TW200844113A

TW200844113A - DR6 antagonists and uses thereof in treating neurological disorders

Info

Publication number: TW200844113A
Application number: TW096149573A
Authority: TW
Inventors: Anatoly Nikolaev; Marc Tessier-Lavigne
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2008-11-16
Also published as: CL2007003793A1; RU2009128039A; JP2010514700A; AR064501A1; CO6210755A2; ZA201004219B; US20100203044A1; NZ577436A; SG177924A1; AU2007336770A1; CA2671903A1; MX2009006685A; PE20081546A1; EP2094732A2; WO2008080045A3; NO20092741L; KR20090094854A; WO2008080045A2; BRPI0719459A2

Description

200844113 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】 ’ 本發明一般而言係關於使用（例如）抑制DR6與其同源配位體APP之間的相互作用之DR6拮抗劑治療神經疾病之方法及適用於該等方法中之DR6拮抗劑組合物。在可選實施例中’使用諸如DR6受體抗體、DR6受體變體、DR6受體免疫黏附素或APP抗體之DR6拮抗劑治療神經疾病，包括治療阿兹海默氏症（Alzheimer’s disease)。 (% 本申請案是根據37 CFR 1.53(b)(1)申請的非臨時申請案，其依據35 USC 119(e)規定主張2006年12月22日申請的美國臨時申請案第60/871,528號及2007年2月12日申請的美國臨時申請案第60/900,848號之優先權，其内容以引用之方式併入本文中。【先前技術】在此項技術中已鑑別出屬於腫瘤壞死因子（TNF)超家族之各種配位體及受體。在該等配位體中包括腫瘤壞死因子 (’’TNF-α”）、腫瘤壞死因子-β(πΤΝΡ-β"或”淋巴毒素-οι1’）、淋巴毒素-P(”LT-P，，）、CD30配位體、CD27配位體、CD40配位體、OX-40配位體、4-1BB配位體、LIGHT、Apo-1配位體（亦稱為Fas配位體或CD95配位體）、Apo-2配位體（亦稱為 Apo2L或 TRAIL)、Apo-3 配位體（亦稱為 TWEAK)、APRIL、 OPG配位體（亦稱為RANK配位體、ODF或TRANCE)及 TALL-1(亦稱為 BlyS、BAFF或 THANK)(參見例如 Ashkenazi， Nature Review，2:420-430 (2002) ; Ashkenazi 及 Dixit， 127689.doc 200844113

Science，281:1305-1308 (1998) ; Ashkenazi及 Dixit，Curr· Opin· Cell Biol·，11:255-260 (2000) ; Golstein，Curr· Biol·， 7:750-753 (1997) ; Wallach，Cytokine Reference，Academic Press，2000,第 377-41 1 頁；Locksley等人，Cell，104:487-501 (2001); Gruss 及 Dower，Blood，85:3378-3404 (1995); Schmid 等人，Proc. Natl. Acad. Sci·，83:1 881 (1986) ; Dealtry等人， Eur· J. Immunol·，17:689 (1987) ; Pitti等人，J· Biol· Chem·， 271:12687-12690 (1996); Wiley等人，Immunity，3:673-682 (1995) ; Browning等人，Cell，72:847-856 (1993) ; Armitage 等人。Nature，357:80-82 (1992) ; 1997年 1 月 16 日公開之 WO 97/01633 ; 1997年 7月 17 日公開之WO 97/25428 ; Marsters 等人，Curr. Biol·，8:525-528 (1998) ; Chicheportiche等人， Biol. Chem.，272:32401-32410 (1997) ; Hahne等人，J· Exp. Med·，188:1 1 85-1 190 (1998) ; 1998 年 7 月 2 日公開之 WO 98/28426 ; 1998 年 10 月 22 日公開之 WO 98/46751 ; 1998 年 5 月 7 日公開之 WO/98/18921 ; Moore 等人，Science， 285:260-263 (1999) ; Shu等人，J. Leukocyte Biol·，65:680 (1999) ; Schneider 等人，J· Exp· Med·，189:1747-1756 (1999) ; Mukhopadhyay 等人，J· Biol. Chem·，274:15978-15981 (1999))。由該等TNF家族配位體所介導之各種細胞反應之誘導通常由其與特異性細胞受體之結合起始。在至今鑑別出之 TNF受體超家族之成員中包括TNFRJ、TNFR2、p75-NGFR、 TACI、GITR、CD27、OX-40、CD30、CD40、HVEM、Fas(亦 127689.doc 200844113 稱為 Apo-l 或 CD95)、DR4(亦稱為 TRAIL-Rl)、DR5(亦稱為 Apo-2或TRAIL-R2)、DR6(亦稱為TR9,在文獻中亦稱為TNF 受體超家族成員21或TNFRSF21)、DcRl、DcR2、骨保護素 (OPG)、RANK及Apo-3(亦稱為DR3或TRAMP)(參見例如 Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002) ； Ashkenazi 及 Dixit，Science，281:1305-1308 (1998) ; Ashkenazi及 Dixit， Curr· Opin· Cell Biol·，11:255-260 (2000) ; Golstein，Curr· Biol·，7:750-753 (1997) ; Wallach，Cytokine Reference， C Academic Press，2000，第 377-41 1 頁；Locksley等人，Cell， 104:487-501 (2001) ; Gruss及 Dower，Blood，85:3378-3404 (1995) ； Hohman 等人，J· Biol· Chem·，264:14927-14934 (1989) ; Brockhaus等人，Proc·Natl·Acad·Sci·，87:3127-3 13 1 (1990) ; 1991年 3 月 20 日公開之 EP 417,563 ; Loetscher 等人，Cell，61··351 (1990) ; Schall 等人，Cell，61..361 (1990) ; Smith等人，Science，248:1019_1023 (1990) ; Lewis 等人，Proc. Natl· Acad. Sci·，88:2830-2834 (1991); Goodwin c I 等人，Mol· Cell· Biol·，11:3020-3026 (1991) ; Stamenkovic 等人，EMBO J·，8:1403-1410 (1989) ; Mallett等人，EMBO J·，9:1063-1068 (1990); Anderson 等人，Nature，390:175-179 (1997) ； Chicheportiche 等人，J. Biol. Chem.，272:32401 -32410 (1997) ; Pan等人，Science，276:1 11-1 13 (1997) ; Pan 等人，Science，277:815-818 (1997) ; Sheridan等人，Science， 277:818-821 (1997) ; Degli-Esposti等人，J. Exp. Med·， 186:1 165-1170 (1997) ; Marsters等人，Curr· Biol·，7:1003- 127689.doc 200844113 • 1006 (1997) ; Tsuda等人，BBRC，234:137-142 (1997); ‘ Nocentini 等人，Proc· Natl· Acad· Sci·，94:6216-6221 (1997) ; vonBulow等人，Science，278:138_141 (1997); Johnson等人，Cell，47:545-554 (1986); Radeke等人，Nature， 325:593-597 (1987) ; Pan等人，FEBS Lett·，43 1:35 1-356 (1998) )。此等TNF受體家族成員之多數共有細胞表面受體包括細胞外、跨膜及細胞内區之典型結構，而發現其他成員為缺 ( 乏跨膜及細胞内域之天然可溶性蛋白質。典型TNFR之細胞外部分含有由NH2末端起始的多個半胱胺酸富集域（CRD) 之重複胺基酸序列模式。對於配位體及受體之TNF家族之回顧，通常參見例如

Wallach, Cytokine Reference，Academic Press，2000，第 377-41 1 頁；Locksley等人，Cell，104:487-501 (2001); Ware,

Cytokine & Growth Factor Reviews, 14:181-184 (2003)； Llu 等人 ’ ϊ^ιηιιηΗγ，15(1):23-34 (2001)及 Bossen 等人，J

Biol Chem· 281(20):13964-71 (2006) 〇稱為DR6受體之TNFR家族成員（在文獻中亦稱為”TR9，，；在文獻中亦稱為TNF受體超家族成員21或TNFRSF21)已經描述為具有4個細胞外半胱胺酸富集基元及細胞質死亡域結構之1型跨膜受體（Pan等人，FEBS Lett·，43 1:35 1-356 (1998);亦參見美國專利 6,358 5〇8 ; 6,667,39〇 ; 6,919,〇78 ; 6,949,358)。已報導DR6在某些轉染細胞株中之過度表現導致細胞〉周亡及則_吐與JNK之活化（Pan等人，FEBS Letters， 127689.doc 200844113 43 1:35 1-356 (1998))。在DR6缺陷型小鼠模型中，在JNK活化中T細胞大體上受損，且當DR6(-/-)小鼠經蛋白質抗原激發時，發現其T細胞過度增生且顯示朝向Th2反應之深度極化（而Thl分化並不受同等影響）（Zhao等人，J· Exp· Med·， 194:1441-1448 (2001))。進一步報導DR6之靶向破壞導致活體外輔助性T細胞2型（Th2)分化增強（前述Zhao等人）。於 2005年3月31日公開之US 2005/0069540中描述DR6促效劑或拮抗劑在調節B細胞所介導之病狀中的各種用途。 DR6受體可在調節OVA誘發之小鼠哮喘模型中之氣管炎症中起作用（Venkataraman等人，Immunol· Lett·，106:42-47 (2006)) 〇使用髓鞘寡樹突神經膠質細胞醣蛋白（MOG(35-55))誘發之實驗性自體免疫性腦脊髓炎模型，發現與野生型（WT)仔畜相比DR6-/-小鼠對CNS疾病之發作及進行具有高度抗性。因此，DR6可與調節白細胞浸潤有關且在實驗性自體免疫性腦脊髓炎之誘導及進行中起作用（Schmidt等人，J. Immunol·，175:2286-2292 (2005)) ° 儘管已鑑別出各種TNF配位體及受體家族成員具有多樣生物活性及特性，但極少數該等配位體及受體已報導與神經相關功能有關。舉例而言，2004年8月26日公開之 \¥〇2004/0715 28描述在鼠類模型中抑制0095(?33)配位體/ 受體複合物來治療脊髓損傷。【發明内容】在本發明之實施例中，提供分離之死亡受體6(ffDR6”）拮 127689.doc -10- 200844113 抗劑。本文中揭示之拮抗劑的某些實施例抑制或阻斷DR6 與一或多種其同源配位體之間的相互作用。在較佳實施例中，本文中揭示之DR6拮抗劑抑制或阻斷DR6與其同源配位體類澱粉前驅蛋白（πAPP”）之間的相互作用。DR6拮抗劑之實施例可包含諸如DR6或APP抗體之抗體。該等DR6拮抗抗體可為（例如）單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在本發明之某些實施例中，DR6拮抗劑可包含抗DR6 抗體，其結合DR6胞外域多肽或其片段，且視情況可結合包含圖1A之胺基酸1-3 49或42-349之DR6多肽。或者，DR6 拮抗劑可包含抗-APP抗體，其結合APP多肽且視情況可結合包含圖1B之胺基酸66-81的APP多肽（SEQ ID NO: 6)。所涵蓋之DR6拮抗劑亦包括DR6免疫黏附素、DR6變體、 DR6片段、其共價修飾形式或其融合蛋白以及小分子拮抗劑。舉例而言，DR6拮抗劑可包括聚乙二醇化DR6或與諸如抗原決定基標籤之異源序列、諸如人類Fc之抗體片段或白胺酸拉鏈融合的DR6之可溶性胞外域形式。本發明之說明性實施例亦包括抑制或阻斷DR6與APP結合之方法，其包含在DR6與APP之結合受抑制之條件下將 DR6多肽及/或APP多肽曝露至一或多種DR6拮抗劑。用於該等方法中之典型DR6拮抗劑包括結合DR6或APP之抗體以及可溶性DR6多肽。視情況，藉由觀察DR6拮抗劑抑制DR6 與APP之間結合的能力選擇其用於此等方法。在本發明之某些實施例中，使用該等方法（例如）抑制細胞凋亡及/或增強神經元細胞在活體外組織培養物中之生長及/或存活。該 127689.doc 200844113 等方法涵蓋使用單一類型之DR6拮抗劑分子或兩種或兩種以上類型之DR6拮抗劑之組合。本發明之實施例亦提供用於增強神經元細胞或組織在哺乳動物中生長或再生或存活之方法，纟包含向哺乳動物投與有效量之DR6拮抗劑。在可選實施例中，投與DR6拮抗劑增強神經元細胞或組織在該哺乳動物中之生長且阻斷細胞死亡及退化。神經元細胞或組織可包含（例如）運動神經元、感覺神經元、連合神經元、軸突、微神經膠質細胞及/或寡樹突神經膠質細胞。在本發明之一些實施例中，用於該^ 方法中之DR6括抗劑可包含結合App且抑制其結合则之能力的抗體。在本發明之其他實施例中，用於該等方法中之DR6拮抗劑可包含結合DR6且抑制其結合App之能力的抗體。或者，DR6拮抗劑可包含DR6免疫黏附素，與選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白質性聚合物連接之DR6多肽或DR6多肽變體。用於該等方法中之 DR6免疫黏附素可包含與免疫球蛋白之卜區馬虫合的可溶性 DR6受體。此外，本發明之〇116拮抗劑可包括小分子。本發明之實施例亦提供治療神經疾病之方法，其包含向哺乳動物投與有效量之DR6结抗劑。在可選實施例中，該等方法包含治療哺乳動物之阿㈣默氏症。用於該等方法中之DR6拮抗劑可包含結合App且抑制其結合刪之能力的抗體。DR6拮抗劑亦可包含刪抗體。或者，腦抬抗劑可包含DR6免疫黏附素，與選自由聚乙二醇、$丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白質性聚合物連接之dr6多肽， 127689.doc -12- 200844113 DR6抗體或DR6變體。用於該等方法中之刪免疫黏附素可包含與免疫球蛋白之Fc區融合的可溶性DR6受體。用於該等方法中之抗-DR6抗體可結合包含圖丨八之胺基酸^的或 42-349的 DR6受體。本發明之實施例亦包括診斷患有神經疾病或易受神經疾病感染的患者之方法，其包含自患者獲得樣本且測試樣本中具有與SEQ ID NO: 1之DR6多肽序列不同的多肽序列之 DR6多肽變體的存在。通常在該等方法中，多肽變體經鑑別對APP多肽具有與觀察到對SEQ m N〇: 多肽序列的親和力不同之親和力。本叙明之貝施例亦提供鑑別所關注抑制DR6與App結合的分子之方法。該等方法可包含在所關注之分子存在或不存在之情況下組合DR6與APP，且隨後偵測在該所關注之分子存在下對DR6與APP結合之抑制。視情況，使用在細胞表面上表現DR6之哺乳動物細胞進行該等方法；且該等方法進一步包括偵測對DR6活化或信號轉導之抑制。本發明之實施例進一步包括由該等方法鑑別之分子。視情況，所關注之分子為結合APP之抗體，結合DR6之抗體或可溶性1)116 多肽。本發明之貫施例亦提供能夠特異性地與App配位體、受體結合，及/或能夠調節與DR6及/或其配位體及/或輔助受體相關的生物活性，且適用於治療各種神經疾病之抗體。在特定實施例中，提供特異性地與DR6多肽之胞外域序列結合之抗體（下文實例中進一步描述）。典型抗體為彼等 127689.doc -13- 200844113 結合APP或DR6且進一步針對其抑制DR6與APP之間的結合之能力加以選擇者。視情況，抗體為單株抗體。視情況，單株抗體包含由分別以寄存編號PTA-8095、PTA-8094或 PTA-8096寄存的融合瘤分泌之3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7 抗體。亦提供結合與由分別以ATCC寄存編號PTA-8095、 PTA-8094或PTA-8096寄存的融合瘤細胞株產生之 3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7單株抗體結合之抗體抗原決定基相同的抗原決定基之抗體。在一態樣中，本發明係關於包含3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7抗體之抗-DR6抗體，其對DR6 展示至少與抗體3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7相同的親和力，及/或展現至少與其相同的生物活性及/或效力。在其他特定實施例中，提供產生單株抗體3F4.4.8、 4B6.9.7或1Ε5·5·7，且分別經ATCC以寄存編號PTA-8095、 PTA-8094或PTA-8096寄存之融合瘤細胞株，且單株抗體 3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7分別由經ATCC以寄存編號 PTA-8095、PTA-8094或PTA-8096寄存的融合瘤分泌。亦提供分離之抗DR6單株抗體，其包含結合DR6多肽且競爭型抑制由以ATCC寄存編號PTA-8095、PTA-8094或 PTA-8096寄存之融合瘤產生的單株抗體與該DR6多肽之結合之抗體。亦提供嵌合或人類化抗DR6抗體，其特異性地結合DR6多肽且包含（a)來源於由分別經ATCC以寄存編號 PTA-8095、PTA-8094或PTA-8096寄存之融合瘤分泌的 3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7抗體之序列。視情況，該等抗體 127689.doc -14- 200844113 可包含來源於3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7抗體的重鏈、輕鏈或可變區。在另一態樣中，本發明係關於編碼本文之抗DR6抗體或抗體片段的分離之核酸分子，包含該等核酸分子之載體，包含該等核酸分子之宿主細胞及用於產生本文之抗體及抗體片段之方法。本發明進一步係關於包含如本文中所定義之DR6拮抗劑及載劑的組合物。載劑可為醫藥學上可接受之載劑且組合物可進一步包含其他藥劑。在另一態樣中’本發明係關於包含容器及含於該容器中之組合物的製品，其中該組合物包括本發明之DR6拮抗劑。製品可進一步包含活體外或活體内使用DR6拮抗劑之用法說明書。在一較佳實施例中，用法說明書係關於神經疾病之治療。在一相關怨樣中’本發明之實施例包括包含第一容器、位於該容器上之標籤及含於該容器内之組合物的套組。在该套組中，組合物包括有效抑制至少一種類型之哺乳動物神經凡細胞的細胞凋亡之DR6拮抗劑，位於該容器上之標鐵或包括於該容器中之藥品說明書指示該組合物可用於抑制至少一種類型之哺乳動物神經元細胞的細胞凋亡。視情况，4套組包括其他要素，諸如包含醫藥學上可接受之緩衝液之第二容器；及/或使用DR6拮抗劑抑制至少一種類型之哺乳動物神經元細胞的細胞凋亡之用法說明書。本發明進一步提供本文中所述之DR6拮抗劑及組合物用 127689.doc •15- 200844113 於製備或製造適用於治療哺乳動物神經疾病，包括用於治療阿茲海默氏症的藥物之用途。【實施方式】使用習知方法熟習此項技術者通常充分理解且通常採用本文中描述或引用之技術及程序，該方法諸如“瓜心⑽匕等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第二版（1989)

Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ν·Υ·中描述之廣泛使用之分子選殖方法。除非另作說明，否則適當時通常根據製造商定義之方案及/或參數進行包括使用市售套組及試劑之程序。在描述本發明方法及檢定之前，應瞭解本發明不侷限於特疋方法、方案、細胞株、動物物種或屬、構築體，且因而所描述之試劑當然可變化。亦應瞭解本文中使用之術語僅為描述特定實施例之目的，且並不且並不意欲限制本發明之僅由隨附申請專利範圍限定之範聋。

以揭示且描述連同該等公開案一以引用的方式併入本文中一起引用之方法及/或材 127689.doc 16 200844113 料。引用本文中引用之公開案在本申請案申請曰期之前的揭不内容。此處不應由於本發明之較早優先權日期或先前曰期而視為承認發明者無權提早公開案之曰期。另外，實際公開日期可不同於所示者且要求獨立核實。 I.定義術語”類澱粉前驅蛋白，，或”APP”包括由App前mRNA編碼之各種多肽同功異型物，例如圖1B-1D中分別展示之 APP695、APP751及App770同功異型物（自APP前mRNA之替代勇接轉錄產物轉譯之同功異型物）以及App同功異型物之轉#後加工部分。如在此項技術中所已知，自App基因轉錄之APP前mRNA經歷替代外顯子剪接以產生許多同功異型物（參見例如 Sandbrink等人，Ann NY Acad. Sci. 777: 281-287 (1996);及與pubMed NCBI蛋白質基因座寄存 P05 067相關之資訊）。此替代外顯子剪接產生695、75 1及770 個胺基酸之三種主要同功異型物（參見例如Kang等人，

Nature 325: 733-736 (1987)·，Kitaguchi等人，Nature 331: 530-532 (1988) ; Ponte等人，Nature 33 1: 525-527 (1988); 及丁anzi等人 ’ Nature 33 1: 528-532 (1988))。此等同功異型物中之兩種（八卯…及APPwo)含有與絲胺酸蛋白酶抑制劑 (KPI)之Kimitz家族高度同源的56個殘基之插入物且普遍表現。與此相反，缺乏κρι基元之較短同功異型物app695主要表現於神經系統中，例如表現於神經元及神經膠質細胞中’且因此其通常稱為π神經元APP"(參見例如Tanzi等人，

Science 235·· 880-884 (1988) ; Neve等人，Neuron 1: 669_677 127689.doc 200844113 (1988);及 Haas 等人，J. Neurosci 1 1: 3783-3793 (1991))。包括695、751及770之APP同功異型物經歷顯著轉譯後加工事件（參見例如 Esch 等人 1990 Science 248:1122-1124 ; Sisodia等人 1990 Science 248:492-495)。舉例而言，此等同功異型物中之每一者受各種分泌酶及/或分泌酶複合物裂解’此為產生包括含有APP胞外域（sAPPa及sAPPp)的N末端分泌多肽之APP片段之事件。由a分泌酶或者由β分泌酶進行之裂解分別導致產生且細胞外釋放可溶性Ν末端ΑΡΡ多肽、sAPPa及sAPPp，且保留相應膜錨定c末端片段C83及 C99。γ分泌酶對C83之後續加工產生P3多肽。此為主要分泌途徑且為非類澱粉產生途徑。或者，C99之早老素 (presenilin)/尼卡斯群（nicastrin)介導之γ分泌酶加工釋放類澱粉β多肽、類澱粉β40(Αβ40)及類澱粉β42(Αβ42)(類澱粉斑塊之主要組份），及細胞毒性C末端片段^CTF(50)、 Y-CTF(57)及^CTF(59)。證據表明各裂解事件之相對重要性視細胞類型而定。舉例而言，非神經元細胞較佳經在Ap序列中裂解ΑΡΡ之a分泌酶途徑加工ΑΡΡ，藉此排除Αβ之形成 (參見例如 Esch寺人 1990 Science 248:1122-1124 ; Sisodia等人1990 Science 248:492- 495)。與此相反，神經元細胞藉由 β分泌酶途徑加工更大部分之APP69〗，其藉由至少兩種酶類別之組合活性產生完整Αβ。在神經元細胞中，分泌酶在Αβ 域之胺基末端裂解APP6”，釋放不同ν末端片段（3ΑΡΡβ)。此外，γ-分泌酶在羧基末端之替代部位裂解App，產生為 40(Αβ4〇)或42個胺基酸長（Αβ42)之Αβ物質（參見例如Seubert 127689.doc -18- 200844113 等人 1993 Nature 361:260-263 ; Suzuki 等人 1994 Science 264:1336-1340 ;及 Turner 等人 1996 J· Biol. Chem. 271:8966-8970) 〇當用於本文中時術語”APP”、”App蛋白，，及”App多肽，，涵凰原生APP序列及APP變體及其加工片段。此等術語涵蓋表現於包括人類之多種哺乳動物中之ΑρρσΑρρ可内源性表現為天然存在於多種人類組織系中，或可藉由重組或合成方法表現。"原生序列ΑΡΡ”包含具有與來源於自然界之 ΑΡΡ(例如695、75 i及77〇同功異型物或其經加工部幻相同的胺基酸序列之多肽。因此’原生序列App可具有來自包括人類之任何哺乳動物的天然存在之App的胺基酸序列。該等原生序列APP可自自然界分離或可由重組及/或合成方法產生。術語"原生序列APP,H、函蓋APP之天㈣在之加工及/或分泌形式（例如’含有例如胞外域序列之可溶形式）、天然存在變體形式（例如’替代性剪接及/或蛋白質水解加工形式）及天^存在之對偶基因變異體。術變體可包括原生序列APP之片段或缺失突變體。適用於本發明實施例之APP多肽包括上述APP多肽及下列非限制性實例。可選擇此等說『生幵〆式用於本於明夕夂種實施例。在本發明之一此實施又二只施例中，App多 APP同功異型物，諸如展示於圖⑺一山匕3王長 APP751及/或APP77〇同功異型物。 695及/或中，APP多肽包含APP之轉譯後加工同:明之其他實施例由諸如α-分泌酶、β-分泌酶或7•分二型物，例如經歷 _之刀泌酶裂解之ΑΡΡ 127689.doc -19- 200844113 多肽（例如可溶性N末端片段，諸如sAPPa4sAppp)。在本發明之相關實施例中，App多肽可經選擇以包含一或多個特疋域’諸如N末端胞外域（參見例如quast等人，FASEB J. 2003; 17(12):1739-41)、肝素結合域（參見例如R〇ssj〇hn等人，Nat Struct Biol. 1999 Apr;6(4):32 7-3 1)、銅 II型（參見例如 Hesse 等人，FEBS Letters 349(1): 109-116 (1994))或

Kunitz蛋白酶抑制劑域（參見例如p〇me等人，Nature; 331 (615 6):525-7 (198 8))。在本發明之一些實施例中，App多肽包括經觀察包含由本文中揭示之DR6拮抗劑（諸如抗體或 DR6免疫黏附素）識別的抗原決定基之序列，例如App…之胺基酸22-81，包含由單株抗體22(：11結合的抗原決定基之序列（參見例如 Hilbich 等人，Journai of Bi〇1〇gical

Chemistry，268(35): 26571-26577 (1993))。在本發明之某些實施例中，APP多肽不包含一或多個特定域或序列，例如不包括某些N末端或C末端胺基酸之App 多肽（例如貫例12中揭示之人類重組N_App多肽）、不包括 Kunitz蛋白酶抑制劑域之App多肽（例如App或不包括阿茲海默氏β類澱粉蛋白（Αβ)序列之App多肽（sAppp，其為不包括Αβ4〇及/或Αβ〇序列之多肽）（參見例如B〇nd等人，j· Struct Biol· 2003 Feb; 141(2):156_70)。在本發明之其他實施例中，用於本發明實施例中之App多肽包含一或多個域或序列而非其他域或序列，例如包含N末端胞外域（或至少其之經觀察由諸如單株抗體22C112DR6拮抗劑結合的部分）而非為一或多個分泌酶裂解部位之c末端的諸如β類澱 127689.doc -20- 200844113 粉（Αβ)序列（例如sAPPa或sAPPp)之域或序列之App多肽。術語”細胞外域”、，，胞外域”或”ECD”係指app基本上不含跨膜及細胞質域之形式。通常可溶性Ecd將具有小於1%之该等跨膜及細胞質域，且較佳將具有小於〇. 5 %之該等域。應瞭解按照通常用於此項技術中鑑別疏水性域之類型的標準鑑別針對本發明多肽所鑑別之任何跨膜域。跨膜域之確切邊界可改變，但最可能在如最初所鑑別之域的任一末端改變不超過約5個胺基酸。在較佳實施例中，ECD將由不含跨膜及細胞質或胞内域的多肽之可溶性、胞外域序列組成 (且不為膜結合型）。術語"APP變體，，意謂如下定義之與具有圖1B_1D中所展示之胺基酸序列的人類APP或其可溶性片段或其可溶性胞外域具有至少約80%、較佳至少約85%、86%、87%、88%、 89%、更佳至少約90%、91%、92%、93%、94%、最佳至少約95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性之App 多肽。該等變體包括（例如）圖1B-1D之全長或成熟序列的N_ 末端或C-末端中添加一或多個胺基酸殘基或自圖iB]D之全長或成熟序列的N-末端或C-末端中缺失一或多個胺基酸殘基之APP多肽，或多肽之内部序列或域中插入一或多個胺基酸殘基或自多肽之内部序列或域中缺失一或多個胺基酸殘基之APP多肽，包括來自其他物種之變體，但排除原生序列APP多肽。 nDR6”或’’DR6受體”包括在此項技術中提及之受體，其聚核苷酸及多肽序列展示於圖中。pan等人已描述 127689.doc -21 - 200844113 稱為"DR6”或”TR9”之TNF受體家族成員的聚核苷酸及多肽序列（Pan等人，FEBS Lett·，431:351-356 (1998);亦參見美國專利 6,358,508 ; 6,667,390 ; 6,919,078 ; 6,949,358)。人類DR6受體為655個胺基酸之蛋白質（參見圖1A-2)，其具有推測信號序列（胺基酸1 -41 )、胞外域（胺基酸42-349)、跨膜域（胺基酸350-369)，接著為細胞質域（胺基酸370-655)。當在本文中使用時，術語"DR6受體，，涵蓋原生序列受體及受體變體。此等術語涵蓋表現於包括人類之多種哺乳動物中之 DR6受體。DR6受體可内源性表現為天然存在於多種人類組織系中，或可藉由重組或合成方法表現。”原生序列DR6受體π包含具有與來源於自然界的DR6受體相同之胺基酸序列的多肽。因此，原生序列DR6受體可具有來自包括人類之任何哺乳動物的天然存在之DR6受體的胺基酸序列。該等原生序列DR6受體可自自然界分離或可由重組或合成方法產生。術語”原生序列DR6受體”特定涵蓋天然存在截短或分泌形式之受體（例如，含有例如胞外域序列之可溶形式）、天然存在變體形式（例如替代性剪接形式）及天然存在之對偶基因變異體。受體變體可包括原生序列DR6受體之片段或缺失突變體。術語’，細胞外域，’或” ECD”係指DR6受體基本上不含跨膜及細胞f域之形式。通常可溶性ECD將具有小於1%之該等跨膜及細胞質域’且較佳將具有小於0.5%之該等域。應瞭解^ ^通常用於此項技術中用以鑑別疏水性域之類型的標準4a別針對本發明多肽所鑑別之任何跨膜域。跨膜域之確 127689.doc -22- 200844113 切邊界可改變，但最可能. 、犯在如取仞鑑別之域的任一末端改變不超過約5個胺基酸。在、罕乂住貝轭例中，ECD將由不含路膜及細胞質或胞内域的多女夕肽之可溶性、胞外域序列組成（且不為膜結合型）。』且術語，’DR6變體”意謂如下定疋義/、具有圖1A中所展示之推斷胺基酸序列的人類DR6或並 /、J，合性片段或其可溶性胞外域具有至少約80%、較佳地至少王乂、习 85/〇、86%、87%、88%、 89%、更佳至少約90%、9l〇/

Vi/° 92%、93%、94%、最佳至少 i. 約95%、96%、97%、98%或挪胺基酸序列—致性之刪多肽。該等變體包括(例如)在圖1A之全長或成熟序列的N 末端或C末端添加—或多個胺基酸殘基至或自圖1A之全長或成熟序列的N末端或C末端缺失一或多個胺基酸殘基之 DR6多肽，或在多肽之内部序列或域插入一或多個胺基酸殘基或自多肽之内部序列或域缺失一或多個胺基酸殘基之 DR6多肽，包括來自其他物種之變體，但排除原生序列· 多肽。視情況，DR6變體包含DR6受體之可溶形式，其包含圖1A的胺基酸卜州或42_349,具有至多1〇個保守胺基酸取代。較佳地，該變體充當如下文定義之DR6拮抗劑。術s吾DR6拮抗劑"以最廣泛意義使用，且包括在神經元細胞或組織中或活體外、就地、活體内或離體部分或完全阻斷、抑制或中和DR6受體結合其同源配位體、較佳其同源配位體APP或活化一或多個細胞内信號或細胞内信號轉導途徑之能力的任何分子。舉例而言’ Dr6拮抗劑可在神經元細胞或組織中部分或完全阻斷、抑制或中和DR6受體活 127689.doc -23· 200844113 化導致神經元細胞或組織中細胞凋亡或細胞死亡之一或多個細胞内信號或細胞内信號轉導途徑之能力。DR6拮抗劑可起作用以藉由多種機制部分或完全阻斷、抑制或中和 DR6，該等機制包括（但不限於）阻斷、抑制或中和同源配位體與DR6之結合，在DR6與其同源配位體（例如APP)之間形成複合物，使DR6受體募聚化，在DR6受體與異源輔助受體之間形成複合物，使同源配位體與DR6受體/異源輔助受體複合物結合，或在DR6受體、異源輔助受體與其同源配位體之間形成複合物。DR6拮抗劑可以直接或間接方式起作用。本發明涵蓋之DR6拮抗劑包括（但不限於）APP抗體、DR6 抗體、免疫黏附素、DR6免疫黏附素、DR6融合蛋白、DR6 之共價修飾形式、DR6變體及其融合蛋白，或DR6之較高寡聚物形式（二聚體、聚集體）或DR6之均聚物或雜聚物形式、諸如JNK信號轉導級聯之藥理學抑制劑之小分子，其包括 Jun N末端激酶JNK活性之小分子及肽抑制劑，在信號轉導途徑中JNK之上游起作用的蛋白質激酶MLK及MKK活性之藥理學抑制劑，JNK與支架蛋白質JIP-1結合之藥理學抑制劑，JNK與其諸如c-Jun或AP-1轉錄因子複合物之底物結合之藥理學抑制劑，JNK介導之其底物（諸如JNK結合域（JBD) 肽及/或JNK之底物結合域及/或包含JNK底物磷酸化部位之肽抑制劑）磷酸化之藥理學抑制劑，阻斷ATP與JNK結合之小分子’及阻斷底物與JNK結合之小分子。為測定DR6拮抗劑是否部分或完全阻斷、抑制或中和DR6 受體在神經元細胞或組織中活化一或多個細胞内信號或細 127689.doc -24- 200844113 胞内信號轉導途徑之能力，可進行檢定以評估DR6拮抗劑對（例如）各種神經元細胞或組織（如實例中所述）以及中風/ 大腦局部缺血活體内模型、神經退化性疾病活體内模型（諸如帕金森氏病（parkins〇n，s disease)小鼠模型）；阿茲海默氏症小a模型；肌萎縮性側索硬化ALS小鼠模型；脊髓性肌萎縮SMA小鼠模型；病灶性及整體大腦局部缺血小鼠/大鼠模型’例如頸總動脈阻塞模型或大腦中動脈阻塞模型；或離體全胚胎培養物中之效應。可以諸如如下所述或如在此項技術中已知及在文獻中所述之已知活體外或活體内檢定格式進行各種檢定（參見例如McGowan等人，TRENDS in

Genetics，22:281-289 (2006) ; Fleming 等人，NeuroRx， 2:495-503 (2005) ; Wong 等人，Nature Neuroscience， 5:633-639 (2002))。測定DR6拮抗劑是否在神經元細胞或組織中部分或完全阻斷、抑制或中和DR6受體活化一或多個細胞内信號或細胞内信號轉導途徑之能力的檢定之一實施例包含在DR6拮抗劑或潛在性DR6拮抗劑（亦即所關注之分子）存在或不存在之情況下組合DR6與APP ;且隨後在此 DR6拮抗劑或潛在性DR6拮抗劑存在下偵測對DR6與App結合之抑制。 ”核酸”意欲包括任何DNA或RNA。例如，組織樣本中存在之木色體、線粒體、病毒及/或細菌核酸。術語,，核酸，，涵盍雙股核酸分子之任一股或兩股且包括完整核酸分子之任何片段或部分。 ”基因"意謂在編碼或轉錄蛋白質或調節其他基因表現中 127689.doc -25- 200844113 /、有功此r生作用之任何核酸序列或其部分。基因可由負責編碼功能性蛋白質之所有核酸或僅由負責編碼或表現蛋白貝之核酸的-部分組成。核酸序列可含有外顯子、内含子、啟始或終止區、啟動子序列、其他調節序列或基因之獨特相鄰區内的遺傳異常。 Ο

術浯胺基酸"係指所有天然存在之L_a_胺基酸。此定義意謂包括正白胺酸、鳥胺酸及高半胱胺字母或三字母名稱鏗別：酸。該等胺基酸由 Asp D 天冬胺酸 lie I 異白胺酸 Thr T 蘇胺酸 Leu L 白胺酸 Ser S 絲胺酸 Tyr Y 酪胺酸 Glu E 麵胺酸 Phe F 苯丙胺酸 Pro P 脯胺酸 His H 組胺酸 Gly G 甘胺酸 Lys K 離胺酸 Ala A 丙胺酸 Arg R 精胺酸 Cys C 半胱胺酸 Trp W 色胺酸 Val V 纈胺酸 Gin Q 麩胺醯胺 Met M 甲硫胺酸 Asn N 天冬醯胺在圖中可採用某些其他單字母或三字母名稱來指代 4α別在序列之給定位置處的兩種或兩種以上胺基酸或核苷酸。當用以描述本文中揭示之各種肽或蛋白質時，，，分離，，意謂已自其天然環境之組份鑑別且分離及/或回收之肽或蛋白貝其天然環^兄之，亏染物組份為通常將干擾肽或蛋白貝的#斷或治療用途之材料，且可包括酶、激素及其他蛋謂包括正白胺酸、烏胺醅菸宜坐R、k ^ V ^ μ仏e a丨―奴 127689.doc -26- 200844113 白質性或非蛋白質性溶質。在較佳實施例中，狀或蛋白質將經純化⑴至^以藉由使用旋杯式序列分析儀獲得n末端或内部胺基酸序列之至少15個殘基之程度；或⑺至均質以使用考馬斯藍(C〇〇massie blue)或較佳地銀染色法用於非還原或還原條件下之SDS_PAGE;或（3)至均質以用於光譜技術或肽作圖技術。分離之材料包括重組細胞内的原位狀或蛋白質，此係由於其天然環境之至少一種組份將不存在。然而’通常藉由至少一個純化步驟製備分離之肽或蛋白質。關於本文中鑑別之序列的，，胺基酸序列一致性百分數 (%)’經定義為比對序列且引入缺口（必要時）以取得最大序列一致性百分數，且不將任何保守性取代視為序列一致性之部分後，與參考序列中之胺基酸殘基一致的候選序列中胺基酸殘基之百分數。可以此項技術之技藝範圍内，可測定量測比對之適當參數的多種方式（包括為對所比較全長序列取得最大比對所需之賦值演算法）取得為達成測定胺基酸序列一致性百分數目的之比對。出於本文之目的，可使用由Genentech，Inc.設計且源編碼已與使用者文件一起保存在US Copyright Office，Washington，DC，20559 中，以 US 版權登記（Copyright Registration)第 TXU5 10087 號登記之序列比較電腦程式ALIGN-2獲得胺基酸一致性百分數值。ALIGN-2 程式可經由 Genentech，Inc.，South San Francisco，CA公開獲得。由ALIGN-2程式設定所有序列比較參數且不改變。一般技術者可易於測定雜交反應之”嚴格性”且其通常為 127689.doc -27- 200844113 根據探針長度、洗滌溫度及鹽濃度之經驗計算值。通常，較長探針要求較高溫度以適當黏接，而較短探針需要較低溫度。雜交通常依賴於當互補鏈存在於低於其溶融溫度之環境時變性麵再黏接之能力。探針與可雜交序列之間的所需-致性程度愈高，其可使用之相對溫度愈高。因此，由此得出結論’較高相對溫度將趨向於使反應條件更嚴格，而因此較低溫度趨向於使反應條件不太嚴格。對於雜交反應之嚴格性之其他細節及說明，參見Ausubel等人， Current Protocols in Molecular Biology, Wiiey

Interscience Publishers (1995)。藉由以下條件鑑別如本文中所定義之”高嚴格性條件，，： (1)採用低離子強度及咼溫以供洗務；〇 · 〇 1 5 μ氯化納/〇.〇〇 1 5 Μ擰檬酸鈉/〇·ι%十二烷基硫酸鈉，5(rc ; 在雜交期間採用變性劑；在42 °C下具有0.1%牛血清白蛋白/〇.1% Ficoll/0.1 %聚乙浠π比u各u定酮之5〇% (v/v)甲酿胺/具有75〇 mM氯化鈉、75 mM檸檬酸鈉之50 mM構酸鈉緩衝液pH 6·5 ;或（3)採用在 42°C 下 50%甲醯胺、5xSSC (0.75 M NaCl、 0.075 IV[檸檬酸納）、50 mM磷酸納（pH 6.8)、0.1%焦石粦酸鈉、 5 x唐納氏溶液（Denhardf s solution)、超音波處理之娃魚精 DNA(5 0 pg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，洗滌液為在 42°C下於0.2xSSC(氣化鈉/檸檬酸鈉）中及55°C下50%曱醯胺，接著為由在55°C下含有EDTA之O.lxSSC組成的高嚴格性洗滌液。可如 Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory 127689.doc -28 - 200844113

Manual, New York: Cold Spring Harbor Press，1989所述鑑

別’’中等嚴格條件”，且其包括在37”下於包含以下各物之溶液中培育隔夜：20%甲醯胺、5xSSC(15〇 mM Naa、15 mM 檸檬酸鈉）、50mM磷酸鈉（ρΗ7·6)、5x唐納氏溶液、1〇%硫酸葡聚糖及20 mg/ml變性剪切鮭魚精DNA，接著在1><ssc 中在約37-5G C下洗條過漉器。熟習此項技術者應認識到如何視需要調節溫度、離子強度等以適應諸如探針長度及其類似因素之因素。術浯”引子”係指如（例如）在聚合酶鏈反應中所進行，與互補RNA或DNA標革巴聚核苦酸雜交且充當藉由核*酸轉移酶作用自單料酸逐步合成㈣㈣之起始點之募核苦酸序列0 術§吾’控制序列"係指表現特定宿主生物體中操作性連接之編碼序列所必需的DNA序列。適於原核生物之控制序列

⑴士）啟動子、視情況操縱基因及核糖體結合部位。已知真核細胞使用啟料、多聚腺g呤㈣及強化子。，二將核酸置於與另一核酸序列之功能關係中日夺，其係經私作ί·生連接。舉例而言，若前序列或分泌前導序列之表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其與該多肽之DNA操作性連接’ S啟動子或強化子影響序列之轉錄，則其與編 ^列操作性連接；或若核糖體結合部位較位以便促進轉 1，則其與編碼序_純連接。通常，"㈣性連接"音 '所連接之DNA序列為鄰接的且在分泌前導序列之情、；下’鄰接且處於閱讀相中。然而強化子不必鄰接。藉：連 127689.doc *29- 200844113 接反應在便利限制性部位實現連接。若該等部位並不存在丄則根據習知實踐使用合成寡核㈣銜接子或連接子。當在本文中使用時措詞"標記物"係指直接或間接接合或融合至諸如核酸探針或抗體之試劑且促進其所接合或融合之該試劑的偵測之化合物或組合物。標記物本身可偵測(例 =放射性同位素標記物或螢光標記物），或在酶促標記物之 f月况下，可催化可偵測之底物化合物或組合物之化學改變。如本文中所用，術語”免疫黏附素"表示抗體樣分子，其 =合異源蛋白質（”黏附素”）之結合特異性與免疫球蛋白怪定域之效應功能。在結構上’免疫黏附素包含具有所需結 &特八I"生不為抗體之抗原識別及結合部位的（亦即為，，異源" 的）胺基酸序列與免疫球蛋白恆定域序列之融合體。免疫黏附素分子之黏附素部分通常為包含至少受體或配位體之結合部位的連續胺基酸序列。免疫黏附素中之免疫球蛋白恆定域序列可獲自任何免疫球蛋白，諸如IgG_卜IgG_2、igG_3 或IgG-4亞型、IgA(包括IgA]及IgA_2)、邮、邮或㈣。 "DR6受體抗體"、”DR6抗體"或，，抗DR6抗體"以廣泛意義使用以指結合至少一種形式之DR6受體 '較佳地人類dr6 受體、諸如圖1A中所示之DR6序列或其胞外域序列的抗體。視情況，將DR6抗體與異源序列或分子融合或連接。較佳地，異源序列允許或輔助抗體形成高階或寡聚複合物。術语’抗-DR6抗體"及其語法等效物尤其涵蓋下文實例部分中所述之DR6單株抗體。視情況，DR6抗體與DR6受體結合但不與腫瘤壞死因子家族之任何其他受體（例如DR4、 127689.doc -30· 200844113 DR5、TNFR1、TNFR2、Fas)結合或交又反應。視情況，如在BIAcore結合檢定中所量測，本發明之DR6抗體以約〇 nM至約〇·〇33 μΜ之濃度範圍與DR6受體結合。術語”抗-ΑΡΡ抗體”、，，ΑΡΡ抗體”及語法等效物以廣泛意義使用，且係指與至少一種形式之ΑΡΡ、較佳地諸如本文中特定描述之ΑΡΡ多肽同功異型物的人類ΑρΡ結合之抗體。較佳地’ ΑΡΡ抗體為DR6拮抗劑抗體。舉例而言，在製造及/ 或鑑別如本文中揭示之DR6拮抗劑的方法中，Αρρ之一戋多種同功異型物及/或其部分可用作免疫原以使動物免疫（例如作為產生單株抗體之方法之部分的小鼠）及/或用作探針以篩選化合物庫（例如重組抗體庫）。適用於本發明實施例之典型ΑΡΡ多肽包括以下非限制性實例。可選擇此等說明性形式用於本發明之各種實施例中。在本發明之一 4b實施例中，APP多肽包含全長APP同功異型物，諸如展示於圖丄中之ΑΡΡ6”及/或ΑΡΡ7”*/或ΑΡΡ”。同功異型物。在本發明之其他實施例中，APP多肽包含APP之轉譯後加工同功異型物，例如已經歷諸如α-分泌酶、β-分泌酶或[分泌酶之分泌酶之裂解之ΑΡΡ多肽（例如可溶性ν末端片段，諸如sAppa 或sΑΡΡβ)。在本發明之相關實施例中，App多狀可經選擇以包含一或多個特定域，諸如N末端胞外域（參見例如Quast 等人，FASEB J· 2003; 17(12):1739-41)、肝素結合域（參見例如 Rossjohn等人，Nat Struct Biol· 1999 Apr; 6(4):327. 3 1)、銅弟二型（參見例如Hesse等人，FEBS Letters 349⑴： 109-116 (1994))或Kunitz蛋白酶抑制劑域（參見例如P〇nt_ 127689.doc -31 - 200844113 人，Nature; 33 1 (61 56):525_7 (1988))。在本發明之一些實施例中，APP多肽包括經觀測包含由本文中揭示諸如抗體或 DR6免疫黏附素（例如APP695之胺基酸22-8 1}之DR6拮抗劑所識別的抗原決定基之序列，包含由單株抗體2 2 c 11結合的抗原決定基之序列（參見例如Hilbich等人，Journal 〇f

Biological Chemistry，268(35): 26571-26577 (1993))。在本發明之某些實施例中，APP多肽不包含一或多個特定域或序列，例如不包括某些N末端或C末端胺基酸之App多肽（例 f 如實例12中揭示之人類重組ν·αρρ多肽）、不包括Kunitz蛋白酶抑制劑域之APP多肽（例如APP6%)或不包括阿兹海默氏β類殺粉蛋白（Αβ)序列之APP多肽（例如sAPp(3，一種不包括Αβ4◦及/或Αβ42序列之多肽）（參見例如Bond等人，j. Struct Β1〇1· 2〇〇3 Feb; 141(2):156-7〇)。在本發明之其他實施例中，用於本發明實施例中之APP多肽包含一或多個域或序列而非其他域或序列，例如包含N末端胞外域（或至少其經 ( 觀察由諸如單株抗體22C11之DR6拮抗劑結合的部分）而非 ^ 為一或多個分泌酶裂解部位之C末端的諸如β類澱粉（Αβ)序列（例如sAPPa或δΑΡΡβ)之域或序列之app多肽。視情況，抗APP抗體將抑制APP多肽與〇116之結合且將如本文中所述及/或如在基於細胞之定量結合檢定中所量測與濃度為 10 Kg/ml至50 pg/ml之APP多肽結合。本文之術語’’抗體”以最廣泛意義使用且尤其涵蓋完整單株抗體、多株抗體、由至少兩個完整抗體形成之多特異: 抗體（例如雙特異性抗體）及抗體片段，只要其展現所需2物 127689.doc -32- 200844113 活性。 π抗體片段”包含完整抗體之一部分，較佳地包含其抗原結合或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab，、F(ab，）2& Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。

”原生抗體”通常為約150,000道爾頓之由兩個相同輕鏈 (L)及兩個相同重鏈（H)組成的雜四聚體醣蛋白。各輕鏈藉由一個共價雙硫鍵與重鏈連接，而雙硫鍵之數目在不同免疫球蛋白同型之重鏈中可變。各重鏈及輕鏈亦具有規則隔開之鏈内雙硫橋。各重鏈在一端具有可變域（Vh)，接著為許夕恆疋域。各輕鏈在一端具有可變域且在其另一端具有恆定域；輕鏈之恆定域與重鏈之第一恆定域對準且輕鏈可變域與重鏈之可變域對準。咸信特定胺基酸殘基形成輕鏈與重鏈可變域之間的界面。術浯可變”係指以下事實：可變域之某些部分在抗體之序列上廣泛不同且用於各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。“，可變性並不均勻分布在整個抗體之可變域中。其集中在三個輕鏈與重鏈可變域中稱為高變區或互補決定區之區段中。可變域之較高度保守部分稱作框架區 (FR)m鏈及輕鏈之可變域各包含4個叹，大部分採用 β擅疊構型，經形成環連接且在某些情況下形成⑽疊結構之一部分的三個高變區連接。各鏈中之高變區經㈣鏈之高《緊密接近料在—起，促進抗體之抗原結ς 位之形成（參見Kabat等人，㈣__ σ/ 127689.doc -33- 200844113 /顯關o/og/ca/ ㈣以，第五版。Public Health

National Institutes of Health，Bethesda，MD. (1991))。恆定域並不直接參與使抗體結合至抗原，但顯示各種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴型細胞介導之細胞毒性 (ADCC)。抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個稱為”Fab"片段之各具有單一抗原結合部位的相同抗原結合片段及殘餘”Fc，，片段，其名稱反映其易於結晶之能力。胃蛋白酶處理產生 F(ab’）2片段，其具有兩個抗原結合部位且仍能夠使抗原交聯。 nFv”為含有完整抗原識別及抗原結合部位之最小抗體片 I又。此區域由呈緊密、非共價結合之一個重鍵及一個輕鍵可受域之一聚體組成。在此構型中，各可變域之三個高變區相互作用以界定Vh_Vl二聚體表面上之抗原結合部位。六個高變區共同賦予抗體抗原結合特異性。然而，甚至單一可變域（或僅包含三個對抗原具有特異性之高變區的”之一半）具有識別且結合抗原之能力，儘管親和力比整個結合部位低。

Fab片段亦含有輕鏈之怪定域及重鏈之第一怪定域 (CHI)。Fab’片段與Fab片段不同之處在於在重鏈CH1域之羧基末端添加包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸的數個殘基。Fab’-SH為本文中對恆定域之半胱胺酸殘基帶有至少一個游離硫醇基之Fab，之命名。F(ab’）2抗體片段最初產生為其間具有鉸鏈半胱胺酸的Fab，片段對。亦已知抗體片段之 127689.doc -34- 200844113 其他化學偶合。來自任何脊椎動物物種之抗體（免疫球蛋白）的，，軒鍵、基於其悝定域之胺基酸序列指派為稱為K及A兩彳 J |固明顯不同類型中之一種。根據重鍵之恆定域之胺基酸序列，抗體可指 4曰I為不同類別。存在5種完整抗體之主要類別：IgA、IgD、IgE、及IgM，且此等類別中之數種可進一步分成子類（同型），例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及 IgA2。對應於抗體之 ί、不同類別的重鏈恆定域分別稱作α、δ、ε、γ及μ。熟知免产球蛋白之不同類別之次單位結構及三維構型。 π單鏈Fv”或” scFv”抗體片段包含抗體之％及％域，其中此等域存在於單一多肽鏈中。較佳地，Fv多肽進一步包含介於域之間的多肽連接子，其使得％以能夠形成供抗原結合之所需結構。對於scFv之回顧參見ριϋς:]α1ιιιη2 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113 卷，

Rosenburg 及 Moore 編，Springer-Verlag，New York，第 I 269-3 15 頁（1994)。術語’’雙功能抗體”係指具有兩個抗原結合部位之小抗體片段，該等片段包含以同一多肽鏈（VH-VL)連接至輕鏈可變域（VL)之重鏈可變域（VH)。藉由使用過短以不允許同一鏈上之兩個域之間配對的連接子，域被迫與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合部位。雙功能抗體更充分描述於（例如）EP 404,097 ; WO 93/11161 ;及 Hollinger 等人，iV%·

Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)t 0 127689.doc -35- 200844113 如本文中所用之術語”單株抗體，，係指獲自大體上同源抗體之群體之抗體，亦即除可少量存在之可能的天然存在之大夂外構成群體之個別抗體相同。單株抗體針對單一抗原部位具有高度特異彳生。此外，與通f包括針對不同決定子 (抗原決定基）之不同抗體的習知（多株）抗體製劑不同，各單株抗體針對抗原上之單-決定子。除其特異性外，單株抗體之有利之處在於其係藉由融合瘤培養而合成，未污染有其他免疫球蛋白。修飾語”單株”指示獲自抗體之大體上同源群體的抗體之特徵且其不應理解為要求藉由任何特定方法產生抗體。例如，可藉由Kohler等人，Nature，256:495 (1975)首先描述之融合瘤方法或可藉由重組dna方法（參見例如美國專利第4,816,567號）製造欲根據本發明使用之單株抗體。亦可使用例wClackson等人，Nature，352:624_628 (1991)及 Marks 等人，J. MoLBi〇1，222:581-597 (1991)中描述之技術自噬菌體抗體庫分離”單株抗體，，。本文之單株抗體尤其包括”嵌合”抗體（免疫球蛋白），其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類的抗體之相應序列相同或同源，而鏈之剩餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類的抗體以及該等抗體之片段之相應序列相同或同源，只要其顯示所需生物活性（美國專利第4,816,567號；M〇rrison等人，

Proc· Natl· Acad· Sci. USA，81:685 1-6855 (1984))。本文中所關注之嵌合抗體包括”霊長類化”抗體，其包含來源於非人類靈長類（例如舊大陸猴（Old World Monkey)，諸如拂 127689.doc -36- 200844113 狒、恆河猴或翻猴）之可變域抗原結合序列及人類恆定區序列（美國專利第5,693,780號）。非人類（例如鼠類）抗體之，，人類化”形式為含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。在很大程度上，人類化抗體為人類免疫球蛋白（受體抗體），其中受體之高變區的以基經來自諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類之非人類物種（供體抗體）之高變區的具有所需特異性、親和力及能力之殘基置換。在某些情況下，人類免疫球蛋白之框架區（FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含受體抗體或供體抗體中不存在之殘基。進行此等修飾以進一步改善抗體效能。通常，人類化抗體將包含大體上至少一個且通常兩個可變域之全部，其中所有或大體上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環，且所有或大體上所有FR為人免疫球蛋白序列之FR。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區（Fc)之至少一部分，通常人類免疫球蛋白之恆定區之至少一部分。對於其他細節，請參見

Jones專人 ’ Nature 321:522-525 (1986) ; Riechmann等人， Nature 332:323-329 (1988) ； ^Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) 〇當在本文中使用時術語”高變區”係指抗體中負責抗原結合之胺基酸殘基。高變區包含”互補決定區，，或”CDR”之胺基酸殘基（例如輕鏈可變域中之殘基24-34(Ll)、50-56(L2)及 89-97(L3)，及重鏈可變域中之 31_35(H1)、50-65(H2)及 95-102(H3)，Kabat 等人 ’ Sequences of Proteins of 127689.doc -37- 200844113

Immunological Interest，第五版，Public Health Service，

National Institutes of Health，Bethesda，MD. (1991))及 /或 n面變環n之殘基（例如輕鏈可變域之殘基26-32(L 1)、 50-52(L2)及 91-96(L3)，及重鏈可變域之 26-32(Η1)、 53-55(H2)及 96-101(H3) ; Chothia &LeskJ.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))。”框架，，或” FR”殘基為除如本文中所定義之高變區殘基以外的可變域殘基。

π結合”所關注之抗原的抗體為能夠以足夠親和力及/或親和性結合彼抗原以使得抗體適用作靶向表現該抗原之細胞的治療或診斷劑之抗體。出於本文之目的，”免疫治療”將係指以抗體治療哺乳動物（較佳人類患者）之方法，其中該抗體可為未接合或，，裸，，抗體’或該抗體可與諸如一或多個細胞毒性劑之異源分子或藥劑接合或融合’藉此產生”免疫接合物”。为離抗體為已自其天然環境之組份鑑別且分離及/或回收的抗體。其天然環境之污染組份為干擾抗體的診斷或治療性用途之物質’且可包括酶、激素及其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。在較佳實施例中，抗體將經純化⑴至如 Lowry方法所測定大於95重量％之抗體，且最佳大於99重量 %，⑺至足以藉由使用旋杯式序列分析儀獲得至少末端或内部胺基酸序列之殘基之程度；或⑺至使用考馬斯藍或較佳地銀染色法在還原或非還原性條件下進行 SDS PAGE之均貝。分離抗體包括重組細胞内之原位抗體> 此係因為抗體之天然環境的至少一種組份將不存在。然 127689.doc -38- 200844113 而，通常藉由至少一個純化步驟製備分離抗體。田在本文中使用時術語”經標籤標記’，係指包含與”標籤多肽’融合的抗體或多肽之嵌合分子。標籤多肽具有足夠殘基以提供可針對其製備抗原之抗原決定基或提供某些其他功此，諸如募聚能力（例如，如具有白胺酸拉鏈域之肽中所發生），然而應足夠短以使得其通常並不干擾抗體或多肽之活性。標籤多肽較佳地亦相當獨特，以便標籤特異性抗體大體上不與其他抗原決定基交叉反應。適當標籤多肽通常具有至少六個胺基酸殘基且通常在約8至約5〇個胺基酸殘基之間（較佳在約1〇至約20個殘基之間）。術語’’Fc受體”或”FcR”用以描述與抗體之卜區結合的受體。較仏FcR為原生序列人類pcR。此外，較佳pcR為结合 IgG抗體（γ受體）且包括Fc^ri、FcyRII及FcyRIII子類（包括此等受體之對偶基因變異體及替代剪接形式）之受體的FcR。 Fc^RII受體包括FqRIIA(”活化受體”）及FcyRIIB(”抑制受體Ί，其具有主要在其細胞質域中不同之相似胺基酸序列。活化受體FqRIIA在其細胞質域中含有免疫受體酪胺酸基活化基元（ITAM)。抑制受體FcyRIIB在其細胞質域中含有免疫受體酪胺酸基抑制基元（ITIM)(參見DaSr〇n, 及以 / 所所關〇/· 15:203-234 (1997))。FcR 回顧於 Ravetch 及 Kinet，

Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) ; Capel 等人，

Immunomethods 4:25-34 (1994)及 de Haas等人，J· Lab· Clin

Med· 126:33 0-41 (1995)中。本文之術語”FcR，，涵蓋包括將來待識別者之其他FcR。該術語亦包括新生受體pcRn，其負 127689.doc -39- 200844113 責將母系IgGs轉移至胎兒（Guyer等人，J. immun〇l. 117:587 (1976)及 Kim 等人，J. Immunol. 24:249 (1994))。本文之 FcR 包括多態現象，諸如編碼FcyRHIa之基因之遺傳二態現象，其在位於結合IgGl之受體的區域中之胺基酸位置158產生苯丙胺酸（F)或纈胺酸（v)。相對於純合苯丙胺酸FcyRIIIa (Fc7RIIIa-15 8F)或雜合（FcYRIIla-i58F/v)受體，已展示純合綠胺酸FcYRIIIa(FcYRIIIa-158V)對人類igGl具有較高親和力且在活體外介導ADCC增加。當在本文中使用時術語”多元醇”廣泛指多羥基醇化合物。多το醇可為例如任何水溶性聚（氧化烯）聚合物且可具有直鏈或支鏈。較佳多元醇包括在一或多個羥基位置經諸如具有1與4個之間的碳之烷基的化學基團取代之多元醇。通 Φ，多το醇為聚（烷二醇），較佳為聚（乙二醇奴叩⑺。然而，热白此項技術者認識到可使用本文中關於pEG所描述之接合技術，採用諸如聚（丙二醇）及聚乙二醇_聚丙二醇共聚物之其他多元醇。多元醇包括在此項技術中熟知之多元醇及可自（諸如）諸如Nektar® c〇rp〇mi〇n之市售來源公開獲得之多元醇。術語，，接合物"在本文中根據其最廣泛定義使用以意謂聯〆、妾在起^分子如聯接般起作用或操作時，分子係’’經接合”。表達"有效量"係指有效預防、改善或治療所討論之病症或病狀之藥劑（例如DR6拮抗劑物量。預期本發明之㈣心抗^將適用於減緩或終止退化性神經疾病之進行或適用 127689.doc -40- 200844113 於增強受損神經元細胞或組織之修復且有助於恢復適當神經功能。如本文中所用之術吾”治療”（”treating，，，"treatment，，）及 ”療法"（"therapy”）係指治療性療法及預防性療法。連續治療或投藥係指至少母日基礎上之治療，在一或多天之治療中無間斷。間歇治療或投藥或以間歇方式治療或投藥係指不連續，但性質上為循環之治療。如本文中所用術語”病症”通常係指將受益於以本文中所描述之DR6拮抗劑治療的任何病狀。其包括慢性及急性病症’以及使哺乳動物易患所討論之病症的病理學病狀。神經元細胞或組織’’通常指運動神經元、包括（但不限於）連合神經元之中間神經元、包括（但不限於）背根神經節神經元之感覺神經元、黑質之多巴胺（DA)神經元、紋狀體DA神經凡、皮層神經元、腦幹神經元、脊髓中間神經元及運動神經元、包括（但不限於）海馬區之CA1錐體神經元的海馬區神經元及前腦神經元。本文中術語神經元細胞或組織意欲指由細胞體、軸突及樹突組成之神經元細胞，以及指可形成該等神經元細胞之部分的軸突或樹突。本文中使用’’神經疾病”來指包括神經退化性病狀、特徵在於中樞性或外周神經系統功能異常或神經元細胞或組織壞死及/或細胞凋亡之神經元細胞或組織損傷，及與營養因子剝奪相關的神經元細胞或組織損傷之病狀。神經退化性疾病之實例包括家族及偶發性肌萎縮性側索硬化（分別為 FALS及ALS)、家族及偶發性帕金森氏病、亨丁頓氏症（亨 127689.doc -41 - 200844113

爾頓氏舞蹈病（Huntington's chorea))、家族及偶發性阿茲海默氏症、脊髓性肌萎縮（SMA)、諸如青光眼或相關疾病之視神經病（包括視網膜變性、糖尿病性神經病或黃斑退化）、歸因於内耳感覺細胞或神經元退化之聽力受損、癲癇症、貝爾麻痹（Bell’s palSy)、具有與染色體17(FTDP_17)有關的帕金森氏病之額顳葉型癡呆、多發性硬化症、擴散型大腦皮層萎縮、路易體癡呆、匹克氏病（pick disease)、三核苷西文重複疾病、朊病毒病症及香德症候群（处广〜叫“ syndrome)。可因損害神經元細胞或組織之存活或適當功能的多種不同病因發生神經元細胞或組織之損傷，其包括（但不限於）因例如以下原因導致之急性及非急性損傷：整體^ 病灶性大腦局部缺血（中風）時缺血性條件限制（暫時或永久）血流；例如大腦組織或脊趙之切口或傷口； #經元电織中之病變或斑塊；細胞生長及存活所需要之營養因子的剝奪；曝露於諸如化療劑之神經毒素；以及易發生諸如慢性代謝疾病（諸如糖尿病或腎功能異常）之其他疾病病況。 ”受檢者"或”患#”意謂任何需要療法之包括人類之單個對象。亦意欲包括任何與臨床研究試驗有關但未展示任疾病臨床症狀的對象作為受檢者， 4興机仃病學研究有關之對象或用作對照之對象作為受檢者。 ^ 如本文中所用之術語"喝乳動物"係指任何歸類為哺物之哺乳動物，包括人類、牛、 …、動、千馬、犬及錨。在本發明之一較佳實施例中，哺乳動物為人類。 II·本發明之例示性方法及材料 127689.doc -42- 200844113 先前研究已分析神經系統發育期間細胞死亡之現象 (Hamburger等人，J· Neurosci·，1:60-71 (1981); 〇ppenheim， Ann. Rev. Neurosci·，14:453-501 (1991) ; O’Leary等人，j· Neurosci·，6:3692-3705 (1986) ; Henderson等人，Nature， 363.266-270 (1993) ; Yuen等人，Brain Dev·，1 8:362-368 (1996))。咸信神經元細胞之死亡在各種神經疾病之發展及/ 或進行中起作用，該等神經疾病諸如家族及偶發性肌萎縮性側索硬化（分別為FALS及ALS)、家族及偶發性帕金森氏病、亨丁頓氏症、家族及偶發性阿茲海默氏症及脊髓性肌萎縮（SMA)(Price 等人，Science，282:1079-1083 (1998))。申請者意外發現TNFR家族之成員DR6高度表現於包括大腦皮質、海馬區、脊髓之運動神經元及中間神經元的胚胎及成人中樞神經系統中。如下文實例中所述，申請者進行各種實驗性檢定以研究DR6作為神經元細胞存活或死亡之凋即劑可起之作用。連合神經元之存活依賴於其中間標靶之一者脊髓基板的營養支持。在活體外外植體培養物中，申請者發現RNA干擾對DR6表現之抑制阻斷連合神經元之軸突退化。亦在背脊髓存活檢定中測試抗DR6單株抗體，且確定DR6特異性抗體3F4.4.8、4B6.9.7及1E5.5.7對DR6 叉體信號轉導之抑制防止活體外外植體培養物中連合神經元之軸突退化。在文獻中已報導DR6經由活化JNK傳導信號 (上文之Pan等人，1998 ;上文之Zha〇等人，2〇〇1)。因此，為研究DR6-JNK信號轉導在軸突退化中之作用，進行背脊髓存活檢定，其中連合神經元中之JNK信號轉導途徑被肽 127689.doc -43- 200844113 抑制劑L-JNK-Ι阻斷。JNK信號轉導之此抑制在背脊髓存活檢定中部分阻斷軸突退化。因此，咸信DR6至少部分經由 JNK途徑傳導軸突過程退化之信號。為更好地瞭解DR6在發育中調節神經元細胞死亡之生理學作用，在全胚胎培養系統中藉由抗-DR6抗體阻斷DR6信號轉導。驚人地，某些DR6 特異性抗體對D R 6信號轉導之抑制在此系統中保護脊髓神經元免於天然存在之發育細胞死亡。因此，可使用諸如拮抗劑抗體之DR6拮抗劑來減少神經疾病中出現之神經元細胞死亡，該等神經疾病諸如神經退化性疾病（例如als、 SMA、阿茲海默氏症及帕金森氏病、ftdP-17、亨爾頓氏症）及中風。為研究DR6是否在活體内充當真正促凋亡受體，申請者分析發育階段E15.5之DR6基因剔除胚胎之表型。根據所提出的DR6作為神經元細胞存活之負調節劑之作用，與DR6雜合仔畜對照相比，在DR6缺乏脊髓及背根神經節中偵側到神經元細胞死亡減少約4〇%至5〇%。申請者亦已意外發現類澱粉前驅蛋白（App)為DR6受體之同源配位體且進一步發現APP起作用以經由DR6受體觸發軸突退化。先前已假設類澱粉前驅蛋白在阿茲海默氏症中起某些（儘管未充分瞭解）作用（Selk〇e，BiQl> chem< 271:18295 (1996) ; Scheimer ;等人，Nature Med 2:864 (1996)，Goate，等人，Nature 349:704 (1991))。咸信DR6拮抗劑將尤其適用於治療各種神經疾病。因此本發明提供DR6拮抗劑組合物及抑制、阻斷或中和哺乳動物之DR6活性的方法，其包含投與有效量之dr6拮抗劑。較 127689.doc • 44 - 200844113 佳地，所用DR6拮抗劑之量將為有效阻斷軸突退化及神經元細胞死亡之量。此可根據（例如）下文及實例中所述之方法實現。可用於該等方法之DR6拮抗劑包括（但不限於）DR6及/或 APP免疫黏附素、包含DR6及/或APP之融合蛋白、DR6及/ 或APP之共價修飾形式、DR6及/或APP變體、其融合蛋白及 DR6及/或APP抗體。本文中描述可用於製造拮抗劑之各種技術。例如，描述用以製備DR6及APP多肽之方法及技術。亦描述DR6及APP多肽之其他修飾，及DR6及APP之抗體。本文中揭示之本發明具有許多實施例。本發明提供抑制 DR6與APP之結合之方法，其包含在DR6與APP之結合受抑制之條件下使DR6多肽及/或APP多肽曝露於一或多種DR6 拮抗劑。本發明之相關實施例提供抑制包含SEQ ID NO: 1 的胺基酸1-655之DR6多肽與包含SEQ ID NO: 6之胺基酸 66-81的APP多肽（例如sAPPp)結合之方法，該方法包含組合 DR6多肽及APP多肽與結合DR6或APP之分離拮抗劑，其中該分離拮抗劑係選自結合APP之抗體、結合DR6之抗體及包含SEQ ID NO: 1之胺基酸1-3 54的可溶性DR6多肽中之至少一者；且就該分離拮抗劑抑制DR6與APP結合之能力對其加以選擇；以便抑制DR6與APP之結合。視情況在該等方法中，一或多種DR6拮抗劑係選自結合 DR6之抗體（例如結合DR6、競爭性抑制由分別以ATCC寄存編號PTA-8095、PTA-8094或PTA-8096寄存之融合瘤細胞株產生的3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7單株抗體的結合之抗 127689.doc -45- 200844113 體 )，包3 SEQ ID NO: 1之胺基酸1 354的可溶性dr6多狀（例如 DR6免疫黏附素）或結合App之抗體（例如單株抗體 22C11)。在本發明之某些實施例中，㈣拮抗劑為結合刪之抗體、結合APP之抗體或與一或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧I组成之群的非蛋白質性聚合物連接的可溶性DR6多肽。在此等方法之可選實施例中，DR6多肽表現於—或多種哺乳動物細胞（例如連合神經元細胞、感覺神經元細胞或運動神經元細胞）之細胞表面上，且該_或多種咖拮抗劑之結合抑制DR6活化或信號轉導。在本發明之—此實施例中，活體外進行該方法以抑制一或多種表現㈣的哺乳動物細胞之細胞洞亡以便在組織培養物中增強神經元細胞之生長及/或再生及/或存活。舉例而言，該⑽拮抗劑適用作組織培養基之活體外添加劑，例如彼等經設計以使神經元細胞培養物增殖者。詳言之’如在此項技術中所已知= 因於該等細胞經歷細胞壯之趨勢，某些神經元細胞培養物之增殖可成問題。一些神經元培養物在（例如）缺乏諸^ > 經生長因子之外源因子之情況下死亡。本文中提供之二内容展示刪拮抗劑可用於該等神經元細㈣養物^ 如）近乎於在该荨培養物中使用神經仅U子之方式增細胞生長及/或再生及/或存活。难在本發明之其他實施例中，可在患有神經病狀或病；哺乳動物中活體内進行抑制DR6與APP結人夕 ( 、、 °。之方法。視十主況，該神經病狀或病症為肌萎縮性側索硬化、八* η 怕孟森氏病、 127689.doc -46- 200844113 I爾頓氏症或阿兹海默氏症。或者，該神經病狀或病症包 s由於中風、大細或脊髓組織外傷，或神經元組織病變導致之神經元細胞或組織損傷。本發明之其他實施例提供治療患有神經病狀或病症之哺乳動物之方法，其包含向該哺乳動物投與有效量之一或多種娜拮抗齊卜通常，纟該等方法中，f亥一或多種㈣抬抗劑係選自結合DR6之抗體、包含SEQ m N〇·· 胺基酸 1-354的可溶性DR6多肽及結合App之抗體。在本發明之可 f 選實施例中，神經病狀或病症為肌萎縮性側索硬化、帕金森氏病、亨爾頓氏症或阿茲海默氏症。或者，該神經病狀或病症包含由於中風、大腦或脊髓組織外傷，或神經元組織病變導致之神經元細胞或組織損傷。在本發明之各種實施例中，將-或多種其他治療劑投與該哺乳動物。在本發明之某些說明性實施例中，該一或多種其他治療劑係選自 NGF、細胞凋亡抑制劑、⑽叹抑制劑、卜分泌酶抑制劑、丫_ f 分泌酶抑制劑、膽鹼酯酶抑制劑、抗-Αβ抗體&NMDA受體 ^ 拮抗劑。視情況，經由注射、輸液或灌注將該一或多種DR6 拮抗劑及/或其他治療劑投與哺乳動物。本發明之其他實施例提供鑑別所關注之抑制DR6與結合的分子之方法，該方法包含：在所關注之分子存在或不存在之情況下組合OR6與APP ;且隨後在該所關注之分子存在下债測對DR6與APP結合之抑制。本發明之相關實施例提供測定組合物是否調節包含SEQ ID N〇: i之胺基酸 l-65 5(且視情況SEQIDNO··l之胺基酸卜354)的DR6多肽與 127689.doc •47 _ 200844113 包含SEQ ID NO: 6之胺基酸66-81的APP多肽（例如APP695、 sAPPa或sAPPp)之間的結合之方法，該方法包含組合該組合物與DR6及APP ;且隨後比較在組合物存在下DR6與APP 之間的結合與組合物不存在之情況下DR6與APP之間的結合；以便測定組合物是否調節DR6與APP之間的結合。視情況，經由表面電漿共振（SPR)技術（如由Biacore Life Sciences獲得）量測該等方法中之結合差異。本發明之實施例進一步包括根據此等方法鑑別之所關注之分子。本發明之其他實施例包括診斷患有神經疾病或易患神經疾病的患者之方法，.其包含自患者獲得樣本且測試樣本中具有與SEQ ID NO: 1之DR6多肽序列不同的多肽序列之 DR6多肽變體的存在。視情況，該等方法進一步包含鑑別該多肽變體為對APP多肽具有與觀察到之對SEQ ID NO : 1 之DR6多肽序列的親和力不同之親和力。本發明之相關實施例包括測定包含SEQ ID NO·· 1之胺基酸1-65 5的DR6之多肽變體是否存在於哺乳動物中之方法，該方法包含比較哺乳動物中所表現之DR6多肽之序列與SEQ ID NO: 1以便測定DR6之多肽變體是否存在於哺乳動物中。此等方法之某些實施例可包括鑑別經觀察作為APP結合變體存在於哺乳動物中之多肽變體之其他步驟，其中APP結合變體之特徵在於對包含SEQ ID NO: 6之胺基酸66-81的類殿粉前驅蛋白 (APP)多肽（例如APP695、sAPPa或ΞΑΡΡβ)具有不同於包含 SEQ ID NO: 1之DR6多肽對包含SEQ ID NO·· 6之胺基酸 66-8 1的APP多肽之結合親和力的結合親和力。視情況，經 127689.doc -48- 200844113 由表面電漿共振（SPR)技術（如由—⑽e Life Scien⑽獲得量測該等方法中之結合親和力差異。此等方法之―些實^) 例可包括選擇個別患者之步驟’如具有在肌萎縮性側索硬巾王林氏病、了爾頓氏症或阿茲海默氏症中觀察到之症狀或病狀的患者。

除本文中所描述之全長原生序列DR6及App多狀外，預期可衣備DR6及/或App多肽變體。可藉由將適當核皆酸變化引入:編碼DNA及/或藉由合成所需多肽來製備娜及/或 APP ’交體。熟習此項技術者應瞭解胺基酸變化可改變DR6 及/或APP多肽之轉譯後加工，諸如改變糖基化部位之數目或位置或改變膜錨定特徵。可（例如）使用闡述於（例如）美國專利第5,364,934號中之保守及非保守突變之任何技術及指導原則進行本文中所描述之DR6及/或APP多肽之變異。變異可為編碼與原生序列多肽相比產生胺基酸序列變化的多肽之一或多個密碼子之取代、缺失或插入。視情況，藉由在DR6&/或app多肽之一或多個域中以任何其他胺基酸取代至少一個胺基酸進行、交異。可藉由比較DR6多肽之序列與同源已知蛋白質分子之序列且最小化高同源性之區域中所進行之胺基酸序列變化的數目’發現可插入、取代或缺失何種胺基酸殘基而不對所需活性產生不利影響之指南。胺基酸取代可為以另一具有相似結構及/或化學特性之胺基酸置換一個胺基酸之結果’諸如以絲胺酸置換白胺酸，亦即保守胺基酸置換。插入或缺失可視情況在約1至5個胺基酸之範圍内。可藉由 127689.doc -49- 200844113 在序列中系統地進行胺基酸之插入、缺失或取代且測試戶得變體之DR6及/或APP拮抗活性測定所允許之變異。$斤本文中提供DR6及/或APP多肽片段。當與全長天然蛋質相比時，該等片段可在>^末端或c末端經截短，或（例如白) 可缺乏内部殘基。某些片段缺乏對DR6多肽之所需生物活性不必需的胺基酸殘基。〆可藉由許多習知技術中之任一種製備職及/或術多狀

片奴。可化學合成所需肽片&。替代方法包括藉由酶促消產生夕肽片奴，例如藉由以已知在由特定胺基酸殘基界定=部位裂解蛋白質之酶處理蛋白質，或藉由以適當限制酶消化DNA且分離所需片段。另—適當技術包括藉由聚合酶鏈反應(PCR)分離且擴增編碼所需多肽片段之d财片段。在PCR中對於5’及3,引子採用界定舰片段之所需末端之券核苦酸。在特定實施例中，所關注之保守性取代展示於下表中較 < 題°若_等取代導致生物活性變化，則引入更κ貝艾化（在表中命名為"例示性取代I，，或如下所述關於胺基酸類型進一步描述)且薛選該等產物。原始殘基 Ala(A) Arg(R) Asn(N) Asp(D) 較佳取代 val lys gin glu 例示性取代 val、leu、ile 如、gin 、 asn gin、his、iys、arg glu 127689.doc •50- 200844113

Cys(C) ser ser Gln(Q) asn asn Glu(E) asp asp Gly(G) pro、 ala ala His(H) asn ^ gin、lys、arg arg lie⑴ leu ^ val、met、ala、phe、正白胺酸 leu Leu(L) 正白胺酸、ile、val、 met、 ala、phe ile Lys(K) arg、 gin 、 asn arg Met(M) leu、 phe、ile leu Phe(F) leu、 val、ile、ala、tyr leu Pro(P) ala ala Ser(S) thr thr Thr(T) ser ser Trp(W) tyr、 phe tyr Tyr(Y) trp、 phe 、 thr 、 ser phe Val(V) ile、 leu、met、phe、 ala、正白胺酸 leu DR6及/或APP多肽之功能或免疫學特性之實質修飾係藉由選擇對於保持以下特性具有顯著不同效應之取代來^ 現·（a)取代區域内多肤主絲纟士搂、 1夕肮主鏈之結構，例如呈摺疊片或螺旋構型；⑻料子在躲部位H切水性；或⑷側鍵之體積。基於常見側鏈特性可將天'然存在之殘基分為： 127689.doc -51 - 200844113 (1) 疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile ; (2) 中性親水性：CyS、ser、thr ; (3) 酸性：aSp、giu ; (4) 鹼性：asn、gln、his、lys、arg ; (5) 衫響鏈取向之殘基：gb、pr〇;及 (6) 方力矢· trp、tyr、phe。非保守性取代將需要使該等類別中之一者之成員更換為另類別。亦可將該等取代殘基引入保守性取代部位中，或更佳引入其餘（非保守）部位中。可使用在此項技術中已知之方法，諸如募核苷酸介導（定點）之誘變、丙胺酸掃描及PCR誘變進行變異。可對選殖之 DNA執行疋點誘變[carter等人 ’ Nucl. Acids Res” 13:4331 (1986) ; Zoller等人，Nucl· Acids Res·，10:6487 (1987)]、序列盒誘變[Wells等人，Gene，34:315 (1985)]、限制性選擇誘變[Wells等人，Philos· Trans. R· Soc· London SerA，317:415 (1986)]或其他已知技術以產生dr6多肽變體DNA。亦可採用掃描胺基酸分析以鑑別紕連序列中之一或多個胺基酸。較佳掃描胺基酸為相對較小、中性之胺基酸。該等胺基酸包括丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸及半胱胺酸。在此組中丙胺酸通常為較佳掃描胺基酸，因其消除超出β碳之側鏈且較不可能改變變體之主鏈構型[Cunningham and Wells， Seienee，244:1081-1085 (1989)]。丙胺酸亦通常較佳，因其為最常見之胺基酸。此外，其常見於内埋及曝露位置兩者 [Creighton，The Proteins，(W.H. Freeman & Co,，Ν·Υ·); 127689.doc -52- 200844113

Chothia，J· Mol· Biol·，150:1 (1976)]。若丙胺酸取代未得到足夠量之變體’則可使用電子等排胺基酸。任何不參與維持DR6及/或APP多肽之適當構型之半胱胺酸殘基亦可通常由絲胺酸取代以提高分子之氧化穩定性且防止異常交聯。相反，可將半胱胺酸鍵添加至DR6及/或App 多肽中以提高其穩定性。本文中揭示之本發明實施例適用於多種APP多肽。在本發明之某些實施例中，（例如）APP為圖1B-1D中展示之全長 695、750或770 APP同功異型物。在本發明之其他實施例中，APP包含APP之具有APP胞外域且為由轉譯後加工事件產生者（例如sAPPa或δΑΡΡβ)的N末端部分。視情況，（例如）APP可包含由分泌酶裂解產生之695、750或770 APP同功異型物中之一者的可溶形式，例如由β_分泌酶裂解產生之神經元APP6%之可溶形式。在一特定說明性實施例中，Αρρ 包含ΑΡΡ695之胺基酸20-591(參見例如Jin等人，j. Neurosci.， 14(9): 5461-5470 (1994))。在本發明之另一實施例中，App 包含具有由單株抗體22C11識別之抗原決定基之多肽（例如

如可自 Chemicon International Inc·，Temecula，CA，U S A 獲得）。視情況，APP包含APP6”之殘基66-81，其為含有 22C11抗原決定基之區域（參見例如Hilbrich，J.B.C.第268 卷，第 35號：26571-26577 (1993))。下文之描述主要係關於藉由培養經含有編碼DR6多肽的核酸之載體轉型或轉染之細胞產生DR6及/或APP多肽。其當然涵蓋可採用在此項技術中所熟知之替代性方法來製備 127689.doc -53- 200844113 DR6及/或APP多肽。例如，可藉由使用固相技術之直接肽合成法產生適當胺基酸序列或其部分[參見例如Stewart等人，Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H. Freeman Co.，San Francisco，CA (1969) ; Merrifield，J· Am. Chem. Soc·， 85:2149-2154 (1963)]。可使用人工技術或藉由自動裝置進行活體外蛋白質合成。可（例如）使用Applied Biosystems肽合成儀（Foster City，CA)使用製造商之說明實現自動合成。可獨立地化學合成DR6及/或APP多肽之各種部分且將其使用化學或酶促方法組合來產生所需DR6及/或APP多肽。所述方法及技術可類似地應用於產生DR6及/或APP變體、DR6及/或APP之修飾形式及DR6及/或APP抗體。

分離編碼DR6及/或APP多肽之DNA 編碼DR6及/或APP多肽之DNA可獲自由認為具有DR6及/ 或APP多肽mRNA且以可偵測水準表現其的組織製備之 cDNA庫。因此，人類DR6及/或APP多肽DNA可便利地獲自由人類組織製備之cDNA庫。DR6及/或APP多肽編碼基因亦可獲自染色體組庫或藉由已知合成程序獲得（例如自動核酸合成）。可以經設計以鑑別所關注之基因或其所編碼之蛋白質的探針（諸如至少約20-80個鹼基之寡核苷酸）篩選庫。可使用諸如 Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory

Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中描述之標準程序進行以所選探針篩選cDNA或染色體組庫。分離編碼DR6多肽之基因的替代方法係使用PCR 127689.doc -54- 200844113 方法[上文之 Sambrook 等人；Dieffenbach等人，PCR primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995)] 〇師ig： c D N A庫之技術為此項技術中所熟知。經選擇作為探針之寡核苷酸序列應具有足夠長度及足夠明確性以使假陽性最小化。寡核苷酸較佳經標記以使得雜交至所篩選之庫中的DNA後可偵測。標記之方法為此項技術中所熟知且包括使用如經32P標記之ATP的放射性標記、生物素化或酶標記。包括中度嚴格性及高度嚴格性之雜交條件提供於上文之Sambrook等人中。在該等庫篩選法中鑑別出之序列可與其他已知在諸如 GenBank之公共資料庫或其他私人序列資料庫中寄存且可獲得之序列比較及比對。可使用在此項技術中已知且如本文中所描述之方法確定分子之確定區域内或整個全長序列内之序列一致性（在胺基酸或核苷酸層面）。可藉由篩選所選cDNA或染色體組庫，首次使用本文中揭不之推斷胺基酸序列且必要時使用如上文之Sambrook等人中所述的習知引子延伸程序獲得具有蛋白質編碼序列之核 -文乂 4貞測可犯未逆轉錄為〇〇^八的mRNA之前驅體及加工中間物。宿主細胞之選擇及轉型以本文中關於DR6及/或APP多肽產生所描述之表現或選殖載體轉染或轉型宿主細胞且將其在經改良適於誘導啟動選擇轉型株或擴增編碼所需序列之基因的習知培養基 127689.doc -55· 200844113 中培養。熟習此項技術者可在無不當實驗之情況下選擇諸如培養基、溫度、pH值及其類似因素之培養條件。通常，用以將細胞培養物之生產率最大化的原理、方案及實施技術了見於 Mammalian Cell Biotechnology: a Practical

Appr0ach，M. Butler 編（IRL Press，1991)及上文之以她⑺心等人中。真核細胞轉染及原核細胞轉型之方法為一般技術者所已知，例如CaCh、CaPCU、脂質體介導及電穿孔。視所用宿主細胞而定，使用適合於該等細胞之標準技術進行轉型。對於原核生物通常使用如上文之Sanibro〇k等人中所述採用氣化努之鈣處理或電穿孔。如Shaw等人，Gene， 23:3 15(1983)及 1989 年 6 月 29 日公開之 WO 89/05859 中所述’以根癌土壤桿細似）感染用於某些植物細胞之轉型。對於無該等細胞壁之哺乳動物細胞而言’可採用 Graham 及 van der Eb， Virology， 52:456-457(1978)之磷酸鹽沈澱法。哺乳動物細胞宿主系統轉染之一般態樣已描述於美國專利第4,399,2 16號中。轉型至酵母中通常根據Van Solingen等人，j· Baet·，i3〇:946 (1977)及 Hsiao等人，proc· Natl· Acad· Sci· (USA)，76:3829 (1979)之方法進行。然而，亦可使用諸如藉由核顯微注射、電穿孔、與完整細胞之細菌原生質體融合或聚陽離子（例如水冷是月女、t鳥胺酸）將DN A引入細胞中之其他方法。對於轉型哺乳動物細胞之各種技術，參見Keown等人，Meth〇ds in Enzymology，185:527_537 (199〇)及 Mans〇ur等人，心化代 127689.doc -56- 200844113 3 36:348-352 (1988)。用以選殖或表現本文載體中DNA之適當宿主細胞包括原核生物、酵母或較高等真核生物細胞。適當原核生物包括 (但不限於）真細菌，諸如革蘭氏陰性（Gram_negative)或格蘭氏1¼性（Gram-positive)生物體，例如腸内菌科 (Enterobacteriaceae)，諸如大腸桿菌（五.co/z_)。各種大腸桿菌菌株可公開獲得，諸如大腸桿菌K12菌株MM294 (ATCC 31，446);大腸桿菌X1776 (ATcc 31，537);大腸桿菌菌株 W3110 (ATCC 27,3 25)及 Κ5 772 (ATCC 5 3,63 5)。其他適當原核宿主細胞包括腸内菌科，諸如埃希氏菌屬 (心c/zer/c/z/a) ’例如大腸桿菌；腸桿菌屬（五; 歐文菌屬OEriWm’a);克雷伯氏菌屬（火;變形桿菌屬（Proiew) , /少門氏菌屬（以/⑺…，例如鼠傷寒沙門菌 (心/mone//a以⑼〜以/麵）；沙雷氏菌屬，例如黏質沙雷菌（心7加。maraa㈣;及志賀氏菌屬（別以心^ ;

胞为泌最小量之蛋白質水解酶良以在編碼宿主内源性蛋白質伯王囷株。較佳地，宿主細。例如，菌株W3 110可經改之基因中實現遺傳突變，該 127689.doc -57. 200844113 等宿主之實例包括大腸桿菌W3110菌株1A2，其具有完整基因型纟⑽儿大腸桿菌W3110菌株9E4,其具有完整基因型；^3;大腸桿菌界3110菌株27〇7(八丁(：〇 55,244)，其具有完整 I 西型 tonA Ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT ；大腸桿菌W3110菌株37D6，其具有完整基因型 ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr •，尺肪#囟W3 110菌株4〇B4，其為具有非卡那黴素 (non-kanamycin)抗性缺失突變之菌株37d6 ;及揭示於 1990年8月7曰頒予之美國專利第4,946,783號中具有突變型周質蛋白酶之大腸桿菌菌株。或者，例如PCR或其他核酸聚合酶反應的活體外選殖方法為適當的。除原核生物之外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為 DR6多肽編碼載體的適當選殖或表現宿主。釀酒酵母 cerevbke)為通常使用之較低等真核宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母（心所Z^)(Beach及 Nurse，Nature，290: 140 [1981]; 1985 年 5 月2曰公開之EP 139,383);刻魯維酵母（尺⑽％㈣宿主 (美國專利弟 4,943,529 j虎，Fleer等人，Bio/Technology， 9:968-975 (1991))，諸如乳酸刻魯維酵母（尼沿） (MW98-8C、CBS683、CBS4574 ; Louvencourt 等人，J· Bacterio丨·，15 4(2):73 7-742 [1983])、脆壁刻魯維酵母（尺· fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞刻魯維酵母（尤 bulgaricus)(ATCC 16,045)、魏氏刻魯維酵母（尺 w/chram")(ATCC 24，178)、（[ wa"“）（ATCC 56,500)、果 -58- 127689.doc 200844113 繩刻魯維酵母（见（^(^op/H7arwm)(ATCC 36,906 ; Van den Berg等人，Bio/Tech no logy，8:135 (1990))、耐熱刻魯維酵母（【及馬克斯刻魯維酵母（见 ;耶氏酵母（j/arr<9>Wa)(EP 402,226);巴斯德畢赤酵母（P/c/z/a /7(^i<9r/s)(EP 183,070 ; Sreekrishna 等人，J· Basic Microbiol·， 28:265-278 [1988]);念珠菌屬 {Candida) \ ^ ^ ^^(Trichoderma reesia)(EP 244,234) ； 4¾ 链脈抱菌cra*^a)(Case等人，Proc· Natl· Acad· Sci. USA， 76:5259-5263 [1979])；許旺酵母 (Schwanniomyces)，諸如西方許旺酵母 %以心^2仏/以）（1990年10月31日公開之£? 3 94,53 8);及絲狀真菌，諸如鏈抱黴屬、青黴屬、彎頸黴菌（Tb/^ypoc/a心wm)(1991年1月10曰公開之WO 91/00357)及麯黴屬宿主，諸如構巢麯黴（儿 mWa/75)(Ballance等人，Biochem· Biophys. Res. Commun·， 112:284-289 [1983] ; Tilburn 等人，Gene，26:205-221 [1983] ; Yelton等人，Proc· Natl· Acad· Sci. USA，81: 1470-1474 [1984])及黑麯黴Wgw)(Kelly 及 Hynes, EMBO J·，4:475-479 [1985])。甲醇酵母在本文中為適當的且包括（但不限於）能夠在甲醇上生長之酵母，其係選自由漢森酵母（//β似、念珠菌、克勒克酵母（尤/c^cA^ra)、畢赤酵母（i^c/ζ/α)、酵母、球擬酵母 (Tbrw/ops/s)及紅酵母組成之屬。例示此類酵母之特定物種之清單可見於C. Anthony，The Biochemistry 127689.doc -59- 200844113 of Methylotrophs，269 (1982)中。用以表現糖基化DR6及/或APP多肽之適當宿主細胞係來源於多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括昆蟲細胞，諸如果繩S 2及夜蛾S f 9，以及植物細胞，諸如棉花、玉米、馬鈐薯、大豆、矮牽牛、養茄及煙草之細胞培養物。已鑑別出許多桿狀病毒株及變體及諸如草地黏蟲 /rwg/perda)(毛蟲）、埃及伊蚊（dedes aegxp")(蚊子）、白紋伊蚊（Jedw (蚊子）、黑腹果錄 (Ζ)Γ〇5·(9；7/2//α me/awogwier)(果蠅）及家蠢mor/)之宿主之相應許可昆蟲宿主細胞。多種用於轉染之病毒株可公開獲得，例如苜蓿銀紋夜蛾（d wiograp/za ca/(/brw/ca)NPV之 L-1變體及家蠶NPV之Bm-5病毒株，且根據本發明該等病毒在本文中可用作尤其用以轉染草地黏蟲細胞之病毒。然而，最關注脊椎動物細胞，且培養物（組織培養物）中脊椎動物細胞之增殖已成為常規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40轉型之猴腎CV1細胞株（COS-7、 ATCC CRL 1651);人類胚腎細胞株（293或經次選殖以在懸浮培養物中生長之293細胞，Graham等人，J. Gen Virol. 3 6:59 (1977));幼倉鼠腎臟細胞（ΒΗΚ，ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細胞 /-DHFR(CHO，Urlaub 等人，Proe·Natl· Acad. Sci· USA 77:4216 (1980));小鼠足細胞（TM4, Mather， Biol· Reprod· 23:243-251 (1980));猴腎細胞（CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞（VERO-76，ATCC CRL-1587); 人類宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2);犬腎細胞（MDCK， 127689.doc -60- 200844113

ATCC CCL 34);布法羅（buffalo)大鼠肝細胞（BRL 3 A，ATCC CRL 1442);人類肺細胞（W138，ATCC CCL 75);人類肝細胞（Hep G2，HB 8065);小鼠乳房腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL5 1) ; TRI 細胞（Mather 等人，Annals Ν·Υ· Acad. Sci. 383:44-68 (1982)) ; MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝癌細胞株（Hep G2)。以上述關於DR6及/或APP多肽產生之表現或選殖載體轉型佰主細胞且將其在經改良以適於誘導啟動子、選擇轉型株或擴增編碼所需序列之基因的習知培養基中培養。可複製載體之選擇及使用可將編碼DR6及/或APP多肽之核酸（例如cDNA或染色體組DNA)插入用以選殖（擴增DNA)或表現之可複製載體中。可公開獲得各種載體。載體可（例如）呈質體、黏質體、病毒顆粒或噬菌體之形式。可藉由多種程序將適當核酸序列插入載體中。通常 ’使用在此項技術中已知之技術將DNA插

现序列可為載體之組份或其可為插邛位之多肽。通常，信入載體中的DR6及/或 127689.doc -61 - 200844113 APP多>肽編碼腿之一部分。信號序列可為選自（例如嫌性磷酸酶、青黴素酶、lpp或熱穩定型腸毒素π前導序列之群組的原核信號序歹，卜對於酵母分泌、，信號序列可為（例如）酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列（包括酵母及刻魯維酵母α-因子前導序列，後者描述於美國專利第5，嶋，^號中）或酸性磷酸醋酶前導序列，白色念珠菌（c 糖澱粉酶前導序列（1 990年4月4日公開之Ep 362,丨79)或描述於1990年i i月15日公開之w〇 9紹3646中的信號。在哺^ 動物細胞表現中，哺乳動物信號序列可用以指導蛋白質之分泌，諸如來自相同或相關物種之分泌多肽以及病毒=泌前導序列之信號序列。表現與選殖載體均含有使得載體能夠在一或多種所選宿主細胞中複製之核酸序列。熟知多種細菌、酵母及病毒之該等序列。質體PBR322之複製起點適合於多數革蘭氏=性細菌，2μ質體起點適合於酵母且各種病毒起點（8¥4〇、多形瘤、腺病毒、VSV或BPV)適用於哺乳動物細胞中之選殖載體。表現及選殖載體通常含有亦稱為可選擇性標記之選擇基因。典型遠擇基因編碼⑷賦予對例如胺苄青黴素 (ampidllm)、新黴素（neomycin)、甲胺嗓吟（細⑽⑽叫或四環素（tetracydine)之抗生素或其他毒素之抗性；（μ補足營養缺陷型缺陷；或（c)供應自複合培養基不可獲得之關鍵營養素（例如編碼芽胞桿菌之1)•丙胺酸消旋酶之基因）的蛋白質。 127689.doc -62 - 200844113 哺乳動物細胞之適當可選擇性標記之實例為使得能夠鑑別勝任吸收DR6及/或APP多肽編碼核酸之細胞者，諸如 DHFR或胸苷激酶。當採用野生型〇11?^時，適當宿主細胞為缺乏DHFR活性之CH0細胞株，其如Urlaub等人，pr〇c.

Nat丨· Acad· Sei· USA，77:4216 (198〇)所述製備且增殖。適用於酵母之適當選擇基因為存在於酵母質體¥汉1)7中之trpi 基因[Stinchcomb等人，Nature，282:39 (1979); Kingsman 等人，Gene，7:141 (1979) ; Tschemper等人，Gene，10:157 (1980)]。trpl基因為缺乏在色胺酸中生長之能力的酵母之突變株（例如ATCC第44076或PEP4]號）提供選擇標記 [Jones，Genetics，85:12 (1977)]。表現及選殖載體通常含有與DR6及/或APP多肽編碼核酸序列操作性連接之啟動子以指導mRNA合成。熟知由多種潛在宿主細胞識別之啟動子。適用於原核宿主之啟動子包括 β-内醯胺酶及乳糖啟動子系統[Chang等人，Nature，275:615 (1978) ; Goeddel等人，Nature，281:544 (1979)]、鹼性磷酸酶、色胺酸（trp)啟動子系統[Goeddel，Nucleic Acids Res.， 8:4057 (1980) ; EP 36,776]及雜交啟動子，諸如tac啟動子 [deBoer 等人，Proc· Natl· Acad· Sci· USA，80:21-25 (1983)]。適用於細菌系統之啟動子亦含有與編碼DR6及/或 APP多肽之DNA操作性連接的Shine-Dalgarno (S.D.)序列。用於酵母宿主的適當啟動序列之實例包括3 -磷酸甘油酸激酶[Hitzeman 等人，J· Biol· Chem·，255:2073 (1980)]或其他糖解酶[Hess等人，J· Adv· Enzyme Reg·，7:149 (1968); 127689.doc -63 - 200844113

Holland，Biochemistry，17··4900 (1978)]之啟動子，該等其他糖解酶諸如烯醇化酶、甘油醛磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、葡糖磷酸異構酶、3_磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡糖異構及葡糖激酶。其他為具有由生長條件控制之另一轉錄優勢之誘導型啟動子的酵母啟動子為醇脫氫酶2、異細胞色素c、酸性磷酸

\ 酯酶、與氮代謝相關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛_3_磷酸脫氫酶及負責麥芽糖及半乳糖利用之酶之啟動子區。適用於酵母表現之適當載體及啟動子進一步描述於Ep 73,657 中。 DR6及/或APP多肽在哺乳動物宿主細胞巾自載體之轉錄受（例如）獲自以下各物之啟動子控制··諸如多形瘤病毒、禽癌病毒（1989年7月5日公開之侃2,211，5〇4)、腺病毒（諸如腺病毋2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病4、細胞巨大病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒4G(SV4G)之病毒的染色體組’例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子之異源哺乳動物啟動子’及熱休克啟動子，其限難件為該等啟動子與宿主細胞系統相容。 ' 或夕肽之DNA經較高等真核生物之轉錄 :藉由將強化子序列插入載體中而得以增加。強化子為通常約至300 bp之DNA之順式作用元件，其作用於啟動子以增加其轉錄。現自哺乳動物基因（珠蛋白、彈性蛋白酶白蛋白、甲胎蛋白⑷Pha·〜rGtein)及胰島素）已知許 127689.doc -64- 200844113 化子序列。然而’通#使用來自真核細胞病毒之強化子。實例包括複製起點之晚期侧上的SV4〇強化子（bp 100-270)、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、複製起點之晚期側上的多形瘤強化子及腺病毒強化子。強化子可剪接入載體中DR6及/或APP多肽編碼序列之5,或3,位置，但較佳位於啟動子5，端之部位。用於真核宿主細胞（酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或來自其他多細胞生物體之有核細胞）之表現載體亦含有終止轉錄且使mRNA穩定所必需的序列。該等序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA之5’且有時3,非轉譯區獲得。此等區域含有轉錄為編碼DR6多肽之mRNA的非轉譯部分中之多聚腺嘌呤化片段之核苷酸片段。其他適於配合DR6及/或APP多肽在重組脊椎動物細胞培養物中合成的方法、載體及宿主細胞描述於Gething等人，

Nature，293:620-625 (1981) ; Mantei 等人，Nature， 281:40-46 (1979) ; EP 117,060 ;及 EP 1 17,058 中。培養宿主細胞可在多種培養基中培養用以產生本發明之DR6及/或APP 多月太的宿主細胞。諸如漢姆F10 (Ham’s F10)(Sigma)、最低必需培養基（MEM)(Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)及杜貝卡改良伊格爾培養基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (DMEM)(Sigma)之市售培養基適合於培養宿主細胞。此外 Ham 等人，Meth. Enz. 58:44 (1979) ; Barnes 等人，Anal· Biochem.l02:255 (1980);美國專利第 4,767,704 號；第 127689.doc -65- 200844113 4,657,8 66號；第 4,927,762號；第 4,560,655號；或第 5，122,469 號；WO 90/03 43 0 ; WO 8 7/00195 ;或美國專利參考案 30,985 中所述之培養基中的任一者可用作宿主細胞之培養基。必要時，任何該等培養基可補充有激素及/或其他生長因子（諸如胰島素、運鐵蛋白或上皮生長因子）、鹽（諸如氣化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽）、緩衝劑（諸如HEPES)、核苷酸（諸如腺苷及胸苷）、抗生素（諸如GENTAMYCIN™藥物）、微量元素（定義為通常以微莫耳範圍内之最終濃度存在之無機化合物）及葡萄糖或等效能量來源。亦可以熟習此項技術者已知之適當濃度包括任何其他必要補充物。諸如溫度、pH值等之培養條件為彼等先前用於經選擇用於表現之宿主細胞的培養條件，且對一般技術者而言將顯而易見。偵測基因擴增/表現可在樣本中直接藉由（例如）將mRNA之轉錄量化之習知南方印跡法（Southern blotting)、北方印跡法（Northern blotting)[Thomas? Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5 205 (1980)]、點印跡法（dot blotting)(DNA分析）或原位雜交，使用經適當標記之探針基於本文中提供之序列量測基因擴增及/或表現。或者，可採用可識別包括DNA雙鏈體、 RNA雙鏈體及DNA-RNA雜交雙鏈體或DNA-蛋白質雙鏈體之特定雙鏈體之抗體。抗體接著可經標記且可進行檢定，其中使雙鏈體結合至表面，以便雙鏈體在表面上形成後，可偵測結合至雙鏈體之抗體的存在。或者，可藉由諸如細胞或組織切片之免疫組織化學染色 127689.doc -66- 200844113 及細胞培養物或體液之檢定的免疫學方法量測基因表現以將基因產物之表現直接量化。適用於免疫組織化學染色及/ 或樣本流體檢定之抗體可為單株或多株抗體，且可在任何哺乳動物中製備。便利地，可製備針對原生序列多狀或針對基於本文中提供之DR6序列的合成肽或針對融合至 DR6 DNA且編碼特異性抗體抗原決定基之外源序列的抗 DR6多肽之純化可自培養基或自宿主細胞溶解產物回收DR6及/或App多肽之形式。若與膜結合，則可使用適當清潔劑溶液（例如曲通-X 100 (Triton-x 100))或藉由酶促裂解使其自膜釋放。可藉由各種物理或化學方法破壞DR6多肽表現中所使用之細胞，該等方法諸如凍融循環、超音波處理、機械破壞或細胞溶解劑。可需要自重組細胞蛋白質或多肽純化DR6及/或APP多肽。以下程序例示適當純化程序：經離子交換柱分級分離；乙醇沈;殿’逆相HPLC，經^一氧化石夕或諸如DEAE之陽離子父換樹脂層析，層析聚焦，SDS-PAGE ;硫酸錄沈殿；使用 (例如）Sephadex G-75之凝膠過濾；蛋白質a瓊脂糖管柱移除諸如IgG之污染物；及結合DR6及/或APP多肽之抗原決定基標記形式之金屬螯合管柱。可採用蛋白質純化之各種方法且該等方法為在此項技術中所已知且描述於例如 Deutscher，Methods in Enzymology, 182 (1990) ; Scopes， Protein Purification: Principles and Practice， 127689.doc -67- 200844113

Springer-Verlag，New York (1 982)中。所選純化步驟將視（例如）所用製備過程及所產生之特定DR6多肽之性質而定。可採用DR6及/或APP之可溶形式作為本發明方法中之 DR6拮抗劑。DR6及/或APP之該等可溶形式可包含如下所述之修飾（諸如融合至免疫球蛋白、抗原決定基標籤或白胺酸拉鏈）。進一步預期免疫黏附素分子用於本文之方法中。DR6 及7或APP免疫黏附素可包含各種形式之DR6及/或APP，諸如DR6及/或APP之全長多肽以及可溶性胞外域形式或其片段。在特定實施例中，分子可包含DR6多肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白之特定區域的融合體。對於免疫黏附素之二 4貝形式，该融合體可融合至IgG分子之Fc區。Ig融合體較佳包括多肽之可溶（跨膜域經缺失或失活）形式之取代，來替代 Ig分子中之至少一個可變區。在一尤其較佳實施例中，免疫球蛋白融合體包括IgGi分子之鉸鏈、CH2及(ΙΉ3，或鉸鏈、CHI、CH2及CH3區。對於產生免疫球蛋白融合體之產生，亦芩見1995年6月27日頒予之美國專利第5,428，i3〇號及 Chamow等人，TIBTECH，14:52-6〇 (1996)。可遥免疫黏附素設計組合黏附素（例如DR6及/或App胞外域）之結合域與免疫球蛋白重鏈之以區。通常，當製備本發明之免疫黏附素時，編碼黏附素之結合域的核酸將c_末端融合至編碼免疫球蛋白恆定域序列之冰末端的核酸，然而亦可能N末端融合。通常，在該等融合體中，所編碼嵌合多肽將保留免疫球蛋白重鏈之恆定區的至少功能上有效之鉸鏈、Ch2及Ch3 127689.doc -68 - 200844113 域。亦對恆定域之Fc部分的C_末端或緊接重鏈之(：^1的：^末端或輕鏈之相應區域進行融合。進行融合之精確部位並不關鍵；熟知特定部位且其可經選擇以優化免疫黏附素之生物活性、分泌或結合特徵。在一較佳實施例中，將黏附素序列融合至免疫球蛋白 Gi(IgGi)之Fc區的N末端。可能將整個重鏈恆定區融合至黏附素序列。然而，更佳地，在鉸鏈區中僅在化學上界定IgG Fc之木瓜蛋白酶裂解部位（亦即殘基2丨6，令重鏈恆定區之第一個殘基為114)之上游或其他免疫球蛋白之類似部位開始的序列用於融合。在一尤其較佳實施例中，將黏附素胺基酸序列融合至IgG重鏈之（a)鉸鏈區及Ch2及cH3 ;或（b) CH1、鉸鏈、cH2及CH3域。對於雙特異性免疫黏附素，免疫黏附素經裝配成多聚體且尤其裝配成雜二聚體或雜四聚體。通常，此等所裝配之免疫球蛋白將具有已知單元結構。基本4鏈結構單元係呈其中存在IgG、IgD及IgE之形式。在較高分子量免疫球蛋白中 4鏈單元重複；lgM通常以藉由雙硫鍵保持在一起之4個基本單元的五聚體形式存在。IgA球蛋白及有時IgG球蛋白亦可在血清中以多聚形式存在。在多聚體之情況下，4個單元中之每一者可相同或不同。在本文之範疇内將各種例示性經裝配免疫黏附素示意性圖示如下： (a) ACl-ACl ; (b) ACH-(ACH、ACL-ACH、ACL-VHCH 或 VLCL-ACH); 127689.doc -69- 200844113 (c) ACl-ACh-(ACl-ACh 、ACl-VhCh 、VLCL_ACH 或 VlCl-VhCh) » (d) ACL-VHCH-(ACH 或 ACL-VHCH 或 vlcl-ach); (e) VLCL-ACH-(ACL-VHCH 或 VLCL-ACH);及 (f) (A-Y)n-(VLCL-VHCH)2 ; 其中各A表示相同或不同黏附素胺基酸序列； V L為免疫球蛋白輕鏈可變域； VH為免疫球蛋白重鏈可變域； f

CL為免疫球蛋白輕鏈恆定域； CH為免疫球蛋白重鏈恆定域； η為大於1之整數； Υ表示共價交聯劑之殘基。為簡短起見，上述結構僅展示關鍵特徵；其並不指示聯接(々:)或免疫球蛋白之其他域，亦未展示雙硫鍵。然而，若該等域為結合活性所需，則其經構築以存在於其在免疫球蛋白分子中佔據之常見位置。或者，可將黏附素序列插於免疫球蛋白重鏈與輕鍵序列之間，以使得獲得包含嵌合重鏈之免疫球蛋白。在此實施例中’將黏附素序列融合至免疫球蛋白之各臂中的免疫球蛋白重鏈之3,端，或融合在鉸鍵與Ch2域之間，或融合在Q 與⑸域之間。Η〇〇__等人，Μ〇Ι· Immunol.， 28.1027 1037 (1991)已報導類似構築體。

儘管在本發明之資疬斑 I Μ黏附素中並不要求存在免疫球蛋白疫球蛋白輕鏈可存在與黏附素·免疫球蛋白重鏈 I27689.doc -70- 200844113 融合多肽共價結合或直接融合至黏附素。在前者情況下，編碼免疫球蛋自輕鏈之魏料與.轉附素免疫球蛋白重鏈融合蛋白之DNA_起共表現。分泌後，雜交重鍵及輕鏈將共價結合以提供包含由雙硫鍵鍵聯之免疫球蛋白重鏈·輕鏈對的免疫球蛋白樣結構。適於製備該等結構之方法揭不於例如1989年3月28日頒予之美國專利第4,816,567號中。藉由將編碼黏附素部分之cDNA序列同框融合至免疫球蛋白cDNA序列來最便利地構築免疫黏附素。然而，亦可使用與染色體組免疫球蛋白片段之融合體（參見例如 bff〇等人，Ceu，61:1303_1313(199〇);及…咖心… 等人，Cell，66:1 133-1 144 (1991))。後者類型之融合體要求存在用於表現之Ig調節序列。可基於來自來源於脾臟或外周血淋巴細胞之cDNA庫之公開序列藉㈣交或藉由聚合酶鏈反應（PCR)技術分離編碼IgG重鏈恆定區之 cDNA。將編碼免疫黏附素之”黏附素，，及免疫球蛋白部分的

cDNA串聯插入指導在所選宿主細胞中有效表現之質體載體中。在另一實施例中，可藉由以美國專利第4,64〇,835號；第 4,496,689號；第 4,301，144號；第 4,670,417號；第 4,791，192 號或第4,179,337號中闡述之方式將受體多肽連接至例如聚乙一醇（PEG)、聚丙二醇或聚環氧烷之多種非蛋白質性聚合物中中之一種或諸如聚麩胺酸酯之其他類似分子來共價修飾DR6拮抗劑。可使用在此項技術中已知之技術製備該等聚乙二醇化形式。 127689.doc -71 - 200844113 、本矣月亦涵盍此等分子之白胺酸拉鏈形式。，，白胺酸拉鏈，’ 為在此項技術中用以指增強、促進或驅動融合搭配物（例如白胺酸拉鏈所融合或連接之序列或分子）二聚化或三聚化之白胺酸富集序列之術語。各種白胺酸拉鏈多肽已描述於此項技術中。苓見例如Landschulz等人，Science，24〇:i759 (1988);美國專利 5,716,8〇5 ; w〇 94/1〇3〇8 ; Η〇ργ 等人， FEBS Letters，344:1991 (1994) ; Maniatis等人，Nature， 341:24 (1989)。熟習此項技術者應瞭解白胺酸拉鏈序列可融合於DR6分子之5,或3,端。亦可以形成嵌合分子之方式，藉由將多肽融合至另一異源多狀或胺基酸序列修飾本發明之DR6&/或app多肽。較佳地’該等異源多肽或胺基酸序列為起作用以使嵌合分子寡聚者。在一實施例中，該嵌合分子包含〇116及/或App多月太與提供抗標籤抗體可選擇性結合之抗原決定基的標籤多狀之融合體。通常將抗原決定基標籤置於多肽之胺基末端或叛基末端。可使用針對標籤多肽之抗體偵測多肽之該等抗原決定基標記形式之存在。又，抗原決定基標籤之提供使得多肽能夠易於藉由親和純化法使用抗標籤抗體或另一類型之與抗原決定基標籤結合的親和力基質純化。各種標籤多肽及其各別抗體為此項技術中所熟知。實例包括聚組胺酸（聚his)或聚組胺酸_甘胺酸（聚-his-giy)標籤；flu ha標籤多肽及其抗體12CA5 [Field等人，Mol· Ce丨1· Biol·， 8:2159-2165 (1988)] ; c-niyc標籤及其 8F9、3C7、6E10、G4、 B7及 9E10抗體[Ενan等人，]yjolecular and Cellular Biology， 127689.doc -72- 200844113 5:3610_3616 (1985)];及疱疹單純型病毒醣蛋白D(gD)標籤及其抗體[Paborsky 等人，Protein Engineering， 3(6):547_553 (1990)]。其他標藏多肽包括Flag-肽[Hopp等人，BioTechnology，6:1204-1210 (1988)] ; KT3抗原決定基肽[Martin等人，Science，255:192-194 (1992)] ; α-微管蛋白抗原決疋基狀[Skinner等人’ J· Biol. Chem·， 266:15163-15166 (1991)];及T7基因10蛋白質肽標籤 [Lutz-Freyermuth 等人，Proc· Natl· Acad· Sci· USA，

87:6393-6397 (1990)] 〇抗DR6及抗APP抗體在本發明之其他實施例中，提供Dr6及/或app抗體。例不性抗體包括多株、單株、人類化、雙特異性及雜接合抗體。此等抗-DR6及/或APP抗體較佳為！)^^拮抗劑抗體。多株抗體本發明之抗體可包含多株抗體。製備多株抗體之方法為熟習此項技術者所已知。可在哺乳動物中藉由(例如)一或多射免疫劑及（必要時）佐劑激發多株抗體。通常，將藉由夕皮下或腹膜内注射將免疫劑及/或佐劑注射至哺乳動物中。免疫射包括DR6及/或A心肽（例如刪及/或App 動物融。蛋白。使免疫劑接合至已知在經免疫之哺乳 ==免疫原性的蛋白質可為適用的。該等免疫原性 :白二之實例包括(但不限於)匙孔螺血氛蛋白、血清白蛋佐劑之：：：：球蛋白及大豆胰蛋白酶抑制劑。可採用之貝i傳氏完全佐劑（Freund,s complete叫 127689.doc -73- 200844113 及MPL-TDM佐劑（單填酿基脂質A、合成海藻糖二棒狀桿菌酸鹽（trehalose dicorynomycolate))。熟習此項技術者可在無過度實驗之情況下選擇免疫方案。可隨後將哺乳動物放血，且檢定血清之DR6及/或APP抗體力價。若需要，則可對哺乳動物加以強化直至抗體力價增加或趨於平穩。單株抗體或者，本發明之抗體可為單株抗體。可使用諸如Kohler 及Milstein，Nature，256:495 (1975)描述之融合瘤方法製備單株抗體。在融合瘤方法中，通常以免疫劑將小鼠、倉鼠或其他適當宿主動物免疫以得到產生或能夠產生與免疫劑特異性結合的抗體之淋巴細胞。或者，淋巴細胞可經活體外免疫。

免疫劑通吊包括DR6及/或APP多肽（例如DR6及/或APP ECD)或其融合蛋白，諸如DR6 ECD_IgG及/或App sApp_IgG 融合蛋白。通常，若需要人類來源之細胞，則使用外周血淋巴細胞 (PBL ),或若需要非人類哺乳動物來源，則使用脾臟細胞或淋巴結細胞。接著使用諸如聚乙二醇之適當融合劑使淋巴細胞與永生化細胞株融合以形成融合瘤細胞[G〇ding， Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Aeademic Press，（1986)第59_1〇3頁]。永生化細胞株通常為、、二轉型之哺乳動物細胞，尤其齧齒動物、牛及人類來源之月知瘤細胞。通常採用大鼠或小鼠骨體瘤細胞株。可在較仏含有一或多種抑制未融合永生化細胞之生長或存活的物 127689.doc -74- 200844113 質之適當培養基中培養融合瘤細胞。舉例而言，若親本細胞缺乏酶次黃嗓吟鳥嗓呤磷酸核糖轉移酶（HGpRT或 HP RT) ’則W合瘤之培養基通常將包括次黃0票呤、胺基蝶呤及胸苷ΓΗΑΤ培養基”），該等物質阻止hgprt缺陷型細胞之生長。較佳永生化細胞株為彼等有效融合、支持所選抗體產生細胞中抗體之穩定高水準表現且對諸如HAT培養基之培養基敏感的永生化細胞株。更佳永生化細胞株為鼠類骨髓瘤細胞株，其可獲自（例如）索爾克學院細胞分配中心（Salk

Institute Cell Distribution Center，San Diego, California)及美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection，Manassas，Virginia)。該鼠類骨髓瘤細胞株之一實例為P3X63Ag8U.l (ATCC CRL 1580)。亦描述人類骨骨遠瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤細胞株用於製備人類單株抗體 [Kozbor，J. Immunol·，133:3001 (1984) ； Brodeur 等人，

Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，（1987)第 51-63頁]。可隨後檢定培養融合瘤細胞之培養基中針對DR6及/或 APP的單株抗體之存在。較佳地，藉由免疫沈定反應或藉由活體外結合檢定（諸如放射免疫檢定（RIA)或酶聯免疫吸附檢定（ELISA))來測定由融合瘤細胞所產生之單株抗體之結合特異性。該等技術及檢定為此項技術中所已知。可（例如）藉由 Munson及 Pollard，Anal. Biochem·，107:220(1980) 127689.doc -75- 200844113 之Seated分析《藉助於BiaC〇re分析測定單株抗體之結合親和力。鑑別所需融合瘤細胞|，可藉由限制稀釋程序次選殖該等純系且藉由標準方法[前述G〇ding]培養。用於此目的之適當培養基包括（例如）杜貝卡改良伊格爾培養基或 RPMI-1640培養基。或者，可使融合瘤細胞在哺乳動物中以腹水形式活體内生長。可藉由習知免疫球蛋白純化程序自培養基或腹水流體分離或純化次純系所分泌之單株抗體，該等程序諸如蛋白質 A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。亦可由諸如彼等描述於美國專利第4,816,567號中之重組 DNA方法製備單株抗體。編碼單株抗體之dna易於使用習知程序分離且定序（例如藉由使用能夠特異性結合編碼該等單株抗體之重鏈及輕鏈之基因的募核苷酸探針）。融合瘤細胞充當该DNA之較佳來源。分離後，可將DNA置於表現載體中，隨後將其轉染至並不另外產生免疫球蛋白蛋白質之宿主細胞（諸如大腸桿菌細胞、猿c〇s細胞、中國倉鼠卵巢（CHO)細胞或骨髓瘤細胞）中以在重組宿主細胞中獲得單株抗體之合成。DNA亦可藉由（例如）以人類重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列取代同源鼠類序列（M〇rris〇n，等人，Pr〇c. Nat· Aead· Sci· 81，6851 (1984))或藉由使非免疫球蛋白多肽之全部或部分編碼序列共價聯接至免疫球蛋白編碼序列加以修飾。以該種方式，製備具有本文之抗DR6單株抗體之結合特異性的’’欲合’’或’’雜交”抗體。 127689.doc -76 - 200844113 通常該等非免疫球蛋白多肽取代本發明之抗體之恆定域或其取代本發明之抗體之一個抗原結合部位的可變域以產生肷合二價抗體，其包含一個對DR6具有特異性之抗原結合部位及另一對不同抗原具有特異性之抗原結合部位。亦可使用合成蛋白質化學中之包括彼等包括交聯劑之已知方法活體外製備嵌合或雜交抗體。例如，可使用雙硫鍵交換反應或藉由形成硫醚鍵來構築免疫毒素。用於此目的之適當試劑之實例包括亞胺基硫醇酯及曱基_4_巯基丁醯亞胺醋。诸如 Iliades專人，FEBS Letters，409:437-441(1997)中所述亦可製備單鏈Fv片段。使用各種連接子偶合該等單鏈片丰又描述於 Kortt 等人，Protein Engineering，10:423-433 (1 997)中。重組產生且操作抗體之多種技術為此項技術中所熟知。下文更詳細地描述熟習此項技術者通常使用之該等技術之說明性實例。人類化抗體通常，人類化抗體具有一或多個自非人類來源引入其中之胺基酸殘基。該等非人類胺基酸殘基通常稱為”輸入，，殘基，其通常取自π輸入π可變域。可基本上按照Winter及其合

作者之方法（Jones 等人，Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等人，Nature，332:323-327 (1988); Verhoeyen 等人，Science，239:1534-1536 (1988))藉由以齧齒動物 CDR 或CDR序列取代人類抗體之相應序列來進行人源化。 127689.doc -77- 200844113 —因此，該等，，人類化”抗體為嵌合抗體，其中大體上小於完整人類可變域已經非人類物種之相應序列取代。實際上，人類化抗體通常為人類抗體，其中一些(：：1)尺殘基及可月匕之些FR殘基經來自齧齒動物抗體中類似部位之殘基取代。土重要的是抗體經人類化，保留對抗原之高親和力及其他有利生物特性。為實現該目標，根據一較佳方法，人類化抗體藉由使用親本及人類化序列之三維模型分析親本序列及各種没想之人類化產物的方法來製備。三維免疫球蛋白杈型通常可獲得且為熟習此項技術者所熟知。可獲得說明且顯示所選候選免疫球蛋白序列之可能三維構型結構之電腦私式。對該等顯示之檢視允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能中之可能作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，FR殘基可選自且組合自一致及輸入序列以便獲得所需抗體特徵，諸如對歡標抗原之親和力增加。通常，CDR殘基直接且最大體上參與影響抗原結合。人類抗體可藉由融合瘤方法製備人類單株抗體。例如，K〇zb〇r，j

Immimol· 133, 3001 (1984);及 Brodeur等人，M〇n〇cl〇nal

Antibody Production Techniques and Applications，第 51-63 頁（Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)已描述用以產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤細胞株。 127689.doc • 78 - 200844113 現可能產生免疫後能夠在不存在内源免疫球蛋白產生之情況下產生人類抗體庫的轉基因動物（例如小鼠）。舉例而言，已描述在嵌合及生殖系突變型小鼠中同型缺失抗體重鏈聯接區（jh)基因導致内源抗體產生之完全抑制。人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移入該生殖系突變型小鼠中將使得在抗原激發後產生人類抗體。參見例如Jak〇b〇vits等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993) ； Jakobovits 等人，Nature 362, 255-258 (1993)。

Mendez 等人（Nature Genetics 15: 146-156 [1997])已進一步改良該技術且已產生命名為”異種小鼠n(Xen〇m〇use π)π 之轉基因小鼠品系，當以抗原激發時其產生高親和力全人類抗體。藉由將巨驗基人類重鏈及輕鏈基因座生殖系整合入如上所述缺失内源性&片段之小鼠中達成此目的。異種小鼠II具有1，020 kb之含有約66 VH基因、完整Dh&Jh區及二個不同恆定區（μ、δ及χ)之人類重鏈基因座且亦具有8〇〇 kb之含有32 Vk基因、JK片段及Ck基因之人類κ基因座。在此等小鼠中產生之抗體在包括基因重排、裝配及庫之各方面非常類似於人類中所見之抗體。歸因於阻止鼠類基因座中基因重排之内源性JH片段之缺失，人類抗體較佳經表現超過内源性抗體。或者，可使用噬菌體呈現技術（McCafferty等人，Nature 348, 552-553 [1990])來由來自未經免疫之供體之免疫球蛋白可變（V)域基因庫活體外產生人類抗體及抗體片段。根據該技術，將抗體V域基因同框選殖入絲狀噬菌體之主要或次 127689.doc -79- 200844113 要外殼蛋白質基因（諸如M13或fd)中，且作為功能性抗體片 4又壬現於㉟_體顆粒之表面上。由於絲狀顆粒含有嗤菌體基因組之單股DNA複本，故基於抗體功能特性之選擇亦使得可選擇編碼顯示彼等特性之抗體的基因。因此，嗤菌體模擬B細胞之一些特性。可以多種形式執行噬菌體呈現；對於違專形式之回顧請參見例如j〇hnsoI1 Kevin S·及Chi swell， David J.9 Current Opinion in Structural Biology 3? 564-571 (1993)。對於噬菌體呈現可使用數種v_基因區段來源。Clackson等人，Nature，352, 624_628 (1991)由來源於免疫小执脾臟之V基因的小型隨機組合庫分離出各種系列之抗噁唑酮抗體。可構築來自未經免疫之人類供體之V基因庫，且可基本上按照Marks等人，J· Mol· Biol· 222, 581-597 (1991)或 Griffith等人，EMBO J· 12, 725-734 (1993)描述之技術分離針對各種系列之抗原（包括自體抗原）之抗體。在自然免疫反應中，抗體基因以高速率累積突變作用（體細胞超突變）。一些所引入之變化將賦予較高親和力，且顯示高親和力表面免疫球蛋白之B細胞較佳在後續抗原激發期間複製且刀化。可藉由採用稱為，，鏈改組，，之技術（Marks等人， Bio/Teehnol· 10, 779_783 [1992])模擬此自然過程。在此方法中，可藉由以獲自未經免疫之供體的V域基因之天然存在之’交體（庫）的庫依次置換重鏈及輕鏈V區基因改良藉由噬又竹 < 初級人類抗體之親和力。此技術允許產生親和力在nM範圍内之抗體及抗體片段。Waterh〇use等人，Nucl· Adds Res· 21，2265-2266 (1993)已描述製備極大 127689.doc 200844113 噬菌體抗體庫（亦稱為”所有庫之根源”）之策略。基因改組亦可用以自齧齒動物抗體衍生人類抗體，其中人類抗體與起始齧齒動物抗體具有相似親和力及特異性。根據此亦稱為 π抗原決定基印記”之方法，藉由噬菌體呈現技術獲得之齧齒動物抗體之重鏈或輕鏈ν域基因經人類ν域基因庫置換，產生齧齒動物_人類嵌合體。對抗原之選擇使得可分離能夠恢復功能性抗原結合部位的人類可變域，亦即抗原決定基支配（印記）搭配物之選擇。當重複該過程以置換其餘齧齒動物V域時，獲得人類抗體（參見1993年4月1日公開之 PCT專利申請案w〇 93/06213)。不同於利用CDR移植的齧齒動物抗體之傳統人源化，此技術提供完全人類抗體，其不具有齧齒動物來源之框架或CDR殘基。如下文所詳細討論，本發明之抗體可視情況包含單體抗體、二聚抗體以及抗體之多價形式。熟習此項技術者可藉由此項技術中已知之技術且使用本文之DR6及/或App抗體構築該等二聚體或多價形式。製備單價抗體之方法亦為此項技術中所熟知。例如，一種方法包括重組表現免疫球蛋白輕鏈及經修飾之重鏈。通常在Fc區中之任一點將重鏈截短以便防止重鏈交聯。或者，以另一胺基酸殘基取代相關半胱胺酸殘基或將其缺失以便防止交聯。雙特異性抗體雙特異性抗體為單株抗體，較佳為人類或人類化抗體，其對至少兩種不同抗原具有結合特異性。在本發明之情況下，結合特異性中之一者係針對DR6受體，另一者係針對 127689.doc -81 - 200844113 任何其他抗原，且較佳地針對另一受體或受體次單位。製造雙特異性抗體之方法在此項技術中已知。通常，雙特異性抗體之重組製備係基於兩個免疫球蛋白重鏈—輕鏈對之共表現’其中該兩個重鏈具有不同特異性（MiUstein及

Cuello, Nature 305, 537-539 (1983))。由於免疫球蛋白重鏈

與輕鏈之隨機搭配，故此等融合瘤（四瘤體）產生具有丨〇種不同抗體分子之可能混合物，其中僅一種具有恰當雙特異性結構。通常由親和性層析步驟進行之恰當分子之純化十分繁瑣且產物產率低。類似程序揭示於pcT申請公開案第w〇 93/08829號（1993年5月13日公開）及Traunecker等人

，EMBO 10，3655-3659 (1991)中。根據；f同且更佳之方法，冑具有戶斤需結合特異性之抗體可變域(抗體-抗原組合部位)融合至免疫球蛋白恆定域序列。較佳與包含鉸鏈、CH2及CH3區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈恒定域融合。較佳具有含有輕鏈結合所必需之部位的第-重鏈怪定區(CH1)，其存在於至少一種融合體中。將、扁馬免疫球蛋白重鏈融合體及。必要時)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入單獨表現载體中且共轉染入適當宿主生物體中。在實施例中當二插田一種用於该構梁之多肽鏈之不等比率提供最佳產率時，此舉扃 _ 牛在调即二種多肽片段之相互比例中提

供極大靈活性。缺而A …、而萄至少兩種等比率之多肽鏈之表現產生南產率時或當此査T i 羊不具有特定顯著性時，可能在一個表現載體中插入兩種武ό 一 4斤有三種多肽鏈之編碼序列。在該方法之一較佳實施例申又特異性抗體包含在一臂中具有第 127689.doc -82 - 200844113 -結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈及在另一臂中之雜交免疫球蛋白重鏈·輕鏈對（提供第二結合特異性）。發現冬僅 -半之雙特異性分子中之免疫球蛋白輕鏈的存在提供較易分離方式時’該不對稱結構促進所需雙特異性化合物自不當免疫球蛋白鏈組合之分離。此方法係揭示於1994年3月3 曰公開之PCT公開案第w〇 94/04690號中。對於產生雙特異性抗體之其他細節，請參見例如Suresh等人，Meth〇ds in

Enzymology 121，210 (1986)。雜接合抗鱧雜接合抗體亦在本發明之範疇内。雜接合抗體包含兩個仏私”接之抗體。已提出該等抗體（例如）使免疫系統細胞革巴向不當細胞（美國專利第4,676,980號）且用於治療HIV感染 (PCT申請公開案第w〇 91/〇〇36〇及w〇92/200373號；Ερ 03 089)可使用任何適宜交聯法製造雜接合抗體。適當交鍵劑以及許多交聯技術為此項技術中所熟知且揭示於美國專利第4,676,980號中。抗體片段在某些實施例中，抗DR6及/或ΑΡΡ抗體（包括鼠類、人類及人類化抗體及抗體變體）為抗體片段。已發展出多種用於產生抗體片段之技術。通常，經由完整抗體之蛋白質水解消化獲得此等片段（參見例如Morimoto等人，/·价 Mei/zo心 24:107-1 17 (1992)及 Brennan等人， 229:81 (1985))。然而，該等片段現可直接藉由重組宿主細胞產生。舉例而言，Fab’-SH片段可直接自大腸桿菌中回收 127689.doc •83- 200844113 且以化學方式偶合以形成F(ab，）2片段（Carter等人，Bio/ Technology 1〇: mu 67 (1992))。在另一實施例中，使用白胺酸拉鏈GCN4以促進F(ab，）2分子之裝配來形成F(ab，）2。根據另一方法，可直接自重組宿主細胞培養物分離Fv、Fab 或F(ab’）2片段。對熟練從業者而言多種產生抗體片段之技術將顯而易見。例如，可使用木瓜蛋白酶進行消化。木瓜蛋白_：消化之實例描述於94/12/22公開之WO 94/29348及美國專利第4,342,566號中。抗體之木瓜蛋白酶消化通常產生兩個稱為F ab片段之各自具有單一抗原結合部位的相同抗原結合片段，及殘餘Fc片段。胃蛋白酶處理產生F(ab，）2 片段’其具有兩個抗原結合部位且仍能夠使抗原交聯。抗體消化產生之F ab片段亦含有輕鏈之恒定域及重鏈之第一悝定域（CH〗）。Fab，片段與Fab片段不同之處在於在重鏈域之魏基末端添加包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸的數個殘基。Fab’- S Η為本文中對恒定域之半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基之Fab，之命名。F(ab，）2抗體片段最初產生為其間具有鉸鏈半胱胺酸的Fab，片段對。亦已知抗體片段之其他化學偶合。抗趙之糖基化變艘在恆定區中在保守位置將抗體糖基化（Jefferis及Lund，

Chem· Immunol· 65:11 1-128 [1997] ; Wright及 Morrison，

TibTECH 15:26-32 [1997])。免疫球蛋白之寡醣側鏈影響蛋白質之功能（Boyd 等人，Mol· Immunol· 32:1311-1318 [1996] ; Wittwe及 Howard，Biochem· 29:4175-4180 [1990])， 127689.doc -84- 200844113 及可影響醣蛋白之構型及所呈示之三維表面的醣蛋白部分之間的分子内相互作用（前述Hefferis及Lund ; Wyss及

Wagner，Current Opin· Biotech· 7:409-416 [1996])。募醣亦可用來基於特異性識別結構使所給醣蛋白乾向某些分子。舉例而言’已報導在異半乳糖化之IgG中，寡酶部分自CH2 間空間f彈出’’且末端N-乙醯葡萄胺糖殘基變得可用以結合甘露糖結合蛋白（Malhotra等人，Nature Med· 1:237-243 [1995] )。藉由糖肽酶移除中國倉鼠卵巢（CH〇)細胞中產生之CAMPATH-1H(重組人類化鼠類單株匕⑴抗體，其識別人類淋巴細胞之CDw52抗原）的寡醣使得補體介導之溶解 (CMCL)完全降低（Boyd 等人，Mol. Immun〇i· 32:131 卜 1318 [1996] )，而使用神經胺酸酶選擇性移除唾液酸殘基未引起 DMCL損失。亦已報導抗體之糖基化影響抗體依賴性細胞毒性（ADCC)。詳言之，已報導具有四環素調節之β(ι，4)-Ν_: 基葡糖轉移酶HRGnTmX 一種催化形成二等分 GlcNAc之糖基轉移酶）之表現的CH〇細胞具有提高之 ADCC 活性（Umana 等人，Mature Bi〇teeh· n:i76_i8〇 [1999]) 〇抗體之糖基化變體為抗體之糖基化模式已改變之變體。改變意謂缺失抗體中存在之一或多個碳水化合物部分，向抗體添加-或多個碳水化合物部分，改變糖基化之組成（糖基化模式）、糖基化程度等。可（例如）藉由在編碼抗體之核酸序列中移除、改變及/或添加—或多個糖基化部位製備糖基化變體。 127689.doc -85 - 200844113 抗體之糖基化通常為N_連接或〇_連接。N_連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X -絲胺酸及天冬醯胺-X _蘇胺酸（其中χ為除脯胺酸之外之任何胺基酸）為碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈酶促連接的識別序列。因此，在多肽中該等三肽序列中任一者之存在產生可能的糖基化部位。連接糖基化係指糖Ν_乙酿基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者與經胺基酸(儘管亦可使用5-羥脯胺酸或5_羥賴胺酸，但最通常為絲胺酸或蘇胺酸）連接。藉由改變胺基酸序列以使得其含有上述三肽序列中之一或多者來便利地實現糖基化部位向抗體中之添加（用於Ν_ 連接糖基化部位）。亦可藉由添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基至原始抗體之序列中或由一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代原始抗體之序列來進行該變異（用於〇_連接糖基化部位）。亦可在不改變基本核苷酸序列之情況下改變抗體之糖基化（包括糖基化模式）。糖基化大部分依賴於用於表現抗體之宿主細胞。由於用於表現作為潛在治療劑之例如抗體之重組醣蛋白之細胞類型極少為原生細胞，因此可期望抗體之糖基化模式之顯著改變（參見例如Hse等人，j. chem. 272:9062-907(^1997]^除宿主細胞之選擇外，在抗體之重組產生期間影響糖基化之因素包括生長模式、培養基調配物、培養物密度、氧合作用、pH值、純化流程及其類似因素。已提出各種方法改變特定宿主生物體中獲得之糖基化 127689.doc -86 - 200844113 模式’其包括引入或過度表現某些與寡醣產生有關之酶（美國專利第 5,047,33 5 ; 5,510,261 及 5·278,299號）。可使用（例如）内切糖苷酶H(Endo Η)自醣蛋白酶促移除糖基化或某些類型之糖基化。此外，重組宿主細胞可經遺傳工程化，（例如）使得在加工某些類型之多醣中具有缺陷。此等及類似技術為此項技術中所熟知。藉由石反水化合物分析之習知技術可易於分析抗體之糖基化結構’該等技術包括凝集素層析、NMR、質譜分析、 HPLC、GPC、單組成分析、按序酶促消化及HpAEC_pAD，其基於電荷使用高pH值陰離子交換層析來分離寡醣。亦已知出於分析目的用以釋放募醣之方法，且其包括（但不限於）酶促處理（通常使用肽糖苷酶？/内4_半乳糖苷酶進行）、使用苛刻鹼環境消除以釋放主要0 —連接結構，及使用無水肼以釋放N-連接及〇_連接之寡醣的化學方法。例示性抗體如下文只例中所述，抗DR6單株抗體已經鑑別。在可選貝她例中本發明之DR6抗體具有與本文中特定揭示之抗 DR6及/或APP抗體中之任一者相同的生物學特性。術語”生物學特性”用以指單株抗體之活體外及/或活體内活性或特性，諸如特異性結合刪或崎、抑制或中和刪活化之此力。在下文實例中進一步描述DR6及/或APP抗體之特性及活性。視h况，本發明之單株抗體具有與下文實例中特定表徵之抗體中之任一者相同的生物學特性及/或結合與此等抗 127689.doc -87· 200844113 體相同之抗原決定基。此可藉由進行諸如本文中及實例中描述之各種檢定來確定。例如，為測定單株抗體是否具有與本文中特定提及的DR6及/或APP抗體相同之特異性，可在競爭性結合檢定中比較其活性。此外，可藉由DR6及/或 APP與所討論之抗體之間的複合物之晶體學研究來測定特定抗DR6及/或APP抗體結合之抗原決定基。如本文中所描述之DR6及/或APP抗體較佳具有所需DR6 拮抗活性。該等DR6抗體可包括（但不限於）嵌合、人類化、人類及親和力成熟抗體。如上所述，可使用各種技術構築或工程化DR6及/或APP抗體以獲得此等所需活性或特性。本發明之其他實施例包括本文中揭示之抗DR6受體及/或 APP配位體抗體，其與一或多個選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烧組成之群的非蛋白質性聚合物連接。視情況，本文中揭示之抗DR6受體及/或APP配位體抗體係經糖基化或者未經糖基化。本發明之抗體包括”交聯’’DR6及/或APP抗體。如本文中所用之術語’’交聯π係指至少兩個IgG分子結合在一起以形成一個（或單一）分子。可使用各種連接子分子交聯DR6及/ 或APP抗體，較佳使用抗IgG分子、補體、化學修飾或分子工程化交聯DR6及/或APP抗體。熟習此項技術者應瞭解抗體與細胞表面膜結合後，補體對抗體分子具有相對高的親和力。因此，咸信補體可用作交聯分子以連接與細胞表面膜結合之兩個或兩個以上抗DR6抗體。本發明亦提供如本文中揭示之編碼DR6及/或APP抗體的 127689.doc -88- 200844113 分離核酸，包含該核酸之載體及宿主細胞及用以產生該抗體之重組技術。對於重組產生抗體，將編碼其之核酸分離且插入可複製載體中以便進一步選殖（擴增DNA)或表現。編碼抗體之 DNA易於使用習知程序分離且定序（例如藉由使用能夠特 /、 &、、扁碼$亥抗體之基因的寡核普酸探針）。許多載體可獲得。載體組份通常包括（但不限於）一或多種以下組份：信

號序列、複製起點、一或多種標記基因、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列。本文之方法包括用以產生嵌合或重組抗DR6及/或App抗體之方法’其包含以下步驟··提供包含編碼抗及/或App 抗體I工鏈或重鏈（或輕鏈與重鏈兩者）之序列之載體；以載體轉染或轉型宿主細胞；及在足以產生重組抗嶋抗體及/或APP抗體產物之條件下培養宿主細胞。 DR6拮抗劑之調配物在本文之典型調配物之製備中，應注意所採用組份之推薦品質或，，等級”將視調配物之最終用途而定。對於治療用途’組份較佳具有作為醫藥產品之添加劑之容許等級（諸如，，GRAS，’）。在某些實施例中’提供包含DR6拮抗劑及一或多種賦形劑之組合物’該-或多種賦形劑提供足夠離子強度以增強 DR6拮抗劑之溶解性及/或穩定性，其巾組合物具有6(或約 6)至9(或約9)之pH值。可藉由任何適當方法（例如根據上述方法）製備DR6拮抗劑以獲得所需蛋白f純度。在某些實施 127689.doc -89- 200844113 例中，DR6拮抗劑係重組表現於宿主細胞中或藉由化學合成製備。DR6拮抗劑在調配物中之濃度可視（例如）調配物之預疋用迷而改變。热習此項技術者可在無過度實驗之情況下測定DR6拮抗劑之所需濃度。調配物中提供足夠離子強度以增強D R 6拮抗劑之溶解性及/或穩定性之該一或多種賦形劑視情況為聚離子型有機或無機酸、天冬胺酸鹽、硫酸鈉、琥珀酸鈉、乙酸鈉、氯化納、CaPtisolTM、Tris、精胺酸鹽或其他胺基酸，諸如海藻糖及嚴糖之糖及多元醇。較佳地’在調配物中提供足夠離子強度之該一或多種賦形劑為鹽。可採用之鹽包括（但不限於）鈉鹽及精胺酸鹽。所用之鹽的類型及鹽之濃度較佳使得調配物具有使調配物中之DR6拮抗劑穩定的相對高的離子強度。視情況，調配物中所存在之鹽的濃度為約2〇 mM 至約0.5 Μ。組合物較佳具有6(或約6)至9(或約9)、更佳約6.5至約 8.5且甚至更佳約7至約7·52ρΗ值。在此實施例之一較佳悲樣中，組合物將進一步包含緩衝劑以使組合物值保持在至乂約6至約8。可採用的緩衝劑之實例包括（但不限於）Tris、HEPES及組胺酸。當採用加時，pH值可視情況凋正至約7至8.5。當採用Hepes或組胺酸時，pH值可視情況凋正至、、、勺6 · 5至7。視情況，所用緩衝液在調配物中之濃度為約5 mM至約50 mM。特疋s之，對於液體調配物（或復水凍乾調配物），可需要在、、且a物中包括一或多種界面活性劑。該等界面活性劑 127689.doc -90- 200844113 可（例如）包含非離子型界面活性劑，如TWEENtm或 PLURONICSTM(例如聚山梨醇酉旨n各沙姆（p〇i〇xamer))。較佳地’界面活性劑包含聚山梨醇酯20("吐溫（Tween) 20 )。視^況採用之界面活性劑濃度為約〇.〇〇5%至約〇.2〇/〇。除DR6拮抗劑及彼等如上所述之組份外，本發明之調配物可進一步包括各種其他賦形劑或組份。視情況，對於非

經腸投藥，調配物可含有醫藥學上或非經腸可接受之載劑，亦即在所用劑量及濃度下對接受者無毒性且與調配物之其他成份相容的載劑。視情況，載劑為非經腸載劑，諸如與接受者之血液等張的溶液。該等載劑媒劑之實例包括水、鹽水或緩衝溶液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水（pBs)*葛爾氏溶液（Ringer's solution)及右旋糖溶液。各種可選醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或敎劑進—步描述於^一oh Pharmaceutical Sciences，第 16版，〇s〇i，A 編〇_)中。本文之調配物亦可含有一或多種防腐劑。實例包括十八烧基二甲基节基氯化銨、氣化六料録、氯^銨（烧基為長鏈化合物之氯化烧基节基二甲基錢之混合物）及节索氯銨。其他類型之防腐劑包括芳族醇，諸如對羥基苯甲酸甲醋或對羥基苯甲酸丙酿之對經基苯甲酸烷酿及間甲紛。抗氧化劑包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑（諸如十八烧基^ 甲基节基氯化銨；氯化六羥季銨；氯节烷銨、节索二了丁醇；對經基苯甲酸炫醋’諸如對經基苯甲酸甲醋或對經基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；％戊醇及間甲酚）；低分子量（少於約10個殘基）多肽；蛋白質，諸士 127689.doc 91 200844113 二清：蛋白、明勝或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙胺基酸’諸如甘胺酸、麵胺酿胺、天冬醢胺、組胺酉夂、精胺酸或離胺酸； ^ — 夂早醣、一醣及其他碳水化合物， a祜匍甸糖、甘露糖或細· ^ π，糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海澡糖或山梨糖醇；或聚乙二醇（PEG)。、… （、且口物可包含液體調配物(液體溶液或液體懸序液）及滚乾調配物以及懸浮液調配物。若為液體，則最終調配物較佳在_<2代下冷;東儲存。或者，調配物可㈣乾且提供為用以與注㈣水復水之粉末’其可視情況在2-30°C下儲存。欲用於治療性投藥之調配物必須為無菌的。藉由經無菌過遽膜（例如0.2微米膜）過濾易於實現無菌。通常將治療經

合物置於具有益菌人;^丨夕&纪I 令,、，、囷入孔之谷益中，例如具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈内溶液袋或小瓶。組合物通常將以水溶液或用於復水之滚乾調配物形式儲存於單一單元或多劑量容器中’例如密封安瓶或小瓶。容器可為此項技術中之任何可用容器且使用習知方法填充。視情況，調配物可包括於注射筆裝置中（或裝人筆裝置中之濾、筒）’冑如彼等在此項技術中可用者（參見例如美國專利 5’3 70’629)，其適合於調配物之治療傳遞。可藉由使用(例如）注射用水將减乾DR6拮抗劑調配物復水來製備注射溶液0 使用DR6拮抗劑質療法本發明之DR6拮抗劑具有各種*用。刪拮抗劑適用於神 127689.doc -92- 200844113 經疾病之診斷及治療。孰 “…白攸業者可進行哺乳動物中本文所描述之各種病理學病狀的診斷。此項技術中可獲得允。斗例如診斷或谓測哺乳動物之各種神經疾病之診斷技術。預』本务明治療之神經疾病包括家族及偶發性肌萎縮性側索，化（分別為隱8及綱、家族及偶發性帕金森氏病、亨丁頓氏舞蹈症、家族及偶發性阿兹海默氏症及脊趙性肌萎縮（SMA)(前述Price等人）。許多此等疾病之特徵在於

在成人中年年齡期間發作且導致神經系統内神經元之特定子集的快速退化，最終導致過早死亡。肌萎縮性側索硬化 (ALS)為最常診斷出之進行性神經元錢。該疾病之特徵在於皮質、腦幹及脊财運動神經元之退化⑶灿㈣等人，J· NeUral Transni. SuppI.，49:219_233 (i997) ’· siddique 等人，NeUrology, 47: (4 Suppl 2):S27_34 ;心嶋1〇11 Μ" (1996) ; R0sen等人，Nature，362:59 62 (i993” ㈤卿等人，Science，264:1772-1775 1994))。帕金森氏病（帕金森氏震顫麻痹）為常見神經退化性病症，其通常出現在生命中期或晚期。存在家族及偶發性病例，儘管家族病例僅佔所觀察到病例之百分之1-2。患者時常具有神經細胞損失伴隨反應性神經膠質過多症及腦幹之黑質與藍斑核（locus coeruleus)中的路易體（LeWy body)。作為一類，黑貝紋狀體多巴胺能神經元似乎最受影響（Uhi等人，Neurology，35:1215-1218 (1985) ·，Levine等人，Trends

Neurosci” 27:691-697 (2004) ·’ Fleming等人，NenroRx， 2:495-503 (2005)) ° 127689.doc -93 - 200844113 、近端脊14性肌萎縮（SMA)為人類常見體染色體隱性神經退化性疾病，其特徵通常在於脊椎運動神經元損失及四肢及軀幹肌肉萎縮（Monani等人，Hum. M〇丨· 9:2451-2457 (2000) ; Monani# Λ ^ J. Cell 160:41-52 (2003))。其發生之頻率為10,000個個體中1人發病且為嬰兒死亡率之最常見遺傳病因。基於發作時的年齡及疾病表型之嚴重程度，近端SMA已分類為第〗型（嚴重）、第11型（中度）及第III型（輕度）SMA。所有三種形式之疾病均歸因於運動神經το基因（SMN1)端粒存活之損失或突變作用（上述 Monani等人，2000 ;上述^^⑽仙丨等人，（2〇〇3))。已在許多神經退化性疾病中報導神經元細胞損失，該等疾病包括阿茲海默氏症、帕金森氏病、肌萎縮性側索硬化 (ALS)及脊髓性肌萎縮（SMa)。視情況，患者中阿茲海默氏症之診斷可基於Diagn〇stic and Statistical Manual of Mental disorders，第 4 版 (DSM_IV-TR)(參見例如 American Psychiatric Association· Diagnostic and statistical manual of mental disorders，第 4 修訂版 Washington，DC: 2000)之標準。簡言之，dsm_IV-TR 才示準包括·（A)表現為記憶受損及一或多種以下症狀之多種認知缺陷的發展：（1)失語症；（2)精神性運動不能；（3)認識不月b ’或（4)執行功能干擾，（b)認知缺陷表示先前功能下降且導致社會或職業功能顯著受損；（C)該病程之特徵在於漸進發作及持續下降；（D)認知缺陷並不歸因於其他中樞神經系統、全身性或物質誘發之造成記憶及認知進行性缺陷的 127689.doc -94- 200844113 病狀；及（E)干擾無法由另一精神病症更佳說明。可進行阿茲海默氏症之診斷的替代標準包括彼等基於國家神經學及交流病症及中風-阿茲海默氏症及相關病症協會研究院 (National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke-Alzheimerfs Disease and Related Disorder Association，NINDS-ADRDA)之阿兹海默氏症之工作組標準（參見例如McKhann等人，Neurology 1984; 34: 939-944)者。簡言之，可能的阿茲海默氏症之NINCDS-ADRD A標準包括具有非典型發作、表現或進行且無已知病原學之癡呆症候群，其中並不認為任何能夠產生癡呆之伴隨疾病為病因。可能的阿茲海默氏症之NINCDS-ADRDA標準包括由臨床及神經心理學檢查確定之癡呆，且其包括（a) 包括記憶之兩個或兩個以上認知方面之進行性缺陷；（b)在 40與90歲之間發作；及（c)缺少能夠產生包括譫妄之癡呆症候群之全身性或其他腦疾病。明確阿茲海默氏症之 NINCDS-ADRDA標準包括滿足可能的阿茲海默氏症標準且經由屍檢或生檢具有阿兹海默氏症之組織病理學證據。

Dubois等人，The Lancet Neurology，第 6卷，第 8期，2007 年8月，第734-746頁已提出修訂之NINDS-ADRDA診斷標準。如下文所簡要概述，為滿足可能的阿茲海默氏症之此標準，受影響個體必須滿足標準A(核心臨床標準）及B、C、 D或E中所註明之支持性生物標記標準中之至少一或多種。在此上下文中，標準A之特徵在於包括以下特徵之早期及顯著情節記憶受損之存在：（1)由患者或病史申述者經超 127689.doc -95- 200844113 過ό個月報導之記憶功能之漸進及進行性變化；（2)測試時顯著受損情節記憶之客觀證據：此通常由提示或識別測試時及已預先控制資訊之有效編碼後未顯著改良或未正常化之回憶缺陷組成；（3)情節記憶受損可與AD發作時或AD進行中之其他認知變化分離或相關。標準B之特徵在於存在内側顳葉萎縮，如（例如）以下所示：以使用公開示分法（visual sc〇ring)(參考具有正常年齡標準之充分表徵之群體）之定性評級或所關注區域之定量容積測定法（參考具有正常年齡標準之充分表徵的群體）在MRI上所證明之海馬區、内嗅皮夤、扁桃體之體積損失。標準C之特徵在於腦脊髓液生物標 δ己異4，例如低類澱粉β i η濃度，增加之總r濃度或增加之磷酸-r濃度或三者之組合。標準c之特徵在於利用ρΕτ 之功旎性神經成像之特定圖案，例如雙邊顳頂聯合區中之葡萄糖代謝降低。標準Ε之特徵在於直系親屬中已驗證之 AD體染色體顯性突變。若存在以下情形則認為ad為明確的：⑴如死後AD診斷之NIA-Reagan標準所要求，疾病之臨床與組織病理學（腦生檢或屍檢）證據；標準必須存在（參見例如 Neurobiol Aging 1997; 18: S1_S2);及（2) AD 之臨床與遺傳證據（染色體丨、14或21之突變）；標準必須存在。在本發明之方法中，較佳地在載劑、較佳地醫藥學上可接受之載劑中將DR6拮抗劑投與哺乳動物。適當載劑及其調配物描述於由OS〇l等人所編之Remingt〇nfs Pharmaceutics Seienees，第 16版，198〇，Mackpubiishing C〇·，中。通常，將適當量之醫藥學上可接受之鹽用於調配物 127689.doc -96- 200844113 以使調配物等張。載劑之實例包括鹽水、林葛爾氏溶液及右旋糖溶液。溶液之pH值較佳地為約5至約8，且更佳為約7 至約7.5。其他載劑包括持續釋放製劑，諸如含有抗體之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈例如薄膜、脂質體或微粒之成形物品之形式。對於熟習此項技術者顯而易見，視（例如）投藥途徑及所投與DR6拮抗劑之濃度而定，某些載劑可更佳。可藉由注射（例如靜脈内、腹膜内、皮下、肌肉内、門靜脈内）、經口或藉由諸如輸液之確保以有效形式傳遞至血流中的其他方法將DR6拮抗劑投與哺乳動物。亦可藉由諸如分離之組織灌注的分離之灌注技術或藉由鞠内、眼内或腰椎穿刺投與DR6拮抗劑以發揮局部治療效應。可直接（例如顱内）給予不易於穿過血腦障壁之DR6拮抗劑，或提供至脊叙二間中’或者使其傳輸穿過障壁。可按經驗確定投與dR6 拮抗劑之有效劑量及時程，且進行該等判定係在此項技術之技藝内。熟習此項技術者應瞭解必須投與之DR6拮抗劑之劑量將視（例如）將接受拮抗劑之哺乳動物、投藥途徑、所用拮抗劑之特定類型及投與哺乳動物之其他藥物而改變。選擇適當劑量之指南可見於文獻中，例如關於抗體之治療用迷’例如 Handbook of Monoclonal Antibodies，Ferrone 等人編，Noges Publications，Park Ridge，N.J.，（1985)第 22 早及弟 303-357 頁，Smith 等人，Antibodies in Human Diagnosis and Therapy，Haber等人編，Raven press，New York (1977)第365-389頁。單獨使用之DR6抗體之典型曰劑 127689.doc -97- 200844113 量可根據上述因素在每日約1 pg/kg至至多100 mg/kg體重範圍内或更多。

亦可組合一或多種其他治療劑將DR6拮抗劑投與哺乳動物。該等其他治療劑之實例包括上皮生長因子受體（EGFR) 抑制劑，例如結合EGFR或者直接與EGFR相互作用且阻止或降低信號轉導活性之化合物，諸如它賽瓦（Tarceva)，如 C225之抗體，其亦稱為西妥昔單抗（cetuximab)及Erbitux® (ImClone Systems Inc.)，全人類 ABX-EGF(盤尼圖單抗 (panitumumab)，Abgenix Inc·)，以及稱為 Ε1·1、Ε2·4、Ε2·5、 Ε6·2、Ε6·4、Ε2.11、Ε6·3及 Ε7.6.3 且描述於 US 6,235,883 中之全人類抗體；MDX-447 (Medarex Inc)以及EGFR小分子抑制劑，諸如描述於US 56165 82、US 545 7105、US 5 475 001、 US 5654307、US 5679683、US 6084095、US 6265410、US 6455534 、 US 6521620 、 US 6596726 、 US 6713484 、 US 5770599 、 US 6140332 、 US 5866572 、 US 6399602 、 US 6344459、US 6602863 > US 6391874、WO 9814451、WO 9850038 ^ WO 9909016、WO 9924037、US 6344455、US 5 760041、US 6002008、US 5 747498 中之 4匕合物；特定小分子EGFR抑制劑包括OSI-774(CP-358774，埃羅替尼 (erlotinib)，OSI Pharmaceuticals) ; PD 1 83805(CI 1033， N-[4-[(3-氯-4-氟苯基）胺基]-7-[3-(4-嗎啉基）丙氧基]-6-喹 σ坐琳基]-2-丙烯醢胺二鹽酸鹽，Pfizer Inc.);易瑞沙 (Iressa)(ZDl 839，吉非替尼（gefitinib)，4-(3’-氣-4’-氟苯胺基）-7 -甲氧基- 6-(3-嗎琳基丙氧基）啥嗤琳，AstraZeneca); 127689.doc -98 - 200844113 履則_-胺基-4办甲基苯基_胺基）+坐琳，

Zeneca);BIBX_1382⑽_(3-氣-4-氟-苯基）指-(1-甲基_呢。定 -4-基）-嘧啶幷[5,4_d]嘧啶 _2,8_ 二胺，B〇ehringer

Ingelheim);PKM66(⑻·4-[4-[(ι-苯基乙基）胺基]-1H十各幷[2,3_d]。密唆-6_基]_苯龄）；（R)_6_(4·經苯基）_4·仏笨基乙基）胺基 WH-t各幷[2,3_d]喷咬）；cl_387785(n_[4_[(3^ 苯基）胺基]-6-喹唑啉基]·2_丁炔醯胺）；及ekb_569(n_[4^3_ 氯-4-氟苯基）胺基]·3_氰基_7_乙氧基_6啥琳基]_4_(二甲胺基）-2-丁烯醯胺）。可採用之其他治療劑包括細胞凋亡抑制劑，尤其細胞内細胞凋亡抑制劑，例如卡斯蛋白酶抑制劑，諸如卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶_6或卡斯蛋白酶_8抑制劑、 Bid抑制劑、Bax抑制劑或其任何組合。適當抑制劑之實例通常為卡斯蛋白酶抑制劑、二肽抑制劑、胺基甲酸酯抑制劑、經取代之天冬胺酸縮醛、雜環基二碳醯胺、喹啉_(二_、二_四肽）衍生物、經取代之2-胺基苄醯胺卡斯蛋白酶抑制劑、經取代之a-羥基酸卡斯蛋白酶抑制劑、藉由亞硝基化加以抑制；CASP-1 ; CASP-3 :蛋白質抑制劑，反義分子，於驗基-天冬胺酸基-嗣，酸二肽衍生物，CASP-8 ·反義分子，相互作用蛋白質CASP-9，CASP2 :反義分子； CASP-6 :反義分子；CASP-7 :反義分子；及CASP-12抑制劑。其他實例為線粒體抑制劑，諸如Bcl-2-調節因子；衍生自Bad、Bad、BH3相互作用域死亡促效劑、Bax抑制劑蛋白夤&BLK基因及基因產物之Bcl-2-突變型狀。細胞〉周亡之其他適當細胞内調節劑為CASP9/Apaf-1結合之調節劑， 127689.doc -99- 200844113

Apaf-1表現之反義調節劑，抑制細胞凋亡之肽，包含疱疹單純型病毒之R1次單位、MEKK1及其片段之抗細胞凋亡組合物，Survivin之調節劑、細胞凋亡抑制劑之調節劑及 HIAP2。該等藥劑之其他實例包括二甲胺四環素 (Minocycline)(Neuroapoptosis Laboratory)，其抑制細胞色素C自線粒體之釋放且阻斷卡斯蛋白酶-3 mRNA上調； Pifithrin a (UIC)，其為p53抑制劑；CEP-1346 (Cephalon Inc·)，其為JNK途徑抑制劑；TCH346(Novartis)，其抑制促调亡 GAPDH信號轉導；IDN6556 (Idun Pharmaceuticals)，其為泛卡斯蛋白酶抑制劑；AZQs (AstraZeneca)，其為卡斯蛋白酶-3抑制劑；HMR-3480 (Aventis Pharma)，其為卡斯蛋白酶-1Λ4抑制劑；及Activase/TPA (Genentech)，其溶解血塊（溶企栓藥物）。

除DR6拮抗劑外可投與之其他適當藥劑包括膽鹼酯酶抑制劑（諸如冬尼培°坐（Donepezil)、加蘭他敏（Galantamine)、雷斯替明（Rivastigmine)、塔克林（Tacrine))、NMDA受體# 抗劑（諸如美金剛（Memantine))、Αβ聚集抑制劑、抗氧化劑、 γ-分泌酶調節劑、NGF模擬物或NGF基因治療劑、PPARj促效劑、HMG-CoA還原酶抑制劑（斯達汀（statins))、安目帕克 (ampakines)、約通道阻斷劑、GABA受體拮抗劑、肝糖合成酶激酶抑制劑、靜脈内免疫球蛋白、簟毒鹼受體促效劑、於驗受體調節劑、主動或被動Αβ免疫法、填酸二酯酶抑制劑、血清素受體拮抗劑及抗Αβ抗體（參見例如WO 2007/062852 ； WO 2007/064972 ； WO 2003/040183 ； WO 127689.doc -100- 200844113 1999/06066 ； WO 2006/081 171 ； WO 1993/21526 ； EP 0276723B1 ； WO 2005/0285 1 1 ； WO 2005/082939) 〇可依次或與該一或多種其他治療劑同時投與DR6拮抗劑。DR6拮抗劑及治療劑之量視（例如）所用藥物之類型、所治療之病理學病狀及投藥時程及途徑而定，但其量通常將小於各者單獨使用時的量。向哺乳動物投與DR6拮抗劑後，可以熟習從業者所熟知之多種方式監控哺乳動物之生理學病狀。可在活體外檢定中且使用活體内動物模型檢驗本發明之 DR6拮抗劑的治療效應。多種熟知檢定及動物模型可用於測試候選治療劑之功效。該等模型之活體内性質使得其尤其預不人類患者之反應、。各種神、經退化性病狀之動物模型及用以研究與神經退化之此等模型相關的病變之相關技術 (例如在DR6拮抗劑存在及不存在之情況下）論述於下文實例1 4中。各種神經疾#之動物模$包括非重組及重組（轉基因）動物。非重組動物模型包括（例如）齧齒動物，例如鼠類模型。可藉由使用例如皮下注射、尾靜脈注射、脾臟植入、腹膜内植入及腎包膜下植入之標準技術將細胞引入同基因型小鼠中產生該等模型。活體内模型包括中風/大腦局部缺血模型^申經退化性疾病之活體内模型，諸如帕金森氏病之小賊杈型，阿絲海默氏症之小鼠模型；肌萎縮性側索硬化A。之小鼠模型；脊趙性肌萎縮SMA之小鼠模型；病灶性及整體大腦局部缺血之小鼠/大鼠模型，例如頸總動脈阻塞模= 127689.doc -101 - 200844113 或大腦中動脈阻塞模型；或離體全胚胎培養物。可以諸如如下所述或如在此項技術中已知且描述於文獻（參見例如 McGowan等人，TRENDS in Genetics，22:28 1，289 (2006); Fleming 等人，NeuroRx，2:495-503 (2005) ； Wong 等人， Nature Neuroscience，5:633-639 (2002))中之已知活體外或活體内檢定形式進行各種檢定。亦由諸如傑克遜實驗室 (Jackson Laboratory)之商業供應商獲得各種該等動物模型 (參見 http://jaxmice.jax.org) 〇可使用在此項技術中已知之多種動物模型研究本文中所揭示的DR6拮抗劑對諸如AD之神經疾病之活性（（參見例如 Rakover等人，Neurodegener Dis. 2007; 4(5): 392-402; Mouri 等人，FASEB J. 2007年 7月；21(9):2135-48 ; Minkeviciene 等人，J Pharmacol Exp Ther. 2004年 11 月；3 1 1(2):677-82及 Yuede 等人，Behav Pharmacol· 2007年 9 月；18(5-6):347-63)。例如，可使用目標識別測試研究本文中揭示的DR6拮抗劑對小鼠之認知功能之效應（參見例如Ennaceur等人，Behav. Brain Res· 198 8; 3 1:47-5 9)。可藉由（例如）經設計以量測諸如IL-Ιβ及TNF-α之炎症標記及抗發炎細胞激素IL-10在小鼠血漿部分中的含量之組織化學分析以及ELISA方案，在小鼠中研究本文中揭示之DR6拮抗劑對（例如）大腦炎症的活性（參見例如 Rakover 等人，Neurodegener Dis. 2007; 4(5):392-402)。可經由使用（例如）認知結果量測結合整體評估研究本文中揭示的DR6拮抗劑對諸如阿茲海默氏症（AD)之人類神經 127689.doc -102- 200844113 疾病之效應（參見例如 Leber P: Guidelines for the Clinical

Evaluation of Antidementia Drugs，第一草案，Rockville， MD，US Food and Drug Administration，1990)。可使用（例如）單一或多組標準研究對諸如AD之神經疾病之效應。例如， ^^洲醫藥品管理局（European Medicine Evaluation Agency，EMEA)提出對應於認知之預先指定程度之提高及功能性與整體活性之穩定化之反應者之定義（參見例如歐洲西樂口口管理局（European Medicine Evaluation Agency， EMEA): Note for Guidelines on Medicinal Products in the

Treatment of Alzheimer’s Disease. London，EMEA，1997)。

在此項技術中已知可單獨或組合使用以評估患者對藥劑的反應性之峰多具體公認測試（參見例如Van Dyke等人，am J

Genatr· Psychiatry 14:5 (2006))。例如，可使用嚴重損害量表（Severe Impairment Battery，SIB，一種用以量測患有較嚴重AD之患者的認知變化之測試）評估對藥劑之反應性（參見例如 Schmitt等人，Alzheimer Dis Assoc Disord 1997; ll(suppl 2):51-56)。亦可使用經設計且確認用於晚期癡呆之19項阿茲海默氏症合作研究日常生活活動清單 (Alzheimer’s Disease Cooperative Study-Activities of Daily

Living inventory，ADCSADL19)，亦即量測執行日常生活活動之獨立性程度的丨9項清單，量測對藥劑之反應性（參見例如 Galasko 等人，j Int Neur〇psych〇1 s〇c 2〇〇5; 1 1:446-453)。亦可使用基於臨床醫師之訪談的變化印象加上護理者輸入（Clinician,s Interview_Based匕阶以⑽ 127689.doc -103- 200844113

Change Plus Caregiver Input，CIBIC-Plus，一種基於患者與護理者之結構化訪談的7分整體變化評級）量測對藥劑之反應性（參見例如 Schneider 等人，Alzheimer Dis Assoc Disord 1 997，11 (增刊2):22-3 2)。亦可基於護理者訪談使用評估12 種行為症狀之頻率及嚴重程度的神經精神病學清單 (Neuropsychiatric Inventory，NPI)量測對藥劑之反應性（參見例如 Cummings 等人，Neurology 1994; 44:2308-23 14) 各種膽鹼酯酶抑制劑（冬尼培唑、加蘭他敏、雷斯替明及塔克林以及美金剛’ N-甲基-D-天冬胺酸鹽（NMdA)受體拮抗劑）已收到管理批准用於治療阿茲海默氏症（參見例如

Roberson等人，Science 314: 781-784 (2006))。在患有輕度至中度嚴重性AD之患者中的膽驗酯酶抑制劑之臨床試驗中’治療反應之常見定義包括經6個月阿茲海默氏症評估表 -認知子表（Alzheimer’s Disease Assessment Scale-Cognitive

Subscale，ADAS-cog)至少4分之提高（參見例如winblad等人，Int J Geriatr Psychiatry 2001; 16: 653-666; Cummings J·， Am J Geriatr Psychiatry 2003; 11: ι31_145 ;及 Lanct〇4 人，CMAJ 2003; 169: 557-564)。此等結果亦已與分別經約 6個月或1年逆轉疾病過程相比較（參見例如D〇raiswamy等人，Alzheimer Dis Assoc Disord (2001) 15； 174一 183)。在美金剛之5品床试驗中’治療反應者已經預先指定為未展示整體能力惡化且無功能性或認知能力惡化之患者（參見例如

Reisberg等人，N· Engl· J. Med· 2003; 348: 1333-1341)。美金剛在服用穩定劑量之膽驗酯酶抑制劑冬尼培σ坐之患者中 127689.doc -104- 200844113 的另一試，驗，表徵美金剛為根據嚴重損害量表（s间及改進之19項阿茲海默氏症合作研究-日常生活活動清單 (ADCS-ADL19)、基於臨床醫師之訪談的變化印象加上^理者輸入（CIBIC-Plus)、神經精神病學清單（Νρι)及老年患者行為評級表（BGP監護依賴性子表）包括自基線變化之結果量測顯示優於安慰劑之效益（參見例如TaH〇t等人，jama 2004; 291:3 17-324)。美金剛之特徵進一步在於在多個sib、 ADCS-ADL19、CIBIC-P1US及NPI結果量測中產生症狀改良及穩定化之有效性（參見例如van Dyck等人，AM ; Psychiatry 14:5 (2006)) 〇 DR6拮抗劑診斷應用豕私性阿炫海默氏症（FAD)或體染色體顯性早期發作阿茲海默氏症（ADEOAD)係指通常在定義為65歲之前（通常介於20與65歲之間）的生命早期發作之阿茲海默氏症之不常見形式，其可以體染色體顯性方式遺傳。類澱粉前驅蛋白 (APP)、早老素1(PSEN1)及早老素2(pSEN2)基因之研究提供此等基因中之突變造成大多數所觀察到之ADE〇AD病例之證據（參見例如 Raux等人，Journal 〇f Medical Genetics 2〇〇5; 42:793-795)。然而，許多所觀察到之該等症候群之病例仍未獲得解釋。本文中提供之資料表明死亡受體6之多肽及/ 或聚核苷酸變體可造成FAD及/或其他神經疾病之某些病例。本發明之實施例包括測定包含SEQ ID NO: 1之死亡受體6 (DR6)多肽之變體是否存在於個體中之方法，該等方法包έ比較個體中所存在之DR6多肽的序列與SEQ ID NO: 127689.doc -105- 200844113 1，以便判定DR6之多肽變體是否出現在個體中。視情況，在該等方法中，患者患有或懷疑患有FAD及/或另一神經疾病。在此上下文中，可藉由在此項技術中熟知之多種方法分析患者樣本中之DR6多肽及/或聚核苷酸（例如以鑑別天然存在之DR6變體），該等方法包括（但不限於）臨床樣本及細胞株之免疫組織化學分析、原位雜交、RT-PCR分析、西方印跡分析，及組織陣列分析。用以評估DR6基因之序列（例 ( 如DR6 5,及3,調節序歹ij、内含子、外顯子及其類似物）及DR6 基因產物（例如DR6 mRNA、DR6多肽及其類似物）之典型方案可見於（例如）Ausubel 等人編，2007, Current Protocols In Molecular Biology，第2單元（北方印跡法）、第4單元（南方印跡法）、第15單元（免疫印跡法）及第18單元（PCR分析）中。在該等分析之說明性實施例中，自患有神經疾病或懷疑易患神經疾病之患者獲得神經元細胞，以便可藉由諸如免疫檢定、北方印跡檢定或聚核苷酸序列分析之程序分析其中表現之DR6多肽及/或mRNA序列（參見例如Lane等人， Laryngoscope. 2002; 112(7 Pt 1): 11 83-9 及 Silani 等人， Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord. 200; 2 增刊1 :S69-76)。在本發明之某些實施例中，可藉由諸如西方印跡分析之免疫檢定分析獲自患者神經元細胞（其可視情況在活體外培養中繼代）之DR6多肽（參見例如peUermann 等人，J Nenrosci· (10): 3624-3632 (1988))。或者，可藉由（例如）自患者神經元細胞中萃取之mRNA之逆轉錄酶聚合酶鏈 127689.doc -106- 200844113 反應（RT-PCR)分析來分析DR6基因之一部分或整個編碼區。在本發明之其他實施例中，自除神經元細胞以外之細胞，例如纖維母細胞或外周血液白血球獲得DR6染色體組序列，且隨後分析以測定此等染色體組序列是否編碼DR6 多肽及/或具有DR6之聚核苷酸變體（包括5’及3’調節序列變體，例如影響DR6在細胞中之表現量者）。在本發明之某些實施例中，該等分析可根據類澱粉前驅蛋白（APP)、早老素 l(PSENl)及早老素2(PSEN2)基因之分析而圖案化（參見例如 Nagasaka 等人，Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102(41):14854-9 ;及 Finckh 等人，Neurogenetics. 2005; 6(2):85-9)。篩選鑑別DR6拮抗劑之方法本發明之實施例包括鑑別所關注之抑制DR6與APP結合的分子之方法，該方法包含：在所關注之分子存在或不存在之情況下組合DR6與APP ;且隨後在該所關注之分子存在下偵測對DR6與APP結合之抑制。詳言之，使用本文中提供之揭示内容可鑑別（例如）與DR6及/或APP相互作用且抑制 DR6與APP之間的相互作用之蛋白質、小分子及其他分子。在此方法之一說明性實施例中，DR6可固定於基質上。可隨後在所關注之分子存在及不存在之情況下，觀測游離 APP(例如，經諸如發色標記、螢光標籤、放射性標記、磁性標籤或酶促反應產物等之可偵測標記加以標記之APP)結合所固定DR6之能力。APP與DR6結合之下降（例如如經由可偵測標記之含量及/或位置的變化所觀察到）可隨後用以 127689.doc -107- 200844113 鑑別分子抑制APP結合DR6之能力。在本發明之替代實施例中，APP可固定於基質上以在所關注之分子存在及不存在之情況下偵測APP結合游離DR6(例如經可偵測標記加以標記之DR6)之能力。視情況在該等實施例中，所關注之分子可為抗體。本文中提供之揭示内容允許多種用於此項技術之方案表徵諸如DR6及APP之欲用於鑑別抑制DR6與App之間的結合相互作用之分子的多肽之間的結合。本發明之該等實施例包括彼荨採用E LIS A檢定（例如如美國專利第$ 8 $ 5 5 0 8 ; 6，113,897及7,241，803號中揭示之競爭或夾層£1^八檢定）、放射免疫檢定（例如如Ausubel等人編，Current

Protocols In Molecular Biology，2007之第 ΐ〇·24單元中所揭示）、西方印跡檢定（例如如pettermann等人，j Nar〇sci (10): 3624-3632 (1988)及下文實例10中所揭示）、免疫組織化學檢定（例如下文實例ίο中所揭示）、iAsys分析及 CM-5(BIAcore)感應器晶片分析（參見例如美國專利第 6,720,1 56及7,1 01，85 1號）者。在本發明之某些實施例中，鑑別抑制DR6與APP結合的所關注分子之方法使用蛋白質微陣列。蛋白質微陣列通常使用固定於表面上確定位置處的所關注蛋白質分子（例如DR6及/或APP)且其已用以鑑別小分子結合蛋白質（參見例如Wilson等人，Curr. Opinion in

Chemical Biology 2001，6, 81-85 ;及 Zhu，H·，等人，Science 2001，293, 1201-2105)。套組及製品 127689.doc -108- 200844113 在本發明之其他實施例中，叔供含有適用於治療神麵在病之物質的製品及套組。势σ 6人摩狎‘疾 —抑a 表口口包含具有標籤之容器。適者谷态匕括例如瓶、小瓶及試田奋為可由诸如玻璃或塑料之夕種材料形成且較佳經、读片 ,—' 二减囷。容器容納具有有效治療包括阿茲海默氏症之神經疾病 ’、 τ、工戾届的活性劑之組合物。組合物之活性劑為DR6拮抗劑且釦儿^ 匕机j且較佳包含抗DR6單株抗 APP單株抗體。容器上之標飞机籤^日不、、且合物用於治療神經疾 ί i 病且亦可“活體内或活料使用之說明，諸如彼等以上所述者。製品或套組視情況進—步包括藥品說明書，其係 I曰t吊匕括於冶療產品之商業包裝中含有有關適應症、用法、劑量、投藥、禁忌症、待與封裝產物組合之其他治療產品及/或關於使用該等治療產品之警告等之資訊的用法說明書。一本發明之套組包含如上所述之容器及包含緩衝液之第二 ,、 /、可進步包括其他由商業及使用者觀點出發所需之物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭及注射器0 實例藉助於下文之實例進一步描述且說明本發明之各種態樣’該等實例不欲限制本發明之範嘴。實例1 · DR6在胚胎及成人中樞神經系統中之表現進行鼠類胚組織中TNF受體超家族表現模式之rna原位筛選。更特定言之，使用mRNA定位器套組（Ambion，目錄

號1 803)按照製造商之方案進行原位雜交實驗。dr6 cDNA 127689.doc 200844113 之以下一級序列用以產生此等實驗之RNA探針（riboprobe):

GAGCAGAAACGGCTCCTTTATTACCAAAGAAAAGAAGG

ACACAGTGTTGCGGCAGGTCCGCCTGGACCCCTGTGACT

TGCAGCCCATCTTTGATGACATGCTGCATATCCTGAACCC

CGAGGAGCTGCGGGTGATTGAAGAGATTCCCCAGGCTGA

GGACAAACTGGACCGCCTCTTCGAGATCATTGGGGTCAA

GAGCCAAGAAGCCAGCCAGACCCTCTTGGACTCTGTGT

ACAGTCATCTTCCTGACCTATTGTAGAACACAGGGGCAC TGCATTCTGGGAATCAACCTACTGGCGG(SEQ ID NO: 3) 對於RNA探針之活體外合成根據製造商之方案使用 Maxiscript套組（Ambion，目錄號 1308)。如圖2A中所示，發現在階段E10至E12(當已知神經元細胞死亡發生時之階段）在正發育之脊髓及背根神經節細胞中DR6幾乎僅由分化之神經元而非增生性祖代細胞表現。如圖2B中所示，DR6蛋白質表現於神經元之細胞體及轴突上。在圖2B中，上部兩張照片展示來自觀測DR6(左）或對照蛋白質（右）之正常小鼠之神經元。下部兩張照片相應地展示來自觀測DR6(左）或對照蛋白質（右）之DR6基因剔除小鼠之神經元。用以產生此圖中所示之資料的材料及方法如下。為觀測如（例如）圖2B中所示DR6蛋白質在感覺軸突上之表現，在 Genentech使用人類重組DR6作為免疫原產生DR6特異性小鼠單株抗體（參見下文實例3)。藉由免疫螢光進一步就此等 127689.doc -110- 200844113 抗體識別表現於細胞表孤甘肥表面上之全長小鼠及人類DR6的能力加以師選。一種稱為”RA.3"(亦稱為”3F4.8.8"mAb，且進一步描述於下文實例3及實例7中）之此抗體與人類與小 = DR6多肽交叉反應，且心觀測如圖2B中所示DR6在軸突^的表現。使用在此項技術中已知之標準方案進行免疫螢光染色程序（Nik〇laev等人，2〇〇3, CeU，丨丨以丨），29_4〇)。

為觀測DR6在軸突上之表現，使用來自W

Solutions^Axi〇Visi〇n40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)¾ 腦軟體在Axi〇plan_2 ImagingZeiss顯微鏡上拍攝照片。如圖2C中所示，DR6 mRNA由分化神經元表現。在圖中自左至右，二張照片展示對來自分別處於發育階段 E1 0.5、E11.5及E 12.5之正常小鼠的神經元之腦部掃描。用以產生此圖中所示之資料的材料及方法如下。為觀測發育小鼠胚胎中之DR6 mRNA表現，對取自ει〇·5-Ε12·5小鼠胚胎之胸軸向層面的20微米組織橫切片進行與DR6 3’UTR-特異性放射性標記RNA探針的原位mRNA雜交 (ISH)。使用mRNA定位器原位雜交套組根據如mRNA定位器使用手冊（Ambion Inc·，目錄號1803)中所概述之製造商之方案進行ISH實驗。在活體外轉譯反應中使用MAXIscript 套組根據製造商之使用手冊（Ambion Inc·，目錄號 1308-1326)產生對應於小鼠〇尺6 3’1；丁11的反義序列之放射性標記mRNA探針。使用應用於具有胚組織橫切片之載片的 Kodak Autoradiography Emulsion (Kodak)觀測 DR6 mRNA 表現貨料。使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions之 127689.doc -Ill - 200844113

AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體在 Axioplan-2 Imaging Zeiss顯微鏡上在暗視野中拍攝照片。用以產生此等實驗中之RNA探針之DR6 cDNA的一級序列如下：

GAGCAGAAACGGCTCCTTTATTACCAAAGAAAAGAAGG ACACAGTGTTGCGGCAGGTCCGCCTGGACCCCTGTGACT TGCAGCCCATCTTTGATGACATGCTGCATATCCTGAACCC CGAGGAGCTGCGGGTGATTGAAGAGATTCCCCAGGCTGA f GGACAAACTGGACCGCCTCTTCGAGATCATTGGGGTCAA GAGCCAAGAAGCCAGCCAGACCCTCTTGGACTCTGTGT ACAGTCATCTTCCTGACCTATTGTAGAACACAGGGGCAC TGCATTCTGGGAATCAACCTACTGGCGG(SEQ ID NO: 3) 使用 Allen Brain Atlas (http://www.brainatlas.org/aba/ ; Allen Brain Atlas為可公開獲得之科學資源，其提供小鼠大腦中約20,000個基因之表現圖）之進一步分析揭示DR6高度表現於成人大腦之大腦皮層中。DR6 mRNA表現（例如）於皮 ( 層神經元、海馬區CA1-CA4錐體神經元及齒狀回中。DR6 蛋白質表現於成人皮層及海馬區之神經元細胞體中。此表現模式提供DR6除在發育中之作用外亦可在與神經元細胞損失相關的神經退化性疾病之進行中起作用之證據。實例2 :在外植體培養物中RNA干擾對DR6表現之抑制預防連合神經元之轴突退化連合神經元為一群在發育階段E9.5至E11.5之間生於背 127689.doc -112- 200844113 脊射之長的投射脊椎中間神經心認為連合神經元之存依賴於其中間標革巴中之—者脊趙基板的營養支持。此依賴性在其軸突沿基板延伸時的數天長之時段期間發生，此 :卿:出其他營養要求。神經元對在進行中自其中間軸 ^標無獲得之#養支持之依賴性提供迅速消除錯誤投射神 =凡之機制，其可有助於防止在神經系統發育期間形成異吊神、工元迴路（Wang等人，Nature，401:765-769 (1999))。為研究DR6在連合神經元之軸突退化及漸進式細胞死亡 ,中之功能作用，進行基於RNAi之背脊鑛存活檢定（〖議吻專 Cell, 78.425-435 (1994);前述 Wang等人，1999)(參見圖3)。將E13大鼠或Ε11·5小鼠胚胎置於L15培養基（Gibc〇) 中，且將siRNA(IDT)連同綠色螢光蛋白（”GFP，，）編碼質體一起注入神經管中。接著藉由電穿孔將siRNA及質體傳遞至背祖細胞。剝離出背脊髓外植體、包埋入31)膠原蛋白凝膠基質中’且在具有重組軸突導向因子_丨（netrin_1)(R & d

Pharmaceuticals)及 5% 馬血清（Sigma)之 Opti-MEM/F 12培養基（Invitr〇gen)中在37°C下在5% C〇2環境中培養。在丨6小時内’回應化學引誘劑軸突導向因子_ 1，連合軸突自外植體長出進入膠原蛋白基質凝膠内（前述Kennedy等人，1994)。以GFP螢光藉由使用倒置顯微鏡觀測目測連合軸突。如圖4A中所不’在不存在獲自基板的營養因子支持之情況下培養4 8小時後，連合神經元經歷漸進式細胞死亡且其軸突退化（亦參見前述Wang等人，1999)。當連合神經元中之DR6表現受到DR6特異性siRNA分子下調時該軸突退化 127689.doc • 113- 200844113 顯著随斷（參見圖4，下圖）。在具有非靶向siRNA分子之對戶、?、實驗中並未觀察到對軸突退化之此抑制。該資料表明 DR6為撤消來自中間標靶脊髓基板之營養支持後，連合神經元輛突退化所需之重要促凋亡受體。如圖4B中所示，RNAi抗性DR6 cDNA恢復經DR6 siRNA 阻斷之退化表型。在_ 4B中自左至右，上部4張照片展示以下各物存在下之神經元：（1)對照RNAi ; (2)曝露於DR6 siRNA #3之野生型 _DR6 ; (3)曝露於DR6 siRNA #2之錯配DR6 ;及（4)曝露於 DR6 siRNA #3之錯配DR6。下部2張圖展示以下各物之放射自顯影圖：（1)在對照siRNA、siRNA#2及siRNA#3存在下之野生裂 DR6 mRNA;及（2)在對照 siRNA、siRNA#2及 siRNA#3 存在下之錯配DR6 mRNA。用以產生此圖中所示之資料的材料及方法如下。為研究 DR6受體在連合神經元之軸突退化及漸進式細胞死亡中之生理學作用，根據此項技術中已知之方案（Kennedy等人， Cell，78:425-435 (1994) ; Wang等人，Nature，401:765-769 (1999))執行背脊髓存活檢定（資料展示於圖4B中）。將El3 大鼠胚胎置於L15培養基（Gibco)中，且將以下siRNA構築體 (圖4B)注射至其神經管中：對照非靶向或靶向DR6 siRNA #2或靶向DR6 siRNA #3(IDT)連同野生型或錯配DR6 cDNA及GFP-編碼質體。將 DR6 cDNA及GFP cDNA次選殖入pCAGGS載體骨架（可購自 BCCM/LMBP)中。接著藉由電穿孔將siRNA及質體傳遞至背 127689.doc -114- 200844113 祖細胞。接著將背脊髓外植體剝離出，包埋入3D膠原蛋白凝膠基質中，且在具有重組軸突導向因子—1及5%馬血清 (Sigma)之〇pti-MEM/F12培養基（invitr〇gen)中在 37°C 下在 5% C〇2環境中培養。在16小時内，回應化學引誘劑軸突導向因子-1，連合軸突自外植體長出進入膠原蛋白基質凝膠内（Kennedy等人，Cell，78:425-435 (1994))。以 GFP螢光藉由使用倒置顯微鏡觀測目測連合軸突。在不存在獲自基板的營養因子支持之情況下培養48小時後，連合神經元經歷漸進式細胞死亡且其軸突退化（Wang等人，Nature， 401:765-769 (1999))(圖4B)。然而，可藉由引入靶向DR6特異性siRNA #3阻斷軸突退化程式（圖4B)。在恢復實驗中進一步證實DR6特異性siRNA #3對標靶之特異性效應，在該恢復實驗中藉由共表現siRNA#3抗性錯配DR6 cDNA構築體與DR6 siRNA #3恢復轴突退化表型（圖4B)。所提供之實驗證據確定自中間標靶脊髓基板取出後，DR6受體功能為連合神經元之軸突退化及死亡所需。 DR6 siRNA #2及#3(有義股）之序列及與上述檢定中所用之DR6 siRNA #3序列互補的DR6 cDNA之錯配片段如下：大鼠 DR6 siRNA #2 5f- AAU CUG UUG AGU UCA UGC CUU -3，（SEQ ID NO: 11) 大鼠 DR6 siRNA #3 5，- CAA UAG GUC AGG AAG AUG GCU -3，（SEQ ID NO: 12)

與DR6 siRNA #3序列互補的大鼠DR6 cDNA之錯配片段：5，- GGACTCTGTGTACAGTCACCTCCCAGATCTGTTATAG 127689.doc -115- 200844113 -31 (SEQ ID NO: 13)。實例3:外植體培養物中抗-DR6抗體對DR6受體信號轉導之抑制預防連合神經元之轴突退化使用抗DR6抗體進行背脊髓存活檢定（如上文實例2中所述）。採用微觀觀察（使用GFP之綠色螢光通道）目測連合軸突。根據在此項技術中已知之方案（Kennedy等人，Cell， 78:425-435 (1994); Wang等人，Nature，401:765-769 (1999)) 以上文實例2中概述之修改形式進行背脊髓存活檢定。將 GFP表現質體構築體（將GFP cDNA次選殖入可購自 BCCM/LMBP之pCAGGS載體骨架）注射至E13大鼠胚胎之神經管中。接著藉由電穿孔將GFP表現質體傳遞至背祖細胞。平孤接種24小時後，以40 gg/ml將抗DR6阻斷抗體或對照正常小鼠IgG添加至連合外植體中。平皿接種48小時後如下文所概述拍攝連合外植體之照片。為觀測GFP表現連合軸突，在Axiovert 200 Zeiss倒置顯微鏡（在GFP之綠色螢光通道中）上使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP 1(03/2006)電腦軟體拍攝照片。用於此實驗之抗DR6抗體如下產生。將與Fc融合之人類DR6胞外域序列（hDR6-ECD-Fc)用作免疫原以產生抗DR6小鼠單株抗體。所用hDR6-ECD-Fc免疫原之序列如下：

MGTSPSSSTALASCSRIARRATATMIAGSLLLLGFLSTTTAQ

PEQKASNLIGTYRHVDRATGQVLTCDKCPAGTYVSEHCTN 127689.doc -116- 200844113

TSLRVCSSCPVGTFTRHENGIEKCHDCSQPCPWPMIEKLPC

AALTDRECTCPPGMFQSNATCAPHTVCPVGWGVRKKGTE

TEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAYTDCLSQNLVVIKP

GTKETDNVCGTLPSFSSSTSPSPGTAIFPRPEHMETHEVPSS

TYVPKGMNSTESNSSASVRPKVLSSIQEGTVPDNTSSARG

KEDVNKTLPNLQVVNHQQGPHHRHILKLLPSMEATGGEK

SSTPIKGPKRGHPRQNLHKHFDINEHLPWMIPDKTHTCPPC

PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED

PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL

HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY

TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN

NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:4) 使用先前描述之免疫黏附素方案產生融合多肽 (Ashkenazi 等人，Curr Opin Immunol” 9(2):195-200 (1997) ; Haak-Frendscho等人，J Immunol·，152(3):1347-53 (1994))。藉由經約8週之時程注射100 μΐ hDR6-ECD-Fc免疫原（1毫克/動物）免疫9週齡Balb/c小鼠。接著使所有經免疫小鼠之淋巴結（11 xlO6個細胞/毫升，5 ml)與5 χΙΟ6個細胞/毫升之濃度，5 ml之PU.1骨髓瘤細胞（來自ATCC之鼠類骨髓瘤細胞）融合。將細胞以2x1 06個細胞/毫升平jBi接種於4個板中。使用捕獲ELISA就融合瘤與如上所述之hDR6-ECD-Fc多肽結合的特異性篩選融合瘤。在4°C下，以50 μΐ之2 gg/ml Fc 127689.doc -117- 200844113 特異性山羊抗人類IgG(Cappel目錄號55〇71)塗佈平板隔夜。以PBS加上Brij將平板洗滌3次，且在室溫下以200 μΐ 2% BSA阻斷平板1小時。接著以PBs加上Brij將平板洗滌3次。隨後’在震盪器上以1〇〇微升/孔〇·4 pg/ml之免疫黏附素培育平板1小時。接著以PBS加上Brij將平板洗滌3次。將100 μΐ 第一抗體添加至各孔，在震盪器上培育1小時。再次以PBS 加上Brij將平板洗滌3次。1〇〇 μι之1:1000綿羊抗小鼠IgG HRP(與人類無交又，Cappel目錄號55569)抗體1小時。以pBS 加上Brij將平板洗滌3次。添加5〇 μ1底物（TMB微孔過氧化物 S# KPL #50-76-05)且培育平板5分鐘。以50微升/孔終止溶液 (KPL #50-85-05)終止反應。在450 nm下讀取吸光率。所用檢定緩衝液含有PBS、5% BSA及0.05°/。吐溫20。接著藉由限制稀釋法（含有10% HCF、10% FCS之SCDME 培養基）選殖在捕獲ELISA檢定中測試與hDR6-ECD-Fc多肽之結合顯陽性之融合瘤。1 〇天後，取出平板且藉由如上所述之捕獲ELIS A檢定具有一個群落之孔。接著同型測試各種所選單株抗體，且其經展示為IgGl同型。接著在背脊髓存活檢定中測試鑑別為”3Β11.7 7Π ; ”3Ρ4·4·8” ； ”4Β6·9,7” ；及” 1Ε5.5·7”之 4 個抗 DR6 mAb 的阻斷軸突退化之能力。驚人的是，此等抗DR6 mAb中之某些（3F4.4.8 ; 4Βό 9 7 · 及1Ε5·5·7)能夠部分抑制由在培養物中營養剝奪料小時誘發之連合神經元之轴突退化（參見圖5 )。咸信該等抗體可（例如）藉由阻斷推測DR6配位體與DR6受體之間的相互作用或 127689.doc •118- 200844113 藉由抑制配位體獨立型DR6信號轉導促進神經元存活。 3B11.7.7 DR6抗體在誘發軸突退化中具有輕微刺激效應。實例4 : JUN N末端激酶（JNKI)之特異性肽抑制劑對DR6受體信號轉導之抑制已報導DR6受體經由活化JNK傳導信號，且在DR6缺乏小鼠模型中觀測到JNK活性受損（Pan等人，FEBS Lett·， 43 1:35 1-356 (1998) ; Zhao等人，Journal of Experimental Medicine，第 194卷，1441-1441，2001))。為研究DR6-JNK 信號轉導在軸突退化中之作用，進行背脊髓存活檢定（如上文實例2中所述），其例外為藉由使用1 μΜ濃度之肽抑制劑 L-JNK-I((Z)-HIV-TAT48-57-PP-JBD20 ; Calbiochem)阻斷連合神經元中之JNK信號轉導途徑。測試DMSO(SIGMA)及正常小鼠IgG作為對照。如圖6中所示，在背脊髓存活檢定中JNK信號轉導之此抑制部分阻斷軸突退化。該資料表明DR6至少部分經由JNK途徑傳導軸突過程退化之信號。實例5 :在小鼠胚胎脊髓中抗DR6抗體對DR6受鱧信號轉導之抑制預防神經元細胞死亡在全胚胎培養系統中進行DR6信號轉導經抗DR6 mAb阻斷之檢定。下文所述之此系統允許在小瓶中自發育階段 E9.5至E11.5活體外培養全小鼠胚胎2天。自卵黃囊與胚胎連接之子宮中剝離出E9.5胚胎，且第一天在65%氧環境中在 100%大鼠血清（Harlan)中培養且第二天在37 °C下在95%氧中培養。在檢定中以10 pg/ml之最終濃度添加抗DR6 127689.doc -119- 200844113 mAb(上文實例中所述），且將濃度為1〇 gg/mi之正常小鼠 IgG抗體用作對照。使用利用識別已裂解卡斯蛋白酶_ 3之抗體（針對小鼠裂解卡斯蛋白酶·3之抗體，購自R&D Systems)的免疫螢光染色偵測且顯微鏡觀察凋亡細胞。結果說明於圖7中。驚人的是，在此系統中抗DR6 mAb 3F4.4.8 ; 4B6.9.7 ;及 1Ε5·5.7 對DR6之抑制保護脊髓神經元免於天然存在之發育細胞死亡。實例6 : DR6缺乏小鼠中神經元細胞死亡減少分析發育階段Ε15·5時DR6基因剔除胚胎（Zha〇等人， Journal of Experimental Medicine^ ^1944 ^ 1441-1441, 2001)之表型。裂解卡斯蛋白酶3為凋亡細胞之標記，且為研究胚胎脊髓中神經元細胞死亡之程度，使用對裂解卡斯蛋白酶3的免疫染色（針對小氣裂解卡斯蛋白酶的抗體，購自R&D Systems)。亦研究DR6異源同窩同伴作為對照。將經多聚甲酸（PFA)固定之胚胎組織切片在阻斷溶液（2%加熱失活之山羊灰清（Sigma)/PBS(Gibc〇)/〇 1%曲通中阻斷1小時，且在下在阻斷溶液中以初級抗體（小鼠裂解卡斯蛋白酶-3之抗體的1:5〇〇稀釋液，購自R & d 培月隔仪。在室溫下以阻斷溶液將切片洗滌3次，歷時i小時，且在室溫下以二級抗體（山羊抗兔Alexa 488之丨：5〇〇稀釋液，分子探針，Invitr〇gen)培育丨小時。接著在室溫下以阻斷溶液將切片洗· !小時，且以免疫螢光在綠色通道中觀測。 127689.doc -120- 200844113 將每個胚胎每個脊髓切片中卡斯蛋白酶3陽性核之數目量化（參見圖8及9A)。與DR6雜合仔畜對照相比，在^^^缺乏小鼠脊髓及背根神經節（nDRGn)中偵測到神經元細胞死亡減少約40至50%(圖8及9A)。因此，咸信DR6信號轉導可在活體内發育神經系統中促進神經元細胞死亡。如圖9B中所示，如以DR6缺乏小鼠所證實，DR6為運動軸突退化所需。在大腦衍生之神經營養因子（BDNF)及神經營養蛋白3(NT-3)(BDNF及NT-3，獲自Chemic〇n)存在及不存在之情況下，分析發育階段E13.5之正常以及DR6基因剔除胚胎（Zhao 等人，Journal 〇f Experimental Medicine，第 194 卷，1441-1441,2001)之腹側脊髓外植體（運動神經元）。在圖9B中’左上圖展示在BDNF及NT-3存在下正常小鼠之腹側脊鏞外植體，而左下圖展示在BDNF&NT_3存在下 DR6基因剔除（κ〇)小鼠之腹側脊髓外植體。類似地，右上圖展不不存在此等生長因子之情況下正常小鼠之腹側脊髓外植體，且右下圖展示不存在此等生長因子之情況下DR6 基因剔除（KO)小氣之腹側脊髓外植體。用以產生此圖9B中所示之資料的材料及方法如下。如 Henderson等人，Nature，363:26卜27〇 (1993)中所述以數處改進進行運動神經元腹側脊髓存活檢定。使用酒精處理之剪刀剝離出DR6雜合或DR6缺乏小鼠£135胚胎且將其置於 =熱L15培養基（Gibc〇)中。使用相同剪刀及鑷子，打開胚，I側區域，移除杰官，切掉肋骨且剝離出全脊髓，隨後以鑷子移除周圍腦脊膜組織。移除頂板且獲得脊髓之書 127689.doc -121 - 200844113 頁狀製備物。分離包括MMC及LMC運動管之脊髓之腹側一半且謹慎切除剩餘基板組織。以已在L15中塗佈之黃色尖嘴轉移腹側脊髓至新的小碟w/L15 + 5% FBS(Sigma)血清中以便使用鎢針進一步切為外植體。以每孔500 μΐ神經基質培養基（invitrogen)加上5〇 ng/ml 各重組BDNF及NT-3 Chemicon)、加上B-27補充劑χ5〇 (Invitrogen);加上青黴素鏈黴素麩胺醯胺χι〇〇(目錄號 10378-016 ; Gibco)加上葡萄糖XI 〇〇填充經PDL/層黏連蛋白塗佈之8孔載片（Becton，Dickinson and Company)。將經切片之腹側脊魏外植體置於各孔（每孔2 - 3個外植體）中且置於3 7 C培養室中48小時以便生長。兩天後，如下進行營養因子剝奪：取走舊培養基且以神經基質培養基（無營養因子）將孔溫和洗務兩次。以20 pg/ml添加預先加熱之神經基質培養基/β·27 (Invitr〇gen)(如上所述製備，無營養因子）加上抗bDNF及抗 NT3阻斷抗體（Genentech，Inc,)。接著在37°C下將具有外植體之載片再培育24-48小時。 2天後，將外植體在於PBS中之4% PFA中固定，在〇〇c以於（Nikolaev專人，2003，Cell，112(1)，29-40)網狀凝膠中之 0.2%曲通滲透1〇分鐘且以網狀凝膠洗滌兩次。為阻斷非特異性結合部位，在4°C下將載片在於PBS中之l〇/〇 BSA中培育隔夜。為觀測正退化之運動軸突，第二天進行利用抗 p75NTR特異性抗體（1:5〇〇稀釋液，chemicon)之免疫染色 (在4°C下於1% BSA/PBS中初級Ab 1:500隔夜，在室溫下二 127689.doc -122- 200844113 級Ab 1:500 1小時）。將各孔取出，且使用Flu〇r〇m〇仙卜〇安裝載片與蓋玻片。為觀測表現p75NTR之運動軸突，使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 Axi〇Visi〇n40 Release 4·5·0·0 SP1(03/2006)電腦軟體在 Axi〇phhe-2 Imaging zeiss 顯微鏡上拍攝照片。如圖9C中揭示之資料所展示，DR6基因剔除小鼠中損傷誘發之退化延遲。在圖9C中自左至右，上部4張圖展示在神經生長因子 (NGF)存在下；及分別損傷4、8或16小時後正常小鼠之神經元。在圖9C中自左至右，下部4張圖自左至右展示在外源神經生長因子（NGF)存在下；及分別損傷4、8或16小時後DR6 KO小鼠之神經元。如圖9C中所示之活體外感覺軸突病變檢定如下進行。剝離出DR6雜合或DR6缺乏小鼠E12.5胚胎且將其置於溫熱 L15培養基（Gibco)中。使用相同剪刀及鑷子，打開胚胎之腹側區域，移除器官，切掉肋骨且以鑷子剝離出與脊髓連接之背根神經節（DRG)。接著以黃色尖嘴將已在L15中塗佈之DRG轉移至新的小碟w/L15 + 50/〇 FBS(Sigma)血清中以便使用鶴針進一步切為1 /4 DRG外植體。以每孔500 μΐ神經基質培養*(Invitr〇gen)加上5〇 ng/ml NGF(Roche Molecular Biochemicals)、加上 B-27補充劑 X50 (Invitrogen);加上筆狀長條麩胺醯胺χι〇〇 ;加上葡萄糖 XI00填充經PDL/層黏連蛋白預先塗佈之塑料8孔載片 (Becton，Dickinson及Company)。將經切片之drg外植體置 127689.doc -123- 200844113 於各孔（每孔2-3個DRG外植體）中且置於37°C培養室中48小時以便生長。2天後，如下進行軸突病變檢定··藉由恰在DRG 外植體上方或恰在下方以微刀（Fine science Tools)對感覺轴突作兩個平行切口誘發損傷。Drg外植體左邊及右邊之未切口軸突充當内源性無病變對照。損傷〇、4、8、1 6及24 小時後在於PBS中之4% PFA中固定具有切口 DRG外植體之載片、在0 °C下經網狀凝膠（Nikolaev等人，2003，Cell， 112(1)，29-40)中之〇·2。/。曲通滲透1〇分鐘，且以網狀凝膠洗務兩次。為阻斷非特異性結合部位，在4它下將載片在於pb s 中之1% BSA中培育隔夜。為觀測正退化之感覺軸突，第二天進行利用神經元類別III β_微管蛋白（TUJ1)特異性抗體 (1:500稀釋液，Covance)之免疫染色（在4。(：下1% BSA/PBS 中一級Ab 1:500隔夜，在室溫下二級Ab 1:500 1小時）。將各孔取出，且使用Fluoromount-G安裝載片與蓋玻片。為觀測經免疫螢光標記之感覺軸突，使用來自Cari Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體在 Axioplthe-2 Imaging Zeiss 顯微鏡上拍攝照片。實例7 :抗DR6抗體拮抗劑抑制神經元退化如圖10A中所示，抗DR6抗體抑制各種營養因子剝奪的神經元之退化（以軸突退化之檢定）。在圖10A中自左至右，上部及下部之前2張照片展示連合神經元之資料。在此等前4張照片中，上部兩張照片分別展示在對照IgG及RA.5 DR6抗體存在下之連合神經元，而下 127689.doc -124- 200844113 4兩張照片分別展示在RA1 DR6抗體及ra.3 dr6抗體存在下之連合神、經元。圖10A中上部及下部之巾間兩張照片展不感覺神經元之資料。在此等中間4張照片中，上部兩張照片分別展示在NGF存纟及不存在之情況下之感覺神經元，而下部兩張照片分別展示不存在NGF但存在rai dr6抗體及RA.3 DR6抗體情況下之感覺神經元。圖1〇A右側上之兩張上部及下部照片展示運動神經元之資料。在此等右側4 張照片中，上部兩張照片分別展示在生長因子存在及不存在之情況下之運動神經元，而下部兩張照片分別展示不存在生長因子但存在RAJ DR6抗體及RA.3 DR6抗體情況下之運動神經元。用以產生此圖中所示之資料的材料及方法如下。藉由以如上文實例3中所述之DR6胞外域免疫小鼠產生小鼠單株 RA· 1 -RA.5 DR6抗體。在此實例及圖中稱作，，RA,丨”及”RA 3，，抗體之DR6抗體分別為實例3中所述之”ιε5·5 7，，及 ”3卩4.4_8”抗體（例如使用替代命名法簡單提及）。類似地，在此實例及圖中提及之，’RA.5”抗體為實例3中所述之 "3B 11 ·7·7Π抗體（例如已使用替代命名法提及）。如上文實例2及實例6中所述以如下修改形式進行感覺、運動及連合外植體培養。對於連合外植體存活檢定，平孤接種24小時後將DR6抗體RA· 1或RA.3或對照igG以20微克/ 宅升最終濃度添加至連合外植體培養物中（圖1 〇A)。對於感覺外植體培養物，平m接種48小時後進行NGF剝奪檢定。平皿接種48小時後，將無NGF但具有NGF阻斷抗體 127689.doc -125- 200844113 (Genentech，Inc.)之新鮮神經基質培養基與所指示DR6抗體 (RA.1或RA.3)或對照igG—起以20微克/毫升最終濃度添加至感覺外植體培養物中（圖1〇Α)。對於運動外植體培養物，平孤接種48小時後進行營養因子剝奪檢定。平皿接種48小時後，將無NT3/BDNF但具有BDNF阻斷及NT3阻斷抗體（功能阻斷營養因子mAb，Genentech，Inc·)之新鮮神經基質培養基與所指示DR6抗體（RA.1或RA.3)或對照IgG—起以20 微克/宅升最終濃度添加至感覺外植體培養物中（圖1〇A)。為觀測經由以抗 TUJl(Covance)及抗 p75NTR (Chemicon/ Millipore)抗體免疫螢光染色標記之感覺及運動軸突，因此在Axioplan-2 Imaging Zeiss顯微鏡上使用來自 Carl Zeiss

Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP 1(03/2006)電腦軟體拍攝照片。為觀測GFP表現連合軸突，在Axiovert 200 Zeiss倒置顯微鏡（在GFP之綠色螢光通道中）上使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions之 AxioVision40 Release 4·5·0·0 SP 1(03/2006)電腦軟體拍攝照片。如圖1 0B中所示，抗DR6抗體抑制各種營養因子剝奪神經元之退化（在正凋亡細胞體之檢定中經由TUNEL染色）。在圖10B中由左側起始，兩張上部及下部照片展示連合神經元之資料。在此等前4張照片中，上部兩張照片分別展示在對照IgG及RA· 5 DR6抗體存在下之連合神經元，而下部兩張照片分別展示在RA.1 DR6抗體及RA.3 DR6抗體存在下之連合神經元。圖10B中中間組之兩張上部及下部照片展示感 127689.doc -126- 200844113 覺神經元之資料。在此等中間4張照片中，上部兩張昭片分別展示在NGF存在及衫在u 刀廿牡< ^況下之感覺神經元，而下部兩張照片A別展示不存在卿但存在RAl⑽抗體及 RA.3 DR6抗體情況下之感覺神經元。圖丨⑽右側上之兩張上部及下部照片組展示運動神經元之資料。在此等右側4 張照片中’上部兩張照片分別展示在生長因子存在及不存在之情況下之運動神經元，而下部兩張照片分別展示不存在生長因子但存在RA」DR6抗體及RA 3 DR6抗體情況下之運動神經元。圖1 〇之揭示内容表明對於D R 6在軸突退化中之功能配位體可起重要作用。用以產生此圖中所示之資料的材料及方法如下。如上所述，藉由以如上文實例3中所述之DR6胞外域免疫小鼠產生小鼠單株RA· 1-RA.5 DR6抗體。如上文實例2及實例6中所述以如下概述之修改形式進行感覺、運動及連合外植體培養。對於連合外植體存活檢定，如上文實例3中所述，平盟接種24小時後將DR6抗體尺尤丨及尺八^、抗體RA 5(或者稱為 ’’1B11.7.7”，Genentech，Inc·)或對照 IgG(Genentech，—）以 2〇彳政克/笔升最終濃度單獨添加至連合外植體培養物中（圖 1 0B，左）。對於感覺外植體培養物，平皿接種48小時後進行NGF剝奪檢定。平皿接種48小時後，將無NGF但具有NGF阻斷抗體（Genentech，Inc·)之新鮮神經基質培養基與DR6抗體RA. i 或RA.3或對照lgG(Genentech，Inc·)—起以2〇微克/毫升最終 127689.doc -127- 200844113 濃度添加至感覺外植體培養物中（圖1 〇B，中間）。對於運動外植體培養物，平皿接種48小時後進行營養因子剝奪檢定。平皿接種48小時後，將無NT3/BDNF但具有BDNF阻斷及NT3阻斷抗體（功能阻斷營養因子mAb，Genentech，Inc.) 之新鮮神經基質培養基與RA.1或RA.3或對照IgG (Genentech，Inc·)—起以20微克/毫升最終濃度添加至感覺外植體培養物中（圖1 0B，右）。將外植體於4%PFA/PBS中固定且經處理以便基於DNA股斷裂之標記（穿隧技術）使用原位細胞死亡偵測套組（目錄號 1 1 684 795 910，Roche)根據製造商之使用手冊（R〇che)在單細胞層面偵測細胞凋亡。藉由螢光顯微鏡術分析連合、感覺及運動外植體培養物之細胞體中的細胞凋亡（圖丨0B)。為觀測螢光標s己之穿随陽性細胞周亡細胞體，在Axi〇plan-2 Imaging Zeiss顯微鏡（在紅色螢光通道中）上使用來自carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SPl(03/2006)電腦軟體拍攝照片。實例8 : DR6免疫黏附素拮抗劑抑制神經元退化如圖11A中所示，hDR6-ECD-Fc使連合軸突退化延遲。用於此檢定之hDR6-ECD-Fc免疫黏附素蛋白質如以上實例3 中所述。在圖11A中自左至右，第一張照片提供展示在48小時時連合軸突退化的對照。第二張照片展示在3〇 pg/ml hDR6-ECD-Fc存在下48小時時之連合軸突退化。第三張照片展示在10 pg/ml hDR6-ECD-Fc存在下在48小時時之連合 127689.doc -128- 200844113 軸突退化。用以產生此圖中所示之資料的材料及方法如下。如上實例2_6中所述製備且進行連合外植體培養物及存活檢定。用於此檢定之hDR6-ECD-Fc免疫黏附素蛋白質序列如以上實例3中所述。為觀測經GFP標記之連合軸突，在Axiovert 200 Zeiss倒置顯微鏡（在GFP之綠色螢光通道中）上使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SPl(03/2006)電腦軟體拍攝照片。如圖1 IB中所示，hDR6-ECD-Fc延遲經神經生長因子 (NGF)撤消誘發之感覺軸突退化。在圖丨1B中自左至右，上部三張照片分別展示在對照Fc存在下在〇、6及24小時之剝奪NGF之感覺神經元，而下部三張照片分別展示在DR6-Fc 構築體存在下在0、6及24小時之剝奪NGF之感覺神經元。圖11中提供之揭示内容提供配位體對於DR6在軸突退化中之功能可起重要作用之進一步提示。用以產生此圖中所示之資料的材料及方法如下。為研究配位體是否為DR6在感覺軸突退化中之功能所需，如下進行感覺軸突生長及退化之間隔培養物分析。使用肯佩諾 (Campenot)神經細胞腔室系統以自不同隔室（獨立流體環境）中之細胞體分離神經突出（軸突），該等細胞體與將轴突投射至另一位置中之遠端標靶的神經系統之一個位置中的神經元細胞體類似。如最初Campenot(Campenot等人，j Neurosci. 11(4): 1126-39 (1991))所述以以下修改形式進行檢定。簡言之，如（例如）前述Campenot等人之圖1及4中所 127689.doc -129- 200844113 說明以PDL/層黏連蛋白塗佈35 mm組織培養皿且以大頭把 (Tyler Research)刮擦以產生軌道。將一滴培養基（具有B27補充劑、25 ng/ml NGF及4 g/L甲基纖維素之神經基質培養基）置於經刮擦之底層。將鐵氟龍 (Teflon)分隔器（Tyler Research)固定在聚矽氧潤滑脂上，且將少量聚矽氧潤滑脂置於中心縫之口處。將獲自E12 5小鼠 DRG之解離感覺神經元懸浮於經甲基纖維素稠化之培養基中且裝填入裝備有22號針之拋棄式無菌注射器中。在解剖顯被鏡下將此細胞懸浮液注入各間隔培養皿之中心縫中。允奔神經元靜置隔仪。以含有甲基纖維素之培養基填充培養皿之外部周邊（細胞體隔室）及内部軸突隔室。活體外3-5 天内，如（例如）前述Campenot等人之圖1及4中所說明軸突開始出現在左及右隔室中。為觸發局部軸突退化，以具有NGF阻斷抗體（抗NGF， Genentech，Inc·，20pg/ml)之神經基質培養基取代來自軸突隔室之含NGF培養基。NGF剝奪0小時、6小時或24至48小時後，在室溫下將感覺神經元於4% PFA中固定30分鐘且加工以便以軸突標記TUJ-1 (Covance，1:500稀釋液）免疫螢光染色以藉由營光顯微鏡術觀測正退化之軸突（圖11B)(如以上實例7中所述）。為觀測肯佩諾腔室之軸突隔室中經免疫螢光標記之感覺轴突，在Axioplan-2 Imaging Zeiss顯微鏡上使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 Axi〇Vision40 Release 4.5·0·0 SP 1(03/2006)電腦軟體拍攝照片。為研究配位體是否為DR6在由NGF撤消觸發之軸突退化 127689.doc -130- 200844113 程式中之功能所需，在肯佩諾腔室之軸突隔室中包括30 pg/ml hDR6-ECD-Fc免疫黏附素蛋白質（上文實例3中所述）或 30 pg/ml對照 Fc(Genentech，Inc.)連同抗 NGF處理。NGF 剝奪0至24小時後，以4% PFA/PBS將肯佩諾腔室中之軸突固定且藉由以TUJ-1(1:500，Covance)/與螢光基團Alexa 488 接合之二級抗體（Molecular Probes，BD)免疫螢光染色加以觀測（圖11B)。如圖11B中所示，NGF剝奪觸發軸突退化之明顯圖案。顯著地，在此系統中hDR6-ECD-Fc免疫黏附素蛋白質之添加延遲軸突退化之發作（圖11B，下圖）。因此，此等資料提示可溶性配位體可為DR6受體在藉由生長因子移除誘發之局部軸突退化中之功能所需。實例9 : NGF剝奪後DR6配位體結合部位自轴突之脫落如圖12A及12B中所示，使用DR6-AP構築體來顯現感覺軸突上之DR6結合部位。在圖12A中自左至右，上部兩張照片展示在NGF存在下在 48小時使用DR6-AP構築體使處於發育階段E12.5的感覺軸突上之DR6結合部位顯現以分別在低及高放大倍數下觀測此等軸突，而下部兩張照片展示使用AP對照構築體分別在低及高放大倍數下觀測感覺軸突。如圖12B中所示，NGF剝奪後DR6配位體結合部位自感覺軸突損失。在圖12B中自左至右，上部兩張照片展示感覺軸突上DR6 結合部位之觀測，其中第一張照片展示在NGF及ΒΑΧ抑制 127689.doc -131 - 200844113 劑存在下之感覺神經元，而第二張照片展示在NGF存在下之Bax缺乏感覺神經元。下部兩張照片分別展示：不存在 NGF但存在ΒΑΧ抑制劑情況下之感覺神經元；及不存在 NGF情況下之Bax缺乏感覺神經元。在神經營養蛋白存在及不存在之情況下，在運動軸突中觀測到等效結果。用以產生圖12A及12B中所示之資料的材料及方法如下。藉由將小鼠DR6胞外域融合至人類胎盤鹼性磷酸酶 (DR6-AP)，使用pRK5-AP選殖載體產生DR6-AP構築體（參見例如 Yan等人，Nature Immunology 1，37-41 (2000))° PRK5 親本選殖載體可獲自Becton，Dickinson and Company， Pharmingen部門。用以產生DR6-AP融合蛋白之鼠類DR6胞外域序列如下： MGTRASSITALASCSRTAGQVGATMVAGSLLLLGFLSTIT AQPEQKTLSLPGTYRHVDRTTGQVLTCDKCPAGTYVSEHC TNMSLRVCSSCPAGTFTRHENGIERCHDCSQPCPWPMIERL PCAALTDRECICPPGMYQSNGTCAPHTVCPVGWGVRKKG TENEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAHTDCLGQNLEV VKPGTKETDNVCGMRLFFSSTNPPSSGTVTFSHPEHMESH DVPSSTYEPQGMNSTDSNSTASVRTKVPSGIEEGTVPDNTS STSGKEGTNRTLPNPPQVTHQQAPHHRHILKLLPSSMEATG EKSSTAIKAPKRGHPRQNAHKHFDINEH(SEQ ID NO: 14) 先前已描述（Deckwerth 等人，Neuron，第 17卷，401-411， 1996)Bax缺乏小鼠品系（Bax-Rl)且其獲自傑克遜實驗室 (Jackson Laboratories)。使用10 μΜ之ΒΑΧ抑制性肽以阻斷 127689.doc -132- 200844113 神經元細胞死亡（Bax-V5，Tocris Inc)。為產生小鼠DR6胞外域-AP融合蛋白（DR bv6-AP)，根據製造商之方案以15微克DR6-AP融合表現構築體使用 FuGene轉染試劑（Roche)轉染於 DMEM/10% FBS (Gibco)培養基中培養之COS-1細胞。轉染12小時後，將COS-1細胞培養基改變為OPTI-MEM (Invitrogen)。轉染48小時後，收集且過濾含有DR6-AP蛋白質之COS-1細胞條件培養基。培養基中DR6-AP蛋白質之量如下量化：將100微升2XAP緩衝液（藉由添加1 00 mg對-硝基笨基碟酸鹽（Sigma)及 15微升 1M MgCl2至 15 ml 2M二乙醇胺 pH 9.8 中製備）與等體積之經轉染COS細胞條件培養基或來自未轉染COS-1細胞之對照條件培養基混合。使反應之顏色顯影 12-15分鐘，其中O.D.在線性範圍（0.1-1)内。隨後藉由添加 800微升蒸餾水調節反應之體積，且在405 nm吸光率波長下量測O.D.。根據下式（100微升）計算nM濃度：C (111^) = 〇.〇./10〇\(60/顯影時間）/3 0。對於原位DR6-AP感覺軸突結合檢定，如上文實例7_8中所概述在具有50 ng/ml NGF(Roche)之神經基質培養基/B27 (Invitrogen)中培養野生型或Bax缺乏感覺外植體。平皿接種後2天，DRG外植體不加以處理或如上實例7-8中所述剝奪 NGF。在圖12B上所指示處添加Bax抑制性肽（1〇 μΜ， Bax-V5, Tocris)。NGF剝奪後12小時，以結合緩衝液（HBSS， Gibco 目錄號：14175-095，具有 0.2% BSA、0.1% NaN3、5 mM CaCl2、1 mM MgCl2、20 mM HEPES，ρίΚ.Ο)將 DRG 夕卜植體 127689.doc -133 - 200844113 洗滌兩次。接著藉由製備DR6-AP條件培養基與結合緩衝液 (或對照AP條件培養基與結合緩衝液）之1:1混合物進行AP 結合檢定，將該混合物直接應用至8孔培養載片（Becton， Dickinson and Company)中之DRG外植體且在室溫下培育 9 0分鐘。培育後，藉由以結合緩衝液將DRG外植體沖洗5次洗去未結合DR6-AP蛋白質。接著在室溫下以在PBS中稀釋之3.7% 甲醛將DRG外植體固定12分鐘。藉由以HBS緩衝液（20 mM HEPES ρΗ=7·0，150 mM NaCl)沖洗DRG夕卜植體3次移除剩餘甲醛。藉由在65 °C下在HBS緩衝液中加熱失活30分鐘阻斷内源性AP活性。接著在AP反應緩衝液（100 mM TRIS pH=9.5，100 mM NaCl，50 mM MgCl2)中將 DRG外植體沖洗3次。接著藉由在室溫下在AP反應緩衝液中以1/50(體積）NBT/BCIP儲備溶液（Roche，目錄號168145 1)使對0110外植體之染色顯影隔夜使與感覺軸突結合之DR6-AP融合蛋白可見（圖12A及B)。在平行對照實驗中，將來自經AP-轉染之COS細胞之條件培養基用於AP軸突結合檢定（圖12A，下圖）。如圖12B中所見，NGF剝奪後DR6-AP結合部位自感覺軸突表面損失，此提示營養剝奪後DR6配位體釋放入軸突條件培養基中。如圖12C中所示，處於發育階段E1 2.5之ΒΑΧ缺乏感覺軸突之研究展示β分泌酶（BACE)抑制劑可阻斷NGF撤消後 DR6-AP結合部位自感覺軸突之消失。在圖12C中自左至 127689.doc -134- 200844113 右，上部三張照片展示分別在DMSO對照；OM99-2(BACE-I 抑制劑）及TAP 1 (α分泌酶-I抑制劑）存在下之此等神經元。下部照片展示在NGF存在下之此等神經元。用以產生此資料之小鼠DR6胞外域-ΑΡ融合蛋白係如上所述。先前已描述（Deckwerth等人，Neuron，第17卷， 401-411，1996)Bax缺乏小鼠品系（Bax-Rl)且其獲自傑克遜實驗室（Jackson Laboratories)。如上圖12A及12B所述進行 DRG外植體培養及DR6-AP軸突結合檢定。該檢定中BACE 抑制劑以1 μΜ最終濃度使用（InSolution OM99-2, Calbiochem/Merck)。該檢定中α分泌酶抑制劑TAPI以1 0 μΜ 最終濃度使用（TAPI-l，Calbiochem)。為觀測DR6-AP-陽性感覺軸突（經上文實例9中概述之AP比色染色反應染色），在 Axioplan-2 Imaging Zeiss 顯微鏡上使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體拍攝明視場照片。實例10:類澱粉前驅蛋白（APP)為DR6之同源配位體如圖13中所示，發現N-APP為DR6胞外域相關之配位體。在圖13A中自左至右，前2個印跡提供在生長因子存在及不存在之情況下（及在Bax抑制劑存在下）使用DR6-AP構築體探測獲自感覺及運動神經元之蛋白質的研究之資料。在此等印跡中，在剝奪生長因子（且在Bax抑制劑存在下）之感覺與運動神經元中均觀察到在約35kDA包括強條帶之APP多肽。圖13 A之中心印跡展示以獲自剝奪生長因子之感覺神經元的多肽之抗N-APP抗體探針相應地觀察到在約35kDA包 127689.doc -135- 200844113 括強條帶之APP多肽。以1:100稀釋度用於西方印跡法實驗之多株抗N-APP抗體獲自Thermo Scientific^目錄號 RB-9023-P1)。以 10 μΜ 使用 Bax 抑制劑肽 P5(Tocris Biosciences，目錄號1786，Bax易位至線粒體之細胞可滲透合成肽抑制劑）。由圖1 3 A之右側中展示之印跡提供的資料進一步證實 APP為DR6胞外域相關配位體之觀測結果。使用通用拉下 (pull down)方案（例如 Nikolaev 等人，2004，BBRC，323, 12 16-1222)以在剝奪NGF的條件下自收集自肯佩諾腔室之軸突隔室之感覺轴突條件培養基純化DR6-ECD胞外域相關因子。在4°C下，在以下條件下以50 ml感覺軸突條件培養基將DR6-ECD-His胞外域（下文所述之構築體）偶合之 NiNTA 珠粒（Sigma)培育隔夜：150 mM NaCl、0·2°/〇 NP-40(Calbiochem)、lxPBS緩衝液。接著以10倍過量之結合緩衝液（1 xPBS 緩衝液中 150 mM NaCl、0.2% NP-40 (Calbiochem))將 DR6-ECD-His 胞外域偶合之 NiNTA 珠粒 (Sigma)洗務5次，且以lxSDS上樣緩衝液（Invitrogen)溶離出 DR6-ECD相關蛋白質複合物，接著經由凝膠電泳分離且以抗N-APP抗體探測。來自此DR6-ECD釣餌實驗之資料相應地鑑別在約35kDA包括強條帶之APP多肽。根據先前描述之方案進行軸突條件培養基之DR6-AP印跡檢定（Pettmann等人，1988, J· Neurosci.，8(10):3624-3632) 〇用於西方印跡法實驗之多株抗N-APP抗體獲自Thermo Scientific^目錄號RB-9023-P1)。所用小鼠DR6胞外域-AP融 127689.doc -136- 200844113 合蛋白係描述於上文實例9中。表現小鼠重組DR6-ECD-His 且隨後自CHO細胞培養物純化。鼠類DR6-ECD-His之胺基酸序列如下： MGTRASSITALASCSRTAGQVGATMVAGSLLLLGFLSTIT AQPEQKTLSLPGTYRHVDRTTGQVLTCDKCPAGTYVSEHC TNMSLRVCSSCPAGTFTRHENGIERCHDCSQPCPWPMIERL PCAALTDRECICPPGMYQSNGTCAPHTVCPVGWGVRKKG TENEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAHTDCLGQNLEV VKPGTKETDNVCGMRLFFSSTNPPSSGTVTFSHPEHMESH DVPSSTYEPQGMNSTDSNSTASVRTKVPSGIEEGTVPDNTS STSGKEGTNRTLPNPPQVTHQQAPHHRHILKLLPSSMEATG EKSSTAIKAPKRGHPRQNAHKHFDINEHHHHHH(SEQ ID NO: 15) 圖13B展示以DR6-AP印跡對軸突條件培養基中DR6配位體之另一次觀測。此印跡資料鑑別許多包括35 kDa N末端 APP之APP多肽，以及C99-APP及C83/C89 APP多肽。根據先前描述之方案進行軸突條件培養基之DR6-AP印跡檢定 (Pettmann等人，1988, J. Neurosci·，8(10): 3624_3632)。如上在實例8中所述產生小鼠DR6胞外域-AP融合蛋白。表現小鼠重組DR6-ECD-His且隨後自CHO細胞培養物純化。 DR6-ECD-His之胺基酸序列展示於上文中。用於西方印跡法實驗之多株抗N-APP抗體獲自Thermo Scientific^目錄號 RB-9023-P1)。為觀測膜繫鏈APP C末端片段（CTF)C99-APP 及C83/C89-APP，使用識別Αβ之中心部分内的抗原決定基 127689.doc -137- 200844113 之4G8抗體（單株4G8，1:500，Covance)進行軸突溶解產物之西方印跡分析。圖14A提供展示剝奪NGF後不久發生之APP胞外域脫落。在圖14A中，在經添加以阻斷軸突退化之Bax抑制劑存在下以N-APP多株抗體將生長因子移除後各時間之神經元染色。自左至右，此等照片展示NGF移除（且添加抗NGF抗體）0小時以及3、6、12及24小時後之軸突退化。用以觀測APP軸突脫落實驗中表面APP表現之多株抗 N-APP抗體獲自 Thermo Scientiflc(目錄號RB-9023-P1)。如上文實例6及7中所述進行感覺外植體培養。如上實例7中所述以如下修改形式進行NGF剝奪檢定。NGF剝奪後之指定時間間隔後：〇小時、3小時、6小時、12小時及24小時，將 DRG外植體培養物於4% PFA/PBS中固定。為觀測表面APP 表現，DRG軸突經處理以便如實例6及7中（無曲通滲透步驟）使用上述抗N-APP初級抗體進行免疫螢光染色。為觀測感覺轴突（經抗N-APP抗體（Thermo Scientific，目錄號RB-9023-P1)免疫螢光標記）上之表面APP表現，在 Axioplan-2 Imaging Zeiss顯微鏡上（在紅色榮光通道中）使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SPl(03/2006)電腦軟體拍攝照片。圖14B提供展示DR6胞外域結合由培養細胞表現之APP的照片。在圖14B中自左至右，上部兩張照片分別展示用 DR6-APP(具有DR6胞外域）探測之對照Cos細胞及APP表現細胞。下部兩張照片展示用DR6-AP探測之p75NTR受體及 127689.doc -138- 200844113 DR6受體表現細胞。DR6胞外域不與p75NTR或DR6受體表現細胞結合。用以產生此圖中展示之資料的材料及方法如下。為測試 APP是否與DR6胞外域直接相互作用，進行細胞基AP結合檢定（圖14B)。為產生DR6胞外域-AP融合蛋白（DR6-AP)，根據製造商之方案以15微克DR6-AP融合表現構築體使用 FuGene轉染試劑（Roche)轉染於 DMEM/10% FBS(Gibco)培養基中培養之COS-1細胞。轉染12小時後，將COS-1細胞培養基改變為OPTI-MEM(Invitrogen)。轉染48小時後，收集且過濾含有DR6-AP蛋白質之COS-1細胞條件培養基。根據以下程序量化培養基中DR6-AP蛋白質之量。將100 微升2XAP緩衝液（藉由添加1 00 mg對-硝基苯基磷酸鹽 (Sigma)及 15微升 1M MgCl2至 15 ml 2M二乙醇胺 pH 9·8 中製備）與等體積之經轉染COS細胞條件培養基或來自未轉染 COS-1細胞之對照條件培養基混合。使反應之顏色顯影 12-15分鐘，其中O.D.在線性範圍（0.1-1)内。隨後藉由添加 800微升蒸餾水調節反應之體積，且在405 nm吸光率波長下量測O.D.。根據下式（100微升）計算nM濃度：C (nM)= O.D.xl00x(60/顯影時間）/ 30。對於APP AP結合檢定，根據製造商之方案使用FuGene轉染試劑（Roche)以每孔2微克APP表現載體轉染在6孔培養孤中於DMEM/10% FBS(Gibco)培養基中培養之COS-1細胞。轉染2天後，以結合緩衝液（HBSS，Gibco目錄號14175-095，具有 0.2% BSA、〇·1〇/0 NaN3、5 mM CaCl2、1 mM MgCl2、 127689.doc •139- 200844113 20 mM HEPES、pH=7.0)將細胞洗滌兩次。接著藉由製備 DR6-AP條件培養基與結合緩衝液之1:1混合物進行AP結合檢定，將混合物直接應用至APP過度表現之COS-1細胞且在室溫下培育90分鐘。培育後，藉由以結合緩衝液將COS-1 細胞沖洗5次洗去未結合之DR6-AP蛋白質。接著在室溫下以在PBS中稀釋之3.7%甲醛將細胞固定12分鐘。藉由以HBS 缓衝液（20 mM HEPES ρΗ=7·0，150 mM NaCl)沖洗細胞 3次移除剩餘甲醛。藉由在65 °C下在HBS緩衝液中加熱失活30 分鐘阻斷内源性AP活性。接著在AP反應緩衝液（1 〇〇 mM TRIS ρΗ=9·5，100 mM NaCl，50 mM MgCD 中將 COS-1 細胞沖洗3次。接著藉由在室溫下在AP結合緩衝液中以 1/50(體積）NBT/BCIP儲備溶液（Roche，目錄號1681451)使 COS-1細胞之顏色反應顯色隔夜來觀測與跨膜APP結合之 DR6-AP融合蛋白（圖14B)。在平行對照實驗中，將來自未轉染COS細胞之條件培養基用於AP結合檢定。在相同實驗條件下COS-1細胞中表現之跨膜P75NTR及DR6受體未展示與DR6-AP融合蛋白之特異性結合（圖14B)，此指示DR6胞外域與APP之間的相互作用具有特異性。圖14C提供展示DR6為感覺軸突上N-APP之主要受體，且 APP結合部位在DR6缺乏小鼠的神經元細胞中顯著消耗之照片。在圖1 4C中自左至右，上部三張照片分別展示獲自用 AP對照、N-APP-AP及 Sema3A-AP探測之 DR6 +/- (het)小鼠之神經元。下部三張照片相應地分別展不獲自用AP對照、 N-APP-AP及Sema3A-AP探測之DR6-/-(KO)小鼠之神經元。 127689.doc -140- 200844113 用以產生圖14 C中展不之貧料的材料及方法如下。如以上實例9中所述產生小鼠DR6胞外域_AP融合蛋白。如先前所述產生小鼠Sema3A胞外域_AP(Sema3A-AP)融合蛋白 (Feiner等人，1997, Neuron，第 19卷，539-545)。先前已描述DR6缺乏小鼠品系（DR6.KO)(Zhao等人，Journal of Experimental Medicine，第 194卷，1441-1441，2001)。如以上實例9中關於圖12A及12B所述進行DRG外植體培養及 DR6-AP軸突結合檢定。圖14D提供展示拮抗劑DR6抗體破壞DR6胞外域與神經元APP之間的相互作用之照片。在此等研究中，將N-APP 添加至表現DR6之神經元細胞且隨後以抗N-APP抗體顯現。自左至右，前4張照片分別展示在對照IgG; RA.4抗DR6 抗體；RA.3抗DR6抗體；及RA.1抗DR6抗體存在下N-APP 結合神經元表面上之DR6之能力。最右端之照片展示使用對照IgG對細胞上DR6的染色。用以產生此圖中展示之資料的材料及方法如下。如先前所述（Okada等人，Nature，2006，第 444卷，369-373)以以下修改形式進行用以獲得圖14D中所示之資料之細胞基配位體結合檢定。為產生N末端生長因子樣域APP-His融合蛋白 (N-APP-His)，根據製造商之方案使用FuGene轉染試劑 (Roche)以15微克N-APP-His融合表現構築體轉染於 DMEM/10% FBS(Gibco)培養基中培養之COS-1細胞。轉染 12小時後，將COS-1細胞培養基改變為OPTI-MEM (Invitrogen)。轉染48小時後，收集且過濾含有N-APP-His 127689.doc -141 - 200844113 蛋白質之COS-1細胞條件培養基。藉由西方印跡分析以上述抗N-APP抗體測定N-APP-His之濃度。用於此結合檢定之人類N-APP-His之胺基酸序列如下： MLPGLALLLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFC GRLNMHMNVQNGKWDSDPSGTKTCIDTKEGILQYCQEVY PELQITNVVEANQPVTIQNWCKRGRKQCKTHPHFVIPYRC LVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKE TCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNV DSADAEEDHHHHHH(SEQ ID NO: 10) 接著藉由製備N-APP-His條件培養基與結合緩衝液之1 ·. 1 混合物進行N-APP-His結合檢定，將混合物直接應用至DR6 受體過度表現COS-1細胞且在室溫下培育90分鐘。若指示，則連同N-APP-His條件培養基及結合緩衝液一起以20 pg/ml 個別添加DR6 mAb RA.1、RA.3或RA.4(上文所述，實例3 及7)。在對照實驗中，連同N-APP-His條件培養基及結合緩衝液一起以20 pg/ml添加正常小鼠IgG(Genentech Inc)。藉由根據如實例6及7之方案中所述之已知方案（Okada等人，Nature，2006，第 444 卷，369-373)以抗 N-APP 抗體 (Thermo Scientific目錄號RB-9023-P1)免疫營光染色觀測與 DR6受體表現細胞結合之N-APP。為觀測與細胞表面（經抗 N-APP 抗體（Thermo Scientific，目錄號 RB-9023-P1)免疫螢光標記）上之DR6受體結合的N-APP蛋白質，在Axioplan-2 Imaging Zeiss顯微鏡上（在紅色螢光通道中）使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions-^ AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 127689.doc -142- 200844113 (03/2006)電腦軟體拍攝照片。實例11 ··類澱粉前驅蛋白（APP)活化DR6以誘發轴突退化圖15A提供展示N末端APP之多株抗體在連合軸突檢定中阻斷軸突退化之照片。自左至右，圖1 5 A中之照片分別展示在對照 IgG; 30 pg/ml 抗 NAPP 抗體；及 1.1 pg/ml 抗 NAPP 抗體存在下之連合軸突退化。用以產生圖1 5 A中展示之資料的材料及方法如下。如實例 2之方案及圖4B中產生之資料中所述，以指定量之多株抗 ^ N-APP抗體（Thermo Scientific 目錄號 RB-9023-P1，經廣泛透析）或對照IgG(兔IgG，R & D systems)進行連合外植體存活檢定。為觀測經GFP標記之連合軸突，在Axiovert 200 Zeiss 倒置顯微鏡（在GFP之綠色螢光通道中）上使用來自Cad Zeiss Imaging Solutions之 AxioVision40 Release 4·5·0·0 SP1 (03/2006)電腦軟體拍攝照片。圖15Β提供展示Ν末端APP抗體抑制由NGF移除誘發之感覺軸突退化之照片。自左至右，圖15B之上部三張照片分別 C；展示在NGF及：對照抗體；抗APP單株抗體22C11 ;及抗APP 多株抗體存在下之感覺軸突。下部三張照片相應地分別展示不存在NGF(以及抗NGF抗體）及：對照抗體；抗APP單株抗體22C11 ;及抗APP多株抗體情況下之感覺軸突。用以產生此圖1 5 B中展不之貢料的材料及方法如下。如以上實例8中所述在肯佩諾腔室中進行NGF剝奪檢定。檢定中所用之N末端APP之抗體為多株抗Ν-APP抗體（Thermo Scientific目錄號RB-9023-P1，經廣泛透析）或22C11單株抗 127689.doc -143 - 200844113 體（22C11，Chemicon，經廣泛透析）。添加正常IgG(兔IgG， R & D systems)作為對照實驗。如實例1、7及8中所述進行用丁1^1抗體（1:500，（：(^&1^6)對感覺軸突之免疫螢光標記。為觀測肯佩諾腔室之軸突隔室中經免疫螢光標記之感覺軸突，在Axioplan-2 Imaging Zeiss顯微鏡上使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體拍攝照片。圖15C提供展示藉由抑制β-分泌酶（B ACE)活性阻斷之軸突退化可藉由添加N-APP恢復的照片。自左至右，圖15C中之上部三張照片分別展示在以下各物存在下觀察到之神經元（在NGF不存在之情況下培養）及軸突退化：DMSO對照、 BACE抑制劑及N-APP(及BACE-I)。圖15C中之下部三張照片相應地分別展示神經元（在NGF存在下培養）以及：DMSO 對照、BACE抑制劑及N-APP(及BACE-Ι)。用以產生此圖1 5C中展示之資料的材料及方法如下。如以上實例8中所述在肯佩諾腔室中進行NGF剝奪檢定。用於此檢定之人類重組N-APP胺基酸19-306購自Novus (Novus Biologicals，目錄號 H00000351-P01)。在 NGF剝奪時，連同 BACE 抑制劑（1 μΜ 最終濃度，InSolution OM99-2， Calbiochem/Merck) —起以 3 pg/ml 添加 N-APP。此檢定中 BACE抑制劑以1 μΜ最終濃度使用（InSolution OM99-2， Calbiochem/Merck)。如實例1、7及8中所述進行用TUJ1抗體（1:500，（：(^311(^)對感覺軸突之免疫螢光標記。為觀測肯佩諾腔室之軸突隔室中經免疫螢光標記之感覺軸突，在 127689.doc -144- 200844113

Axioplan-2 , Imaging Zeiss 顯微鏡上使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SPl(03/2006)電腦軟體拍攝照片。圖15D提供展示利用RNAi移除APP使在BACE抑制劑存在下生長之神經元細胞對由N-APP誘發之細胞死亡敏感之照片。在圖1 5D中自左至右，上部三張照片展示在對照RNAi 存在下培養之神經元。此等上部照片分別展示對照以及用3 pg/ml N-APP或0· 1 pg/ml N-APP培養之神經元。下部三張照片展示在APP RNAi存在下培養之神經元。此等下部照片分別展示對照以及用3 pg/ml N-APP或0.1 pg/ml N-APP培養之神經元。用以產生此圖15D中展示之資料的材料及方法如下。如實例2中所述進行連合外植體培養物中之APP RNAi。用於此檢定之人類重組N-APP胺基酸19-306購自Novus(Novus Biologicals，目錄號H00000351-P01)。根據製造商之方案，在此檢定中使用預先設計之大鼠特異性APP ON-TARGETplus siRNA池以下調E13大鼠連合夕卜植體中之 APP表現（APP ON-TARGETplus siRNA池，GenelD : 54226，目錄號088 191，Dharmacon Inc.)。為觀測經GFP標記及經 RFP標記之連合軸突（如實例2及7中所述），在Axiovert 200 Zeiss倒置顯微鏡上（在GFP綠色螢光通道中）使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體拍攝照片。實例12 : DR6為APP誘發之轴突退化所需，但不為Αβ觸發 127689.doc -145- 200844113 之退化所需如圖16A中所示，DR6活化為N-APP誘發之軸突退化所需。在圖16A中自左至右，上部三張照片展示獲自DR6+/-(het) 小鼠之神經元。第一張照片展示未曝露於Αβ或N-APP之對照神經元，第二張照片展示曝露於Αβ之神經元且第三張照片展示曝露於Ν-ΑΡΡ之神經元。下部三張照片展示獲自 DR6-/-(KO)小鼠之神經元。自左至右，下部第一張照片展示未曝露於Αβ或N-APP之對照神經元，第二張照片展示曝露於Αβ之神經元且第三張照片展示曝露於Ν-ΑΡΡ之神經元。用以產生此圖16Α中展不之貢料的材料及方法如下。如實例2中所述進行連合外植體培養及存活檢定。先前已描述 DR6 缺乏小鼠品系（DR6.KO)(Zhao 等人，Journal of Experimental Medicine，第 194卷，1441-1441，2001)。用於此檢定之人類重組N-APP胺基酸19-306購自Novus(Novus Biologicals，目錄號H00000351-P01)。用於此檢定之重組人類β類殿粉胺基酸1-42購自Chemicon(超純人類Αβ1-42，目錄號AG912，Chemicon)。平孤接種後24小時，連同BACE 抑制劑一起將N-APP以3 pg/ml添加至連合外植體中。平jiel 接種後24小時，連同BACE抑制劑一起將重組人類β類澱粉胺基酸1-42以3 μΜ添加至連合外植體中。該檢定中BACE 抑制劑以1 μΜ最終濃度使用（InSolution OM99-2， Calbiochem/Merck)。以指定量之N-APP或Αβ將連合外植體 127689.doc -146- 200844113 再培育24小時。連合外植體平m接種後48小時收集資料。為觀測連合軸突，在Axiovert 200 Zeiss倒置顯微鏡（在明視場中）上使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5,0.0 SP 1(03/2006)電腦軟體拍攝照片。如圖1 6B中所示，拮抗劑DR6抗體未能阻斷由Αβ觸發之軸突退化。在圖1 6Β中自左至右，上部三張照片展示對照神經元、在BACE-I存在下之神經元及在BACE-I及Αβ存在下之神經元。在圖16Β中，下部兩張照片展示在BACE-I、Αβ及抗 DR6抗體RA.1存在下之神經元，且隨後為在BACE-I、Αβ及抗DR6抗體RA.3存在下之神經元。用以產生此圖16Β中展示之資料的材料及方法如下。如實例2中所述進行連合外植體培養及存活檢定。用於此檢定之重組人類β類澱粉胺基酸1-42購自Chemicon(超純人類 Αβ1-42，目錄號AG912，Chemicon)。該檢定中BACE抑制劑以 1 μΜ最終濃度使用（InSolution OM99-2，Calbiochem/ Merck)。平孤接種後24小時，連同BACE抑制劑及所指示40 pg/ml之抗DR6 mAb—起將重組人類β類澱粉胺基酸1-42以3 μΜ添加至連合外植體中。該檢定中BACE抑制劑以1 μΜ最終濃度使用（InSolution ΟΜ99-2，Calbiochem/Merck)。以指定量之Αβ將連合外植體再培育24小時。連合外植體平ϋϋ接種後48小時收集資料。藉由以如上文實例3中所述之DR6胞外域免疫小鼠產生小鼠單株RA.1-RA.5 DR6抗體。如上所述，此處命名為RA.1 127689.doc -147- 200844113 及11人.3抗體之0116抗體分別為”旧5.5.7|’及’’3?4.4.8，，，實例3 中描述之DR6抗體。為觀測經GFP標記之連合軸突，在 Axiovert 200 Zeiss倒置顯微鏡（在GFP之綠色螢光通道中）上使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4·5·0·0 SP 1(03/2006)電腦軟體拍攝照片。實例13 :細胞内DR6信號轉導卡斯蛋白酶為漸進式細胞死亡途徑中之重要因子（參見例如 grutter 等人，Curr Opin Struct Biol. 10(6):649-55 (2000) ; Kuida等人，Nature 384(6607):368-72 (1996);及

Finn等人，J Neurosci· 20(4):1333-41 (2000))且某些卡斯蛋白酶與包括亨爾頓氏病及AD之神經退化性疾病中之細胞内信號轉導相關聯（參見例如Wellington等人，J Neurosci. 22(18):7862-72 (2002); Graham等人，Cell 125(6):1179-91 (2006) ； Guo等人，Am J Pathol. (2):523-31 (2004)；及 Horowitz等人，J Neurosci. 24(36):7895-902 (2004))。圖17 A展示經培養5天且隨後曝露於各種不同培養條件24 小時之感覺神經元之照片。如圖1 7 A中所示，軸突退化藉由抑制JNK及上游卡斯蛋白酶-8而非下游卡斯蛋白酶-3而延遲。在圖1 7 A中，左側以下行順序之兩張照片分別展示曝露於 NGF及抗NGF抗體之感覺神經元。在圖17A中，右側以下行順序之4張照片分別展示曝露於以下各物之感覺神經元：抗 NGF抗體及JNK抑制劑；抗NGF抗體及卡斯蛋白酶-8抑制劑；抗NGF抗體及ΒΑΧ抑制劑；及抗NGF抗體及卡斯蛋白 127689.doc -148- 200844113 酶-3抑制劑。用以產生此圖17 A中展示之資料的材料及方法如下。如上實例8中所述在肯佩諾腔室中進行ngf剝奪檢定。此檢定中小分子JNK抑制劑SP 600125以1 μΜ最終濃度使用（SP 600125，目錄號 1496，Tocris Bi〇science)。此檢定中卡斯蛋白酶-3抑制劑Z-DEVD-FMK以10 μΜ使用 (Z-DEVD-FMK，目錄號 264155，Calbiochem)。此檢定中卡斯蛋白酶-8抑制劑Z_IETD-FMK以10 μΜ使用 (Z-IETD-FMK，目錄號FMK007，R & D Systems)。ΒΑΧ抑制性肽以10 μΜ使用以阻斷神經元細胞死亡（Bax—V5，T〇cris

Inc)。先前已描述（Deckwerth等人，Neuron，第 17卷，401-411， 1996)Bax缺乏小鼠品系（Bax-R1)且其獲自傑克遜實驗室 (Jackson Lab)。如實例i、7及8中所述進行用TUJ1抗體 (1:500，C〇Vance)對感覺軸突之免疫螢光標記。為觀測肯佩諾腔室之軸突隔室中經免疫螢光標記之感覺軸突，在 AXioPlan-2 Imaging Zeiss顯微鏡上使用來自以⑹ Imaging Solutions 之 AxioVisi〇n4〇汉士㈣ 4 5 〇〇 §ρι (03/2006)電腦軟體拍攝照片。圖1 7B提供El2·5運動神經元外植體培養物之運動神經元之Ή ’且其展不卡斯蛋白酶_3在細胞體中起作用，而卡斯蛋白酶-6在軸突中起作用。在圖17Β中自左至右，4張照片分別展示在以下條件下培養之神經元：⑴生長因子；⑺無生長因子且不存在卡斯^ 白酶抑制劑(對照” (3)無生長因子，存在卡斯蛋白酶邱 127689.doc -149- 200844113 制劑；及（4)無生長因子，存在卡斯蛋白酶-6抑制劑。用以產生此圖1 7 B中展不之貢料的材料及方法如下。此檢定中卡斯蛋白酶-3抑制劑Z-DEVD-FMK以10 μΜ使用 (Z-DEVD-FMK，目錄號264155，Calbiochem)。此檢定中卡斯蛋白酶-6抑制劑Z-VEID-FMK以10 μΜ使用 (Z-VEID-FMK，目錄號 550379，Becton，Dickinson and Company PHARMINGEN部門）。如上文實例6中所述進行運動神經元腹側脊髓存活檢定。如實例1、7及8中所述進行用 TUJ1抗體（1:500，Covance)對運動軸突之免疫螢光標記。為觀測經免疫螢光標記之運動軸突，使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006)電腦軟體在 Axioplthe-2 Imaging Zeiss 顯微鏡上拍攝照片。圖17C提供經培養5天且隨後曝露於各種不同培養條件24 小時之感覺神經元之照片。圖1 7C之資料展示儘管卡斯蛋白酶-3似乎不為軸突退化所需，但ΒΑΧ為其所需。在圖17C中自左至右，上部4張照片分別展示用NGF ;且隨後在抗NGF抗體（亦即NGF剝奪）存在下培養16、24及48 小時之ΒΑΧ +/+神經元。底部4張照片相應地分別展示用 NGF且隨後抗NGF抗體培養16、24及48小時之ΒΑΧ -/-神經元。用以產生此圖17C中展示之資料的材料及方法如下。如上在上文實例8中所述在肯佩諾腔室中進行NGF剝奪檢定。先前已描述（Deckwerth 等人，Neuron，第 17 卷，401-411， 127689.doc -150- 200844113 1996)Bax缺乏小鼠品系（Bax_R1)且其獲自傑克遜實驗室 (Jackson Lab)。將NGF抗體用於肯佩諾腔室之軸突隔室中之 NGF剝奪檢定（單株功能阻斷抗ngf #911，Genentech，2〇 pg/ml)。如實例i、7及8中所述進行用TUJ1抗體⑴5〇〇， Covance)對感覺軸突之免疫螢光標記。為觀測肯佩諾腔室之軸突隔室中經免疫螢光標記之感覺軸突，在Axi〇plan_2

Imaging Zeiss顯微鏡上（在綠色螢光通道中）使用來自carl

Zeiss Imaging Solutions 之 Axi〇ViSi〇n40 Release 4.5.0.0 SPl(03/2006)電腦軟體拍攝照片。圖PD提供經在不同培養條件下培養以小時之ei3大鼠外植體連合神經元之培養物的照片。圖17D之資料展示卡斯蛋白酶-3在細胞體中起作用，而卡斯蛋白酶在軸突中起作用。在圖17D中自左至右’上部三張照片分別展示與經卡斯蛋白酶-3或卡斯蛋白酶_6抑制劑培養之神經元相比對照神經元之GFP分析。下部三張照片相應地分別展示與經卡斯蛋白酶-3或卡斯蛋白酶_6抑制劑培養之神經元相比對照神經元之TUNEL(細胞死亡）分析。用以產生此圖17D中展示之資料的材料及方法如下。如實例2中所述進行連合外植體培養及存活檢定。如上文實例7 十所述，在連合外植體培養物中藉由丁_el檢定觀測連合細胞體中之漸進式細胞死亡。將連合外植體於 4WFA/PBS中固定且經處理以便基於職股斷裂之伊纪 (TUN狐技術）使用原位細胞死亡㈣套組（目錄如咖 127689.doc -151 - 200844113 795 910，Roche)根據製造商之使用手冊（Roche)在單細胞層面偵測漸進式細胞死亡（細胞凋亡）。藉由螢光顯微鏡術分析連合、感覺及運動外植體培養物之細胞體中的細胞凋亡（圖 17D)。此檢定中卡斯蛋白酶_3抑制劑Z-DEVD-FMK以10 μΜ 使用（Z-DEVD-FMK，目錄號264155，Calbiochem)。此檢定中卡斯蛋白酶-6抑制劑Z-VEID-FMK以10 μΜ使用 (Z-VEID-FMK，目錄號 550379，Becton，Dickinson and Company，PHARMINGEN部門）。為觀測經GFP標記之連合軸突，在Axiovert 200 Zeiss倒置顯微鏡（在GFP之綠色螢光通道中）上使用來自Carl Zeiss Imaging Solutions之 AxioVision40 Release 4·5·0·0 SP 1(03/2006)電腦軟體拍攝照片。為觀測螢光標記之TUNNEL陽性凋亡細胞體，在

Axioplan_2 Imaging Zeiss顯微鏡上（在TUNNEL之紅色螢光通道中）使用來自 Carl Zeiss Imaging Solutions 之 AxioVision40 Release 4.5·0_0 SP 1(03/2006)電腦軟體拍攝照片。實例14 :動物模型中之DR6拮抗劑活性熟習此項技術者可採用許多與不同神經退化性疾病相關之動物模型來研究活體内DR6结抗劑效應。例如，APP/RK 轉基因小鼠表現突變型類澱粉前驅蛋白多肽且顯示嚴重神經退化及細胞凋亡。因此，APP/PK轉基因小鼠提供阿茲海默氏症之模型，其可用於研究DR6拮抗劑對與在此動物模型中觀察到之此症候群相關的病理學過程之效應（參見例如 Moechars等人，Neuroscience 91(3)·· 819-830 (1999))。諸 127689.doc -152- 200844113 如APP23及JNPL3轉基因品系之多種其他轉基因鼠類品系表現突變型阿茲海默氏症相關多肽，且進一步顯示神經元細胞損失。因此，APP23及JNPL3轉基因小鼠提供可投與 DR6拮抗劑之阿茲海默氏症之替代模型（參見例如 McGowan等人，TRENDS in Genetics Vol· 22 No. 5 (2006)) 〇 G93A SOD1轉基因小鼠表現人類超氧化歧化酶突變型多肽，且顯示升高程度之卡斯蛋白酶-3表現以及運動神經元細胞凋亡。G93 A SOD1轉基因小鼠提供肌萎縮性側索硬化之模型，其可用於研究DR6拮抗劑之效應（參見例如Tokuda 等人，Brain Res. 1 148: 234-242 (2007);及 Wang等人，丑111*· J. Neurosci. 26(3): 633-641 (2007))。R6/2轉基因小鼠在其原生啟動子控制下表現具有延長N末端聚麩胺酸重複之亨爾頓（huntington)之外顯子-1，且顯示暗示人類亨爾頓氏病之進行性神經病理學變化（參見例如Mangarini等人，Cell， 87，493-506 (1996) ; Chen等人，Nat. Med. 6，797-801 (2000))。R6/2轉基因小鼠提供亨爾頓氏病之模型，其可用於研究DR6拮抗劑對與在此動物模型中觀察到之此症候群相關的病理學過程之效應（參見例如Wang等人，European Journal of Neuroscience，26: 633-641 (2007))。PK-KO轉基因小鼠並不表現Park-2基因之蛋白質產物，顯示類似帕金森氏病之異常且具有與野生型小鼠相比對細胞凋亡更敏感之神經元（參見例如 Casarejos 等人，J Neurochem. 97(4): 934-46 (2006))。PK-KO轉基因小鼠提供帕金森氏病之模型，其可用於表徵DR6拮抗劑對與在此動物模型中觀察到 127689.doc -153- 200844113 之此症候群相關的病理學過程之效應。此外，諸如 Smn-/-SMN2小鼠、攜帶在人類Ar啟動子控制下之純239三核苷酸CAG重複以及具有至少一個在鼠類背景中起作用的人類SMNC基因複本之轉基因雙重原生小鼠Smn基因剔除的轉基因小鼠之許多轉基因小鼠品系皆不表現存活運動神經元基因之蛋白質產物或表現存活運動神經元基因之蛋白質產物之變異形式，且因此顯示類似脊髓性肌萎縮疾病之異常（參見例如 Hsiu 等人，Nature Genetics 24，66-70 (2000); Ferri 等人，Neuroreport 15(2): 275-280 (2004); Ferri 等人，Curr Biol. 2003 Apr 15;13(8):669-73 ;及 R0SS0l 等人，

Journal of Cell Biology，第 163卷，第 4號，801-812 (2003))。因此’該等轉基因鼠類品系提供脊髓性肌萎縮之模型，其可用於表徵DR6拮抗劑對與在此動物模型中觀察到之此症候群相關的病理學過程之效應。包括上文所述者之神經病狀或病症之動物模型可用於研究本文中揭示之DR6拮抗劑之效應，該等拮抗劑例如一或多種結合DR6之抗體（例如3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7單株抗體）’及/或結合APP之DR6之一或多種可溶形式（例如包含 SEQ ID NO: 1之胺基酸1—354者），及/或一或多種結合App 之抗體（例如22C 11單株抗體）以及此等藥劑彼此及/或與其他在此項技術中已知之治療劑之組合。在本文中揭示之一或多種DR6拮抗劑之實驗性測試的說明性方案中，可將動物模型之許多年齡及性別匹配動物（例如6月齡雌性APP/PK轉基因小鼠）分配至多個測試及/或對 127689.doc -154- 200844113 照組之-者。可隨後根㈣定投藥方⑽㈣dr6抬抗劑投與此等動物之第一測試組（例如，對於每兩週之每次注^ 以2〇mg/kg體重腹膜内注射DR6拮抗劑抗體，歷時六個月之時間）。其他測試組之條件可根據標準操作規程改變，例如：投與不同劑量之DR6拮抗劑（例如丨、5、1〇、15邮心體重）；投與不同時程之DR6拮抗劑（例如每週注射，歷時12 個月之時間）；投與不同DR6拮抗劑（例如DR6免疫黏附素）；使用藥劑組合（例如與膽鹼酯酶抑制劑組合之DR6拮抗劑），使用不同投藥途徑（例如靜脈内投藥）等。一或多個動物組可充當對照，例如根據與接受DR6拮抗劑之測試組相同的投藥過程接受無菌磷酸鹽緩衝生理食鹽水之組。在接受DR6拮抗劑後之某些時間，可隨後比較此等動物之測試及匹配對照組以（例如）研究及/或表徵〇116拮抗劑之活體内效應。例如，可藉由諸如磁共振顯微鏡術及/或免疫組織化學分析之技術評估此等動物之測試及對照組之包含來自特定組織或器官（例如大腦）之神經元細胞的樣本以比較此等組中神經元細胞之狀態（參見例如petrik等人，

Neuromoleculai· Med· 9(3):216-29 (2007))。或者，可藉由諸如多光子顯微鏡術之技術評估獲自此等組之樣本以證明諸如神經突執道改變、樹突棘損失或樹突薄化之現象（參見例如 Tsai 等人，Nat· Neurosci· 7，1 181-1 183 (2004);及 Spires 等人，J· Neurosci· 25, 7278-7287 (2005))。或者，可使獲自此等組之血液或其他組織樣本經受經設計以量測諸如 IL-Ιβ、TNF-α、IL-10、p53蛋白質、干擾素 _丫或 NFkB 的炎 127689.doc -155- 200844113 症及/或細胞凋亡之標記的含量之ELISA方案（參見例如 Rakover等人，Neurodegener. Dis. 4(5):392-402 (2007);及 Mogi等人，Neurosci Lett. 414(1):94-7 (2007))。或者’可以在此項技術中已知之行為測試範例比較來自測試及匹配對照組之動物，該等範例例如莫裏斯（Morris)水迷宮或目標識別測試（參見例如Hsiao等人，Science 274, 99-102 (1996); Janus等人，Nature 408，979-982 (2000); Morgan等人，Nature 408，982-985 (2000);及 Ennaceur 等人，Behav· Brain Res· 1988; 31:47-59)。動物之測試與匹配對照組之間比較的結果將允許熟習此項技術者研究動物模型中DR6拮抗劑之活體内效應。實例1-13，其中包括之資料及此等資料之相關特徵證明 DR6拮抗劑將（例如）抑制神經元細胞之活體内細胞凋亡。詳言之，上文之實例1-13教示（例如）：（1) DR6誘發多種神經元細胞之細胞凋亡；（2) APP為DR6之同源配位體，其結合 DR6且觸發DR6介導之細胞凋亡；及（3)抑制活體外 DR6/APP結合相互作用之DR6拮抗劑因此抑制DR6介導之活體外細胞凋亡。鑒於申請者之觀測結果及揭示内容，熟習此項技術者將合理地預期DR6拮抗劑抑制DR6介導之活體内細胞凋亡。因此，如本文中所述，熟習此項技術者將合理地預期諸如彼等上文所述者之動物模型及相關技術用於研究在此等動物模型中所觀察到之各種病理學過程以證實DR6拮抗劑之生物活性。實例15 :脊髓性肌萎縮動物模型中之RA.1("1E5.5.7”）、 127689.doc -156- 200844113 RA.2、RA.3(，，3F4.4.8”）及 RA.4抗體治療脊髓性肌萎縮（SMA)為影響脊髓之前柱中的運動神經元之隱性運動神經元疾病，且認為其因SMN(存活運動神經元）蛋白質減少產生。SMA之動物模型為具有以下品系名稱之轉基因小鼠品系：品系名稱：FVB.Cg-Tg (SMN2*57) 4299Ahmb Tg (SMN2) 89Ahmb SmnltmlMsd/J (JAX 5025) (參見例如 Le等人，Human Molecular Genetics 14(6):845-857 (2005))。此三倍體突變型小鼠具有兩個轉基因等位基因及單一靶向突變體。Tg (SMN2*delta7) 4299Ahmb等位基因由缺乏外顯子7之SMAcDNA組成，而Tg (SMN2) 89Ahmb等位基因由整個人類SMN2基因組成。在下文之描述中，此品系亦稱為57 SMA KO模型。純合靶向突變型Smn等位基因且純合兩個轉基因等位基因之小鼠顯示類似於罹患近端脊髓性肌萎縮（SMA)之患者的症狀及神經病理學。出生時，三倍突變體顯著小於正常仔畜。截至第5天，肌無力之病徵明顯且在接下來的一週内因小鼠顯示步態異常、後肢顫抖及易於倒下而逐漸變得更加顯著。平均存活時間為約1 3天。三倍體突變型小鼠進一步顯示對平面翻正反射、負趨地性及懸崖排斥而非對觸覺刺激之反應受損。此等小鼠中自發運動活動及握力亦顯著受損（參見例如 Butchbach等人，Neurobio 1 Dis. 27(2):207-19 (2007))。以下方案經設計以測定諸如DR6拮抗劑抗體之某些抗體及劑量對δ7 SMA模型小鼠（KO)之存活、體重及肌緊張之效應。 127689.doc -157- 200844113 如上所述，用於此研究中之小鼠可為δ_7 sma(jax 5〇25) κο模型（smn-/_; SMN2+/+; d7+/+)。出生時，可伴以（例如）移除相等數母之雄性及雌性將同寫仔畜隨機剔除至丨〇隻動物（或某些其他數目）。此方案後，截至第一次給藥時（p3) 同窩仔畜可經剔除至8隻小鼠。可自研究排除少於6隻幼畜之任何同窩仔畜。可自週一與週三之間出生的同窩仔畜出生時（P0)將小鼠尾剪斷。可藉由在此項技術中已知之多種方法進行基因型分析，例如使用可購自諸如TransnetyxInc 之分子診斷公司的自動基因型分析服務篩選生檢中之轉基因、基因剔除及插入突變。通常出生後48小時内可獲得該基因型資料。在δ兒明性實驗中可使用（例如）週一至週三出生之小鼠。可在Ρ3起始對小鼠IP給藥。研究中之典型數目可為··（ i)例如平均10隻KO(5隻雄性及5隻雌性）使用諸如無菌PBS之媒劑對照；（2)例如平均1 〇隻κ〇(5隻雄性及5隻雌性）使用包含 20mg/kg之各別抗體之第一劑量；及（3)例如平均1〇隻〖〇(5 隻雄性及5隻雌性）使用包含5 mg/kg之各別DR6抗體之第二劑ϊ °各動物可每週兩次接受各別RA.卜RA.2、RA.3及RA.4 抗體之IP給藥。"RA.1抗體”對應於"1E5.5.7，，且，，RA.3抗體，，對應於 n3F4.4.8"。，，RA.2抗體，，對應於"4B6.9.7，，，而，，RA.4 抗體對應於"2C7.3 ^’’（Genentech Inc.，結合DR6但並不阻斷功能之抗體）。"RA.5抗體，，對應於”3B11.7.7，，（Genentech Inc•’結合DR6但可能增強或刺激DR6活性之抗體）。 &Α·1、RA.2、ra.3及RA.4抗體可在4°C下儲存。必要時， 127689.doc -158- 200844113 可在給藥之前將此等抗體溫至室溫。可使用諸如PBS之典型媒劑。儘管此實例中之RA.1、RA.2、RA.3及RA.4單株抗體係使用人類DR6多肽序列作為免疫原產生，但如諸如實例7 中所述之軸突退化及細胞凋亡檢定方案所示，所有此等抗體與人類以及大鼠及小鼠DR6反應。

在一說明性實施例中，所評估之DR6拮抗劑可為拮抗劑抗體· R A. 1、R A · 2、R A · 3及R A · 4 ;每種抗體治療組之數目可為2組（每組1 〇隻動物）；投藥途徑可為ιρ ;且劑量範圍可為5及20mg/kg。視情況該等組可如下··（1)RA.l : 5 mg/kg IP； (2) RA.l ： 20 mg/kg IP； (3) RA.2： 5 mg/kg IP; (4) RA 2 ： 20 mg/kg IP ； (5) RA.3 ： 5 mg/kg IP ； (6) RA.3 ： 20 mg/kg IP ; ⑺ RA.4 : 5 mg/kg IP ;⑻ RA.4 : 20 mg/kg lp ;及⑼媒劑 (PBS)IP。在此方案中，可將小鼠每曰稱重。在出生後第ι〇、 12及14天（PND)，可稱量同窩仔畜中各仔畜之體重。在pND 在出生之曰（P0)，可使用在皮下應用之無毒墨水將幼

其母畜（幼畜可與其籠之草墊混合以使處理後母畜之排斥 6、8、1〇、12、丨4及16，可對研究中之每隻動物進行肌緊張評估（參見例如下文提供之說明性基因型分析方案卜 127689.doc -159- 200844113 ::二。自出生直至斷乳可每天檢查存活及體重 =先之慢性则研究_評㈣物對初生仔畜轴向之影響。體溫:可在規定年齡取軸向體溫之一個讀數。可错由包括趨地性之研究方案研究測試及對照㈣小鼠 :是異。趨地性測試當面向下放置在傾斜平臺上時動物自身定向之能力。此測試量測運動協調及前庭系統。可使用分析以作為事後測試進行存活評估。

為分析隨時間重複量測之f料，可採用混合效應模型（亦稱為混合ANOVA模型）。>典型重複量測an〇va分析，此方法係基於似然性估异而非矩估計法，但其對於歸因於小鼠隨時間死亡而遺漏值更可靠。可使用SAs 9丄3 (SAS Institute，Cary，NC)中之pR〇c ΜΙχΕΕ>程序擬合所有模型。治療為模型中之最重要因素。亦可考慮性別及天數以及其與治療之相互作用。研究終點可為死亡。可藉由諸如彼等於實例14中所述（例如組織學分析）之方法進一步評估動物。此外，可評估血清/血液以測定RA.1、 RA.2、RA.3及RA.4血清濃度。材料之寄存以下材料已寄存於美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection 5 10801 University Blvd.? Manassas, VA 201l〇_22〇9, USA (ATCC)): 材料 ATCC寄存編號寄存曰期 127689.doc -160 - 200844113

依據布達佩斯條約（Budapest 2006年12月21曰 2006年12月21日 2006年12月21曰

Treaty)之關於微生物寄存 I 際識別的條款，出於專利程序及據此之管理（布達佩斯 '、、、）的目的進行此寄存。此確保自寄存之日起保存寄存之活體培養物3〇年。寄存將由ATCC按照布達佩斯條約之條款同思進行，且其服從Genentech，Inc•與ATCC之間的協定， "玄協疋確保相關美國專利頒予後或任何美國或國外專利申口月木公諸於眾後（無論兩種情況何者首先出現），公眾對寄存之培養物之子代的永久及無限制可用性，且確保子代對於由待根據35 USC ’122授權之美國專利與商標委員及與其有關的委員之規定（包括37 CFR，1·14，尤其參考886 〇G 638) 確定之人員的可用性。本申請案之受讓人已同意若當在適當條件下培養時寄存之材料之培養物死亡或損失或破壞，則根據通知立即以另一相同材料替換該等材料。所寄存材料之可用性不應理解為准許達反任何政府當局根據其專利法授予的權利實施本發明。認為上述書面說明足以使得熟習此項技術者能夠實施本發明。本發明之範疇不應受本文中所提供之實例限制。實際上’除彼等本文中所示及所描述者外的本發明之各種修改形式將因上述說明而對熟習此項技術者變得顯而易見且屬於隨附申請專利範圍之範疇内。【圖式簡單說明】 127689.doc -161 - 200844113 圖1A展示人類DR6 cDNA之核苷酸序列（圖1A-1，SEQ ID NO: 2)，其推導出之胺基酸序列（圖1A-2，SEQ ID NO: 1) 以及其域結構之示意圖（圖1A-3)。在DR6示意圖中，指示包括推測信號肽、半胱胺酸富集域基元、跨膜域及死亡域之域邊界。在此示意圖中，指示推測信號肽、半胱胺酸富集域基元、跨膜域及死亡域之推測域邊界。圖1B展示人類類澱粉前驅蛋白（APP) cDNA之695同功異型物的核苷酸序列 (圖1B-1，SEQ ID NO: 5)及其推導出之胺基酸序列（圖 1B-2，SEQ ID NO: 6)。圖1C展示人類類澱粉前驅蛋白之751 同功異型物的胺基酸序列（SEQ ID NO: 7)。圖1D展示人類類澱粉前驅蛋白（APP) cDNA之770同功異型物的核苷酸序列（圖1D-1，SEQ ID NO: 8)及其推導出之胺基酸序列（圖 1 D_2，SEQ ID NO: 9)。參見例如 UniProtKB/Swiss_prot entry P05067及相關揭示内容，包括分別與同功異型物ID P05067-1、同功異型物ID P05067-4及同功異型物ID P05067-8有關的揭示内容（http://expasy.org/uniprot/P05067)。圖2A展示DR6在發育階段E10.5-E12.5強烈表現於包括脊髓之運動及連合神經元及背根神經節神經元之正發育之中枢神經系統中。圖2B展示表現在軸突及細胞體上之DR6蛋白質。圖2C展示表現於正分化神經元中之DR6 mRNA。圖3展示背脊髓外植體存活檢定中軸突退化及神經元細胞死亡之示意圖；指示藉由電穿孔將干擾RNA之siRNA劑連同GFP表現質體一起引入胚胎連合神經元中。圖4A說明小干擾RNA對DR6表現之抑制在背脊髓存活檢 127689.doc -162- 200844113 定中阻斷連合軸突退化且預防神經元細胞死亡。圖4B展示援救經DR6 siRNA阻斷之退化表型的RNAi抗性DR6 cDNA。圖5展示拮抗性DR6抗體在背脊髓存活檢定中幫助阻斷軸突退化及神經元細胞死亡。圖6提供神經元的機制示意圖及照片，其展示藉由藥理學抑制c-Jun N末端激酶（JNK)來下調DR6下游的細胞内信號轉導在外植體存活檢定中預防軸突退化及神經元細胞死亡。圖7展示拮抗性DR6抗體在離體全胚胎培養物中對脊椎運動及中間神經元之存活的神經保護效應。圖8提供用經裂解卡斯蛋白酶3抗體免疫染色之E15.5頸部脊髓切片之照片，以展示DR6之損失在DR6缺乏胚胎的脊髓及背根神經節中使得神經元細胞死亡降低。圖9A展示對表現經裂解卡斯蛋白酶-3之E15.5 DR6 KO胚胎中神經元細胞之定量，其證明與DR6+/-仔畜對照（DR6 hets)相比DR6缺乏胚胎中神經元細胞死亡降低約50%。圖 9B提供細胞之照片，其展示如在神經營養生長因子存在及不存在之情況下正常小鼠與DR6基因剔除小鼠之比較所證實，DR6為運動軸突退化所需。圖9C提供細胞之照片，其展示損傷誘發之軸突退化在DR6基因剔除小鼠中延遲。圖1 0 A提供神經元之照片，其展示抗DR6抗體抑制由撤消各種營養因子剝奪神經元之神經生長因子（NGF)而產生的軸突退化。圖1 0B提供連合、感覺及運動神經元中細胞凋亡細胞體之TUNEL染色觀測之其他照片資料，其展示抗DR6 127689.doc -163 - 200844113 抗體抑制各種營養因子剝奪神經元的退化。圖11A提供連合神經元之照片，其展示可藉由DR6-FC延遲連合軸突退化。圖11B提供感覺神經元之照片，其展示由 NGF撤消誘發之感覺軸突退化可經DR6-FC延遲。圖12A提供神經元之照片，其展示使用DR6-AP觀測軸突上之DR6結合部位。圖12B提供NGF存在及不存在之情況下神經元之照片，其展示NGF剝奪後DR6配位體結合部位自軸突消失。圖12C提供對在發育階段E12.5之ΒΑΧ缺乏感覺軸突之研究的照片，其展示β分泌酶（BACE)抑制劑可阻斷NGF 撤消後DR6-AP結合部位自感覺軸突之消失。圖13Α提供獲自各種西方印跡法（Western blotting)程序之資料之照片，該程序中以DR6-AP(左上部）或抗N-APP抗體（右上部）探測神經元細胞之多肽，以及：（1)就多肽結合 DR6之能力選擇多肽；且隨後（2)以抗N-APP抗體探測多肽 (下圖，’’DR6-ECD釣餌"）。此資料鑑別類澱粉前驅蛋白（APP) 為DR6胞外域相關配位體。圖1 3B提供獲自允許觀測軸突條件培養基中用DR6-AP探測之DR6配位體（包括APP多肽）的各種印跡法實驗之資料之照片。此印跡法資料鑑別許多包括35 kDa N末端APP以及C99-APP及C83/C89 APP多肽之 APP多肽。圖14A提供神經元之照片，其展示剝奪NGF後不久出現 APP胞外域脫落。圖14B提供細胞之照片，其展示DR6胞外域結合由培養細胞產生之APP。圖14C提供細胞之照片，其展示DR6為感覺軸突上N-APP之主要受體，且APP結合部位 127689.doc -164- 200844113 在DR6缺乏小鼠的神經元細胞中顯著消耗。圖1 4D提供細胞之照片，其展示DR6功能阻斷抗體破壞DR6胞外域與N-APP 之間的相互作用。圖15A提供神經元之照片，其展示針對N末端APP之多株抗體在連合軸突檢定中阻斷軸突退化。圖1 5B提供神經元之照片，其展示針對N末端APP之多株抗體以及22C11抗APP 單株抗體抑制由NGF移除誘發之局部軸突退化。圖15C提供神經元之照片，其展示藉由抑制β-分泌酶（BACE)活性阻斷之軸突退化可藉由添加Ν-ΑΡΡ援救。圖15D提供神經元之照片，其展示由RNAi移除ΑΡΡ使神經元細胞對由Ν-ΑΡΡ誘發之死亡敏感。圖16A提供神經元之照片，其展示DR6功能為Ν-ΑΡΡ誘發之軸突退化所需，而非由Αβ觸發之退化所需。圖16B提供神經元之照片，其展示功能阻斷DR6抗體未能阻斷由Αβ觸發之軸突退化。圖1 7 Α提供神經元之照片，其展示軸突退化藉由抑制JNK 及上游卡斯蛋白酶-8，而非下游卡斯蛋白酶-3而得以延遲。圖17B提供來自E1 2.5外植體培養物之運動神經元之照片，其展示卡斯蛋白酶-3在細胞體中起作用，卡斯蛋白酶-6在軸突中起作用。圖1 7C提供感覺神經元之照片，其展示儘管卡斯蛋白酶-3並不為軸突退化所需，但ΒΑΧ為其所需。圖17D 提供連合神經元之照片，其展示卡斯蛋白酶-3在細胞體中起作用，而卡斯蛋白酶-6在軸突中起作用。 127689.doc -165-

Claims

200844113 十、申請專利範圍： 1 · 一種活體外抑制死亡受體6 (DR6)與類澱粉前驅蛋白 (APP)結合之方法，其包含在使DR6與APP之結合受抑制之條件下，使DR6多肽及/或APP多肽曝露於一或多種DR6 拮抗劑。 2.如請求項1之方法，其中該一或多種DR6拮抗劑係選自結合DR6之抗體、包含SEQ ID NO: 1之胺基酸1-354的可溶性DR6多肽及結合APP之抗體。 f 3.如請求項2之方法，其中該可溶性DR6多肽包含DR6免疫黏附素。 4. 如請求項3之方法，其中該可溶性DR6多肽包含與免疫球蛋白之Fc區融合的DR6胞外域序列。 5. 如請求項2之方法，其中該結合DR6之抗體結合包含圖1 (SEQ ID NO: 1)之胺基酸 1-349 或 42-349 的 DR6多肽。 6. 如請求項2之方法，其中該結合DR6之抗體為嵌合、人類化或人類抗體。 C 7.如請求項2之方法，其中該結合DR6之抗體競爭性抑制由分別以 ATCC 寄存編號 PTA-8095、PTA-8094 或 PTA-8096 寄存的融合瘤細胞株產生之3F4.4.8、4Β6·9·7或1E5.5.7單株抗體之結合。 8.如請求項2之方法，其中該結合DR6之抗體或可溶性DR6 多肽與一或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白質性聚合物連接。 9·如請求項2之方法，其中該結合ΑΡΡ之抗體為單株抗體。 127689.doc 200844113 1〇·如請求項9之方法，其中該結合APP之單株抗體為嵌合、人類化或人類抗體。 Π·如請求項9之方法’其中該結合APP之單株抗體競爭性抑制該3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7抗體之結合。 1 2·如請求項9之方法，其中該結合APP之抗體與一或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白質性聚合物連接。 13·如請求項1之方法，其中該DR6多肽表現於一或多種哺乳動物細胞之細胞表面上且該一或多種DR6拮抗劑之結合抑制DR6活化或信號轉導。 14·如請求項13之方法，其中在活體外執行該方法以在一或夕種表現DR6之哺乳動物細胞中抑制細胞凋亡。 1 5 ·如明求項丨3之方法，其中該一或多種具有表現於該細胞表面上之DR6多肽的哺乳動物細胞中之至少一者為連合神經tl細胞、感覺神經元細胞或運動神經元細胞。 1 6·如明求項1之方法，其中該一或多種DR6拮抗劑中之至少者抑制DR6與包含SEQ ID NO·· 6之胺基酸66-81的APP 多肽之結合。 1 7·々明求項J之方法，其中該一或多種拮抗劑中之至少一者抑制APP與包含SEQ ID N〇: k胺基酸卜奶的娜多肽之結合。 18· 一種:或多種DR6拮抗劑之料，其係用以製造用於抑制死：文體6 (DR6)與類澱粉前驅蛋白(App)結合之藥物。 θ求項18之用途，其中該一或多種刪拮抗劑係選自結 127689.doc 200844113 合DR6之抗體、包含SEQ ID NO: 1之胺基酸1-354的可溶性DR6多肽及結合APP之抗體。 20.如請求項19之用途，其中該可溶性DR6多肽包含DR6免疫黏附素。 2 1 ·如請求項20之用途，其中該可溶性DR6多肽包含與免疫球蛋白之Fc區融合的DR6胞外域序列。 22. 如請求項19之用途，其中該結合DR6之抗體結合包含圖1 (SEQ ID NO: 1)之胺基酸 1-349 或 42-349 的 DR6多肽。 23. 如請求項19之用途，其中該結合DR6之抗體為嵌合、人類化或人類抗體。 24. 如請求項19之用途，其中該結合DR6之抗體競爭性抑制由分別以 ATCC 寄存編號 PTA-8095、PTA-8094 或 PTA-8096 寄存的融合瘤細胞株產生之3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7單株抗體之結合。 25. 如請求項19之用途，其中該結合DR6之抗體或可溶性DR6 多肽與一或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白質性聚合物連接。 26. 如請求項19之用途，其中該結合APP之抗體為單株抗體。 27. 如請求項26之用途，其中該結合APP之單株抗體為嵌合、人類化或人類抗體。 28. 如請求項26之用途，其中該結合APP之單株抗體競爭性抑制該3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7抗體之結合。 29. 如請求項26之用途，其中該結合APP之抗體與一或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白 127689.doc 200844113 質性聚合物連接。 30. 如請求項18之用途，其中該DR6多肽表現於一或多種哺乳動物細胞之細胞表面上且該一或多種DR6拮抗劑之結合抑制DR6活化或信號轉導。 31. 如請求項30之用途，其中該藥物在一或多種表現dr6之哺乳動物細胞中抑制細胞〉周亡。 32. 如請求項30之料，其中該一或多種具有表現於該細胞表面上之DR6多肽的哺乳動物細胞中之至少一者為連合神經元細胞、感覺神經元細胞或運動神經元細胞。 33·如請求項30之用途，其中該藥物係用於患有神經病狀或病症之哺乳動物。 34·如請求項33之用途，其中該神經病狀或病症為肌萎縮性側索硬化、帕金森氏病（Parkins〇n，s disease)、亨爾頓氏病 (Huntington’s disease)或阿茲海默氏症削〜 disease) 〇 35·如請求項33之用途，其中該神經病狀或病症包含由於中風、大腦或脊趙組織外傷，或神經組織病變導致之神經元細胞或組織損傷。 36·如請求項18之用途，其中該一或多種DR6拮抗劑中之至少一者抑制DR6與包含SEQ ID N〇: 6之胺基酸“^丨的八叩夕月太之結合。 37.如請求項18之用途，其中該一或多種DR6拮抗劑中之至少一者抑制APP與包含SEQ ID N〇:五之胺基酸1_655的1^6 多肽之結合。 127689.doc 200844113 3 8. —種一或多種DR6拮抗劑之用途，其係用以製造用於治療患有神經病狀或病症之哺乳動物的藥物。 39·如請求項38之用途，其中該一或多種DR6拮抗劑係選自結合DR6之抗體、包含SEQ ID NO: 1之胺基酸1-354的可溶性DR6多肽及結合APP之抗體。 40.如請求項39之用途，其中該可溶性DR6多肽包含DR6免疫黏附素。 4 1.如請求項39之用途，其中該可溶性DR6多肽包含與免疫球 ( 蛋白之Fc區融合的DR6胞外域序列。 42·如請求項39之用途，其中該結合DR6之抗體結合包含圖 1(SEQ ID NO·· 1)之胺基酸 1-349或 42_349的 DR6 多肽。 43. 如請求項39之用途，其中該結合DR6之抗體為嵌合、人類化或人類抗體。 44. 如請求項39之用途，其中該結合DR6之抗體競爭性抑制由分別以 ATCC 寄存編號 PTA-8095、PTA-8094 或 PTA-8096 寄存的融合瘤細胞株產生之3F4.4.8、4B6.9.7或1E5.5.7單 ( 株抗體之結合。 45. 如請求項39之用途，其中該結合DR6之抗體或可溶性DR6 多肽與一或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白質性聚合物連接。 46. 如請求項39之用途，其中該結合APP之抗體為單株抗體。 47. 如請求項46之用途，其中該結合APP之單株抗體為嵌合、人類化或人類抗體。 48. 如請求項46之用途，其中該結合APP之單株抗體競爭性抑 127689.doc 200844113 制單株抗體22C11之結合。 49·如4求項46之用途，其中該結合APP之單株抗體與一或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白貝性聚合物連接。 5 〇. 士明求項38之用途，其中該一或多種DR6拮抗劑中之至少一者抑制1^6與包含SEQ ID NO: ό之胺基酸66_81的App 多肽之結合。 51·如請求項38之用途，其中該一或多種DR6拮抗劑中之至少一者抑制APP與包含SEQ ID N〇: 胺基酸1_655的1^6 多肽之結合。 52·如巧求項38之用途，其中該神經病狀或病症為肌萎縮性側索硬化、帕金森氏病、亨爾頓氏病或阿茲海默氏症。 53·如請求項38之用途，其中該神經病狀或病症包含由於中風大腦或脊髓組織外傷，或神經組織病變導致之神經元細胞或組織損傷。 54·如請求項38之用途，其中該藥物係與一或多種其他治療劑組合使用。 55·如請求項38之用途，其中該藥物係用於注射、輸液或灌注。 56·如明求項54之用途，其中該_或多種其他治療劑係選自、、田胞屑亡抑制劑、EGFR抑制劑、卜分泌酶抑制劑、 γ刀泌酶抑制副、膽鹼_酶抑制劑、抗⑽抗體及舰Μ 受體拮抗劑。 57· -種鑑別抑制DR6與Αρρ之結合的所關注分子之方法，該 127689.doc 200844113 方法包含：在所關注分子存在或不存在之情況下組合DR6與 APP ;及在該所關注分子存在下偵測對DR6與APP結合之抑制。 5 8.如請求項57之方法，其中該所關注分子為結合APP之抗體、結合DR6之抗體或包含SEQ ID NO: 1之胺基酸1-3 54 的可溶性DR6多肽。 59·如請求項57之方法，其中在無細胞檢定中執行在該所關 { 注分子存在下偵測對DR6與APP結合之抑制。 60·如請求項57之方法，其進一步包含：使用在細胞表面上表現DR6之哺乳動物細胞執行該方法；及偵測對DR6活化或信號轉導之抑制。 6 1 · —種組合物，其含有根據如請求項57之方法鑑別的所關注分子。 62.如請求項61之組合物，其進一步含有載劑。 ( 63 ·如請求項62之组合物，其中該載劑為醫藥學上可接受之載劑。 64· —種分離之DR6拮抗劑，其包含（a)結合包含SEQ ID NO: 1 之DR0多肽之單株抗體或（b)可溶性DR0多肽或（c)結合包含SEQ ID NO·· 6之APP的單株抗體，其中該DR6拮抗劑抑制APP與DR6之結合。 65·如請求項64之分離之DR6拮抗劑，其中該可溶性DR6多肽包含DR6免疫黏附素。 127689.doc 200844113 66.如請求項65之分離之DR6拮抗劑，其中該可溶性DR6多肽包含與免疫球蛋白之Fc區融合的DR6胞外域序列。 67·如請求項64之分離之DR6拮抗劑，其中該結合DR6之抗體結合包含圖1 (SEQ ID NO: 1)之胺基酸1-349或42-349的 DR6多肽。 68. 如請求項64之分離之DR6拮抗劑，其中該結合DR6之抗體為嵌合、人類化或人類抗體。 69. 如請求項64之分離之DR6拮抗劑，其中該結合DR6之抗體競爭性抑制由分別以ATCC寄存編號PTA-8095、PTA-8094 或PTA-8096寄存的融合瘤細胞株產生之3F4.4.8、4B6.9.7 或1E5.5.7單株抗體之結合。 70·如請求項64之分離之DR6拮抗劑，其中該結合DR6之抗體或可溶性DR6多肽與一或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白質性聚合物連接。 71·如請求項64之分離之DR6拮抗劑，其中該DR6拮抗劑抑制 DR6與包含SEQ ID NO: 6之胺基酸66-81的APP多肽之結合。 72. 如請求項64之分離之DR6拮抗劑，其中該拮抗劑結合藉由空間抑制作用來抑制DR6與APP之結合的抗原決定基。 73. 如請求項64之分離之DR6拮抗劑，其中該結合APP之單株抗體為嵌合、人類化或人類抗體。 74. 如請求項64之分離之DR6拮抗劑，其中該結合APP之抗體競爭性抑制22C 11單株抗體之結合。 75. 如請求項64之分離之DR6拮抗劑，其中該結合APP之抗體 127689.doc 200844113 與一或多種選自由聚乙二醇、聚丙二醇及聚環氧烷組成之群的非蛋白質性聚合物連接。 76·如請求項64之分離之dr6拮抗劑，其中該拮抗劑抑制DR6 與包含SEQ ID NO·· 6之胺基酸66-81的APP多肽之結合。 77. —種醫藥組合物，其包含如請求項64-76中任一項之DR6 拮抗劑及醫藥學上可接受之載劑。 78. —種診斷患有神經疾病或易患神經疾病之患者的方法，其包含測試獲自該患者之樣本中具有與SEQ ID N〇:工之 DR6多肽序列不同的多肽序列之DR6多肽變體的存在。 79·如請求項77之方法，其進一步包含鑑別該多肽變體為對 APP多肽具有與對SEq ID N0: !之DR6多肽序列所觀察到的親和力不同之親和力。 80· —種製品，其包含： ⑷包含有效量之如請求項64_76中任—項之DR6結抗劑的物質之組合物； (b) 容納該組合物之容器；及 (c) 黏附至该容菇之標籤，或包括於該容器中之藥口說明書’其提供該DR6拮抗劑在治療神經病狀或病症中用說明。 $ 8 1 · —種套組，其包含：及容納於該容器内第一容器，位於該容器上之標籤之組合物；其中該組合物包括在至細胞中有效抑制細胞凋亡少-種類型之哺乳動物神經元之活性劑，該位於該容器上之 127689.doc 200844113 標籤或包括於該容器中之单σ ~ na n卜杀α口％明書指示該組合物可用於在至V冑類5L之甫礼動物神經元細胞中抑制細胞〉周亡，且該組合物中之該活性劑包含至少一種如請求項 64-76中任一項之DR6拮抗劑；第二容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液；及使用 DR6拮抗劑在至少一種類型之哺乳動物神經元細胞中抑制細胞凋亡之用法說明書。 127689.doc 10-