR6 à APP, na presença deste antagonista de DR6 ou antagonista de DR6 em potencial.
Pelo termo "ácidos nucléicos" pretende-se incluir qualquer DNA ou RNA. Por exemplo, ácido nucléico cromossômico, mitocondrial, viral e/ou bacteriano presente na amostra de tecido. O termo "ácido nucléico" engloba tanto molécula de ácido nucléico de fita simples, quanto molécula de ácido nucléico de fita dupla e inclui qualquer fragmento ou porção de uma molécula de ácido nucléico intacta.
Pelo termo "gene" entende-se qualquer seqüência de ácido 5 nucléico ou parte desta com um papel funcional na codificação ou transcrição de uma proteína ou regulação da expressão de outro gene. O gene pode ser constituído por todos os ácidos nucléicos responsáveis pela codificação de uma proteína funcional ou por apenas uma porção de ácidos nucléicos responsáveis pela codificação ou expressão de uma proteína. A seqüência de 10 ácido nucléico pode conter uma anormalidade genética dentro dos éxons, introns, regiões de término ou início, seqüências promotoras, outras seqüências reguladoras ou regiões adjacentes únicas ao gene.
Os termos "aminoácido" e "aminoácidos" referem-se a todos os L- alfa-aminoácidos de ocorrência natural. Esta definição destina-se a incluir a norleucina, ornitina e homocisteína. Os aminoácidos são identificados tanto pela designação de uma letra quanto pela de três letras:
Asp D Ácido aspártico Ile I Isoleucina Thr T Treonina Leu L Leucina Ser S Serina Tyr Y Tirosina Glu E ' ácido glutâmico Phe F Fenilalanina Pro P Prolina His H Histidina Gly G Glicina Lys K Lisina Ala A Alanina Arg R Arginina Cys C Cisteina Trp W Triptofano Val V Valina Gln Q Glutamina Met M Metionina Asn N Asparagina Nas figuras, algumas denominações além do alfabeto dos aminoácidos de uma única letra ou de três letras podem ser utilizadas para se referir e identificar dois ou mais aminoácidos ou nucleotídeos em uma determinada posição na seqüência.
A expressão “isolado” quando utilizada para descrever vários peptídeos ou proteínas descritas na presente invenção, significa um peptídeo 5 ou proteína que tenha sido identificado, separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir em usos diagnóstico ou terapêutico para o polipeptídeo ou proteína, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não-proteináceos. Em realizações 10 preferidas, o peptídeo ou proteína será purificado (1) a um grau suficiente para se obter pelo menos 15 resíduos de seqüência de aminoácidos interna ou N- terminal, pelo uso de um seqüenciador de copo de fiação (spinning cup)\ ou (2) até a homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não- redutoras utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, coloração de 15 prata ou (3) até a homogeneidade por espectroscopia de massa ou técnicas de mapeamento de peptídeos. O material isolado inclui o peptídeo o proteína in situ em células recombinantes, desde que, pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, entretanto, o peptídeo o proteína isolada será preparada através de pelo menos uma etapa
*
de purificação.
“Percentual (%) de identidade de seqüências de aminoácidos” com respeito às seqüências do polipeptídeo Apo-2L identificadas no presente é definida como percentual de identidade de seqüências de aminoácidos em uma seqüência candidata qúe são idênticos aos resíduos de aminoácido em uma 25 seqüência de referência, após o alinhamento das seqüências e introdução dos gaps, se necessário, para conseguir a porcentagem de identidade máxima e não considerar todas as substituições conservadoras como a parte da identidade da seqüência. O alinhamento para a finalidade de determinar a porcentagem de identidade da seqüência dos aminoácidos pode ser conseguido de várias maneiras que estão dentro de habilidades no estado da técnica que podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de medição, incluindo todos os algoritmos necessários para conseguir o alinhamento máximo sobre toda extensão das seqüências que estão sendo comparadas. Opcionalmente, os valores da % da seqüência de aminoácidos idênticos são obtidos usando o programa de computador de comparação de seqüência ALIGN-2. O programa de computador de comparação de seqüência ALIGN-2 foi desenvolvido pela Genentech, Inc. e o código de fonte foi depositado com a documentação do usuário no escritório Norte Americano de direitos autorais, Washington, DC, 20559 Estado Unidos, onde está registrado sob o n° de registro de direitos autorais Norte Americano TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível pela Genentech Inc., South San Francisco, Califórnia. Todos os parâmetros da comparação da seqüência são ajustados pelo programa ALIGN-2 e não variam.
"Estringência" das reações de hibridação são facilmente determináveis pelos técnicos hábeis no assunto e, em geral, é um cálculo empírico dependente do comprimento da sonda, temperatura de lavagem e concentração de sal. Ém geral, sondas longas requerem altas temperaturas 20 para o anelamento correto, enquanto sondas menores necessitam de temperaturas mais baixas. A hibridação depende geralmente da capacidade de desnaturar o DNA para então re-anelar com fitas complementares presentes em um ambiente abaixo da sua temperatura de fusão. Quanto maior o grau de identidade entre a sonda desejada e seqüência hibridizável, uma relação de 25 temperatura maior pode ser utilizada. Como resultado, segue-se que temperaturas mais elevadas tendem a tornar as condições de reação mais estringentes, enquanto que temperaturas mais baixas, menos estringentes. Para mais informações e explicações sobre a estringência das reações de hibridação, vide Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers1 (1995).
A expressão "condições de estringência elevada", da forma como
são definidas na presente invenção, podem ser identificadas por aquelas que:
(1) empregam baixa força iônica e temperatura elevada para lavagem: cloreto
de sódio 0,015 M / citrato de sódio 0.0015 M / dodecil sulfato de sódio 0.1% a
50 °C; (2) empregam durante hibridização um desnaturante, como a
formamida: formamida 00% (v/v) com 0,1% de albumina de soro bovino / 0.1%
de Ficoll/0.1% de polivinilpirrolidona/50mM de tampão fosfato de sódio em pH
6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42 °C; ou (3)
empregando: 50% de formamida, 5 x SSC (NaCI 0,75 M, citrato de sódio 0,075
M), fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8 ), pirofosfato de sódio 0,1%, 5 x solução
Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicados (50 mg/ml), 0,1% de SDS,
10% de dextran sulfato a 42 °C, com uma lavagens a 42 0C em 0,2 x SSC
f·
(cloreto de sódio / citrato de sódio) e 50% de formamida a 55 0C1 seguida por uma lavagem de alta estringência consistindo de 0,1 x SSC contendo EDTA a 55 °C.
A expressão "condições de estringência moderada", da forma como definida no presente, pode ser identificada como as descritas por 20 Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem incubaçõa overnight a 37 0C em uma solução que inclui: 20% formamida, 5 x SSC (150 mM de NaCI, 15 mM de citrato trissódico), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5 x Solução de Denhardt, 10% de dextran sulfato, e 20 mg/ml de DNA de esperma de salmão 25 desnaturado, seguido pela lavagem dos filtros em 1 x SSC a cerca de 37-50 °C. Os técnicos hábeis no assunto irão reconhecer como ajustar a temperatura, força iônica, etc, quando isto for necessário, para ajustar fatores como o comprimento da sonda e similares. O termo "primer" ou "primers" refere-se a seqüências de oligonucleotídeos que ^hibridizam um RNA ou DNA complementar de um polinucleotídeo alvo e servem como pontos de partida para a síntese gradual de polinucleotídeo a partir de mononucleotídeos pela ação de uma 5 nucleotidiltransferase, como ocorre, por exemplo, na reação em cadeia da polimerase.
A expressão “seqüências de controle” designa seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência de codificação operacionalmente ligada em um organismo hospedeiro específico. As 10 seqüências de controle que são apropriadas para procariotos incluem, por exemplo, um promotor, opcionalmente uma seqüência operadora, um sítio de ligação de ribossomos. As células eucarióticas são conhecidas por utilizarem promotores, sinais de poliadenilação e amplificadores (enhancers).
Ácido nucléico está “operacionalmente ligado” quando este é colocado em uma relação funcional com outra seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, o DNA parâ uma seqüência prévia ou líder de secreção está operacionalmente ligado ao DNA que codifica um polipeptídeo caso este seja expresso na forma de pré proteína que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou amplificadores (enhancers) é operacionalmente ligado a uma seqüência de codificação caso afete a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossomos é operacionalmente ligado a uma seqüência de codificação caso seja posicionado de forma a possibilitar a tradução. Geralmente, “operacionalmente ligado” indica que as seqüências de DNA ligadas são contíguas e, no caso do líder de secreção, contíguas e estão no quadro de leitura. Os amplificadores, entretanto, não necessitam ser contíguos. A ligação é realizada por meio de ligação em sítios de restrição convenientes. Caso estes sítios não existam, adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou Iigantes são utilizados de acordo com a prática convencional. O termo "marcador" quando utilizado no presente refere-se a um composto ou composição, que está conjugado ou fundido direta ou indiretamente a um reagente, tal como uma sonda de ácido nucléico ou anticorpoe facilita a detecção de um reagente ao qual este é conjugado ou 5 fundido. O marcador pode ser detectável per se (por exemplo, marcadores radioisótopos ou marcadores fluorescentes), ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar uma reação química de um composto ou composição de substrato que se torna detectável.
Da forma utilizada no presente, o termo "imunoadesina" designa moléculas similares a anticorpos que combinam o domínio de ligação de uma proteína heteróloga (uma "adesina") com as funções efetoras de um domínio constante de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão da seqüência de aminoácido de adesina com a especificidade de ligação desejada que é diferente do reconhecimento de antígeno e sítio de ligação (sítio de combinação de um antígeno) de um anticorpo (ou seja, é "heterólogo") e uma seqüência de domínio constante de imunoglobulina. A parte adesina de uma molécula imunoadesina é tipicamente uma seqüência de aminoácido contigua compreendendo pelo menos um sítio de ligação a um receptor ou um ligante. A seqüência do domínio constante de uma imunoadesina pede ser obtida a partir de uma imunoglobulina, tal como os subtipos lgG-1, lgG-2, lgG-3, ou lgG-4,lgA (incluindo IgAI e lgA2) IgE, IgD ou IgM.
“Anticorpo para receptor DR6”, “anticorpo DR6”, ou “anticorpo anti-DR6” são usados no sentido amplo referindo-se aos anticorpos que se 25 ligam a pelo menos uma forma de um receptor DR6, preferencialmente um um receptor DR6 humano, tal como a seqüência DR6 exibida na Figura 1A ou uma seqüência do domíniò extracelular deste. Opcionalmente o anticorpo DR6 é fundido ou ligado a uma seqüência ou molécula heteróloga. Preferivelmente a seqüência heteróloga permite ou ajuda o anticorpo a formar uma ordem elevada ou complexos oligoméricos. O termo "anticorpo anti-DR6" e seus equivalentes gramaticais englobam especificamente os anticorpos monoclonais DR6 descritos na seção “Exemplos” abaixo. Opcionalmente, o anticorpo DR6 5 liga-se ao receptor DR6, mas não reage cruzadamente com nenhum outro receptor da família do fator de necrose tumoral adicional (por exemplo, DR4, DR5, TNFR1, TNFR2, Fas). Opcionalmente o anticorpo DR6 da presente invenção se liga a um receptor DR6a uma concentração de cerca de 0,067 nM a cerca de 0,033 μΜ, como medido em um ensaio de ligação BIAcore.
“Anticorpo para receptor APP”, “anticorpo APP”, ou “anticorpo
anti-APP” são usados no sentido amplo referindo-se aos anticorpos que se ligam a pelo menos uma forma de um receptor APP, preferencialmente um receptor APP humanb, tal como as isoformas de polipeptídeo APP especificamente descritas no presente. Preferencialmente, o anticorpo APP é 15 um anticorpo antagonista de DR6. Por exemplo, nos métodos de fabricação e/ou identificação dos antagonistas de DR6 assim como divulgado no presente, um ou mais isoformas de APP e/ou porção deste pode ser usada como um imunógeno para imunizar um animal (por exemplo, um camundongo, como parte de um processo para gerar um anticorpo monoclonal) e ou como uma 20 sonda para selecionar· uma biblioteca de compostos (por exemplo, uma biblioteca de anticorpos recombinantes). Polipeptídeos APP tipicamente úteis em exemplos de realização da presente invenção incluem os seguintes exemplos não-limitantés. Estas formas ilustrativas podem ser selecionadas para o uso em diversos exemplos de realização da invenção. Em algumas 25 realizações da invenção, o polipeptídeo APP compreende uma isoforma de APP de comprimento total como, por exemplo, as isoformas APP695 e/ou APP751 e / ou APP770 exibidas na FIG. 1. Em outras realizações da presente invenção, os polipeptídeos APP compreendem uma isoforma da APP processada pós-traducionalmente, por exemplo, um polipeptídeo APP que sofreu por uma clivagem pela secretase, tal como uma α-secretase, β- secretase ou um γ-secretase (por exemplo, fragmento N-terminal solúvel, tal como um sAPPa, εΑΡΡβ). Em realizações relacionadas da invenção, o 5 polipeptídeo APP pode ser selecionado para compreender um ou mais domínios específicos, tais como um ectodomínio N-terminal, (vide, por exemplo, Quast et al., FASEB J. 2003; 17 (12) :1739-41 ), um domínio ligado a heparina (vide, por exemplo, Rossjohn et al., Nat Struct Bioi 1999; 6 (4) :327- 31), um cobre tipo Il (vide, por exemplo, Hesse et al., FEBS Letters 349 (1 ): 10 109-116 (1994)) ou um domínio inibidor da protease Kunitz (vide, por exemplo, Ponte et al., Nature, 331 (6156) :525-7 (1988)). Em alguns exemplos de realização da presente invenção, o polipeptídeo APP inclui uma seqüência observada por compreender um epítopo reconhecido por um antagonista de DR6 divulgado no presente, tal como um anticorpo ou imunoadesina DR6, por 15 exemplo, aminoácidos 22-81 da APP695, uma seqüência que inclui os epítopo que são ligados pelo anticorpo monoclonal 22C11 (vide, por exemplo, Hilbich et al., Journal of Biological Chemistry, 268 (35): 26571-26577 (1993)). Em certos exemplos de realização da invenção, os polipeptídeos APP não incluem um ou mais domínios ou seqüências específicas, por exemplo, um polipeptídeo APP 20 que não inclui determinados aminoácidos N-terminal ou C-terminal (por exemplo, o polipeptídeo N-APP recombinante humano divulgado no Exemplo 12), um polipeptídeo APP que não inclui o domínio inibidor da protease Kunitz (por exemplo, APP695), ou um polipeptídeo APP que não inclui as seqüências da proteína beta amilóide (Abeta) doença de Alzheimer (por exemplo, εΑΡΡβ, 25 um polipeptídeo que não possui as seqüências A β40 e /ou Αβ42) (vide, por exemplo, Bond et al., J. Struct Biol. 2003; 141 (2) :156-70). Em outras realizações da invenção, um polipeptídeo APP utilizado em realizações da invenção compreende um ou vários domínios ou seqüências, mas não outros domínios ou seqüências, por exemplo, um polipeptídeo APP que compreende um polipeptídeo do ectodomínio N-terminal (ou pelo menos uma parte dele é observada por se ligar a um antagonista de DR6, tal como o anticorpo monoclonal 22C11), mas não um domínio ou seqüência que é C-terminal de 5 um ou mais sítios de clivagem da secretase como uma seqüência beta amilóide (Abeta) (por exemplo, uma sAPPa ou εΑΡΡβ) . Opcionalmente, o anticorpo anti-APP irá inibir a ligação do polipeptídeo APP ao DR6 e se ligará a um polipeptídeo APP em concentrações de 10 pg/ml a 50 pg/ml, conforme descrito no presente, e/ou como mesurado de maneira quantitativa em um ensaio de 10 ligação celular.
O termo "anticorpo" na presente invenção é utilizado no sentido mais amplo e abrange especificamente os anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais e anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) fõrmado'por pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos desde que exibam a atividade biológica desejada.
“Fragmentos de anticorpos” compreendem apenas uma porção de um anticorpo intacto, preferencialmente a compreendendo a região variável ou região de ligação com o antígeno deste. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab1 Fab’, F(ab’)2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares, 20 moléculas de anticorpos de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
“Anticorpos nativos” são normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 D, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a 25 uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto a quantidade de ligações dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isótopos de imunoglobulina. Cada cadeia leve e pesada também contém pontes dissulfeto intracadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (VH), seguido por um número de domínios constante. Cada cadeia leve contém um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia 5 pesada, e o domínio variável da cadeia leve é alinhado ao domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácidos específicos formam uma superfície intermediária entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada.
O termo 'Variável", refere-se ao fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem extensamente na seqüência entre os anticorpos e são utilizados na ligação e especificidade de cada anticorpo específico ao seu alvo principal. No entanto, a variabilidade não é uniformemente distribuída através dos domínios variável dos anticorpos. Elas estão concentradas em três segmentos denominados de regiões de determinação hipervariáveis ou de complementaridade em ambos os domínios variáveis tanto de cadeia leve quanto de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas de regiões estruturais (FRs). Os domínios variáveis de cada cadeia pesada e leve nativa contêm quatro regiões FRs, adotando em grande parte uma conformação de folha-β, ligadas por três regiões hipervariáveis, que formam alças de conexão e, em alguns casos fazem parte da estrutura em folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são unidas em estreita proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis de outras cadeias, contribuem para a formação do sítio de ligação ao alvo dos anticorpos (vide Kabat et al Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantefe não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas apresentam diferentes funções efetoras como, por exemplo, a participação do anticorpo na citotoxicidade mediada por células dependentes dos anticorpos (ADCC).
A digestão com papaína dos anticorpos produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, denominados fragmentos “Fab”, cada um com um sítio de ligação ao antígeno único, e um fragmento “Fc” residual, cujo nome 5 reflete sua capacidade de cristalizar rapidamente. O tratamento com pepsina gera um fragmento F(ab’)2 que possui dois sítios de ligação ao antífeno e ainda é capaz de reticular o antígeno.
"Fv" é o fragmento mínimo de anticorpo que contém um sítio completo de reconhecimento doantígeno e sítio de ligação ao antígeno. Esta 10 região é constituída por um dímero de um domínio variável de uma cadeia pesada e uma cadeiâ leve em uma associação firme, por ligação não- covalente. É nesta configuração que as três regiões hieprvariáveis de cada domínio variável interagem para formar o sítio de ligação ao antígeno sobre a superfície do dímero Vh-Vl. Coletivamente, os seis CDRs conferem a 15 especificidade de ligação ao alvo para o anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três regiõe hieprvariáveis específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e se ligar ao antígeno, embora com menor afinidade do que o sítio de ligação completo.
O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia
leve e o primeiro domínio constante (Ch1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos na extremidade cabóxi-terminal do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo um ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab’-SH é a designação da 25 presente invenção para o Fab’ em que o(s) resíduo(s) de cisteína(s) do domínio constante sustenta(m) pelo menos um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpos F(ab’)2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab’ que possuem uma região de articulação cisteínas entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos são também conhecidos.
As “cadeias leves” de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser classificadas em dois tipos claramente distintos, denominadas de kappa (k) e Iambda (λ), com base nas seqüências de aminoácidos de seus domínios constantes.
Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), os anticorpos podem ser classificados em diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA1 IgD1 IgE1 IgG e IgM, e muitas destas podem ainda ser divididas em sub-classes 10 (isotipos), por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem as diferentes classes de anticorpos são denominados, α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As estruturas da subunidade e configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv"
compreendem os domínios Vh e Vl de um anticorpo, no qual estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídica. Preferencialmente, os polipeptídeos Fv contem ainda uma ponte de ligação polipeptídica entre os domínios Vh e Vl, o que permite o scFv formar a estrutura necessária para sua 20 ligação ao antígeno. Para uma revisão de scFv vide, Plückthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Ed Rosenburg and Moore, Springer-Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315 (1994).
I
O termo “diacorpos” designa pequenos fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação de antígenos, que compreendem um domínio 25 variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável de cadeia leve (Vl) na mesma cadeia de polipeptídeo (Vh-Vl). Utilizando um Iigante que é curto demais para permitir o pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são obrigados a parear-se com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígenos. Os diacorpos são descritos de maneira mais completa, por exemplo, na patente EP 404.097 e no documento WO 93/11161 e Hollinger et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).
A expressão “anticorpo monoclonal”, da forma utilizada no
presente, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os 10 anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Além disso, ao contrário das preparações dos anticorpos convencionais (policlonais) que incluem diferentes anticorpos dirigidos a diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido a um único determinante sobre o antígeno. Além de sua especificidade, os 15 anticorpos monoclonais são vantajosos de modo que eles podem ser sintetizados por cultura de hibridomas, não contaminada por outras imunoglobulinas. O adjetivo “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea e não deve ser considerado como requerendo a produção do 20 anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, Os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler e Milstein, Nature 256, 495 (1975), ou podem ser feitos por métodos recombinantes (vide, por exemplo, Patente US 4.816.567). Os “anticorpos monoclonais” podem 25 também ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos de fagos, utilizando as técnicas descritas, por exemplo, em Clackson et ai, Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et ai, J. Moi Biol., 222:581-597 (1991).
Os anticorpos monoclonais da presente invenção incluem especificamente anticorpos “quiméricos” (imunoglobulinas), em que uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica, ou pertencente a uma classe ou subclasse específica de anticorpos, enquanto o 5 restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Patente US 4.816.567; Morrison et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos de 10 interesse no presente incluem anticorpos “primatizados”, que compreendem seqüências de ligação de antígenos de domínio variável derivadas de primatas não-humanos (por exemplo, Macacos do Velho Mundo, tal como babuíno, rhesus ou macaco cinomolgo) e seqüências da região constante humana (Patente US 5.693.780):
As formas “humanizadas” de anticorpos não-humanos (por
exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm uma seqüência mínima derivada da imunoglobulina não-humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais os resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos 20 de uma região hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpo doador), tal como camündongo, rato, coelho ou primata não-humano que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos 25 humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todas as FRs são as de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá de 5 pelo menos uma porção de uma região constante (Fe) de imunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide Jones et ai, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
A expressão “região hipervariável”, quando utilizada no presente, designa os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígenos. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos de uma “região de determinação de complementaridade” ou “CDR” (ou seja, resíduos 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31 a 35 (H1), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, Estados Unidos (1991)) e/ou os resíduos de uma “alça (Ioop) hipervariável” (ou seja, os resíduos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Resíduos da "região estrutural" ou "FR" são aqueles resíduos do domínio variável diferentes dos resíduos da região hipervariável assim como definido no presente.
Um anticorpo “que liga” a um antígeno de interesse é aquele capaz de se ligar ao antígeno com afinidade e/ou avidez suficiente para que o anticorpo seja útil como agente terapêutico ou diagnóstico direcionado a uma célula que expresse o antígeno.
Para as finalidades da presente invenção, “imunoterapia” refere- se a um método de tratar um mamífero (preferivelmente um paciente humano) com um anticorpo, de modo que o anticorpo pode ser um anticorpo não conjugado ou “nú” (naked), ou o anticorpo pode ser conjugado ou fundido a uma(algumas) molécula(s) ou agente(s) heterólogo(s), tais como um ou mais agentes citotóxicos, gerando desse modo um “imunoconjugado”.
Um anticorpo “isolado” é aquele que tenha sido identificado, separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir no uso diagnóstico ou terapêutico do anticorpo, e podem 10 incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não-proteináceos. Em realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) em mais de 95% em peso de anticorpo, conforme determinado através do método Lowry e, de preferência, em mais de 99% em peso; (2) até um grau suficiente para a obtenção de pelo menos 15 resíduos de seqüência de aminoácidos interna ou 15 N-terminal, pelo uso de um seqüenciador de copo de fiação (spinning cup)\ ou
(3) até a homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou rião- redutoras utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, coloração de prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinantes, desde que, pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não 20 esteja presente. Normalmente, entretanto, o anticorpo isolado será preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.
O termo "marcado" quando utilizado no presente refere-se a um polipeptídeo que é fundido a um "polipeptídeo marcador". O polipeptídeo marcador tem resíduos suficientes para fornecer um epítopo contra o qual um 25 anticorpo contra este pode ser feito ou para fornecer alguma outra função, tal como a capacidade de oligomerizar (por exemplo, como o que ocorre com peptídeos que possuem um domínio de zíperes de leucina), sendo ainda curto o suficiente para não interferir com a atividade do anticorpo ou polipeptídeo. O polipeptídeo marcador é também preferencialmente bastante singular a fim de que o anticorpo específico do marcador não reaja cruzadamente contra outros epítopos. Polipeptídeos marcadores adequados têm, em geral, pelo menos seis resíduos de aminoácido e, geralmente, entre cerca de 8 a cerca de 50 5 resíduos de aminoácidos (em certos exemplos de realização, entre cerca de 10 e 20 resíduos).
As expressões “receptor Fc” ou “FcR” são utilizadas para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de seqüência nativa. Além disso, um FcR preferido 10 é aquele que se liga a um anticorpo IgG (receptor γ) e inclui receptores das subclasses FcDRI, FcDRII e FcDRIlI, incluindo variantes alélicas e, alternativamente, formas divididas desses receptores. Os receptores FcGRII incluem FcDRIiA (um “receptor de ativação”) e FcDRIlB (um “receptor de inibição”), que possuem seqüências de aminoácidos similares que diferem, 15 principalmente, nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FcDRIIA contém uma unidade de ativação imuno-receptora baseada em tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcDRIIB contém uma unidade de inibição imuno-receptora baseada em tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático (vide Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 20 (1997)). FcRs são analisadas em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457- 92 (1991); Capel et ai, Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et ai, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Outras FcRs1 incluindo aquelas a serem identificadas no futuro, são englobadas pelo termo “FcR” no presente. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência 25 de IgGs maternos para o feto (Guyer et ai, J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et ai, J. Immunol. 24:249 (1994)). Os FcRs no presente inclui polimorfismos tais como o dimorfismo genético no gene que codifica o FcYRIIIa tendo por resultado um fenilalanina (F) ou uma valina (V) na posição 158 do aminoácido, situado na região do receptor que liga a IgGI. A homozigose da valina FcYRIIIa (FcYRIIIa-158V) demonstrou ter alta afinidade ao IgGI humano e mediou o ADCC in vitro relativo a homozigose da fenilalanina FcyRIIIa (FcYRIIIa-158F) ou aos receptores (FcYRIIIa-158F/V) heterozigotos.
O termo “poliol” quando usado no presente refere-se amplamente
aos compostos polihídricos do álcool. Os Polióis podem ser, por exemplo, qualquer polímero poli(óxido alquileno) solúvel em água, e podem ter uma cadeia linear ou ramificada. Os poliois preferidos incluem aqueles com substituições em uma ou mais posições da hidroxila com um grupo químico, tal 10 como um grupo alquila que tem entre um e quatro carbonos. Tipicamente, o poliol é um poli(alquileno glicol), preferivelmente poli(etileno glicol) (PEG). Entretanto, aqueles conhecedores da técnica reconhecem que outros polióis, como, por exemplo, poli(propileno glicol) e co-polímeros polietileno- polipropileno glicol, podem ser empregados usando a técnica para conjugação 15 descritas no presente para PEG. Os poliois incluem aqueles bem conhecidos na arte e aqueles disponíveis publicamente, como de fontes comercialmente disponíveis, tal com a Nektar® Corporation.
O termo “conjugado” é usado no presente de acordo com sua definição mais ampla para significar juntado ou ligado. As moléculas “conjugadas” agem ou operam como juntas.
A expressão “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade de um agente (por exemplo, antagonista de DR6) que é eficaz para prevenir, melhorar ou tratar o distúrbio ou condição em questão. Contempla-se que o antagonista DR6 da presente invenção será útil para 25 abrandar ou parar a progressão de doenças neurológicas degenerativas ou melhorar da reparação de células ou tecidos neuronais e ajudar no restabelecimento apropriado da função nervosa.
Os termos “tratando”, “tratamento” ou “terapia” são utilizados no presente para referir-se a uma terapia curativa, medidas profiláticas ou preventivas. Tratamento ou administração consecutive refere-se ao tratamento em uma base diária, pelo menos, sem interrupção no tratamento por um ou mais dias. Tratamento ou administração intermitente, ou tratamento ou 5 administração, em uma forma intermitente, se refere ao tratamento que não seja consecutivo, mas sim de natureza cíclica.
Conforme utilizado no presente, o termo "distúrbio" em geral refere-se a qualquer condição que possa se beneficiar pelo tratamento com os antagonistas de DR6 descritos no presente. Isto inclui doenças crônicas e agudas, bem como as condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão.
"Células ou tecidos Neuronais" referem-se de modo geral aos neurônios motores, intérneurônios, incluindo mas não limitados a neurônios comissurais, neurônios sensoriais, incluindo mas não limitados a neurônios 15 ganglionares da raiz dorsal, neurônios produtores de dopamina (DA) da substância nigra, neurônios estriatais (DA), neurônios corticais, neurônios do tronco encefálico, interneurônios da medula espinhal e neurônios motores, neurônios do hipocampo, incluindo mas não limitados a, neurônios piramidais CA1 do hipocampo, e neurônios do prosencéfalo. O conceito de células ou 20 tecidos neuronais destina-se no presente de fazer referência a células neuronais que consistem de um corpo celular, axônio(s) e dendrito(s), bem como ao(s) axônio(s) ou dendrito(s) que podem fazer parte de tais células neuronais.
O termo "distúrbio neurológico" é utilizado no presente para se referir a condições que incluem condições neurodegenerativas, lesões no tecido ou células neuronais caracterizadas pela disfunção do sistema nervoso central ou periférico ou por necrose e/ou apoptose das células ou tecidos neuronais, e danos a células ou tecidos neuronais associados com a privação de fatores tróficos. Exemplos de doenças neurodegenerativas incluem a esclerose lateral amiotrófica familiar e esporádica (ALS e FALS, respectivamente), doença de Parkinson familiar e esporádica, doença de Huntington (coréia de Huntington), doença de Alzheimer familiar e esporádica, 5 atrofia muscular espinhal (SMA), neuropatias ópticas, tais como glaucoma ou doença associada envolvendo degeneração da retina, neuropatia diabética, ou degeneração macular, perda auditiva devido à degeneração das células ou neurônios sensoriais dà orelha interna, epilepsia, paralisia de Bell, demência fronto-temporal com parkinsonismo ligada ao cromossomo 17 (FTDP-17), 10 esclerose múltipla, atrofia cerebral corical difusa, demência com corpos de Lewy, doença de Pick, doença da expansão de trinucleotídeos repetidos , distúrbios causados por prions, syndrome de Shy-Drager. Lesões ou dano de células ou tecidos neuronais pode ocorrer a partir de uma diversidade de causas que comprometem a sobrevivência dos neurônios ou bom 15 funcionamento das células ou tecidos, incluindo mas não se limitado a: lesão agudo e não aguda, por exemplo, condições isquêmicas que restringem (temporariamente ou permanente) o fluxo sangüíneo global e focal na isquemia cerebral (AVC); incisões ou cortes, por exemplo, ao tecido cerebral ou medula espinhal, lesões ou placas em tecidos neuronais; privação de fator(es) trófico(s) 20 necessário(s) para o crescimento e a sobrevivência das células; neurotoxinas, exposição a neurotoxinas ou agentes quimioterápicos, bem como incidentes a outros estados, como doenças metabólicas crônicas, como o diabetes ou disfunção renal.
Por "indivíduo" ou "paciente" refere-se a um único indivíduo para o qual a terapia é desejada, incluindo os seres humanos. Também tem a intenção de incluir como indivíduo qualquer paciente envolvido em ensaios de pesquisa clínica que não exibem qualquer sinal clínico da doença, ou pacientes envolvidos em estudos epidemiológicos, ou pacientes utilizados como controle. O termo “mamífero” inclui qualquer animal classificado como mamífero, inciuindo humanos, vacas, cavalos, cachorros e gatos. Em uma realização preferida da presente invenção, o mamífero é humano.
Il Materiais e Métodos Exemplares da Invenção Estudos anteriores examinaram o fenômeno de morte celular
durante o desenvolvimento do sistema nervoso (Hamburger et al., J. Neurosci., 1:60-71 (1981); Oppenheim, Ann. Rev. Neurosci., 14:453-501 (1991); 0'Leary et al., J. Neurosci., 6:3692-3705 (1986), Henderson et al., Nature, 363:266-270 (1993); Yuen et al., Brain Dev., 18:362-368 (1996)). Acredita-se que a morte de 10 células neuronais desempenha um papel importante no desenvolvimento e/ou progressão de diversas doenças neurológicas, tais como a esclerose lateral amiotrófica familiar e esporádica (ALS e FALS, respectivamente), doença de Parkinson familiar e esporádica, a doença de Huntington, doença de Alzheimer familiar e esporádica e atrofia muscular espinhal (SMA) (Price et al., Science, 15 282:1079-1083 (1998)).
Os requerentes da presente patente verificaram que o DR6, um membro da família do TNFR, é altamente expresso no sistema nervoso central embrionário e adulto, incluindo o córtex cerebral, hipocampo, neurônios motores e interneurônios da medula espinhal. Conforme descrito nos exemplos 20 a abaixo, os requerentes da presente invenção conduziram diversos ensaios experimentais para estudar se o DR6 pode des empenhar um papel como regulador da sobrevida ou morte nas células neuronais. Neurônios Comissurais dependem para sua sobrevivência do suporte trófico de um dos seus alvos intermédios, a placa ventral da medula espinhal. Em uma cultura de explante in 25 vitro, os requerentes verificaram que a inibição da expressão de DR6 por interferência de RNA bloqueou a degeneração axonal de neurônios comissurais. Anticorpos monoclonais anti-DR6 foram também testados em ensaios de sobrevida na medula espinhal dorsal, e determinou-se que a inibição da sinalização do receptor DR6 pelos anticorpos DR6 específicos 3F4.4.8; 4B6.9.7 e 1E5.5.7; preveniu a degeneração axonal dos neurônios comissurais nas culturas de explante in vitro. DR6 tem sido descrito na literatura por sinalizar através da ativação da JNK (Pan et al., supra 1998, Zhao 5 et al., supra 2001). Conseqüentemente, para investigar os papéis da sinalização DR6-JNK na degeneração axonal, ensaios de sobrevida em medula espinhal dorsal foram conduzidos, onde a via de sinalização JNK em neurônios comissurais foi bloqueáda por um peptídeo inibidor, L-JNK-I. Esta inibição da sinalização JNK bloqueia parcialmente a degeneração axonal nos ensaios de 10 sobrevida na medula espinhal dorsal. Assim, acredita-se que os sinais DR6 de degeneração dos processos axonais, ocorre pelo menos em parte, através da via JNK. Para entender melhor o papel fisiológico do DR6 na regulação da morte celular neuronal no desenvolvimento, a sinalização DR6 foi bloqueada por anticorpos anti-DR6 em um sistema cultura com o embrião inteiro. 15 Surpreendentemente, a inibição da sinalização de DR6 por certos anticorpos específicos para DR6, protegeu os neurônios da medula espinhal contra o desenvolvimento da morte celular de ocorrência natural neste sistema. Portanto, antagonistas de DR6, tais como anticorpos antagonistas de DR6, podem ser utilizados para reduzir a morte celular neuronal que ocorre em 20 doenças neurológicas, tais como doenças neurodegenerativas (por exemplo, ALS, SMA, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, FTDP-17, doença de Huntington) e acidente vascular cerebral. Para verificar se funciona o DR6 funciona como um receptor pró-apoptótico in vivo genuíno, os Requerentes da presente invenção analisaram os fenótipos de embriões DR6 knockouts em 25 estágio de desenvolvimento E 15.5. Em consonância com o papel proposto do DR6 como um regulador negativo da sobrevida das células neuronais, uma redução de aproximadamente 40% a 50% na morte celular neuronal foi detectada nas medulas espinhais e gânglios da raiz dorsal DR6 null, em comparação com as crias DR6 heterozigóticas controles.
Os requerentes também constataram surpreendentemente que a proteína precursora amilóide (APP) é um Iigante cognato do receptor DR6 e, além disso, que a APP ativa a degeneração axonal através do receptor DR6. A 5 proteína precursora amilóide foi previamente hipotetizada por desempenhar um papel, embora não totalmente compreendido, na doença de Alzheimer (Selkoe, J. Biol. Chem. 271:18295 (1996); Scheuner; et al., Nature Med. 2:864 (1996); Goate, et al., Nature 349:704 (1991)).
Acredita-se que os antagonistas de DR6 são particularmente úteis 10 no tratamento de diversas doenças neurológicas. A presente invenção, fornece conseqüentemente composições de antagonista de DR6 e métodos para inibir, bloquear ou neutralizar a atividade de DR6 em um mamífero que compreende a administração de uma quantidade eficaz do antagonista de DR6. Preferencialmente, a quantidade de antagonista DR6 empregada será uma 15 quantidade eficaz para bloquear a degeneração axonal e morte celular neuronal. Isto pode ser obtido de acordo, por exemplo, com os métodos descritos abaixo e nos exemplos.
Os antagonistas de DR6 que podem ser empregadas nos métodos incluem, mas não estão limitados a, imunoadesinas DR6 e/ou APP, 20 fusão compreendendo proteínas DR6 e/ou APP, formas de DR6 e/ou APP modificadas covalentemente, variantes de DR6 e/ou APP, proteínas de fusão destes, e anticorpos DR6 e/ou APP. Várias técnicas que podem ser empregadas para fabricar os antagonistas são descritos a seguir. Por exemplo, são descritos métodos e técnicas para a preparação de polipeptídeos DR6 e 25 APP. modificações adicionais dos polipeptídeos DR6 e APP, e anticorpos para DR6 APP também são descritos.
A invenção divulgada no presente tem uma variedade de exemplos de realização. A invenção fornece métodos para inibir a ligação do DR6 à APP compreendendo na exposição do polipeptídeo DR6 e/ou APP a um ou mais antagonistas de DR6 em condições nas quais a ligação do DR6 à APP é inibida. Realizações relacionadas da presente invenção fornecem métodos de inibição da ligação do polipeptídeo DR6 que compreende os aminoácidos 1- 5 655 da SEQ ID No: 1 e um polipeptídeo APP que compreende os aminoácidos 66-81 da SEQ ID No: 6 (por exemplo βΑΡΡβ), o compreendendo método na combinação dos polipeptídeos DR6 e dos polipeptídeos APP com um antagonista isolado que se liga a DR6 ou APP, de modo que o antagonista isolado é escolhido a partir de, pelo menos, um anticorpo que se liga a APP, 10 um anticorpo que se liga a DR6 e um polipeptídeo DR6 solúvel que compreende os aminoácidos 1-354 da SEQ ID No: 1; e o antagonista isolado é selecionado pela sua capacidade de inibir a ligação do DR6 e APP, de modo que a ligação do DR6 à APP seja inibida.
Opcionalmente em tais métodos, um ou mais dos antagonistas de DR6 são selecionados a partir de um anticorpo que se liga a DR6 (por exemplo, um anticorpo que se liga competitivamente a DR6 inibindo a ligação do anticorpo monoclonal 3F4.4.8, 4B6.9.7, ou 1E5.5.7 produzido pelas linhagens de células de hibridomas depositadas sob o número de acesso ATCC; PTA-8095, PTA-8094, ou PTA-8096, respectivamente), uma polipeptídeo DR6 solúvel que compreende os aminoácidos 1-354 da SEQ ID No: 1 (por exemplo, uma imunoadesina DR6), ou um anticorpo que se liga a APP (por exemplo, o anticorpo monoclonal 22C11). Em certas realizações da invenção, um antagonista de DR6 é um anticorpo que se liga DR6, anticorpo que se liga a APP ou polipeptídeo DR6 solúvel que está ligado a um ou mais polímeros não proteináceos s elecionados a partir do grupo constituído por polietileno glicol, polipropileno glicol, e polioxialquileno.
Em um exemplo de realização opcional destes métodos, o polipeptídeo DR6 é expresso na superfície celular de uma ou mais células de mamíferos (por exemplo, neurônio comissural célula nervosa sensorial ou uma céiuia nervosa motora) e se liga a um ou mais dos antagonistas de DR6 mencionados inibindo a ativação ou sinalização do DR6. Em uma dessas realizações da invenção, o método é realizado de maneira in vitro para inibir a 5 apoptose em uma ou mais células de mamífero que expressam DR6, de forma a melhorar o crescimento e/ou regeneração e/ou sobrevida das células neuronais em uma cultura de tecidos. A título de exemplo, tais antagonistas de DR6 são úteis como um aditivo in vitro para meios de tecidos, por exemplo, aqueles destinadas a propagar culturas de células neuronais. Em particular, 10 como é conhecida no estado de técnica, a propagação de certas culturas de células neuronais podem ser problemáticas devido à tendência de tais células se submeterem a apoptose. Algumas culturas de células neuronais, por exemplo, morrem na ausência de fatores exógenos como, por exemplo, fator de crescimento neural. A divulgação fornecida na presente invenção demonstra 15 que os antagonistas de DR6 podem ser utilizados nessas culturas de células neuronais para aumentar o crescimento celular e/ou regeneração e/ou sobrevida, por exemplo, de uma forma semelhante ao uso do fator de crescimento neural nessas culturas.
Em realizações adicionais da invenção, os métodos de inibição da 20 ligação do DR6 à APP pode ser realizada de maneira in vivo em um mamífero com uma condição ou distúrbio neurológico. Opcionalmente, a condição ou distúrbio é a esclerose lateral amiotrófica, doença de Parkinson, doença de Huntington ou doença de Alzheimer. Alternativamente, a condição ou distúrbio neurológico compreende uma lesão neuronal celular ou tecidual decorrente de; 25 acidente vascular cerebral, trauma do tecido cerebral ou da medula espinhal ou lesões no tecido neuronal..
Realizaçõés adicionais da presente invenção fornece métodos de tratamento de um mamífero, com uma condição ou distúrbio neurológico, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um ou mais antagonista DR6 ao mamífero mencionado. Normalmente, em tais métodos, um ou mais antagonistas de DR6 são selecionados a partir de um anticorpo que se liga a DR6, um polipeptídeo DR6 solúvel DR6 que compreende os 5 aminoácidos 1-354 da SEQ ID No: 1, e um anticorpo que se liga a APP. Em exemplos de realizações opcionais da presente invenção, a condição ou distúrbio é a esclerose lateral amiotrófica, doença de Parkinson, doença de Huntington ou doença de Alzheimer. Alternativamente, a condição ou distúrbio neurológico compreende uma lesão neuronal celular ou tecidual decorrente de; 10 acidente vascular cerebral, trauma do tecido cerebral ou da medula espinhal ou lesões no tecido neuronal.. Em vários exemplos de realização da presente invenção, um ou mais agentes terapêuticos é(são) administrado(s) ao mamífero mencionado. Em certas realizações ilustrativas da presente invenção, um ou mais agente(s) terapêutico(s) é(são) selecionado(s) a partir de 15 NGF, um inibidor da apoptose, um inibidor EGFR, um inibidor de β-secretase, um inibidor de γ-secretase, um inibidor da colinesterase, um anticorpo anti- Abeta e um antagonista do receptor NMDA. Opcionalmente a um ou mais antagonistas de DR6 e/ou agentes terapêuticos adicionais é(são) administrado(s) para o mamífero através de injeção, infusão ou perfusão.
Ainda em realizações adicionais da presente invenção fornecem
métodos para identificação de uma molécula de interesse que inibe a ligação do DR6 à APP, compreendendo o método em: combinar DR6 e APP, na presença ou ausência de uma molécula de interesse; e detectar a inibição da ligação do DR6 à APP na presença da molécula de interesse mencionada. 25 Realizações relacionadas da presente invenção fornece métodos para determinar se uma composição modula a ligação entre um polipeptídeo DR6 compreendendo os aminoácidos 1-655 da SEQ ID No: 1 (e, opcionalmente, aminoácidos 1-354 da SEQ ID NO: 1) e o polipeptídeo APP compreendendo os aminoácidos 66-81 da SEQ ID No: 6 (por exemplo: ΑΡΡβ95, sAPPa ou sAPPp), compreendendo o método em combinar a composição com DR6 e APP, e então comparar a ligação entre DR6 e APP, na presença da composição com a ligação entre DR6 e APP, na ausência da composição, de modo a determinar 5 se a composição modula a ligação entre DR6 e APP. Opcionalmente, as diferenças na ligação em tais métodos são mensuradas através da tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR) (como por exemplo, disponível pela Biacore Life Sciences). Realizações da presente invenção incluem ainda uma molécula de interesse que é identificada de acordo com esses métodos.
Outras realizações da presente invenção incluem métodos para
diagnosticar urin paciente com um distúrbio neurológico ou um paciente suscetível a um distúrbio neurológico, compreendendo o método em obter uma amostra do paciente e examinar a amostra para a presença de uma variante polipeptídeo DR6 variante tendo a seqüência polipeptídica que difere da 15 seqüência do polipeptídeo DR6 da SEQ ID No: 1. Opcionalmente os métodos compreendem adicionalmente a identificação do polipeptídeo variante que possui uma afinidade a um polipeptídeo APP que difere da afinidade observada para a seqüência polipeptídicas do DR6 da SEQ ID No: 1. Realizações relacionadas da presente invenção incluem métodos para determinar se um 20 polipeptídeo DR6 variante composto dos aminoácidos 1-655 da SEQ ID No: 1 está presente em um mamífero, o método compreende em comparar a seqüência de um polipeptídeo DR6 expresso com a SEQ ID No: 1 nos mamíferos, a fim de determinar se uma polipeptídeo variante de DR6 está presente no mamífero. Algumas realizações destes métodos podem incluir uma 25 etapa adicional de identificação de um polipeptídeo variante observada por estar presente em um mamífero como um Iigante APP variante, onde um Iigante APP variante é caracterizado como tendo uma afinidade de ligação para um polipeptídeo da proteína precursora amilóide (APP) compreendendo os aminoácidos 66-81 da SEQ ID No: 6 (por exemplo: APP695, sAPPa ou sAPPp), que é diferente aa afinidade de ligação do polipeptídeo DR6 compreendendo a SEQ ID No: 1 para um polipeptídeo APP compreendendo os aminoácidos 66- 81 da SEQ ID No: 6. Opcionalmente, as diferenças de afinidade de ligação em 5 tais métodos são mensuradas através da tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR) (como por exemplo, disponível pela Biacore Life Sciences). Algumas realizações destes métodos podem incluir a etapa de seleção do paciente como um indivíduo possuindo um sintoma ou condição observada na esclerose lateral amiotrófica, doença de Parkinson, a doença de 10 Huntington ou a doença de Alzheimer.
Além disso, a seqüência nativa dos polipeptídeos DR6 e APP de comprimento total descritas no presente, é contemplada de modo que polipeptídeos DR6 e/ou APP variantes podem ser preparados. DR6 e/ou APP variantes podem ser preparados através da introdução de nucleotídeos 15 modificantes apropriados no DNA codificador, e/ou pela síntese do polipeptídeo desejado. Aqueles hábeis no assunto irão apreciar que as modificações no aminoácido pode alterar processos pós-traducionais dos polipeptídeos DR6 e/ou APP, tal como a mudança no número ou a posição de sítios de glicosilação ou alteração das características de ancoragem na membrana.
Variações nos polipeptídeos DR6 e/ou APP descrito no presente,
podem ser feitos, por exemplo, utilizando qualquer uma das técnicas e orientações para mutações conservadoras e não-conservadoras estabelecidas, por exemplo, na Patente US No. 5,364,934. Variações podem ser uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais códons que codificam o 25 polipeptídeo que resulta em uma mudança na seqüência de aminoácidos, em comparação com a seqüência de polipeptídeos nativos. Opcionalmente a variação é por substituição de pelo menos um aminoácido com qualquer outro aminoácido em um ou mais dos domínios de polipeptídeos DR6 e/ou APP. A orientação na determinação de qual resíduos de aminoácidos pode ser inserido, substituído ou deletado sem afetar a atividade desejada pode ser encontrada através da comparação da seqüência do polipeptídeo DR6 com as moléculas de proteínas homólogas conhecidas e desta forma minimizando o 5 número de alterações efetuadas na seqüência de aminoácidos nas regiões de alta homologia. Substituições de aminoácidos podem ser o resultadas da substituição de um aminoácido por outro aminoácido com estruturas e/ou propriedades químicas similares, tais como a substituição de uma Ieucina por uma serina, isto é, substituições conservadoras de aminoácidos. Inserções ou 10 deleções podem opcionalmente ocorrer entre cerca de 1 a 5 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada por inserções, deleções ou substituições de aminoácidos realizadas sistematicamente na seqüência; e testando o resultado para verificar a atividade antagonística do DR6 e/ou APP.
Fragmentos de polipeptídeos DR6 e/ou APP são fornecidos no 15 presente. Tais fragmentos podem ser truncados na extremidade N-terminal ou C-terminal, ou pode faltar resíduos internos, por exemplo, quando comparado com uma proteína nativa de comprimento total. Alguns fragmentos carecem de resíduos de aminoácido que não são essenciais para o desenvolvimento da atividade biológica dos polipeptídeos DR6.
Fragmentos de polipeptídeos DR6 e/ou APP podem ser preparados por
qualquer um dentre uma série de técnicas convencionais. Fragmentos de peptídeos desejados pòdem ser sintetizados quimicamente. Uma abordagem alternativa envolve a geração de fragmentos de polipeptídeos por digestão enzimática, por exemplo, tratando as proteínas com uma enzima conhecida por 25 clivar proteínas em locais definidos pelos resíduos de aminoácidos específicos, ou por digestão do DNA com enzimas de restrição adequadas e deste modo, isolando o fragmento desejado. Outra técnica adequada envolve o isolamento e a amplificação de um' fragmento de DNA que codifica um fragmento de polipeptídeo desejado, por reação em cadeia da polimerase (PCR). Oligonucieoíídeos, que definem os términos desejados do fragmento de DNA são empregados no prímers 5 'e 3' na PCR.
Em realizações específicas, as substituições conservadoras de 5 interesse são exibidas na tabela abaixo sob o título de substituições preferidas. Se tais substituições resultarem em uma mudança na atividade biológica, neste caso mais mudanças substanciais, denominadas substituições exemplares na Tabela, ou como descritas mais abaixo em referência às classes de aminoácidos, são introduzidos e os produtos são selecionados.
Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições Preferidas Ala (A) Vai; Leu; Ile Val Arg (R) Lis; Gin; Asn Lis Asn (N) Gin; His; Asp1 Lis; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gin; Lis; Arg Arg He (I) Leu; Vai; Met; Ala; Leu Fen; Norleucina Leu (L) Norleucina; lie; Vai; Ile Met; Ala; Fen Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg Met (M) Leu; Fen; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Vai; lie; Ala; Tir Tir Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições Preferidas Pro (P) Ala Ala Ser (S) Tre Tre Thr (T) Vai; Ser Ser Trp (W) Tyr; Fen Tir Tyr (Y) Trp; Fen; Tre; Ser Fen Val (V) lie; Leu; Met; Fen; Leu Ala; Norleucina Modificações substanciais na função ou identidade imunológica dos polipeptídeos DR6 e/ou APP são atingidas através da seleção de substituições que diferem significativamente em seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, por 5 exemplo, na forma de folha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral:
(1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ile (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: Asn, Gln1 His, Lys, Arg;
(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro1 e
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Substituições não-conservadoras causarão a substituição de um
membro de uma dessas classes por outra classe. Tais resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos locais conservados da substituição ou, mais preferivelmente, nos locais (não-conservados) restantes. As variações podem ser feitas usando métodos conhecidos no estado da técnica como, por exemplo, a mutagênese mediada por oligonucleotídeos (sítio dirigidos), exploração da alanina e a mutagênese dirigida por PCR. Mutagênese local dirigida [Carter et al., Nucl. Acids Res., 5 13:4331 (1986); Zoller et ai, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], cassete mutagênese [Wells et ai, Gene, 34:315 (1985)], mutagênese de seleção e limitação [Wells et ai, Philos. Trans. R. Soe. London SerA, 317:415 (1986)] ou outras técnicas conhecidas podem ser executadas no DNA clonado para produzir o DNA variante do polipeptídeo DR6.
A análise de seleção do aminoácido pode também ser empregada
para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma seqüência contígua. Entre a seleção de aminoácidos preferidos estão os aminoácidos neutros relativamente pequenos. Tais aminoácidos incluem a alanina, glicina, serina, e a cisteína. A alanina é tipicamente o aminoácido de seleção preferido entre 15 este grupo porque elimina a cadeia lateral além do carbono beta é menos provável alterar a conformação da cadeia principal do variante [Cunningham e Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. A alanina é preferida também tipicamente porque é o aminoácido o mais comum. Além disso, encontra-se freqüentemente em posições enterradas e expostas [Creighton, The Proteins, 20 (W.H. Freeman & Co.I N.Y.); Chothia, J. Moi Biol., 150:1 (1976)]. Se a substituição da alanina não render quantidades adequadas de variantes, um aminoácido isotérico pode ser usado.
Qualquer resíduo da cisteína não envolvida na manutenção da conformação apropriada dos polipeptídeos DR6 e/ou APP também pode ser 25 substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e para impedir ligações cruzadas aberrantes. Inversamente, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) aos polipeptídeos DR6 e/ou APP para melhorar sua estabilidade. Exemplos.de Realizações divulgados na presente invenção se aplicam a uma ampla variedade de polipeptídeos APP. Em certos exemplos de realização da presente invenção por exemplo, um APP é a APP isoforma 695, 750 ou 770 de comprimento total exibida nas Figuras 1B-1D. Em outras 5 realizações da invenção, a APP compreende uma porção N-terminal da APP contendo o ectodomínio APP e o qual é produzido a partir de um processamento do evento pós-traducional (por exemplo, sAPPa ou sAPPp). Opcionalmente, por exemplo, um APP podem incluir uma forma solúvel de uma isoforma da AAP 695, 750 ou 770 que resulta da clivagem por uma secretase, 10 por exemplo, uma forma solúvel da APP695 neuronal que resulta da clivagem pela β-secretase. Em uma realização específica, uma APP compreende os aminoácidos 20-591 da APP695 (vide, por exemplo, Jin et al., J. Neurosci., 14 (9): 5461-5470 (1994). Em outra realização da invenção, uma APP compreende um polipeptídeo tendo o epítopo reconhecido pelo anticorpo monoclonal 22C11 15 (por exemplo, com é disponível pela Chemicon International Inc., Temecula, CA, EUA). Opcionalmente, um APP inclui os resíduos 66-81 da APP695, uma região que contém o epítopo para o 22C11 (vide, por exemplo, Hilbrich, JBC vol. 268, n° 35: 26571-26577 (1993).
A descrição abaixo refere-se principalmente à produção de 20 polipeptídeos DR6 e/ou APP pela cultura células transformadas ou transfectadas com um vetor contendo o ácido nucléico que codifica o polipeptídeo DR6. É, obviamente, contemplado que métodos alternativos, que são bem conhecidos no estado da técnica, possam ser empregados para preparar os polipeptídeos DR6 e/ou APP. Por exemplo, a seqüência de 25 aminoácido apropriada, ou partes desta, pode ser produzida pela síntese direta de peptídeos utilizando técnicas de fase sólida [vide, por exemplo, Stewart et al. Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. A síntese de proteína In vitro pode ser realizada utilizando técnicas manuais ou por automação. A síntese automatizada pode ser realizada, por exemplo, utilizando um sintetizador Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA), utilizando as instruções do fabricante. Várias porções do polipeptídeo DR6 e/ou 5 APP pode ser sintetizado quimicamente de maneira separada e combinada utilizando métodos químicos ou enzimáticos para produzir o polipeptídeo DR6 e/ou APP desejado.
Os métodos e técnicas descritas são igualmente aplicáveis à produção de formas variantes de DR6 e/ou APP, formas modificadas de de DR6 e/ou APP e anticorpos DR6 e/ou APP .
1. Isolamento do Dna que Codifica os Polipeptídeos DR6 e/ou APP
O DNA que codifica as seqüências dos polipeptídeos DR6 e/ou APP pode ser obtido a partir de uma biblioteca de cDNA preparada a partir de um tecido em que acredita-se possuir tal seqüência e expresse este a níveis 15 detectáveis. Assim, a seqüência de DNA do polipeptídeos DR6 e/ou APP humano pode ser convenientemente obtida a partir de uma biblioteca dè cDNA preparada a partir de tecido humano. A seqüência do gene que codifica os polipeptídeos DR6 e/ou APP desejados pode também ser obtida a partir de uma biblioteca genômica ou através de procedimentos sintéticos conhecidos 20 (por exemplo, síntese de ácido nucléico automatizada).
As bibliotecas podem ser selecionadas com sondas (como oligonucleotídeos de pelo menos cerca de 20-80 bases) designadas para identificar o gene de interesse ou a proteína codificada pelo mesmo. A seleção da biblioteca genômica ou de cDNA com a sonda selecionada pode ser 25 realizada através do uso de procedimentos padrão, tal como descrito em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratóry Press, 1989).Um meio alternativo de isolar o gene que codifica o polipeptídeo DR6 é o uso da metodologia de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Técnicas para a seleção de uma biblioteca de cDNA são técnicas bem conhecidas. As seqüências de oligonucleotídeos selecionadas como 5 sondas devem ter um comprimento suficiente e devem ser suficientemente não-ambígüas, de forma que falso-positivos sejam minimizados. O oligonucleotídeo é preferencialmente marcado de forma que este possa ser detectado através dá hibridização do DNA na biblioteca a ser selecionada. Métodos de marcação são de técnicas bem conhecidas, e incluem o uso de 10 radio-marcadores como ATP marcada com P32, biotinilação ou marcação enzimática. Condições de hibridização, incluindo hibridização de estringência moderada e de alta estringência, são fornecidas em Sambrook et al., supra.
As seqüências identificadas em tais métodos de seleção de bibliotecas podem ser comparadas e alinhadas a outras seqüências 15 conhecidas, depositadas e disponibilizadas em base de dados públicos, como no GenBank, ou outras bases de dados privadas de seqüências. A identidade da seqüência (tanto em relação aos aminoácidos quanto em relação aos nucleotídeos), em regiões específicas da molécula ou no comprimento total das seqüências, pode ser déterminada utilizando métodos conhecidos no estado da 20 técnica e descritos no presente.
Ácidos nucléicos contendo a seqüência de codificação da proteína podem ser obtidos pela seleção de bibliotecas genômicas ou cDNA selecionado utilizando a seqüência de aminoácido deduzida, descrita no presente para a primeira etapa, e se necessário, utilizando procedimentos 25 convencionais de extensão por primers, como descrito em Sambrook et al., supra, para detectar e processar precursores e intermediários de RNAm que talvez não foram transcritos de forma reversa em cDNA.
2. Seleção E Transformação De Células Hospedeiras As células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com vetores de expressão ou clonagem descritos no presente para produção do polipeptídeo DR6 e/ou APP e cultivadas em meio nutriente convencional modificado de forma a estar apropriado para a indução de promotores, seleção 5 de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as seqüências desejadas. As condições de cultivo, tais como o meio, temperatura, pH e similares, podem ser selecionadas pelo técnico hábil no assunto sem experimentação indevida. Em geral, princípios, protocolos e técnicas práticas para maximizar a produtividade de culturas celulares podem ser encontrados 10 em Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook et ai, supra.
Os métodos de transfecção de células eucarióticas e transformação de células procarióticas são conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto, por exemplo, transfecções por; CaCI2, CaPO4, mediada por Iipossomo e 15 eletroporação. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é realizada através do uso de técnicas padrões apropriadas para tais células. O tratamento com cálcio que emprega o cloreto de cálcio, como descrito em Sambrook et al., supra, ou eletroporação, é geralmente utilizado para procariotos. A infecção com Agrobactenum tumefaciens é utilizada para 20 transformação de determinadas células vegetais, como descrito por Shaw et al,, Gene, 23:315 (1983) e pelo documento WO 89/05859 publicado em 29 de junho de 1989. Para células de mamíferos sem paredes celulares, o método de precipitação em fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, 52:456-457
(1978) pode ser empregado. Aspectos gerais de sistemas de transfecções de células hospedeiras de mamíferos foram descritos na Patente US 4.399.216. Transformações em leveduras são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Baet., 730:946 (1977) e Hsiao et al., Proe. Nati Acad. Sei. (USA), 76:3829 (1979). Entretanto, outros métodos para a introdução de DNA em células, tal como por micro injeção nuclear, eletroporação, fusão de protoplasto bacteriano com células intactas, ou policátions, tal como polibreno e poliornitina, também podem ser utilizados. Para diversas técnicas de transformação de células de mamíferos, vide Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) e Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).
Células hospedeiras apropriadas no presente para clonagem ou expressão de DNA em vetores incluem células eucarióticas superiores, procarióticas ou leveduras. Procariontes apropriados incluem, mas sem se limitar a: eubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos, 10 por exemplo, Enterobacteriaceae como E. coli. Várias linhagens de E. coli são disponíveis publicamente, tais como linhagem MM294 de E. coli K12 (ATCC
31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); linhagem W3110 de E coli (ATCC
27.325) e K5 772 (ATCC 53.635). Outras células hospedeiras procarióticas apropriadas incluem Enterobacteriaceae tais como Escherichia, E . coli, 15 Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, tal como, Salmonella typhimurium, Serratia, como, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli como B. subtilis e B. Iicheniformis (por exemplo, B. Iicheniformis 41P descrita no DD 266.710 publicada em 12 de Abril de 1989); Pseudomonas como P. aeruginosa, e Streptomyces. Ditos exemplos são apenas ilustrativos, e não 20 Iimitativos da presente invenção. A linhagem W3110 pode, por exemplo, ser modificada para causar uma mutação gênica nos genes que codificam proteínas endógenas para o hospedeiro, sendo que exemplos de ditos hospedeiros incluem linhagem 1A2 de E. coli W3110, que possui o genótipo tonA completo; linhagem 9E4 de E. coli W3110, que possui o genótipo tonA 25 ptr3 completo; linhagem 27C7 de E coli W3110 (ATCC 55.244), que possui o genótipo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac169 degP ompT karícompleto; linhagem 37D6 de E coli W3110, que possui o genótipo tonA ptr3 phoA E15 (argF- lac)169 degP ompT rbs7 ilvG karí completo; linhagem 40B4 de E coli de DNA em células, tal como por micro injeção nuclear, eletroporação, fusão de protopiasto bacteriano com células intactas, ou policátions, tal como polibreno e poliornitina, também podem ser utilizados. Para diversas técnicas de transformação de células de mamíferos, vide Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) e Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).
Células hospedeiras apropriadas no presente para clonagem ou expressão de DNA em vetores incluem células eucarióticas superiores, procarióticas ou leveduras. Procariontes apropriados incluem, mas sem se limitar a: eubactérias, tàis como organismos gram-negativos ou gram-positivos, 10 por exemplo, Enterobacteriaceae como E. coli. Várias linhagens de E. coli são disponíveis publicamente, tais como linhagem MM294 de E. coli K12 (ATCC
31.446); E coli X1776 (ATCC 31.537); linhagem W3110 de E coli (ATCC
27.325) e K5 772 (ATCC 53.635). Outras células hospedeiras procarióticas apropriadas incluem Enterobacteriaceae tais como Escherichia, E . coli, 15 Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, tal como, Salmonella typhimurium, Serratia, como, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli como B. subtilis e B. Iicheniformis (por exemplo, B. Iicheniformis 41P descrita no DD 266.710 publicada em 12 de Abril de 1989); Pseudomonas como P. aeruginosa, e Streptomyces. Ditos exemplos são apenas ilustrativos, e não 20 Iimitativos da presente invenção. A linhagem W3110 pode, por exemplo, ser modificada para causar uma mutação gênica nos genes que codificam proteínas endógenas para o hospedeiro, sendo que exemplos de ditos hospedeiros incluem Iihhagem 1A2 de E coli W3110, que possui o genótipo tonA completo; linhagem 9E4 de E coli W3110, que possui o genótipo tonA 25 ptr3 completo; linhagem 27C7 de E coli W3110 (ATCC 55.244), que possui o genótipo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac169 degP ompT karí completo; linhagem 37D6 de E coli W3110, que possui o genótipo tonA ptr3 phoA E15 (argF- lac)169 degP ompT rbs7 ilvG karí completo; linhagem 40B4 de E. coli W3110, que e linhagem 37D6 com uma mutação de deleção degP não-resistente a canamicina; e uma linhagem de E. coli que possui protease periplasmática mutante descrita na patente US 4.946.783 emitida em 7 de agosto de 1990. Alternativamente, métodos de clonagem in vitro, tal como, PCR ou outras reações polimerases de ácido nucléico, são apropriados.
Além disso, procariontes, micróbios eucariontes tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de expressão ou clonagem apropriados para vetores que codificam o polipeptídeo DR6. Saccharomyces cerevisiae é um microorganismo hospedeiro eucarionte inferior comumente utilizado. Outros microorganismos incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach e Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139.383 publicada em 2 de maio de 1985); hospedeiros Kluyveromyces (patente U.S. 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tal como, por exemplo, K. Iaetis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Baeteriol., 154(2):737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgarieus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:5259-5263
[1979]); Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538 publicada em 31 de Outubro de 1990); e fungos filamentosos tais como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicado em 10 de janeiro de 1991), e hospedeiros Aspergillus, tais como, A. nidulans 25 (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 1470-1474 [1984]) e Á. niger (Kelly e Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). Leveduras metilotróficas são apropriadas no presente e incluem, sem se limitar a, levedura capaz de crescer em metanol selecionada a partir dos gêneros: Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, e Rhodotorula. Um lista de espécies específicas que exemplificam esta classe de leveduras pode ser encontrada em C. Anthony, The Bioehemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
Células hospedeiras apropriadas para a expressão do polipeptídeo DR6 e/ou APP são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células invertebradas incluem células de insetos tais como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, bem como células vegetais, tais como 10 culturas celulares de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco. Foram identificadas numerosas linhagens baculovirais e variantes e células hospedeiras de insetos permissivas correspondentes de hospedeiros como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopietus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta), e Bombyx mori. Uma 15 série de linhagens virais para transfecção estão disponíveis publicamente, tais como, a variante L-1 de Autographa ealifomiea NPV e a linhagem Bm-5' de Bombyx mori NPV1 e ditos vírus podem ser utilizados como o vírus do presente de acordo com a presente invenção, em particular para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
Entretanto, há maior interesse em células de vertebrados, e
propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecido) se tornou um procedimento rotineiro. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são; linhagem CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (células 293 25 ou 293 subclonadas para crescimento em suspensão de cultura, Graham et al., J. Gen ViroL 36:59 (1977)); células de rim de hamster filhotes (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macacos (CV1 ATCC CCL 70); células de rim do macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células do fígado de ratos do 5 tipo buffalo (buffalo rat Iiver cells) (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).
As células hospedeiras são transformadas com os vetores de
expressão ou por vetores de clonagem como descrito acima para a produção do polipeptídeo DR6 e/ou APP e cultivadas em meio nutriente convencional modificado de forma a ser apropriado para a indução dos promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as seqüências desejadas.
3. Seleção e Uso de um Vetor Replicável
O ácido nucléico (tal como, cDNA ou DNA genômico) que codifica o polipeptídeo DR6 e/óu APP pode ser inserido em um vetor replicável para clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. Vários vetores estão 20 publicamente disponíveis. O vetor pode, por exemplo, estar na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula viral ou fago. A seqüência de ácido nucléico apropriada pode ser inserida no vetor através de uma série de procedimentos. Em geral, o DNA é inserido em sítio(s) de endonucleases de restrição apropriado pelo uso de técnicas conhecidas. Os componentes do vetor 25 geralmente incluem, mas não se limitam a, uma ou mais seqüências sinais, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento amplificador, um promotor e uma seqüência de finalização de transcrição. A construção de vetores apropriados que contém um ou mais dos componentes ditos emprega técnicas padrões de ligação que são conhecidas pelo técnico no hábil no assunto.
O DR6 e/ou APP pode ser produzido de forma recombinante não apenas diretamente, mas também como uma fusão de polipeptídeo com um polipeptídeo heterólogo, que pode ser uma seqüência sinal ou outro polipeptídeo que possui um sítio de clivagem específico no N-terminal da proteína ou um polipeptídeo maduro. Em geral, a seqüência sinal pode ser um componente do vetor, ou pode ser uma'parte do DNA que codifica o polipeptídeo do DR6 e/ou APP que é inserido no vetor. A seqüência sinal pode ser uma seqüência sinal procariótica selecionada, por exemplo, a partir do grupo de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou líderes de enterotoxina Il estáveis ao calor. Para a secreção em levedura a seqüência sinal pode ser, por exemplo, líder invertase de levedura, fator α líder (incluindo líderes fator α do Saccharomyces e Kluyveromyces, descrito na patente U.S. 5.010.182), ou fosfatase ácida líder, a glucomilase líder de C. albieans (EP 362.179 publicada em 4 de Abril de 1990), ou o sinal descrito no documento WO 90/13646 publicada em 15 de Novembro de 1990. Em expressão celular de mamíferos, as seqüências sinais de mamíferos podem ser utilizadas para secreção direta da proteína, tais como seqüências sinais de polipeptídeos secretados da mesma espécie, ou espécies relacionadas, bem como líderes de secreção viral.
Tanto os vetores de clonagem quanto os vetores de expressão contém uma seqüência de ácido nucléico que permite a replicação do vetor em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Tais seqüências são bem conhecidas para uma série de bactérias, leveduras e vírus. A origem de 25 replicação do plasmídeo pBR322 é apropriada para a maior parte das bactérias gram-negativas, a origem do plasmídeo 2μ é apropriada para levedura, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamíferos. Os vetores de clonagem e expressão irão conter, tipicamente, um gene de seleção, também denominado como marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, tal como ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, 5 (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes essenciais não disponíveis a partir do meio complexo, tal como, o gene que codifica D-alanina racemase para Bacilli.
Exemplos de marcadores de seleção apropriados para células de mamíferos são aqueles que permitem a identificação de células competentes que adiquerem o ácido nucléico que codifica o polipeptídeo DR6 e/ou APP, tal como DHFR ou timidina quinase. Uma célula hospedeira apropriada quando é utilizado o DHFR do tipo selvagem é a linhagem de células CHO deficiente na atividade de DHFR, preparada e propagada como descrito por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216 (1980). Um gene de seleção apropriado para uso em leveduras é o gene trpl presente no plasmídeo YRp7 de levedura [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. O gene trpl fornece um marcador de seleção para uma linhagem mutante de levedura que não apresenta a capacidade de crescer èm triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4- 1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
Vetores de expressão e clonagem normalmente apresentam um promotor operacionalmente ligado à seqüência de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo DR6 e/ou APP de forma a direcionar a síntese de RNAm. Promotores reconhecidos por uma série de células hospedeiras potenciais são 25 conhecidos. Os promotores apropriados para uso com hospedeiros procarióticos incluem os sistemas promotores da β-lactamase e Iactose [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36.776], e promotores híbridos tais como o promotor tac [deBoer et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:21-25 (1983)]. Promotores para uso em sistemas bacterianos também apresentarão uma seqüência Shine-Dalgarno (S.D.) operacionalmente ligada ao DNA que codifica o polipeptídeo DR6 e/ou APP.
Exemplos de seqüências promotoras apropriadas para uso em hospedeiros de leveduras incluem os promotores para 3-fosfogIicerato quinase [Hitzeman etal., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] ou outras enzimas glicolíticas [Hess et ai, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland1 Biochemistry, 10 17:4900 (1978)], tal como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato decarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase, e glicoquinase.
Outros promotores de levedura, que são promotores inducíveis 15 que possuem a vantagem adicional de transcrição controlada através de condições de crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas com metabolismo de nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e 20 galactose. Vetores e promotores apropriados para uso em expressão de levedura são descritos adicionalmente na patente EP 73.657.
A transcrição do polipeptídeo DR6 e/ou APP a partir de vetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir de genomas de vírus tais como polioma vírus, 25 fowlpox vírus (patente UK 2.211.504 publicada em 5 de Julho de 1989), adenovírus (tal como Adenovírus 2), papiloma vírus bovino, sarcoma vírus de aves, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e Vírus 40 de símios (SV40), através de promotores mamíferos heterólogos, tais como, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, e a partir de promotores de choque térmico (heat-shock), contanto que os ditos promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.
A transcrição de um DNA que codifica o polipeptídeo DR6 e/ou APP por eucariotos superiores pode ser aumentada através da inserção de uma seqüência enhancer no vetor. Amplificadores são elementos de atuação cis do DNA1 usualmente de cerca de 10 a 300 bp, que agem sobre o promotor para aumentar sua transcrição. Muitas seqüências enhancers são conhecidas a partir de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, alfa-fetoproteína, e insulina). Tipicamente, entretanto, pode-se utilizar um amplificador (θηήβηοβή de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o amplificador SV40 sobre o lado posterior (late side) da origem de replicação (bp 100-270), o amplificador anterior ao promotor do citomegalovírus, o amplificador do polioma sobre o lado posterior da origem de replicação, e amplificador do adenovírus. O amplificador pode sofrer splicing no vetor, na posição 5' ou 3' para a seqüência de codificação do polipeptídeo DR6 e/ou APP, no entanto, está preferencialmente localizado em um sítio 5' do promotor.
Vetores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (levedura, fungo, inseto, células vegetais, animais, humanas, ou 20 células nucieadas de outros organismos multicelulares) irão apresentar, adicionalmente, seqüências necessárias para a terminação da transcrição e para a estabilização do RNAm. Tais seqüências são comumente disponíveis a partir da extremidade 5', ocasionalmente 3', regiões não-traduzidas de DNAs ou cDNAs virais ou eucarióticos. Ditas regiões contém segmentos de 25 nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não- traduzida do RNAm que codifica polipeptídeo DR6.
Outros métodos, vetores, e células hospedeira apropriadas para a adaptação à síntese do polipeptídeo DR6 e/ou APP em cultura de células de vertebrados recombinante estão descritos em Gething et ai, Nature, 293:620- 625 (1981); Mantei et ai, Nature, 281:40-46 (1979); patente EP 117.060; e patente EP 117.058.
4. Cultura de Células Hospedeiras
As células hospedeiras utilizadas para a produção do
polipeptídeo DR6 e/ou APP da presente invenção podem ser cultivadas em uma série de meios. Meios comercialmente disponíveis tais como F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio Eagle Modificado da Dulbecco ((DMEM), Sigma) são apropriados para a cultura 10 de células hospedeiras. Além disso, qualquer meio descrito em Ham et ai, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et ai, Anal. BiochemA 02:255 (1980), patentes US 4.767.704; US 4.657.866; US 4.927.762; US 4.560.655; ou US 5.122.469; documento WO 90/03430; documento WO 87/00195; ou patente US Re. 30.985 pode ser utilizado como meio de cultura para as células hospedeiras. 15 Qualquer dos ditos meios podem ser suplementados conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tal como insulina, transferina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tal como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tal como a droga GENTAMYCIN®), 20 elementos traços (definidos como compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessário pode também ser incluído em concentrações apropriadas que serão conhecidas pelos técnicos conhecedores do assunto. A condições de cultura, tais como 25 temperatura, pH, e similares, são aquelas anteriormente utilizadas com a célula hospedeira selecionadâ para expressão, e serão evidentes para os técnicos conhecedores do assunto.
5. Detecção da Amplificação / Expressão Gênica A amplificação e/ou expressão gênica pode ser mensurada diretamente em uma amostra, por exemplo, através de Southern hlotting convencional, Northern blotting para quantificar a transcrição de RNAm [Thomas, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 77:5201-5205 (1980)], dot blotting 5 (análise de DNA), ou hibridização in situ, utilizando uma sonda marcada de forma apropriada, com base nas seqüências fornecidas no presente. Alternativamente, anticorpos que possam reconhecer duplexos específicos, incluindo duplexos de DNA, duplexos de RNA, duplexos híbridos de DNA-RNA ou duplexos DNA-proteína podem ser empregados. Os anticorpos podem ser 10 marcados e o ensaio pode ser realizado onde o duplexo se liga à superfície, de forma que pela formação do duplexo na superfície, a presença do anticorpo ligado ao duplexo pode ser detectado.
A expressão gênica, alternativamente, pode ser mensurada através de métodos imunológicos, tais como coloração por imuno-histoquímica 15 de células ou secções de tecidos e ensaio de cultura celular ou fluídos corporais, para quantificar diretamente a expressão do produto gênico. Anticorpos úteis para a coloração de imuno-histoquímica e/ou ensaio de amostras de fluídos podem ser tanto monoclonais quanto policlonais, e podem ser preparados em qualquer mamífero. De forma conveniente, os anticorpos 20 podem ser preparados contra uma seqüência do polipeptídeo DR6 nativa fornecida no presente ou contra um peptídeo sintético com base na seqüência do DR6 fornecida no presente ou contra uma seqüência exógena fundida ao DNA do DR6 e codificando um epítopo de anticorpo específico.
6. Purificação Do Polipeptídeo DR6 Formas do polipeptídeo DR6 e/ou APP podem ser recuperadas a
partir do meio de cultUra ou de Iisados de células hospedeiras. Se estes estiverem ligados à membrana, eles podem ser liberados da membrana utilizando uma solução detergente apropriada (tal como Triton-X 100) ou através da clivagem enzimática. As células empregadas na expressão do polipeptídeo DR6 podem ser rompidas por vários meios químicos e físicos, tais como ciclagem a frio (freeze-thaw cycling), sonicação, ruptura mecânica ou agentes de Iise celular.
Pode-se desejar purificar o polipeptídeo DR6 e/ou APP a partir de
proteínas ou polipeptídeos de células recombinantes. Os procedimentos a seguir são exemplos de procedimentos de purificação apropriados: através de fracionamento em uma coluna de troca iônica; precipitação em etanol, HPLC de fase reversa; cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica tal 10 como DEAE; cromatofocusação; SDS-PAGE; precipitação em sulfato de amônio; gel filtração utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A Sepharose para removér contaminantes tais como IgG; e colunas de quelação de metais para ligar formas marcadas dos epítopos do polipeptídeo DR6 e/ou APP. Vários métodos de purificação de proteína podem ser empregados e tais 15 métodos são de técnicas conhecidas e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). A etapa(s) de purificação selecionada dependerá, por exemplo, da natureza do processo de produção utilizado e do polipeptídeo DR6 específico produzido.
Formas solúveis de DR6 e/ou APP podem ser empregadas como
antagonistas DR6 nos métodos da invenção. Tais formas solúveis de DR6 e/ou APP podem compreender modificações, como descritas abaixo (como pela fusão a uma imunoglobulina, a um epítopo marcado ou zíper de leucina). As moléculas de imunoadesina são adicionalmente contempladas para uso nos métodos da presénte 25 invenção. As imunoadeslnas DR6 e/ou APP podem compreender várias formas de DR6 e/ou APP, tal como o polipeptídeo de comprimento total, bem como formas do domínio celular solúveis do DR6 e/ou APP ou fragmento deste. Em um exemplo de realização específica, a molécula pode compreender uma fusão do polipeptídeo DR6 com uma imunoglobulina ou uma região específica de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente de imunoadesina, tal fusão podia ser à região de Fc de uma molécula de IgG. As fusões de Ig incluem preferivelmente a substituição (domínio transmembrana suprimido ou inativado) de uma forma solúvel do 5 polipeptídeo no lugar de uma região variável dentro de uma molécula de lg. Em um exemplo específico de realização preferida, a fusão da imunoglobulina inclui as regiões de articulação, CH2 e CH3, ou CH1, CH2 e CH3 de uma molécula IgGI. Para a produção de fusões de imunoglobulina, vide também a patente US 5.428.130 concedida em 27 de junho de 1995 e Chamow et ai, TIBTECH, 14:52-60 10 (1996).
Um projeto opcional de imunoadesina, combina o(s) domínio(s) de ligação da adesina (por exemplo, um DR6 e/ou APP) com a região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Ordinariamente, ao preparar as imunoadesinas da presente invenção, o ácido nucléico que codifica o domínio 15 de ligação da adesina será C-terminal fundido ao ácido nucléico que codifica o N-terminal de uma seqüência do domínio constante da imunoglobulina, porém, fusões do N-terminal também são possíveis.
Tipicamente em tais fusões o polipeptídeo quimérico codificado reterá pelo menos a região de articulação funcionalmente ativa, os domínios Ch2 e Ch3 da 20 região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. As fusões são feitas também na extremidade C-terminal da fração Fc de um domínio constante, ou imediatamente no N-terminal ao Ch1 da cadeia pesada ou à região correspondente da cadeia leve. O local preciso em que a fusão é feita não é crítico; os locais específicos são bem conhecidos e podem ser selecionados a fim otimizar a 25 atividade biológica, a secreção ou as características de ligação da imunoadesina.
Em um exemplo de realização preferido, a seqüência do adesina é fundida ao N-terminal da região Fc da imunoglobulina Gi (IgGi). É possível fundir a região constante da cadeia pesada inteira à seqüência da adesina. Entretanto, mais preferivelmente, uma seqüência que começa na região de articulação apenas a montante do loca! de clivagem da papaína que define quimicamente a Fe do IgG (isto é, resíduo 216, ligado ao primeiro resíduo da região constante da cadeia pesada para a Ser 114), ou locais análogos de outras imunoglobulinas são usados na fusão. Em uma realização específica da presente invenção, a seqüência de aminoácido da adesina é fundida a: (a) a região de articulação e o CH2 e o CH3 ou (b) a região de articulação CH1, domínios Ch2 e Ch3, de uma cadeia pesada de IgG.
Para imünoadesinas biespecíficas, as imunoadesinas são montadas como múltimeros, e particularmente como heterodímeros ou heterotetrâmeros. Geralmente, estas imunoglobulinas montadas terão unidades estruturais conhecidas. Uma unidade estrutural básica de quatro cadeias é a forma encontrada em 'lgG, IgD1 e IgE. Uma unidade de quatro cadeias é repetida nas imunoglobulinas que possuem peso molecular mais elevado; a IgM existe geralmente como um pentámero de quatro unidades básicas unidas por ligações de bissulfeto. O globulina de IgA, e ocasionalmente a globulina IgG, pode também existir na forma multimérica no soro. No exemplo do multímero, cada uma das quatro unidades pode ser a mesma ou diferentes.
Várias imunoadesinas montadas exemplarmente dentro do escopo da presente invenção são diagramadas esquematicamente abaixo:
(a) ACl-ACl;
(b) ACh-(ACh, ACl-ACh, ACl-VhCh, or VlCl-ACh);
(c) ACl-ACh-(ACl-ACh, ACl-VhCh1 VlCl-ACh, or VlCl-VhCh);
(d) ACl-VhCh-(ACh, or ACl-VhCh, or VlCl-ACh);
(e) VlCl-ACh-(ACl-VhCh, or VlCl-ACh); e
(f) (A-Y)n-(VLCL-VHCH)2,
onde, cada A representa seqüências idênticas ou diferentes do aminoácido da adesina; Vl é um domínio variável da cadeia leve da imunoglobulina;
Vh é um domínio variávei da cadeia pesada da imunoglobulina;
Cl é um domínio constante da cadeia leve da imunoglobulina;
Ch é um domínio constante da cadeia pesada da imunoglobulina;
n é um inteiro maior que 1;
Y designa o resíduo de um agente reticulante covalente;
Nos interesses do presente, as estruturas apresentadas mostram somente as características chaves; elas não indicam junções (J) ou outros domínios de imunoglobulinas, nem exibem as ligações de bissulfeto. 10 Entretanto, quando esses domínios são necessários para a atividade de ligação, eles devem ser construídos de modo a estar presentes nos locais que normalmente ocupam nas moléculas de imunoglobulina.
Alternativamente, as seqüências da adesina podem ser introduzidas entre a cadeia pesada da imunoglobulina e as seqüências da 15 cadeia leve, de modo que seja obtida uma imunoglobulina que compreende uma cadeia pesada quimérica. Nesta realização, as seqüências da adesina são fundidas a extremidade 3’ de uma cadeia pesada de imunoglobulina em cada braço de uma imunoglobulina, tanto entre a região de articulação e o domínio Ch2, quanto entre os domínios Ch2 e Ch3. Construções similares foram 20 divulgadas por Hoogenboom et ai, Mol. Immunol., 28:1027-1037 (1991).
Embora a presença de uma cadeia leve da imunoglobulina não fosse necessária nas imunoadesinas da presente invenção, uma cadeia leve de imunoglobulina pôòde estar presente associada covalentemente a um polipeptídeo da cadeia pesada da fusão adesina-imunoglobulina, ou 25 diretamente fundida a adesina. No caso anterior, o DNA que codifica a cadeia leve da imunoglobulina é tipicamente co-expresso com o DNA que codifica a proteína de cadeia pesada da fusão adesina-imunoglobulina. Sobre a secreção, a cadeia pesada hibrída e a cadeia leve serão covalentemente associadas para fornecer umam estrutura parecida com imunoglobulina que compreende de duas cadeias pesadas de imunoglobulina ligadas por pontes de bissulfeto. Os métodos apropriados para a preparação de tais estruturas são divulgados, por exemplo, na patente US 4.816.567 emitida em 28 de março de 5 1989. Imunoadesinas são mais convenientemente construídas pela fusão das seqüência de cDNA que codificam o in-frame da parcela da adesina a uma seqüência do cDNA da imunoglobulina. Entretanto, a fusão aos fragmentos genomicos da imunoglobulina pode também ser usada (vide, por exemplo Aruffo et ai, Cell, 61:1303-1313 (1990); e Stamenkovic et al., Cell, 66:1133- 10 1144 (1991)). O último tipo de fusão requer a presença de seqüências regulatórias de Ig para a expressão. Os cDNAs que codificam as regiões constantes da cadeia pesada de IgG podem ser isoladas baseadas em seqüências publicadas das bibliotecas do cDNA derivadas do baço ou dos linfócitos do sangue periféricos, por hibridização ou pela técnica de reação em 15 cadeia da polimerase (PCR). Os cDNAs que codificam a “adesina” e as peças de imunoglobulina da imunoadesina são introduzidos no tandem em um vetor de plasmídeo que direciona a expressão eficiente nas células hospedeiras escolhidas.
Embora a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina não 20 seja necessária nas imunoadesinas da presente invenção, uma cadeia leve de imunoglobulina pode estar tanto associada covalentemente a um polipeptídeo de cadeia pesada da fusão adesina-imunoglobulina, quanto fundida diretamente a adesina. No caso anterior, o DNA que codifica a cadeia leve da imunoglobulina é tipicamente co-expresso com o DNA que codifica a proteína 25 de cadeia pesada da fusão adesina-imunoglobulina. Sobre a secreção, a cadeia pesada híbrida e a cadeia leve serão ligadas covalentemente para fornecer uma estrutura similar a imunoglobulina compreendendo duas cadeias pesadas de imunoglobulina ligadas por pontes de bissulfeto. Os métodos apropriados para a preparação de tais estruturas são divulgados, por exemplo, na Patente US 4.816.567 emitida em 28 de março de 1989. Imunoadesinas são mais convenientemente construídas pela fusão das seqüência de cDNA que codificam a porção in-frame da adesina a uma seqüência do cDNA da imunoglobulina. Entretanto, pode também ser utilizado a fusão aos fragmentos genômicos da imunoglobulina (vide, por exemplo Aruffo et ai, Cell, 61:1303-1313 (1990); e Stamenkovic et ai, Cell, 66:1133-1144 (1991)). O último tipo de fusão requer a presença de seqüências regulatórias de Ig para a expressão. Os cDNAs que codificam as regiões constantes da cadeia pesada da IgG podem ser isolados combase nas seqüências publicadas das bibliotecas de cDNA derivadas do baço, linfócitos do sangue periférico, por hibridização ou pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). Os cDNAs que codifica a “adesina” e as partes de imunoglobulina da imunoadesina são introduzidos no tandem em um vetor de plasmídeo que direciona a expressão eficiente nas células hospedeiras escolhidas. Em outra realização da presente invenção, o antagonista DR6 pode
ser covalentemente modificado pela ligação do polipeptídeo do receptor a um dentre uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, ou polioxialquilenos, do modo estabelecido pelas Patentes US 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ou 4.179.337, 20 ou outras moléculas similares, tais como, o poliglutamato. Tais formas peglicadas podem ser preparadas utilizando técnicas conhecidas.
As formas de zíper de Leucina destas moléculas são também contempladas pela invènção. “Zíper de leucina” é um termo usado na técnica para se referir a uma seqüência rica em leucina que realce, promova, ou dirija a 25 dimerização ou trimerização de seu parceiro de fusão (por exemplo, a seqüência ou molécula ao qual o zíper de leucina está fundida ou ligada). Vários polipeptídeos do zíper de leucina foram descritos no estado da técnica. Vide, por exemplo, Landschulz et al. Science, 240:1759 (1988); Patente US 5.716.805; documento WO 94/10308; Hoppe et al., FEBS Letters, 344:1991 (1994); Maniatis et al., Nature, 341:24 (1989). Os técnicos hábeis no técnica apreciarão que uma seqüência de zíper de leucina pode ser fundida e mambas as extremidade 5' ou 3' da molécula DR6.
Os polipeptídeos DR6 e/ou APP da presente invenção podem
também ser modificados de maneira a formar moléculas quiméricas pela fusão do polipeptídeo a um outro polipeptídeo ou seqüência de aminoácido heteróloga. Preferivelmente, tal polipeptídeo ou seqüência heteróloga de aminoácido é aquela que age oligomerizando a molécula quimérica. Em uma 10 realização da presente invenção, tal molécula quimérica compreende uma fusão do polipeptídeo DR6 e/ou APP com um polipeptídeo marcado que fornece um epítopo ao qual um anticorpo anti-polipeptídeo marcado possa se ligar seletivamente. O epítopo marcado é geralmente colocado na extremidade carbóxi ou amino-terminal do polipeptídeo. A presença de 15 destas formas de epítopo-marcado no polipeptídeo pode ser detectada pelo uso de um anticorpo contra o polipeptídeo marcado. Também, o fornecimento de um epítopo marcado permite com que o polipeptídeo seja rapidamente purificado por purificação por afinidade usando um anticorpo anti-epítopo marcado ou outro tipo de matriz de afinidade que se liga ao 20 epítopo marcado. Os vários polipeptídeos marcados e seus respectivos anticorpos são bem conhecidos no estado da técnica. Exemplos incluem marcadores poli-histidina (poli-his) ou poli-histidina-glicina (poli-his-gly); o polipeptídeo marcado flu HA e seu anticorpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Bioi, 8:2159-2165 (1988)]; os marcadores c-myc e seus antcorpos 8F9, 25 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 [Evan et ai, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; è o marcador de glicoproteína (gD) do Herpes vírus simples e seus anticorpos [Paborsky et ai, Protein Engineering, 3(6):547- 553 (1990)]. Anticorpos Anti-DR6 e Anti-APP
Em uma realização, a presente invenção fornece anticorpos DR6 e/ou APP. Anticorpos exemplares incluem anticorpos policlonal, monoclonal, humanizado, bispecífico e heteroconjugado. Estes anticorpos anti-DR6 e/ou anti- APP são preferencialmente anticorpos antagonistas de DR6.
1. Anticorpos Policlonais Os anticorpos da invenção podem compreender de anticorpos policlonais. Os métodos de preparação de anticorpos policlonais são bem conhecidos. Os anticorpos policlonais podem ser obtidos em um mamífero, por exemplo, por um ou mais injeção de agente imunizantes, e se desejado, de um adjuvante. Tipicamente, o agente imunizante e/ou o adjuvante serão injetados no mamífero por múltiplas injeções subcutâneas ou intraperitoneais. O agente imunizante pode incluir um polipeptídeo DR6 ou APP (por exemplo, um ECD do DR6 ou APP) ou uma proteína de fusão deste. Pode ser útil conjugar o agente imunizante a uma proteína conhecida por ser imunogênica no mamífero que é imunizado. Os exemplos de tais proteínas imunogênicas incluem, mas não são limitadas a, hemocianina (keyhole Iimpet hemocyanin), albumina do soro, a tiroglobulina bovina e o inibidor do tripsina de soja. Os exemplos dos adjuvantes que podem ser empregados incluem o adjuvante completo de Freund e o adjuvante MPL-TDM (monofosforil lipídio A, dicorinomicolato de trealose sintético). O protocolo do imunização pode ser selecionado por um técnico no assunto. O mamífero pode então ser sangrado, e o título de anticorpos no soro pode ser mensurado. Se desejado, o mamífero pode ser estimulado até que o título de anticorpo aumente ou chegue a um platô.
2. Anticorpos Monoclonais
Os anticorpos da invenção podem, alternativamente, ser anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais podem ser fabricados através do uso do método de hibridoma descrito por Kohler et al., Nature 256: 495 (1975). No método de hibridoma, um camundongo, hamster, ou outro animal hospedeiro apropriado, é tipicamente imunizado com um agente imunizante para gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligam de forma especifica a proteína utilizada para imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro.
O agente imunizante inclui tipicamente um polipeptídeo DR6 e/ou APP (por exemplo, um ECD do DR6 ou APP) ou uma proteína de fusão destas como, por exemplo, a proteína de fusão IgG-ECD DR6 ou APP.
Geralmente, outros linfócitos periféricos do sangue ("PBLs") são usados se as células de desejadas forem origem humana, ou células do baço ou Iinfonodos são usadas se forem desejadas células de mamíferos não humanos. Os linfócitos são fundidos em seguida com uma linhagem de células imortalizada, utilizando um agente de fusão apropriado, tal como o polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press (1986) págs. 59 -103). Linhagens de células imortalizadas são geralmente células de mamíferos transformadas, particularmente células de mielomas de roedores, bovinos e de origem humana. Geralmente, são utilizadas linhagens celulares de mieloma de ratos e camundongos. As células de hibridoma podem ser cultivadas em um meio de cultura apropriado que contém, preferencialmente, uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células imortalizadas não-fundidas. Por exemplo, se as células parentais não contenham a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência em HGPRT.
Células imortalizadas preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, apoiam a produção estável em alto nível de anticorpos pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. As linhagens de células imortalizadas mais preferidas são linhagens de mieloma murino que podem ser obtidas no caso pela Salk Institute Cell Distribution Center1 San Diego1 Califórnia, Estados Unidos, e American Type Culture 5 Collection, Manassas, Virginia. Um exemplo de tal linhagem de células de mieloma é P3X63AgU.1 (ATCC CRL 1580). Linhagens de células de mieloma humano e heteromieloma humano/camundongo também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); e Brodeur et ai, Monoclonal Antibody Production Techniques and 10 Applications, págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Estados Unidos, 1987)).
O meio de cultura em que são cultivadas células de hibridoma é testado para determinar a produção de anticorpos monoclonais contra o DR6 e/ou APP. Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorpos 15 monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada através de imunoprecipitação ou de um ensaio de ligação in vitro, tais como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoenzimático (ELISA). Tais técnicas e ensaios são conhecidos no estado da técnica. A afinidade de ligação do
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anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, através da análise de Scatchard descrita em Munson et ai, Anal. Biochem., 107: 220 (1980) ou por meio da análise BiaCore.
Após a identificação das células desejadas, os clones podem ser subclonados através da limitação de procedimentos de diluição e cultivados através de métodos padrão [Goding, supra]. Meios de cultura apropriados para 25 este propósito incluem, por exemplo, meio Dulbeeeo's Modified EagIe1S (D- MEM) ou RPMi-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo na forma de tumores de ascite em mamíferos.
Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser isolados ou purificados do meio de cultura, liquido ascítico por meio de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, tais como, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia por afinidade.
Os anticorpos monoclonais podem também ser feitos por métodos
de DNA recombinante, tais como aqueles descritos na patente US 4.816.567. O DNA codificador dos anticorpos monoclonais da invenção é facilmente isolado e seqüenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de se ligar, 10 especificamente, a genes codificadores das cadeias pesada e leve de anticorpos murinos). As células de hibridoma servem de fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida para células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de símios, células de ovário de hamster chinês (CHO) 15 ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de imunoglobulina para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O DNA pode também ser modificado, por exemplo, pela substituição das seqüências humanas do domínio constante das cadeias leve e pesada pelas seqüências murinas homólogas, Morrison et al., 20 Proc. Nat. Acad. Sei. 81, 6851 (1984) ou por meio de ligação covalente da seqüência codificadora de imunoglobulina, no todo ou em parte, com a seqüência codificadora para um polipeptídeo não-imunoglobulina. Deste modo, são preparados anticorpos “quiméricos” ou “híbridos” que possuem a afinidade de ligação específica de um anticorpo monoclonal anti-DR6.
Tipicamente polipeptídeos que não são imunoglobulinas são
substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo da invenção ou são substituídos pelos domínios variáveis de um sítio de combinação de antígeno de um anticorpo da invenção para criar um anticorpo bivalente quimérico contendo um sítio de combinação de antígeno que possui especificidade para o DR6 e outro sítio de combinação de antígeno que possui especificidade para um antígeno diferente.
Anticorpos quiméricos ou híbridos podem também ser preparados 5 de maneira in vitro, utilizando métodos conhecidos na química de proteínas sintéticas, incluindo aqueles que envolvem agentes reticulantes. Imunotoxinas, por exemplo, podem ser construídas utilizando uma reação de troca de dissulfeto ou através da formação de ligação tioéter. Exemplos de reagentes apropriados para este propósito incluem iminotiolato e metil-4- 10 mercaptobutirimidato.
Fragmentos Fv de cadeia simples podem também ser produzidos, tal como descrito em Iliades et al., FEBS Letters, 409: 437-441 (1997) O acoplamento desses fragmentos de cadeia simples utilizando vários Iigantes é descrito em Kortt et ai, Protein Engineering, 10: 423-433 (1997). Várias 15 técnicas para a produção e manipulação de anticorpos recombinantes são bem conhecidas no estado da técnica. Exemplos ilustrativos de tais técnicas que são tipicamente utilizadas pelos técnicos hábeis no assunto estão descritas abaixo com mais detalhes.
Anticorpos Humanizados
Geralmente, um anticorpo humanizado contém um ou mais
resíduos de aminoácidós nele introduzidos a partir de uma fonte não-humana. Esses resíduos de aminoácidos não-humanos são muitas vezes denominados resíduos “importados”, que são tipicamente retirados de um domínio variável “importado”. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o 25 método de Winter e colaboradores (Jones et ai, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et ai, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), atrâvés da substituição de seqüências CDR ou CDRs de roedores pelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Conseqüentemente, esses anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto tenha sido substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente 5 anticorpos humanos, em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.
É importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das seqüências parentais e diversos produtos humanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das seqüências parental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e familiares para os técnicos no assunto. São disponíveis programas de computador que ilustram e exibem prováveis estruturas de conformação tridimensional de seqüências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, ou seja, a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata ligar seu antígeno. Desta forma, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das seqüências importada e de consenso, de forma que seja atingida a característica desejada do anticorpo, tal como maior afinidade para o(s) antígeno(s) alvo(s). Geralmente, os resíduos de CDR são direta e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação de antígenos.
Anticorpos Humanos Os anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados através do método de hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano/de camundongos para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas, por exemplo, por Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984), e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Estados Unidos, 1987).
É agora possível produzir animais transgênicos (por exemplo,
camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Descreveu-se, por exemplo, que a deleção homozigótica do gene da região de ligação de cadeia pesada de anticorpos (Jh) em camundongos 10 quiméricos e mutantes de linhagem germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência do conjunto de genes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana nesses camundongos com mutação da linhagem1 germinativa resultará na produção de anticorpos humanos mediante desafio de antígenos. Vide, por exemplo, Jakobovits et al., 15 Proc. NatL Acad. Sei. U. S. A. 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993).
Mendez et al., (Nature Geneties 15: 146-156 (1997)) ampliaram adicionalmente a tecnologia e geraram uma linhagem de camundongos transgênicos denominada “Xenocamundongo II” que, quando 20 desafiada com um antígeno, gera anticorpos totalmente humanos de alta afinidade. Isso foi atingido pela integração em linhagem germinativa de Ioei de cadeia leve e cadeia pesada humana megabase em camundongos com deleção em segmento Jh endógeno, conforme descrito acima. O Xenocamundongo Il abriga 1020 kb de Ioeus de cadeia pesada humana 25 que contém cerca de 66 genes Vh, regiões Dh e Jh completas e 3 regiões constantes diferentes (μ, δ e χ) e também abriga 800 kb de Iocus κ humano que contém 32 genes Vk1 segmentos Jk e genes Ck. Os anticorpos produzidos nesses camundongos relembram de perto os observados em humanos em todos os aspectos, incluindo o rearranjo gênico, montagem e repertório. Os anticorpos humanos são preferencialmente expressos sobre anticorpos endógenos, devido à deleção no segmento Jh endógeno que evita o rearranjo gênico no Iocus murino.
Alternativamente, a tecnologia de exibição de fagos (McCaffertv et
al., Nature 348, 552-553 (1990)) pode ser utilizada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vitro a partir de repertórios de genes de domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não-imunizados. De acordo com esta técnica, os genes de domínio V de anticorpos são clonados 10 em quadro em um gene de proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos na forma de fragmentos de anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula de fago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fita simples do genoma de fagó, seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo 15 também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe essas propriedades. Desta forma, o fago imita algumas das propriedades da célula B. Assim, a exibição de fágos pode ser realizada de diversas formas; para sua revisão, vide, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Várias fontes de segmentos de 20 gene V podem ser utilizadas para exibição de fagos. Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991), isolaram um conjunto diverso de anticorpos anti- oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes
V derivados dos baçòs de camundongos imunizados. Pode ser construído um repertório de genes V de doadores humanos não-imunizados e, anticorpos 25 para um conjunto diverso de antígenos (incluindo autoantígenos) pode ser isolado, seguindo-se essencialmente as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol Biol. 222, 581-597'(1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993). Em uma resposta imunológica natural, os genes de anticorpos acumulam mutações em alta velocidade (hipermutação somática). Algumas das mudanças introduzidas conferirá afinidades mais altas e as células B que exibem imunoglobulina de superfície de alta afinidade são preferencialmente replicadas e diferenciadas durante desafio do antígeno subseqüente. Este 5 processo natural pode ser mimetizado empregando a técnica conhecida como “transferência de cadeias” (Marks et al., Bio/Technol. 10, 779-783 (1992)). Neste método, a afinidade de anticorpos humanos “primários” obtidos através de exibição de fago pode ser aprimorada através da substituição seqüencial dos genes da região V de cadeia leve e pesada com repertórios de variantes 10 de ocorrência natural (repertórios) de genes de domínio V obtidos a partir de doadores não-imunizados. Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos com afinidades na faixa nM. Uma estratégia de elaboração de repertórios de anticorpos de fagos muito grandes (também conhecida como “a mãe de todas as bibliotecas”) foi descrita por Waterhouse et 15 al., NueL Acids Res. 21, 2265-2266 (1993). A transferência de genes pode também ser utilizada para derivar anticorpos humanos a partir de anticorpos de roedores, em que o anticorpo humano possui afinidades e especificidades similares ao anticorpo de roedor inicial. De acordo com este método, que também é denominado “impressão de epítopos”, o gene de domínio V de 20 cadeia leve ou pesada de anticorpos de roedores obtido através da técnica de exibição de fagos é substituído com um repertório de genes de domínio V humanos, criando quimeras de roedores-humanos. A seleção sobre antígeno resulta no isolamentò de variável humana capaz de restaurar um sítio de ligação de antígenos funcional, ou seja, o epítopo governa (imprime) a escolha 25 do parceiro. Quando o processo for repetido, a fim de substituir o domínio V de roedor remanescente, é obtido um anticorpo humano (vide o pedido de patente PCT documento WO 93/06213, publicado em 1 de abril de 1993). Ao contrário da humanização tradicional de anticorpos de roedores através de enxerto de CDR, esta técnica fornece anticorpos completamente humanos, que não possuem resíduos de CDR ou estrutura de origem murina.
Como discutido abaixo, os anticorpos de acordo com a presente invenção podem compreender opcionalmente anticorpos monoméricos e 5 anticorpos diméricos, bem como formas multivalentes de anticorpos. Os técnicos no assunto podem construir esses dímeros ou formas multivalentes através de métodos conhecidos na técnica. Métodos de preparação de anticorpos monovalentes também são bem conhecidos na técnica. Um método envolve, por exemplo, a expressão recombinante de cadeia leve de 10 imunoglobulina e cadeia pesada modificada. A cadeia pesada geralmente é truncada em qualquer ponto da região Fc1 de forma a evitar a reticulação da cadeia pesada. Alternativamente, os resíduos de cisteína relevantes são substituídos com outro'resíduo de aminoácido ou são deletados, de forma a evitar a reticulação.
Anticorpos Biespecíficos
Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, preferencialmente humanos ou humanizados, que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. No caso atual, uma das especificidades de ligação é para o DR6 e a outra é para qualquer outro antígeno 20 e preferencialmente para qualquer receptor ou subunidade de receptor. Os métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias pesadas possuem especificidades 25 diferentes [Milstein e Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Devido à seleção aleatória de cadeias lève e pesada de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que normalmente é realizada através de etapas de cromatografia de afinidade, é um tanto problemática e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são descritos no documento WO 93/08829 (publicado em 13 de maio de 1993) e em Traunecker et al., EMBO 10, 3655-2659 (1991).
De acordo com uma abordagem diferente e, de maior preferência, domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de antígeno e anticorpo) são fundidos à seqüências de domínios constantes de imunoglobulina. A fusão ocorre preferencialmente com 10 um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiões de articulação, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se 15 desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são co-transfectados em um organismo hospedeiro apropriado. Isso proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos 3 fragmentos de polipeptídeos em realizações quando razões desiguais das três cadeias de polipeptídeos utilizadas na construção fornecem 20 os rendimentos ideais. É possível, entretanto, inserir as seqüências de codificação para 2 ou todas as 3 cadeias de polipeptídeos em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeos em razões iguais resultar em altos rendimentos ou quando as razões não foram de significância específica. Em uma realização preferida da presente invenção, 25 os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço, e um pár de cadeias leve e pesada de imunoglobulina híbrida (que fornece uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Descobriu-se que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, pois a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica fornece forma fácil de separação. Esta abordagem é descrita no documento WO 94/04690, publicado em 3 de março de 1994.
Para detalhes adicionais sobre a geração de anticorpos biespecíficos, vide, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
Anticorpos Heteroconjugados
Os anticorpos heteroconjugados também se encontram dentro do
escopo da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos ligados covalentemente. Esses anticorpos foram propostos, por exemplo, para direcionar células do sistema imunológico a células indesejadas (Patente US 4.676.980) e para o tratamento de infecções por HIV 15 (Documentos WO 91/00360 e WO 92/200373; e patente EP 03.089). Anticorpos heteroconjugados podem ser elaborados utilizando qualquer método de reticulação conveniente. Agentes reticulantes apropriados são bem conhecidos na técnica e são descritos na Patente US 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas reticulantes.
! Fragmentos de Anticorpo
Em certas realizações, o anticorpo anti-DR6 ou anti-APP (incluindo anticorpos murinos, humanos e humanizados e variantes de anticorpos) é um fragmento de anticorpo. Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram 25 derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide, por exemplo, Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24: 107-117 (1992) e Brennan et al., Science 229: 81 (1985)). Entretanto, estes fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos Fab1-SH1 por exemplo, podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al., Bio/Technoloav 10: 163-167 (1992)). Em outra realização, o F(ab’)2 é formado utilizando o zíper de leucina GCN4 para promover a montagem da molécula F(ab’)2. De acordo com outra abordagem, fragmentos Fv, Fab ou F(ab’)2 podem ser isolados diretamente de cultura de células hospedeiras recombinantes. Uma série de técnicas de produção de fragmentos de anticorpos será evidente para os técnicos no assunto. Pode-se realizar digestão, por exemplo, utilizando papaína. Exemplos de digestão de papaína encontram-se descritos no documento WO 94/29348, publicado em 22 de dezembro de 1994, e na Patente US 4.342.566. A digestão de anticorpos por papaína produz tipicamente 2 fragmentos de ligação de antígenos idênticos, denominados fragmentos Fab, cada qual com um único sítio de ligação de antígenos, e um fragmento Fc residual. O tratamento com pepsina gera um fragmento F(ab’)2 que contém 2 sítios de combinação de antígenos e ainda é capaz de reticular antígeno.
Os fragmentos Fab produzidos na digestão do anticorpo também contêm os domínios constantes da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHi) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab’ diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no carbóxi-terminal do domínio CHi de cadeia pesada, 20 incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab’-SH é a denominação do presente para Fab’, em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes contém um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab’)2 foram originalmente produzidos na forma de pares de fragmentos Fab’ que contêm cisteínas articuladas entre eles. Outros acoplamentos químicos de 25 fragmentos de anticorpos também são conhecidos.
Glicosilacões Variantes de Anticorpos Os anticorpos são glicosilados em posições conservadas nas suas regiões constantes (Jefferis e Lund, Chem. Immunol. 65: 111-128 (1997); Wright e Morrison, TibTECH 15: 26-32 (1997)). As cadeias laterais de oligossacarídeos das imunoglobulinas afetam a função da proteína (Boyd et al., Mol Immunol 32: 1311-1318 (1996); Wittwe e Howard1 Biochem. 29: 4175-4180 (1990)) e a interação intramolecular entre porções da glicoproteína que podem afetar a 5 confirmação e apresentaram superfície tridimensional da glicoproteína (Hefferis e Lund1 supra; Wyss e Wagner, Current Opin. Biotech. 7: 409-416 (1996)). Os oligossacarídeos podem também servir para dirigir uma dada glicoproteína a certas moléculas com base em estruturas de reconhecimento específicas. Relatou-se, por exemplo, que, em IgG agalactosilado, a fração de oligossacarídeo “sai” do espaço 10 inter- CH2 e os resíduos de N-acetilglucosamina terminais tornam-se disponíveis para se ligar à proteína de ligação da manose (Malhotra et al, Nature Med. 1: 237- 243 (1995)). A remoção por glicopeptidase dos oligossacarídeos de CAMPATH-1H (anticorpo IgGI monoclonal murino humanizado recombinante que reconhece o antígeno CDw52 de linfócitos humanos) produzidos em células de Ovário de 15 Hamster Chinês (CHO) resultou em uma redução completa em Iise mediada por complemento (CMCL) (Boyd et al., Mol. Immunol. 32: 1311-1318 (1996)), embora a remoção seletiva de resíduos de ácido siálico utilizando neuraminidase resultassem em ausência de perda de DMCL. Relatou-se que a glicosilação de anticorpos afeta a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Particularmente, relatou- 20 se que as células de CHO com expressão regulada por tetraciclina de β(1,4)-Ν- acetilglucosaminiltransferase IN (GnTIII), formação catalisadora de glicosiltransferase de GIcNAc em bisecção, possuem atividade ADCC aprimorada (Umana e al, Mature Biotech. 17: 176-180 (1999)).
Variantes de glicosilação de anticorpos são variantes em que o padrão de glicosilação de um anticorpo é alterado. Alteração indica a deleção de uma ou mais unidades carboidrato encontradas no anticorpo, adição de uma ou mais unidades carboidrato ao anticorpo, alteração da composição de glicosilação (padrão de glicosilação), extensão da glicosilação, etc. Variantes de glicosilação podem ser preparadas, por exemplo, através da remoção, modificação e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação na seqüência do ácido nucléico que codifica o anticorpo.
A glicosilação de anticorpos é tipicamente N-Iigada ou O-ligada. N- 5 ligada designa a ligação da unidade carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeos asparagina-X-serina e asparagina-X- treonina, em que X é qualquer aminoácido, com exceção de prolina, são as seqüências de reconhecimento para a ligação enzimática da unidade carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Por esta razão, a presença de qualquer dessas 10 seqüências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-Iigada designa a ligação de um dos açúcares N- acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser utilizadas.
A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente Dtida pela alteração da seqüência de aminoácidos, de forma que contenha uma „j mais das seqüências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração pode também ser feita através da adição de um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo original, ou substituição por estes (para sítios de glicosilação O-ligados).
A glicosilação (incluindo o padrão de glicosilação) de anticorpos
pode também ser alterada sem alterar a seqüência de nucleotídeos subjacente. A
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glicosilação depende, em grande parte, da célula hospedeira utilizada para expressar o anticorpo. Como o tipo de célula utilizado para a expressão de 25 glicoproteínas recombinantes, tais como anticorpos, como potenciais produtos terapêuticos raramente é a célula nativa, podem ser esperadas variações significativas do padrão de glicosilação dos anticorpos (vide, por exemplo, Hse et al., J. BioL Chem. 272: 9062-9070 (1997)). Além da seleção de células hospedeiras, os fatores que afetam a glicosilação durante a produção recombinante de anticorpos incluem o modo de crescimento, formulação dos meios, densidade da cultura, oxigenação, pH, esquemas de purificação e similares. Vários métodos foram propostos para alterar o padrão de glicosilação 5 atingido em um organismo hospedeiro específico, incluindo a introdução ou a sobre-expressão de certas enzimas envolvidas na produção de oligossacarídeos (Patentes US 5.047.335, US 5.510.261 e US 5.278.299). A glicosilação, ou certos tipos de glicosilação, pode ser removida enzimaticamente da glicoproteína, utilizando, por exemplo, endoglicosidase H (Endo H). Além disso, a célula 10 hospedeira recombinante pode ser elaborada geneticamente, tal como tornada defeituosa no processamento de certos tipos de polissacarídeos. Estes e outros métodos similares são bem conhecidos na técnica.
A estrutura de glicosilação de anticorpos pode ser facilmente analisada através de métodos convencionais de análise de carboidratos, 15 incluindo cromatografia de lectinas, NMR, espectrometria de massa, HPLC, GPC, análise da composição de monossacarídeos, digestão enzimática seqüencial e HPAEC-PAD, que utiliza cromatografia de troca aniônica de alto pH para separar os oligossacarídeos com base na carga. Também são conhecidos métodos de liberação de oligossacarídeos para propósitos 20 analíticos, que incluem, sem limitação, tratamento enzimático (comumente realizado utilizando peptídeo-N-glicosidase F/endo-p-galactosidase), eliminação utilizando ambiente alcalino severo para liberar principalmente estruturas O-Iigadas e métodos químicos que utilizam hidrazina anidra para liberar oligossacarídeos N e O-ligados.
Exemplos de Anticorpos
Conforme descrito nos Exemplos a seguir, os anticorpos monoclonais anti-DR6 foram identificados. Em realizações opcionais, os anticorpos DR6 da presente invenção terão as mesmas características biológicas como qualquer um dos anticorpos anti-DR6 e/ou APP especificamente divulgados na presente invenção.
O termo "características biológicas" é utilizada para referir-se à atividades ou propriedades in vitro e/ou in vivo do anticorpo monoclonal, tais como a capacidade de se ligar especificamente a DR6 ou bloquear, inibir ou neutralizar a ativação de DR6. As propriedades e atividades dos anticorpos DR6 e/ou APP estão adicionalmente descritas nos Exemplos a seguir.
Opcionalmente, os anticorpos monoclonais da presente invenção terão as mesmas características biológicas como qualquer um dos anticorpos 10 especificamente caracterizados nos exemplos abaixo, e/ou irão se ligar ao(s) mesmo(s) epítopo(s), assim como estes anticorpos. Isto pode ser determinado através de vários ensaios, tal como descrito no presente e nos Exemplos. Por exemplo, para determinar se um anticorpo monoclonal tem a mesma especificidade como os anticorpos DR6 e/ou APP especificamente referidos no 15 presente, pode-se comparar a atividade destes em um ensaio de ligação competitiva. Além disso, um epítopo ao qual um determinado anticorpo anti- DR6 e/ou APP se liga, pode ser determinado por um estudo de cristalografia do complexo entre DR6 e/ou APP e o anticorpo em questão.
Os anticorpos para DR6 e/ou APP, como descrito no presente, 20 possuirão preferencialmente a atividades antagonística desejada. Tais anticorpos DR6 podem incluir, mas não estão limitados a anticorpo quimérico, humanizado, humano e anticorpos maturados por afinidade. Como descritos acima, os anticorpos DR6 e/ou APP podem ser construídos ou projetados usando várias técnicas para se obter as atividades ou propriedades desejadas. 25 Realizações adicionais da presente invenção incluem um
anticorpo anti-réceptor DR6 e/ou Iigante APP descrito na presente invenção ao qual está ligado um ou mais polímeros não proteináceo selecionado do grupo constituído por polietileno glicol, polipropileno glicol, e polioxialquilenos. Opcionalmente o anticorpo anti-receptor DR6 e/ou Iigante APP descrito na presente invenção está glicosilado ou alternativamente, não glicosilado.
Os anticorpos da invenção incluem anticorpos DR6 e/ou APP “reticulados”. O termo “reticulado” usado no presente refere-se a ligação de 5 pelo menos duas moléculas de IgG unidas formando uma (ou única) molécula. Os anticorpos DR6 e/ou APP podem ser reticulados utilizando várias moléculas de ligação, preferencialmente os anticorpos DR6 e/ou APP são reticulados usando uma molécula de anti-lgG, complemento, modificada quimicamente ou por engenharia molecular. É apreciado pelos técnicos hábeis no assunto que o 10 complemento tenha uma afinidade relativamente elevada às moléculas de anticorpo uma vez que o anticorpo esteja ligado a superfície da membrana celular. Desse modo, ácredita-se que o complemento possa ser usado como uma molécula de reticulação entre dois ou mais anticorpos anti-DR6 ligados à superfície da membrana celular.
A presente invenção também fornece ácidos nucléicos isolados
que codificam anticorpos DR6 e/ou APP conforme descrito no presente, vetores e células hospedeiras que compreendem o ácido nucléico e técnicas recombinantes para a produção do anticorpo.
Para a produção recombinante do anticorpo, o ácido nucléico que o codifica é isolado e inserido em um vetor replicável para clonagem adicional
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(amplificação do DNA) ou para expressão. O DNA codificador do anticorpo é facilmente isolado e seqüenciado através da utilização de procedimentos convencionais (utilizando-se, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente a genes codificadores do 25 anticorpo). Muitos vexores são disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas sem limitar-se a, um ou mais dos seguintes: uma seqüência sinalizadora, origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento amplificador, um promotor e uma seqüência de término de transcrição.
Os métodos do presente incluem métodos para a produção de anticorpos anti-DR6 e/ou APP quiméricos ou recombinantes que compreendem as etapas de fornecimento de vetor que compreende uma seqüência de DNA 5 que codifica uma cadeia pesada ou cadeia leve de anticorpo anti-DR6 e/ou APP (ou ambas, cadeia leve e cadeia pesada), transfecção ou transformação de célula hospedeira com o vetor e cultura da(s) célula(s) hospedeira(s) sob condições suficientes para gerar o produto de anticorpo anti-DR6 e/ou APP recombinante.
Formulações dos Antagonistas de DR6.
Na preparação das formulações típicas da presente invenção, nota-se que a qualidade recomendado ou "grau" dos componentes empregados irão depender da utilização final da formulação. Para uso terapêuticos, é preferível que o(s) componente(s) seja(m) de um grau 15 admissível (como, por exemplo, "GRAS") como um aditivo para produtos farmacêuticos.
Em certas realizações da presente invenção, existem composições compreendendo antagonista(s) DR6 e um ou mais excipientes que oferecem força iônica suficiente para aumentar a solubilidade e/ou a 20 estabilidade do antagonista de DR6, onde a composição tem um pH de 6 (ou cerca de 6) a 9 (ou cerca de 9). O antagonista de DR6 pode ser preparado por qualquer método adequado para atingir o grau de pureza desejado da proteína, por exemplo, de acordo com os métodos acima. Em certas realizações, o antagonista de DR6 é expresso de maneira recombinante em células 25 hospedeiras ou preparados por síntese química. A concentração do antagonista de DR6 na formulação pode variar dependendo, por exemplo, da intenção de uso da formulação. Aqueles qualificados no estado da técnica podem determinar sem experimentação excessiva a concentração desejada do DR6 antagonista.
Um ou mais excipientes nas formulações que fornecem força
iônica o suficiente para aumentar a solubilidade e/ou estabilidade do antagonista de DR6 é opcionalmente um ácido poliônico orgânico ou inorgânico, aspartato, sulfato de sódio, sucinato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio, Captisol®, Tris , sal arginina ou outros aminoácidos, açúcares e polióis, tais como a trealose e sacarose. Preferencialmente, um ou mais excipientes nas formulações que fornecem força iônica suficiente é um sal. Sais que podem ser empregados incluem mas não estão limitados a; sais de sódio e sais de arginina. O tipo de sal empregado e a concentração do sal são preferencialmente tais que a formulação tem uma força iônica relativamente alta, permitindo que o antagonista de DR6 na formulação permaneça estável. Opcionalmente, o sal está presente na formulação a uma concentração de
cerca de 20 mivi a cerca de 0,5 M. A composição preferivelmente tem um pH de 6 (ou cerca de 6) a 9
(ou cerca de 9), mais preferencialmente cerca de 6,5 a cerca de 8.5, e mais preferencialmente ainda, cerca de 7 a cerca de 7,5. Em um aspecto preferido desta realização, a composição irá incluir ainda um tampão para manter o pH da composição a pelo menos, cerca de 6 a 8. Exemplos de tampões que podem ser empregados incluem, mas não estão limitados a; Tris, HEPES, e histidina. Quando é empregado Tris, o pH pode opcionalmente ser ajustado para cerca de 7 a 8,5. Quando é empregado o Hepes ou a histidina, o pH pode opcionalmente ser ajustado para cerca de 6,5 a 7. Opcionalmente, o tampão é empregado na formulação a uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de
50 mM.
Especialmente para formulações líquidas (ou formulações Iiofilizadas reconstituídas), pode ser desejável incluir um ou mais tensoativos na composição. Tais tensoativos podem, por exemplo, compreender um tensoativo não iônióo como TWEEN® ou PLURONICS® (por exemplo, poüssorbato ou poloxamero). Preferencialmente, o tensoativo compreende polisorbato 20 ("Tween 20"). O surfactante irá opcionalmente ser empregadas a uma concentração de cerca de 0,005% a cerca de 0,2%.
As formulações da presente invenção podem incluir, além do(s)
antagonista(s) de DR6 e os componentes descritos acima, vários outros excipientes ou componentes adicionais. Opcionalmente, a formulação pode conter, para a administração parenteral, um veículo farmaceuticamente ou parenteralmente aceitável, ou seja, aquela que não é tóxica para aqueles que a recebem nas dosagens e concentrações empregadas e é compatível com outros componentes da formulação. Opcionalmente, o veículo é um veículo parenteral, tal como uma solução que é isotônica com o sangue do receptor. Exemplos de tais veículos incluem a água, ou uma solução salina tamponada, tal como solução salina tamponada com fosfato (PBS), solução de Ringer, e solução de dextrose. Vários veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes opcionais estão descritos adicionalmente em Remington1S Pharmaceutical Sciences, 16 a edição, Ed. Osol, A. (1980).
Nas formulações da presente invenção existe também um ou mais conservantes. Exemplos incluem cloreto octadecildimetilbenzil de amônio, cloreto hexametônio, cloreto de benzalcônio (uma mistura de cloretos alquilbenzildimetilamônio em que os grupos alquílicos são compostos de cadeia longa), e cloreto de benzetônio. Outros tipos de conservantes incluem alcoóis aromáticos alquil parabenos, tais como metil ou propilparabeno e m- cresol. Antioxidantes incluem o ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto octadecildimetilbenzil de amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool butílico; alquil parabenos, tal como o metil ou propilparabeno,; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol e m-cresol); polipeptídéos de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como a albumina, gelatina ou imunoglobulina; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos como a glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo a glicose, manose ou dextrinas; açúcares como a sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; ou polietileno glicol (PEG).
As composições da invenção podem incluir formulações líquidas (soluções líquidas ou suspensões líquidas), e formulações liofilizadas, bem como formulações em suspensão.
A formulação final, se líquida, é preferencialmente armazenada congelada a < 20 0C. Alternativamente, a formulação pode ser Iiofilizada e fornecida como um pó para a reconstituição com água para injeção que opcionalmente pode ser armazenado a 2-30 0C.
A formulação a ser utilizada para administração terapêutica deve ser estéril. A esterilidade é facilmente obtida por filtração através de membranas de filtração estéril (por exemplo, membranas de 0,2 mícrons). Composições terapêuticas geralmente são colocados em um recipiente com um acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução intravenosa com uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.
A composição normalmente será armazenada em frascos de unidade única ou multi-dose, por exemplo, ampolas ou frascos vedados, como uma solução aquosa oü como uma formulação Iiofilizada para a reconstituição. Os recipientes podem ser quaisquer recipientes disponíveis no estado da técnica e preenchidos pelos métodos convencionais. Opcionalmente, a formulação pode ser incluída em um dispositivo de injeção do tipo caneta (ou um cartucho que se encaixa em um dispositivo do tipo caneta), como aqueles disponíveis no estado da técnica (vide, por exemplo, Patente US 5.370.629), que são adequados para a entrega das formulações terapêuticas. Uma solução injetável pode ser preparada pela reconstituição da formulação do antagonista de DR6 Iiofilizada utilizando, por exemplo, água para injeção.
Terapias Usando Antagonista(s) de DR6 Os antagonistas de DR6 da presente invenção tem várias utilidades. Antagonistas DR6 são úteis no diagnóstico e no tratamento de distúrbios neurológicos. O diagnóstico em mamíferos das diversas condições patológicas descritas no presente pode ser feita por um médico qualificado. Técnicas diagnosticas estão disponíveis no estado da técnica que permitem, por exemplo, o diagnóstico ou a detecção de vários transtornos neurológicos
em um mamífero.
Tratamento de distúrbios neurológicos contemplados pela presente invenção incluem; a esclerose lateral amiotrófica familiar e esporádica (ALS e FALS, respectivamente), a doença de Parkinson familiar e esporádica, a doença de Huntington, a doença de Alzheimer familiar e esporádica e a atrofia muscular espinhal (SMA) (Price et ai, supra). Muitas dessas doenças são tipificadas pelo aparecimento na idade meio adulta e leva a uma rápida degeneração de subgrupos específicos de neurônios dentro do sistema neural, resultando em morte prematura. A esclerose lateral amiotrófica (ALS) é a doença progressiva de neurônios motor mais comumente diagnosticada. A doença é caracterizada por degeneração de neurônios motores no córtex, tronco cerebral e medula espinhal (Siddique et ai, J. Neural Transm. Suppl., 49:219-233 (1997); Siddique et ai, Neurology, 47: (4 Suppl 2): S27-34; discussion S34-5 (1996); Rosen et ai, Nature, 362:59 - 62 (1993); Gurney et ai, Science, 264:1772-1775 1994)). A doença de Parkinson (paralisia agitans) é uma doença
neurodegenerativa comum que costuma aparecer da metade ao final da vida. Ocorrem casos familiares e casos esporádicos, embora casos familiares representam apenas 1-2 por cento dos casos observados. Os pacientes freqüentemente têm perda de células nervosas com gliose reativa e corpos de Lewy na substância negra e Iocus coeruleus do tronco cerebral. Como uma classe, os neurônios dopaminérgicos nigroestriatal parecem ser os mais afetados (Uhl et ai, Neurology, 35:1215-1218 (1985), Levine et al. Trends Neurosci., 27:691-697 (2004); Fleming et al., NeuroRx, 2:495-503 (2005)).
A atrofia muscular espinhal proximal (SMA) é uma doença neurodegenerativa autossômica recessiva em humanos tipicamente caracterizada pela perda de neurônios motores espinhais e atrofia dos músculos do tronco e membros (Monani et al. Hum. Moi Genet., 9:2451-2457 (2000); Monani et al., J. Cell Biol., 160:41-52 (2003)). Isto ocorre com uma freqüência de 1 para 10.000 pessoas e é a causa genética mais comum de mortalidade infantil. Com base na idade de início e gravidade do fenótipo da doença, as SMAs proximais foram classificadas em SMA tipo I (grave), tipo Il (intermediária) e tipo Ill (leve). Todas as três formas da doença são devido à perda ou mutação do gene de sobrevida dos neurônios motores telomérico (SMN1) (Monani et ai, supra, 2000; Monani et ai, supra, 2003)).
Perda de células neuronais tem sido relatada em uma série de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica (ALS) e atrofia muscular espinhal (SMA).
Opcionalmente, o diagnóstico da doença de Alzheimer em um paciente pode ser fèita com base nos critérios do Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (Diagnostic and Statistical Manual of Mental disorders), 4a Edição (DSM-IV-TR) (vide, por exemplo, American Psychiatrie Assoeiation. Diagnostie and Statistieal Manual of Mental disorders, 4a Edição do texto revisado. Washington, DC: 2000). Resumidamente, os critérios DSM-IV- TR incluem: (A) o desenvolvimento de múltiplos déficits cognitivos manifestados tanto por diminuição da memória e um ou mais dos seguintes: (1) afasia (2); apraxia; (3) agnosia, ou (4) perturbações no funcionamento executivo; (B)1 o déficit cognitivo representa uma diminuição no funcionamento e causa prejuízo significativo no funcionamento social ou profissional; (C) o curso é caracterizado por início gradual e declínio contínuo; (D) os déficits cognitivos não devido a outros do sistema nervoso central, sistêmico, induzida por substância ou condições que causam déficits progressivos na memória e cognição; e (E) a perturbação não é melhor representada por um outro distúrbio psiquiátrico. Alternativa critérios pelos quais o diagnóstico da doença de Alzheimer podem ser feitos incluem aqueles baseados no grupo de critérios do National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke- AIzheimer1S Disease and Related DisorderAssociation (NINDS-ADRDA) para a doença de Alzheimer (vide, por exemplo, McKhann et al. Neurology 1984; 34: 939-944). Resumidaménte, os critérios do NINCDS-ADRDA para possível doença de Alzheimer inclui uma síndrome demencial com uma manifestação atípica, apresentação ou progressão e sem uma etiologia conhecida onde qualquer doença co-mórbida capaz de produzir demência não é acredita como sendo a causa. Os critérios da NINCDS-ADRDA de provável doença de Alzheimer inclui demência estabelecida por exame clínico e neuropsicológicos e envolve (a) déficits progressivos em duas ou mais áreas da cognição, incluindo a memória, (bj início entre as idades de 40 e 90 anos, e (c) ausência de doenças sistêmicas ou outras doenças cerebrais capazes de produzir uma síndrome demencial, incluindo o delírio. Os critérios NINCDS-ADRDA para a doença de Alzheimer definitiva inclui o encontro de critérios para a doença de Alzheimer provável e com evidências histopatológicas da doença de Alzheimer através de autópsia ou biópsia.
O diagnóstico NINDS-ADRDA revisado foi proposto em Dubois et al. The Lancet Neurology, Volume 6, fascículo 8, de Agosto de 2007, páginas 734-746. Conforme descrito de forma sucinta, para atingir esse critérios de provável doença de Alzheimer, um indivíduo afetado devem cumprir um critério (o principal critério clínico) e pelo menos um ou mais dos critérios de suporte biomarcador descritos em B1 C, D ou E. Neste contexto, o critério A é caracterizado pela presença de uma perda de memória episódica rápida e significativa que inclui as seguintes características: (1) mudança gradual e progressiva na função da memória relatada pelos pacientes ou acompanhantes ao longo de mais de 6 meses; (2) evidências objetivas de perda de memória episódica significativas em testes: esta geralmente consiste de recordar que o déficit que não melhora significativamente ou não normalizar com testes de indicação ou reconhecimento e após a eficaz codificação da informação ter sido previamente controlada; (3), a perda de memória episódica pode ser isolada ou associada a outras alterações cognitivas no início da DA ou com o avanço da DA. Critério B é caracterizado pela presença de atrofia do lobo temporal mediai, como mostrado por exemplo pelo: volume de perda do hipocampo, córtex entorinal, amígdala evidenciada na MRI com classificação qualitativa utilizando escore visual (com referência a população bem caracterizada de acordo com idade) ou volumimetria quantitativa das regiões de interesse (com referência a população bem caracterizada de acordo com idade). Critério C é caracterizado por um biomarcador anormal de líquido cefalorraquidiano, por exemplo, baixas concentrações amilóide B1^2, aumento da concentração total de tau, ou aumento da concentrações de fosfo-tau, ou combinações dos três. Critério C é caracterizado por um padrão específico na neuro-imagem funcional com PET, por exemplo reduz o metabolismo da glicose nas regiões bilaterais parietais temporal. Critério E é caracterizado pela prova da mutação autossômica dominante da DA na família. A DA é considerada definitiva, se estiverem presentes os seguintes: (1) ambas as evidências clínicas e histopatológicos (biópsia cerebral ou necropsia) da doença, tal como exigido pelos critérios de NIA-Reagan para o diagnóstico post-mortem da DA; os critérios devem estar presentes ( vide, por exemplo,
Neurobiol Aging 1997: 18: - —'___3C β , .
' w^ w vw oiiiucjs as eviaencias clínicas e
genéticas (mutação no cromossomo 1, 14, ou 21) da DA; critérios devem estar presentes.
Nos métodos da presente invenção, o antagonista DR6 é
administrado preferencialmente ao mamífero em um veículo, de preferência um veículo farmaceuticamente aceitável. Veículos adequados e suas formulações estão descritos em Remington1s Pharmaceutical Sciences, 16. Ed., 1980, Mack Publishing Co., editado por Osol ef a/. Normalmente, uma' quantidade
ι adequada de um sal farmaceuticamente aceitável é utilizado na formulação para tornar a formulação isotônica. Exemplos de veículos incluem; salina, solução de Ringer e solução de dextrose. O pH da solução é preferencialmente de cerca de 5 a cerca He 8, e mais preferencialmente, cerca de 7 a cerca de 7,5. Outros veículos incluem preparações de liberação prolongada, tais como matrizes semipermeáveis de polímeros sólidos hidrofóbicos contendo o anticorpo, que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes, Iipossoma ou microcápsulas. Será evidente para as técnicos do assunto que alguns veículos podem ser preferíveis dependendo, por exemplo, da via de administração e da concentração de antagonista de DR6 sendo administrado.
O antagoriista de DR6 pode ser administrado ao mamífero por injeção (por exemplo, via intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intraportal), oralmente, ou por outros métodos, como a infusão que garante a sua entrega à corrente sangüínea de uma forma eficaz. O antagonista de DR6 pode também ser administrado por técnicas de perfusão isolada, tais como perfusão tecidual isolada, ou por punção intratecal, intraocular ou punção lombar para exercer efeitos terapêuticos locais. Os antagonistas de DR6 que não atravessam facilmente a barreira hemato- encefálica podem ser administrados diretamente, por exemplo, intracerebralmente ou no espaço da medula espinhal ou outro espaço, que irá transportá-los através da barreira. Dosagens eficazes e esquemas de administração do antagonista de DR6 pode ser determinado empiricamente, e encontra-se dentro dos conhecimentos de um técnico do assunto. Os técnicos hábeis no assunto entenderão que a dosagem de antagonista de DR6 que deve ser administrado irá variar dependendo, por exemplo, do mamíferos que irá receber o antagonista, a via de administração, o tipo específico de antagonista utilizado e outras drogas administradas ao mamífero. Orientações na seleção de doses adequadas são encontradas na literatura, por exemplo, no uso terapêutico de anticorpos, por exemplo, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., Eds., Noges Publications, Park Ridge, NJ, (1985) cap. 22 e págs. 303-357; Smith et ai, Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et ai., Èds., Raven Press, Nova Iorque (1977), págs. 365-389. Uma dose diária típica de anticorpo DR6 usado sozinho poderia variar entre cerca de 1 pg/kg até 100 mg/kg de peso corporal ou mais por dia, dependendo dos fatores mencionados acima.
O antagonista de DR6 pode também ser administrado ao mamífero em combinação com um ou mais agentes terapêuticos. Exemplos desses outros agentes terapêuticos inclui, inibidores do receptor do fator de crescimento epidérmico' (EGFR), por exemplo, compostos que se ligam ou não para interagir diretamente com o EGFR e prevenir ou reduzir a sua atividade de sinalização, tal como Tarceva, anticorpos como C225, também referidos como cetuximab e Erbitux® (!mClone Systems Inc.), ABX-EGF totalmente humano (panitumumab, Abgenix Inc.), bem como anticorpos humanos totalmente conhecidos como E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6. 3 e E7.6. 3 e descrito na Patente IJS 6.235.883; MDX-447 (Medarex Inc), bem como pequenas moléculas inibidoras de EGFR, tais como compostos descritos nas patentes US 5616582, US 5457105, US 5475001, US 5654307, US 5679683, US 6084095, US 6265410, US 6455534, US 6521620, US 6596726, US 6713484, US 5770599, US 6140332, US 5866572, US 6399602, US 6344459, US 6602863, US 6391874, W09814451, documento W09850038, documento W09909016, documento W09924037, US 6344455, US 5760041, US 6002008, US 5747498; as pequenas moléculas inibidoras de EGFR incluem OSI-774 (CP-358774, erlotinib, OSI Pharmaceuticals)] PD 183805 (Cl 1033, 2- propenamida, dihidrocloreto de N-[4-[(3-cloro-4-fluorofenil) amino]- 7- [3-(4- morfolinil)propoxi]-6-quinazolinil], Pfizer Inc.); Iressa (ZD1839, gefitinib, 4 - (3- cloro-4'-fluoroanilino)-7-metoxi-6-(3-morfolinopropoxi) quinazolina,
AstraZeneca); ZM 105180 ((6-amino-4-(3-metilfenil-amino)-quinazolina, Zeneca); BIBX-1382 (N8-(3-cloro-4-fluoro-fenil)-N2-(1-metil-piperidina-4-il)- pirimida [5,4-d] pirimidina-2 ,8-diamina, Boehringer Ingelheim); ICP-166 ((R) -4 - [4-[(1 -feniletil)amino]-1 H-pirrolo [2,3-d]pirimidina-6-il]-fenol), (R)-6-(4- hidroxifenil)-4-[(1-feniletil)amino]-7H-pirrol [2,3-d] pirimidina); CL-387785 (N-[4 - [(3-bromofenil) amino]-6-quinazolinil]-2-butinamida) e EKB-569 (N-[4-[(3-cloro- 4-fluorofenil) amino]-3-ciano-7-etoxi-6-quinolinil]-4-(dimetilamina)-2-
butenamida).. Outros agentes terapêuticos que podem ser empregados incluem inibidores da apoptose, especialmente inibidores da apoptose intracelular, por exemplo, caspase, tais como inibidores da caspase-3,
I
caspase-6, ou inibidores da caspase-8, inibidores de Bid, inibidores de Bax ou qualquer combinação destes. Exemplos de inibidores adequados são inibidores da caspase em geral, inibidores dipeptídeos, inibidores carbamato, acetatos ácido aspártico substituídos, heterociclildicarbamidas, quinolina-(di-, tri-, tetrapeptídeo), derivados de inibidores da caspase 2- aminobenzamida substituídos, inibidores da caspase ácidos a-hidróxi
substituídos, inibição por nitrosilação; inibidores de proteína CASP-1;
/
CASP-3: moléculas ánti-sense, nicotinil-aspartil-cetonas, derivados do dipeptídeo y-cetoácido, CASP-8: moléculas anti-sense, proteínas de interação CASP-9, CASP2: moléculas anti-sense; CASP-6: moléculas anti- sense; CASP-7: moléculas anti-sense e CA3P-12: inibidores. Outros exemplos são inibidores mitocondriais, como fator modulante de Bcl-2; peptídeos mutados de Bcl-2 derivados de Bad, Bad1 antagonista do domínio de morte interagindo com BH3, proteínas inibidoras de Bax e gene BLK e produtos gênicos. Moduladores intracelulares mais adequados da apoptose são moduladores da associação CASP9/Apaf-1, moduladores anti-sense da expressão de Apaf-1, peptídeos para a inibição da apoptose, composições anti-apoptóticas compreendendo a subunidade R1 do vírus herpes simplex, MEKK1 e fragmentos deste, moduladores da Survivina, moduladores de inibidores da apoptose e HIAP2. Outros exemplos de tais agentes incluem minociclina (Laboratório Neuroapoptosis que inibe a liberação do citocromo C das mitocôndrias e bloqueia a supra-regulação do RNAm da caspase-3, Pifitrina alfa (UIC), que é um inibidor da p53, CEP-1346 (Cephalon Inc.), que é um inibidor da via JNK , TCH346 (Novartis), que inibe a sinalização GAPDH pró- apoptótica, IDN6556 (Idun Farmacêutica), que é um inibidor pan-caspase; AZQs (AstraZeneca), que é um inibidor da caspase-3, HMR-3480 (Aventis Pharma), que é um inibidor da caspase -1/-4, e Activase/TPA (Genentech), que dissolve coágulos (droga trombolítica).
Agentes mais adequado que podem ser administrados, além do antagonista de DR6, incluem inibidores da colinesterase (como o donepezil, galantamina, rivastigmina, tacrina), antagonistas dos receptores NMDA (como Memantine), inibidores da agregação Αβ, antioxidantes, moduladores da γ- secretase, NGF miméticos ou terapia gênica com NGF, agonistas de PPARy, inibidores da HMG-CoA redutase (estatinas), ampaquinas, bloqueadores dos canais de cálcio, antagonistas dos receptores GABA, inibidores da glicogênio sintase cinase, imunoglobulina intravenosa, agonistas de receptores muscarínicos, moduladores de receptores nicotínicos, imunização Αβ ativa ou passiva, inibidores da fosfodiesterãse, antagonistas de receptores de serotonina e anticorpos anti-Αβ (vide, por exemplo, os documentos WO 2007/062852; WO 2007/064972; WO 2003/040183; WO 1999/06066; WO 2006/081171; WO 1993/21526; EP 0276723B1; WO 2005/028511; WO 2005/082939).
O antagonista de DR6 pode ser administrado seqüencialmente ou concomitantemente com o um ou mais agentes terapêuticos. As quantidades de antagonista DR6 e agente terapêutico dependem, por exemplo, do tipo de drogas que são utilizadas, a condição patológica a ser tratada, e o esquema e vias de administração, mas seria em geral, menor do que se fossem utilizadas individualmente.
Na seqüência da administração do antagonista de DR6 ao mamífero, os a condição fisiológica do mamífero pode ser monitorado de várias formas pelos médicos hábeis no assunto.
Os efeitos terapêuticos dos antagonistas de DR6 da presente invenção podem ser exâminados em ensaios in vitro e in vivo usando modelos animais. Uma variedade de ensaios e bem conhecidos e modelos animais podem ser usados para testar a eficácia dos agentes terapêuticos candidatos. A natureza in vivo de tais modelos, torna-os particularmente preditivos da reação em pacientes humanos. Modelos animais de diversas condições neurodegenerativas e técnicas associadas para examinar a processos patológicos associados a estes modelos de neurodegeneração (por exemplo, a presença e ausência de antagonistas de DR6 ) são discutidas no Exemplo 14 abaixo.
Modelos animais de diversos distúrbios neurológicos incluem tanto animais não-recombinantes quanto animais recombinantes (transgênicos). Modelos animais não-recombinantes incluem, por exemplo, roedores, por exemplo, modelos murinos. Tais modelos podem ser gerados através da introdução de células em camundongos singênicos usando as técnicas padrão, por exemplo, injeção subcutânea, injeção na veia caudal, implante baço, implante intraperitoneal e implante sob a cápsula renal. Modelos in vivo incluem modelos de AVC/isquemia cerebral, modelos in vivo das doenças neurodegenerativas, tais como modelos de camundongos da doença de Parkinson; modelos de camundongos da doença de Alzheimer; modelos de camundongos da esclerose lateral amiotrófica ALS; modelos de camundongos da atrofia muscular espinhal SMA; modelos de ratos/camundongos de isquemia cerebral focai e global, por exemplo, modelo de oclusão da artéria carótida comum ou modelo de oclusão da artéria cerebral média; ou em culturas de embriões inteiros ex vivo. Os diversos ensaios podem ser realizados em formas de ensaios in vitro ou in vivo conhecidos, tais como descrito abaixo, ou conhecido no estado da técnica e descritos na literatura (vide, por exemplo, McGowan et al., TRENDS in Genetics, 22:281-289 (2006); Fleming et al. NeuroRx, 2:495-503 (2005), Wong et al., Nature Neuroscience1 5:633-639 (2002)). Vários desses modelos animais estão também disponíveis a partir de fornecedores comerciais, tal como Jackson Laboratory (vide http://jaxmice.jax.org).
Uma variedade de modelos animais conhecidos no estado da técnica podem ser usados para examinar a atividade do antagonistas de DR6 divulgado na presente invenção em doenças neurológicas, tais como a DA (vide, por exemplo, Rakover et al. Neurodegener Dis. 2007; 4 (5): 392-402; Mouri et al., FASEB J. Jul de 2007; 21 (9) :2135-48; Minkeviciene et al., J Pharmacol Exp Ther. Nov de 2004; 311 (2) :677-82 e Yuede et al. Behav Pharmaeoi Setembro de 2007; 18 (5-6) :347-63). Por exemplo, o efeito do antagonistas de DR6 divulgado no presente na função cognitiva de camundongos pode ser analisado usando ensaios de reconhecimento de objetos (vde, por exemplo, Ennaceur et al. Behav. Brain Res. 1988; 31:47-59). A atividade dos antagonistas de DR6 divulgado no presente, por exemplo, na inflamação cerebral, pode ser analisada em camundongos, por exemplo, pela análise histoquímica, .bem como protocolos de ELISA concebidos para mensurar os níveis de marcadores inflamatórios como a IL-1 β e TNF-α e as citocinas anti-inflamatórias IL-10 nas frações do plasma de camundongos (vide, por exemplo, Rakover et al. Neurodegener Dis. 2007;4(5):392-402).
O efeito dos antagonistas de DR6 divulgado no presente, em relação aos distúrbios neurológicos, tal como a doença de Alzheimer (DA) em seres humanos, pode ser analisado, por exemplo, através da utilização de uma medida de resultados cognitivos em conjunto com uma avaliação global (vide, por exemplo, Leber P: Guidelines for the Clinicai Evaluation of Antidementia Drugs, 1o versão, Rockville, MD, US Food and Drug Administration, 1990). Os efeitos nos distúrbios neurológicos tais como a DA, podem ser analisados, por exemplo, usando um único ou múltiplos conjuntos de critérios. Por exemplo, a European Medicine Evaluation Agency (EMEA) introduziu uma definição de respondedores correspondente a um grau pré-específicado de melhora na cognição e estabilização em ambas as atividades funcionais e globais (vide, por exemplo, European Medicine Evaluation Agency (EMEA): Note for Guidelines on Medicinal Products in the Treatment of Alzheimer's Disease. Londres, EMEA, 1997). Uma série de testes específicos estabelecidos que podem ser utilizados sozinhos ou em combinação para avaliar a resposta de um paciente a um agente, são conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Van Dyke et al., Am J Geriatr. Psychiatry 14:5 (2006). Por exemplo, a resposta a um agente pode ser avaliada utilizando a Bateria para Comprometimento Grave (SIB), um teste utilizado para medir alterações cognitivas em pacientes com DA mais grave (vide, por exemplo, Schmitt et al., AIzheimerDis Assoc Disord 1997; 11 (supl 2) :51-56). A responsividade a um agente também pode ser mensurada utilizando o escore de 19 itens do Estudo Cooperativo da Doença de Alzheimer - desenvolvimento das atividades cotidianas (ADCSADL19), um questionário de 19 itens que mede o nível de independência no exercício das atividades da vida diária, concebidos e validados para estágios mais tardios da demência (vide, por exemplo, Galasko et al., J Int Neuropsychol Soc 2005; 11:446-453). A responsividade de um agente também pode ser mensurada utilizando a Impressão de Mudança Baseada na Entrevista Clínica (CIBIC-PIus), uma classificação de sete pontos da mudança global baseado em entrevistas estruturadas com os pacientes e cuidadores (vide, por exemplo, Schneider et al., Alzheimer Dis Assoc Disord 1997; 11(suppl 2):22-32). A responsividade de um agente também pode ser medida utilizando o inventário neuropsiquiátrico (NPI)1 que avalia a freqüência e severidade de 12 sintomas comportamentais baseados na entrevista com o cuidador (vide, por exemplo, Cummings et al. Neurology 1994; 44:2308-2314).
Vários inibidores da colinesterase (donepezil, galantamina, rivastigmina e tacrina, bem como Memantina, um antagonista dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA)) recebeu aprovação regulamentar para o tratamento da doença de Alzheimer (vide, por exemplo, Roberson et ai, Science 314: 781-784 (2006). Em ensaios clínicos de inibidores da colinesterase em pacientes com DA de gravidade leve a moderada, uma definição comum da resposta terapêutica envolveu uma melhoria de, pelo menos, quatro pontos na Escala de Avaliação da Doença de Alzheimer - Subescala Cognitiva (ADAS-cog) durante seis meses (vide, por exemplo, Winblad et al. Int J Geriatr Psychiatry 2001; 16: 653-666; Cummings J., Am J Geriatr Psychiatry 2003; 11: 131-145; e Lanctot et al., CMAJ 2003; 169: 557- 564). Estes resultados também foram comparados com a reversão do processo da doença por cerca de 6 meses ou 1 ano, respectivamente (vide, por exemplo, Doraiswamy et ai, AÍzheimer Dis Assoc Disord (2001) 15: 174-183). Em ensaios clínicos da Memantina, respondedores ao tratamento foram pré especificados com pacientes que não mostraram deterioração nas habilidades globais não mostraram qualquer deterioração funcional ou nas habilidades cognitivas (vide, por exemplo, Reisberg et al., N. Engl. J. Med. 2003; 348: 1333-1341). Outro ensaio clínico com a Memantina em pacientes tomando doses estáveis do inibidor da colinesterase Donepezil, caracterizou a Memantina como sendo capaz de exibir um benefício sobre o placebo nos resultados mensurados, incluindo as alterações da linha basal na Bateria para Comprometimento Grave (SIB), e sobre os escores de 19 itens do Estudo Cooperativo da Doença de Alzheimer - desenvolvimento das atividades cotidianas (ADCSADL19), Impressão de Mudança Baseada na Entrevista Clínica (CIBIC-PIus), inventário neuropsiquiátrico (NPI) e a Escala Comportamental para pacientes geriátricos (BGP subescala "Care Dependencf ) (vide, por exemplo, Tariot et ai, JAMA 2004; 291:317-324). A memantina tem sido caracterizada como a mais eficaz, produzindo tanto melhoria quanto estabilização dos sintomas em várias escalas de mensurações SIB, ADCS-ADL19, CIBIC-PIus, e NPI (vide, por exemplo, Van Dyck et al., Am J Geriatr. Psychiatry 14:5 (2006)).
Aplicações Diagnosticas do Antagonista de DR6
A doença de Alzheimer familiar (FAD) ou doença Alzheimer autossômica dominante de início precoce (ADEOAD) referem-se a forma incomum da doença de Alzheimer que geralmente aparece precocemente na vida, definido como antes dos 65 anos de idade (normalmente entre 20 e 65 anos de idade), que pode ser'herdado de uma forma autossômica dominante. Estudos da proteína precursora amilóide (APP), e genes da presenilina 1 (PSEN1), e presenilina 2 (PSEN2) fornecem provas de que mutações nestes genes são responsáveis pela maioria dos casos observados de ADEOAD (vide, por exemplo, Raux et al., Joumal of Medicai Genetics 2005; 42:793-795). No entanto, um certo número de casos observados de tais síndromes permanecem inexplicáveis. Os dados aqui apresentados sugerem que polipeptídios e/ou polinucleotídeos variantes do Receptor de Morte 6, podem ser responsáveis por alguns casos de FAD e/ou outros distúrbios neurológicos. Realizações da presente invenção incluem métodos para determinar se um polipeptídeo variante do polipeptídeo Receptor de Morte 6 (DR6) compreendendo a SEQ ID No: 1 está presente em um indivíduo, O método compreende em comparar uma seqüência de um polipeptídeo DR6 presente no indivíduo com a SEQ ID No: 1, de modo a determinar se o polipeptídeo variante de DR6 ocorre no indivíduo. Opcionalmente, em tais métodos, o paciente tem ou é suspeito de ter FAD e/ou outro distúrbio neurológico.
Neste contexto, os polipeptídeos e/ou polinucleotídeos nas amostras do paciente podem ser analisados por meio de uma diversidade de meios bem conhecidos no estado da técnica (por exemplo, a fim de identificar variantes de DR6 de aocrrência natural), incluindo, sem se limitar, a análise por imuno-histoquímica, hibridização in situ, análise por RT-PCR, análise de Westem blot de amostras clínicas e linhagens de células e análise de arranjos teciduas. Protocolos típicos para a avaliação da seqüência do gene DR6 (por exemplo: seqüências reguladoras 5 'e 3' do DR6, introns, exons e similares) e produtos do gene DR6 (por exemplo, RNAm do DR6, polipeptídeos do DR6 e similares) podem ser encontrados, por exemplo em, Ausubel et al. Eds., 2007, Current Protocols In Molecular Bioloav, Unidade 2 (Northern blotting), 4 (Southern blotting), 15 (imunoblotting) e 18 (Análise por PCR).
Em uma realização ilustrativa de tais análises, são obtidas células neuronais a partir de um paciente com um distúrbio neurológico ou suspeito de ser suscetível a um distúrbio neurológico de modo a que as seqüências de polipeptídeos e/ou RNAm de DR6 expressas nestas células podem ser analisadas por üm protocolo, tal como um imunoensaio, um ensaio de Northem blot ou análise de seqüência de polinucleotídeos (vide, por exemplo, Lane et al. Laryngoscope. 2002; 112 (7 Pt 1) :1183-9; e Silani et al. Amyotroph Lateral Scler OtherMotorNeuron Disord. 200; 2 Supl 1: S69-76). Em certas realizações da presente invenção, os polipeptídeos DR6 obtidos a partir de células neuronais doentes (que podem opcionalmente serem passadas para cultura in vitro) podem ser analisados por um imunoensaio, tal como uma análise de Western blot (vide, por exemplo, Pettermann et al., J Neurosci. (10): 3624-3632 (1988)). Alternativamente, uma porção, ou a toda a região codificadora do gene DR6 pode ser analisado, por exemplo, por uma análise por reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) do RNAm extraído de células neuronais do paciente. Em outras realizações da presente invenção, as seqüências genômicas de DR6 são obtidas a partir de uma célula que não seja uma célula neuronal, por exemplo, um fibroblasto ou leucócitos do sangue periférico e em seguida analisadas para determinar se estas seqüências genômicas codificam um polipeptídeo e/ou abrigam um polinucleotídeo variante do DR6 (incluindo as seqüências reguladoras 5' e 3' variantes, por exemplo, que influenciam os níveis de expressão de DR6 em uma célula). Em certas realizações da presente invenção, tais análises podem ser padronizadas nas análises da protèína precursora amilóide (APP), genes da presenilina 1 (PSEN1), e presenilina 2 (PSEN2) (vide, por exemplo, Nagasaka et al., Proc NatIAcad Sei USA. 2005; 102 (41): 14854-9; e Finckh et al. Neurogeneties. 2005;6(2):85-9).
Métodos de Sélecão Para Identificar Antagonistas de DR6
Realizações da presente invenção incluem métodos para identificar uma molécula de interesse, que inibe a ligação do DR6 à APP, o método compreendendo em combinar DR6 e APP, na presença ou ausência de uma molécula de interesse, e, em seguida, detectar a inibição da ligação do DR6 à APP na presença da molécula de interesse mencionada. Em particular, utilizando a divulgação fornecida no presente pode-se identificar proteínas, pequenas moléculas e outras moléculas que, por exemplo, interagem com DR6 e/ou APP e inibem a interação entre DR6 e APP. Em uma realização ilustrativa deste método, o DR6 pode ser imobilizado em uma matriz. A capacidade da APP livre (por exemplo, APP marcada com um marcador detectável, tal como um marcador cromogênico, um marcador fluorescente, um radio marcador, um marcador magnético ou um produto de uma reação enzimática, etc), para se ligar ao DR6 imobilizado podendo então ser observado na presença e ausência de uma molécula de interesse. A diminuição da ligação da APP ao DR6 (por exemplo, como foi observado através de uma mudança nos níveis e/ou localização do marcador detectável) pode então ser usada para identificar as moléculas que inibem a capacidade do APP de se ligar a DR6. Em realizações alternativas da invenção, a APP pode ser imobilizada em uma matriz, a fim de detectar a capacidade da APP de se ligar a DR6 livre (por exemplo, DR6 marcado com um marcador detectável) na presença e ausência de uma molécula de interesse. Opcio nalmente, em tais realizações, a molécula de interesse pode ser um anticorpo.
A divulgação fornecida no presente permite o uso de uma variedade de protocolos utilizados no estado da técnica para caracterizar a ligação entre polipeptídeos, tal como o DR6 e APP são utilizados para identificar uma molécula que inibe a interação de ligação entre DR6 e APP. Tais realizações da invenção incluem aqueles que empregam ensaios de ELISA (por exemplo, ensaios de ELISA competitivos ou do tipo sanduíche como divulgado nas Patentes US 6.855.508, US 6.113.897 e US 7.241.803), radioimunoensaios (por exemplo, como divulgado na unidade 10,24 de Ausubel et al. Eds., Current Protocols In Molecular Biology, 2007), ensaios de Western blot (por exemplo, como divulgado em Pettermann et al., J Neurosci. (10): 3624-3632 (1988) e Exemplo 10 abaixo), ensaios imuno-histológicos (por exemplo, como divulgádo no Exemplo 10 abaixo), análises IAsys e análises com chip sensor CM-5 (BIAcore) (vide, por exemplo, Patentes US 6.720.156 e US 7.101.851). Em certas realizações da presente invenção, um método para identificar uma molécula de interesse, que inibe a ligação do DR6 à APP usa um microarranjo de proteínas. Microarranjo de proteínas normalmente usam moléculas de proteínas imobilizadas de interesse (por exemplo, DR6 e/ou APP) em uma superfície em locais definidos e que tenham sido utilizadas para identificar proteínas de ligação de moléculas pequenas, (vide, por exemplo, Wilson et al., Curr. Opinion in Chemical Biology 2001, 6, 81-85; e Zhu, H., et al., Science 2001, 293, 1201-2105).
Kits ε Artigos Manufaturados Em realizações adicionais da presente invenção, há o fornecimento de artigos manufaturados e de kits contendo materiais úteis para o tratamento de distúrbios neurológicos. O artigo manufaturado compreende um recipiente com um rótulo. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser produzidos a partir de uma variedade de materiais como o vidro ou plástico, e são preferencialmente esterilizados. O recipiente armazena uma composição com um agente ativo que è eficaz para o tratamento de doenças neurológicas, incluindo a doença de Alzheimer. O agente ativo na composição é um antagonista de DR6 e, preferencialmente, compreende anticorpos monoclonais anti-DR6 ou anticorpos monoclonais anti-APP. O rótulo no recipiente indica que a composição é utilizada para tratar distúrbios neurológicos, e também pode indicar instruções tanto para uso in vivo quanto para uso in vitro, tal como descrito acima. O artigo manufaturado ou Kit opcionalmente também inclui uma bula com instruções de uso, que faz referência a instruções usualmente incluídas nas embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, utilização e dosagem, administração, contra- indicações, outros produtos terapêuticos para serem combinados com o produto embalado e/ou advertências relativas à utilização de tais produtos terapêuticos, etc.
O kit da invenção compreende o recipiente descrito acima, e um segundo recipiente compreendendo um tampão. Este pode ainda incluir outras materiais desejáveis a partir de uma perspectiva comercial e de uso, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
Exemplos
Vários aspectos da presente invenção são ainda descritos e ilustrados por meio dos exemplos a seguir, nenhum dos quais tem a intenção de limitar o escopo de aplicação da presente invenção.
Exemplo 1
Expressão De DR6 No Sistema Nervoso Central Embriônico E Adulto
Foram realizadas seleções por RNA in situ do dos padrões de expressão de receptores da superfamília do TNF em tecidos embrionários murinos. Mais especificamente, experimentos de hibridização in situ foram realizados utilizando um kit "mRNA Iocalizador Kif (Ambion, cat. No. 1803), seguindo o protocolo do fabricante. A seguinte seqüência primárias de cDNA do DR6 foi utilizada para gerar o riboprobe para estes experimentos: GAGCAGAAACGGCTCCTTTATTACCAAAGAAAAGAAGGACACAGTGTTGC GGCAGGTCCGCCTGGACCCCTGTGACTTGCAGCCCATCTTTGATGACATG CTGCATATCCTGAACGCCGAGGAGCTGCGGGTGATTGAAGAGATTCCCCA GGCTGAGGACAAACTGGACCGCCTCTTCGAGATCATTGGGGTCAAGAGCC AAGAAGCCAGCCAGACCCTCTTGGACTCTGTGTACAGTCATCTTCCTGACC TATTGTAGAACACAGGGGCACTGCATTCTGGGAATCAACCTACTGGCGG. (SEQ ID No:3) :
Um kit Maxiscript (Ambion, cat. No. 1308) foi utilizado para a síntese in vitro do riboprobe, de acordo com o protocolo do fabricante.
Conforme exibido na figura 2A, verificou-se que o DR6 foi expresso quase exclusivamente por neurônios diferenciados, mais do que em progenitores em proliferação, no desenvolvimento das células da medula espinhal e ganglionares das raízes dorsais nos estágios E10 a E12; estágios onde a ocorrência da morte celular neuronal é sabida.
Conforme exibido na figura 2B, a proteína DR6 é expressa em ambos os corpos celulares e axônios dos neurônios.
Na Figura 2B, as duas fotografias superiores mostram neurônios a partir de um camundongo normal visualizando DR6 (à esquerda) ou proteína controle (direita). O duas fotografias abaixo exibem correspondentemente neurônios de camundongo DR6 knock-out visualizando DR6 (à esquerda) ou uma proteína controle (direita).
Materiais e métodos utilizados para gerar os dados apresentados nesta figura são os seguintes. Para visualizar a expressão proteína DR6 nos axônios sensoriais como exibido, por exemplo, na Figura 2B, anticorpos monoclonais de camundongos específicos para DR6 foram gerados na Genentech utilizando um DR6 recombinante humano como imunógerio (vide Exemplo 3 abaixo). Estes anticorpos foram ainda selecionados por imunofluorescência pela sua capacidade de reconhecer o DR6 de comprimento total de camundongo e humano expresso na superfície da célula. Um desses anticorpos, denominado "RA.3" (também conhecido como "3F4.8.8" mAB, e adicionalmente descrito no Exemplo 3 e Exemplo 7 abaixo), reage cruzadamente com ambos polipeptídeos DR6 humano e de camundongo, e foi utilizado para a visualização da expressão de DR6 nos axônios como exibido na figura 2B. O procedimento de marcação por Imunofluorescência foi realizado utilizando um protocolo padrão conhecido no estado da técnica (Nikolaev et al., 2003, Cell1 112 (1), 29-40). Para visualizar a expressão de DR6 em axônios, fotos foram tiradas em um microscópio Zeiss (Axiopían-2 Imaging) utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da Carl Zeiss Imaging Solutions. Como exibido na Figura 2C, o RNAm do DR6 é expresso por neurônios em diferenciação. Na Figura 2C, da esquerda para a direita, as três fotografias exibem varreduras cerebrais de neurônios a partir de camundongos nas fases de desenvolvimento E10.5, E11.5 e E12.5 respectivamente.
Materiais e métodos utilizados para gerar os dados apresentados
nesta figura são os seguintes. Para visualizar a expressão de RNAm do DR6 no desenvolvimento embrionário de camundongo, a hibridização in situ (ISH) do RNAm com sondas de RNA radiomarcadas específicas para a UTR-3' do DR6 foi realizada em 20 cortes de tecidos transversais de 20 micrômetros retirados no nível torácico axial de embriões de camundongos E10.5 - E12 ,5. Um kit de hibridização in situ Iocalizador de RNAm foi utilizado para realizar os experimentos de ISH de acordo com o protocolo do fabricante, conforme descrito no manual de instruções do Iocalizador de RNAm (Ambion Inc., cat. No. 1803). A sonda de RNAm radiomarcada correspondente a seqüência anti- senseda UTR-3' do DR6 de camundongo foi gerada em uma reação de tradução in vitro utilizando o kit "MAXIscript" de acordo com o manual de instruções do fabricante (Ambion Inc., cat. No. 1308-1326). Os dados da expressão de RNAm do DR6 foram visualizados utilizando a emulsão autoradiográfica Kodak (Kodak), aplicada as lâminas com os cortes transversais de tecido embrionário. Fotos foram tiradas em campo escuro em um microscópio Zeiss (Axioplan-2 ímaging) utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da CarIZeiss Imaging Solutions.
A seqüência primária de cDNA do DR6 usado para gerar a
*
riboprobe neste experimento é a seguinte:
GAGCAGAAACGGCTCCTTTATTACCAAAGAAAAGAAGGACACAGTGTTGC
GGCAGGTCCGCCTGGACCCCTGTGACTTGCAGCCCATCTTTGATGACATG
CTGCATATCCTGAACCCCGAGGAGCTGCGGGTGATTGAAGAGATTCCCCA GGCTGAGGACAAACTGGACCGCCTCTTCGAGATCATTGGGGTCAAGAGCC AAGAAGCCAGCCAGACCCTCTTGGACTCTGTGTACAGTCATCTTCCTGACC TATTGTAGAACACAGGGGCACTGCATTCTGGGAATCAACCTACTGGCGG (SEQ ID No: 3)
Uma análise adicional utilizando o atlas uAIIen Brain Atlas" (http://www.brainatlas.org/aba/; a Allen Brain Atlas é uma fonte cientifica disponível publicamente que fornece mapas de expressão de aproximadamente 20.000 genes no cérebro de camundongo) revelou que DR6 é altamente expresso no córtex cerebral no cérebro adulto. O RNAm do DR6 é expresso por exemplo, em neurônios corticais, hipocampais neurônios piramidais CA1-CA4 e do giro denteado. A proteína DR6 é expressa em corpos celulares neuronais no córtex e hipocampo adulto.
Este padrão de expressão fornece evidências de que, além de seu papel no desenvolvimento, o DR6 também pode funcionar na progressão da doença neurodegenerativa associada à perda de células neuronais.
Exemplo 2
Inibição Da Expressão de DR6 Por RNA de Interferência Previne A Degeneração Axonal De Neurônios Comissurais Em Culturas De Explante
Neurônios comissurais são um grupo de interneurônios de longa projeção espinal nascidos na medula espinhal dorsal entre as fases de desenvolvimento E9.5 a E11.5. Acredita-se que os neurônios comissurais dependem para sua sobrevivência do suporte trófico de um dos seus alvos intermédios, a placa ventral da medula espinhal. Est a dependência ocorre durante um período longo de vários dias quando os seus axônios estendem-se ao longo da placa ventral, após o qual eles se desenvolvem necessidades tróficas adicionais. Uma dependência de neurônios no suporte trófico derivado de passagem a partir de seus alvos intermediários axonais, fornece um mecanismo para eliminar rapidamente neurônios sem projeções, que podem ajudar a evitar a formação de circuitos neuronais aberrantes durante o desenvolvimento do sistema nervoso (Wang et al., Nature, 401:765-769 (1999)).
Para examinar os papel funcional do DR6 na degeneração axonal e morte celular programada de neurônios comissurais, foi realizado um ensaio de sobrevida baseado em RNAi na medula espinhal dorsal (Kennedy et al., Cell, 78:425-435 (1994), Wang et al., supra, 1999) (vide Figura 3). Embriões de Rato E13 ou camundongo E11.5 foram colocados no meio L15 (Gibco) e siRNAs (IDT), juntamente com plasmídeos que codificam a proteína verde fluorescente (-GFP) foram injetados no tubo neural. Os siRNAs e plasmídeos foram então entregues as células progenitoras dorsais por eletroporação. Os explantes da medula espinhal dorsal foram dissecados, emblocados em uma matriz em gel de colágeno 3D, e cultivados em meio Opti-MEM/F12 (Invitrogen), com netrina-1 recombinante (R&D Pharmaceuticals) e 5% de soro eqüino (Sigma) a 37 0C em um ambiente com 5% de CO2. Dentro de 16 horas em resposta à netrina-i quimio-atraente, os neurônios comissurais cresceram para fora do explante na matriz em gel de colágeno (Kennedy et al., supra, 1994). Os axônios comissurais são visualizados pela observação da fluorescência do GFP utilizando um microscópio invertido. Conforme exibido na figura 4A, após 48 horas de cultura na
ausência de apoio de fator trófico derivado da placa ventral, os neurônios comissurais sofreram morte celular programada e seus axônios degeneraram (vide, também," Wang et al., supra, 1999). Essa degeneração axonal foi notoriamente bloqueada quando a expressão de DR6 nos neurônios comissurais foi infra-regulada pelas moléculas de siRNA específicas para DR6 (vide, Figura 4, painel inferior). Esta inibição da degeneração axonal não foi observada em experimentos controle com moléculas de siRNA não- direcionadas. Os dados sugerem que DR6 é um importante receptor pró- apoptótico necessário para degeneração axonal dos neurônios comissurais mediante retirada de suporte trófico de seus alvos intermediários, a placa ventral da medula espinhal.
Conforme exibido na Figura 4B, um cDNA de DR6 resistente a RNAi recupera o fenótipo de degeneração bloqueado pelo siRNA DR6.
Na Figura 4B, da esquerda para a direita, as quatro fotografias superiores exibem neurônios na presença de: (1) um RNAi controle; (2) DR6 tipo selvagem exposto ao siRNA DR6 #3; (3) um DR6 não pareado exposto ao siRNA de DR6 #2, e (4) um DR6 não pareado exposto ao siRNA de DR6 #3. Os dois painéis inferiores mostram autoradiogramas de: (1) RNAm de DR6 do tipo selvagem na presença de: siRNA controle, siRNA #2, e siRNA #3; e (2) RNAm de DR6 não pareado na presença de: siRNA controle, siRNA #2, e siRNA #3.
Materiais e métodos utilizados para gerar os dados apresentados nesta figura são os seguintes. Para investigar os papéis fisiológicos do receptor DR6 na degeneração axonal e morte celular programada de neurônios comissurais, foi realizado um ensaio de sobrevida na medula espinhal dorsal de acordo com protocolos conhecidos no estado da técnica (Kennedy et al., Cell, 78:425-435 (1994), Wang et al., Nature, 401:765-769 (1999)) (com os dados apresentados na Figura 4B). Embriões de ratos E13 foram colocados em meio L15 (Gibco) e foi injetado em seus tubos neurais as seguintes construções de siRNA (Figura 4B):
siRNA #2 controle não-direcionado, ou direcionado para DR6, ou siRNA #3 (IDT) direcionado para DR6, juntamente com ambos cDNA de DR6 , tipo selvagem ou não pareado e plasmídeos que codificam GFP. O cDNA do DR6 e cDNA do GFP foram sub-clonados em uma estrutura de vetor pCAGGS (comercialmente disponível pela BCCM/LMBP). Os siRNAs e plasmídeos foram então entregues as células progenitoras dorsais por eletroporação. Os explantes da medula espinhal dorsal foram então dissecados, emblocados em uma matriz em gel de colágeno 3D e cultivados em meio Opti-MEM/F12 (Invitrogen)1 com netrina-1 recombinante e 5% de soro eqüino (Sigma) a 37 °C, em ambiente com 5% de CO2. Dentro de 16 horas em resposta à netrina-1 quimio-atraente, os axônios comissurais cresceram para fora do explante na matriz em gel de colágeno (Kennedy et al., Cell, 78:425-435 (1994). Os axônios comissurais são visualizados pela observação da fluorescência do GFP utilizando um micròscópio invertido. Após 48 horas de cultura na ausência de apoio de fator trófico derivado da placa ventral, os neurônios comissurais sofreram morte celular programada e seus axônios degeneraram (Wang et al., Nature, 401:765-769 (1999)) (Figura 4B). Entretanto, a degeneração axonal pode ser bloqueada pela introdução de um siRNA #3 direcionado especificamente para DR6 (vide, Figura 4, painel inferior). O efeito específico no alvo do siRNA #2 específico para DR6 é ainda confirmado em um experimento de resgate' no qual o fenótipo de degeneração axonal é restaurado pela co-expressão do cDNA de DR6 não pareado resistente ao siRNA #3 construído juntamente com o siRNA #3 para DR6 (Figura 4B). Foram apresentadas evidências experimentais estabelecendo que a função do receptor DR6 é necessária para a degeneração axonal e morte de neurônios comissurais sob a retirada de seus alvos intermédios, a placa ventral da medula espinhal.
As seqüências de siRNAs #2 e #3 do DR6 (fitas sense), e o fragmento de cDNA do DR6 não pareado complementar a seqüência do siRNA #3 DR6 utilizada no ensaio descrito acima, são as seguintes: Seqüência do siRNA Wl para DR6 de rato 5'- AAU CUG UUG AGU UCA UGC CUU-3' (SEQ ID No: 11)
Seqüência do siRNA #3 para DR6 de rato 5'- CAA UAG GUC AGG AAG AUG GCU -3' (SEQ ID No: 12) Seqüência do fragmento não pareado do cDNA do DR6 complementar a seqüência do siRNA #3: 5'-
GGACTCTGTGTACAGTCACCTCCCAGATCTGTTATAG -3'(SEQ ID No: 13)
Exemplo 3
Inibição Da Sinalização Do Receptor DR6 Por Anticorpos Anti-DR6 Previne A Degeneração Axonal Dos Neurônios Comissurais Em Culturas
de Explantes
Um ensaio de sobrevida na medula espinhal dorsal (conforme descrito no Exemplo 2 acima) foi realizado utilizando anticorpos anti-DR6. Observação microscópica (utilizando canal de fluorescência verde para GFP) foi utilizado para visualizar os axônios comissurais. O ensaio de sobrevida na medula espinhal dorsal foi realizado de acordo com os protocolos conhecida no estado da técnica (Kennedy et ai, Cell, 78:425-435 (1994), Wang et a/., Nature, 401:765-769 (1999)) com modificações descritas no Exemplo 2 acima. Embriões de ratos E13 foram injetados em seus tubos neurais com as construções de plasmídeos expressando GFP1 (cDNA do GFP foi sub-clonado na estrutura do vetor pCAGGS, disponível comercialmente pela BCCM/LMBP). Os plasmídeos expressando -GFP foram então entregues às células progenitoras dorsais por eletroporação. Anticorpos anti-DR6 de bloqueio ou IgG controle de camundongo normal foram adicionados aos explantes comissurais a 40 pg/ml, 24 horas após o plaqueamento. Fotos dos explantes comissurais foram tiradas 48 horas após o plaqueamento conforme descrito abaixo. Para visualizar os axônios comissurais expressando o GFP, as fotos foram tiradas no microscópio invertido da Zeiss (Axiovert 200) (no canal de fluorescência verde para GFP) utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da CarIZeiss Imaging Solutions.
Os anticorpos anti-DR6 utilizados para este experimento foram gerados da seguinte forhia. Uma seqüência do domínio extracelular do DR6 humano fundida com uma porção Fc (hDR6-DCE-FC) foi utilizado como um imunógeno para gerar anticorpos monoclonais de camundongos Anti-DR6 . A seqüência do imunógeno hDR6-DCE-Fc utilizado é a seguinte:
MGTSPSSSTALASCSRIARRATATMIAGSLLLLGFLSTTTAQPEQKASNLIGTY
RHVDRATGQVLTCDKCPAGTYVSEHCTNTSLRVCSSCPVGTFTRHENGIEKC
HDCSQPCPWPMIEKLPCAALTDRECTCPPGMFQSNATCAPHTVCPVGWGVR
KKGTETEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAYTDCLSQNLWIKPGTKETDN
VCGTLPSFSSSTSPSPGTAIFPRPEHMETHEVPSSTYVPKGMNSTESNSSASV
RPKVLSSIQEGTVPDNTSSARGKEDVNKTLPNLQWNHQQGPHHRHILKLLPS
MEATGGEKSSTPIKGPKRGHPRQNLHKHFDINEHLPWMIPDKTHTCPPCPAP
ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWWDGVEV
HNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN
NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK (SEQ ID No:4)
O polipeptídeo de fusão foi gerado usando protocolos de imunoadesina anteriormente descritos (Ashkenazi et ai, Curr Opin Immunol.,9(2): 195-200 (1997); Haak-Frendscho et ai, J Immunol., 152(3):1347- 53(1994)).
Camundongos Balb/c com 9 semanas de idade foram imunizados por injeção com 100 μΙ de imunógeno hDR6-DCE-Fc (1 mg/animal) durante um período de aproximadamente oito semanas. Linfonodos (11x106 células/ml, 5 ml) de todos os camundongos imunizados foram então fundidos com células de mieloma PU.1 (células de mieloma murino ATCC) em uma concentração de 5x106 células/ml, 5 ml. As células foram plaqueadas em 4 placas a 2x106 células/ml.
Um ensaio de ELISA de captura foi usado para selecionar hibridomas pela especificidade de ligação ao polipeptídeo hDR6-DCE-Fc descrito acima. As placas foram revestidas com 50 μΙ de Ac de cabra específico anti-Fc da IgG humana 2 pg/ml (Cappel cat. No. 55071) a 4 0C durante a noite. As placas foram lavadas três vezes com PBS acrescido de Brij, e as placas foram bloqueadas com 200 μΙ de BSA 2% em temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram então lavadas três vezes com PBS acrescido de Brij. Posteriormente, as placas foram incubadas com 100 μΙ/poço de imunoadesina a 0,4 pg/ml durante 1 hora em um agitador. As placas foram então lavadas três vezes com PBS acrescido de Brij. 100 μΙ dos 1os anticorpos foram adicionados aos poços, incubadas durante 1 hora no agitador. As placas foram lavadas três vezes novamente com PBS acrescido de Brij. 100 μΙ de anticorpo de ovelha anti-lgG de camundongo conjugado com HRP (não reage cruzadamente com humano, Cappel cat. Nó. A uma diluição de 1:1000 por 1 hora. As placas foram lavadas três vezes com PBS acrescido de Brij. 50 μΙ de substrato (TMB Microwell peroxidase KPL #50-76-05) foi adicionado e as placas foram incubadas por 5 minutos. A reação foi interrompida com 50 μΙ/poço da solução de parada (KPL # 50-85-05). A absorbância foi lia a 450 nm. O tampão de ensaio utilizado continha PBS, BSA 5% e Tween 20 0,05%.
Hibridomas com positividade de ligação para o polipeptídeo hDR6-DCE-Fc testados no ensaio de ELISA de captura foram então clonados por diluição Iimitante (meio SCDME contendo 10% de HCF, 10% de FCS). 10 dias depois as placas foram retiradas e poços com uma colônia foram analisadas pelo ensaio de ELISA de captura descrito acima. Vários anticorpos monoclonais selecionados foram então testados pelos isotipos, e mostraram-se do isotipo IgGI.
Quatro dòs MAbs anti-DR6, identificados como "3B11.7.7"; "3F4.4.8"; "4B6.9.7" e "1 E5.5.7", foram então testados pelo ensaio de sobrevida na medula espinhal dorsal pela capacidade de bloqueio da degeneração axonal.
Surpreendentemente, alguns destes MAbs anti-DR6 (3F4.4.8; 4B6.9.7; e 1E5.5.7) foram capazes de inibir parcialmente a degeneração axonal dos neurônios comissurais induzido pela privação trófica de 48 horas na cultura (vide Figura 5). Acredita-se que esses anticorpos pode promover a sobrevivência neuronal, por exemplo, através do bloqueio da interação entre o Iigante putativo de DR6 e o receptor DR6 ou inibindo a sinalização DR6 independente de ligante. O anticorpo DR6 3B11.7.7 teve um ligeiro efeito estimulatório na indução da degeneração axonal. Exemplo 4
Inibicão Da Sinalização Do Receptor DR6 Pelo Inibidor Peptídico Específico Da Jun N-terminal Quinase (JNKl) O receptor DR6 tem sido relatado por sinalizar através da ativação da JNK1 e atividade da JNK foi observada por estar prejudicada em um modelo de camundongo DR6 null (Pan et ai, FEBS Leti., 431:351-356 (1998), Zhao et al. , Journal of Experimental Medicine, vol. 194, 1441-1441, 2001)). Para examinar o papel da sinalização DR6-JNK na degeneração axonal, um ensaio de sobrevida da medula espinhal dorsal (conforme descrito no Exemplo 2 acima) foi realizado com exceção de que a via de sinalização da JNK foi bloqueada nos neurônios comissurais por meio de um peptídeo inibidor, L-JNK-I ((L)-HIV-TAT48-57-PP-JBD20; Calbiochem) a uma concentração de 1 μΜ. DMSO (SIGMA) e o camundongo normal IgG foram
testados como controles.
Conforme exibido na Figura 6, a inibição da sinalização JNK
bloqueou parcialmente a degeneração axonal no ensaio de sobrevida na medula espinhal dorsal. Os dados sugerem que sinais de degeneração DR6 nos processos áxonais ocorre, pelo menos em parte, através da via JNK.
Exemplo 5 Inibicão Da Sinalização Do Receptor DR6 Por Anticorpos Anti-DR6 Previne A Morte Celular Neuronal Nas Medulas Espinhais Embrionárias
De Camundongos
Os ensaios foram conduzidos de modo que a sinalização DR6 foi bloqueada pelos MAbs anti-DR6 em um sistema de cultura de embriões inteiros. Este sistema, descrito abaixo, permite que embriões de camundongos inteiros possam ser cultivados in vitro em frascos por 2 dias a partir das fases E9.5 a E11.5. Embriões E9.5 foram dissecados fora do útero com saco vitelino anexado ao embrião e cultivados em soro de rato 100% (HarIan) ambiente com 65% de oxigênio para o primeiro dia e 95% de oxigênio para o segundo dia a uma temperatura de 37 °C. MAbs anti-DR6 (descrito nos exemplos acima), foram adicionados nos ensaios, a uma concentração final de 10 μg/ml, e anticorpos IgG de camundongos normais nas concentrações de 10 μg/ml foram
utilizados comó controle.
A coloração por Imunofluorescência com o anticorpo
reconhecendo a Caêpase-3 clivada (anticorpo para Caspase-3 clivada de camundongo, Comprados da R&D Systems) foi utilizada para detectar e observar microscopicamente as células apoptóticas. Os resultados são ilustrados na Figura 7. Surpreendentemente, a inibição do DR6 pelos MAbs anti-DR6 3F4.4.8; 4B6.9.7; e 1E5.5.7 protegeu os neurônios da medula espinhal contra o desenvolvimento da morte celular de ocorrência natural neste sistema.
Exemplo 6
Redução Na Morte Celular Neuronal Em Camundongos DR6 Null
Fenótipos de embriões DR6 knock-out (Zhao et ai, Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001) na fase de desenvolvimento Elõ-õ^foram analisados. A caspase-3 clivada é um marcador de células apoptóticas, e para analisar o grau de morte celular neuronal nas medulas espinhais embrionárias, foi utilizada a imunocoloração para caspase 3 clivada (anticorpo para a Caspase-3 clivada de camundongo, comprado da R&D Systems). Crias DR6 heterólogas também foram analisadas como controles. Cortes de tecidos embrionários fixados em paraformaldeído (PFA) foram bloqueados durante 1 hora na solução de bloqueio (2% de soro de cabra inativado por calor (Sigma) / PBS (Gibco) / 0,1% Triton (Sigma)) e incubados durante a noite a 4 0C1 com o anticorpo primário (diluição 1:500 de anticorpo para caspase-3 clivada de camundongo, comprado da R&D Systems) na solução de bloqueio. Os cortes foram lavados três vezes pela solução de bloqueio durante 1 hora a temperatura ambiente e incubadas com o anticorpo secundário (diluição 1:500 de cabra anti-coelho Alexa 488, Molecular Probes, Invitrogen) durante 1 hora a temperatura ambiente. Os cortes foram então lavadas por 1 hora a temperatura ambiente na solução de bloqueio e visualizados por imunofluorescência no canal verde.
O número de núcleos caspase 3 positivos por corte da medula espinhal por embrião foi quantificado (vide as Figuras 8 e 9A). Uma redução de aproximadamente 40 a 50% na morte de células neuronais foi detectada na medula espinhal e ganglionares da raiz dorsal ("DRGs") de camundongos DR6 null, em comparação com crias DR6 heterozigotas controles (Figuras 8 e 9A). Conseqüentemente, acredita-se que a sinalização DR6 pode promover à mórte celular neuronal no desenvolvimento do sistema nervoso in vivo.
Conforme exibido na Figura 9B, o DR6 é necessário para a degeneração do axônio motor como verificado com o camundongo DR6 null. Explantes da medula espinhal ventral (neurônios motores) de embriões normais, bem como de embriões DR6 knock-out (Zhao et al., Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441=1441, 2001) na fase de desenvolvimento E13.5 foram analisados, na presença e ausência de fator neurotrófico derivado dò cérebro (BDNF) e neurotrofina 3 (NT-3) (BDNF e NT-3 obtidos da Chemicon).
Na Figura 9B, o painel superior esquerdo mostra explantes da
medula espinhal ventral de camundongos normais na presença de BDNF e NT- 3, enquanto o painel inferior esquerdo mostra explantes da medula espinhal ventral de camundongos DR6 knock-out (ko) na presença de BDNF e NT-3. Do mesmo modo, o painel superior direito exibe explantes da medula espinhal ventral de camundongos normais, na ausência destes fatores de crescimento e o painel inferior direito exibe explantes da medula espinhal ventral de camundongos DR6 knock-out (KO) na ausência destes fatores de crescimento.
Materiais e métodos usados para gerar os dados apresentados nesta Figura 9B são os seguintes. O ensaio de sobrevida dos neurônios motores da medula espinhal ventral foi realizado conforme descrito em Henderson et ai, Nature, 363:266-270 (1993) com algumas modificações. Embriões E13.5 de camundongos DR6 heterozigóticos ou DR6 nuil foram dissecados, utilizando tesoura tratada com álcool, e colocados em meio L15 (Gibco) aquecido. Usando a mesma tesoura e pinça, a região ventral do embrião foi aberta, os órgãos foram removidos, costelas foram cortados fora e toda a medula espinhal foi dissecada, o tecido das meninges circundantes foi removido com pinça. As placas dorsais foram retiradas e foi obtida um preparação da medula espinhal em "livro aberto". O metade ventral da medula espinhal, incluindo as colunas motoras MMC e LMC foi isolada e o tecido da placa ventral foi cuidadosamente cortado fora. As medulas espinhais ventrais foram transferidas com ponteiras amarelas que foram revestidas na L15 para novas placas pequenas com L15 + FBS 5% (Sigma) para seccionamento posterior nos explantes usando uma agulha de tungstênio.
Lâminas com 8 poços revestidas com PDL/Laminina (Becton, Dickinson and Company) foram preenchidas com 500 μΙ de meio neurobasal por poço (Invitrogen) 'e 50 ng/mL de cada BDNF e NT-3 recombinante (Chemicon), acrescido de suplemento B-27 x50 (Invitrogen) ; mais Pen Strip Glutamine x100 (Cat. No. 10378-016; Gibco) mais Glicose X100. Os explantes da medula espinhal ventral seccionada foram colocados em cada poço (2-3 explantes por poço) e colocados em uma incubadora a 37 0C por 48 horas para o crescimento. Dois dias depois, a privação de fator trófico foi realizada da seguinte maneira: O meio antigo foi retirado, e os poços foram cuidadosamente lavados duas vezes com meio Neurobasal (SEM fatores tróficos).
O meio Neurobasal /B-27 (Invitrogen) pré-aquecido (preparado como descrito anteriormente SEM fatores tróficos) mais anticorpos de bloqueio anti-BDNF e anti-NT3 (Genentech, Inc.), foram adicionados em 20 pg/ml. As lâminas com os explantes foram então incubadas a 37°C por mais 24-48 horas.
Dois dias depois, os explantes foram fixados em PFA 4% em PBS1 permeabilizados com Triton 0,2% em Net Gel (Nikolaev et ai, 2003, Cell, 112 (1), 29-40) duranteΊ0 minutos a 0 0C1 e lavados duas vezes com Net Gel. Para bloquear sítios de ligações inespecíficas, as lâminas foram incubadas com BSA 1% em PBS, a 4 0C durante a noite. Para visualizar a degeneração dos axônios motores, a imunomarcação com o anticorpo anti-p75NTR específico (diluição 1:500, Chemicon) foi realizada no dia seguinte (Anticorpo primário 1:500 durante a noite a 4 0C em BSA 1%/PBS, Ac secundário 1:500 por 1 hora a temperatura ambiente). Os poços foram retirados, e meio de montagem "Fluoromount-G" foi utilizado para montar as lâminas com lamínulas. Para visualizar ao axônios motores expressando p75NTR, fotos foram tiradas no microscópio Zeiss (Axioplan-2 Imaging) utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da Carl Zeiss Imaging Solutions.
Conforme demonstrado nos dados divulgados na Figura 9C, as lesões induzidas pela degeneração foi retardada nos camundongos DR6 knock-out.
Na Figura 9C da esquerda para a direita, os 4 painéis superiores mostram neurônios de camundongos normais: na presença do fator de crescimento do neural (NGF)1 e 4, 8 ou 16 horas pós-lesão, respectivamente. Na Figura 9C da esquerda para a direita, os 4 painéis inferiores da esquerda para a direita mostram neurônios de camundongos DR6 KO: na presença do fator de crescimento neural (NGF) exógeno, e 4, 8 ou 16 horas pós-lesão, respectivamente.
O ensaio de lesão em axônios sensoriais in vitro como mostrado na figura 9C foi realizado da seguinte forma. Embriões de camundongos E12.5 DR6 null e DR6 heterozigotos foram dissecados e colocada em meio L15 (Gibco) aquecido. Usando a mesma tesoura e pinça, a região ventral do embrião foi aberta, os órgãos foram removidos, costelas foram cortados fora e os ganglionares das raízes dorsais (DRGs), associado à medula espinhal, foram dissecados com a pinça. DRGs foram transferidos com ponteiras amarelas que foram revestidas na L15 para novas piacas pequenas com Ll 5 + FBS 5% (Sigma) para seccionamento adicional em % de explantes usando
uma agulha de tungstênio.
Lâminas com 8 poços revestidas com PDL/Laminina (Becton,
Dickinson and Company) foram preenchidas com 500 μΙ de meio neurobasal por poço (Invitrogen) e 50 ng/mL de NGF (Roche Molecular Biochemicals), acrescido de suplemento B-27 x50 (Invitrogen); mais Pen Strip Glutamine x100. Os explantes de DRG foram colocados em cada poço (2-3 explantes de DRG por poço) e colocados em uma incubadora a 37 0C por 48 horas para o crescimento. Dois dias depois, um ensaio de lesão de axônio foi realizada da seguinte maneira: lesão foi induzida por dois cortes paralelos nos axônios sensoriais logo acima e logo abaixo do explante de DRG com uma micro-faca (Fine Science Tools). Os axônios não cortados à esquerda e à direita dos explantes DRG serviram como controles endógenos sem lesão. Lâminas com explantes DRG cortados foram fixados 0, 4, 8, 16 e 24 horas pós-lesão, com PFA 4% em PBS1 permeabilizados com 0,2% Triton em Net Gel (Nikolaev et ai, 2003, Cell, 112 (1) , 29-40) durante 10 minutos a 0 0C, e lavados duas vezes com Net Gel. Para bloquear sítios de ligações inespecíficas, as lâminas foram incubadas com BSA 1% em PBS, a 4 0C durante a noite. Para visualizar a degeneração dos axônios sensoriais, a imunomarcação com um anticorpo específico para β-tubulina neuronal classe Ill (diluição 1:500, Chemicon) foi realizada no dia seguinte (Anticorpo primário 1:500 durante a noite a 4 0C em BSA 1%/PBS, Ac secundário 1:500 por 1 hora a temperatura ambiente). Os poços foram retirados, e meio de montagem "Fluoromount-G" foi utilizado para montar as lâminas com lamínulas. Para visualizar ao axônios sensores marcados co imunofluorescência, fotos foram tiradas no microscópio Zeiss (Axioplan-2 Imaging) utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da CarIZeiss Imaging Solutions.
\ Exemplo 7
Anticorpo Antagonista Anti-DR6 Inibe A Degeneração De Neurônios
Conforme demonstrado na Figura 10A, anticorpos anti-DR6 inibem a degeneração de neurônios privados de diversos fatores tróficos (em ensaios de degeneração axonal).
Na Figura 10A, da esquerda para a direita, as duas primeiras fotografias, superior e inferior, exibem dados de neurônios comissurais. Nestas quatro primeiras fotografias, as duas fotografias superiores mostram neurônios comissurais na presença de um IgG controle e o anticorpo DR6 RA.5, respectivamente, enquanto as duas fotografias inferiores mostram neurônios comissurais na presença de anticorpos DR6 RA. 1 e anticorpos DR6 RA.3, respectivamente. As duas imagens do meio superior e inferior na Figura 10A mostram os dados de neurônios sensoriais. Nestas quatro fotografias do meio, as duas fotografias superiores mostram neurônios sensoriais, na presença e ausência do NGF, respectivamente, enquanto as duas fotografias inferiores mostram neurônios sensoriais na ausência de NGF1 mas na presença de anticorpos DR6 RA. 1 e anticorpos DR6 RA.3, respectivamente. As duas imagens, superior e inferior, a direita da Figura 10A mostram os dados dos neurônios motores. Nestas quatro fotografias da direita, as duas fotografias . 5 superiores mostram neurônios motores, na presença e ausência de fatores de crescimento, respectivamente, enquanto que as duas fotografias inferiores mostram neurônios motores, na ausência de fatores de crescimento, mas na presença de anticorpos 'DR6 RA.1 e anticorpos DR6 RA.3, respectivamente.
Materiais e métodos utilizados para gerar os dados apresentados nesta figura são ós seguintes. Os anticorpos DR6 monoclonais de camundongos RA.1 - RA.5 foram gerados pela imunização de camundongos com o ectodomínio DR6 como descrito no Exemplo 3 acima. Os anticorpos DR6 referidos neste exemplo e as Figuras como anticorpos "RA.1" e "RA.3" são, respectivamente,os anticorpos "1E5.5.7" e "3F4.4.8" descritos no Exemplo 3 (por exemplo, são simplesmente referidos utilizando uma nomenclatura diferente). Da mesma forma, o anticorpo "RA.5" referido neste exemplo e Figuras é o anticorpo "3B11.7.7" descrito no Exemplo 3 (por exemplo, são simplesmente referidos utilizando uma nomenclatura diferente).
As culturas de explantes sensores, motores e comissurais foram realizadas conforme descrito acima no Exemplo 2 e Exemplo 6, com as seguintes modificações. Para o ensaio de sobrevida do explante comissural, anticorpos DR6 RA.1 ou RA.3, ou IgG controle, foram adicionados a culturas de explantes comissurais a 20 microgramas/ml em uma concentração final de 24 horas após plaqueamento (Figura 10A). Para culturas de explantes sensoriais, o ensaio de privação de NGF foi realizado 48 horas após o plaqueamento. Meio neurobasal fresco sem NGF, mas com anticorpos de bloqueio de NGF (Genentech, Inc.), juntamente com os anticorpos DR6 indicados (RA.1 ou RA.3) ou IgG controle foram adicionados a cultura de explantes sensoriais a 20 microgramas/mI de concentração final 48 horas após o plaqueamento (Figura 10A). Para culturas de explantes motores, o ensaio de privação de fator trófico foi realizado 48 horas após o plaqueamento. Meio neurobasal fresco sem NT3/BDNF, mas com anticorpos bloqueadores de BDNF e bloqueadores de NT3 (Mabs com função de bloquear o fator trófico, Genentech, Inc.), juntamente com os anticorpos DR6 indicados (RA.1 ou RA.3) ou IgG controle foram adicionados a cultura de explantes motores a 20 microgramas/ml de concentração final 48 horas após o plaqueamento (Figura 10A). Para visualizar axônios sensoriais e motoras que foram marcados pela coloração de imunofluorescência com anticorpos anti-TUJ1 (Covance) e anti-p75NTR (Chemicon/Millipore), as imagens foram tiradas no microscópio Zeiss (Axioplan- 2 Imaging) utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da Carl Zeiss Imaging Solutions. Para visualizar os axônios comissurais expressando o GFP1 as fotos foram tiradas no microscópio invertido da Zeiss (Axiôvert 200) (no canal de fluorescência verde para GFP) utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da Carl Zeiss Imaging Solutions.
Conforme mostrado na figura 10B, os anticorpos anti-DR6 inibiram a degeneração de diversos neurônios com privação de fatores tróficos (em ensaios de corpos celulares apoptóticos através da coloração de TÚNEL). Na Figura 10B, a partir da esquerda, as duas imagens superiores e inferiores mostram os dados de neurônios comissurais. Nestas primeiras quatro fotografias, as duas fotografias superiores mostram neurônios comissurais na presença de anticorpos IgG controle e anticorpos DR6 do RA.5, respectivamente, enquanto as duas fotografias inferiores mostram neurônios comissurais na presença de anticorpos DR6 RA.1 e anticorpos DR6 RA.3, respectivamente. As duas conjunto do meio, superior e inferior, na Figura 10B mostram os dados de neurônios sensoriais. Nestas quatro fotografias do meio, as duas fotografias superiores mostram neurônios sensoriais, na presença e ausência do NGF, respectivamente, enquanto as duas fotografias inferiores mostram neurônios sensoriais na ausência de NGF, mas na presença de anticorpos DR6 RA. 1 e anticorpos DR6 RA.3, respectivamente. O conjunto das duas fotografias superior e inferior do lado direito da Figura 10B mostra dados de neurônios motores. Nestas quatro fotografias da direita, as duas fotografias superiores mostram neurônios motores, na presença e ausência de fatores de crescimento, respectivamente, enquanto que as duas fotografias inferiores mostram neurônios motores, na ausência de fatores de crescimento mas na presença de anticorpos DR6 RA. 1 e anticorpos DR6 RA.3, respectivamente.
A divulgação na Figura 10 sugere que o Iigante pode desempenhar um papel importante para a função de DR6 na degeneração axonal.
Materiais e métodos utilizados para gerar os dados apresentados nesta figura são os seguintes. Como referido anteriormente, os anticorpos DR6 monoclonais de camundongos RA. 1 - RA.5 foram gerados pela imunização de camundongos com o ectodomínio DR6 como descrito no Exemplo 3 acima. As culturas de explantes sensores, motores e comissurais foram realizadas conforme descrito acima no Exemplo 2 e Exemplo 6, com as seguintes modificações. Para o ensaio de sobrevida do explante comissural, como descrito no Exemplo 3 ácima, anticorpos DR6 RA. 1 ou RA.3, anticorpos RA.5 (alternativamente referido como "1B11.7.7", Genentech1 Inc.) ou IgG controle (Genentech, Inc.), foram adicionados a culturas de explantes comissurais a 20 microgramas/ml em uma concentração final de 24 horas após plaqueamento
(Figura 10B, esquerda).
Para culturas de explantes sensoriais, o ensaio de privação de NGF foi realizado 48 horas após o plaqueamento. Meio neurobasal fresco sem NGF, mas com anticorpos de bloqueio de NGF (Genentech, Inc.), juntamente com os anticorpos DR6 RA.1 ou RA.3 ou IgG controle (Genentech1 Inc.) foram adicionados a cultura de explantes sensoriais a 20 microgramas/ml de concentração final 48 horas após o plaqueamento (Figura 10B, meio). Para culturas de explantes motores, o ensaio de privação de fator trófico foi realizado 48 horas após o plaqueamento. Meio neurobasal fresco sem NT3/BDNF, mas com anticorpos bloqueadores de BDNF e bloqueadores de NT3 (Mabs com função de bloquear o fator trófico, Genentech, Inc.), juntamente com os anticorpos DR6 indicados (RA.1 ou RA.3) ou IgG controle foram adicionados a cultura de explantes motores a 20 microgramas/ml de concentração final 48 horas após o plaqueamento (Figura 10B, direita).
Os explantes foram fixados com PFA 4% em PBS e processados para a detecção de células em apoptose em nível único, baseado na marcação das quebras nas fitas de DNA (tecnologia TUNNEL) usando o kit para detecção "In Situ Cell Death Detection Kit' (Cat. No. 11 684 795 910,'Roche) de acordo com o manual de insíruções do fabricante (Roche). Apoptose em corpos celulares nas culturas de explantes comissurais sensores e motores foi analisada por microscopia de fluorescênciâ (Figura 10B). Para visualizar os corpos celulares apoptcticos TUNNEL- positivos marcados fluorescentemente, as fotos foram tiradas no microscópio Zeiss Axioplan-2 Imaging (em canal vermelho de fluorescênciâ) utilizando o software de computador AxioVisioh40
Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da CarIZeiss Imaging Solutions.
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Exemplo 8
Imunoadesinas DR6 Antagonistas Inibem A Degeneração De Neurônios
Conformè exibido na figura 11 A, a degeneração de axônios comissurais foi retardada pelo hDR6-DCE-Fc. A proteína imunoadesina hDR6- DCE-Fc utilizada neste experimento está descrita acima no Exemplo 3.
Na Figura 11 A, da esquerda para a direita, a primeira fotografia fornece um controle mostrando a degeneração do axônio comissural em 48 horas. A segunda fotografia mostra a degeneração do axônio comissural em 48 horas, na presença de 30 μg/ml de hDR6-DCE-Fc. A terceira fotografia mostra a degeneração do axônio comissural em 48 horas, na presença de 10 μg/ml de hDR6-DCE-Fc.
Materiais e métodos utilizados para gerar os dados apresentados
nesta figura são os seguintes. Culturas de explantes comissurais e ensaios de sobrevida foram preparados e realizados como descrito acima no Exemplos 2- 6. A proteína imunoadesina hDR6-DCE-Fc utilizada neste experimento está descrita acima no Exemplo 3. Para visualizar os axônios comissurais marcados com GFP1 as fotos foram tiradas no microscópio invertido da Zeiss (Axiovert 200) (no canal de fluorescência verde para GFP) utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da CarIZeiss Imaging Solutions.
Conforme mostrado na figura 11B, a hDR6-DCE-Fc atrasou a degeneração axonal sensorial induzida pela retirada do fator de crescimento neural (NGF). Na Figura 11B1 da esquerda para a direita, as três fotografias superiores mostram neurônios sensoriais privados de NGF na presença de um Fc controle as 0, 6 e 24 horas, respectivamente, enquanto as três fotografias inferiores mostram neurônios sensoriais privados de NGF na presença da construção DR6-Fc as 0, 6 e 24 horas, respectivamente.
A divulgação fornecida na Figura 11 fornece ainda que a sugestão de que o Iigante pode desempenhar um papel importante na função do DR6 na degeneração axonal.
Materiais e métodos utilizados para gerar os dados apresentados nesta figura são os seguintes. Para verificar se o Iigante é necessário para a função de DR6 na degeneração de axônios sensores, uma análise de cultura compartimentada de crescimento de axônios sensoriais e degeneração foi realizada da seguinte forma. Um sistema de câmara de célula nervosa Campenot foi utilizado para isolar processos neuronais (axônios) dos corpos celulares em diferentes compartimentos (ambientes com fluidos separados), análogo aos corpos celulares neuronais em um local do sistema nervoso projetando seus axônios para um alvo distai em outro local. O ensaio foi realizado como descrito originalmente por Campenot (Campenot et al.,. J Neurosci. 11(4): 1126-39 (1991)) com as seguintes modificações. Resumidamente, placas de cultura de tecidos de 35 mm foram revestidas com PDL/Laminina e riscado com um rastilho de pinos (Tyler Research) para gerar pistas, como ilüstrado, "por exemplo, nas Figuras 1 e 4 de Campenot et al., supra.
Uma gota de meio de cultura (meio Neurobasal suplementado com B27, 25 ng/ml de NGF, e 4 g/L de metilcelulose) foi colocado sobre o substrato arranhado. Um divisor Teflon (Tyler Research) foi assentado na graxa de silicone e uma aplicação de graxa de silicone foi colocada na boca do ranhura central. Os neurônios sensoriais dissociados derivados de DRGs de camundongos E12.5 foram suspensos em meio espesso em metilcelulose e carregado em uma seringa descartável estéril equipada com uma agulha de medida 22. Esta suspensão celular foi injetada nas faixas do centro de cada placa compartimentada sob um microscópio de dissecção. Foi permitido que os neurônios se assentassem durante a noite. O perímetro exterior da placa (o compartimento do corpo celular) e os compartimentos axonal interior foram preenchidos com meio contendo metil-celulose. Dentro de 3-5 dias in vitro, os axônios começam a surgir nos compartimentos da esquerda e direita como ilustrado, por exemplo, nas Figuras 1 e 4 de Campenot et al., supra. Para acionar a degeneração de axônio local, meio contendo NGF
do compartimento axonal foi substituído por meio neurobasal com anticorpos de bloqueio de NGF (anti-NGF, Genentech, Inc., 20 pg/ml). Zero hora, 6 horas, ou 24 a 48 horas após a privação de NGF os neurônios sensoriais foram fixados com PFA 4% por 30 minutos em temperatura ambiente e processados para coloração de imunofluorescência com o marcador de axônios TUJ-1 (Covance, diluição 1:500), para visualizar a degeneração dos axônios por microscopia de fluorescência (Figura 11B) (tal como acima descrito no Exemplo 7). Para visualizar os axônios sensoriais marcados com imunofluorescência nos compartimentos das câmaras de Campenot, as fotos foram tiradas no microscópio Zeiss Axioplan-2 Imaging utilizand o o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da CarIZeiss Imaging Solutions.
Para verificar se o Iigante é necessário para a função de DR6 no programa de degeneração axonal desencadeado pela retirada do NGF1 30 pg/ml de proteína imünoadesina hDR6-DCE-Fc (descrito no exemplo 3 acima) ou 30 μg/ml de um Fc 'controle Genentech , Inc.), foram incluídos juntamente com o tratamento anti-NGF nos compartimentos axonais das câmaras de Campenot. Zero a 24 horas após a privação de NGF1 os axônios nas Câmaras de Campenot foram fixados com 4% PFA em PBS e visualizados pela coloração de imunofluorescência com TUJ-1 (1:500, Covance) / anticorpo secundário conjugado com uma fluoróforo do grupo Alexa 488 (Molecular Probes, BD) (Figura Ϊ1Β).
A privação de NGF desencadeou um padrão notável de degeneração axonal, como mostrado na Figura 11B. Significativamente, a adição da proteína imünoadesina hDR6-DCE-Fc atrasou o início da degeneração axonal nèste sistema (Figura 11B, painéis inferiores). Assim, estes dados sugerem que o Iigante solúvel pode ser necessário para o receptor DR6 funcionar na degeneração axonal local induzida pela remoção de fatores de crescimento.
Exemplo 9
Liberação Dos Sítios de Ligação do DR6 Ligante De Axônios Após a
Privação De NGF Como mostrado nas figuras 12A e 12B, uma construção DR6-AP foi utilizada para a visualização os sítios de ligação de DR6 nos axônios sensoriais.
Na Figura 12A, da esquerda para a direita, as duas fotografias superiores mostram uma visualização de sítios de ligação de DR6 em axônios sensoriais no estágio de desenvolvimento E12.5 na presença de NGF em 48 horas usando uma construção DR6-AP para visualizar estes axônios em baixa e alta ampliação, respectivamente, enquanto as duas fotografias inferiores mostram uma visualização de axônios sensoriais utilizando uma construção AP controle em baixa e alta ampliação, respectivamente.
Conforme exibido na Figura 12B, os sítios de ligação do DR6 Iigantes são perdidos dos axônios sensoriais após a privação de NGF.
Na Figura 12B, da esquerda para a direita, as duas fotografias superiores mostram uma visualização dos sítios de ligação do DR6 nos axônios sensoriais, onde a primeira fotografia mostra neurônios sensoriais na presença de NGF e de um inibidor de ΒΑΧ, enquanto a segunda fotografia mostra neurônios sensoriais Bax null na presença de NGF. As duas fotografias inferiores exibem: neurônios sensoriais na ausência de NGF mas na presença de um inibidor ΒΑΧ; e neurônios sensoriais Bax null , na ausência de NGF, respectivamente. Resultados equivalentes são observados nos axônios motores na presença e ausência de neurotrofinas.
Os materiiais e os métodos utilizados para gerar os dados apresentados nas figuras 12A e 12B são os seguintes. A construção DR6-AP foi gerada pela fusão de um ectodomínio DR6 de camundongo a uma fosfatase alcalina de placenta humana (DR6-AP), utilizando o vetor de clonagem pRK5- AP (vide, por exemplo, Yan et al„ Nature Immunology 1, 37-41 (2000)). O vetor de clonagem parental PRK5 é disponível comercialmente pela Becton, Dickinson and Company, Pharmingen division. A seqüência do ectodomínio DR6 murino usada para gerar a proteína de fusão DR6-AP é a seguinte: MGTRASSITALASCSRTAGQVGATMVAGSLLLLGFLSTITAQPEQKTLSLPGTY RHVD RTTG QVLTC D KC P AGTYVS EHCTNM S LR VC SSC P AGTFTR H E N GIE RC HDCSQPCPWPMIERLPCAALTDRECICPPGMYQSNGTCAPHTVCPVGWGVR KKGTENEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAHTDCLGQNLEWKPGTKETD NVCGMRLFFSSTNPPSSGTVTFSHPEHMESHDVPSSTYEPQGMNSTDSNST ASVRTKVPSGIEEGTVPDNTSSTSGKEGTNRTLPNPPQVTHQQAPHHRHILKL LPSSMEATGEKSSTAIKAPKRGHPRQNAHKHFDINEH (SEQ ID No: 14)
A linhagem de camundongo Bax null (Bax-RI)1 foi previamente descrita (Deckwerth et al. Neuron, vol. 17, 401-411, 1996) e foi obtido a partir do Jackson Laboratories. O peptídeo inibidor de BAX foi utilizado a uma concentração de 10 uM para bloquear a morte celular neuronal (Bax-V5, Tocris Inc).
Para gerar a proteína de fusão AP-ectodomínio DR6 de camundongo (DR bv6-ÂP), células COS-1 cultivadas em meio DMEM/FBS 10% (Gibco) foram transfectadas com 15 microgramas da construção de expressão fusão DR6-AP utilizando o reagente de transfecção FuGene (Roche), de acordo com o protocolo do fabricante. Doze horas após a transfecção, o meio da célula COS-1 foi alterado para OPTI-MEM (Invitrogen). Quarenta e oito horas pós-transfecção, o meio condicionado da célula COS-1 contendo proteínas DR6-AP foi coletado e filtrado. A quantidade de proteínas DR6-AP no meio foi quantificada da seguinte forma:
100 microlitros de tampão 2X AP (preparado pela adição de 100 mg de para-nitrofenil fosfato (Sigma) e 15 microlitros de MgCb 1M a 15ml de dietanolamina 2M pH 9,8) foi misturado com volume igual meio condicionado de células COS transfectadas ou meio condicionado de células controle COS-1 não transfectadas. A cor da reação foi desenvolvida durante 12/15 minutos, com a O.D. estando na faixa linear (0,1-1). O volume de reação que foi então ajustado pela adição de 800 microlitros de água destilada e a OD foi mensurada a um comprimento de onda de absorbância de 405 nm. A concentração em nM foi calculada de acordo com a fórmula (por 100 microlitros): C (nM) = O.D. X 100 X (60 / tempo de desenvolvimento)/30.
Para o ensaio de ligação do in situ do DR6-AP no axônio
sensorial, tanto os explantes do tipo selvagem quanto os explantes Bax null foram cultivados em meio Neurobasal /B27 (Invitrogen), conforme descrito nos exemplos 7-8 acima, com 50 ng/mL de NGF (Roche). Dois dias após o plaqueamento, explantes DRG foram deixados sem tratamento ou privados de NGF como nos exemplos 7-8 descritos acima. O peptídeo inibidor de Bax foi adicionado onde indicado na Figura 12B (10 μΜ, Bax-V5, Tocris). Doze horas de após a privação de NGF1 os explantes DRG foram lavados duas vezes com o tampão de ligação (HBSS, Gibco Cat. No. 14175-095, com BSA 0,2% , NaN3 0,1% , CaCI2 5 mM, MgCI2 1 mM, HEPES 20 mM, pH = 7,0). O ensaio de ligação AP foi então realizado, fazendo uma mistura 1:1 de meios DR6-AP condicionado a o tampão de ligação (ou meio AP controle condicionado e tampão de ligação), que foi aplicado diretamente aos explantes de DRG em lâminas de culturas de 8 poços (Becton, Dickinson and Company) e incubadas por 90 minutos ém temperatura ambiente. Após a incubação, as proteínas DR6-AP não ligadas foram
lavadas pela lavagem dos explantes DRG por cinco vezes, com o tampão de ligação. Os explantes DRG foram então fixados com formaldeído 3,7% diluído em PBS1 por 12 minutos em temperatura ambiente. O formaldeído remanescente foi removido pela lavagem dos explantes DRG por 3 vezes com tampão HBS (HEPES 20mM pH = 7,0, NaCI 150 mM). A atividade da AP endógena foi bloqueada com inativação pelo calor a 65 0C em tampão HBS durante 30 minutos. Os explantes DRG foram então lavados três vezes no tampão de reação da AP (Tris 100 mM; pH = 9,5, NaCI 100 mM, MgCI2 50 mM). A ligação da proteína de fusão DR6-AP aos axônios sensoriais foi então visualizada pelo desenvolvimento de cor sobre os explantes DRG no tampão de reação da AP com 1/50 (por volume) de NBT/BCIP da solução estoque (Roche1 cat. No. 1681451), durante a noite em temperatura ambiente (Figuras 12A e B). Em um experimento controle paralelo, o meio condicionado das células COS transfectadas com AP foi utilizado para o ensaio de ligação do axônio a AP (Figura 12A, painéis inferiores).
Conforme pode ser observado na Figura 12B, os sítios de ligação DR6-AP são perdidos a partir da superfície do axônio sensorial após a privação do NGF1 sugerindo que o Iigante DR6 é liberado para o meio onde o axônio está condicionado após a privação trófica.
Conforme mostrado na figura 12C, estudos com axônios sensoriais BAX null em fases de desenvolvimento E12.5 exibem que um inibidor da beta secretase (BACE) pode bloquear o desaparecimento dos sítios de ligação DR6-AP de axônios sensoriais após a retirada do NGF. Na Figura 12C, da esquerda para a direita, as três fotografias superiores mostram esses neurônios na presença de: Um controle DMSO; OM99-2 (inibidor BACE-I) e TAP1 (inibidor da alfa-secretase-l), respectivamente. As fotografias inferiores exibem estes neurônios na presença de NGF. A proteína de fusão AP-ectodomínio DR6 de camundongo usada
para gerar esses dados está descrita acima. A linhagem de camundongos Bax null (Bax-R1), foram previamente descritas (Deckwerth et al. Neuron, vol. 17, 401-411, 1996) e foram obtidas pelo Jackson Laboratories. Culturas de explantes DRG e o ensaio de ligação DR6-AP ao axônio foram realizados como descrito acima para as Figuras 12A e 12B. O inibidor BACE foi utilizado no ensaio a uma concentração final de 1 μΜ (InSoIution OM99-2, Calbiochem / Merck). O inibidor da alfa-secretase TAPI foi utilizado no ensaio a uma concentração final de 10 μΜ (TAPI-1, Calbiochem). Para visualizar os axônios sensoriais DR6-AP positivos (corados pela reação colorimétrica da AP descrita no Exemplo 9 supra), fotos dos campos brilhantes foram tiradas no microscópio Zeiss Axioplan-2 Imagirig utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da Carl Zeiss Imaging Solutions.
Exemplo 10
Proteína Precursora Amilóide (APP) É Um Ligante Cognato De DR6
Conforme exibido na Figura 13, N-APP foi encontrada para ser um Iigante associado ao ectodomínio DR6.
Na Figura 13A, da esquerda para a direita, os dois primeiros blots fornecem dados a partir de estudos utilizando uma construção DR6-AP para sondar proteínas obtidas de neurônios sensoriais e motores, na presença e ausência de fator de crescimento (e na presença de um inibidor de Bax). Nestes blots, os polipeptídeos APP incluindo uma banda forte a aproximadamente 35 kDA são observadas em tanto em neurônios motores quanto em neurônios sensoriais privados de fator de crescimento (e na presença de um inibidor de Bax). O blot central na figura 13A mostra que os polipeptídeos AlPP incluindo a banda forte a aproximadamente 35 kDA são correspondentemente observadas com a sonda anticorpo anti-N-APP de polipeptídeos obtidos de neurônios sensoriais privados de fator de crescimento. O anticorpo policlonal ãnti-N-APP utilizado para os experimentos de Western blot na diluição de 1:100 foi obtido da Thermo Scientific (Cat. No. RB-9023-P1). A peptídeo inibidor de Bax P5 foi utilizado a uma concentração de 10 μΜ (Tocris Biosciences, cat. No. 1786, peptídeo sintético permeável nas células inibidor da translocação de Bax para mitocôndrias).
A observação de que a APP é um Iigante associado ao ectodomínio de DR6 foi ainda confirmada pelos dados apresentados no blot exibido a direita da figiira 13A. Um protocolo "pull-down" geral (por exemplo, Nikolaev et ai, 2004, BBRC, 323, 1216-1222) foi utilizado para purificar os fatores associados ao ectodomínio DR6-DCE a partir do meio condicionado do axônio sensorial, que foi coletado dos compartimentos axonais das Câmaras Campenot sob condições de privação de NGF. Esferas NiNTA (Sigma) acopladas ao ectodomínio DR6-ECD-His (construção descrita abaixo) foram incubadas com 50 ml de meio condicionado de axônio sensorial, nas seguintes condições: NaCI 150 mM, NP-40 a 0,2% (Calbiochem), tampão PBS 1X, incubado durante a noite a 4 0C. As esferas NiNTA (Sigma) acopladas ao ectodomínio DR6-ECD-His foram, em seguida, lavadas 5 vezes com um excesso de 10 vezes do tampão de ligação (150 mM de NaCI1 NP-40 a 0,2% (Calbiochem), em tampão PBS 1X), e os complexos de proteína associados a DR6-ECD foram eluídos com tampão de carregamento da amostra SDS 1x (Invitrogen)) que foram, então, separados através da eletroforese em gel e analisadas com o anticorpo anti-N-APP. Os dados deste experimento "pull dowrí' identificou correspondentemente polipeptídeos APP incluindo uma forte banda a aproximadamente 35kDA.
O ensaio de blot da AP-DR6 no meio condicionado de axônio foi realizado de acordo coím o protocolo descrito anteriormente (Pettmann et ai, 1988, J. Neurosci., 8 (10) :3624-3632). O anticorpo policlonal anti-N-APP usado para os experimentos de Western blot foi obtido da Thermo Scientific (Cat. No. RB-9023-P1). A proteína de fusão AP-ectodomínio DR6 de camundongo utilizada foi a acima descrita no Exemplo 9. A DR6-DCE-His recombinante de camundongo foi expressa e subseqüentemente purificada a partir de culturas de células CHO. A seqüência de aminoácidos da DR6-DCE-His murina é a seguinte:
MGTRASSITALASCSRTAGQVGATMVAGSLLLLGFLSTITAQPEQKTLSLPGTY RHVDRTTGQVLTCDKCPAGTYVSEHCTNMSLRVCSSCPAGTFTRHENGIERC HDCSQPCPWPMIERLPCAALTDRECICPPGMYQSNGTCAPHTVCPVGWGVR KKGTENEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAHTDCLGQNLEWKPGTKETD NVCGMRLFFSSTNPPSSGTVTFSHPEHMESHDVPSSTYEPQGMNSTDSNST ASVRTKVPSGIEEGTVPDNTSSTSGKEGTNRTLPNPPQVTHQQAPHHRHILKL LPSSMEATGEKSSTAIKAPKRGHPRQNAHKHFDINEHHHHHH (SEQ ID No: 15)
A Figura 13B exibe outra visualização do Iigante DR6 no meio
condicionado do axônio pelo blotting DR6-AP. Estes dados do blotting identifica uma série de polipepíídeos APP incluindo o APP N-terminal a 35 kDa, bem como os polipeptídeos C99-APP e C83/C89 APP. O ensaio de blot da AP-DR6 no meio condicionado de axônio foi realizado de acordo com o protocolo descrito anteriormente (Pettmann et ai, 1988, J. Neurosci., 8 (10) :-). 3624- 3632). A proteína de fusão AP-ectodomínio DR6 de camundongo utilizada foi gerada como descrito acima no Exemplo 8. A DR6-DCE-His recombinante de camundongo foi expressa e subseqüentemente purificada a partir de culturas de células CHO. A seqüência de aminoácidos da DR6-DCE-His é exibida acima. O anticorpo policlonal anti-N-APP usado para os experimentos de Western blot foi obtido da Thermo Scientific (Cat. No. RB-9023-P1). Para visualizar os fragmentos C-terminal da APP (CTFs) presos a membrana C99- APP e C83/C89-APP, a análise por Western blot de Iisados axonais foi realizada utilizando o anticorpo 4G8 que reconhece um epítopo na parte central do Abeta (monoclonal 4G8, 1:500, Covance).
A Figura 14A fornece fotografias demonstrando que a perda do ectodomínio APP ocorre numa fase precoce após a privação de NGF. Na Figura 14A, neurônios em vários momentos pós remoção do fator de crescimento foram corados com um anticorpo policlonal APP-N1 na presença de um inibidor de Bax adicionado para bloquear a degeneração axonal. Da esquerda para a direita, estas fotografias exibem a degeneração axonal em 0 horas, bem como 3, 6, 12 e 24 horas após a remoção do NGF (e a adição de anticorpos anti-NGF). O anticorpo policlonal anti-N-APP usado para visualizar a expressão de APP na superfície em experimentos de perda de APP do axônio foi obtido da Thermo Scientific (Cat. No. RB-9023-P1). As culturas de neurônios sensoriais foram realizados conforme descrito nos Exemplos 6 e 7 acima. O ensaio de privação de NGF foi realizado como descrito acima no Exemplo 7, com as seguintes alterações: As culturas de explantes DRG foram fixadas em PFA 4% em PBS após os seguintes intervalos de tempo da privação de NGF: 0 hora, 3 horas, 6 horas, 12 horas e 24 horas. Para visualizar a expressão de APP na superfície, axônios DRG foram processados para a colorações de imunofluorescência como nos Exemplos 6 e 7, sem a etapa de permeabilização com Triton, usando o anticorpos primário anti-N-APP descrito acima.
Para visualizar a expressão de APP na superfície de axônios sensores (marcados por imunofluorescência com anticorpo anti-N-APP, Thermo Scientific (Cat. No. RB-9023-P1)), as fotos foram tiradas no microscópio Zeiss Axioplan-2 Imaging (em canal vermelho de fluorescência) utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da Carl Zeiss Imaging Solutions
A Figura 14B fornece fotografias demonstrando que o ectodomínio DR6 se liga a APP expressa por células cultivadas. Na Figura 14B, da esquerda para a direita, as duas fotografias superiores exibem as células Cos controle è células expressando APP, respectivamente sondadas com DR6-APP (tendo o ectodomínio DR6). As duas fotografias inferiores mostram o receptor p75NTR e o receptor DR6 expressos em células sondadas com DR6-AP. O ectodomínio DR6 não se liga a células expressando receptores p75NTR ou DR6.
Os materiais e os métodos utilizados para gerar os dados apresentados nesta figura são os seguintes. Para testar se APP interage diretamente com o domínio extracelular DR6, um ensaio de ligação AP baseados em célula foi realizado (Figura 14B). Para gerar a proteína de fusão ectodomínio DR6-AP (DR6-AP), células COS-1 cultivadas em meio DMEM/ 10% FBS (Gibco) foram transfectadas com 15 microgramas de construções de expressão da fusão DR6-AP utilizando o reagente de transfecção FuGene (Roche)1 de acordo com o protocolo do fabricante. Doze horas após a transfecção, o meio da célula COS-1 foi alterado para OPTI-MEM (Invitrogen). Quarenta e oito horas pós-transfecção, o meio condicionado da célula COS-1 contendo proteínas DR6-AP foi coletado e filtrado.
A quantidade de proteínas DR6-AP, no meio foi quantificado de acordo com o seguinte procedimento. 100 microlitro de tampão 2X AP (preparado pela adição de 100 mg de para-nitrofenil fosfato (Sigma) e 15 microlitros de MgCI2 1M a 15ml de dietanolamina 2M pH 9,8) foi misturado com volume igual de meio condicionado de células COS transfectadas ou meio condicionado de células controle COS-1 não transfectadas. A cor da reação foi desenvolvida durante 12/15 minutos, com a O.D. estando na faixa linear (0,1- 1). O volume de reação que foi então ajustado pela adição de 800 microlitros de água destilada e a OD foi mensurada a um comprimento de onda de absorbância de 405 nm. A concentração em nM foi calculada de acordo com a fórmula (por 100 microlitros): C (nM) = O.D. X 100 X (60 / tempo de desenvolvimento)/30.
Para o ensaio de ligação APP AP, células COS-1 cultivadas em meio DMEM/ 10% de FBS (Gibco), em placas de cultura de 6 poços foram transfectadas com 2 microgramas de vetor de expressão APP por poço usando o reagente de transfecção FuGene (Roche), de acordo com o protocolo do fabricante. Dois dias após a transfecção, as células foram lavadas duas vezes com o tampão de ligação (HBSS, Gibco Cat. No. 14175-095, com BSA 0,2% , NaN3 0,1% , CaCI2 5 mM, MgCI2 1 mM, HEPES 20 mM, pH = 7,0). Um ensaio de ligação AP foi então realizado através de uma mistura 1:1 de meio condicionado DR6-AP e tampão de ligação, o qual foi aplicado diretamente sobre as células COS-I expressando APP e incubadas por 90 minutos a temperatura ambiente. Após a incubação, as proteínas DR6-AP não ligadas foram lavadas pela lavagem das células COS-1 por cinco vezes com o tampão de ligação. As células foram então fixadas com formaldeído 3,7% diluído em PBS1 por 12 minutos em temperatura ambiente. O formaldeído remanescente foi removido pela lavagem das células por 3 vezes com tampão HBS (HEPES 20mM pH = 7,0, NaCI 150 mM). A atividade da AP endógena foi bloqueada com inativação pelo calor a 65 0C em tampão HBS durante 30 minutos. As células COS-1 foram então lavadas três vezes no tampão de reação da AP (Tris 100 mM; pH = 9,5, NaCI 100 mM, MgCI2 50 mM). A ligação da proteína de fusão DR6-AP à APP transmembrana foi então visualizada pelo desenvolvimento de cor sobre as células COS-1 no tampão de reação da AP com 1/50 (por volume) de NBT/BCIP da solução estoque (Roche, cat. No. 1681451), durante a noite em temperatura ambiente (Figura 14B). Em um experimento controle paralelo, o meio condicionado das células COS transfectadas foi utilizado para o ensaio de ligação a AP. Receptores transmembrana DR6 e p75NTR expressos em células COS-1 não demonstraram ligação específica para a proteína de fusão DR6-AP (Figura 14B), sob as mesmas condições experimentais, indicando que a interação entre o ectodomínio DR6 e APP é específico.
A Figura 14C fornece fotografias exibindo que o DR6 é o principal receptor para N-APP nos axônios sensores e que os sítios de ligação APP são significativamente depletados nas células neuronais de camundongos DR6 null. Na Figura 14C, da esquerda para a direita, as três fotografias superiores exibem neurônios obtidos a partir de um camundongo DR6 +/- (het) sondados com um AP controle, N-APP-AP, e Sema3A-AP, respectivamente. As três fotografias inferiores mostram correspondentemente neurônios obtidos a partir de um camundongo DR6 -/- (KO) analisadas com um AP controle, N-APP-AP1 e Sema3A-AP, respectivamente.
Os materiais e métodos utilizados para gerar os dados exibidos nas Figuras 14C, são os seguintes. A proteína de fusão AP-ectodomínio DR6 de camundongo utilizada foi gerada como descrito no Exemplo 9, acima. A proteína de fusão AP-ectodomínio Sema3A (Sema3A-AP) de camundongo utilizada, foi gerada como descrito anteriormente (Feiner et al., 1997, Neuron, vol. 19, 539-545). A linhagem de camundongo DR6 null (DR6.KO) foi descrita anteriormente (Zhao et al., Journal of Experimental Medicine, vol. 194, 1441- 1441, 2001). As culturais de explante DRG e o ensaio de ligação de DR6-AP em axônio foram realizados como descrito acima no Exemplo 9 para as Figuras 12A e 12B.
A Figura 14D fornece fotografias exibindo que os anticorpos antagonista de DR6 interromperam a interação entre o ectodomínio DR6 e a APP neuronal. Nestes estudos, a N-APP foi adicionada as células neuronais expressando DR6 e, em seguida, visualizados com o anticorpo anti-N-APP. Da esquerda para a direita, as quatro primeiras fotografias mostram a capacidade da N-APP de se ligar a DR6 na superfície dos neurônios, na presença de: um controle IgG; o anticorpo anti-DR6 RA.4; o anticorpo anti-DR6 RA.3; e o anticorpo anti-DR6 RA. 1, respectivamente. A fotografia da extrema direita exibe a coloração de DR6 em células usando um IgG controle.
Os materiais e os métodos utilizados para gerar os dados apresentados nesta figura são os seguintes. A ensaio de ligação do Iigante baseado em célula utilizado para se obter os dados exibidos na Figura 14D foi realizado conforme previamente descrito (Okada et al., Nature, 2006, Vol. 444, 369-373), com as seguintes modificações. Para gerar a proteína de fusão APP- His domínio similar ao N-terminal do fator de crescimento (N-APP-His), células COS-1 cultivadas em meio DMEM/ 10% FBS (Gibco) foram transfectadas com microgramas de construções de expressão da fusão N-APP-His utilizando o reagente de transfecção FuGene (Roche), de acordo com o protocolo do fabricante. Doze horas após a transfecção, o meio da célula COS-1 foi alterado para OPTI-MEM (Invitrogen). Quarenta e oito horas pós-transfecção, o meio condicionado da célula COS-1 contendo proteínas N-APP-His foi coletado e filtrado. A concentração de N-APP-His foi determinada pela análise por Western blot com o anticorpo anti-N-APP descrito acima.
A seqüência de aminoácidos N-APP-His humano utilizado neste teste de ligação foi o seguinte: MLPGLALLLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFCGRLNMHMNVQNGK WDSDPSGTKTCIDTKEGILQYCQEVYPELQITNWEANQPVTIQNWCKRGRK QCKTHPHFVIPYRCLVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAK ETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNVDSADAEEDHHH HHH (SEQ ID No: 10)
Um ensaio de ligação N-APP-His foi então realizado através de
uma mistura 1:1 de meio condicionado N-APP-His e tampão de ligação, o qual foi aplicado diretamente sobre as células COS-1 super-expressando o receptor DR6 e incubadas por 90 minutos a temperatura ambiente. Quando indicado, MAbs de DR6 RA.1, RA.3 ou RA.4 (acima descrito, Exemplos 3 e 7) foram adicionados individualmente a 20 pg/ml em conjunto com o meio condicionado N-APP-His e o tampão de ligação. IgG de camundongo normal (Genentech Inc) foi adicionado a 20 pg/ml em conjunto com o meio condicionado N-APP-His e o tampão de ligação em um experimento controle.
A ligação do N-APP a células expressando receptor DR6 foi visualizada pela coloração de imunofluorescência com o anticorpo anti-N-APP (Thermo Scientific cat. No. RB-9023-P1), de acordo com protocolos conhecidos como os descrito nos protocolos dos Exemplos 6 e 7 (Okada et al., Nature, 2006, vol. 444, 369-373). Para visualizar a proteína N-APP ligada ao receptor DR6 na superfície celular (marcados por imunofluorescência com anticorpo anti-N-APP, Thermo Scientific (Cat. No. RB-9023-P1)), as fotos foram tiradas no microscópio Zeiss Axioplan-2 Imaging (em canal vermelho de fluorescência) utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da Carl Zeiss Imaging Solutions
Exemplo 11
Proteínas Precursora Amilóide (APP) Ativa o DR6 Para Induzir A
Degeneração Axonal
A Figura 15A fornece fotografias exibindo que o anticorpo policlonal para a APP N-terminal bloqueia a degeneração axonal em um ensaio com axônio comissural. Da esquerda para a direita, as fotografias na Figura 15A exibem a degeneração do axônio comissural na presença de: um IgG controle, 30 μg/ml de um anticorpo anti-NAPP; e 1,1 μg/ml de um anticorpo anti-NAPP, respectivamente.
Os materiais e os métodos utilizados para gerar os dados apresentados na Figura 15A, são os seguintes. O ensaio de sobrevida do explante comissural foi realizado com quantidades indicadas de anticorpo policlonal anti-N-APP (Thermo Scientific cat. No. RB-9023-P1, extensivamente dialisado) ou IgG controle (IgG de coelho, R&D systems), conforme descrito nos protocolos do Exemplo 2 e os dados gerados na Figura 4B. Para visualizar os axônios corriissurais marcados com GFP1 as fotos foram tiradas no microscópio invertido da Zeiss (Axiovert 200) (no canal de fluorescência verde para GFP) utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da Carl Zeiss Imaging Solutions.
A Figura 15B fornece fotografias mostrando que os anticorpos APP N-terminal inibem a degeneração de axônios sensoriais induzida pela remoção de NGF. Da esquerda para a direita, as três fotografias superiores da
«r
Figura 15B exibem axônios sensoriais na presença de NGF e: um anticorpo controle; anticorpo monoclonal anti-APP 22C11, e anticorpos policlonais anti- APP1 respectivamente. As três fotografias inferiores exibem correspondentemente axônios sensoriais na ausência de NGF (bem como um anticorpo anti-NGF) e: um anticorpo controle; anticorpo monoclonal anti-APP 22C11, e anticorpos policlonais anti-APP, respectivamente.
Os materiais e os métodos utilizados para gerar os dados apresentados nesta Figura 15B são os seguintes. O ensaio de privação do NGF foi realizado em Câmaras Campenot, como descrito acima no Exemplo 8. Anticorpos contra o APP N-terminal utilizados no ensaio foi o anticorpo policlonal anti-N-APP (Thermo Scientific cat. No. RB-9023-P1, extensivamente dialisado) ou anticorpo monoclonal 22C11 (22C11, Chemicon, extensivamente dialisado). O IgG normal (IgG de coelho, R&D systems) foi adicionado como um experimento controle. A marcação por imunofluorescência de axônios sensores com o anticorpo TUJ1 (1:500, Covance) foi realizado conforme descrito nos Exemplos 1, 7 e 8. Para visualizar os axônios sensoriais marcados com imunofluorescência nos compartimentos das câmaras de Campenot, as fotos foram tiradas no microscópio Zeiss Axioplan-2 Imaging utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da Carl Zeiss Imaging Solutions. A Figura 15C fornece fotografias mostrando que a degeneração
axonal que é bloqueada pela inibição da atividade da β-secretase (BACE) podem ser resgatada através da adição de N-APP. Da esquerda para a direita, as três fotografias superiores na Figura 15C exibem neurônios (cultivados na ausência de NGF) e a degeneração axonal observada na presença de: um controle DMSO, um inibidor BACE, e N-APP (e BACE-I), respectivamente. As três fotografias inferiores na Figura 15C exibem correspondentemente neurônios (cultivados na presença de NGF), bem como: um controle DMSO, um inibidor BACE, e N-APP (e BACE-I), respectivamente. Materiais e métodos usados para gerar os dados apresentados nesta Figura 15C, são os seguintes. O ensaio de privação do NGF foi realizado em Câmaras Campenot, como descrito acima no Exemplo 8. Os aminoácidos N-APP humano recombinante 19-306 utilizados neste ensaio foi comprado da Novus (Novus Biologicals, cat. No. H00000351-P01). O N-APP foi adicionado em 3 μg/ml juntamente com o inibidor BACE (1 μΜ na concentração final, InSoIution OM99-2, Calbiochem / Merck), no momento da privação do NGF. O inibidor BACE foi utilizado no ensaio a uma concentração final de 1 μΜ (InSoIution OM99-2, Calbiochem / Merck). A marcação por imunofluorescência de axônios sensores com o anticorpo TUJ1 (1:500, Covance) foi realizado conforme descrito nos Exemplos 1, 7 e 8. Para visualizar os axônios sensoriais marcados com imunofíuorescência nos compartimentos das câmaras de Campenot, as fotos foram tiradas no microscópio Zeiss Axioplan-2 Imaging utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da Carl Zeiss !maging Solutions.
A Figura 15D fornece fotografias exibindo a remoção da APP por células neuronais sensibilizadas com RNAi cultivadas na presença de inibidor
BACE para a morte celular induzida por N-APP. Na figura 15D, da esquerda
j
para a direita, as três fotografias superior exibem neurônios cultivados na presença de um RNAi controle. Estas fotografias superiores mostram um controle, bem como neurônios cultivados com 3 μg/ml de N-APP ou 0,1 μg/ml de N-APP, respectivamente. As três fotografias inferiores exibem neurônios cultivados na presença de um RNAi da APP. Estas fotografias inferiores exibem um controle, bem como neurônios cultivados com 3 μg/ml de N-APP ou 0,1 μg/ml de N-APP, respectivamente.
Materiais e métodos usados para gerar os dados apresentados nesta Figura 15D são os seguintes. O RNAi da APP nas culturas de explantes comissurais foram realizadas conforme descrito no Exemplo 2. Os aminoácidos N-APP humano recombinante 19-306 utilizados neste ensaio foram comprados da Novus (Novus Bioiogicals, cat. No. H00000351-P01). O pool de RNAi pre- concebido, específico de rato, APP-ON-TARGETplus foi utilizado neste experimento, de acordo com os protocolos do fabricante para infra-regular a expressão de APP rios explantes comissurais de ratos E13 (APP ON- TARGETplus siRNA pool, GenelD: 54226, Cat. No. 088191, Dharmacon Inc.). Para visualizar os axônios comissurais marcados com GFP (tal como descrito nos exemplos 2 e 7), as fotos foram tiradas no microscópio invertido da Zeiss (Axiovert 200) (no canal de fluorescência verde para GFP) utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da Carl Zeiss Imaging Solutions.
Exemplo 12
DR6 É Necessário Para A Degeneracão Axonal Induzida Por APP. Mas Não Para A Degeneração Desencadeada Pela Abeta
Conforme exibido na Figura 16A, a ativação de DR6 é necessária
para a degeneração axonal induzida por N-APP.
Na Figura 16A, da esquerda para a direita, as três fotografias superiores exibem neurônios obtidos a partir de um camundongo DR6 +/- (het). A primeira foto mostra neurônios controle não exposto a Abeta ou N-APP, a segunda foto mostra neurônios expostos a Abeta, e a terceira fotografia mostra neurônios expostos a N-APP. As três fotografias inferiores exibem neurônios obtidos a partir de um camundongo DR6 -/- (KO). Da esquerda para a direita, a primeira fotografia inferior mostra neurônios controle não exposto a Abeta ou N- APP, a segunda foto mostra neurônios expostos a Abeta, e a terceira fotografia mostra neurônios expostos à N-APP.
Materiais e métodos usados para gerar os dados apresentados nesta Figura 16A são os seguintes. Culturas de explantes comissurais e ensaio de sobrevida foram realizados conforme descrito no Exemplo 2. A linhagem de camundongo DR6 null (DR6.KO) foi descrita anteriormente (Zhao et ai, Journal of Experimental Medicine, vol. 194, 1441-1441, 2001). Os aminoácidos N-APP humano recombinante 19-306 utilizados neste ensaio foi comprado da Novus (Novus Biologicals, cat. No. H00000351-P01). Os aminoácidos Beta amilóide humano recombinante 1-42 utilizados no presente ensaio foi comprado da Chemicon (Abeta humano ultra puro 1-42, cat. No. AG912, Chemicon). N-APP foi adicionado aos explantes comissurais a 3 μς/ηιΙ, 24 horas após o plaqueamento, juntamente com o inibidor BACE. Os aminoácidos Beta amilóide recombinante humano f-42 foi adicionado aos explantes comissurais em uma concentração de 3 μΜ, 24 horas após o plaqueamento, juntamente com o inibidor BACE. O inibidor BACE foi utilizado no ensaio a uma concentração final de 1 μΜ (InSoIution OM99-2, Calbiochem / Merck). Os explantes comissurais foram incubados com as quantidades indicadas de N-APP ou Abeta por mais 24 horas. Os dados foram coletados 48 horas após o plaqueamento do explante comissural. Para visualizar os axônios comissurais, fotos foram tiradas no microscópio invertido Zeiss Axiovert 200 (nos campos brilhantes) utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da Carl Zeiss Imaging Solutions.
Conforme exibido na Figura 16B, o anticorpo antagonista DR6 falhou em bloquear a degeneração axonal desencadeada pela Abeta. Na Figura 16B, da esquerda para a direita, as três fotografias superiores mostram neurônios controle, neurônios na presença de BACE-I e neurônios na presença de BACE-I e Abeta. Na Figura 16B, as duas fotografias inferiores mostram neurônios na presença de BACE-I, Abeta e anticorpo anti-DR6 RA. 1 e, em então neurônios na presença de BACE-I, Abeta e anticorpo anti-DR6 RA.3.
Materiais e métodos usados para gerar os dados apresentados nesta Figura 16B são os seguintes. Culturas de explantes comissurais e ensaio de sobrevida foram realizados conforme descrito no Exemplo 2. Ós aminoácidos Beta amilóide humano recombinante 1-42 utilizados no presente ensaio foram comprados da Chemicon (Abeta humano ultra puro 1-42, oat. No. AG912, Chemicon). O inibidor BACE foi utilizado no ensaio a uma concentração final de 1 μΜ (InSoIution OM99-2, Calbiochem / Merck). Os aminoácidos Beta amilóide humano recombinante 1-42 foram adicionados aos explantes comissurais em uma concentração de 3 μΜ, 24 horas após o plaqueamento, juntamente com o inibidor BACE e Mabs anti-DR6 e indicado a uma concentração de 40 pg/ml. O inibidor BACE foi utilizado no ensaio a uma concentração final de 1 μΜ (InSoIution OM99-2, Calbiochem / Merck). Os explantes comissurais foram incubados com a quantidade indicada de Abeta por mais 24 horas. Os dados foram coletados 48 horas após o plaqueamento do explante comissural.
Os anticorpos monoclonais DR6 de camundongos RA. 1 - RA.5 foram gerados pela imunização de um camundongo com um ectodomínio DR6 como descrito no Exemplo 3 acima. Tal como referido anteriormente, os anticorpos DR6 designados aqui como anticorpos RA. 1 e RA.3 são respectivamente os anticorpos DR6 "1E5.5.7" e "3F4.4.8", descritos no Exemplo 3. Para visualizar os axônios comissurais marcados com GFP1 as fotos foram tiradas no microscópio invertido da Zeiss Axiovert 200 (no canal de fluorescência verde para GFP) utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da Carl Zeiss Imaging Solutions.
Exemplo 13 Sinalização Intracelular Do DR6 As caspasès são importantes fatores na via da morte celular programada (vide, por exemplo, Grutter et al. Curr Opin Struct Biol. 10 (6) :649- 55 (2000); Kuida et al., Nature 384 (6607) :368-72 (1996): e Finn et al., J Neurosci. 20 (4) : 1333-41 (2000)). E algumas caspases estão associadas com a sinalização intracelular em doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Huntington e a DA (vide, por exemplo, Wellington et ai, J Neurosci. 22 (18) :7862-72 (2002), Graham et al., Cell 125 (6) :1179-91 (2006), Guo et al., Am J Pathol. (2) :523-31 (2004) e Horowitz et al., J Neurosci. 24 (36) :7895-902 (2004)).
A Figura 17A exibe fotografias dos neurônios sensoriais cultivados
por 5 dias e então expostos a diferentes condições de cultura por 24 horas. Conforme exibido na Figura 17A, a degeneração axonal é retardada pela inibição da JNK e a montante da caspase-8, mas não a jusante caspase-3.
Na Figura 17A, as duas fotografias do lado esquerdo, em ordem descendente, mostram neurônios sensoriais expostos à NGF e anticorpos anti- NGF1 respectivamente. Na figura 17A, as quatro fotografias à direita, em ordem descendente, exibem neurônios sensoriais expostos a: anticorpo anti-NGF e um inibidor da JNK; anticorpo anti-NGF e um inibidor da caspase-8; anticorpo anti-NGF e um inibidor de ΒΑΧ, e anticorpos anti-NGF e um inibidor da caspase-3, respectivamente.
Materiais e métodos usados para gerar os dados apresentados nesta figura 17A são os seguintes. O ensaio de privação do NGF nas Câmaras Campenot foi realizado como descrito acima no Exemplo 8. A pequena molécula inibidora de JNK, SP 600125, foi utilizada nesta análise, em uma concentração final de 1 μΜ (SP 600125, cat. No. 1496, Tocris Bioscience). O inibidor da Caspase-3, Z-DEVD-FMK, foi utilizado nesta análise, a uma concentração de 10 μΜ (Z-DEVD-FMK, cat. No. 264155, Calbiochem). O inibidor da Caspase-8 Z-IETD-FMK foi utilizado neste ensaio a uma concentração de 10 μΜ (Z-IETD-FMK, cat. No. FMK007, R&D Systems). O
peptídeo inibidor de BAX foi utilizado a uma concentração de 10 uM para
i
bloquear a morte celular neuronal (Bax-V5, Tocris lnc). A linhagem de camundongos Bax null (Bax-R1), foi descrito anteriormente (Deckwerth et al. Neuron, vol. 17, 401-411, 1996) e foi obtida pelo Jackson Lab. A marcação por imunofluorescência de axônios sensores com o anticorpo TUJ1 (1:500, Covance) foi realizado conforme descrito nos Exemplos 1, 7 e 8. Para visualizar os axônios sensoriais marcados com imunofluorescência nos compartimentos das câmaras de Campenot, as fotos foram tiradas no microscópio Zeiss Axioplan-2 Imaging utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da Carl Zeiss Imaging Solutions.
A Figura 17B fornece imagens de neurônios motores a partir de culturas de explantes de neurônios motores E12.5 e mostra funções caspase-3 nos corpos celulares, enquanto axônios mostram funções caspase-6. Na Figura 17B, da esquerda para a direita, as quatro fotografias
mostram neurônios cultivados com: (1) fatores de crescimento; (2), sem fatores de crescimento e na ausência de inibidores da caspase (um controle); (3), sem fatores de crescimento na presença de um inibidor da caspase-3, e (4), sem fatores de crescimento na presença de um inibidor da caspase-6, respectivamente.
Materiais e métodos usados para gerar os dados apresentados nesta Figura 17B são os seguintes. O inibidor da Caspase-3, Z-DEVD-FMK, foi utilizado nesta análise, a uma concentração de 10 μΜ (Z-DEVD-FMK, cat. No. 264155, Calbiochem). O inibidor da Caspase-6, Z-VEID-FMK, foi utilizado nesta análise a uma concentração de 10 μΜ (Z-VEID-FMK, cat. No. 550379, Becton, Dickinson and Company PHARMINGEN Division). O ensaio de sobrevida dos neurônios motores da medula espinhal foi realizado como descrito no Exemplo 6, acima. A marcação por imunofluorescência de axônios motores com o anticorpo TUJ1 (1:500, Covance) foi realizado conforme descrito nos Exemplos 1, 7 e 8. Para visualizar os axônios motores marcados com imunofluorescência, fotos foram tiradas no microscópio Zeiss Axioplan-2 Imaging utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da Carl Zeiss Imaging Solutions. A Figura 17C fornece imagens de neurônios sensoriais cultivados por 5 dias e então expostos a diferentes condições de cultura por 24 horas. Os dados na Figura 17C demonstram que, embora a Caspase-3 não pareça ser necessária para a degeneração do axônio, o BAX é.
Na Figura 17C, da esquerda para a direita, as quatro fotografias
de cima mostram neurônios BAX +/+ cultivados com: NGF; e, em seguida, na presença de anticorpos anti-NGF (isto é, Privação de NGF) por 16, 24 e 48 horas, respectivamente. As quatro fotografias inferiores mostram correspondentemente neurônios BAX -/- cultivados com: NGF; e, em seguida, anticorpos anti-NGF por 16, 24 e 48 horas, respectivamente.
Materiais e métodos usados para gerar os dados apresentados nesta Figura 17C, são os seguintes. O ensaio de privação de NGF em câmara Campenot foi realizada como descrito anteriormente no Exemplo 8, acima. A linhagem de camundongos Bax null (Bax-R1), foi descrito anteriormente (Deckwerth et al. Neuron, vol. 17, 401-411, 1996) e foi obtida pelo Jackson Lab. O anticorpo NGF foi utilizado no ensaio de privação de NGF no compartimento axonal da Câmara (bloqueio da função com anti-NGF monoclonal #911, Genentech, 20 pg/ml). A marcação por imunofluorescência de axônios sensores com o anticorpo TUJ1 (1:500, Covance) foi realizado conforme descrito nos Exemplos 1, 7 e 8. Para visualizar os axônios sensoriais marcados com imunofluorescência no compartimento axonal da câmara de Campenot, às fotos foram tiradas no microscópio Zeiss Axioplan-2 Imaging (no canal de fluorescência verde) utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da Carl Zeiss Imaging Solutions. A Figura' 17D fornece fotografias de culturas de neurônios
comissurais de explante de rato E13 cultivados sob diferentes condições de cultura por 24 horas. Os dados na Figura 17D mostram funções caspase-3 nos corpos celulares, enquanto axônios mostram funções caspase-6. Na figura 17D, da esquerda para a direita, as três primeiras fotografias mostram uma análise GFP de neurônios controles comparados com neurônios cultivados com uma caspase-3 ou um inibidor da caspase-6, respectivamente. As três fotografias inferiores mostram um correspondentemente uma análise por TUNEL (morte celular) de neurônios controle, em comparação com neurônios cultivados com uma caspase-3 ou um inibidor da caspase-6, respectivamente.
Materiais e métodos usados para gerar os dados apresentados nesta Figura 17D são os seguintes. Culturas de explantes comissurais e ensaio de sobrevida foram realizados conforme descrito no Exemplo 2. A morte celular programada em corpos celulares comissurais foi visualizada em cultura de explantes comissurais pelo ensaio de TUNNEL como descrito no Exemplo 7 acima. Os explantes comissurais foram fixados com PFA 4% em PBS e processados para a detecção da morte celular programada (apoptoseO em nível único, baseado na marcação das quebras nas fitas de DNA (tecnologia TUNNEL) usando o kit para detecção "In Situ Cell Death Detection Kif (Cat. No. 11 684 795 910, iRoche) de acordo com o manual de instruções do fabricante (Roche). A poptose em corpos celulares de culturas de explante comissurais sensores e motores foi analisada por microscopia de fluorescência (Figura 17D). O inibidor da Caspase-3, Z-DEVD-FMK, foi utilizado nesta análise, a uma concentração de 10 μΜ (Z-DEVD-FMK, cat. No. 264155, Calbiochem). O inibidor da Caspase-6, Z-VEID-FMK, foi utilizado nesta análise a uma concentração de 10 μΜ (Z-VEID-FMK, cat. No. 550379, Becton, Dickinson and Company, PHARMINGEN Division). Para visualizar os axônios comissurais marcados com GFP, as fotos foram tiradas no microscópio invertido da Zeiss Axiovert 200 (no canal de fluorescência verde para GFP) utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da Carl Zeiss Imaging Solutions. Para visualizar os corpos celulares apoptóticos TUNNEL- positivos marcados com fluorescência, as fotos foram tiradas no microscópio Zeiss Axioplan-2 Imaging (em canai vermelho de fluorescência para o TUNNEL) utilizando o software de computador AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) da CarIZeiss Imaging Solutions.
Exemplo 14
Atividade Antagonista Do DR6 Em Modelos Animais Uma série de modelos animais associados com diferentes doenças neurodegenerativas podem ser empregados pelos técnicos hábeis no assunto para examinar os efeitos antagonísticos do DR6 in vivo. Por exemplo, camundongos transgênicos APP/RK expressando um polipeptídeo da proteína precursora amilóide mutante e exibindo neurodegeneração severa e apoptose. Camundongos transgênicos APP/RK por esse motivo fornecem um modelo da doença de Alzheimer, que pode ser usado para examinar os efeitos dos antagonistas de DR6 sobre os processos patológicos associados a essa síndrome que é observada neste modelo animal (vide, por exemplo, Moechars et al., Neuroscience 91 (3): 819-830 (1999)). Uma variedade de outras linhagens transgênicas de murinos, como a linhagem transgênica APP23 e JNPL3 que expressam um polipeptídeo mutante associado com a doença de Alzheimer e apresentam adicionalmente perda neuronal. Camundongos transgênicos APP23 e JNPL3, fornecem assim modelos alternativos da doença de Alzheimer de modo que os antagonistas DR6 podem ser administrados (vide, por exemplo, McGowan et al., TRENDS in Genetics Voi 22 No. 5 (2006).
Os camundongos transgênicos G93A SOD1 expressando um polipeptídeo mutante da superóxido dismutase humana e exibindo níveis elevados da expressão de caspase-3, bem como apoptose de neurônios motores. Os camundongos transgênicos G93A SOD1 fornecem um modelo de esclerose lateral amiotrófica, que pode ser usado para examinar os efeitos dos antagonistas DR6 (vide, por exemplo, Tokuda et al., Brain Res. 1148: 234-242 (2007) e Wang et al. Eur. J. Neurosci. 26(3): 633-641 (2007)). Os camundongos transgênicos R6/2 expressam o exon-l de Huntington com uma repetição poliglutamato N-terminal expandida sob controle de seu promotor nativo e exibem mudanças neuropatológicas progressivas reminiscentes da doença de Huntington em seres humanos (vide, por exemplo, Mangarini et al., Cell1 87, 493-506 (1996), Chen et al., Nat. Med. 6, 797-801 (2000)). Camundongos transgênicos R6/2 fornece um modelo da doença de Huntington que pode ser usado para examinar os efeitos dos antagonistas de R6 sobre os processos patológicos associados a essa síndrome que é observada neste modelo animal (vide, por exemplo, Wang et al., European Journal of Neuroscience, 26: 633-641 (2007)). Os camundongos transgênicos PK-KO não expressam o produto da proteína do gene Park-2, exibindo anormalidades que lembram a doença de Parkinson, e possuir neurônios que são mais suscetíveis a apoptose do que os camundongos do tipo selvagem (vide, por exemplo, Casarejos et al., J Neurochem. 97(4): 934-46 (2006)). Camundongos transgênicos PK-KO fornecem um modelo da doença de Parkinson, que pode ser usado para examinar os efeitos dos antagonistas de DR6 sobre os processos patológicos associados a essa síndrome que é observada neste modelo animal. Além disso, uma variedade de linhagens de camundongos transgênicos, tal como o camundongo Smn-/-SMN2, um camundongo transgênico que carrega 239 repetições do trinucleotídeo CAG sob regulação do promotor humano AR, bem como transgênicos knockouts duplos do gene SMN nativo do camundongo que tenha pelo menos uma cópia do gene SMNc humano que funciona em um fundo totalmente murino, ambos não expressando ou expressam versões modificadas do produto protéico dos genes de sobrevivência do neurônio motor e, conseqüentemente, apresentam anormalidades que lembram a atrofia muscular espinhal (vide, por exemplo, Hsiu et al., Nature Genetics 24, 66 - 70 (2000), Ferri et al. Neuroreport 15 (2): 275-280 (2004), Ferri et ai, Curr Biol. 15 de abr de 2003 ; 13 (8) :669-73; e Rossol et al., Journal of Ceil Biology, Volume 163, Número 4, 801-812 (2003)). Essas linhagens de murinos transgênicos fornecem conseqüentemente modelos de atrofia muscular espinhal que podem ser utilizados para caracterizar os efeitos dos antagonistas DR6 sobre os processos patológicos associados com esta síndrome que são observados neste modelo animal.
Modelos animais de condições ou distúrbios neurológicos, incluindo os modelos acima indicados, podem ser utilizados para analisar os efeitos dos antagonistas DR6 divulgado na presente invenção, por exemplo, um ou mais anticorpos que liga a DR6 (por exemplo, os anticorpos monoclonais 3F4.4.8, 4B6.9.7 ou 1E5.5.7 ), e/ou uma ou mais formas solúveis de DR6 que se liga à APP (por exemplo, aquela que compreende os aminoácidos 1-354 da SEQ ID No: 1), e/ou um ou mais anticorpos que se ligam à APP (por exemplo, o anticorpo monoclonal 22C11), bem como estes agentes em combinação uns com os outros e/ou outros agentes terapêuticos conhecidos no estado da técnica.
Em protocolos ilustrativos para os ensaios experimentais de um ou mais dos antagonistas DR6 divulgados no presente, uma variedade de animais de idade sexo compatíveis de animais de um modelo animal (por exemplo, camundongos transgênicos APP/RK fêmeas de 6 meses de idade) pode ser utilizado em üm de vários testes e/ou grupos controle. Para um primeiro grupo teste destes animais pode então ser administrado um antagonista DR6 selecionado de acordo com um protocolo de administração específico (por exemplo, uma injeção intraperitoneal de um anticorpo antagonista DR6 a 20 mg/kg de peso corporal para cada injeção a cada duas semanas por um período de seis meses). Condições para outros grupos teste pode variar de acordo com as práticas padrões, como por exemplo: pela administração de diferentes doses do antagonista DR6 (por exemplo, 1,5, 10, mg/kg de peso corporal), pela administração de um esquema de dosagem diferente do antagonista DR6 (por exemplo, uma injeção a cada semana, por um período de 12 meses); pela administração de uma antagonista DR6 diferente (por exemplo, uma imunoadesina DR6); pelo uso de uma combinação de agentes (por exemplo, o antagonista DR6 em combinação com um inibidor da colinesterase), pelo uso de diferentes vias de administração (por exemplo, administração intravenosa) etc. Um ou mais grupos de animais podem servir como controle, por exemplo, aquele que recebe uma injeção de salina estéril tamponada com fosfato, de acordo com a mesma via de administração que o
grupo teste recebe o antagonista de DR6.
Por um período de tempo após receber o antagonista DR6, um teste e um grupo controle adequado desses animais podem então ser comparados, por exempfo, para examinar e/ou caracterizar os efeitos in vivo do antagonista DR6. Por exemplo, amostras contendo células neuronais de tecidos ou órgão específicos (por exemplo, o cérebro) a partir dos grupos teste e controle destes animais podem ser avaliados por uma técnica, tal como a microscopia de ressonância magnética e/ou análise imuno-histoquímica, a fim de comparar o estado das células neuronais destes grupos (vide, por exemplo, Petrik et al. Neuromolecular Med. 9(3):216-29 (2007)). Alternativamente, as amostras obtidas a partir destes grupos podem ser avaliadas por técnicas como, por exemplo, a microscopia multi-foton, a fim de demonstrar fenômenos como trajetória da neurite alterada, perda da espinha dendrítica ou redução dos dendritos (vide, por exemplo, Tsai et al., Nat Neurosci. 7, 1181-1183 (2004): e Spires et al., J. Neurosci. 25, 7278-7287 (2005)). Alternativamente, o sangue ou outras amostras de tecido obtidas a partir destes grupos podem ser submetido a protocolos de ELISA concebidos para medir os níveis de marcadores inflámatórios e/ou de apoptose, tais como IL-Ιβ, TNF-α, IL-10, proteína p53, interferon-γ ou NF-kappaB (vide, por exemplo, Rakover et al. Neurodegener. Dis. 4 (5) :392-402 (2007); e Mogi et al., Neurosci Lett. 414(1):94-7 (2007)). Alternativamente, os animais a partir de um teste e um grupo controle podem ser comparados em testes comportamentais conhecidos no estado da técnica, por exemplo, o labirinto aquatico de Morris ou testes de reconhecimento de objetos (vide, por exemplo, Hsiao et al., Science 274, 99- 102 ( 1996); Janus et al., Nature 408, 979-982 (2000), Morgan et al., Nature 408, 982-985 (2000); e Ennaceur et al. Behav. Brain Res. 1988; 31:47-59). Os resultados das comparações entre os grupos teste e controle de animais permitirá que os técnicos no assunto analisem os efeitos in vivo dos
antagonistas DR6 em modelos animais.
Exemplo^ 1-13, os dados neles incluídos e a caracterização
associada destes dados evidencia que antagonistas DR6 irão, por exemplo, inibir a apoptose de células neuronais in vivo. Em particular, os Exemplos 1-13 acima ensinam, por exemplo, que: (1) o DR6 induz apoptose em uma ampla variedade de células neóronais (2); APP é um Iigante cognato para DR6 que se liga a DR6 e desencadeia a apoptose mediada por DR6, e (3) os antagonistas DR6 que inibem a interação da ligação DR6/APP in vitro, inibem conseqüentemente a apoptose in vitro mediada por DR6 . Em vista dos achados e material divulgado pelos Requerentes, aqueles hábeis no assunto esperam de modo lógico que os antagonistas DR6 podem inibir a apoptose mediada por DR6 in vivo. Por esta razão, os técnicos hábeis no assunto esperariam de modo lógico que modelos animais, tais como os indicados acima e as técnicas associadas para analisar os diferentes processos patológicos observados nestes modelos animais, confirmem a atividade biológica dos antagonistas DR6, como descrito no presente.
Exemplo 15
Tratamento Com O Anticorpo RA.1 ΓΊΕ5.5.7"). RA.2. RA.3 f 3F4.4.8") E RA-4 Em Um Modelo Animal De Atrofia Muscular Espinhal Atrofia muscular espinhal (SMA) é uma doença do neurônio motor recessiva que afeta os neurônios motores no corno anterior da medula espinhal, e acredita-se que resulta da redução da proteína SMN (sobrevida do neurônio motor). Um modelo animal de SMA é a linhagem de camundongo transgênico com a designação da cepa: FVB.Cg-Tg (SMN2 * delta7) 4299Ahmb Tg (SMN2) 89Ahmb SmnItmIMsd / J (JAX 5025), (vide, por exemplo, Le et al. Human Molecular Genetics 14 (6) :845-857 (2005). Este camundongo triplo mutante abriga dois alelos transgênicos e um único alvo mutante. O alelo Tg (SMN2 * delta7) 4299Ahmb consiste de um SMA cDNA que falta o exon 7 enquanto que o alelo Tg(SMN2)89Ahmb alelo consiste de todo o gene SMN2 humáno. Na descrição abaixo, esta cepa é também referida
como modelo Delta 7 SMA KO.
Camundcngos são homozigotos para o alvo mutante alelo SMN e homozigotos para os ' dois alelos transgênicos, exibindo sintomas e neuropatologia semelhantes aos pacientes que sofrem da atrofia muscular espinhal proximal (SMA). Ao nascimento, os triplos mutantes são notavelmente menores c'o que as crias normais. Por volta do 5o dia, os sinais de fraqueza muscular são aparentes e tornam-se progressivamente mais evidentes durante a semana seguinte quando os camundongos exibem um modo de andar anormal, falta de firmeza nas patas traseiras e uma tendência para cair. A média de sobrevida é de cerca de 13 dias. Os camundongos triplo mutantes exibem ainda respostas deficientes ao endireitamento na superfície, geotaxia negativa e aversão a queda, mas não a estimulação tátil. Atividade motora espontânea é força de preensão palmar também estão significativamente prejudicadas nestes camundongos (vide, por exemplo, Butchbach et al. Neurobiol Dis. 27(2):207-19 (2007)). Os seguintes protocolos são concebidos para determinar o efeito de certos anticorpos, tais como anticorpos antagonista DR6, e as doses na sobrevida, peso corporal e tônus muscular do modelo de camundongo Delta 7 SMA (KO).
Tal como referido anteriormente, camundongos utilizados no presente estudo podem ser o modelo Delta-7 SMA (JAX 5025) KO Modelo (smn -/-; SMN2 +/+; d7+/+). Ao nascimento, ninhadas podem ser escolhidas aleatoriamente para 10 animais (ou algum outro número), por exemplo, com um número igual de machos e fêmeas removido. Na seqüência deste protocolo, as ninhadas podem ser selecionadas de 8 camundongos por vez para a primeira dose (P3). Qualquer ninhada com menos de 6 filhotes pode ser retirada do estudo. Camundongos podem ter a cauda cortada ao nascimento (PO) a partir de ninhadas nascidas entre segunda e quarta-feira. A genotipagem pode ser executada por uma variedade de métodos conhecidos no estado da arte, por exemplo, utilizando o serviço de genotipagem automatizado para seleção de mutações transgênicas, knock-outs, knock-in em biópsias que estão comercialmente disponíveis a partir de empresas de diagnósticos moleculares, tais como a Transnetyx Inc. Tais dados de genótipos normalmente são disponíveis em 48 horas após o nascimento.
Camundongos nascidos, por exemplo, na segunda - quarta feira podem ser usados em experimentos ilustrativos. Camundongos podem ser administrados IP iniciando em P3. Um número típico no estudo pode ser: (1), por exemplo, em média, 10 KOs (5 machos e 5 fêmeas) controles com o veículo, tal como PBS estéril (2); por exemplo, em média, 10 KOs (5 machos e fêmeas), com uma primeira dose do respectivo anticorpo que compreende 20 mg/kg, e (3), por exemplo, em média, 10 KOs (5 machos e 5 fêmeas) com a segunda dose do anticorpo DR6 respectivo que compreende 5 mg/kg. Cada animal pode receber uma dose IP do respectivo anticorpo RA.1, RA.2, RA.3, e RA.4 duas vezes por semana. O "anticorpo RA.1" corresponde ao "1E5.5.7" e o "anticorpo RA.3" corresponde ao "3F4.4.8". O "anticorpo RA.2" corresponde ao "4B6.9.7", enquanto que o "anticorpo RA.4" corresponde ao "2C7.3.7" (Genentech, Inc., um anticorpo que se liga à DR6, mas não tem função de bloqueio) . O "anticorpo RA.5" corresponde ao "3B11.7.7" (Genentech, Inc., um anticorpo que se liga à DR6, mas pode aumentar ou estimular a atividade de DR6).
Os anticorpos RA.1, RA.2, RA.3 e RA.4 podem ser armazenados
a 4 °C. Estes anticorpos podem ser aquecidos à temperatura ambiente antes da dosagem, se necessário. Veículos típicos, tal como PBS podem ser utilizados. Embora os anticorpos monoclonais RA.1, RA.2, RA.3, e RA.4 neste exemplo foram gerados usando uma seqüência de polipeptídeo DR6 humano como um imunógeno, todos estes anticorpos reagem tanto com DR6 de humanos quanto com DR6 de camundongos como exibido pelos protocolos como degeneração de axônio e ensaios de apoptose descritos no Exemplo 7.
Em uma realização ilustrativa, os antagonistas DR6 avaliados podem ser anticorpos a}ntagonistas: RA.1, RA.2, RA.3 e RA.4; o número de grupos de tratamento por anticorpo pode ser 2 (com 10 animais por grupo), a via de administração pode ser IP; e o intervalo de dosagem pode ser de 5 e 20 mg/kg. Opcionalmente os grupos podem ser os seguintes: (1) RA.1: 5 mg/kg IP; (2) RA.1: 20 mg/kg IP; (3) RA.2: 5 mg/kg IP; (4) RA.2: 20 mg/kg IP; (5) RA.3: 5 mg/kg IP; (6) RA.3: 20 mg/kg IP; (7) RA.4: 5 mg/kg IP; (8) RA.4: 20 mg/kg IP; e (9) Veículo (PBS) IP. Neste protocolo, camundongos podem ser pesados diariamente. No Dia pós-natal (PND) 10, 12 e 14, o peso corporal de cada filhote na ninhada pode ser medido. No DPP 6, 8, 10, 12, 14 e 16, a avaliação do tônus muscular pode ser realizada em cada animal do estudo, (vide, por exemplo, o protocolo de fenotipagem ilustrativa fornecida abaixo). No dia do nascimento (PO) filhotes podem ser tatuado com tinta
não tóxica aplicada sob a pele e uma amostra da cauda é colhida para a genotipagem (os resultados são disponíveis normalmente dentro de 48 horas). No dia do experimento (P3) a fêmeas com neonatos podem ser trazidos para a <L 173
sala do experimento, ao mesmo tempo todos os dias e deixadas repousar durante pelo menos 10 minutos antes do ensaio começar. Os filhotes podem ser testados no primeiro teste de geotaxia e, em seguida, no tubo de ensaio (2 ensaios consecutivos no tubo de ensaio). Um filhote pode ser colocado sobre uma almofada aquecida até que todos os filhotes da cria sejam testados e, em seguida, todos os filhotes podem ser devolvidos as suas fêmeas (os filhotes podem ser misturados em suas gaiolas para minimizar a rejeição pela fêmea após a manipulação). A sobrevivência e do peso corporal pode ser verificado diariamente a partir do nascimento até o desmame. O efeito do fármaco sobre a temperatura corpórea axial no neonato é normalmente avaliada durante o estudo MTD crônico realizado anteriormente. A temperatura corporal: uma leitura da temperatura corporal axial pode ser tomada na idade especificada.
Camundongos nos grupos teste e controles podem ser examinados pelas diferenças por protocolos de examinação incluindo a geotaxia. A geotaxia testa a habilidade do animal a orientar-se quando colocado de bruços sobre uma plataforma inclinada. Este teste mede a coordenação motora e o sistema vestibular.
Avaliação da sobrevida pode ser realizada usando a análise de Kaplan-Meier com o Mantel-Cox como teste post-hoc. Para analisar os dados com medidas repetidas ao longo do
tempo, Modelos de Efeitos Mistos (também conhecido como Modelos ANOVA misto) podem ser empregados. Esta abordagem é baseada na estimativa da probabilidade em vez da estimativa do momento, como na análise ANOVA de medidas repetitivas típicas, porém é mais robusta para valores em falta devido a mortalidade dos camundongos durante o estudo. Todos os modelos podem ser adequados utilizando o procedimento PROC MIXED do SAS 9.1.3. (SAS lnstitute, Cary1 NC). O tratamento é o fator mais importante no modelo. O Gênero e Dia também podem ser considerados, bem como a sua interação com o tratamento.
O ponto final do estudo pode ser a morte dos camundongos. Os animais podem ainda ser avaliados por uma metodologia como as observadas no Exemplo 14, por exemplo, pela análise histológica. Além disso, o soro/sangue pode ser avaliado para determinar as concentrações
séricas do RA. 1, RA.2, RA.3 e RA.4.
Depósito de Material Os materiais a seguir foram depositados na Coleção Norte- Americana de culturas de Tipos, 10801 University Blvd., Manassas VA 2011 Ο- 2209, Estados Unidos (ÀTCC):
Material Dep. ATCC N0 Data de Depósito
3F4.4.8 PTA-8095 21 de Dezembro de 2006
4B6.9.7 PTA-8094 21 de Dezembro de 2006
1E5.5.7 PTA-8096 21 de Dezembro de 2006
Este depósito foi realizado sob as disposições do Tratado de
Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Propósitos de Procedimentos de Patentes e as Regulamentações com base nele (Tratado de Budapeste). Isso garante a manutenção de uma cultura viável do depósito por 30 anos a partir da data do depósito. O depósito será disponibilizado pela ATCC com base nos termos do Tratado de Budapeste e sujeito a um acordo entre a Genentech, Inc. e a ATCC, que garante a disponibilidade permanente e irrestrita da progênie da cultura do depósito ao público mediante emissão da patente US pertinente ou mediante a abertura ao público de qualquer pedido de patente norte-americano ou estrangeiro, que ocorrer primeiro, e garante a disponibilidade da progênie às partes determinadas pelo Comissário de Patentes e Marcas Comerciais dos Estados Unidos para sèr intitulado a tal, de acordo com 35 USC 122 e as regras do Comissário a este respeito (incluindo 37 CFR 1.14, com referência específica a 886 OG 638).
O cessionário do presente pedido concordou que, se uma cultura dos materiais em depósito morrer ou for perdido ou destruído quando cultivado sob condições apropriadas, os materiais serão imediatamente substituídos mediante notificação por outro idêntico. A disponibilidade do material depositado não deve ser considerada como licença para a prática da presente invenção em contravenção dos direitos concedidos com base na autoridade de qualquer governo de acordo com as suas leis de patentes.
O antecedente descritivo acima é considerado suficiente para permitir que os técnicos no assunto pratiquem a presente invenção. A presente invenção não deve ter seu escopo limitado pelos exemplos apresentados no presente. Na realidade, várias modificações da presente invenção, além das exibidas e descritas no presente, tornarão-se evidentes para os técnicos no assunto a partir do relatório descritivo acima e se encontrarão dentro do escopo das reivindicações anexas Listagem de Seqüências
<110> Anatoly J. Nikolaev Marc Tessier-Lavigne
<120> Antagonistas DR6 e seu uso no tratamento de doenças neurológicas
<130> P2417R1 <140> 60/871528 <141> 22/12/2006 <140> 60/900848 <141> 12/02/2007 <160> 15 <170> FastSEQ for Windows Version 4. 0 <210> 1 <211> 655 <212> PRT <213> "Receptor 6 de morte" humano" <4 00> 1 Met Gly Thr Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ala Leu Ala Ser Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ile Ala Arg Arg Ala Thr Ala Thr Met Ile Ala Gly Ser Leu Leu Leu 20 25 30 Leu Gly Phe Leu Ser Thr Thr Thr Ala Gln Pro Glu Gln Lys Ala Ser 35 40 45 Asn Leu Ile Gly Thr Tyr Arg His Val Asp Arg Ala Thr Gly Gln Val 50 55 60 Leu Thr Cys Asp Lys Cys Pro Ala Gly Thr Tyr Val Ser Glu His Cys 65 70 75 80 Thr Asn Thr Ser Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys Pro Val Gly Thr Phe 85 90 95 Thr Arg His Glu Asn Gly Ile Glu Lys Cys His Asp Cys Ser Gln Pro 100 105 110 Cys Pro Trp Pro Met Ile Glu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Leu Thr Asp 115 120 125 Arg Glu Cys Thr Cys Pro Pro Gly Met Phe Gln Ser Asn Ala Thr Cys 130 135 140 Ala Pro His Thr Val Cys Pro Val Gly Trp Gly Val Arg Lys Lys Gly 145 150 155 160 Thr Glu Thr Glu Asp Val Arg Cys Lys Gln Cys Ala Arg Gly Thr Phe 165 170 175 Ser Asp Val Pro Ser Ser Val Met Lys Cys Lys Ala Tyr Thr Asp Cys 180 185 190 Leu Ser Gln Asn Leu Val Val Ile Lys Pro Gly Thr Lys Glu Thr Asp 195 200 205 Asn Val Cys Gly Thr Leu Pro Ser Phe Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ser 210 215 220 Pro Gly Thr Ala Ile Phe Pro Arg Pro Glu His Met Glu Thr His Glu 225 230 235 240 Val Pro Ser Ser Thr Tyr Val Pro Lys Gly Met Asn Ser Thr Glu Ser 245 250 255 Asn Ser Ser Ala Ser Val Arg Pro Lys Val Leu Ser Ser Ile Gln Glu 260 265 270 Gly Thr Val Pro Asp Asn Thr Ser Ser Ala Arg Gly Lys Glu Asp Val 275 280 285 Asn Lys Thr Leu Pro Asn Leu Gln Val Val Asn His Gln Gln Gly Pro 290 295 300 His His Arg His Ile Leu Lys Leu Leu Pro Ser Met Glu 7\ "1 —ι ηχα TV-, v XllJ- Gly 305 310 315 320 Gly Glu Lys Ser Ser Thr Pro Ile Lys Gly Pro Lys Arg Gly His Pro 325 330 335 Arg Gln Asn Leu His Lys His Phe Asp Ile Asn Glu His Leu Pro Trp 340 345 350 Met Ile Val Leu Phe Leu Leu Leu Val Leu Val Val Ile Val Val Cys 355 360 365 Ser Ile Arg Lys Ser Ser Arg Thr Leu Lys Lys Gly Pro Arg Gln Asp 370 375 380 Pro Ser Ala Ile Val Glu Lys Ala Gly Leu Lys Lys Ser Met Thr Pro 385 390 395 400 Thr Gln Asn Arg Glu Lys Trp Ile Tyr Tyr Cys Asn Gly His Gly Ile 405 410 415 Asp Ile Leu Lys Leu Vai Ala Ala Gln Val Gly Ser Gln Trp Lys Asp 420 425 430 Ile Tyr Gln Phe Leu Cys Asn Ala Ser Glu Arg Glu Val Ala Ala Phe 435 440 445 Ser Asn Gly Tyr Thr Ala Asp His Glu Arg Ala Tyr Ala Ala Leu Gln 450 455 460 His Trp Thr Ile Arg Gly Pro Glu Ala Ser Leu Ala Gln Leu Ile Ser 465 470 475 480 Ala Leu Arg Gln His Arg Arg Asn Asp Val Val Glu Lys Ile Arg Gly 485 490 495 Leu Met Glu Asp Thr Thr Gln Leu Glu Thr Asp Lys Leu Ala Leu Pro 500 505 510 Met Ser Pro Ser Pro Leu Ser Pro Ser Pro Ile Pro Ser Pro Asn Ala 515 520 525 Lys Leu Glu Asn Ser Ala Leu Leu Thr Val Glu Pro Ser Pro Gln Asp 530 535 540 Lys Asn Lys Gly Phe Phe Val Asp Glu Ser Glu Pro Leu Leu Arg Cys 545 550 555 560 Asp Ser Thr Ser Ser Gly Ser Ser Ala Leu Ser Arg Asn Gly Ser Phe 565 570 575 Ile Thr Lys Glu Lys Lys Asp Thr Val Leu Arg Gln Val Arg Leu Asp 580 585 590 Pro Cys Asp Leu Gln PrO Ile Phe Asp Asp Met Leu His Phe Leu Asn 595 600 605 Pro Glu Glu Leu Arg Val Ile Glu Glu Ile Pro Gln Ala Glu Asp Lys 610 615 620 Leu Asp Arg Leu Phe Glu Ile Ile Gly Val Lys Ser Gln Glu Ala Ser 625 630 635 640 Gln Thr Leu Leu Asp Ser Val Tyr Ser His Leu Pro Asp Leu Leu
645 650 655
<210> 2 <211> 3662 <212> DNA
<213> "Receptor 6 de morte" humano" < 4 0 0 > 2
gccaccacgt gtgtccctgc gcccggtggc caccgactca gtccctcgcc gaccagtctg ggcagcggag gagggtggtt ggcagtggct ggaagcttcg ct atg gga agt tgt tcc ttt gct ctc tcg cgc cca gtc ctc ctc cct ggt tct cct cag ccg ctg tcg gag gag age acc cgg aga cgc ggg ctg cag tcg cgg cgg ctt ctc ccc gcc tgg gcg gcc gcg ccg ctg ggc agg tgc tga gcg ccc cta gag cct ccc ttg ccg cct ccc tcc tct gcc cgg ccg cag cag tgc aca tgg ggt gtt gga ggt aga tgg gct ccc ggc ccg gga ggc ggc ggt gga tgc ggc gct ggg cag aag cag ccg ccg att cca gct gcc ccg cgc gcc ccg ggc gcc cct gcg agt ccc cgg ttc age cat ggg gac ctc tcc gag 450
cag cag cac cgc cct cgc ctc ctg cag ccg cat cgc ccg ccg age cac 498
age cac gat gat cgc ggg ctc cct tet cct gct tgg att cct tag cac 54 6
___t-,----------- ---■ ~ ~ ^.-f-^ -t-^ií- = l-rtrr í^a/-^ ata 594
cac CclU age LCcl gcu dya a^a yaa yyu -^cici ^cx ^ ^
ccg cca tgt tga ccg tgc cac cgg cca ggt gct aac ctg tga caa gtg 642
tcc age agg aac cta tgt ctc tga gea ttg tac caa cac aag cct gcg 690
cgt ctg cag cag ttg ccc tgt ggg gac ctt tac cag gea tga gaa tgg 738
cat aga gaa atg cca tga ctg tag tca gcc atg ccc atg gcc aat gat 786
tga gaa att acc ttg tgc tgc ctt gac tga ccg aga atg cac ttg ccc 834
acc tgg cat gtt cca gtc taa cgc tac ctg tgc ccc cca tac ggt gtg 882
tcc tgt ggg ttg ggg tgt gcg gaa gaa agg gac aga gac tga gga tgt 930
gcg gtg taa gea gtg tgc tcg ggg tac ctt ctc aga tgt gcc ttc tag 978
tgt gat gaa atg caa age ata cac aga ctg tet gag tca gaa cct ggt 1026
ggt gat caa gcc ggg gac caa gga gac aga caa cgt ctg tgg cac act 1074
ccc gtc ctt ctc cag ctc cac ctc acc ttc ccc tgg cac age cat ctt 1122
tcc acg ccc tga gea cat gga aac cca tga agt ccc ttc ctc cac tta 1170
tgt tcc caa agg cat gaa ctc aac aga ate caa ctc ttc tgc ctc tgt 1218
tag acc aaa ggt act gag tag cat cca gga agg gac agt ccc tga caa 1266
cac aag ctc age aag ggg gaa gga aga cgt gaa caa gac cct ccc aaa 1314
cct tca ggt agt caa cca cca gea agg ccc cca cca cag aca cat cct 1362
gaa gct gct gcc gtc cat gga ggc cac tgg ggg cga gaa gtc cag cac 1410
gcc cat caa ggg ccc caa gag ggg aca tcc tag aca gaa cct aca caa 1458
gea ttt tga cat caa tga gea ttt gcc ctg gat gat tgt gct ttt cct 1506
gct gct ggt gct tgt ggt gat tgt ggt gtg cag tat ccg gaa aag ctc 1554
gag gac tet gaa aaa ggg gcc ccg gea gga tcc cag tgc cat tgt gga 1602
aaa ggc agg gct gaa gaa ate cat gac tcc aac cca gaa ccg gga gaa 1650
atg gat cta cta ctg caa tgg cca tgg tat cga tat cct gaa gct tgt 1698
age age cca agt ggg aag cca gtg gaa aga tat cta tca gtt tet ttg 1746
caa tgc cag tga gag gga ggt tgc tgc ttt ctc caa tgg gta cac age 1794
cga cca cga gcg ggc cta cgc age tet gea gea ctg gac cat ccg ggg 1842
ccc cga ggc cag cct cgc cca gct aat tag cgc cct gcg cca gea ccg 1890
gag aaa cga tgt tgt gga gaa gat tcg tgg gct gat gga aga cac cac 1938
cca gct gga aac tga caa act age tet ccc gat gag ccc cag ccc gct 1986
tag ccc gag ccc cat ccc cag ccc caa cgc gaa act tga gaa ttc cgc 2034
tet cct gac ggt gga gcc ttc ccc aca gga caa gaa caa ggg ctt ctt 2082
cgt gga tga gtc gga gcc cct tet ccg ctg tga ctc tac ate cag cgg 2130
ctc ctc cgc gct gag cag gaa cgg ttc ctt tat tac caa aga aaa gaa 2178
gga cac agt gtt gcg gea ggt acg cct gga ccc ctg tga ctt gea gcc 2226
tat ctt tga tga cat gct cca ctt tet aaa tcc tga gga gct gcg ggt 2274
gat tga aga gat tcc cca ggc tga gga caa act aga ccg gct att cga 2322
aat tat tgg agt caa gag cca gga age cag cca gac cct cct gga ctc 2370
tgt tta tag cca tet tcc tga cct gct gta gaa cat agg gat act gea 2418
ttc tgg aaa tta ctc aat tta gtg gea ggg tgg ttt ttt aat ttt ctt 2466
ctg ttt ctg att ttt gtt gtt tgg ggt gtg tgt gtg tgt ttg tgt gtg 2514
tgt gtg tgt gtg tgt gtg tgt gtg tgt tta aca gag aat atg gcc agt 2562
gct tga gtt ctt tet cct tet ctc tet ctc ttt ttt ttt taa ata act 2610
ctt ctg gga agt tgg ttt ata age ctt tgc cag gtg taa ctg ttg tga 2658
aat acc cac cac taa agt ttt tta agt tcc ata ttt tet cca ttt tgc 2706
ctt ctt atg tat ttt caa gat tat tet gtg cac ttt aaa ttt act taa 2754
ctt acc ata aat gea gtg tga ctt ttc cca cac act gga ttg tga ggc 2802
tet taa ctt ctt aaa agt ata atg gea tet tgt gaa tcc tat aag cag 2850
tet tta tgt ctc tta aca ttc aca cct act ttt taa aaa caa ata tta 2898
tta cta ttt tta tta ttg ttt gtc ctt tat aaa ttt tet taa aga tta 2946
aga aaa ttt aag acc cca ttg agt tac tgt aat gea att caa ctt tga 2994
gtt ate ttt taa ata tgt ctt gta tag ttc ata ttc atg gct gaa act 3042
tga cca cac tat tgc tga ttg tat ggt ttt cac ctg gac acc gtg tag 3090
aat gct tga tta ctt gta ctc ttc tta tgc taa tat gct ctg ggc tgg 3138
aga aat gaa ate ctc aag cca tca gga ttt gct att taa gtg gct tga 3186
caa ctg ggc cac caa agà act tga act tca cct ttt agg att tga gct 3234
gtt ctg gaa cac att gct gea ctt tgg aaa gtc aaa ate aag tgc cag 3282
tgg cgc cct ttc cat aga gaa ttt gcc cag ctt tgc ttt aaa aga tgt 3330
ctt gtt ttt tat ata cac ata ate aat agg tcc aat ctg ctc tca agg 3378 CCt tgg tcc tgg tgg gat Ctg caa ctg taa gaa CCC ttt aca aat gta CCt tct gtg gcg tgg act CCC ttt gga ccg ata tca gaa aaa cat tag gtg ttt gtt aaa
<210> 3 <211> 300 <212> DNA
<213> Mus Musculis
tcc ttc acc aat tac ttt ttg tct gat ata ttt gca aat gct cag ttg cca ggt gtg tgg gtg yyy +--I--I- I- V- t- gtg tgc Ctt caa gtg tac taa aaa aaa aaa aaa aaa aaa
aat taa aaa tgg 3426 act atg ctc cca 3474 tcc aat gca aag 3522 ggt agt ggt gaa 3570 ttt att aat aaa 3618 aaa aaa aa 3662
<400> 3
gagcagaaac
cctggacccc
ggagctgcgg
gatcattggg
tcttcctgac
ggctccttta tgtgacttgc gtgattgaag gtcaagagcc ctattgtaga
ttaccaaaga agcccatctt agattcccca aagaagccag acacaggggc
aaagaaggac tgatgacatg ggctgaggac ccagaccctc actgcattct
acagtgttgc ctgcatatcc aaactggacc ttggactctg gggaatcaac
ggcaggtccg tgaaccccga gcctcttcga tgtacagtca ctactggcgg
60 120 180 240 300
<210> 4 <211> 582 <212> PRT
<213> Sequencia Artificial <220>
<223> chimera ·
<400> 4
Met Gly Thr Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ala Leu Ala Ser Cys Ser Arg
10 15
Ile Ala Arg Arg Ala Thr Ala Thr Met Ile Ala Gly Ser Leu Leu Leu
25 30
Leu Gly Phe Leu Ser Thr Thr Thr Ala Gln Pro Glu Gln Lys Ala Ser
40 45
Asn Leu Ile Gly Thr Tyr Arg His Val Asp Arg Ala Thr Gly Gln Val
50 55 60
Leu Thr Cys Asp Lys Cys Pro Ala Gly Thr Tyr Val Ser Glu His Cys 65 70 75 80
Thr Asn Thr Ser Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys Pro Val Gly Thr Phe
85 90 95
Thr Arg His Glu Asn Gly Ile Glu Lys Cys His Asp Cys Ser Gln Pro
100 105 110
Cys Pro Trp Pro Met Ile Glu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Leu Thr Asp
115 120 125
Arg Glu Cys Thr Cys Pro Pro Gly Met Phe Gln Ser Asn Ala Thr Cys
130 135 140
Ala Pro His Thr Val Cys Pro Val Gly Trp Gly Val Arg Lys Lys Gly 145 150 155 160
Thr Glu Thr Glu Asp Val Arg Cys Lys Gln Cys Ala Arg Gly Thr Phe
165 170 175
Ser Asp Val Pro Ser Ser Val Met Lys Cys Lys Ala Tyr Thr Asp Cys
180 185 190
Leu Ser Gln Asn Leu Val Val Ile Lys Pro Gly Thr Lys Glu Thr Asp
195 200 205
Asn Val Cys Gly Thr Leu Pro Ser Phe Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ser
210 215 220
Pro Gly Thr Ala Ile Phe Pro Arg Pro Glu His Met Glu Thr His Glu 225 230 235 240
Val Pro Ser Ser Thr Tyr Val Pro Lys Gly Met Asn Ser Thr Glu Ser
245 250 255
Asn Ser Ser Ala Ser Val Arg Pro Lys Val Leu Ser Ser Ile Gln Glu 260 265 270 Gly Thr Val Pro 275
Asn Lys Thr Leu 290
His His Arg His 305
Gly Glu Lys Ser
Arg Gln Asn Leu 340
Met Ile Pro Asp 355
Leu Leu Gly Gly 370
Thr Leu Met Ile 385
Val Ser His Glu
Val Glu Val His 420
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Leu Asn Gly Lys 450
Ala Pro Ile Glu 465
Pro Gln Val Tyr
Gln Val Ser Leu 500
Ala Val Glu Trp 515
Thr Pro Pro Val 530
Leu Thr Val Asp 545
Ser Val Met His
Ser Leu Ser Pro 580
Asp Asn Thr Ser 280
Pro Asn Leu Gln 295
Ile Leu Lys Leu 310
Ser Thr Pro Ile 325
His Lys His Phe
Lys Thr His Thr 360
Pro Ser Val Phe 375
Ser Arg Thr Pro 390
Asp Pro Glu Val 405
Asn Ala Lys Thr
Val Val Ser Val 440
Glu Tyr Lys Cys 455
Lys Thr Ile Ser 470
Thr Leu Pro Pro 485
Thr Cys Leu Val
Glu Ser Asn Gly 520
Leu Asp Ser Asp 535
Lys Ser Arg Trp 550
Glu Ala Leu His 565
Gly Lys
Ser Ala Arg Gly Val Val Asn His
-3 η η ν ν
Leu Pro Ser Met 315
Lys Gly Pro Lys 330
Asp Ile Asn Glu 345
Cys Pro Pro Cys
Leu Phe Pro Pro 380
Glu Val Thr Cys 395
Lys Phe Asn Trp 410
Lys Pro Arg Glu 425
Leu Thr Val Leu
Lys Val Ser Asn 460
Lys Ala Lys Gly 475
Ser Arg Glu Glu 490
Lys Gly Phe Tyr 505
Gln Pro Glu Asn
Gly Ser Phe Phe 540
Gln Gln Gly Asn 555
Asn His Tyr Thr 570
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Gln Gln Gly Pro
Glu Ala Thr Gly 320
Arg Gly His Pro 335
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Lys Pro Lys Asp
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Tyr Val Asp Gly 415
Glu Gln Tyr Asn 430
His Gln Asp Trp 445
Lys Ala Leu Pro
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Pro Ser Asp Ile 510
Asn Tyr Lys Thr 525
Leu Tyr Ser Lys
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<210> 5 <211> 2088 <212> DNA
<213> proteína cDNA 695 precursora de amilóide humano
<400> 5
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ctgaacatgc acatgaatgt ccagaatggg aagtgggatt cagatccatc agggaccaaa 180
acctgcattg ataccaagga aggcatcctg cagtattgcc aagaagtcta ccctgaactg 240
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ggccgcaagc agtgcaagac ccatccccac tttgtgattc cctaccgctg cttagttggt 360
gagtttgtaa gtgatgccct tctcgttcct gacaagtgca aattcttaca ccaggagagg 420
atggatgttt gcgaaactca tcttcactgg cacaccgtcg ccaaagagac atgcagtgag 480
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ggggtagagt ttgtgtgttg cccactggct gaagaaagtg acaatgtgga ttctgctgat 600
gcggaggagg atgactcgga tgtctggtgg ggcggagcag acacagacta tgcagatggg 660
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gagtctgtgg aagaggtggt tcgagttcct acaacagcag ccagtacccc tgatgccgtt 900 gacaagtatc gagaggcttg gcagaacgtc caggagaaag acacacatgg tacatcaccg aagtatgtcc cgcatggtgg gtgatttatg gaggagattc gtcttggcca tctttgaccg gacgatctcc gaagttgagc tctgggttga cgacatgact ggttcaaaca atcgtcatca gtggaggttg ggctacgaaa
tcgagacacc aggccaagca aagcaaagaa tggaatcttt ccagagtgga ctctgcaggc gcgcagaaca atcccaagaa agcgcatgaa aggatgaagt acatgattag aaacgaaaac agccgtggca ctgttgatgc caaatatcaa caggatatga aaggtgcaat ccttggtgat acgccgctgt atccaaccta
tggggatgag ccgagagaga cttgcctaaa ggaacaggaa agccatgctc tgttcctcct gaaggacaga agccgctcag tcagtctctc tgatgagctg tgaaccaagg caccgtggag ttcttttggg ccgccctgct gacggaggag agttcatcat cattggactc gctgaagaag çaccccagag caagttcttt
aatgaacatg atgtcccagg gctgataaga gcagccaacg aatgaccgcc cggcctcgtc cagcacaccc atccggtccc tccctgctct cttcagaaag atcagttacg ctccttcccg gctgactctg gccgaccgag atctctgaag caaaaattgg atggtgggcg aàacagtaca gagcgccacc gagcagatgc
cccatttcca tcatgagaga aggcagttat agagacagca gccgcctggc acgtgttcaa taaagcattt aggttatgac acaacgtgcc agcaaaacta gaaacgatgc tgaatggaga tgccagccaa gactgaccac tgaagatgga tgttctttgc gtgttgtcat catccattca tgtccaagat agaactag
gaaagccaaa atgggaagag ccagcatttc gctggtggag cctggagaac tatgctaaag cgagcatgtg acacctccgt tgcagtggcc ttcagatgac tctcatgcca gttcagcctg cacagaaaac tcgaccaggt tgcagaattc agaagatgtg agcgacagtg tcatggtgtg gcagcagaac
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Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro
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; 40 45
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100 105 110
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115 120 125
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- 165 ' 170 175
Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu
180 185 190
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<211> 751
<212> PRT
<213> proteína APP751 precursora de amilóide humano
<400> 7
Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg Ala Leu Glu Val 20 Gln Ile 7\ T -> λχ α Met 35 Asn Gly Lys Trp 50 Thr Lys Glu Gly 65 Gln Ile Thr Asn Trp Cys Lys Arg 100 Ile Pro Tyr Arg 115 Val Pro Asp Lys 130 Glu Thr His Leu 145 Lys Ser Thr Asn Asp Lys Phe Arg 180 Ser Asp Asn Val 195 Trp Trp Gly Gly 210 Val Val Glu Val 225 Glu Ala Asp Asp Glu Ala Glu Glu 260 Ala Thr Thr Thr 275 Glu Val Cys Ser 290 Ser Arg Trp Tyr 305 Tyr Gly Gly Cys Cys Met Ala Val 340 Pro Asp Ala Val 355 His Ala His Phe 370 Glu Arg Met Ser 385 Ala Lys Asn Leu Gln Glu Lys Val 420 Gln Leu Val Glu 435 Arg Arg Arg Leu 450 Pro Pro Arg Pro 465 Ala Glu Gln Lys Arg Met Val Asp
5
Pro Thr Asp Gly
Phe Cys Gly Arg 40
Asp Ser Asp Pro 55
Ile Leu Gln Tyr 70
Val Val Glu Ala 85
Gly Arg Lys Gln
Cys Leu Val Gly 120
Cys Lys Phe Leu 135
His Trp His Thr 150
Leu His Asp Tyr 165
Gly Val Glu Phe
Asp Ser Ala Asp 200
Ala Asp Thr Asp
. 215
Ala Glu Glu Glu 230
Asp Glu Asp Asp 245
Pro Tyr Glu Glu
Thr Thr Thr Thr 280
Glu Gln Ala Glu 295
Phe Asp Val Thr 310
Gly Gly Asn Arg 325
Cys Gly Ser Ala
Asp Lys Tyr Leu 360
Gln Lys Ala Lys 375
Gln Val Met Arg 390
Pro Lys Ala Asp 405
Glu Ser Leu Glu
Thr His Met Ala 440
Ala Leu Glu Asn
. 4 55 Arg His Val Phe 470
Asp Arg Gln His 485
Pro Lys Lys Ala
8
10
Asn Ala Gly Leu 25
Leu Asn Met His
Ser Gly Thr Lys 60
Cys Gln Glu Val 75
Asn Gln Pro Val 90
Cys Lys Thr His 105
Glu Phe Val Ser
His Gln Glu Arg 140
Val Ala Lys Glu 155
Gly Met Leu Leu 170
Val Cys Cys Pro 185
Ala Glu Glu Asp
Tyr Ala Asp Gly 220
Glu Val Ala Glu 235
Glu Asp Gly Asp 250
Ala Thr Glu Arg 265
Glu Ser Val Glu
Thr Gly Pro Cys 300
Glu Gly Lys Cys 315
Asn Asn Phe Asp 330
Ile Pro Thr Thr 345
Glu Thr Pro Gly
Glu Arg Leu Glu 380
Glu Trp Glu Glu 395
Lys Lys Ala Val 410
Gln Glu Ala Ala .425
Arg Val Glu Ala
Tyr Ile Thr Ala 460
Asn Met Leu Lys 475
Thr Leu Lys His 490
Ala Gln Ile Arg
15
Leu Ala Glu Pro 30
Met Asn Val Gln 45
Thr Cys Ile Asp
Tyr Pro Glu Leu 80
Thr Ile Gln Asn 95
Pro His Phe Val 110
Asp Ala Leu Leu 125
Met Asp Val Cys
Thr Cys Ser Glu 160
Pro Cys Gly Ile 175
Leu Ala Glu Glu 190
Asp Ser Asp Val 205
Ser Glu Asp Lys
Val Glu Glu Glu 240
Glu Val Glu Glu 255
Thr Thr Ser Ile 270
Glu Val Val Arg 285
Arg Ala Met Ile
Ala Pro Phe Phe 320
Thr Glu Glu Tyr 335
Ala Ala Ser Thr 350
Asp Glu Asn Glu 365
Ala Lys His Arg
Ala Glu Arg Gln 400
Ile Gln His Phe 415
Asn Glu Arg Gln 430
Met Leu Asn Asp 445
Leu Gln Ala Val
Lys Tyr Val Arg 480
Phe Glu His Val 495
Ser Gln Val Met 500 505 510 Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser Leu Ser Leu 515 520 525 Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp Glu Val Asp 530 535 540 Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val Leu Ala Asn 545 550 555 560 Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala Leu Met Pro 565 570 575 Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly 580 585 590 Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe Gly Ala Asp 595 600 605 Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val Asp Ala Arg 610 615 620 Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr 625 630 635 640 Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe 645 650 655 Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe 660 665 670 Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val 675 680 685 Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu 690 695 700 Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val Glu Val Asp 705 710 715 720 Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn 725 730 735 Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn 740 745 750
<210> 8
<211> 2310 <212> DNA
<213> proteína ΑΡΡ770 precursora de amilóide humano)
<400> 8
atgctgcccg
cccactgatg
ctgaacatgc
acctgcattg
cagatcacca
ggccgcaagc
gagtttgtaa
atggatgttt
aagagtacca
ggggtagagt
gcggaggagg
agtgaagaca
gaagccgatg
ccctacgaag
gagtctgtgg
cgagcaatga
tacggcggat
tgtggcagcg
cctgttaaac
acacctgggg
aagcaccgag
aagaacttgc
tctttggaac
gtggaagcca
gtttggcact
gtaatgctgg
acatgaatgt
ataccaagga
atgtggtaga
agtgcaagac
gtgatgccct
gcgaaactca
acttgcatga
ttgtgtgttg
atgactcgga
aagtagtaga
atgacgagga
aagccacaga
aagaggtggt
tctcccgctg
gtggcggcaa
ccatgtccca
ttcctacaac
atgagaatga
agagaatgtc
ctaaagctga
aggaagcagc
tgctcaatga
gctcctgctg
cctgctggct
ccagaatggg
aggcatcctg
agccaaccaa
ccatccccac
tctcgttcct
tcttcactgg
ctacggcatg
cccactggct
tgtctggtgg
agtagcagag
cgatgaggat
gagaaccacc
tcgagaggtg
gtactttgat
ccggaacaac
aagtttactc
agcagccagt
acatgcccat
ccaggtcatg
taagaaggca
caacgagaga
ccgccgccgc
gccgcctgga
gaaccccaga
aagtgggatt
cagtattgcc
ccagtgacca
tttgtgattc
gacaagtgca
cacaccgtcg
ttgctgccct
gaagaaagtg
ggcggagcag
gaggaagaag
ggtgatgagg
agcattgcca
tgctctgaac
gtgactgaag
tttgacacag
aagactaccc
acccctgatg
ttccagaaag
agagaatggg
gttatccagc
cagcagctgg
ctggccctgg
cggctcgggc
ttgccatgtt
cagatccatc
aagaagtcta
tccagaactg
cctaccgctg
aattcttaca
ccaaagagac
gcggaattga
acaatgtgga
acacagacta
tggctgaggt
tagaggaaga
ccaccaccac
aagccgagac
ggaagtgtgc
aagagtactg
aggaacctct
ccgttgacaa
ccaaagagag
aagaggcaga
atttccagga
tggagacaca
agaactacat
gctggaggta ctgtggcaga agggaccaaa ccctgaactg gtgcaagcgg ttagttggt ccaggagagg atgcagtgag caagttccga ttctgctgat tgcagatggg ggaagaagaa ggctgaggaa caccaccaca ggggccgtgc cccattcttt catggccgtg tgcccgagat gtatctcgag gcttgaggcc acgtcaagca gaaagtggaa catggccaga caccgctctg
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 caggctgttc ctcctcggcc tcgtcacgtg ttcaatatgc taaagaagta tgtccgcgca gaacagaagg acagacagca caccctaaag catttcgagc atgtgcgcat ggtggatccc aagaaagccg ctcagatccg gtcccaggtt atgacacacc tccgtgtgat ttatgagcgc atgaatcagt ctctctccct gctctacaac gtgcctgcag tggccgagga gattcaggat gaagttgatg agctgcttca gaaagagcaa aactattcag atgacgtctt ggccaacatg attagtgaac caaggatcag ttacggaaac gatgctctca tgccatcttt gaccgaaacg aaaaccaccg tggagctcct tcccgtgaat ggagagttca gcctggacga tctccagccg tggcattctt ttggggctga ctctgtgcca gccaacacag aaaacgaagt tgagcctgtt gatgcccgcc ctgctgccga ccgaggactg accactcgac caggttctgg gttgacaaat atcaagacgg aggagatctc tgaagtgaag atggatgcag aattccgaca tgactcagga tatgaagttc atcatcaaaa attggtgttc tttgcagaag atgtgggttc aaacaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt gtcatagcga cagtgatcgt catcaccttg gtgatgctga agaagaaaca gtacacatcc attcatcatg gtgtggtgga ggttgacgcc gctgtcaccc cagaggagcg ccacctgtcc aagatgcagc agaacggcta cgaaaatcca acctacaagt tctttgagca gatgcagaac
1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2310
<210> 9 <211> 770 <212> PRT
<213> proteína APP770 precursora de amilóide humano
<400> 9
Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg
10 15
Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro
25 30
Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln
40 45
Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp
50 55 60
Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80
Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn
85 90 95
Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val
100 105 110
Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu
115 120 125
Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys
130 135 140
Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160
Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile
165 170 175
Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu
180 185 190
Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val
195 200 205
Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys
210 ■ 215 220
Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240
Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu
245 250 255
Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile
260 265 270
Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg
275 280 285
Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile
290 295 300
Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Cys
Cys Met Ala Val 340
Thr Gln Glu Pro 355
Ala Ser Thr Pro 370
Glu Asn Glu His 385
Lys His Arg Glu
Glu Arg Gln Ala 420
Gln His Phe Gln 435
Glu Arg Gln Gln 450
Leu Asn Asp Arg 465
Gln Ala Val Pro
Tyr Val Arg Ala 500
Glu His Val Arg 515
Gln Val Met Thr 530
Leu Ser Leu Leu 545
Glu Val Asp Glu
Leu Ala Asn Met 580
Leu Met Pro Ser 595
Val Asn Gly Glu 610
Gly Ala Asp Ser 625
Asp Ala Arg Pro
Gly Leu Thr Asn 660
Ala Glu Phe Arg 675
Val Phe Phe Ala 690
Leu Met Val Gly 705
Val Met Leu Lys
Glu Val Asp Ala 740
Gln Gln Asn Gly 755
Gln Asn 770
Gly Gly Asn Arg 325
Cys Gly Ser Ala
Leu Ala Arg Asp 360
Asp Ala Val Asp 375
Ala His Phe Gln 390
Arg Met Ser Gln 405
Lys Asn Leu Pro
Glu Lys Val Glu 440
Leu Val Glu Thr 455
Arg Arg Leu Ala 470
Pro Arg Pro Arg 485
Glu Gln Lys Asp
Met Val Asp Pro 520
His Leu Arg Val 535
Tyr Asn Val Pro 550
Leu Leu Gln Lys 565
Ile Ser Glu Pro
Leu Thr Glu Thr 600
Phe Ser Leu Asp 615
Val Pro Ala Asn 630
Ala Ala Asp Arg 645
Ile Lys Thr Glu
His Asp Ser Gly 680
Glu Asp Val Gly 695
Gly Val Val Ile 710
Lys Lys Gln Tyr 725
Ala Val Thr Pro
Tyr Glü Asn Pro 760
Asn Asn Phe Asp 330
Met Ser Gln Ser 345
Pro Val Lys Leu
Lys Tyr Leu Glu 380
Lys Ala Lys Glu 395
Val Met Arg Glu 410
Lys Ala Asp Lys 425
Ser Leu Glu Gln
His Met Ala Arg 460
Leu Glu Asn Tyr 475
His Val Phe Asn 490
Arg Gln His Thr 505
Lys Lys Ala Ala
Ile Tyr Glu Arg 540
Ala Val Ala Glu 555
Glu Gln Asn Tyr 570
Arg Ile Ser Tyr 585
Lys Thr Thr Val
Asp Leu Gln Pro 620
Thr Glu Asn Glu 635
Gly Leu Thr Thr 650
Glu Ile Ser Glu 665
Tyr Glu Val His
Ser Asn Lys Gly 700
Ala Thr Val Ile 715
Thr Ser Ile His 730
Glu Glu Arg His 745
Thr Tyr Lys Phe
Thr Glu Glu Tyr 335
Leu Leu Lys Thr 350
Pro Thr Thr Ala 365
Thr Pro Gly Asp
Arg Leu Glu Ala 400
Trp Glu Glu Ala 415
Lys Ala Val Ile 430
Glu Ala Ala Asn 445
Val Glu Ala Met
Ile Thr Ala Leu 480
Met Leu Lys Lys 495
Leu Lys His Phe 510
Gln Ile Arg Ser 525
Met Asn Gln Ser
Glu Ile Gln Asp 560
Ser Asp Asp Val 575
Gly Asn Asp Ala 590
Glu Leu Leu Pro 605
Trp His Ser Phe
Val Glu Pro Val 640
Arg Pro Gly Ser 655
Val Lys Met Asp 670
His Gln Lys Leu 685
Ala Ile Ile Gly
Val Ile Thr Leu 720
His Gly Val Val 735
Leu Ser Lys Met 750
Phe Glu Gln Met 765
<210> 10 <211> 210 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>
<223> humano
<4 00> 10 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val 20 Pro Thr Asp Gly Asn 25 Ala Gly Leu Leu Ala 30 Glu Pro Gln Ile Ala 35 Met Phe Cys Gly Arg 40 Leu Asn Met His Met 45 Asn Val Gln Asn Gly 50 Lys Trp Asp Ser Asp 55 Pro Ser Gly Thr Lys 60 Thr Cys Ile Asp Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 Gln Ile Thr Asn Val 85 Val Glu Ala Asn Gln 90 Pro Val Thr Ile Gln 95 Asn Trp Cys Lys Arg 100 Gly Arg Lys Gln Cys 105 Lys Thr His Pro His 110 Phe Val Ile Pro Tyr 115 Arg Cys Leu Val Gly 120 Glu Phe Val Ser Asp 125 Ala Leu Leu Val Pro 130 Asp Lys Cys Lys Phe 135 Leu His Gln Glu Arg 140 Met Asp Val Cys Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 Lys Ser Thr Asn Leu 165 His Asp Tyr Gly Met 170 Leu Leu Pro Cys Gly 175 Ile Asp Lys Phe Arg 180 Gly Val Glu Phe Val 185 Cys Cys Pro Leu Ala 190 Glu Glu Ser Asp Asn 195 Val Asp Ser Ala Asp 200 Ala Glu Glu Asp His 205 His His His His His 210
<210> 11 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> SiRNA <4 00> 11
aaucuguuga guucaugccu u
<210> 12 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> rattus norvegicus <4 00> 12
caauagguca ggaagauggc u
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> rattus norvegicus <400> 13
ggactctgtg tacagtcacc tcccagatct gttatag
<210> 14 <211> 349 <212> PRT
<213> Mus Musculis <400> 14
Met Gly Thr Arg Ala Ser Ser Ile Thr Ala Leu Ala Ser Cys Ser Arg
10 15
Thr Ala Gly Gln Val Gly Ala Thr Met Val Ala Gly Ser Leu Leu Leu
25 30
Leu Gly Phe Leu Ser Thr Ile Thr Ala Gln Pro Glu Gln Lys Thr Leu
40 45
Ser Leu Pro Gly Thr Tyr Arg His Val Asp Arg Thr Thr Gly Gln Val
50 55 60
Leu Thr Cys Asp Lys Cys Pro Ala Gly Thr Tyr Val Ser Glu His Cys 65 70 75 80
Thr Asn Met Ser Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys Pro Ala Gly Thr Phe
85 90 95
Thr Arg His Glu Asn Gly Ile Glu Arg Cys His Asp Cys Ser Gln Pro
100 105 HO
Cys Pro Trp Pro Met Ile Glu Arg Leu Pro Cys Ala Ala Leu Thr Asp
115 120 125
Arg Glu Cys Ile Cys Pro Pro Gly Met Tyr Gln Ser Asn Gly Thr Cys
130 135 140
Ala Pro His Thr Val Cys Pro Val Gly Trp Gly Val Arg Lys Lys Gly 145 150 155 160
Thr Glu Asn Glu Asp Val Arg Cys Lys Gln Cys Ala Arg Gly Thr Phe
165 170 175
Ser Asp Val Pro Ser Ser Val Met Lys Cys Lys Ala His Thr Asp Cys
180 185 190
Leu Gly Gln Asn Leu Glu Val Val Lys Pro Gly Thr Lys Glu Thr Asp
195 200 205
Asn Val Cys Gly Met Arg Leu Phe Phe Ser Ser Thr Asn Pro Pro Ser
210 215 220
Ser Gly Thr Val Thr Phe Ser His Pro Glu His Met Glu Ser His Asp 225 230 235 240
Val Pro Ser Ser Thr Tyr Glu Pro Gln Gly Met Asn Ser Thr Asp Ser
245 250 255
Asn Ser Thr Ala Ser Val Arg Thr Lys Val Pro Ser Gly Ile Glu Glu
260 265 270
Gly Thr Val Pro Asp Asn Thr Ser Ser Thr Ser Gly Lys Glu Gly Thr
275 280 285
Asn Arg Thr Leu Pro Asn Pro Pro Gln Val Thr His Gln Gln Ala Pro
290 295 300
His His Arg His Ile Leu Lys Leu Leu Pro Ser Ser Met Glu Ala Thr 305 310 315 320
Gly Glu Lys Ser Ser Thr Ala Ile Lys Ala Pro Lys Arg Gly His Pro
325 330 335
Arg Gln Asn Ala His Lys His Phe Asp Ile Asn Glu His 340 · 345
<210> 15 <211> 354 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> mus musculis
<4 00> 15 Met Gly Thr Arg 1
Thr Ala Gly Gln 20
Leu Gly Phe Leu 35
Ser Leu Pro Gly 50
Leu Thr Cys Asp 65
Thr Asn Met Ser
Thr Arg His Glu 100
Cys Pro Trp Pro 115
Arg Glu Cys Ile 130
Ala Pro His Thr 145
Thr Glu Asn Glu
Ser Asp Val Pro 180
Leu Gly Gln Asn 195
Asn Val Cys Gly 210
Ser Gly Thr Val 225
Val Pro Ser Ser
Asn Ser Thr Ala 260
Gly Thr Val Pro 275
Asn Arg Thr Leu 290
His His Arg His 305
Gly Glu Lys Ser
Arg Gln Asn Ala 340
His His
Ala Ser Ser Ile 5
Val Gly Ala Thr
Ser Thr Ile Thr 40
Thr Tyr Arg His 55
Lys Cys Pro Ala
70
Leu Arg Val Cys 85
Asn Gly Ile Glu
Met Ile Glu Arg 120
Cys Pro Pro Gly 135
Val Cys Pro Val 150
Asp Val Arg Cys 165
Ser Ser Val Met
Leu Glu Val Val 200
Met Arg Leu Phe 215
Thr Phe Ser His 230
Thr Tyr Glu Pro 245
Ser Val Arg Thr
Asp Asn Thr Ser 280
Pro Asn Pro Pro 295
Ile Leu Lys Leu 310
Ser Thr Ala Ile 325
His Lys His Phe
Thr Ala Leu Ala 10
Met Val Ala Gly 25
Ala Gln Pro Glu
Val Asp Arg Thr 60
Gly Thr Tyr Val 75
Ser Ser Cys Pro 90
Arg Cys His Asp 105
Leu Pro Cys Ala
Met Tyr Gln Ser 140
Gly Trp Gly Val 155
Lys Gln Cys Ala 170
Lys Cys Lys Ala 185
Lys Pro Gly Thr
Phe Ser Ser Thr 220
Pro Glu His Met 235
Gln Gly Met Asn 250
Lys Val Pro Ser 265
Ser Thr Ser Gly
Gln Val Thr His 300
Leu Pro Ser Ser 315
Lys Ala Pro Lys 330
Asp Ile Asn Glu 345
Ser Cys Ser Arg 15
Ser Leu Leu Leu 30
Gln Lys Thr Leu 45
Thr Gly Gln Val
Ser Glu His Cys 80
Ala Gly Thr Phe 95
Cys Ser Gln Pro 110
Ala Leu Thr Asp 125
Asn Gly Thr Cys
Arg Lys Lys Gly 160
Arg Gly Thr Phe 175
His Thr Asp Cys 190
Lys Glu Thr Asp 205
Asn Pro Pro Ser
Glu Ser His Asp 240
Ser Thr Asp Ser 255
Gly Ile Glu Glu 270
Lys Glu Gly Thr 285
Gln Gln Ala Pro
Met Glu Ala Thr
...... 32 0
Arg Gly His Pro 335
His His His His 350
1

Claims (65)

1. MÉTODO PARA INIBIR A LIGAÇÃO DO RECEPTOR DE MORTE 6 (DR6) À PROTEÍNA PRECURSORA AMILÓIDE (APP)1 que compreende a exposição do polipeptídeo DR6 e/ou polipeptídeo APP a um ou mais antagonistas DR6 sob condições em que a ligação do DR6 ao APP seja inibida.
2. MÉTODO, da reivindicação 1, em que um ou mais antagonistas DR6 são selecionados a partir de um anticorpo que se liga a DR6, um polipeptídeo DR6 solúvel, que compreende os aminoácidos 1-354 da SEQ ID No: 1, e um anticorpo que se liga a APP.
3. MÉTODO, da reivindicação 2, em que o polipeptídeo DR6 solúvel compreende uma imunoadesina DR6.
4. MÉTODO, da reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeos DR6 solúvel compreende uma seqüência de domínio extracelular do DR6 fundida a uma região Fc de uma imunoglobulina.
5. MÉTODO, da reivindicação 2, em que o anticorpo mencionado que liga ao DR6, liga um polipeptídeo DR6, que compreende os aminoácidos 1-349 ou 42-349 da Figura 1 (SEQ ID No: 1).
6. MÉTODO, da reivindicação 2, em que o anticorpo mencionado que se liga a DR6 é um anticorpo quimérico, humano ou humanizado.
7. MÉTODO, da reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo mencionado que se liga a DR6 inibe competitivamente a ligação do anticorpo monoclonal 3F4.4.8, 4B6.9.7, ou 1E5.5.7 produzido pela linhagem de hibridoma celular depositados como número de acesso ATCC; PTA-8095, PTA-8094, ou PTA-8096, respectivamente.
8. MÉTODO, da reivindicação 2, em que o anticorpo mencionado que se liga a DR6 ou polipeptídeo DR6 solúvel, está ligado a um ou mais polímeros não proteináceos selecionados do grupo constituído por: polietilenoglicol, polipropileno glicol e polioxialquiieno.
9. MÉTODO, da reivindicação 1, em que o anticorpo mencionado que se liga a APP é um anticorpo monoclonal.
10. MÉTODO, da reivindicação 9, em que o anticorpo monoclonal mencionado que se liga a APP é um anticorpo monoclonal quimérico, humano ou humanizado.
11. MÉTODO, da reivindicação 9, em que o anticorpo monoclonal mencionado que se liga a APP inibe competitivamente a ligação dos anticorpos 3F4.4.8, 4B6.9.7, ou 1E5.5.7.
12. MÉTODO, da reivindicação 9, emque o anticorpo mencionado que se liga a APP está ligado a um ou mais polímeros não proteináceos selecionado do grupo constituído por: polietileno glicol, polipropileno glicol e ponoxialquileno.
13. MÉTODO, da reivindicação 1, em que o polipeptídeo DR6 mencionado é expresso na superfície celular de uma ou mais células de mamíferos e se liga a um ou mais dos antagonistas de DR6 mencionados inibindo a ativação ou sinalização do DR6.
14. MÉTODO, da reivindicação 13, em que o método é realizado de maneira in vitro para inibir a apoptose em uma ou mais células de mamífero que expressam DR6.
15. MÉTODO, da reivindicação 13, em que o método é realizado in vivo para inibir a apoptose em uma ou mais células de mamífero que expressam DR6.
16. MÉTODO, da reivindicação 13, em que pelo menos uma célula, dentre uma ou mais células de mamífero que têm o polipeptídeo DR6 expresso na superfície celular, é uma célula de neurônio comissural, uma célula de neurônio sensor ou uma célula de neurônio motor.
17. MÉTODO, da reivindicação 13, em que o método é realizado in vivo em um mamífero que possui uma condição ou distúrbio neurológico.
18. MÉTODO, da reivindicação 17, em que a condição ou distúrbio é a esclerose lateral amiotrófica, doença de Parkinson1 doença de Huntington ou doença de Alzheimer.
19. MÉTODO, da reivindicação 17, em que a condição ou distúrbio neurológico compreende uma lesão neuronal celular ou tecidual decorrente de; acidente vascular cerebral, trauma do tecido cerebral ou da medula espinhal ou lesões no tecido neuronal.
20. MÉTODO, da reivindicação 1, em que pelo menos um da mencionada ou mais antagonista DR6, inibe a ligação do DR6 a um polipeptídeo APP, que compreende os aminoácidos 66-81 da SEQ ID No: 6.
21. MÉTODO, da reivindicação 1, em que pelo menos um ou mais antagonista DR6, inibe a ligação da APP a um polipeptídeo DR6, que compreende os aminoácidos 1-655 da SEQ ID No: 1.
22. MÉTODO PARA O TRATAMENTO, de um mamífero com uma condição ou distúrbio neurológico compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um ou mais antagonistas de DR6 ao mencionado mamífero.
23. MÉTODO, da reivindicação 22, em que um ou mais antagonistas de DR6 são selecionados a partir de um anticorpo que se liga a DR6, um polipeptídeo DR6 solúvel, que compreende os aminoácidos 1-354 da SEQ ID No: 1, e um anticorpo que se liga a APP.
24. MÉTODO, da reivindicação 23, em que o polipeptídeo DR6 solúvel compreende uma imunoadesina DR6.
25. MÉTODO, da reivindicação 23, em que o polipeptídeo DR6 solúvel compreende uma seqüência do domínio extracelular de DR6 fundida a uma região Fc de imunoglobulina.
26. MÉTODO, da reivindicação 23, em que o anticorpo mencionado que se liga a DR6, é um anticorpo que se liga ao polipeptídeo DR6, que compreende os aminoácidos 1-349 ou 42-349 da Figura 1 (SEQ ID No: 1).
27. MÉTODO, da reivindicação 23, em que o anticorpo mencionado que se liga ao anticorpo DR6 é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.
28. MÉTODO, da reivindicação 23, em que o anticorpo mencionado que se liga ao anticorpo DR6, inibe competitivamente a ligação do anticorpo monoclonal 3F4.4.8, 4B6.9.7, ou 1E5.5.7 produzido pela linhagem de hibridoma celular depositados como número de acesso ATCC; PTA-8095, PTA-8094, ou PTA-8096, respectivamente.
29. MÉTODO, da reivindicação 23, em que o anticorpo que se liga a DR6 ou ao polipeptídeo DR6 solúvel, está ligado a um ou mais polímeros não proteináceos selecionados a partir do grupo constituído por: polietilenoglicol, polipropilenoglicol e polioxialquileno.
30. MÉTODO, de reivindicação 22, em que o anticorpo mencionado que se liga a APP, é um anticorpo monoclonal.
31. MÉTODO, da reivindicação 30, em que o anticorpo monoclonal mencionado que se liga a APP é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.
32. MÉTODO, da reivindicação 30, em que o anticorpo monoclonal mencionado que se liga a APP inibe competitivamente a ligação do anticorpo monoclonal 22C11.
33. MÉTODO, da reivindicação 30, em que o anticorpo monoclonal mencionado que se liga a APP está ligado a um ou mais polímeros não proteináceos selecionados a partir do grupo constituído por: polietilenoglicol, polipropilenoglicol e polioxialquileno.
34. MÉTODO, da reivindicação 22, em que pelo menos um antagonista de DR6, dentre um ou mais dos antagonistas de DR6 mencionados, inibe a ligação do DR6 a um polipeptídeo APP1 que compreende os aminoácidos 66-81 da SEQ ID No: 6.
35. MÉTODO, da reivindicação 22, em que pelo menos um antagonista de DR6,< dentre um ou mais dos antagonistas de DR6 mencionados, inibe a ligação da APP a um polipeptídeo DR6 que compreende os aminoácidos 1-655 da SEQ ID No: 1.
36. MÉTODO, da reivindicação 22, em que a condição ou distúrbio é a esclerose lateral amiotrófica, doença de Parkinson1 doença de Huntington ou doença de Alzheimer.
37. MÉTODO, da reivindicação 22, em que a condição ou distúrbio neurológico compreende uma lesão neuronal celular ou tecidual decorrente de; acidente, trauma do tecido cerebral ou da medula espinhal ou lesões no tecido neuronal.
38. MÉTODO, da reivindicação 22, em que um ou mais agentes terapêuticos é administrada ao dito mamífero.
39. MÉTODO, da reivindicação 22, em que um ou mais antagonista de DR6 é administrado ao mamíferos através de injeção, infusão ou perfusão.
40. MÉTODO, da reivindicação 38, em que o dito um ou mais agentes terapêuticos são selecionados a partir de NGF1 um inibidor da apoptose, um inibidor EGFR, um inibidor de β-secretase, um inibidor de γ- secretase, um inibidor da colinesterase, um anticorpo anti-Abeta e um antagonista do receptor NMDA.
41. MÉTODO PARA IDENTIFICAÇÃO DE UMA MOLÉCULA DE INTERESSE QUE INIBE A LIGAÇÃO DO DR6 À APP1 compreendendo o método em: - combinar DR6 e APP1 na presença ou ausência de uma molécula de interesse; e - detectar a inibição da ligação do DR6 ao APP na presença da molécula de interesse mencionada.
42. MÉTODO, da reivindicação 41, em que a molécula de interesse é um anticorpo que se liga a APP1 um anticorpo que se liga a DR6 ou um polipeptídeo DR6 solúvel compreendendo os aminoácidos 1-354 da SEQ ID No: 1.
43. MÉTODO, da reivindicação 41, em que a detecção da inibição pela ligação do DR6 a APP, na presença da molécula de interesse, é realizada em um ensaio in vitro.
44. MÉTODO, da reivindicação 41, compreende adicionalmente: - na execução do método utilizando células mamíferas expressando DR6 na superfície celular; e - na detecção da inibição da ativação ou sinalização de DR6.
45. COMPOSIÇÃO, contendo uma molécula de interesse identificada, de acordo com o método da reivindicação 40.
46. COMPOSIÇÃO, da reivindicação 45, e um veículo.
47. COMPOSIÇÃO, da reivindicação 46, em o veículo é um veículo farmaceuticamente aceitável.
48. ANTAGONISTA DR6 ISOLADO, compreendendo; (a) um anticorpo monoclonal que se liga ao polipeptídeo DR6, que compreende SEQ ID No: 1 ou (b) um polipeptídeo DR6 solúvel; ou (c) um anticorpo monoclonal que se liga a APP, que compreende SEQ ID No: 6, em que o antagonista DR6 inibe a ligação do APP ao DR6.
49. ANTAGONISTA DR6 ISOLADO, da reivindicação 48, em que o polipeptídeo DR6 solúvel compreende uma imunoadesina DR6.
50. ANTAGONISTA DR6 ISOLADO, da reivindicação 49, em que o polipeptídeo DR6 solúvel contém uma seqüência do domínio extracelular de DR6 fundida a uma região Fc de imunoglobulina.
51. ANTAGONISTA DR6 ISOLADO, da reivindicação 48, em que o anticorpo mencionado que se liga ao DR6, se liga a um polipeptídeo DR6 que compreende os aminoácidos 1-349 ou 42-349 da Figura 1 (SEQ ID No: 1).
52. ANTAGONISTA DR6 ISOLADO, da reivindicação 48, em que o anticorpo mencionado que se liga ao DR6 é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.
53. ANTAGONISTA DR6 ISOLADO, da reivindicação 48, em que o anticorpo mencionado que se liga ao DR6 inibe competitivamente a ligação do anticorpo monoclonal 3F4.4.8, 4B6.9.7, ou 1E5.5.7 produzido pela linhagem de hibridoma celular depositados como número de acesso ATCC; PTA-8095, PTA-8094, ou PTA-8096, respectivamente.
54. ANTAGONISTA DR6 ISOLADO, da reivindicação '48, em que o anticorpo mencionado que se liga ao DR6 ou polipeptídeo DR6 solúvel, está ligado a um ou mais polímeros não proteináceos selecionados do grupo constituído por: polietilenoglicol, polipropileno glicol e polioxialquileno.
55. ANTAGONISTA DR6 ISOLADO, da reivindicação 48, em que o antagonista DR6 mencionado inibe a ligação do DR6 a um polipeptídeo APP que compreende os aminoácidos 66-81 da SEQ ID No: 6.
56. ANTAGONISTA DR6 ISOLADO, da reivindicação 48, em que o antagonista se liga um epítopo que inibe a ligação do DR6 ao APP por inibição estérica.
57. ANTAGONISTA DR6 ISOLADO, da reivindicação 48, em que o anticorpo monoclonal mencionado que se liga a APP é um anticorpo quimérico humanizado ou humano.
58. ANTAGONISTA DR6 ISOLADO, da reivindicação 48, em que o anticorpo mencionado que se liga a APP inibe competitivamente a ligação de anticorpo monoclonal 22C11.
59. ANTAGONISTA DR6 ISOLADO, da reivindicação 48, em que o anticorpo mencionado que se liga a APP está ligado a um ou mais polímeros não proteináceos selecionado do grupo constituído por: polietilenoglicol, polipropileno glicol e polioxialquileno.
60. ANTAGONISTA DR6 ISOLADO, da reivindicação 48, em que o antagonista mencionado inibe a ligação do DR6 a um polipeptídeo APP que compreende os aminoácidos 66-81 da SEQ ID No: 6.
61. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, compreendendo o antagonista DR6, das reivindicações 47-60 e um veículo farmaceuticamente aceitável. :
62. MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR UM PACIENTE COM DISTÚRBIO NEUROLÓGICO OU SUSCETÍVEL A UM DISTÚRBIO NEUROLÓGICO, compreendendo a obtenção de uma amostra do paciente e testando a amostra pela presença de um polipeptídeo DR6 variante que compreende uma seqüência polipeptídica que difere da seqüência do polipeptídeo DR6 da SEQ ID No: 1.
63. MÉTODO, da reivindicação 62, compreendendo ainda a identificação do polipeptídeo variante como tendo uma afinidade para o polipeptídeo APP que difere da afinidade observado para a seqüência polipeptídicas DR6 da SEQ ID No: 1.
64. ARTIGO MANUFATURADO, que compreende: (a) composição de matéria compreendendo uma quantidade eficaz de um antagonista de DR6 das reivindicações 47-60; (b) recipiente contendo a composição mencionada; e (c) um rótulo fixado no recipiente mencionado, ou uma bula incluída no recipiente mencionado, fornecendo instruções de uso para o antagonista de DR6 mencionado no tratamento de uma condição ou distúrbio neurológico.
65. KIT, compreendendo: - um primeiro recipiente, um rótulo no recipiente mencionado, e uma composição contida no recipiente mencionado; - em que a composição inclui um agente ativo eficaz para inibir apoptose em pelo menos um tipo de célula neuronal de mamífero, o rótulo no dito recipiente, ou uma bula incluída no dito recipiente indicando que a composição pode ser usada para inibir a apoptose em pelo menos um tipo de célula neuronal de mamífero, e o agente ativo na referida composição compreendendo pelo menos um antagonista de DR6 das reivindicações 47-60; um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente tampão aceitável; e instruções para o uso do antagonista de DR6 para inibir a apoptose em pelo menos um tipo de célula neuronal de mamífero.
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