WO2015076282A1 - 免疫制御剤 - Google Patents

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WO2015076282A1
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antibody
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大輔 藤倉
利光 上出
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国立大学法人北海道大学
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Definitions

  • the present invention relates to an immunoregulator comprising as an active ingredient a substance capable of suppressing or inducing signal transduction due to binding between death receptor 6 (Death Receptor, DR6) and its ligand syndecan (Syndecan-1, Sdc1). .
  • DR6 death receptor 6
  • Sdc1 ligand syndecan
  • DR6 is a member of the death receptor family and is also referred to as TNF receptor superfamily member 21 (TNFRSF21) or TR9.
  • TNFRSF21 TNF receptor superfamily member 21
  • TR9 is a type I transmembrane receptor having four extracellular cysteine-rich motifs and one cytoplasmic death domain structure (Non-patent Document 1).
  • DR6 expression has been observed in tissues such as the heart, brain, placenta, pancreas, lymph node, thymus, prostate tissue, skeletal muscle, kidney, and testis, and plays an important role in various biological control mechanisms. In addition, the relationship with various diseases has been pointed out.
  • DR6 may be an aggravating factor of multiple sclerosis (Non-patent Document 2).
  • DR6 may be an asthma exacerbation factor (Non-patent Document 3).
  • Non-Patent Document 4 A patent application has been filed for a DR6 antagonistic antibody that becomes a DR6 antagonist that inhibits or blocks the interaction between APP and APP (Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 reports that overexpression of DR6 in a specific cell line transduced with a gene encoding DR6 causes both NF-kB and JNK activation and apoptosis. Yes.
  • T cells do not function substantially normally in JNK activation, and when protein antigens are administered to DR6 ( ⁇ / ⁇ ) mice, these T cells overgrow, It has been reported to show a strong bias to the Th2 response (Non-Patent Document 5).
  • DR6 ( ⁇ / ⁇ ) mice develop CNS disease compared to wild-type littermates. And high resistance to both progression. That is, DR6 is involved in leukocyte infiltration and may function in the induction and progression of experimental autoimmune encephalomyelitis (Non-patent Document 6).
  • DR6 is considered to be an important receptor molecule that serves as a starting point of intracellular signal transduction related to the immune mechanism, particularly the activation control of peripheral T cells. Therefore, a molecule that can specifically bind to DR6 and regulate the receptor function related to DR6 immune control becomes a trigger molecule that activates or suppresses the immune function via DR6 signaling, and serves as an immunoregulator. It is expected that it can be used.
  • DR6 does not show binding affinity with previously known TNF ligand family molecules, and the identity of DR6 ligand that can specifically bind to DR6 and induce a signal relating to immune regulation is However, it is unknown.
  • Sdc1 is also called CD138 antigen and has homology in the transmembrane domain and cytoplasmic domain together with syndecan 2 also called fibroglycan, syndecan 3 also called N-syndecan, and syndecan 4 also called amphiglycan. It is a transmembrane heparan sulfated proteoglycan polymer (HSPG) that constitutes the syndecan family.
  • HSPG transmembrane heparan sulfated proteoglycan polymer
  • HSPG has a distribution specific to cell types and is known to be involved in interactions with extracellular matrix proteins, cell surface molecules, or soluble proteins such as cytokines.
  • extracellular matrix proteins cell surface molecules, or soluble proteins such as cytokines.
  • cytokines extracellular matrix proteins
  • tyrosine residues whose positions are highly conserved in this transmembrane domain and intracellular domain, and are involved in intracellular signal transduction by phosphorylation of any tyrosine residue. The possibility has been pointed out.
  • hSdc1 A gene encoding human Sdc1 (hSdc1) has already been cloned (Non-patent Document 7).
  • hSdc1 is composed of 310 amino acid residues, including the extracellular domain of amino acids 1 to 251 followed by the hydrophobic transmembrane region of 25 amino acid residues (amino acids 252 to 276) and the last 34 amino acid residues (amino acids 277 to 310). Contains the cytoplasmic domain.
  • Amino acids 1-17 are secretion signals, which are useful when secreting Sdc1 from cells that biosynthesize hSdc1, but are understood not to be necessary for the physiological activity of hSdc1.
  • glycosaminoglycan GAG
  • amino acid residues at positions 45 and 47 are known to lose their ability to bind heparan sulfate by substituting these with other amino acid residues, and at the same time lose their physiological activity as hSdc1.
  • Sdc1 is involved in suppression of T cell activation by specifically binding to DR6, that is, it is a physiological ligand of DR6 with respect to the control of immune response by DR6.
  • An object of the present invention is to provide a molecule that can be used as an immunoregulator and can regulate a receptor function relating to DR6 immunoregulation, and a screening method for an immunoregulator using DR6 and syndecan-1. is there.
  • Sdc1 is a DR6 ligand capable of specifically binding to DR6 and inducing signal transduction related to immune control, and completed the following inventions.
  • An immunoregulator comprising, as an active ingredient, a physiologically active substance having a specific binding ability to DR6 and a signal transduction control ability induced by specific binding between DR6 and Sdc1.
  • a physiologically active substance having a specific binding ability to DR6 and a signal transduction control ability induced by specific binding between DR6 and Sdc1.
  • the physiologically active substance is a polypeptide having the amino acid sequence of any one of the following a) to d): a) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8, b) an amino acid sequence in which one or several amino acids except the 45th and 47th amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 have been deleted and / or substituted, or SEQ ID NO: 6 or sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence obtained by adding one or several amino acids to the amino acid sequence shown in No.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or 12; and d) one or several amino acids excluding the 45th and 47th amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12.
  • the anti-DR6 agonist antibody is one or more anti-DR6 antibodies selected from the group consisting of a) to e) below: a) Heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 20
  • An anti-DR6 antibody comprising a light chain CDR1 comprising an amino acid sequence, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence Trp-Ala-Ser, and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22; b) heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown
  • anti-DR6 antagonist antibody is one or more anti-DR6 antibodies selected from the group consisting of f) and g) below; f) heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 64, heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 66, heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68, shown in SEQ ID NO: 70
  • An anti-DR6 antibody comprising a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence, a light chain CDR2 comprising the Arg-Val-Ser amino acid sequence and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 72, and g) represented by SEQ ID NO: 74
  • Heavy chain CDR1 consisting of an amino acid sequence
  • heavy chain CDR2 consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76
  • heavy chain CDR3 consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO:
  • a method for screening a physiologically active substance having the ability to control signal transduction induced by specific binding between DR6 and Sdc1, comprising the following steps a) to e): a) a step of allowing DR6, a functional equivalent of DR6, or a protein containing at least a functional extracellular domain of DR6, and a test substance to coexist with at least one of the polypeptides defined in (3), b) Signal transduction induced by specific binding of DR6, a functional equivalent of DR6 or a protein containing at least a functional extracellular domain of DR6 in step a) and at least one of the polypeptides defined in (3) Detecting step, c) coexistence of DR6, a functional equivalent of DR6 or a protein containing at least a functional extracellular domain of DR6 and at least one of the polypeptides defined in (3) in the absence of a test substance, d) Signal transduction induced by specific binding of DR6, a functional equivalent of DR6 or a protein
  • Hybridoma cell line clone 25-1 deposited as deposit number NITE BP-01729
  • Hybridoma cell line clone 177-1 deposited as deposit number NITE BP-01730
  • Hybridoma cell line clone 82-30 hybridoma cell line clone 186-18 deposited under accession number NITE BP-01732
  • hybridoma cell line clone 180-10 deposited under accession number NITE BP-01733
  • accession number Hybridoma cell line clone 46-15-23 deposited as NITE BP-01734
  • hybridoma cell line clone 100-11 deposited as accession number NITE BP-01735 A hybridoma cell line selected from the group consisting of:
  • an immunoregulatory agent based on an action mechanism that has not been known so far can be provided, and rheumatism, systemic lupus erythematosus (SLE), multiple sclerosis, transplantation disease, Crohn's disease, ulceration It is possible to develop new therapeutic agents for allergic diseases such as autoimmune diseases such as colitis, hay fever, atopy, and severe drug eruption.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram of the structure of wild type DR6 and soluble recombinant mouse DR6 (mDR6-hFcm). It is a figure which shows the result of the FACS analysis regarding the naive cell derived from the mouse
  • FIG. 2 is a graph showing the time course of the binding ability of LPS-stimulated B cells to mDR6-hFcm and the expression pattern of CD86, an activation marker. It is a graph which shows a time-dependent change of the expression level of DR6 mRNA in the T cell stimulated with the anti-CD3 antibody. It is a figure which shows the binding ability with respect to mDR6-hFcm of A20 cell, DO11.10-T cell, WEHI231 cell, and WEHI3B cell. It is a figure which shows the binding ability of A20 cell with respect to mTNFR2-hFcm, mFas-hFcm, mDR5-hFcm and mDR6-hFcm.
  • FIG. 3 is a view showing the binding ability of mSdc1 mutant cells expressing mSdc1 mutants in which both serine at positions 45 and 47 of mSdc1 are substituted with alanine to mDR6-hFcm.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of mSdc1-His on agonists (suppression of IL2 production by T cells) on DO11.10-T cells. It is a graph showing that suppression of IL2 production by mSdc1-His is not observed in DO11.10-T cells into which shRNA specific for mDR6 has been introduced. It is a figure which shows the expression change of each protein of Fas, FasL, CD69, PD-1, and CD3 in the DO11.10-T cell stimulated with the anti-CD3 antibody and mSdc1-His.
  • the effects of monoclonal antibodies produced by clone 25-1, clone 25-2, clone 25-3, clone 100-11 and clone 177-1 were determined from the extracellular domain of mDR6 and the transmembrane region and intracellular domain of mCD40. It is a graph which shows the result tested using the chimeric protein which becomes. 6 is a graph showing the IL2 production inhibitory effect of monoclonal antibody 25-1 on DO11.10-T cells. IL2 production is shown when anti-mDR6 antibody-producing hybridoma culture supernatant (100 ⁇ L) or purified antibody (100 ⁇ g / mL) is added to DO11.10-T cells and A20 cells pulsed with OVA peptide.
  • FIG. 6 It is a figure which shows the result of the FACS analysis regarding each expression cell of CD3, DR6, CD4, and CD8 in the whole spleen cell group prepared from the SLE model mouse which administered the monoclonal antibody 25-1. It is a graph which shows the increase (average value) of the presence rate of DR6 positive cell observed by the panel B and the panel D of FIG. 6 is a graph showing that the prevalence of CD4 positive cells (helper T cells) expressing DR6 is decreased by administering monoclonal antibody 25-1 to SLE model mice in the onset of proteinuria.
  • the present invention relates to an immunoregulator having as an active ingredient a physiologically active substance having a specific binding ability to DR6 and a control ability of signal transduction induced by specific binding between DR6 and Sdc1.
  • DR6 in the present invention refers to a type I transmembrane receptor having four extracellular cysteine-rich motifs (CRD1 to CRD4) and one cytoplasmic death domain structure.
  • Human DR6 (hDR6) is a protein with a total of 655 amino acid residues consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 reported in Non-Patent Document 1, and includes a putative signal sequence (amino acids 1-41), extracellular domain (amino acids 42-211), the transmembrane domain (amino acids 351-370) and the cytoplasmic domain (amino acids 371-655).
  • Mouse DR6 (mDR6) is a protein with a total of 655 amino acid residues consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 reported in Non-Patent Document 5, and the amino acid sequence identity with hDR6 is 88%.
  • DR6 in the present specification includes a naturally occurring DR6 mutant consisting of an amino acid sequence partially different from SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 encoded by a so-called gene polymorphism, a naturally occurring truncated or secreted form (Eg, solubilized DR6 containing extracellular domain sequences), naturally occurring splice variants, and naturally occurring allelic variants.
  • DR6 when simply expressed as DR6, it means any naturally occurring DR6 derived from any mammal including human.
  • the DR6 can be isolated and purified from nature, or can be produced by genetic engineering or chemical synthesis.
  • variable means, for example, in the case of DR6 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, at least about 80% or more, preferably at least about 85% or more with these amino acid sequences. More preferably at least about 90% or more, most preferably at least about 95% or more of DR6 consisting of an amino acid sequence or a fragment thereof, or an extracellular domain thereof.
  • variant means, for example, in the case of DR6 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, one or more amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 DR6 consisting of a deleted, substituted and / or added amino acid sequence, a polypeptide having one or more amino acid residues added to the N-terminal or C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2 Alternatively, DR6 in which one or more amino acid residues are deleted from the N-terminal or C-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is also included.
  • amino acid sequence identity is the maximum percentage obtained when the amino acid sequences to be compared are aligned using an appropriate software program commonly used by those skilled in the art, such as the sequence comparison computer program ALIGN-2. Refers to sequence identity.
  • HSdc1 in the present specification is a transmembrane heparan sulfated proteoglycan having a total of 310 amino acid residues consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 reported in Non-Patent Document 7 and having heparan sulfate bound at positions 45 and 47.
  • Mouse Sdc1 (mSdc1) is a transmembrane heparan sulfated proteoglycan polymer consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and having all 311 amino acid residues to which heparan sulfate is bonded at positions 45 and 47.
  • Sdc1 includes a naturally occurring Sdc1 mutant consisting of an amino acid sequence partially different from SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 encoded by a so-called gene polymorphism, a naturally occurring truncated or secreted form (for example, solubilized Sdc1) containing extracellular domain sequences, naturally occurring splice variants and naturally occurring allelic variants.
  • solubilized Sdc1 when it is simply expressed as Sdc1, it means any naturally occurring Sdc1 derived from any mammal including human.
  • the Sdc1 can be isolated and purified from nature, or can be produced by genetic engineering or chemical synthesis.
  • signal transduction induced by specific binding between DR6 and Sdc1 is initiated by the ligand-receptor interaction of the two molecules and leads to suppression of activation of T cells which are immune cells.
  • the signal transduction can be monitored by measuring the amount of interleukin 2 (IL2) produced by the T cells.
  • IL2 interleukin 2
  • the signal transduction is transmitted by the interaction between the intracellular death domain of DR6 and other proteins in the cell, functions, activities, forms, chemical structures, etc. of intracellular molecules other than DR6 involved in signal transduction, etc. By measuring this change, the signal transduction referred to in the present invention may be monitored.
  • signal transduction control ability refers to the ability to initiate, enhance or amplify the above signal transduction, or prevent, inhibit, neutralize, block, or stop the initiation of the signal transduction. The ability to interrupt, suspend or attenuate. Unless otherwise specified in the present invention, the ability to initiate, enhance or amplify the signal transduction and the ability to prevent, inhibit, block, stop, interrupt or attenuate the initiation of the signal transduction. Is expressed as suppression ability. Further, a substance having the ability to bind to DR6 and the inducing ability will be referred to as a DR6 agonist, and a substance having the ability to bind to DR6 and the inhibitory ability will be referred to as a DR6 antagonist.
  • DR6 antagonist or “DR6 agonist” are used in the broadest sense and control signal transduction leading to suppression of T cell activation by binding of DR6 and Sdc1, either in vitro, in situ, in vivo or ex vivo. Includes any molecule.
  • DR6 antagonists or DR6 agonists contemplated for the present invention include anti-DR6 antibodies, Sdc1, Sdc1 mutants, solubilized Sdc1, solubilized Sdc1 mutants or fusion proteins comprising these and other proteins, multimers thereof, or Examples thereof include a low molecular compound that binds to DR6 and suppresses the binding between DR6 and Sdc1.
  • one aspect of the “immunoregulator” in the present invention is an agonist or antagonist related to signal transduction that has the ability to bind to DR6 and leads to suppression of T cell activity initiated by specific binding between DR6 and Sdc1. And includes substances for initiating, enhancing, amplifying, preventing, deterring, blocking, stopping, interrupting or attenuating an immune response involving T cell activation.
  • Another embodiment of the “immunoregulator” in the present invention has the ability to bind to Sdc1, and prevents signal transduction leading to suppression of T cell activity initiated by specific binding between DR6 and Sdc1, Contains substances to deter, block, stop, interrupt or attenuate.
  • an immunoregulator having a specific binding ability to DR6 and an ability to induce signal transduction leading to suppression of T cell activation induced by specific binding between DR6 and Sdc1. That is, this embodiment relates to an immunoregulator as a DR6 agonist that can bind to DR6 to induce the signal transduction and suppress T cell activation.
  • Sdc1 One embodiment of the DR6 agonist that is an immunoregulator of the present invention is hSdc1, which is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, or mSdc1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • mSdc1 which is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, binds to mDR6 under physiological conditions to induce signal transduction leading to suppression of T cell activity. (1) to (7).
  • mDR6-hFcm a gene encoding mDR6 (SEQ ID NO: 3) was recombined to prepare a soluble recombinant mDR6 (mDR6-hFcm).
  • This recombinant protein is a dimer formed by disulfide bonding of two molecules of a fusion protein consisting of the extracellular region of mDR6 (amino acid sequence 1 to 350, SEQ ID NO: 88) and the Fc region of human IgG. It is.
  • FIG. 1 A schematic diagram of the structure of wild-type DR6 and mDR6-hFcm is shown in FIG.
  • naive cells derived from mouse spleen using mDR6-hFcm (labeled mDR6-hFcm) labeled with APC (allophycocyanin), they were separated by FACS.
  • labeled mDR6- Cells to which hFcm was bound that is, cells expressing DR6 ligand, were detected (FIG. 2, panel D, upper left of lymphocytes).
  • DR6 ligand-expressing cells were stained with labeled antibodies specific for each of cell-specific marker proteins B220, CD3, CD4, CD8, NK1.1, CD11c, CD49b and F4 / 80, DR6 ligand expression Cells were stained with a labeled antibody against B220, a B cell specific marker protein (FIG. 3, upper right portion of panel showing B220 cells).
  • B cells isolated from mouse spleen were stimulated with LPS, and the binding of the same cells to labeled mDR6-hFcm was measured over time.
  • the binding of labeled mDR6-hFcm to B cells was stimulated with LPS. It increased on the second day after (FIG. 4).
  • CD86 a B cell activation marker measured simultaneously, also increased on the second day after LPS stimulation (FIG. 5). From these, it was confirmed that the expression of DR6 ligand is induced in the activation phase of B cells.
  • labeled hDR6-hFcm was prepared by replacing mDR6 (residues 1 to 350) of labeled mDR6-hFcm with the extracellular region of hDR6 (amino acid sequence 1 to 350, SEQ ID NO: 86).
  • An expression vector (pMXsIG / hSdc1) and a control vector (pMXsIG) that were incorporated so as to allow expression were introduced to prepare three types of transformed cells.
  • the transformed cells and DO11.10-T cells were co-cultured in RPMI 1640 medium containing 10% FCS containing the antigen OVA 323-339, and then the amount of IL2 produced in each medium was measured by ELISA.
  • IL2 production in transformed A20 cells expressing mSdc1 or hSdc1 decreased to 170 pg / ml or less (FIG. 11). That is, it was confirmed that expression of hSdc1 or mSdc1 in antigen-presenting cells suppresses T cell activation.
  • Sdc1 is expressed on the cell membrane of B cells and binds to DR6 expressed on the cell membrane of T cells to suppress the activation of T cells. That is, it has a function of suppressing IL2 production by T cells.
  • Sdc1 has a specific binding ability to DR6 and can be used as an immunoregulator having an ability to induce signal transduction leading to suppression of T cell activation.
  • one of the preferred embodiments of the present invention relates to an immunoregulator or T cell activation inhibitor comprising Sdc1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 8 as an active ingredient.
  • Sdc1 which is one of the immunoregulators of the present invention, is produced as a recombinant protein by applying a general genetic recombination technique to a nucleic acid encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7. can do.
  • mammalian cells such as human fetal kidney cell-derived HEK293T cells are used as host cells in order to impart appropriate sugar chains to positions 45 and 47 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8. It is preferable to use it.
  • Examples of general genetic recombination techniques including expression of foreign proteins in mammalian cells include various methods that are described in the above-mentioned Sambrook et al. Or other textbooks or handbooks in this field and widely used by those skilled in the art. it can.
  • Sdc1 variants that are agonists
  • Another embodiment of the present invention is that one or more amino acids except the 45th and 47th amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 are deleted. And / or a substituted amino acid sequence, and / or an amino acid sequence obtained by adding one or more amino acids to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8, and specific binding ability to DR6 and DR6
  • a functional protein consisting of a certain amino acid sequence allows deletion, substitution and / or addition of amino acids within a certain range while maintaining its function.
  • different amino acid residues confirmed by alignment of amino acid sequences between hSdc1 and heterologous Sdc1 such as mSdc1, or different amino acid residues confirmed by alignment of amino acid sequences between syndecan families.
  • the functionality of the original protein is not lost even if they are replaced with each other.
  • amino acid gaps that do not have corresponding amino acids that are confirmed by amino acid sequence alignment
  • the function of the original protein may not be lost even if amino acids corresponding to the gaps are deleted or added. is there.
  • Leu in this specification the natural amino acid is expressed in three letters
  • Ile Asp and Glu
  • Asn and Gln Lys and Agr
  • Ser and Thr others known to those skilled in the art as conservative substitutions.
  • the function of the original protein may not be lost even by substitution between amino acids.
  • substitution positions and amino acids that can maintain the function can be selected based on protein secondary structure prediction and / or three-dimensional structure prediction, hydrophobicity, hydrophilicity, charge, side chain bulk and other amino acid physics. It is possible to predict with high accuracy based on chemical characteristics.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and / or added.
  • Polypeptides having the ability to bind to DR6 and induce signal transduction leading to suppression of T cell activation can be used as Sdc1 agonist mutants for DR6 and constitute the immunoregulatory agent of the present invention.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which amino acid residues at positions 45 and 47 of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 are substituted with other amino acid residues cannot be subjected to sugar chain modification with heparan sulfate, As a result, the polypeptide cannot exhibit a function as an agonist for DR6.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which amino acid residues at positions 45 and 47 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 8 are substituted or deleted is not included in the present invention.
  • the 1st to 17th amino acid sequences of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 are so-called signal sequences that are useful when Sdc1 is secreted or placed in a membrane in cells that biosynthesize Sdc1. Such a signal sequence is not necessary for ligand function for DR6. Therefore, a polypeptide comprising an amino acid sequence in which amino acids 1 to 17 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 are deleted can also be used as an Sdc1 agonist variant for DR6, Construct a control agent.
  • the Sdc1 mutant which is one of the immunoregulators of the present invention is a general genetic recombination including a method for introducing a desired mutation into a nucleic acid encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7 By applying the technique, it can be produced as a recombinant protein.
  • mammalian cells such as HEK293T cells can be used as expression host cells in order to impart appropriate sugar chains to positions 45 and 47 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8.
  • General gene recombination techniques including expression of foreign proteins in such mammalian cells and methods for introducing desired mutations are described in Sambrook et al. Or other textbooks or handbooks in the field, and are widely used by those skilled in the art. Can be mentioned the methodology.
  • Solubilized Sdc1 which is an agonist
  • a further embodiment of the present invention consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12, and has the ability to induce specific binding ability with DR6 and signal transduction induced by specific binding between DR6 and Sdc1. It is an immunoregulatory agent that is a polypeptide (hereinafter referred to as solubilized Sdc1).
  • the solubilized Sdc1 is a polypeptide corresponding to all or part of the extracellular domain of Sdc1, and the amino acid sequence thereof is the amino acid sequence 1 to 250 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 1 to 1 of SEQ ID NO: 8. It corresponds to the 251st amino acid sequence. Since the solubilized Sdc1 does not have a transmembrane region, it is not anchored to the membrane and can exist in a solubilized state in the cytoplasm, blood or other liquid medium.
  • Solubilized Sdc1 which is one of the immunoregulators of the present invention, can be obtained by applying a general gene recombination technique to a nucleic acid encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, thereby Can be manufactured as.
  • solubilized Sdc1 may be produced by protease digesting Sdc1 obtained by applying a general genetic recombination technique to the nucleic acid encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7. .
  • mammalian cells such as HEK293T cells are preferably used as host cells in order to impart appropriate sugar chains to positions 45 and 47 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12.
  • General genetic recombination techniques including expression of foreign proteins in mammalian cells and methods for introducing desired mutations are described in Sambrook et al. Or other textbooks or handbooks in the field and widely used by those skilled in the art. Can be mentioned.
  • a solubilized Sdc1 variant that is an agonist is the lack of one or more amino acids except the 45th and 47th amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12.
  • a specific amino acid sequence comprising a lost and / or substituted amino acid sequence and / or an amino acid sequence obtained by adding one or more amino acids to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12, and specific binding ability to DR6
  • an immunoregulator that is a polypeptide having an activity of inducing signal transduction induced by specific binding between DR6 and Sdc1 (hereinafter referred to as a solubilized Sdc1 mutant).
  • a solubilized Sdc1 mutation comprising an amino acid sequence in which the amino acid is substituted, deleted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12 as described above with respect to the Sdc1 mutant.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which amino acids 1 to 17 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12 are deleted also induces signal transduction that leads to the ability to bind DR6 and suppress T cell activation. It constitutes the immunoregulatory agent of the present invention as a solubilized Sdc1 mutant.
  • the C-terminal amino acid residue of SEQ ID NO: 10 corresponds to the 250th amino acid residue of SEQ ID NO: 6, but the 251st and subsequent amino acid sequences of SEQ ID NO: 6 are present at the C-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10. Even if several to a dozen or more are added, or conversely several to a dozen or more C-terminal of SEQ ID NO: 10 are deleted, the polypeptide comprising such an amino acid sequence has a specific binding ability to DR6 and DR6. It has the activity of inducing signal transduction related to immune control. The same applies to SEQ ID NO: 12.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence to which several to dozens of amino acids are added or deleted at the C-terminus of SEQ ID NO: 10 or 12 is also used as a solubilized Sdc1 mutant. Constitute.
  • the solubilized hSdc1 mutant that is an immunoregulator of the present invention is a general genetic recombination technique including a method for introducing a desired mutation into a nucleic acid encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11. Can be produced as a recombinant protein.
  • mammalian cells such as HEK293T cells are preferably used as host cells in order to impart appropriate sugar chains to positions 45 and 47 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12.
  • General gene recombination techniques including expression of foreign proteins in mammalian cells and methods for introducing desired mutations are described in Sambrook et al. And other textbooks or handbooks in this field and widely used by those skilled in the art. Can be mentioned.
  • Anti-DR6 Agonist Antibodies Another exemplary embodiment of a DR6 agonist is an anti-DR6 that specifically binds DR6 and can induce signaling induced by specific binding of DR6 and Sdc1. It is an agonistic antibody.
  • anti-DR6 agonist antibodies include monoclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies.
  • an immunoregulatory agent that is a DR6 agonist can comprise an anti-DR6 agonist antibody that binds to the DR6 extracellular domain or fragment thereof.
  • the anti-DR6 antibody of the present invention can be obtained by a general antibody production method known to those skilled in the art. Specifically, DR6, preferably DR6 produced by genetic engineering techniques, or a part thereof, or a suitable carrier substance (eg, keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, bovine thyroglobulin, soybean trypsin inhibitor, etc.)
  • Anti-DR6 antibody-producing cells are obtained by immunizing the conjugate with non-human mammals such as rats, rabbits, human antibody-producing transgenic mice, and the like, together with an immunostimulant (such as Freund's complete or incomplete adjuvant) as necessary. Groups can be induced and anti-DR6 antibodies can be prepared.
  • a gene encoding DR6 is introduced into an appropriate expression vector, immunized by expressing DR6 in a non-human mammal, an anti-DR6 antibody-producing cell group is induced, and an anti-DR6 antibody is prepared. Also good.
  • the anti-DR6 antibody of the present invention is preferably a monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody is obtained by culturing a hybridoma obtained by fusing an anti-DR6 antibody-producing cell and an immortalized cell line having no autoantibody-producing ability, for example, a myeloma cell (myeloma cell), to the antigen used for immunization.
  • an immortalized cell line having no autoantibody-producing ability for example, a myeloma cell (myeloma cell)
  • it can be obtained by selecting a clone producing a monoclonal antibody exhibiting specific affinity by an in vitro binding assay such as immunoprecipitation or radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunoassay (ELISA).
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme-linked immunoassay
  • the steps for constructing such a method for producing a monoclonal antibody include those for preparing a desired antibody, including an antigen production step and a monoclonal antibody bioactivity and an assay for its recognition specificity, which will be described in the following examples.
  • a well-known process can be used.
  • antibody heavy and light chains each have a variable region on the N-terminal side and a constant region (CH, CL) on the C-terminal side.
  • the variable regions of the heavy chain and the light chain each have a complementarity determining region (CDR), and this part is responsible for the specificity of antigen recognition.
  • CDR complementarity determining region
  • the part other than the CDR has a role of retaining the structure of the CDR, and is called a framework region (FR).
  • a first complementarity determining region CDR1
  • CDR2 CDR2
  • CDR3 CDR3
  • the three complementarity determining regions in the heavy chain variable region are called heavy chain complementarity determining regions.
  • CDR3 complementarity determining regions of the first complementarity determining region (CDR1), the second complementarity determining region (CDR2) and the third complementarity determining region (CDR3).
  • CDR3 complementarity determining regions in the light chain variable region.
  • the anti-DR6 agonist antibody of the present invention includes an anti-DR6 agonist antibody having a CDR containing a novel amino acid sequence, preferably a monoclonal antibody.
  • an antibody (25-1 antibody) produced by clone 25-1 described in Examples described later can be mentioned.
  • Clone 25-1 was deposited domestically as a deposit number NITE P-01729 (indication of identification: 25-1) on October 17, 2013 at the Patent Microorganism Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation, October 10, 2014. It has been deposited internationally as the deposit number NITE BP-01729 (identification indication: 25-1) on the 27th of the month.
  • the anti-DR6 antibody produced by clone 25-1 comprises a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18.
  • An anti-DR6 comprising: a heavy chain CDR3 comprising: a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20; a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence Trp-Ala-Ser; and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 It is a monoclonal antibody.
  • Another preferred embodiment of the anti-DR6 agonist antibody of the present invention includes an antibody (177-1 antibody) produced by clone 177-1 described in the Examples described later.
  • Clone 177-1 was deposited in Japan as a deposit number NITE P-01730 (indication of identification: 177-1) on October 17, 2013 at the Patent Microorganism Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation, October 10, 2014. It has been deposited internationally as deposit number NITE BP-01730 (indication of identification: 177-1) on the 27th of May.
  • the anti-DR6 antibody produced by clone 177-1 consists of a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28.
  • a heavy chain CDR3 comprising: a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30; a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence Tyr-Ala-Ser; and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32.
  • an antibody produced by clone 82-30 (82-30 antibody) described in the Examples below can be mentioned.
  • Clone 82-30 was deposited domestically as a deposit number NITE P-01731 (indication of identification: 82-30) on October 17, 2013 at the Patent Microorganism Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation, October 10, 2014. It has been deposited internationally as deposit number NITE BP-01731 (indication of identification: 82-30) on the 27th of May.
  • the anti-DR6 antibody produced by clone 82-30 consists of a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38.
  • An anti-DR6 comprising: a heavy chain CDR3 comprising: a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40; a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence Trp-Ala-Ser; and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 It is a monoclonal antibody.
  • Another preferred embodiment of the anti-DR6 agonist antibody of the present invention includes an antibody (186-18 antibody) produced by clone 186-18 described in the Examples described later.
  • Clone 186-18 was registered in Japan as a deposit number NITE P-01732 (identification display (display for identification: 186-18) on October 17, 2013 at the Patent Microbiology Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation. It has been deposited and deposited internationally on October 27, 2014 as accession number NITE BP-01732 (indication of identification (indication for identification: 186-18)).
  • the anti-DR6 antibody produced by clone 186-18 consists of heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 44, heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46, and amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 48.
  • An anti-DR6 comprising: a heavy chain CDR3 comprising: a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50; a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence Trp-Ala-Ser; and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 It is a monoclonal antibody.
  • an antibody (180-10 antibody) produced by clone 180-10 described in the examples described later can be mentioned.
  • Clone 180-10 was deposited domestically as a deposit number NITE P-01733 (identification: 180-10) on October 17, 2013 at the Patent Microorganism Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation, October 10, 2014. It has been deposited internationally as deposit number NITE BP-01733 (indication of identification: 180-10) on the 27th of May.
  • the anti-DR6 antibody produced by clone 180-10 comprises a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 54, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 56, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 58
  • a heavy chain CDR3 comprising: a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 60; a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence Trp-Ala-Ser; and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 62 DR6 monoclonal antibody.
  • antibodies of the present invention also include so-called CDR-grafted antibodies in which amino acid sequences other than CDRs are derived from antibodies other than the antibodies of the present invention, particularly antibodies of different species other than CDRs.
  • a suitable example of a CDR-grafted antibody is a humanized antibody or human antibody in which the CDR sequence is derived from mouse, rat, rabbit or other non-human animal, and the amino acid sequence other than CDR is derived from human.
  • Such humanized antibodies or methods for producing human antibodies are well known to those skilled in the art. For example, Jones et al. (Nature, 1986, 321 pages 522-525), Riechmann et al. (Nature, 1988, 332 pages, 323). -327), Verhoeyen et al. (Science, 1988, Vol. 239, pp. 1534-1536) and the like, and can be applied to each of the above-mentioned clones that are anti-DR6 agonist antibodies.
  • the anti-DR6 agonist antibodies of the present invention also include functional fragments thereof.
  • a functional fragment means a partial fragment of an antibody that retains antigen-binding ability, antigen-reactivity or antigen-recognition ability. Examples of such functional fragments include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , scFv, diabody, peptides containing dsFv and CDR, and the like.
  • the Fab included in the present invention is an antigen having a molecular weight of about 50,000, in which about half of the heavy chain N-terminal side and the entire light chain are linked by a disulfide bond, among fragments obtained by digesting an anti-DR6 agonist antibody with papain. It can be prepared as an antibody fragment having binding activity.
  • a nucleic acid encoding the Fab of the antibody can be prepared, expressed in prokaryotes or eukaryotes using various host expression systems well known to those skilled in the art, and recovered.
  • F (ab ′) 2 encompassed by the present invention is larger than the fragment obtained by pepsin digestion of an anti-DR6 agonist antibody, in which Fab is bound via a disulfide bond in the hinge region, and has a molecular weight of about 100,000. It can be prepared as an antibody fragment having the antigen binding activity. Further, it can be prepared by linking two molecules of Fab ′ described below with a thioether bond or a disulfide bond.
  • Fab ′ included in the present invention is prepared as an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having an antigen-binding activity, which is obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F (ab ′) 2 with a reducing agent such as dithiothreitol. be able to. Further, it can be produced by preparing a nucleic acid encoding Fab ′ of the antibody, expressing it in prokaryotes or eukaryotes using various host expression systems well known to those skilled in the art, and collecting them.
  • the scFv included in the present invention comprises one heavy chain variable region (hereinafter referred to as VH) and one light chain variable region (hereinafter referred to as VL) as a suitable peptide linker (hereinafter referred to as L Antibody fragments having an antigen-binding activity and having a structure that can be expressed as VH-L-VL or VL-L-VH.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • L Antibody fragments having an antigen-binding activity and having a structure that can be expressed as VH-L-VL or VL-L-VH.
  • the scFv included in the present invention is a nucleic acid encoding scFv having the above structure based on the nucleic acids encoding VH and VL of the anti-DR6 agonist antibody of the present invention, and various host expression systems well known to those skilled in the art. It can be produced by expressing in prokaryotic or eukaryotic organisms and recovering them.
  • the diabody included in the present invention is an antibody fragment in which scFv is dimerized, and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen binding activity may be the same or different from each other.
  • the diabody is described in detail in, for example, European Patent No. 404,097 and International Publication No. WO1993 / 11161.
  • the diabody encompassed by the present invention is based on the nucleic acids encoding the VH and VL of the anti-DR6 agonist antibody of the present invention, via a peptide linker L having an amino acid sequence length of 8 residues or less and VH and It can be produced by constructing a nucleic acid encoding a polypeptide to which a VL is linked, expressing it in prokaryotes or eukaryotes using various host expression systems well known to those skilled in the art, and recovering them.
  • the dsFv included in the present invention is a disulfide between a cysteine-containing HV in which one amino acid residue in each of VH and VL of the anti-DR6 agonist antibody of the present invention is replaced with a cysteine residue and a cysteine-containing LV.
  • the determination of the amino acid residue substituted for the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody according to the method of Reiter et al. (Protein Engineering, 7: 697-704, 1994).
  • the dsFv encompassed by the present invention is a polypeptide in which the amino acid residue identified by the method of Reiter et al. Is substituted with cysteine based on the nucleic acids encoding VH and VL of the anti-DR6 agonist antibody of the present invention. It can be produced by constructing the nucleic acid to be encoded, expressing it in prokaryotes or eukaryotes using various host expression systems well known to those skilled in the art, and collecting them.
  • the anti-DR6 agonist antibody and functional fragments thereof of the present invention include radioisotopes such as iodine 125, low molecular compounds such as nucleic acid probes and fluorescent labeling substances, polyethylene glycol, albumin, dextran, polyoxyethylene, and styrene maleic acid.
  • radioisotopes such as iodine 125
  • low molecular compounds such as nucleic acid probes and fluorescent labeling substances
  • polyethylene glycol, albumin, dextran, polyoxyethylene, and styrene maleic acid polyethylene glycol, albumin, dextran, polyoxyethylene, and styrene maleic acid.
  • a labeled antibody or derivative obtained by chemically or genetically linking or conjugated a polymer drug or protein such as a copolymer, polyvinylpyrrolidone, pyran copolymer and hydroxypropylmethacrylamide can be used. Included in the invention.
  • a chemical substance that can be bound to an antibody or a functional fragment thereof or the binding thereof uses a method well-known to those skilled in the art (for example, the method described in Introduction to Antibody Engineering, Osamu Kanmitsu, Jinshokan, 1994). be able to.
  • the anti-DR6 agonist antibody of the present invention may be used after glycosylated by a known method. Methods for glycosylating antibodies are described, for example, in Jefferis et al. (Immunol., 1997, 65, pp. 111-128) or Wright et al. (TibTECH, 1997, 15th, pp. 26-32). Such a method can be applied to the antibody of the present invention or a functional fragment thereof.
  • An antibody in which the glycosylation pattern of the monoclonal antibody of the present invention has been altered by the glycosylation method, specifically, one or more sugar chains from which one or more sugar chains in the original antibody have been removed is newly added.
  • Antibodies with altered or modified sugar chain composition can be produced.
  • the present invention also includes such glycosylated antibodies as long as they are anti-DR6 agonist antibodies.
  • the present invention includes a polypeptide comprising one or more of the amino acid sequences of the CDRs of the clones 25-1, 177-1, 82-30, 186-18 and 180-10 as an anti-DR6 agonist.
  • Each CDR may be linked to each other directly or via a suitable peptide linker.
  • Such polypeptides are produced by constructing nucleic acids encoding one or more of each amino acid sequence, expressing them in prokaryotes or eukaryotes using various host expression systems well known to those skilled in the art, and recovering them. can do.
  • polypeptide containing the CDR of the present invention can be produced by chemical synthesis methods well known to those skilled in the art, such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). .
  • an immunoregulatory agent having the ability to specifically bind to DR6 and the ability to suppress signal transduction induced by the specific binding of DR6 and Sdc1 is provided. That is, this embodiment relates to an immunoregulatory agent as a DR6 antagonist capable of activating T cells by inhibiting signal transduction that binds to DR6 and leads to suppression of T cell activation.
  • Anti-DR6 antagonist antibody An example of an embodiment of a DR6 antagonist is an anti-DR6 antagonist antibody that specifically binds to DR6 and can suppress signal transduction leading to suppression of T cell activation.
  • anti-DR6 antagonist antibodies include monoclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies.
  • an immunoregulatory agent that is a DR6 antagonist can comprise an anti-DR6 antagonist antibody that binds to the DR6 extracellular domain or fragment thereof.
  • an antibody (46-15-23 antibody) produced by clone 46-15-23 described in the Examples described later can be mentioned.
  • Clone 46-15-23 was registered with the Patent Microorganism Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation, as of October 17, 2013, with accession number NITE P-01734 (indication of identification (indication for identification: 46-15-15). 23) and was deposited internationally as deposit number NITE BP-01734 (indication of identification (indication for identification: 46-15-23) on October 27, 2014.
  • the anti-DR6 antibody produced by clone 46-15-23 has a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 64, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 66, and an amino acid shown in SEQ ID NO: 68.
  • a heavy chain CDR3 comprising the sequence, a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence Arg-Val-Ser, and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 72
  • Anti-DR6 monoclonal antibody is a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 64, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 66, and an amino acid shown in SEQ ID NO: 68.
  • a heavy chain CDR3 comprising the sequence, a light chain CDR1 comprising the amino acid
  • Another preferred embodiment of the anti-DR6 antagonist antibody of the present invention includes an antibody (100-11 antibody) produced by clone 100-11 described in the Examples described later.
  • Clone 100-11 was deposited in Japan as a deposit number NITE P-01735 (identification: 100-11) on October 17, 2013 at the Patent Microbiology Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation, October 10, 2014. It has been deposited internationally as deposit number NITE BP-01735 (indication of identification: 100-11) on the 27th of May.
  • the anti-DR6 antibody produced by clone 100-11 comprises a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 74, a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 78.
  • An anti-DR6 comprising: a heavy chain CDR3 comprising: a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 80; a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence Trp-Ala-Ser; and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 82 It is a monoclonal antibody.
  • the amino acid sequence other than each CDR is not particularly limited, and 1 to several amino acid residue additions, deletions, substitutions, and / or Or it may be accompanied by insertion.
  • antibodies of the present invention also include so-called CDR-grafted antibodies in which amino acid sequences other than CDRs are derived from antibodies other than the antibodies of the present invention, particularly antibodies of different species other than CDRs.
  • a suitable example of a CDR-grafted antibody is a humanized antibody or human antibody in which the CDR sequence is derived from mouse, rat, rabbit or other non-human animal, and the amino acid sequence other than CDR is derived from human.
  • Such humanized antibodies or methods for producing human antibodies are well known to those skilled in the art. For example, Jones et al. (Nature, 1986, 321 pages 522-525), Riechmann et al. (Nature, 1988, 332 pages, 323). -327), Verhoeyen et al. (Science, 1988, Vol. 239, pp. 1534-1536) and the like, and can be applied to each of the above-mentioned clones that are anti-DR6 antagonist antibodies.
  • the anti-DR6 antagonist antibody of the present invention also includes functional fragments thereof.
  • a functional fragment means a partial fragment of an antibody that retains antigen-binding ability, antigen-reactivity or antigen-recognition ability. Examples of such functional fragments include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , scFv, diabody, peptides containing dsFv and CDR, and the like.
  • the Fab included in the present invention is an antigen having a molecular weight of about 50,000, in which about half of the heavy chain N-terminal side and the whole light chain are linked by a disulfide bond, among fragments obtained by digesting an anti-DR6 antagonist antibody with papain. It can be prepared as an antibody fragment having binding activity.
  • a nucleic acid encoding the Fab of the antibody can be prepared, expressed in prokaryotes or eukaryotes using various host expression systems well known to those skilled in the art, and recovered.
  • F (ab ′) 2 included in the present invention has a molecular weight of about 100,000, which is larger than that obtained by pepsin digestion of an anti-DR6 antagonist antibody with Fab bound through a disulfide bond in the hinge region. It can be prepared as an antibody fragment having the antigen binding activity. Further, it can be prepared by linking two molecules of Fab ′ described below with a thioether bond or a disulfide bond.
  • Fab ′ included in the present invention is prepared as an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having an antigen-binding activity, which is obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F (ab ′) 2 with a reducing agent such as dithiothreitol. be able to. Further, it can be produced by preparing a nucleic acid encoding Fab ′ of the antibody, expressing it in prokaryotes or eukaryotes using various host expression systems well known to those skilled in the art, and collecting them.
  • the scFv included in the present invention comprises one heavy chain variable region (hereinafter referred to as VH) and one light chain variable region (hereinafter referred to as VL) as a suitable peptide linker (hereinafter referred to as L Antibody fragments having an antigen-binding activity and having a structure that can be expressed as VH-L-VL or VL-L-VH.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • L Antibody fragments having an antigen-binding activity and having a structure that can be expressed as VH-L-VL or VL-L-VH.
  • the scFv included in the present invention is a nucleic acid encoding scFv having the above structure based on the nucleic acids encoding VH and VL of the anti-DR6 antagonist antibody of the present invention, and various host expression systems well known to those skilled in the art. It can be produced by expressing in prokaryotic or eukaryotic organisms and recovering them.
  • the diabody included in the present invention is an antibody fragment in which scFv is dimerized, and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen binding activity may be the same or different from each other.
  • the diabody is described in detail in, for example, European Patent No. 404,097 and International Publication No. WO1993 / 11161.
  • the diabody encompassed by the present invention is based on the nucleic acids encoding the VH and VL of the anti-DR6 antagonist antibody of the present invention, via the peptide linker L having an amino acid sequence length of 8 residues or less and VH and It can be produced by constructing a nucleic acid encoding a polypeptide to which a VL is linked, expressing it in prokaryotes or eukaryotes using various host expression systems well known to those skilled in the art, and recovering them.
  • the dsFv included in the present invention is a disulfide between a cysteine-containing HV and a cysteine-containing LV in which one amino acid residue in each of VH and VL of the anti-DR6 antagonist antibody of the present invention is substituted with a cysteine residue.
  • the determination of the amino acid residue substituted for the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody according to the method of Reiter et al. (Protein Engineering, 7: 697-704, 1994).
  • the dsFv included in the present invention is a polypeptide in which the amino acid residue specified by the above-mentioned method of Reiter et al. Is substituted on the basis of nucleic acids encoding VH and VL of the anti-DR6 antagonist antibody of the present invention. It can be produced by constructing the nucleic acid to be encoded, expressing it in prokaryotes or eukaryotes using various host expression systems well known to those skilled in the art, and collecting them.
  • the anti-DR6 antagonist antibody of the present invention and functional fragments thereof include radioisotopes such as iodine 125, low molecular compounds such as nucleic acid probes and fluorescent labeling substances, polyethylene glycol, albumin, dextran, polyoxyethylene, styrene maleic acid.
  • radioisotopes such as iodine 125
  • low molecular compounds such as nucleic acid probes and fluorescent labeling substances
  • polyethylene glycol, albumin, dextran, polyoxyethylene, styrene maleic acid polyethylene glycol, albumin, dextran, polyoxyethylene, styrene maleic acid.
  • a labeled antibody or derivative obtained by chemically or genetically linking or conjugated a polymer drug or protein such as a copolymer, polyvinylpyrrolidone, pyran copolymer and hydroxypropylmethacrylamide can be used. Included in the invention.
  • a chemical substance that can be bound to an antibody or a functional fragment thereof or the binding thereof uses a method well-known to those skilled in the art (for example, the method described in Introduction to Antibody Engineering, Osamu Kanmitsu, Jinshokan, 1994). be able to.
  • the anti-DR6 antagonist antibody of the present invention may be used after glycosylated by a known method.
  • Methods for glycosylating antibodies are described, for example, in Jefferis et al. (Immunol., 1997, 65, pp. 111-128) or Wright et al. (TibTECH, 1997, 15th, pp. 26-32). Such a method can be applied to the antibody of the present invention or a functional fragment thereof.
  • An antibody in which the glycosylation pattern of the monoclonal antibody of the present invention has been altered by the glycosylation method, specifically, one or more sugar chains from which one or more sugar chains in the original antibody have been removed is newly added.
  • Antibodies with altered or modified sugar chain composition can be produced.
  • the present invention also includes such glycosylated antibodies as long as they are anti-DR6 antagonist antibodies.
  • the present invention includes a polypeptide comprising one or more of the amino acid sequences of the CDRs of clones 46-15-23 and 100-11 as an anti-DR6 antagonist.
  • Each CDR may be linked to each other directly or via a suitable peptide linker.
  • Such polypeptides are constructed by constructing a nucleic acid encoding one or more of the amino acid sequences of each CDR, and expressing and recovering them in prokaryotes or eukaryotes using various host expression systems well known to those skilled in the art. Can be manufactured.
  • polypeptide containing the CDR of the present invention can be produced by chemical synthesis methods well known to those skilled in the art, such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • Sdc1 variants that are antagonists
  • Another example of an embodiment of a DR6 antagonist specifically binds DR6 but is unable to induce signaling induced by specific binding of DR6 and Sdc1 Sdc1 mutant.
  • a signal comprising an amino acid sequence obtained by adding one or more amino acids to the amino acid sequence shown in No. 6 or SEQ ID No. 8 and having a specific binding ability to DR6 but induced by specific binding between DR6 and Sdc1
  • Solubilized Sdc1 variants that are antagonists
  • Another example of an embodiment of a DR6 antagonist is that it specifically binds DR6 but induces signal transduction induced by specific binding of DR6 and Sdc1 It is a solubilized Sdc1 mutant that cannot.
  • Immunoregulator having ability to bind to Sdc1
  • the ability to bind to a polypeptide comprising Sdc1 or its extracellular domain and the ability to suppress signal transduction induced by specific binding between DR6 and Sdc1 are provided.
  • an immunoregulator comprising a physiologically active substance having an active ingredient.
  • An example of a substance capable of preventing the binding between Sdc1 and DR6 by binding to Sdc1 is an anti-Sdc1 antibody against Sdc1, particularly the extracellular domain of Sdc1.
  • Anti-Sdc1 antibodies are already commercially available, and any of these can be used as the immunoregulatory agent of the present invention.
  • a new anti-Sdc1 antibody may be prepared according to a method well known to those skilled in the art and used as the immunoregulatory agent of the present invention.
  • various functional fragments corresponding to peptides including Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , scFv, diabody, dsFv and CDR can also be prepared from the anti-Sdc1 antibody, and these are also used in the immunization of the present invention. It can be used as a control agent.
  • a substance capable of preventing the binding between Sdc1 and DR6 by binding to Sdc1 is a protein consisting of a soluble extracellular domain of DR6 and / or a variant thereof. It is already known that solubilized DR6 consisting of the extracellular domain sequence of DR6 exists in nature. While this solubilized DR6 retains the ability to bind to Sdc1, it lacks the cytoplasmic death domain and therefore cannot initiate signal transduction leading to suppression of T cell activation. Such naturally occurring solubilized DR6 is a substance capable of preventing the binding between Sdc1 and DR6 by binding to Sdc1, and can be used as an immunoregulator of the present invention.
  • solubilized DR6 can be produced from a nucleic acid encoding DR6 by genetic recombination techniques, in which case the aforementioned “conservative substitution” of amino acids, deletion or addition of amino acid gap, N-terminus and Mutation such as addition of an amino acid residue to the C-terminal side can be performed without losing the ability to bind to Sdc1.
  • Such a mutant of solubilized DR6 can also be used as an immunoregulator of the present invention.
  • the solubilized DR6 mutant can be obtained by applying a general gene recombination technique including a method for introducing a desired mutation into a nucleic acid encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, thereby Can be manufactured as.
  • General gene recombination techniques including expression of foreign proteins and methods for introducing desired mutations include the methodologies described in Sambrook et al. Or other textbooks or handbooks in the field and widely used by those skilled in the art. be able to.
  • Example 10 which will be described later, it was revealed that the ability to bind to Sdc1 increases when CRD1 is deleted from the four CRDs present in the extracellular domain of DR6. Therefore, a solubilized DR6 mutant lacking CRD1 is a preferred embodiment of the immunoregulatory agent of the present invention.
  • Nucleic acids Another aspect of the present invention is an isolated nucleic acid (DNA or RNA) encoding a polypeptide that is a DR6 antagonist or DR6 agonist as described above, an expression vector comprising the nucleic acid, the nucleic acid or a host cell comprising the vector I will provide a. These nucleic acids are linked to any functional base sequence whose protein-encoding base sequence regulates its transcriptional expression, such as a promoter sequence, an operator sequence, a ribosome binding site, a polyadenylation signal, and an enhancer to form a “gene”. You may do it.
  • the present invention also includes a nucleic acid comprising a base sequence that can hybridize with the nucleic acid under stringent conditions.
  • the stringent conditions for the hybridization reaction can be appropriately determined by those skilled in the art in consideration of conditions such as temperature and ion concentration, but are generally 6 ⁇ SSC at 50 ° C., 5 ⁇ Denhard's, 0.1 after hybridization. It is sufficient that the membrane is hybridized by Southern hybridization under the condition of washing the membrane in% SDS, 25 ° C. to 68 ° C. (1 ⁇ SSC contains 0.15 M NaCl and 0.015 M sodium citrate).
  • a method for screening an immunoregulatory agent having the ability to control signal transduction induced by specific binding between DR6 and Sdc1 is provided.
  • a method for screening a physiologically active substance having the ability to control signal transduction by the binding of DR6 and Sdc1 is provided, including the following steps a) to e).
  • the functional equivalent of DR6 here is a mutant that retains the function of DR6, an extracellular domain of DR6 that has the ability to bind to Sdc1, a mutant that retains the function of the extracellular domain, or a polys containing these Refers to a peptide.
  • the functional equivalent of Sdc1 is a substance having a function of inducing signal transduction induced by the binding ability of DR6 and specific binding of DR6 and Sdc1, and specifically, agonistic action on DR6.
  • DR6 and its functional equivalent as well as Sdc1 and its functional equivalent may be used after isolation and purification of naturally occurring ones.
  • gene cloning, gene amplification, integration into an expression vector, host cell The use of recombinant proteins prepared by so-called genetic engineering methods including introduction into nucleic acids or expression vectors, protein expression and purification and other operations is preferred.
  • the nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 and for Sdc1 and its functional equivalent, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7 is a recombinant protein that can be prepared by applying a genetic engineering method to a nucleic acid having the base sequence shown in FIG.
  • particularly preferred expression vectors, host cells, and purification methods are tags added with pcDNA3, HEK293T cells, human IgG Fc region, or histidine tag. Such as affinity column purification.
  • the screening method of the present invention comprises a recombinant DR6 expressed on a host cell transformed with DR6 expressed on natural T cells, or a nucleic acid encoding DR6 or a functional equivalent thereof, or Preferably it is implemented using its functional equivalent. In particular, it is preferably carried out using the recombinant DR6 or a functional equivalent thereof using T cells as host cells.
  • T cells By using such T cells, induction or suppression of signal transduction leading to suppression of T cell activation can be monitored by the amount of IL2 production of the T cells.
  • recombinant DR6 expressed on a natural T cell expressing DR6, or a host cell transformed with a nucleic acid encoding DR6 or a functional equivalent thereof, or a functional equivalent thereof in the screening method of the present invention carried out using the method, changes in the function, activity, form, chemical structure, etc. of intracellular molecules (including membrane proteins) other than DR6 involved in signal transduction leading to T cell activation suppression are measured. By doing so, you may monitor the signal transmission said to this invention. Examples of such intracellular molecules include NF ⁇ B, NFAT, Fas, and FasL. These intracellular molecules are all known molecules, and immunoassays using each specific antibody and other methods for detecting such intracellular molecules are known to those skilled in the art.
  • the behavior of the reporter protein is changed instead of IL2 production.
  • the signal transduction referred to in the present invention may be monitored by measurement.
  • signal transduction initiated by the binding of DR6 and Sdc1 by using a chimeric protein in which the transmembrane region and intracellular death domain of DR6 are replaced with the transmembrane region and intracellular domain of another transmembrane protein. Is measured as a function change of the intracellular domain of the chimeric protein, or by measuring a change in the function, activity, form, chemical structure, etc. of other intracellular molecules receiving signals from the intracellular domain. May be monitored.
  • a chimeric protein is also included in the DR6 mutant in the present invention.
  • One of the embodiments of the screening method of the present invention is that DR6 or a functional equivalent thereof can be detected under conditions capable of detecting signal transduction initiated by binding of DR6 or a functional equivalent thereof to Sdc1 or a functional equivalent thereof.
  • Preferred examples of this embodiment include DR6 expressed on natural T cells, or recombinant expressed on a host cell transformed with a nucleic acid encoding DR6 or a functional equivalent thereof.
  • a screening method comprising a step of allowing DR6 or a functional equivalent thereof and Sdc1 or a functional equivalent thereof and a test substance to coexist, and a step of detecting signal transduction in the natural T cell or host cell.
  • Another embodiment of the screening method of the present invention is the coexistence of DR6 or a functional equivalent thereof and Sdc1 or a functional equivalent thereof with a test substance, and DR6 or a functional equivalent thereof and Sdc1 or a functional equivalent thereof.
  • a test substance capable of inhibiting or suppressing the binding to is selected, and then the selected test substance is further started by binding DR6 or a functional equivalent thereof to Sdc1 or a functional equivalent thereof Detecting the signal transduction performed.
  • a functional equivalent of DR6 and Sdc1 or a functional equivalent thereof preferably a step in which a solubilized Sdc1 or a solubilized Sdc1 mutant and a test substance coexist, a functional equivalent of DR6 Screening a test substance that can inhibit or suppress the binding of the product to Sdc1 or a functional equivalent thereof, and DR6 or DR6 expressed on natural T cells or a functional equivalent thereof Signal transduction in the natural T cell or host cell in the presence of recombinant DR6 expressed on the host cell transformed with the encoding nucleic acid or its functional equivalent and the selected test substance It is a screening method including the process of detecting.
  • a method including a step of allowing a test substance to coexist with solubilized DR6 and solubilized Sdc1 or a solubilized Sdc1 mutant is preferable.
  • the binding between DR6 or its functional equivalent and Sdc1 or its functional equivalent, or the binding between these and the test substance is performed by ELISA, sandwich immunoassay, Western blot assay, pull-down assay, etc. It can be detected by biochemical methods. Alternatively, the binding may be detected using IAsys analysis, BIAcore sensor chip analysis, microarray analysis, surface plasmon resonance (SPR), or the like.
  • DR6 or a functional equivalent thereof or Sdc1 or a functional equivalent thereof is preferably immobilized on a suitable matrix and used. All of these techniques are widely known to those skilled in the art and can be applied to the present invention within the ordinary ability of those skilled in the art.
  • Embodiments of the present invention also provide a method for preventing or treating an immune disease in a subject, specifically comprising administering to a mammal an effective amount of an immunoregulatory agent of the present invention.
  • a “subject” is a mammal, and examples thereof include humans, cows, horses, dogs, cats, and the like, but the present invention specifically targets humans.
  • an “effective amount” means an amount of an immunoregulatory agent effective to prevent, cure or ameliorate the disease or condition being treated.
  • the effective amount is appropriately adjusted according to the type of disease, the severity of symptoms, the patient and other medical factors.
  • One embodiment of the therapeutic method of the present invention is to administer an effective amount of the aforementioned immunoregulatory agent capable of inducing signal transduction induced by specific binding of DR6 and Sdc1 to a mammal.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating diseases caused by excessive or abnormal immune responses.
  • Diseases to be treated by the treatment method of the present embodiment include rheumatism, systemic lupus erythematosus (SLE), multiple sclerosis, transplantation disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, Sjogren's syndrome and other autoimmune diseases, hay fever, Allergic diseases such as atopy and severe drug eruption can be mentioned.
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • multiple sclerosis transplantation disease
  • Crohn's disease Crohn's disease
  • ulcerative colitis Sjogren's syndrome
  • Allergic diseases such as atopy and severe drug eruption can be mentioned.
  • Another embodiment of the treatment method of the present invention is to immunize a mammal by administering an effective amount of the aforementioned immunoregulatory agent capable of suppressing signal transduction induced by specific binding between DR6 and Sdc1.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating a disease for which enhancement of function is desired.
  • diseases targeted by the treatment method of the present embodiment include infections caused by bacteria, fungi and other foreign organisms, and malignant neoplasms. Also, the use of the immunoregulatory agent of the present invention as a vaccine adjuvant is also included in this embodiment.
  • the immunoregulatory agent is preferably administered in the form of a pharmaceutical composition or a preparation containing pharmaceutically acceptable excipients, carriers and other components.
  • An immunoregulatory agent in the form of such a pharmaceutical composition or formulation is also an embodiment of the immunoregulatory agent of the present invention.
  • compositions are well known to those skilled in the art, and those skilled in the art can use the ingredients from the ingredients described in the 16th revised Japanese Pharmacopoeia and other standards within the scope of their normal performance. Can be selected and used as appropriate. Further, depending on the disease to be treated, the immunoregulatory agent of the present invention and other medicines may be used in combination.
  • the present invention relates to a disease caused by excessive or abnormal immune response or a disease caused by reduced immune function, comprising the step of testing the sample for the presence or content of DR6 and / or Sdc1 in a sample taken from a subject. Methods of diagnosing a subject having or suspected of such a disease are provided.
  • diseases targeted by the diagnostic method of the present invention include autoimmune diseases such as rheumatism and systemic lupus erythematosus (SLE), and allergic diseases such as hay fever, atopy and severe drug eruption.
  • autoimmune diseases such as rheumatism and systemic lupus erythematosus (SLE)
  • allergic diseases such as hay fever, atopy and severe drug eruption.
  • a preferred embodiment of the diagnostic method of the present invention relates to an immunoassay for testing for the presence or content of said DR6 and / or Sdc1 using the anti-DR antibody and / or anti-Sdc1 antibody disclosed herein.
  • Another embodiment of the diagnostic method of the present invention relates to a method for testing the presence or content of DR6 and / or Sdc1 in a sample based on the nucleic acid encoding them.
  • the immunoassay is performed by a number of means well known in the art including, but not limited to, histoimmunological analysis of samples and cell lines, in situ hybridization, immunoblot analysis, Western blot analysis, and tissue array analysis. can do.
  • Nucleic acid based diagnostics can also be performed by a number of means well known in the art including, but not limited to, various PCR analyzes including RT-PCR, Northern blot analysis, Southern blot analysis.
  • mSdc1 and hSdc1 expression vectors Corresponding to the open reading frame (ORF) of mouse Sdc1 (mSdc1) shown in SEQ ID NO: 8, using a cDNA library prepared using mRNA extracted from A20 cells as a template PCR amplification was performed using DNA primers designed to amplify the DNA to be amplified. The amplified DNA was recombined into an expression vector pMXsIG that was opened with restriction enzymes EcoRI and NotI to construct pMXsIG / mSdc1.
  • DNA corresponding to the open reading frame (ORF) of human Sdc1 (hSdc1) shown in SEQ ID NO: 6 is obtained using a cDNA library prepared using mRNA extracted from HeLa cells derived from human cervical cancer as a template. PCR amplification was performed using DNA primers designed to be amplified. This amplified DNA was recombined into an expression vector pMXsIG that was opened with restriction enzymes BamHI and XhoI to construct pMXsIG / hSdc1.
  • the production amount of IL2 in A20 cells expressing mSdc1 or hSdc1 decreased to 170 pg / ml or less as compared with control and non-transformed A20 cells.
  • Example 2 (1) Preparation of Recombinant Sdc1 Using the cDNA vector pMXsIG / mSdc1 in which the gene encoding mSdc1 shown in SEQ ID NO: 7 has been cloned as a template, the extracellular domain of mSdc1 (amino acid sequence up to position 251 of SEQ ID NO: 8) PCR amplification was performed using DNA primers designed and synthesized to amplify the encoding DNA (SEQ ID NO: 11).
  • An expression vector pcDNA3.1 / myc-his_ver In which the amplified DNA was opened with restriction enzymes EcoRI and BamHI.
  • B (manufactured by Invitrogen) is a protein consisting of an amino acid sequence that is incorporated so that the His sequence previously incorporated in the expression vector matches the reading frame of the incorporated mSdc1 extracellular domain, and the His sequence is added to the C-terminus ( pcDNA3.1 / mSdc1-his was constructed so that mSdc1-His, SEQ ID NO: 84) was amplified. This was introduced into HEK293T cells, cultured in Freestyle 293 Expression medium (Invitrogen) for 7 days, mSdc1-His was secreted into the medium, and purified using a Ni-NTA affinity column.
  • mSdc1 has a function to suppress the production of IL2 depending on the expression of DR6 against T cells expressing DR6.
  • Fas and FasL Expression of Fas, Fas ligand (FasL), CD69, PD-1 and CD3 proteins at 6 hours after stimulation in DO11.10-T cells stimulated with anti-CD3 antibody and mSdc1-His in Example 2
  • the fluctuation was analyzed by flow cytometry method.
  • the result is shown in FIG.
  • the colorless waveform is the control without the stimulation of anti-CD3 antibody and mSdc1-His
  • the gray waveform is the DO11.10-T cell that has been stimulated only by the anti-CD3 antibody
  • the black waveform is the anti-CD3 antibody and mSdc1. -Shows DO11.10-T cells stimulated with His.
  • Fas and FasL induced depending on the stimulation by the anti-CD3 antibody was suppressed by the stimulation of mSdc1. It was shown that signal transduction induced by specific binding between DR6 and Sdc1 can be monitored by variation in the expression level of Fas or FasL.
  • NF ⁇ B, CREB, and ISRE response reporter plasmids were prepared by incorporating into pGL4.26 (manufactured by Promega) into which the firefly luciferase gene that had been circularly opened was incorporated.
  • NFAT activity For the measurement of NFAT activity, a reporter plasmid (pGL4.30 [luc2P / NFAT-RE / Hygro], manufactured by Promega) in which a firefly luciferase gene was incorporated downstream of a commercially available NFAT response element was used.
  • the hybridoma was cultured for about 10 days using a RPMI1640 medium containing penicillin / streptomycin, 10% (w / v) fetal calf serum (FCS) and a HAT solution according to a conventional method until colonies were confirmed.
  • a RPMI1640 medium containing penicillin / streptomycin, 10% (w / v) fetal calf serum (FCS) and a HAT solution according to a conventional method until colonies were confirmed.
  • clones 25-1, clone 25-2, clone 25-3, clone 177-1, clone 82-30, clone 186-18, clone 180-10, clone 46 were produced as hybridomas producing anti-DR6 antibody. -15-23 and clone 100-11 were obtained. These hybridomas except for clone 25-2 and clone 25-3 were lyophilized according to a conventional method and deposited at the Patent Microorganism Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation.
  • the CDR sequence of the hybridoma selected in (1) was analyzed using a SMART cDNA library preparation kit (manufactured by Takara Bio Inc.). Specifically, total RNA was extracted from each hybridoma, and cDNA was prepared using this as a template, using a 3 ′ terminal IgG1 heavy chain specific primer, IgG2a heavy chain specific primer, or ⁇ light chain specific primer. Using this cDNA as a template, the 5′-end specific primer attached to the kit as a forward primer, and the 3′-end IgG1 heavy chain specific primer, IgG2a heavy chain specific primer or ⁇ light chain specific primer as a reverse primer PCR amplification was performed.
  • a SMART cDNA library preparation kit manufactured by Takara Bio Inc.
  • the nucleic acid sequence of the amplified DNA fragment was analyzed using a DNA sequencer, and the obtained sequence information was searched on the IgBLAST database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). As a result, it was confirmed that all the monoclonal antibodies produced by the hybridoma prepared in (1) had a novel combination of CDR sequences.
  • the amino acid sequences of heavy chain CDRs 1 to 3 of clones 25-1, 177-1, 82-30, 186-18, 180-10, 46-15-23 and 100-11 are shown in Table 1, and light chain CDRs 1 to 3 Table 2 shows the amino acid sequences.
  • PCR amplification was performed using DNA primers designed to amplify DNA encoding the -371 region.
  • the primers were designed so that the restriction enzyme site BamHI was introduced at one end of the amplified DNA and the restriction enzyme site EcoRI was introduced at the other end.
  • Two types of amplified fragments were each treated with a restriction enzyme and recombined into a retroviral vector pMXsIG that had been opened with the same restriction enzyme to prepare an expression plasmid pMXsIG encoding hDR6 and an expression plasmid pMXsIG encoding mDR6. These plasmids were packaged using PLAT-E cells to produce virus particles. Mouse L929 cells were infected with this virus particle, and two types of transformed L929 cells expressing hDR6 or mDR6 were obtained.
  • the two types of transformed L929 cells and the parent strain L929 cells were obtained by using monoclonal antibodies produced by non-specific rat IgG (rat IgG), clone 25-1, clone 25-3, clone 100-11 and clone 177-1. After incubating at 4 ° C. for 1 hour in each medium, the plate was washed twice, and incubated again at 4 ° C. for 1 hour in a medium containing the labeled anti-rat IgG antibody. The binding strength of each antibody was measured using a meter. The result is shown in FIG.
  • the monoclonal antibodies used in this experiment were all reactive with mDR6 and also cross-reacted with hDR6.
  • Example 6 Screening of anti-DR6 agonist antibody> Forward with EcoRI recognition sequence designed to amplify DNA encoding human transmembrane region and intracellular domain of human CD40 (hCD40) using cDNA library prepared based on RNA extracted from Jurkat cells as template PCR amplification was performed using a primer and a reverse primer to which a NotI recognition sequence was added. Similarly, PCR amplification was performed using a forward primer added with an EcoRI recognition sequence designed to amplify DNA encoding the extracellular domain of mDR6 and a reverse primer added with an EcoRI recognition sequence.
  • Two kinds of amplified fragments were treated with the above two kinds of restriction enzymes and recombined into an expression vector pTracer-SV40 (manufactured by Invitrogen) that was opened with the same restriction enzymes, and the extracellular domain of mDR6 and the transmembrane region of hCD40 and An expression plasmid pmDR6-hCD40 encoding a chimeric protein consisting of an intracellular domain was prepared.
  • pTracer-SV40 manufactured by Invitrogen
  • This pmDR6-hCD40 was introduced into HEK293T cells together with an NF ⁇ B activation-dependent firefly luciferase expression reporter plasmid to obtain transformed HEK293T cells in which the chimeric protein was arranged so that the extracellular domain of mDR6 was exposed on the cell surface. .
  • This transformed HEK293T cell can monitor signal transduction initiated by binding of the ligand Sdc1 or agonistic anti-DR6 antibody to the extracellular domain of DR6 by changing the activity of the reporter protein firefly luciferase. A cell that has been modified so that it can.
  • the above-mentioned transformed HEK293T cells were prepared so that the monoclonal antibodies produced by clone 25-1, clone 25-2, clone 25-3, clone 100-11 and clone 177-1 were 30 ⁇ g / mL or 0.3 ⁇ g / mL. It seed
  • the monoclonal antibody produced by clone 25-1 is an anti-DR6 agonist antibody capable of remarkably inducing signal transduction via DR6.
  • an expression plasmid phDR6-hCD40 encoding a chimeric protein consisting of the extracellular domain of hDR6, the transmembrane region of hCD40 and the intracellular domain was prepared. As a result, it was confirmed that this chimeric protein also showed the same behavior.
  • Example 7 IL2 production inhibitory effect of monoclonal antibody 25-1>
  • the conditions of monoclonal antibody 25-1 against CD3-dependent IL2 production in DO11.10-T cells / RPMI1640 medium were the same as in Example 2 (2) except that mSdc1-His was replaced with monoclonal antibody 25-1. The effect was measured.
  • An experiment in which mSdc1-His was replaced with nonspecific rat IgG was used as a control. The result is shown in FIG.
  • monoclonal antibody 25-1 inhibited IL2 production of DO11.10-T cells in a dose-dependent manner.
  • Example 8 Evaluation of anti-DR6 antibody> Anti-mDR6 antibody-producing hybridoma culture supernatant (100 ⁇ L) or purified antibody (100 ⁇ g / mL) was added to a co-culture system of DO11.10-T cells and A20 cells pulsed with OVA peptide. IL2 contained in the culture supernatant 48 hours after the addition was measured by ELISA. The result is shown in FIG.
  • clone 25-1, clone 177-1, clone 82-30, clone 186-18 and clone 180-10 are anti-DR6 agonist antibodies
  • clone 46-15-23 and clone 100-11 are anti-DR6 agonist antibodies. It was confirmed to be a DR6 antagonist antibody.
  • Sdc1 expression in systemic lupus erythematosus model animal From normal B6 mice and NZB / WF1 mice (obtained from Japan SLC) known as model mice for systemic lupus erythematosus (SLE), 4 months old (before SLE onset), 6 months old (SLE onset early) and 8 months old Serum was collected at each time point (late stage of SLE onset), and solubilized mSdc1 contained in the serum was immunoprecipitated using an anti-mSdc1 antibody (Biolegend).
  • MSdc1 contained in each sediment was detected with an anti-mSdc1 antibody, and a sugar chain bound to mSdc1 was detected with an anti-heparan sulfate antibody 10E4 (manufactured by Seikagaku Corporation), which is a sugar chain-specific antibody.
  • an anti-heparan sulfate antibody 10E4 manufactured by Seikagaku Corporation
  • solubilized mSdc1 modified with a sugar chain is increased in the early and late stages of SLE compared with normal mice or NZB / WF1 mice before the onset of SLE. It was done. Therefore, the content of solubilized Sdc1 in serum can be used as a biomarker that can monitor the progress of SLE.
  • solubilized DR6 mutant Construction of solubilized DR6 mutant> (1) Preparation of solubilized mDR6 from which cysteine-rich domain (CRD) is deleted Soluble recombinant mDR6 (mDR6-hFcm) comprising the extracellular region of mDR6 shown in SEQ ID NO: 88 and the Fc region of human IgG MDR6 extracellular domain variant lacking CRD1 (the 66th to 105th amino acids of SEQ ID NO: 88) using pcDNA / mDR6-hFcm, in which the gene encoding is cloned as a template (its amino acid sequence is SEQ ID NO: 90 PCR amplification was performed using a DNA primer designed and synthesized so as to amplify DNA (SEQ ID NO: 89) encoding (shown in FIG. 2) to obtain pcDNA3 / mDR6-hFcm deltaCRD1.
  • CRD cysteine-rich domain
  • pcDNA3 / mDR6-hFcm deltaCRD1 was introduced into HEK293T cells, cultured in Freestyle 293 Expression medium (manufactured by Invitrogen) for 7 days, and mDR6-hFcm deltaCRD1 was secreted into the medium and purified using a proteinG-binding agarose column Labeled.
  • An expression vector (pMXsIG / mSdc1) in which a gene encoding mSdc1 (SEQ ID NO: 7) was incorporated so as to be expressed, and a control vector (pMXsIG) were introduced into DO11.10-T cells to prepare transformed cells.
  • a control vector pMXsIG
  • Example 11 Treatment effect of anti-DR6 antibody in model animal> (1) Place 8 SLE model mice in a normal breeding environment, and breed them up to 44 weeks of age by intraperitoneal administration (300 ⁇ g / head / time / 2 days) of monoclonal antibody 25-1 from 15 to 27 weeks of age. The survival rate and the incidence of proteinuria were measured. Urine protein was measured by the Europaper method, and an individual showing a value of 300 mg / dl or more was regarded as positive. In addition, 8 SLE model mice administered with rat IgG intraperitoneally instead of the monoclonal antibody 25-1 were used as a control group. The results are shown in FIGS.
  • the survival rate at the age of 44 weeks was 37.5% in the control group, but 87.5% in the group administered with the monoclonal antibody 25-1, It was confirmed that the survival rate was improved by the administration of the monoclonal antibody 25-1.
  • Example 12 Response of immune cells by administration of anti-DR6 agonist antibody>
  • Whole spleen cell groups were prepared from 10-week-old (before SLE onset) and 24-week-old (after SLE onset) SLE model mice and normal mice of the same week, reared under the same conditions as in Example 11.
  • Expression of T cell surface marker (CD3), DR6, helper T cell surface marker (CD4) and killer T cell surface marker (CD8) in this cell group was determined by comparing monoclonal antibody 25-1, anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody and anti-CD4 antibody. Analysis was performed by flow cytometry using CD8 antibody. The result is shown in FIG.
  • FIG. 26 shows a graph in which the increase (average value) of DR6 positive cells observed in panel B and panel D of FIG. 25 is graphed.
  • Example 13 Response of immune cells by administration of anti-DR6 agonist antibody> 24-week-old SLE model mice reared under the same conditions as in Example 11 were further reared for 2 weeks while intraperitoneally administering rat IgG or monoclonal antibody 25-1 (300 ⁇ g / head / time / 2 days). After the administration, a whole spleen cell group was prepared from each group of mice, and the presence rate of CD4 positive cells (helper T cells) expressing DR6 in this cell group was determined by the flow cytometry method as in Test Example 1. Was analyzed. The results (average value) are shown in FIG. 27 (p ⁇ 0.05).
  • the immunoregulatory agent of the present invention is based on a mechanism of action that has not been known so far, that is, as an immunoregulatory agent that can control signal transduction induced by specific binding between DR6 and Sdc1. It can be used for the treatment or prevention of diseases caused by excessive or abnormal immune responses or diseases for which enhancement of immune function in mammals is desired.

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Abstract

【課題】　本発明はＤＲ６の免疫制御に関するレセプター機能を調節することのできる免疫制御剤及びそのスクリーニング方法を提供することを目的とするものである。 【解決手段】 本発明は、ＤＲ６に対する特異的結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の制御能を有する生理活性物質を有効成分とする免疫制御剤に関する。本発明の免疫制御剤は、これまでに知られていない作用機序に基づいた、すなわちＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を制御することのできる免疫制御剤として、哺乳動物の過剰な又は異常な免疫応答による疾患又は哺乳動物における免疫機能の増強が望まれる疾患の治療又は予防に利用することができる。

Description

免疫制御剤
　本発明は、デスレセプター６（Ｄｅａｔｈ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＤＲ６）とそのリガンドであるシンデカン（Ｓｙｎｄｅｃａｎ－１、Ｓｄｃ１）との結合によるシグナル伝達を抑制又は誘導することのできる物質を有効成分とする免疫制御剤に関する。
　ＤＲ６は、デスレセプターファミリーのメンバーであり、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーメンバー２１（ＴＮＦＲＳＦ２１）、又はＴＲ９とも呼ばれる。ＤＲ６は４つの細胞外システインリッチモチーフ及び１つの細胞質デスドメイン構造を有するＩ型膜貫通レセプターである（非特許文献１）。
　ＤＲ６の発現は、心臓、脳、胎盤、膵臓、リンパ節、胸腺、前立腺組織、骨格筋、腎臓、及び精巣などの組織において観察されており、様々な生体制御機構において重要な役割を担っている他、様々な疾患との関係も指摘されている。
　例えば、ＤＲ６は多発性硬化症の増悪化因子である可能性が指摘されている（非特許文献２）。また、ＤＲ６は喘息の増悪化因子である可能性も指摘されている（非特許文献３）
　また、アルツハイマー病の原因とされるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と結合し、神経細胞の細胞死・軸索伸長不全を制御する機能を有することが報告されており(非特許文献４)、ＤＲ６とＡＰＰとの相互作用を阻害又は遮断するＤＲ６アンタゴニストとなるＤＲ６拮抗性抗体が特許出願されている（特許文献１）。
　一方、ＤＲ６は免疫機構の制御にも深く関与していることが知られている。例えば、前出の非特許文献１は、ＤＲ６をコードする遺伝子が形質導入された特定の細胞株におけるＤＲ６の過剰発現が、ＮＦ－ｋＢ及びＪＮＫ両方の活性化及びアポトーシスを引き起こすことが報告されている。
　また、ＤＲ６遺伝子が欠損したモデルマウスにおいて、Ｔ細胞はＪＮＫ活性化において実質的に正常に機能せず、ＤＲ６（－／－）マウスにタンパク質抗原を投与すると、それらのＴ細胞は過剰増殖し、Ｔｈ２応答への強い偏向を示すことが報告されている（非特許文献５）。
　さらに、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質によって誘発された実験的自己免疫性脳脊髄炎のモデルを使用したところ、ＤＲ６（－／－）マウスは、野生型の同腹仔と比較して、ＣＮＳ疾患の発症及び進行の両方に高い耐性を示した。つまり、ＤＲ６は、白血球の浸潤に関与し、実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発と進行に機能している可能性がある（非特許文献６）。
　このように、ＤＲ６は免疫機構、特に末梢Ｔ細胞の活性化制御に関する細胞内シグナル伝達の開始点となる重要なレセプター分子であると考えられている。したがって、ＤＲ６と特異的に結合してＤＲ６の免疫制御に関するレセプター機能を調節することのできる分子は、ＤＲ６のシグナル伝達を介した免疫機能を活性化する又は抑制するトリガー分子となり、免疫制御剤として利用することができると期待される。
　しかし、ＤＲ６はこれまでに知られているＴＮＦリガンドファミリー分子とは結合親和性を示さず、ＤＲ６と特異的に結合して免疫制御に関するシグナルを誘導することのできるＤＲ６リガンドの正体はこれまでのところ不明である。
　一方、Ｓｄｃ１はＣＤ１３８抗原とも呼ばれ、フィブログリカン（ｆｉｂｒｏｇｌｙｃａｎ）とも呼ばれるシンデカン２、Ｎ－シンデカンとも呼ばれるシンデカン３及びアムフィグリカン（ａｍｐｈｉｇｌｙｃａｎ）とも呼ばれるシンデカン４とともに、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインにホモロジーを有するシンデカンファミリーを構成する、膜貫通型ヘパラン硫酸化プロテオグリカン高分子（ＨＳＰＧ）である。
　ＨＳＰＧは細胞種に特異的な分布をしており、細胞外基質タンパク質や細胞表面分子又はサイトカインなどの可溶性タンパク質との相互作用に関与することが知られている。また、この膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインには位置が高度に保存されたチロシン残基が４個存在しており、いずれかのチロシン残基がリン酸化されることにより細胞内情報伝達に関与する可能性が指摘されている。
　ヒトのＳｄｃ１（ｈＳｄｃ１）をコードする遺伝子はすでにクローニングされている（非特許文献７）。ｈＳｄｃ１は３１０アミノ酸残基からなり、アミノ酸１～２５１の細胞外ドメイン、それに続く２５アミノ酸残基（アミノ酸２５２～２７６）の疎水性膜貫通領域、最後の３４アミノ酸残基（アミノ酸２７７～３１０）の細胞質ドメインを含む。アミノ酸１～１７は分泌シグナルであり、ｈＳｄｃ１を生合成する細胞からＳｄｃ１が分泌される際には有用であるが、ｈＳｄｃ１の生理活性には必要ではないと理解されている。
　一方、ｈＳｄｃ１の細胞外ドメインには、３７位、４５位、４７位、２０６位及び２１６位の５つのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）付着可能部位が存在する。これらのうち４５位と４７位のアミノ酸残基はこれらを他のアミノ酸残基へと置換することによってヘパラン硫酸との結合能を失い、同時にｈＳｄｃ１としての生理活性を失うことが知られている。
　しかし、Ｓｄｃ１がＤＲ６と特異的に結合することによってＴ細胞の活性化抑制に関与していること、すなわちＤＲ６による免疫応答の制御に関してＤＲ６の生理的リガンドであることは知られていない。
Ｐａｎら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．、１９９８年、第４３１巻、ｐｐ．３５１－３５６ Ｍｉら、Ｎａｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１１年、第１７巻、ｐｐ．８１６－８２１ Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒ、２００６年、第１０６巻、ｐｐ．４２－４７ Ｎｉｋｏｌａｅｖら、Ｎａｔｕｒｅ、２００９年、第４５７巻、ｐｐ．９８１－９８９ Ｚｈａｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００１年、第１９４巻、ｐｐ．１４４１－１４４８ Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００５年、第１７５巻、ｐｐ．２２８６－２２９２ Ｍａｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９０年、第２６５巻、ｐｐ．６８８４～６８８９
特表２０１０－５１４７００号公報
　本発明は、免疫制御剤として利用可能な、ＤＲ６の免疫制御に関するレセプター機能を調節することのできる分子並びにＤＲ６及びシンデカン１を用いた免疫制御剤のスクリーニング方法を提供することを目的とするものである。
　本発明者らは、種々研究の結果、Ｓｄｃ１がＤＲ６と特異的に結合して免疫制御に関するシグナル伝達を誘導することのできるＤＲ６リガンドであることを見出し、下記の各発明を完成させた。
（１）ＤＲ６に対する特異的結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の制御能を有する生理活性物質を有効成分とする免疫制御剤。
（２）生理活性物質がＳｄｃ１又はその機能的等価物である、（１）に記載の免疫制御剤。
（３）生理活性物質が下記ａ）～ｄ）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（２）に記載の免疫制御剤；
　ａ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
　ｂ）配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列の４５番目及び４７番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失された及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、又は配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＲ６との特異的結合能を有するポリペプチド、
　ｃ）配列番号１０又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、並びに
　ｄ）配列番号１０若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列の４５番目及び４７番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失された及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、又は配列番号１０若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＲ６との特異的結合能を有するポリペプチド。
（４）生理活性物質がＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達に作用する抗ＤＲ６アゴニスト抗体又は抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体である、（１）に記載の免疫制御剤。
（５）抗ＤＲ６アゴニスト抗体が下記ａ）～ｅ）よりなる群から選ばれる１又は複数の抗ＤＲ６抗体である、（４）に記載の免疫制御剤；
　ａ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、
　ｂ）配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｙｒ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、
　ｃ）配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号３８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号４０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号４２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、
　ｄ）配列番号４４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号５０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、並びに
　ｅ）配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号５６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号５８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体。
（６）抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体が下記ｆ）及びｇ）よりなる群から選ばれる１又は複数の抗ＤＲ６抗体である、（４）に記載の免疫制御剤；
　ｆ）配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号６６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号６８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号７０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＡｒｇ－Ｖａｌ－Ｓｅｒからなる軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、並びに
　ｇ）配列番号７４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号７８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号８０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号８２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体。
（７）下記ａ）～ｅ）の工程を含む、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の制御能を有する生理活性物質をスクリーニングする方法。
　ａ）ＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と、（３）に規定されるポリペプチドの少なくとも一つと被検物質とを共存させる工程、
　ｂ）工程ａ）におけるＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と（３）に規定されるポリペプチドの少なくとも一つとの特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を検出する工程、
　ｃ）被検物質の非存在下でＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と（３）に規定されるポリペプチドの少なくとも一つとを共存させる工程、
　ｄ）工程ｃ）におけるＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と（３）に規定されるポリペプチドの少なくとも一つとの特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を検出する工程、及び
　ｅ）工程ｂ）の検出結果と工程ｄ）の検出結果とを比較する工程。
（８）抗原提示細胞で発現しているＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質を使用する、（７）に記載のスクリーニング方法。
（９）シグナル伝達の検出が、抗原提示細胞が産生するインターロイキン２の検出により行われる、（７）又は（８）に記載のスクリーニング方法。
（１０）受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７２９として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン２５－１、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３０として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１７７－１、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３１として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン８２－３０、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３２として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１８６－１８、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３３として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１８０－１０、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３４として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン４６－１５－２３及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３５として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１００－１１よりなる群から選ばれるハイブリドーマ細胞株。
　本発明によれば、これまでに知られていない作用機序に基づく免疫制御剤を提供することができ、リュウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、移植病、クローン病、潰瘍性大腸炎等の自己免疫疾患、花粉症、アトピー、重症薬疹などのアレルギー疾患に対する新しい治療薬の開発が可能となる。
野生型のＤＲ６及び可溶型組換えマウスＤＲ６（ｍＤＲ６－ｈＦｃｍ）の構造の模式図である。 ｍＤＲ６－ｈＦｃｍを結合させたマウス脾臓由来のナイーブ細胞に関するＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。ＤＲ６リガンド発現細胞はリンパ細胞画分に含まれる。 各種細胞特異的マーカータンパク質に対する標識化抗体で染色したＤＲ６リガンド発現細胞に関するＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。 ＬＰＳで刺激したＢ細胞のｍＤＲ６－ｈＦｃｍに対する結合能の経時変化を示すグラフである。 ＬＰＳで刺激したＢ細胞のｍＤＲ６－ｈＦｃｍに対する結合能及び活性化マーカーであるＣＤ８６の発現パターンの経時変化を示すグラフである。 抗ＣＤ３抗体で刺激したＴ細胞中のＤＲ６ｍＲＮＡの発現量の経時変化を示すグラフである。 Ａ２０細胞、ＤＯ１１．１０－Ｔ細胞、ＷＥＨＩ２３１細胞及びＷＥＨＩ３Ｂ細胞のｍＤＲ６－ｈＦｃｍに対する結合能を示す図である。 ｍＴＮＦＲ２－ｈＦｃｍ、ｍＦａｓ－ｈＦｃｍ、ｍＤＲ５－ｈＦｃｍ及びｍＤＲ６－ｈＦｃｍに対するＡ２０細胞の結合能を示す図である。 ｍＳｄｃ１又はｈＳｄｃ１を発現しているＤＯ１１．１０－Ｔ形質転換細胞のｍＤＲ６－ｈＦｃｍ及びｈＤＲ６－ｈＦｃｍに対する結合能を示す図である。 ｍＳｄｃ１に対する特異的ｓｈＲＮＡを導入したＡ２０細胞の抗ｍＳｄｃ１抗体、ｍＤＲ６－ｈＦｃｍ及び抗Ｂ２２０抗体に対する結合能を示すグラフである。 抗原ＯＶＡ３２３－３３９を含む１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地でｍＳｄｃ１又はｈＳｄｃ１を発現しているＡ２０細胞とＤＯ１１．１０－Ｔ細胞とを共培養したときの、ＤＯ１１．１０－Ｔ細胞によるＩＬ２の産生量の低下を示すグラフである。 ｍＳｄｃ１の４５位及び４７位のセリンをいずれもアラニンに置換したｍＳｄｃ１変異体を発現している形質転換細胞のｍＤＲ６－ｈＦｃｍに対する結合能を示す図である。 ｍＳｄｃ１－ＨｉｓのＤＯ１１．１０－Ｔ細胞に対するアゴニスト（Ｔ細胞のＩＬ２産生量の抑制）効果を示すグラフである。 ｍＳｄｃ１－ＨｉｓによるＩＬ２産生抑制はｍＤＲ６に対する特異的ｓｈＲＮＡを導入したＤＯ１１．１０－Ｔ細胞において観察されないことを示すグラフである。 抗ＣＤ３抗体及びｍＳｄｃ１－Ｈｉｓにより刺激されたＤＯ１１．１０－Ｔ細胞におけるＦａｓ、ＦａｓＬ、ＣＤ６９、ＰＤ－１及びＣＤ３の各タンパク質の発現変動を示す図である。 抗ＣＤ３抗体及びｍＳｄｃ１－Ｈｉｓにより刺激されたＤＯ１１．１０－Ｔ細胞におけるＮＦＡＴ、ＮＦκＢ、ＣＲＥＢ及びＩＳＲＥの各タンパク質の活性変動を表したレポータータンパク質であるルシフェラーゼ活性の変化を示すグラフである。 ｍＤＲ６又はｈＤＲ６を発現している形質転換Ｌ９２９細胞に対するクローン２５－１、クローン２５－３、クローン１００－１１及びクローン１７７－１が産生するモノクローナル抗体の結合強度を示す図である。 クローン２５－１、クローン２５－２、クローン２５－３、クローン１００－１１及びクローン１７７－１が産生するモノクローナル抗体の作用を、ｍＤＲ６の細胞外ドメインとｍＣＤ４０の膜貫通領域及び細胞内ドメインとからなるキメラタンパク質を用いて試験した結果を示すグラフである。 モノクローナル抗体２５－１のＤＯ１１．１０－Ｔ細胞に対するＩＬ２産生抑制効果を示すグラフである。 ＤＯ１１．１０－Ｔ細胞とＯＶＡペプチドによりパルスしたＡ２０細胞との共培養系に、抗ｍＤＲ６抗体産生ハイブリドーマの培養上清（１００μＬ）あるいは精製抗体（１００μｇ／ｍＬを添加したときのＩＬ２産生量を示すグラフである。 全身性エリテマトーデスモデル動物の血清中のＳｄｃ１の含有量の変化を示すイムノブロッティングの写真である。 ｍＳｄｃ１を発現している形質転換細胞に対する、正常ｍＤＲ６及びシステインリッチドメインを欠いた変異型ｍＤＲ６それぞれの結合能を示すグラフである。 全身エリテマトーデスのモデルマウス（ＳＬＥモデルマウス）にモノクローナル抗体２５－１を投与したときの、モデルマウスの生存率を示すグラフである。 ＳＬＥモデルマウスにモノクローナル抗体２５－１を投与したときの、ＳＬＥモデルマウスにおける蛋白尿症の発症率を示すグラフである。 モノクローナル抗体２５－１を投与したＳＬＥモデルマウスから調製された全脾臓細胞群における、ＣＤ３、ＤＲ６、ＣＤ４及びＣＤ８それぞれの発現細胞に関するＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。 図２５のパネルＢ及びパネルＤで観察されたＤＲ６陽性細胞の存在率の増加（平均値）を示すグラフである。 蛋白尿症発症期のＳＬＥモデルマウスにモノクローナル抗体２５－１を投与することで、ＤＲ６を発現しているＣＤ４陽性細胞（ヘルパーＴ細胞）の存在率が低下することを示すグラフである。
　本発明は、ＤＲ６に対する特異的結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の制御能を有する生理活性物質を有効成分とする免疫制御剤に関する。
　本発明におけるＤＲ６とは、４つの細胞外システインリッチモチーフ（ＣＲＤ１～ＣＲＤ４）及び１つの細胞質デスドメイン構造を有するＩ型膜貫通レセプターをいう。ヒトのＤＲ６（ｈＤＲ６）は、非特許文献１に報告された配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる全６５５アミノ酸残基のタンパク質で、推定シグナル配列（アミノ酸１－４１）、細胞外ドメイン（アミノ酸４２―２１１）、膜貫通ドメイン（アミノ酸３５１－３７０）及び細胞質ドメイン（アミノ酸３７１－６５５）が含まれる。マウスのＤＲ６（ｍＤＲ６）は非特許文献５に報告された配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる全６５５アミノ酸残基のタンパク質で、ｈＤＲ６とのアミノ酸配列の同一性は８８％である。
　本明細書における用語ＤＲ６には、いわゆる遺伝子多形にコードされる配列番号２又は配列番号４とは一部異なるアミノ酸配列からなる天然に存在するＤＲ６変異体、天然に存在する切断型又は分泌型（例えば細胞外ドメイン配列を含む可溶化ＤＲ６）、天然に存在するスプライス変異体及び天然に存在する対立遺伝子変異体を含む。なお、本明細書において単にＤＲ６と表したときは、ヒトを含む任意の哺乳動物由来の天然に存在するいずれかのＤＲ６を意味する。当該ＤＲ６は、自然から単離精製されうるか、又は遺伝子工学的に又は化学合成的に製造することができる。
　本明細書における「変異体」なる用語は、例えば配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＤＲ６の場合には、これらアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上、好ましくは少なくとも約８５％以上、より好ましくは少なくとも約９０％以上、もっとも好ましくは少なくとも約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＤＲ６又はその断片、又はその細胞外ドメインを包含する。また用語「変異体」は、例えば配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＤＲ６の場合には、配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加したアミノ酸配列からなるＤＲ６、配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に１又は複数のアミノ酸残基が付加したポリペプチド、配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端から１又は複数のアミノ酸残基が欠失したＤＲ６も含む。
　なお、アミノ酸配列の同一性（％）は、当業者によって通常用いられる適当なソフトプログラム、例えば配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２などを用い、比較されるアミノ酸配列をアラインメントしたときに得られる最大のパーセント配列同一性を意味する。
　本明細書におけるｈＳｄｃ１は、非特許文献７に報告された配列番号６に示されるアミノ酸配列からなり、４５位と４７位にヘパラン硫酸が結合した全３１０アミノ酸残基の膜貫通型ヘパラン硫酸化プロテオグリカン高分子をいう。またマウスのＳｄｃ１（ｍＳｄｃ１）は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなり、４５位と４７位にヘパラン硫酸が結合した全３１１アミノ酸残基の膜貫通型ヘパラン硫酸化プロテオグリカン高分子をいう。
　本明細書におけるＳｄｃ１には、いわゆる遺伝子多形にコードされる配列番号６又は配列番号８とは一部異なるアミノ酸配列からなる天然に存在するＳｄｃ１変異体、天然に存在する切断型又は分泌型（例えば細胞外ドメイン配列を含む可溶化Ｓｄｃ１）、天然に存在するスプライス変異体及び天然に存在する対立遺伝子変異体を含む。なお、本明細書において単にＳｄｃ１と表したときは、ヒトを含む任意の哺乳動物由来の天然に存在するいずれかのＳｄｃ１を意味する。当該Ｓｄｃ１は、自然から単離精製されうるか、又は遺伝子工学的に又は化学合成的に製造することができる。
　本明細書における「ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達」は、前記２つの分子のリガンド－レセプター間相互作用によって開始されて免疫細胞であるＴ細胞の活性化抑制へと至る、ＤＲ６を発現している細胞内における連鎖反応の全部又は一部をいう。ＤＲ６を発現している細胞がＴ細胞である場合、当該シグナル伝達はそのＴ細胞のインターロイキン２（ＩＬ２）産生量を測定することでモニターすることができる。また当該シグナル伝達はＤＲ６の細胞内デスドメインと細胞内の他のタンパク質との相互作用によって伝達されることから、シグナル伝達に関与するＤＲ６以外の細胞内分子の機能、活性、形態、化学構造などの変化を測定することで、本発明にいうシグナル伝達をモニターしてもよい。
　本明細書における「シグナル伝達の制御能」とは、上述のシグナル伝達を開始させる、増強させる若しくは増幅させる能力、又は当該シグナル伝達の開始を防止する、抑止する、中和する、遮断する、停止させる、中断させる若しくは減衰させる能力をいう。本発明では特に断らない限り、前記シグナル伝達を開始させる、増強させる又は増幅させる能力を誘導能と、前記シグナル伝達の開始を防止する、抑止する、遮断する、停止させる、中断させる又は減衰させる能力を抑制能と表すことにする。また、ＤＲ６への結合能及び前記誘導能を有する物質をＤＲ６アゴニストと、ＤＲ６への結合能及び前記抑制能を有する物質をＤＲ６アンタゴニストと表すことにする。
　「ＤＲ６アンタゴニスト」又は「ＤＲ６アゴニスト」なる用語は最も広い意味に使用され、インビトロ、インサイツ、インビボ又はエクスビボの何れかで、ＤＲ６とＳｄｃ１との結合によりＴ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達を制御する任意の分子を含む。
　本発明として意図されるＤＲ６アンタゴニスト又はＤＲ６アゴニストは、抗ＤＲ６抗体、Ｓｄｃ１、Ｓｄｃ１変異体、可溶化Ｓｄｃ１、可溶化Ｓｄｃ１変異体又はそれらと他のタンパク質とからなる融合タンパク質、これらの多量体、又はＤＲ６と結合してＤＲ６とＳｄｃ１との結合を抑制する低分子化合物などを挙げることができる。
　したがって、本発明における「免疫制御剤」の一態様は、ＤＲ６への結合能を有し、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって開始されるＴ細胞の活性抑制へと至るシグナル伝達に関するアゴニスト又はアンタゴニストであって、Ｔ細胞の活性化が関与する免疫応答を開始させる、増強させる、増幅させる、防止する、抑止する、遮断する、停止させる、中断させる又は減衰させるための物質を含む。
　また本発明における「免疫制御剤」の別の態様は、Ｓｄｃ１への結合能を有し、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって開始されるＴ細胞の活性抑制へと至るシグナル伝達を防止する、抑止する、遮断する、停止させる、中断させる又は減衰させるための物質を含む。
　以下、実施態様を例示することにより本発明をさらに説明する。
１．アゴニストである免疫制御剤
　本発明のある実施態様では、ＤＲ６に対する特異的結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるＴ細胞の活性化抑制に至るシグナル伝達の誘導能を有する免疫制御剤が提供される。すなわち、本実施態様は、ＤＲ６と結合して前記シグナル伝達を誘導してＴ細胞活性化を抑制することのできる、ＤＲ６アゴニストとしての免疫制御剤に関する。
１－ａ）Ｓｄｃ１
　本発明の免疫制御剤であるＤＲ６アゴニストの一つの実施態様は、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるｈＳｄｃ１、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるｍＳｄｃ１である。
　配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるｍＳｄｃ１が生理的条件下でｍＤＲ６と結合することでＴ細胞の活性抑制へと至るシグナル伝達を誘導することは、以下に示す本発明者らの研究（１）～（７）によって明らかにされた。
　（１）ＤＲ６のリガンド分子を探索するために、ｍＤＲ６をコードする遺伝子（配列番号３）を組み換えて、可溶型組換えｍＤＲ６（ｍＤＲ６－ｈＦｃｍ）を作成した。この組換タンパク質は、ｍＤＲ６の細胞外領域（アミノ酸配列の１～３５０番目、配列番号８８）とヒトＩｇＧのＦｃ領域とからなる融合タンパク質の２分子がＦｃ領域でジスルフィド結合してなる２量体である。また、非特異的な結合を抑制する為に該ヒトＩｇＧのＦｃ領域の２３３番目のグルタミン酸がフェニルアラニンに、２３４番目のロイシンがバリンに、２３５番目のロイシンがアラニンに、それぞれ置換されている。野生型のＤＲ６及びｍＤＲ６－ｈＦｃｍの構造の模式図を図１に示す。
　ＡＰＣ（アロフィコシアニン）で標識化したｍＤＲ６－ｈＦｃｍ（標識化ｍＤＲ６－ｈＦｃｍ）を用いてマウス脾臓由来のナイーブ細胞を染色した後、ＦＡＣＳでそれらを分離したところ、リンパ細胞群中に標識化ｍＤＲ６－ｈＦｃｍが結合した細胞すなわちＤＲ６リガンド発現細胞が検出された（図２、パネルＤ、リンパ球の左上部）。さらにＤＲ６リガンド発現細胞を、細胞特異的マーカータンパク質であるＢ２２０、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４９ｂ及びＦ４／８０のそれぞれに特異的な標識化抗体で染色したところ、ＤＲ６リガンド発現細胞はＢ細胞特異的マーカータンパク質であるＢ２２０に対する標識化抗体より染色された（図３、Ｂ２２０細胞を示すパネルの右上部）。
　（２）マウス脾臓から単離したＢ細胞をＬＰＳで刺激し、同細胞と標識化ｍＤＲ６－ｈＦｃｍとの結合を経時的に測定したところ、標識化ｍＤＲ６－ｈＦｃｍのＢ細胞への結合はＬＰＳ刺激後２日目に増加した（図４）。また、同時に測定したＢ細胞の活性化マーカーであるＣＤ８６も、ＬＰＳ刺激後２日目に増加した（図５）。これらから、ＤＲ６リガンドの発現はＢ細胞の活性化期に誘導されることが確認された。一方、ＤＲ６を細胞膜上に発現しているＴ細胞を抗ＣＤ３抗体で刺激し、同細胞中のＤＲ６のｍＲＮＡの発現量を経時的に測定したところ、ＤＲ６の発現も抗ＣＤ３抗体による刺激すなわちＴ細胞の活性化刺激により誘導されることが確認された（図６）。
　（３）免疫細胞であるＡ２０細胞、ＤＯ１１．１０－Ｔ細胞、ＷＥＨＩ２３１細胞及びＷＥＨＩ３Ｂ細胞の標識化ｍＤＲ６－ｈＦｃｍに対する結合能を調べたところ、成熟Ｂ細胞由来のＡ２０のみが標識化ｍＤＲ６－ｈＦｃｍとの結合能を示した（図７）。さらに、標識化ｍＤＲ６－ｈＦｃｍのｍＤＲ６（１－３５０残基）をマウスＴＮＦレセプター（ｍＴＮＦＲ２）、マウスＦａｓタンパク質（ｍＦａｓ）、マウスデスレセプター５（ｍＤＲ５）にそれぞれ置き換えた標識化ｍＴＮＦＲ２－ｈＦｃｍ、標識化ｍＦａｓ－ｈＦｃｍ及び標識化ｍＤＲ５－ｈＦｃｍを作製し、これらに対するＡ２０細胞の結合能を調べたところ、Ａ２０細胞は標識化ｍＤＲ６－ｈＦｃｍと特異的に結合した（図８）。すなわち、Ａ２０細胞上に存在するＤＲ６リガンドは、ＤＲ６と特異的に結合することが確認された。
　（４）ｍＳｄｃ１をコードする遺伝子（配列番号７）を発現可能に組み込んだ発現ベクター（ｐＭＸｓＩＧ／ｍＳｄｃ１)、ｈＳｄｃ１をコードする遺伝子（配列番号５）を発現可能に組み込んだ発現ベクター（ｐＭＸｓＩＧ／ｈＳｄｃ１）及びコントロールベクター（ｐＭＸｓＩＧ）をそれぞれＤＯ１１．１０－Ｔ細胞に導入して形質転換細胞を作製した。また、標識化ｍＤＲ６－ｈＦｃｍのｍＤＲ６（１－３５０残基）をｈＤＲ６の細胞外領域（アミノ酸配列の１～３５０番目、配列番号８６）に置き換えて標識化ｈＤＲ６－ｈＦｃｍを作製した。
　標識化ｍＤＲ６－ｈＦｃｍ及び標識化ｈＤＲ６－ｈＦｃｍに対する上記３種類の形質転換細胞の結合能を調べたところ、コントロールを除くいずれの形質転換細胞も、標識化ｍＤＲ６－ｈＦｃｍ及び標識化ｈＤＲ６－ｈＦｃｍいずれにも結合した（図９）。すなわち、ｍＤＲ６はｍＳｄｃ１及びｈＳｄｃ１と、またｈＤＲ６はｍＳｄｃ１及びｈＳｄｃ１と結合することが確認された。
　（５）ｍＳｄｃ１をコードする遺伝子の異なる領域を標的とした２種類の特異的ｓｈＲＮＡ（ｓｈｍＳｄｃ１－２及びｓｈｍＳｄｃ１－５）をＡ２０細胞に導入して、ｍＳｄｃ１の発現が抑制された形質転換細胞を作製した。市販の抗ｍＳｄｃ１抗体、標識化ｍＤＲ６－ｈＦｃｍ及び抗Ｂ２２０抗体に対する前記形質転換細胞の結合能を調べたところ、標識化ｍＤＲ６－ｈＦｃｍに対する結合能は抗Ｓｄｃ１抗体と同程度に減少した（図１０）。すなわち、Ａ２０細胞におけるＳｄｃ１の発現と標識化ｍＤＲ６－ｈＦｃｍに対する結合能には正の相関があることが確認された。
　（６）抗原ＯＶＡ３２３－３３９に反応性を示す抗原提示細胞としてのＡ２０細胞に、マウスＳｄｃ１（ｍＳｄｃ１）をコードする遺伝子を発現可能に組み込んだ発現ベクター（ｐＭＸｓＩＧ／ｍＳｄｃ１）、ｈＳｄｃ１をコードする遺伝子を発現可能に組み込んだ発現ベクター（ｐＭＸｓＩＧ／ｈＳｄｃ１）及びコントロールベクター（ｐＭＸｓＩＧ）をそれぞれ導入して、３種類の形質転換細胞を作製した。抗原ＯＶＡ３２３－３３９を含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で前記形質転換細胞とＤＯ１１．１０－Ｔ細胞とを共培養した後、各培地中のＩＬ２産生量をＥＬＩＳＡによって測定した。コントロール形質転換細胞及び形質転換しなかったＡ２０細胞と比較して、ｍＳｄｃ１又はｈＳｄｃ１を発現している形質転換Ａ２０細胞におけるＩＬ２の産生量は、１７０ｐｇ／ｍｌ以下に低下した（図１１）。すなわち、抗原提示細胞におけるｈＳｄｃ１又はｍＳｄｃ１の発現はＴ細胞の活性化を抑制することが確認された。
　（７）ｍＳｄｃ１の４５位及び４７位のセリンをいずれもアラニンに置換したｍＳｄｃ１変異体をコードする遺伝子を発現可能に組み込んだ発現ベクター（ｐＭＸｓＩＧ／Ｓ４５Ａ／Ｓ４７ＡｍＳｄｃ１）及び前記ｐＭＸｓＩＧ／ｍＳｄｃ１をＡ２０細胞にそれぞれ導入して、ｍＳｄｃ１変異体を発現している形質転換細胞及びｍＳｄｃ１を発現している形質転換細胞を作製した。標識化ｍＤＲ６－ｈＦｃｍに対する上記２種類の形質転換細胞の結合能を調べたところ、ｍＳｄｃ１を発現している形質転換細胞（コントロール）と比較して、ｍＳｄｃ１変異体を発現している細胞の結合能はほとんど検出されなかった（図１２）。
　（１）～（７）に示された研究結果は、Ｓｄｃ１がＢ細胞の細胞膜上に発現しており、Ｔ細胞の細胞膜上に発現しているＤＲ６と結合することでＴ細胞の活性化抑制すなわちＴ細胞によるＩＬ２産生を抑制する機能を有することを示している。このことは、Ｓｄｃ１がＤＲ６に対する特異的結合能を有し、Ｔ細胞の活性化抑制に至るシグナル伝達の誘導能を有する免疫制御剤として利用可能であることを意味する。したがって、本発明の好ましい実施態様の一つは、配列番号６又は８に示されるアミノ酸配列からなるＳｄｃ１を有効成分とする免疫制御剤又はＴ細胞活性化抑制剤に関する。
　なお、上記の研究において行われた各種実験は、いずれも当業者に公知又は周知の手法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９年、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）その他の、当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用されている手法を用いて行われたものである。また市販のキットや試薬の使用を伴う手順は、特に明記しない限り、当該キットや試薬の製造者が定めたプロトコル及び／又はパラメータに従った。
　本発明の免疫制御剤の一つであるＳｄｃ１は、配列番号５又は配列番号７に示されたアミノ酸配列をコードする核酸に対して一般的な遺伝子組み換え手法を適用することで、リコンビナントタンパク質として製造することができる。
　本発明においては、配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列の４５位及び４７位に適切な糖鎖を付与させるために、宿主細胞としてヒト胎児腎細胞由来ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの哺乳動物細胞を利用することが好ましい。かかる哺乳動物細胞における外来タンパク質の発現を含む一般的な遺伝子組み換え手法としては、前記Ｓａｍｂｒｏｏｋら又はその他の当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用されている各種方法を挙げることができる。
１－ｂ）アゴニストであるＳｄｃ１変異体
　本発明の別の実施態様は、配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列の４５番目及び４７番目のアミノ酸を除く１若しくは複数のアミノ酸が欠失された及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、並びに／又は配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＲ６との特異的結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導する活性を有するポリペプチド（以下、Ｓｄｃ１変異体とする）である、免疫制御剤である。
　一般に、あるアミノ酸配列からなる機能性タンパク質において、その機能を保持しながらも一定の範囲でアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加が許容されることは、当業者に広く知られている。例えば、ｈＳｄｃ１と異種生物のＳｄｃ１例えばｍＳｄｃ１とのアミノ酸配列のアライメントによって確認される互いに異なるアミノ酸残基や、シンデカンファミリー間でのアミノ酸配列のアライメントによって確認される互いに異なるアミノ酸残基について、それらを相互に置き換えても元のタンパク質の機能性が失われない場合がある。
　また、アミノ酸配列のアライメントによって確認される対応するアミノ酸が存在しないアミノ酸ギャップについて、そのギャップに相当するアミノ酸を欠失させたりあるいは付加したりしても、元のタンパク質の機能が失われない場合がある。さらに、例えばＬｅｕ（本明細書では天然アミノ酸を３文字表記で表すこととする）とＩｌｅ、ＡｓｐとＧｌｕ、ＡｓｎとＧｌｎ、ＬｙｓとＡｇｒ、ＳｅｒとＴｈｒその他の当業者に保存的置換として知られているアミノ酸間の置換によっても、元のタンパク質の機能が失われない場合があることも広く知られている。特に現在では、機能を維持することができる置換位置とアミノ酸の選択を、タンパク質の２次構造予測及び／又は３次元構造予測、疎水性、親水性、電荷、側鎖の嵩その他のアミノ酸の物理化学的特性に基づいて、高い確度をもって予測することが可能となっている。
　したがって、本発明の実施態様の一つであるＳｄｃ１において、配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失され、置換され及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＤＲ６との結合能及びＴ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達を誘導する活性を有するポリペプチドは、ＤＲ６に対するＳｄｃ１アゴニスト変異体として利用可能であり、本発明である免疫制御剤を構成する。
　なお、配列番号６又は配列番号８の４５位と４７位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ヘパラン硫酸による糖鎖修飾を受けることができず、その結果当該ポリペプチドはＤＲ６に対するアゴニストとしての機能を示すことができない。かかる配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において４５位と４７位のアミノ酸残基が置換された又は欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドは、本発明には包含されない。
　また、配列番号６又は配列番号８の１～１７番目のアミノ酸配列は、Ｓｄｃ１を生合成する細胞においてＳｄｃ１が分泌又は膜に配置される際には有用な、いわゆるシグナル配列である。かかるシグナル配列はＤＲ６に対するリガンド機能にとって必要ではない。したがって、配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において１～１７番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドも、ＤＲ６に対するＳｄｃ１アゴニスト変異体として利用可能であり、本発明である免疫制御剤を構成する。
　本発明の免疫制御剤の一つであるＳｄｃ１変異体は、配列番号５又は配列番号７に示されたアミノ酸配列をコードする核酸に対して所望の変異を導入する方法を含む一般的な遺伝子組み換え手法を適用することで、リコンビナントタンパク質として製造することができる。
　本発明においては、配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列の４５位及び４７位に適切な糖鎖を付与させるために、発現宿主細胞としてＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの哺乳動物細胞を利用することが好ましい。かかる哺乳動物細胞における外来タンパク質の発現、及び所望の変異を導入する方法を含む一般的な遺伝子組み換え手法としては、前記Ｓａｍｂｒｏｏｋら又はその他の当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用される方法論を挙げることができる。
１－ｃ）アゴニストである可溶化Ｓｄｃ１
　本発明のさらなる実施態様は、配列番号１０又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなり、ＤＲ６との特異的結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導する活性を有するポリペプチド（以下、可溶化Ｓｄｃ１とする）である、免疫制御剤である。
　可溶化Ｓｄｃ１は、Ｓｄｃ１の細胞外ドメインの全部又は一部に相当するポリペプチドであり、そのアミノ酸配列は配列番号６に示されるアミノ酸配列の１～２５０番目のアミノ酸配列又は配列番号８の１～２５１番目のアミノ酸配列に相当する。可溶化Ｓｄｃ１は膜貫通領域を持たないので膜にはアンカーリングされず、細胞質、血液その他の液体媒体中に可溶化状態で存在することができる。
　本発明の免疫制御剤の一つである可溶化Ｓｄｃ１は、配列番号９又は配列番号１１に示されたアミノ酸配列をコードする核酸に対して一般的な遺伝子組み換え手法を適用することで、リコンビナントタンパク質として製造することができる。また、配列番号５又は配列番号７に示されたアミノ酸配列をコードする核酸に対して一般的な遺伝子組み換え手法を適用して得られるＳｄｃ１をプロテアーゼ消化して、可溶化Ｓｄｃ１を製造してもよい。
　本発明においては、配列番号１０又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列の４５位及び４７位に適切な糖鎖を付与させるために、宿主細胞としてＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの哺乳動物細胞を利用することが好ましい。哺乳動物細胞における外来タンパク質の発現、及び所望の変異を導入する方法を含む一般的な遺伝子組み換え手法としては、前記Ｓａｍｂｒｏｏｋら又はその他の当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用される方法論を挙げることができる。
１－ｄ）アゴニストである可溶化Ｓｄｃ１変異体
　本発明のさらに異なる実施態様は、配列番号１０若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列の４５番目及び４７番目のアミノ酸を除く１若しくは複数のアミノ酸が欠失された及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、並びに／又は配列番号１０若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＲ６との特異的結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導する活性を有するポリペプチド（以下、可溶化Ｓｄｃ１変異体とする）である、免疫制御剤である。
　本実施態様には、配列番号１０又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、先にＳｄｃ１変異体に関して説明した態様のようなアミノ酸が置換、欠失、付加されたアミノ酸配列からなる可溶化Ｓｄｃ１変異体が含まれる。例えば、配列番号１０又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列において１～１７番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドも、ＤＲ６との結合能及びＴ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達を誘導する活性を有するポリペプチドであり、可溶化Ｓｄｃ１変異体として本発明である免疫制御剤を構成する。
　また、配列番号１０のＣ末端アミノ酸残基は配列番号６の２５０番目のアミノ酸残基に相当するが、配列番号６の２５１番目以降のアミノ酸配列が配列番号１０に示されるアミノ酸配列のＣ末端に数個～十数個付加されても、逆に配列番号１０のＣ末端が数個～十数個欠失されても、かかるアミノ酸配列からなるポリペプチドはＤＲ６との特異的結合能及びＤＲ６を介した免疫制御に関するシグナル伝達を誘導する活性を有することができる。配列番号１２についても同様である。かかる配列番号１０又は配列番号１２のＣ末端において数個～十数個のアミノ酸が付加された又は欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドも、可溶化Ｓｄｃ１変異体として本発明である免疫制御剤を構成する。
　本発明の免疫制御剤である可溶化ｈＳｄｃ１変異体は、配列番号９又は配列番号１１に示されたアミノ酸配列をコードする核酸に対して所望の変異を導入する方法を含む一般的な遺伝子組み換え手法を適用することで、リコンビナントタンパク質として製造することができる。
　本発明においては、配列番号１０又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列の４５位及び４７位に適切な糖鎖を付与させるために、宿主細胞としてＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの哺乳動物細胞を利用することが好ましい。かかる哺乳動物細胞における外来タンパク質の発現、所望の変異を導入する方法を含む一般的な遺伝子組み換え手法としては、前記Ｓａｍｂｒｏｏｋら又はその他の当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用される方法論を挙げることができる。
１－ｅ）抗ＤＲ６アゴニスト抗体
　ＤＲ６アゴニストのまた別の実施態様の例は、ＤＲ６に特異的に結合し、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導することができる抗ＤＲ６アゴニスト抗体である。抗ＤＲ６アゴニスト抗体としては、例えばモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体が挙げられる。
　本発明の特定の実施態様では、ＤＲ６アゴニストである免疫制御剤はＤＲ６細胞外ドメイン又はその断片に結合する抗ＤＲ６アゴニスト抗体を含むことができる。
　本発明の抗ＤＲ６抗体は、当業者に知られた一般的な抗体作成方法によって得ることができる。具体的には、ＤＲ６好ましくは遺伝子組み換え手法によって製造されたＤＲ６又はその一部、若しくはそれらと適当なキャリア物質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビタなど）とのコンジュゲートを、必要に応じて免疫賦活剤（フロインドの完全又は不完全アジュバント等）とともに、ラット、ラビット、ヒト抗体産生トランスジェニックマウスなどの非ヒト哺乳動物に免疫することにより、抗ＤＲ６抗体産生細胞群を誘導し、抗ＤＲ６抗体を調製することができる。又は、ＤＲ６をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに導入し、非ヒト哺乳動物内でＤＲ６を発現させることによって免疫感作させ、抗ＤＲ６抗体産生細胞群を誘導し、抗ＤＲ６抗体を調製してもよい。
　本発明の抗ＤＲ６抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、抗ＤＲ６抗体産生細胞と自己抗体産生能のない不死化株化細胞、例えば骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）とを融合することにより得られるハイブリドーマを培養し、免疫に用いた抗原に対して免疫沈降又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合検定法によって特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって取得することができる。かかるモノクローナル抗体の作製方法を構成する工程としては、後の実施例において説明する抗原の作製工程及びモノクローナル抗体の生理活性及びその認識特異性の検定を含む所望の抗体の選別工程を除き、当業者に周知の工程を利用することができる。
　一般に、抗体の重鎖及び軽鎖はそれぞれＮ末端側に可変領域及びＣ末端側に定常領域（ＣＨ、ＣＬ）を有している。重鎖及び軽鎖の可変領域にはそれぞれ相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）が存在し、この部分が抗原認識の特異性を担っている。ＣＤＲ以外の部分はＣＤＲの構造を保持する役割を有し、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。
　重鎖可変領域中には、第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）の３つの相補性決定領域が存在する。重鎖可変領域中の３つの相補性決定領域は、重鎖相補性決定領域と呼ばれる。また軽鎖可変領域中にも同様に、第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）の３つの相補性決定領域が存在する。軽鎖可変領域中の３つの相補性決定領域は、軽鎖相補性決定領域とよばれる。
　本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体には、新規なアミノ酸配列を含有するＣＤＲを有する抗ＤＲ６アゴニスト抗体、好ましくはモノクローナル抗体が包含される。
　本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体の好ましい実施態様としては、後述の実施例に記載されるクローン２５－１により産生される抗体（２５－１抗体）を挙げることができる。クローン２５－１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに２０１３年１０月１７日付で受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０１７２９（識別の表示：２５－１）として国内寄託され、２０１４年１０月２７日付で受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７２９（識別の表示：２５－１）として国際寄託されている。
　クローン２５－１により産生される抗ＤＲ６抗体は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６モノクローナル抗体である。
　本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体のもう一つの好ましい実施態様は、後述の実施例に記載されるクローン１７７－１により産生される抗体（１７７－１抗体）を挙げることができる。クローン１７７－１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに２０１３年１０月１７日付で受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０１７３０（識別の表示：１７７－１）として国内寄託され、２０１４年１０月２７日付で受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３０（識別の表示：１７７－１）として国際寄託されている。
　クローン１７７－１により産生される抗ＤＲ６抗体は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｙｒ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗ＤＲ６モノクローナル抗体である。
　本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体のもう一つの好ましい実施態様は、後述の実施例に記載されるクローン８２－３０により産生される抗体（８２－３０抗体）を挙げることができる。クローン８２－３０は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに２０１３年１０月１７日付で受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０１７３１（識別の表示：８２－３０）として国内寄託され、２０１４年１０月２７日付で受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３１（識別の表示：８２－３０）として国際寄託されている。
　クローン８２－３０により産生される抗ＤＲ６抗体は、配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号３８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号４０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号４２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６モノクローナル抗体である。
　本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体のもう一つの好ましい実施態様は、後述の実施例に記載されるクローン１８６－１８により産生される抗体（１８６－１８抗体）を挙げることができる。クローン１８６－１８は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに２０１３年１０月１７日付で受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０１７３２（識別の表示（識別のための表示：１８６－１８）として国内寄託され、２０１４年１０月２７日付で受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３２（識別の表示（識別のための表示：１８６－１８）として国際寄託されている。
　クローン１８６－１８により産生される抗ＤＲ６抗体は、配列番号４４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号５０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６モノクローナル抗体である。
　本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体のもう一つの好ましい実施態様は、後述の実施例に記載されるクローン１８０－１０により産生される抗体（１８０－１０抗体）を挙げることができる。クローン１８０－１０は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに２０１３年１０月１７日付で受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０１７３３（識別の表示：１８０－１０）として国内寄託され、２０１４年１０月２７日付で受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３３（識別の表示：１８０－１０）として国際寄託されている。
　クローン１８０－１０により産生される抗ＤＲ６抗体は、配列番号５４に示されるミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号５６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号５８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６モノクローナル抗体である。
　上記の各具体的な態様である抗ＤＲ６アゴニスト抗体において、各ＣＤＲ以外のアミノ酸配列は特に限定されず、必要に応じてＦＲに１ないし数個のアミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入を伴っていてもよい。また、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列が本発明の抗体以外の他の抗体、特にＣＤＲ以外が異なる生物種の抗体由来である、いわゆるＣＤＲ移植抗体も本発明の抗体に包含される。
　ＣＤＲ移植抗体の好適な例は、ＣＤＲ配列がマウス、ラット、ウサギその他の非ヒト動物由来であり、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列がヒト由来であるヒト化抗体又はヒト抗体である。かかるヒト化抗体又はヒト抗体の製造方法は当業者に周知であり、例えばＪｏｎｅｓら（Ｎａｔｕｒｅ、１９８６年、第３２１巻、５２２－５２５ページ）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ、１９８８年、第３３２巻、３２３－３２７ページ）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８年、第２３９巻、１５３４－１５３６ページ）の方法などがあり、上記の抗ＤＲ６アゴニスト抗体であるクローンそれぞれに適用することができる。
　本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体は、その機能的断片も包含する。機能的断片とは、抗体の部分断片であって抗原への結合能、抗原への反応性又は抗原の認識能を保持したものを意味する。かかる機能性断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ｄｓＦｖ及びＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
　本発明に包含されるＦａｂは、抗ＤＲ６アゴニスト抗体をパパイン消化して得られる断片のうち、重鎖のＮ末端側約半分と軽鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片として調製することができる。また、該抗体のＦａｂをコードする核酸を作成し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
　本発明に包含されるＦ（ａｂ’）２は、抗ＤＲ６アゴニスト抗体をペプシン消化して得られる断片のうち、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものより大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片として調製することができる。また、下記に説明するＦａｂ’の２分子をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させることで調製することができる。
　本発明に包含されるＦａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合をジチオスレイトールなどの還元剤で切断した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片として調製することができる。また、該抗体のＦａｂ’をコードする核酸を作成し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
　本発明に包含されるｓｃＦｖは、１本の重鎖可変領域（以下、ＶＨと表記する）と１本の軽鎖可変領域（以下、ＶＬと表記する）とを適当なペプチドリンカー（以下、Ｌと表記する）を用いて連結した、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ又はＶＬ－Ｌ－ＶＨと表すことができる構造を有する、抗原結合活性を有する抗体断片である。
　本発明に包含されるｓｃＦｖは、本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体のＶＨ及びＶＬをコードする核酸を基にして上記構造を有するｓｃＦｖをコードする核酸を構築し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
　本発明に包含されるダイアボディは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片であり、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は同一であっても、また互いに異なっていてもよい。ダイアボディについては例えば欧州特許第４０４，０９７号及び国際公報ＷＯ１９９３／１１１６１号パンフレットに詳細に記載されている。
　本発明に包含されるダイアボディは、本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体のＶＨ及びＶＬをコードする核酸を基にして、アミノ酸配列の長さが８残基以下であるペプチドリンカーＬを介してＶＨ及びＶＬが連結されたポリペプチドをコードする核酸を構築し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
　本発明に包含されるｄｓＦｖは、本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体のＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したシステイン含有ＨＶとシステイン含有ＬＶとを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換されるアミノ酸残基の決定は、Ｒｅｉｔｅｒら（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７：６９７－７０４，１９９４）の方法に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
　本発明に包含されるｄｓＦｖは、本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体のＶＨ及びＶＬをコードする核酸を基にして、上記Ｒｅｉｔｅｒらの方法によって特定されたアミノ酸残基がシステインに置換されたポリペプチドをコードする核酸を構築し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
　なお、本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体及びその機能的断片は、ヨウ素１２５などの放射性同位元素、核酸プローブや蛍光標識物質などの低分子化合物、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー及びヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどの高分子薬剤又はタンパク質などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合又はコンジュゲートさせた標識化抗体又は誘導体とすることができ、これらはいずれも本発明に含まれる。抗体又はその機能的断片に結合させることのできる化学物質やその結合は、当業者に周知の方法（例として抗体工学入門、金光修著、地人書館、１９９４に記載された方法)を使用することができる。
　また、本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体は、公知の方法によってグリコシル化して用いてもよい。抗体をグリコシル化する方法は、例えばＪｅｆｆｅｒｉｓら（Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７年、第６５巻、ｐｐ．１１１－１２８）又はＷｒｉｇｈｔら（ＴｉｂＴＥＣＨ、１９９７年、第１５巻、ｐｐ．２６－３２）などに記載されており、本発明の抗体又はその機能的断片に対してもかかる方法を適用することができる。
　なお、グリコシル化する方法によって、本発明のモノクローナル抗体のグリコシル化パターンが変更された抗体、具体的には元の抗体における１以上の糖鎖が除去された、１以上の糖鎖を新たに加えられた、又は糖鎖の組成が変更された抗体を作製することができる。本発明は、抗ＤＲ６アゴニスト抗体である限り、かかるグリコシル化抗体も含む。
　さらに本発明は、前記クローン２５－１、１７７－１、８２－３０、１８６－１８及び１８０－１０の各ＣＤＲのアミノ酸配列の１又は複数を含むポリペプチドを、抗ＤＲ６アゴニストとして含む。各ＣＤＲは直接又は適当なペプチドリンカーを介して互いに結合させてもよい。かかるポリペプチドは、各アミノ酸配列の１つ又は２以上をコードする核酸を構築し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。また、本発明のＣＤＲを含むポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）などの当業者に周知の化学合成法によって製造することができる。
２．アンタゴニストである免疫制御剤
　本発明の一実施態様では、ＤＲ６に対する特異的結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の抑制能を有する免疫制御剤が提供される。すなわち、本実施態様は、ＤＲ６と結合してＴ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達を抑制することでＴ細胞を活性化させることのできる、ＤＲ６アンタゴニストとしての免疫制御剤に関する。
２－ａ）抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体
　ＤＲ６アンタゴニストの実施態様の例は、ＤＲ６に特異的に結合し、Ｔ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達を抑制することができる抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体である。抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体としては、例えばモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体が挙げられる。
　本発明の特定の実施態様では、ＤＲ６アンタゴニストである免疫制御剤はＤＲ６細胞外ドメイン又はその断片に結合する抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体を含むことができる。
　本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体の好ましい実施態様は、後述の実施例に記載されるクローン４６－１５－２３により産生される抗体（４６－１５－２３抗体）を挙げることができる。クローン４６－１５－２３は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに２０１３年１０月１７日付で受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０１７３４（識別の表示（識別のための表示：４６－１５－２３）として国内寄託され、２０１４年１０月２７日付で受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３４（識別の表示（識別のための表示：４６－１５－２３）として国際寄託されている。
　クローン４６－１５－２３により産生される抗ＤＲ６抗体は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号６６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号６８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号７０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＡｒｇ－Ｖａｌ－Ｓｅｒからなる軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６モノクローナル抗体である。
　本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体のもう一つの好ましい実施態様は、後述の実施例に記載されるクローン１００－１１により産生される抗体（１００－１１抗体）を挙げることができる。クローン１００－１１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに２０１３年１０月１７日付で受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０１７３５（識別の表示：１００－１１）として国内寄託され、２０１４年１０月２７日付で受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３５（識別の表示：１００－１１）として国際寄託されている。
　クローン１００－１１により産生される抗ＤＲ６抗体は、配列番号７４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号７８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号８０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号８２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６モノクローナル抗体である。
　上記の各具体的な態様である抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体において、各ＣＤＲ以外のアミノ酸配列は特に限定されず、必要に応じてＦＲに１ないし数個のアミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入を伴っていてもよい。また、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列が本発明の抗体以外の他の抗体、特にＣＤＲ以外が異なる生物種の抗体由来である、いわゆるＣＤＲ移植抗体も本発明の抗体に包含される。
　ＣＤＲ移植抗体の好適な例は、ＣＤＲ配列がマウス、ラット、ウサギその他の非ヒト動物由来であり、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列がヒト由来であるヒト化抗体又はヒト抗体である。かかるヒト化抗体又はヒト抗体の製造方法は当業者に周知であり、例えばＪｏｎｅｓら（Ｎａｔｕｒｅ、１９８６年、第３２１巻、５２２－５２５ページ）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ、１９８８年、第３３２巻、３２３－３２７ページ）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８年、第２３９巻、１５３４－１５３６ページ）の方法などがあり、上記の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体であるクローンそれぞれに適用することができる。
　本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体は、その機能的断片も包含する。機能的断片とは、抗体の部分断片であって抗原への結合能、抗原への反応性又は抗原の認識能を保持したものを意味する。かかる機能性断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ｄｓＦｖ及びＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
　本発明に包含されるＦａｂは、抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体をパパイン消化して得られる断片のうち、重鎖のＮ末端側約半分と軽鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片として調製することができる。また、該抗体のＦａｂをコードする核酸を作成し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
　本発明に包含されるＦ（ａｂ’）２は、抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体をペプシン消化して得られる断片のうち、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものより大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片として調製することができる。また、下記に説明するＦａｂ’の２分子をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させることで調製することができる。
　本発明に包含されるＦａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合をジチオスレイトールなどの還元剤で切断した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片として調製することができる。また、該抗体のＦａｂ’をコードする核酸を作成し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
　本発明に包含されるｓｃＦｖは、１本の重鎖可変領域（以下、ＶＨと表記する）と１本の軽鎖可変領域（以下、ＶＬと表記する）とを適当なペプチドリンカー（以下、Ｌと表記する）を用いて連結した、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ又はＶＬ－Ｌ－ＶＨと表すことができる構造を有する、抗原結合活性を有する抗体断片である。
　本発明に包含されるｓｃＦｖは、本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体のＶＨ及びＶＬをコードする核酸を基にして上記構造を有するｓｃＦｖをコードする核酸を構築し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
　本発明に包含されるダイアボディは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片であり、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は同一であっても、また互いに異なっていてもよい。ダイアボディについては例えば欧州特許第４０４，０９７号及び国際公報ＷＯ１９９３／１１１６１号パンフレットに詳細に記載されている。
　本発明に包含されるダイアボディは、本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体のＶＨ及びＶＬをコードする核酸を基にして、アミノ酸配列の長さが８残基以下であるペプチドリンカーＬを介してＶＨ及びＶＬが連結されたポリペプチドをコードする核酸を構築し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
　本発明に包含されるｄｓＦｖは、本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体のＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したシステイン含有ＨＶとシステイン含有ＬＶとを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換されるアミノ酸残基の決定は、Ｒｅｉｔｅｒら（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７：６９７－７０４，１９９４）の方法に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
　本発明に包含されるｄｓＦｖは、本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体のＶＨ及びＶＬをコードする核酸を基にして、上記Ｒｅｉｔｅｒらの方法によって特定されたアミノ酸残基がシステインに置換されたポリペプチドをコードする核酸を構築し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
　なお、本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体及びその機能的断片は、ヨウ素１２５などの放射性同位元素、核酸プローブや蛍光標識物質などの低分子化合物、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー及びヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどの高分子薬剤又はタンパク質などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合又はコンジュゲートさせた標識化抗体又は誘導体とすることができ、これらはいずれも本発明に含まれる。抗体又はその機能的断片に結合させることのできる化学物質やその結合は、当業者に周知の方法（例として抗体工学入門、金光修著、地人書館、１９９４に記載された方法)を使用することができる。
　また、本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体は、公知の方法によってグリコシル化して用いてもよい。抗体をグリコシル化する方法は、例えばＪｅｆｆｅｒｉｓら（Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７年、第６５巻、ｐｐ．１１１－１２８）又はＷｒｉｇｈｔら（ＴｉｂＴＥＣＨ、１９９７年、第１５巻、ｐｐ．２６－３２）などに記載されており、本発明の抗体又はその機能的断片に対してもかかる方法を適用することができる。
　なお、グリコシル化する方法によって、本発明のモノクローナル抗体のグリコシル化パターンが変更された抗体、具体的には元の抗体における１以上の糖鎖が除去された、１以上の糖鎖を新たに加えられた、又は糖鎖の組成が変更された抗体を作製することができる。本発明は、抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体である限り、かかるグリコシル化抗体も含む。
　さらに本発明は、前記クローン４６－１５－２３及び１００－１１の各ＣＤＲのアミノ酸配列の１又は複数を含むポリペプチドを、抗ＤＲ６アンタゴニストとして含む。各ＣＤＲは直接又は適当なペプチドリンカーを介して互いに結合させてもよい。かかるポリペプチドは、各ＣＤＲのアミノ酸配列の１つ又は２以上をコードする核酸を構築し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。また本発明のＣＤＲを含むポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）などの当業者に周知の化学合成法によって製造することができる。
２－ｂ）アンタゴニストであるＳｄｃ１変異体
　ＤＲ６アンタゴニストの実施態様の別の例は、ＤＲ６に特異的に結合するが、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導することができないＳｄｃ１変異体である。具体的には、配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列の４５番目及び４７番目のアミノ酸を除く１若しくは複数のアミノ酸が欠失された及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、並びに／又は配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＲ６との特異的結合能を有するがＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導することができないポリペプチド（以下、Ｓｄｃ１不活化変異体とする）である、免疫制御剤である。
２－ｃ）アンタゴニストである可溶化Ｓｄｃ１変異体
　ＤＲ６アンタゴニストの実施態様の別の例は、ＤＲ６に特異的に結合するが、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導することができない可溶化Ｓｄｃ１変異体である。具体的には、配列番号１０若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列の４５番目及び４７番目のアミノ酸を除く１若しくは複数のアミノ酸が欠失された及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、並びに／又は配列番号１０若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＲ６との特異的結合能を有するがＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導することができないポリペプチド（以下、可溶化Ｓｄｃ１不活化変異体とする）である、免疫制御剤である。
３．Ｓｄｃ１との結合能を有する免疫制御剤
　本発明の一実施態様では、Ｓｄｃ１又はその細胞外ドメインからなるポリペプチドに対する結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の抑制能を有する生理活性物質を有効成分とする免疫制御剤が提供される。
　ＤＲ６を発現している細胞において、Ｓｄｃ１がＤＲ６に結合すると、Ｔ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達が生じる。そのため、Ｓｄｃ１に結合することでＳｄｃ１とＤＲ６との結合を妨げることができる物質は、ＤＲ６発現細胞におけるＴ細胞活性化抑制を解き、Ｔ細胞の活性化を促すことができると期待される。
　Ｓｄｃ１に結合することでＳｄｃ１とＤＲ６との結合を妨げることができる物質の例は、Ｓｄｃ１、特にＳｄｃ１の細胞外ドメインに対する抗Ｓｄｃ１抗体である。抗Ｓｄｃ１抗体はすでに市販されており、これらはいずれも本発明の免疫制御剤として利用することができる。また、当業者に周知の方法に従って新たに抗Ｓｄｃ１抗体を調製し、本発明の免疫制御剤として利用してもよい。さらにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ｄｓＦｖ及びＣＤＲを含むペプチドなどに相当する各種機能的断片も、抗Ｓｄｃ１抗体から調製することができ、これらも本発明の免疫制御剤として利用することができる。
　Ｓｄｃ１に結合することでＳｄｃ１とＤＲ６との結合を妨げることができる物質の別の例は、ＤＲ６の可溶性細胞外ドメインからなるタンパク質及び／又はその変異体である。ＤＲ６の細胞外ドメイン配列からなる可溶化ＤＲ６が天然に存在していることはすでに知られている。この可溶化型ＤＲ６はＳｄｃ１との結合能を保持している一方、細胞質デスドメインを欠いているので、細胞に対してＴ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達を開始させることはできない。かかる天然に存在する可溶化型ＤＲ６はＳｄｃ１に結合することでＳｄｃ１とＤＲ６との結合を妨げることができる物質であり、本発明の免疫制御剤として利用することができる。
　かかる天然に存在する可溶化ＤＲ６は、ＤＲ６をコードする核酸から遺伝子組み換え手法によって作製することができ、その際に前述のアミノ酸の「保存的置換」、アミノ酸ギャップの欠失又は付加、Ｎ末端及び／又はＣ末端側へのアミノ酸残基の付加などの変異を、Ｓｄｃ１との結合能を失わずに行うことができる。この様な可溶化ＤＲ６の変異体も、本発明の免疫制御剤として利用することができる。
　可溶化ＤＲ６変異体は、配列番号１又は配列番号３に示されたアミノ酸配列をコードする核酸に対して所望の変異を導入する方法を含む一般的な遺伝子組み換え手法を適用することで、リコンビナントタンパク質として製造することができる。外来タンパク質の発現、及び所望の変異を導入する方法を含む一般的な遺伝子組み換え手法としては、前記Ｓａｍｂｒｏｏｋら又はその他の当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用される方法論を挙げることができる。
　なお、後述する実施例１０において、ＤＲ６の細胞外ドメインに存在する４つのＣＲＤのうちＣＲＤ１を欠損させると、Ｓｄｃ１との結合能が増加することが明らかになった。したがって、ＣＲＤ１を欠損した可溶化ＤＲ６変異体は、本発明の免疫制御剤の好ましい一態様である。
４．ハイブリドーマ
　本発明は、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７２９として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン２５－１、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３０として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１７７－１、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３１として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン８２－３０、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３２として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１８６－１８、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３３として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１８０－１０、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３４として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン４６－１５－２３、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３５として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１００－１１、及びそれらハイブリドーマ細胞株が産生するモノクローナル抗体が認識し結合するエピトープと同じエピトープを認識し結合することができる抗体を提供するハイブリドーマを含む。
５．核酸
　本発明の別の態様は、上述のＤＲ６アンタゴニスト又はＤＲ６アゴニストであるポリペプチドをコードする単離された核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、該核酸を含む発現ベクター、該核酸又は該ベクターを含む宿主細胞を提供する。これら核酸は、タンパク質をコードする塩基配列がその転写発現を調節する任意の機能性塩基配列、例えばプロモータ配列、オペレータ配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーなどと連結し、「遺伝子」を形成していてもよい。
　さらに本発明は上記核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなる核酸も包含する。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェント条件は温度、イオン濃度などの条件を考慮して当業者が適宜決定することができるが、概ねハイブリダイゼーション後に５０℃の６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄ’ｓ、０．１％ＳＤＳ、２５℃ないし６８℃中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムを含む）のサザンハイブリダイゼーションでハイブリダイズする程度であればよい。
６．スクリーニング方法
　本発明のある実施態様では、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の制御能を有する免疫制御剤をスクリーニングする方法が提供される。具体的には、下記ａ）～ｅ）の工程を含む、ＤＲ６とＳｄｃ１との結合によるシグナル伝達の制御能を有する生理活性物質をスクリーニングする方法が提供される。
　ａ）ＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と、（３）に規定されるポリペプチドの少なくとも一つと被検物質とを共存させる工程、
　ｂ）工程ａ）におけるＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と（３）に規定されるポリペプチドの少なくとも一つとの特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を検出する工程、
　ｃ）被検物質の非存在下でＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と（３）に規定されるポリペプチドの少なくとも一つとを共存させる工程、
　ｄ）工程ｃ）におけるＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と（３）に規定されるポリペプチドの少なくとも一つとの特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を検出する工程、及び
　ｅ）工程ｂ）の検出結果と工程ｄ）の検出結果とを比較する工程。
　ここにいうＤＲ６の機能的等価物とは、ＤＲ６の機能を保持した変異体、Ｓｄｃ１との結合能を有するＤＲ６の細胞外ドメイン、該細胞外ドメインの機能を保持した変異体又はこれらを含むポリペプチドをいう。またＳｄｃ１の機能的等価物とは、ＤＲ６との結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導する機能を有する物質であり、具体的にはＤＲ６に対してアゴニスト作用を有する前記Ｓｄｃ１変異体、可溶化Ｓｄｃ１及び可溶化Ｓｄｃ１変異体をいう。
　ＤＲ６及びその機能的等価物並びにＳｄｃ１及びその機能的等価物は、天然に存在するものを単離精製して用いてもよいが、遺伝子クローニング、遺伝子増幅、発現ベクターへの組み込み、宿主細胞への核酸又は発現ベクターへの導入、タンパク質の発現及び精製その他の作業を含むいわゆる遺伝子工学的方法によって調製した組換タンパク質の利用が好ましい。具体的には、ＤＲ６及びその機能的等価物については配列番号１又は配列番号３に示された塩基配列からなる核酸に対して、またＳｄｃ１及びその機能的等価物については配列番号５又は配列番号７に示された塩基配列からなる核酸に対して、遺伝子工学的方法を適用して調製することができる組換タンパク質である。
　遺伝子工学的方法としては、当業者に公知又は周知の手法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９年、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）その他の、当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用されている手法を挙げることができる。また市販のキットや試薬を使用するときは、当該キットや試薬の製造者が定めたプロトコル及び／又はパラメータに従うことが好ましい。
　ＤＲ６及びその機能的等価物並びにＳｄｃ１及びその機能的等価物の調製において、特に好ましい発現ベクター、宿主細胞、精製方法はｐｃＤＮＡ３、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ヒトＩｇＧのＦｃ領域、或はヒスチジンタグ等付加されたタグに対するアフィニティーカラム精製などである。
　本発明のスクリーニング方法は、天然のＴ細胞上に発現しているＤＲ６、又はＤＲ６若しくはその機能的等価物をコードする核酸を用いて形質転換された宿主細胞上に発現している組換えＤＲ６若しくはその機能的等価物を用いて実施されることが好ましい。特に、Ｔ細胞を宿主細胞とした前記組換えＤＲ６又はその機能的等価物を用いて実施されることが好ましい。かかるＴ細胞を用いることにより、Ｔ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達の誘導又は抑制を、当該Ｔ細胞のＩＬ２産生量でモニターすることができる。
　また、ＤＲ６を発現している天然のＴ細胞、又はＤＲ６若しくはその機能的等価物をコードする核酸を用いて形質転換された宿主細胞上に発現している組換えＤＲ６若しくはその機能的等価物を用いて実施される本発明のスクリーニング方法において、Ｔ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達に関与するＤＲ６以外の細胞内分子（膜タンパク質を含む）の機能、活性、形態、化学構造などの変化を測定することで、本発明にいうシグナル伝達をモニターしてもよい。この様な細胞内分子としては、ＮＦκＢ、ＮＦＡＴ、Ｆａｓ、ＦａｓＬを挙げることができる。これらの細胞内分子はいずれも既知分子であり、各特異抗体等を用いたイムノアッセイその他の当該細胞内分子の検出方法は当業者に知られている。
　さらに、Ｔ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達を受けて適当なレポータータンパク質の発現が誘導される又は抑制されるように予め改変した宿主細胞を用い、ＩＬ２産生量に代えて当該レポータータンパク質の挙動を測定することで本発明にいうシグナル伝達をモニターしてもよい。
　さらには、ＤＲ６の膜貫通領域及び細胞内デスドメインを他の膜貫通タンパク質の膜貫通領域及び細胞内ドメインに置換したキメラタンパク質を使用することで、ＤＲ６とＳｄｃ１との結合で開始されるシグナル伝達を前記キメラタンパク質の細胞内ドメインの機能変化として、又は細胞内ドメインからシグナルを受けた他の細胞内分子機能、活性、形態、化学構造などの変化を測定することで、本発明にいうシグナル伝達をモニターしてもよい。この様なキメラタンパク質も本発明におけるＤＲ６変異体に包含される。
　本発明のスクリーニング方法の実施態様の一つは、ＤＲ６又はその機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物との結合により開始されるシグナル伝達を検出することができる条件下で、ＤＲ６又はその機能的等価物及びＳｄｃ１又はその機能的等価物と被検物質とを共存させる工程を含む。本実施態様の好ましい例としては、天然のＴ細胞上に発現しているＤＲ６、又はＤＲ６若しくはその機能的等価物をコードする核酸を用いて形質転換された宿主細胞上に発現している組換えＤＲ６若しくはその機能的等価物及びＳｄｃ１又はその機能的等価物と被検物質とを共存させる工程、及び前記天然のＴ細胞又は宿主細胞におけるシグナル伝達を検出する工程を含むスクリーニング方法である。
　この実施態様のスクリーニング方法を実施することにより、ＤＲ６又はその機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物との結合に直接的に関与する物質だけでなく、ＤＲ６又はその機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物との結合には関与せずに当該結合によるシグナル伝達を制御することができる物質を選択することが可能になる。
　本発明のスクリーニング方法の別の実施態様は、ＤＲ６又はその機能的等価物及びＳｄｃ１又はその機能的等価物と被検物質と共存させ、ＤＲ６又はその機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物との結合を阻害する又は抑制することができる被検物質を選別し、しかる後に当該選別された被検物質についてさらにＤＲ６又はその機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物との結合により開始されるシグナル伝達を検出する工程を含む。
　本実施形態の好ましい例としては、ＤＲ６の機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物、好ましくは可溶化Ｓｄｃ１又は可溶化Ｓｄｃ１変異体と被検物質とを共存させる工程、ＤＲ６の機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物との結合を阻害する又は抑制することができる被検物質を選別する工程、及び天然のＴ細胞上に発現しているＤＲ６又はＤＲ６若しくはその機能的等価物をコードする核酸を用いて形質転換された宿主細胞上に発現している組換えＤＲ６若しくはその機能的等価物と選別された被検物質とを共存させ、前記天然のＴ細胞又は宿主細胞におけるシグナル伝達を検出する工程を含むスクリーニング方法である。特に可溶化ＤＲ６及び可溶化Ｓｄｃ１又は可溶化Ｓｄｃ１変異体と被検物質とを共存させる工程を含む方法が好ましい。
　この実施態様のスクリーニング方法を実施することにより、ＤＲ６又はその機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物との結合に直接的に関与する物質をより効率的に選択することが可能になる。
　なお、本発明のスクリーニング方法において、ＤＲ６若しくはその機能的等価物とＳｄｃ１若しくはその機能的等価物との結合又はこれらと被検物質との結合は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、プルダウンアッセイその他の生化学的手法により検出することができる。また、ＩＡｓｙｓ解析、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）センサーチップ解析、マイクロアレイ解析又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などを用いて前記結合を検出してもよい。この場合において、ＤＲ６若しくはその機能的等価物又はＳｄｃ１若しくはその機能的等価物は適当なマトリックス上に固定化され使用されることが好ましい。これら手法はいずれも当業者に広く知られており、当業者の通常の実施能力の範囲内で本発明に適用することができる。
７．治療方法
　本発明の実施態様はまた、対象における免疫疾患を予防又は治療する方法を提供し、具体的には、哺乳動物に有効量の本発明の免疫制御剤を投与することを含む。
　本明細書中で用いられる「対象」は哺乳動物であり、その例としてはヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコ等を挙げることができるが、本発明は特にヒトを対象とする。
本明細書中で用いられる「有効量」とは、治療対象である疾患又は症状を予防、治癒又は寛解するのに効果的な免疫制御剤の量を意味する。かかる有効量は疾患の種類、症状の重症度、患者その他の医学的要因によって適宜調節される。
本発明の治療方法の実施形態の一つは、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導することのできる前述の免疫制御剤の有効量を投与することで、哺乳動物の過剰な又は異常な免疫応答による疾患を予防又は治療する方法に関する。
　本実施形態の治療方法の対象となる疾患としては、リュウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、移植病、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群等の自己免疫疾患、花粉症、アトピー、重症薬疹などのアレルギー疾患を挙げることができる。
　本発明の治療方法の別の実施態様は、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を抑制することのできる前述の免疫制御剤の有効量を投与することで、哺乳動物における免疫機能の増強が望まれる疾患を予防又は治療する方法に関する。
　本実施形態の治療方法の対象となる疾患としては、細菌、真菌その他の外来生物による感染症、悪性新生物を挙げることができる。また、本発明の免疫制御剤をワクチンアジュバントとしても利用することも、本実施形態に含まれる。
　本発明の治療方法では、免疫制御剤は、薬学的に許容される賦形剤、担体その他の成分を含む医薬組成物又は製剤の形態で投与されることが好ましい。かかる医薬組成物又は製剤の形態にある免疫制御剤も、本発明の免疫制御剤の一態様である。
薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十六改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。また、治療対象となる疾患に応じて、本発明の免疫制御剤とその他の医薬とを併用して使用してもよい。
８．診断方法
本発明は、対象から採取された試料中のＤＲ６及び／又はＳｄｃ１の存在又は含有量について試料を試験する工程を含む、過剰な又は異常な免疫応答による疾患又は免疫機能の低下による疾患を有するか又はかかる疾患が疑われる対象を診断する方法を提供する。
　本発明の診断方法の対象となる疾患としては、リュウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の自己免疫疾患、花粉症、アトピー、重症薬疹などのアレルギー疾患を挙げることができる。
本発明の診断方法の好ましい実施態様は、本明細書に開示された抗ＤＲ抗体及び／又は抗Ｓｄｃ１抗体を用いて前記ＤＲ６及び／又はＳｄｃ１の存在又は含有量について試験するイムノアッセイに関する。また本発明の診断方法の別の実施態様は、試料中のＤＲ６及び／又はＳｄｃ１の存在又は含有量を、それらをコードする核酸に基づいて試験する方法に関する。
前記イムノアッセイは、試料及び細胞株の組織免疫学的解析、インサイツハイブリダイゼーション、イムノブロット解析、ウエスタンブロット解析、及び組織アレイ解析を非限定的に含む当技術分野でよく知られた多くの手段によって実施することができる。また核酸ベースの診断は、ＲＴ-ＰＣＲを含む各種のＰＣＲ解析、ノーザンブロット解析、サザンブロット解析を非限定的に含む当技術分野でよく知られた多くの手段によって実施することができる。
　以下、非限定的な実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種や属、コンストラクト及び試薬に限定されるものではなく、これらは適宜変更することができるものであることは当業者に容易に理解されるものである。
　また、実施例を含む本明細書中に記載又は参照の技術及び手順は、例えば前出のＳａｍｂｒｏｏｋらその他の、当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用されている手法を用いて行われたものである。また市販のキットや試薬の使用を伴う手順は、特に明記しない限り、当該キットや試薬の製造者が定めたプロトコル及び／又はパラメータに従った。これら当分野の教科書やハンドブック、及び本明細書で引用されたすべての文献は、参照により本明細書中に組み込まれる。
＜実施例１＞
（１）ｍＳｄｃ１及びｈＳｄｃ１の発現ベクターの構築
　Ａ２０細胞より抽出されたｍＲＮＡを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号８に示されるマウスＳｄｃ１（ｍＳｄｃ１）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に相当するＤＮＡが増幅される様に設計したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅されたＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで開環させた発現ベクターｐＭＸｓＩＧに組み換え、ｐＭＸｓＩＧ／ｍＳｄｃ１を構築した。
　同様に、ヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞より抽出されたｍＲＮＡを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号６に示されるヒトＳｄｃ１（ｈＳｄｃ１）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に相当するＤＮＡが増幅される様に設計したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。この増幅ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで開環させた発現ベクターｐＭＸｓＩＧに組み換え、ｐＭＸｓＩＧ／ｈＳｄｃ１を構築した。
（２）形質転換及びＩＬ２産生量の測定
　ｐＭＸｓＩＧ／ｍＳｄｃ１又はｐＭＸｓＩＧ／ｈＳｄｃ１をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いたリポフェクション法により、Ｐｌａｔ－Ｅ細胞に導入し、レトロウイルスを作製した。得られたレトロウイルスと抗原ＯＶＡ３２３－３３９に反応性を示す抗原提示細胞としてのＡ２０細胞とを混合し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で４８時間培養することで、ｍＳｄｃ１又はｈＳｄｃ１を細胞上に発現している形質転換Ａ２０細胞を作製した。抗原ＯＶＡ３２３－３３９を含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で前記形質転換細胞とＤＯ１１．１０－Ｔ細胞とを３７℃で１６時間共培養した後、各培地中のＩＬ２産生量をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社製）によって測定した。
　図１１に示されるように、コントロール及び形質転換しなかったＡ２０細胞と比較して、ｍＳｄｃ１又はｈＳｄｃ１を発現しているＡ２０細胞におけるＩＬ２の産生量は１７０ｐｇ／ｍｌ以下に低下した。
＜実施例２＞
（１）リコンビナントＳｄｃ１の調製
　配列番号７に示されるｍＳｄｃ１をコードする遺伝子がクローニングされているｃＤＮＡベクターｐＭＸｓＩＧ／ｍＳｄｃ１を鋳型とし、ｍＳｄｃ１の細胞外ドメイン（配列番号８の２５１番目までのアミノ酸配列）をコードするＤＮＡ（配列番号１１）が増幅される様に設計し合成したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。
　増幅されたＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで開環させた発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ－ｈｉｓ＿ｖｅｒ．Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に、発現ベクターに予め組み込まれているＨｉｓ配列と組み込まれたｍＳｄｃ１細胞外ドメインの読み枠が合う様に組み込み、Ｃ末端にＨｉｓ配列が追加されたアミノ酸配列からなるタンパク質（ｍＳｄｃ１－Ｈｉｓ、配列番号８４）が増幅される様に、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍＳｄｃ１－ｈｉｓを構築した。これをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で７日間培養して、ｍＳｄｃ１－Ｈｉｓを培地中に分泌させ、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティーカラムを用いて精製した。
（２）ｍＳｄｃ１刺激のＣＤ３依存性ＩＬ２産生に対する影響
　３×１０４個のＤＯ１１．１０－Ｔ細胞を（１）で調製したｍＳｄｃ１－Ｈｉｓ（最終濃度１００ｎＭ）を含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で、抗ＣＤ３抗体が固定化された９６穴細胞培養用プレート上で１６時間培養した。培養上清中のＩＬ２をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定した。その結果を図１３に示す。
　抗ＣＤ３抗体刺激のみを与えたＤＯ１１．１０－Ｔ細胞（図中の抗ＣＤ３）が産生するＩＬ２量と比較して、ｍＳｄｃ１－Ｈｉｓを加えた同ハイブリドーマのＩＬ２産生量は約５０％低下することが観察された。なお、図中のｎｏｎは、ＤＯ１１．１０－Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体及びｍＳｄｃ１－Ｈｉｓを含まない条件下で培養した培地を対象にＩＬ２量を調べたネガティブコントロールである。
（３）ＤＲ６発現抑制の影響
　上記（２）の実験を、ＤＯ１１．１０－Ｔ細胞の代わりに、ＤＲ６をコードする遺伝子の異なる領域を標的とした２種類の特異的ｓｈＲＮＡ（ｍＤＲ６－３及びｍＤＲ６－４）を導入したＤＯ１１．１０－Ｔ細胞を用いて行った。図１４に示す結果の通り、ｓｈＲＮＡを導入したＤＯ１１．１０－Ｔ細胞において、ｍＳｄｃ１－ＨｉｓによるＩＬ２産生抑制は観察されなかった。
　以上から、ｍＳｄｃ１はＤＲ６を発現しているＴ細胞に対し、そのＩＬ２産生をＤＲ６の発現に依存して抑制する機能を有していることが確認された。
＜実施例３　Ｆａｓ及びＦａｓＬの発現変化＞
　実施例２における抗ＣＤ３抗体及びｍＳｄｃ１－Ｈｉｓにより刺激されたＤＯ１１．１０－Ｔ細胞において、刺激から６時間経過時のＦａｓ、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ６９、ＰＤ－１及びＣＤ３の各タンパク質の発現変動をフローサイトメトリー法により解析した。その結果を図１５に示す。図中、無色の波形は抗ＣＤ３抗体及びｍＳｄｃ１－Ｈｉｓの刺激を加えていないコントロール、グレーの波形は抗ＣＤ３抗体の刺激のみを受けたＤＯ１１．１０－Ｔ細胞、黒い波形は抗ＣＤ３抗体及びｍＳｄｃ１－Ｈｉｓの刺激を受けたＤＯ１１．１０－Ｔ細胞を示す。
　図１５に示されるように、抗ＣＤ３抗体による刺激に依存して誘導されるＦａｓ及びＦａｓＬの発現が、ｍＳｄｃ１の刺激によって抑制されることが観察された。このＦａｓ又はＦａｓＬの発現量の変動によって、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合により誘導されるシグナル伝達をモニターすることができることが示された。
＜実施例４　転写因子の挙動変化＞
　５’端側にＸｈｏＩ制限酵素認識配列、３’端側にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識配列を付加する様に合成されたＮＦκＢ、ＣＲＥＢ、又はＩＳＲＥ応答配列をコードするＤＮＡ断片を、ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素処理により開環されたホタルルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれたｐＧＬ４．２６（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に組み込み、ＮＦκＢ、ＣＲＥＢ及びＩＳＲＥ応答レポータープラスミドを作製した。ＮＦＡＴ活性測定用には市販のＮＦＡＴ応答配列の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれたレポータープラスミド（ｐＧＬ４．３０［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦＡＴ－ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた。
　上記レポータープラスミドを導入したＤＯ１１．１０－Ｔ細胞に抗ＣＤ３抗体による刺激、又は抗ＣＤ３抗体及びｍＳｄｃ１－Ｈｉｓによる刺激をそれぞれ加え、刺激から６時間経過時のＮＦＡＴ、ＮＦκＢ、ＣＲＥＢ及びＩＳＲＥの各転写因子タンパク質の活性を、レポータータンパク質であるルシフェラーゼの活性の変化によりモニターした。その結果を図１６に示す。
　図１６に示されるように、ｍＳｄｃ１による刺激はＮＦＡＴ及びＮＦκＢの活性を強く抑制することが観察された。このＮＦＡＴ又はＮＦκＢの活性の変動によって、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合により誘導されるシグナル伝達をモニターすることができることが示された。
＜実施例５　モノクローナル抗体の作製＞
（１）ハイブリドーマの作製
　可溶型組換えｍＤＲ６であるｍＤＲ６－ｈＦｃｍを孔径０．４５ｍｍのフィルター（ミリポア社）に通した後、常法に従ってアジュバントを注射したウィスターラットに３回腹腔内注射（０．２ｍｇ／回）することにより免疫を行った。その後、常法に従って、免疫したラットから脾臓細胞を採取し、５０％ポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と融合させてハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマは、常法に従って、ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％（ｗ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びＨＡＴ溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、コロニーが確認できるまで約１０日間培養した。
　以上の操作により、抗ＤＲ６抗体を産生するハイブリドーマとしてクローン２５－１、クローン２５－２、クローン２５－３、クローン１７７－１、クローン８２－３０、クローン１８６－１８、クローン１８０－１０、クローン４６－１５－２３及びクローン１００－１１を得た。クローン２５－２及びクローン２５－３を除くこれらハイブリドーマは常法に従って凍結乾燥され、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに寄託された。
（２）ＣＤＲ解析
　ＳＭＡＲＴｃＤＮＡライブラリー作製キット（タカラバイオ株式会社製）を用いて、（１）で選択されたハイブリドーマのＣＤＲ配列を解析した。具体的には、各ハイブリドーマから全ＲＮＡを抽出し、これを鋳型として３’末端側ＩｇＧ１重鎖特異的プライマー、ＩｇＧ２ａ重鎖特異的プライマー又はκ軽鎖特異的プライマーを用いてｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマーとしてキットに添付の５’末端側特異的プライマーを、リバースプライマーとして３’末端側ＩｇＧ１重鎖特異的プライマー、ＩｇＧ２ａ重鎖特異的プライマー又はκ軽鎖特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅されたＤＮＡ断片の核酸配列をＤＮＡシーケンサーを用いて解析し、得られた配列情報をＩｇＢＬＡＳＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）上で検索した。その結果、（１）で作製されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、いずれも新規なＣＤＲ配列の組み合わせを有することが確認された。クローン２５－１、１７７－１、８２－３０、１８６－１８、１８０－１０、４６－１５－２３及び１００－１１それぞれの重鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を表１に、軽鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（３）ｈＤＲ６及びｍＤＲ６に対する結合親和性
　配列番号１に示されるｈＤＲ６をコードする遺伝子を、ヒトＴリンパ腫細胞由来Ｊｕｒｋａｔ細胞より抽出したＲＮＡを元に作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、その推定シグナル配列から膜貫通ドメインを含むアミノ酸１－３７１領域をコードするＤＮＡが増幅される様に設計したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。同様に、配列番号３に示されるｍＤＲ６をコードする遺伝子を、ＤＯ１１．１０－Ｔ細胞より抽出したＲＮＡを元に作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、その推定シグナル配列から膜貫通ドメインを含むアミノ酸１－３７１領域をコードするＤＮＡが増幅される様に設計したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。プライマーは増幅されたＤＮＡの一端に制限酵素サイトＢａｍＨＩが、他端に制限酵素サイトＥｃｏＲＩが導入されるように設計された。
　２種類の増幅断片をそれぞれ制限酵素で処理し、同じ制限酵素で開環させたレトロウイルスベクターｐＭＸｓＩＧに組み換えて、ｈＤＲ６をコードする発現プラスミドｐＭＸｓＩＧ及びｍＤＲ６をコードする発現プラスミドｐＭＸｓＩＧを作製した。これらプラスミドをＰＬＡＴ－Ｅ細胞を用いてパッケージングし、ウイルス粒子を作製した。このウイルス粒子をマウスＬ９２９細胞に感染させ、ｈＤＲ６又はｍＤＲ６を発現している２種類の形質転換Ｌ９２９細胞を得た。
　この２種類の形質転換Ｌ９２９細胞及び親株であるＬ９２９細胞を、非特異的ラットＩｇＧ（ｒａｔＩｇＧ）、クローン２５－１、クローン２５－３、クローン１００－１１及びクローン１７７－１が産生するモノクローナル抗体をそれぞれ含む培地中で４℃、１時間インキュベートした後、２回の洗浄操作を行い、標識抗ラットＩｇＧ抗体を含む培地中で４℃、１時間再度インキュベートし、２回の洗浄操作の後にフローサイトメトリーを用いて各抗体の結合強度を測定した。その結果を図１７に示す。
　本実験で使用したモノクローナル抗体はいずれもｍＤＲ６に対して反応性を示すとともに、ｈＤＲ６に対しても交差反応を示した。
＜実施例６　抗ＤＲ６アゴニスト抗体のスクリーニング＞
　Ｊｕｒｋａｔ細胞より抽出したＲＮＡを元に作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ヒトＣＤ４０（ｈＣＤ４０）の膜貫通領域及び細胞内ドメインをコードするＤＮＡが増幅されるように設計したＥｃｏＲＩ認識配列を付加したフォワードプライマー及びＮｏｔＩ認識配列を付加したリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。同様に、ｍＤＲ６の細胞外ドメインをコードするＤＮＡが増幅されるように設計したＥｃｏＲＩ認識配列を付加したフォワードプライマー及びＥｃｏＲＩ認識配列を付加したリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。
　２種類の増幅断片を上記２種類の制限酵素で処理し、同じ制限酵素で開環させた発現ベクターｐＴｒａｃｅｒ－ＳＶ４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組み換えて、ｍＤＲ６の細胞外ドメインとｈＣＤ４０の膜貫通領域及び細胞内ドメインとからなるキメラタンパク質をコードする発現プラスミドｐｍＤＲ６－ｈＣＤ４０を作製した。このｐｍＤＲ６－ｈＣＤ４０をＮＦκＢ活性化依存性ホタルルシフェラーゼ発現レポータープラスミドと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入して、細胞表面にｍＤＲ６の細胞外ドメインが露出するようにキメラタンパク質が配置されている形質転換ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を得た。この形質転換ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＤＲ６の細胞外ドメインにリガンドであるＳｄｃ１或はアゴニスティック抗ＤＲ６抗体が結合することで開始されるシグナル伝達を、リポータータンパク質であるホタルルシフェラーゼの活性変化によってモニターすることができるように改変された細胞である。
　上記形質転換ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、クローン２５－１、クローン２５－２、クローン２５－３、クローン１００－１１及びクローン１７７－１が産生するモノクローナル抗体を３０μｇ／ｍＬ又は０．３μｇ／ｍＬとなるように固相化した９６穴細胞培養プレートに播種し、３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベート後の形質転換ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のレポータータンパク質活性をＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ　ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。その結果を図１８に示す。
　その結果、クローン２５－１の産生するモノクローナル抗体がＤＲ６を介したシグナル伝達を顕著に誘導することのできる、抗ＤＲ６アゴニスト抗体であることが示された。また、ｐｍＤＲ６－ｈＣＤ４０のｍＤＲ６をｈＤＲ６に置き換えて、ｈＤＲ６の細胞外ドメインとｈＣＤ４０の膜貫通領域及び細胞内ドメインとからなるキメラタンパク質をコードする発現プラスミドｐｈＤＲ６－ｈＣＤ４０を作製し、上記と同様の実験を行ったところ、このキメラタンパク質も同様の挙動を示すことが確認された。
＜実施例７　モノクローナル抗体２５－１のＩＬ２産生抑制効果＞
　ｍＳｄｃ１－Ｈｉｓをモノクローナル抗体２５－１に置き換えた他は条件を実施例２の（２）と同一にして、ＤＯ１１．１０－Ｔ細胞／ＲＰＭＩ１６４０培地のＣＤ３依存性ＩＬ２産生に対するモノクローナル抗体２５－１の影響を測定した。ｍＳｄｃ１－Ｈｉｓを非特異的ラットＩｇＧに置き換えた実験をコントロールとした。その結果を図１９に示す。
　図１９に示されるように、モノクローナル抗体２５－１は容量依存的にＤＯ１１．１０－Ｔ細胞のＩＬ２産生を抑制した。
＜実施例８　抗ＤＲ６抗体の評価＞
　ＤＯ１１．１０－Ｔ細胞とＯＶＡペプチドによりパルスしたＡ２０細胞との共培養系に、抗ｍＤＲ６抗体産生ハイブリドーマの培養上清（１００μＬ）あるいは精製抗体（１００μｇ／ｍＬ）を添加した。添加後４８時間の培養上清に含まれるＩＬ２をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果を図２０に示す。
　この実験結果から、クローン２５－１、クローン１７７－１、クローン８２－３０、クローン１８６－１８及びクローン１８０－１０が抗ＤＲ６アゴニスト抗体であり、クローン４６－１５－２３及びクローン１００－１１が抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体であることが確認された。
＜実施例９　全身性エリテマトーデスモデル動物におけるＳｄｃ１発現＞
　正常Ｂ６マウス及び、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のモデルマウスとして知られているＮＺＢ／ＷＦ１マウス（日本ＳＬＣ社より入手）から、４月齢（ＳＬＥ発症前）、６月齢（ＳＬＥ発症前期）及び８月齢（ＳＬＥ発症後期）の各時点で血清を採取し、抗ｍＳｄｃ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いて血清に含まれる可溶化ｍＳｄｃ１を免疫沈降させた。各沈降物に含まれるｍＳｄｃ１を抗ｍＳｄｃ１抗体で、ｍＳｄｃ１に結合している糖鎖を糖鎖特異的抗体である抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４（生化学工業社製）でそれぞれ検出した。その結果を図２１に示す。
　図２１に示される様に、正常マウス又はＳＬＥ発症前のＮＺＢ／ＷＦ１マウスと比較して、ＳＬＥ発症前期及び後期において、糖鎖修飾された可溶化ｍＳｄｃ１の含有量が増加している事が示された。したがって、血清中の可溶化Ｓｄｃ１の含有量は、ＳＬＥの進行をモニターすることのできるバイオマーカーとして利用可能である。
＜実施例１０　可溶化ＤＲ６変異体の構築＞
（１）システインリッチドメイン（ＣＲＤ）を欠失させた可溶化ｍＤＲ６の調製
　配列番号８８に示されるｍＤＲ６の細胞外領域とヒトＩｇＧのＦｃ領域とからなる可溶型組換えｍＤＲ６（ｍＤＲ６－ｈＦｃｍ）をコードする遺伝子がクローニングされているｐｃＤＮＡ／ｍＤＲ６－ｈＦｃｍを鋳型として、ＣＲＤ１（配列番号８８の６６番目～１０５番目のアミノ酸）を欠いたｍＤＲ６の細胞外ドメイン改変体（そのアミノ酸配列は配列番号９０に示される）をコードするＤＮＡ（配列番号８９）が増幅される様に設計し合成したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐｃＤＮＡ３／ｍＤＲ６－ｈＦｃｍ　ｄｅｌｔａＣＲＤ１を得た。
　ｐｃＤＮＡ３／ｍＤＲ６―ｈＦｃｍ　ｄｅｌｔａＣＲＤ１をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で７日間培養して、ｍＤＲ６―ｈＦｃｍ　ｄｅｌｔａＣＲＤ１を培地中に分泌させ、ｐｒｏｔｅｉｎＧ結合アガローズカラムを用いて精製した後、標識化した。
　ｍＳｄｃ１をコードする遺伝子（配列番号７）を発現可能に組み込んだ発現ベクター（ｐＭＸｓＩＧ／ｍＳｄｃ１)、及びコントロールベクター（ｐＭＸｓＩＧ）をＤＯ１１．１０－Ｔ細胞に導入して形質転換細胞を作製した。標識化ｍＤＲ６－ｈＦｃｍ及び標識化ｍＤＲ６―ｈＦｃｍ　ｄｅｌｔａＣＲＤ１に対する上記２種類の形質転換細胞の結合能を調べたところ、ｍＤＲ６―ｈＦｃｍ　ｄｅｌｔａＣＲＤ１の結合性がｍＤＲ６－ｈＦｃｍのそれの約２．５倍に増加していることが確認された（図２２）。
＜実施例１１　モデル動物における抗ＤＲ６抗体の治療効果＞
（１）ＳＬＥモデルマウス８匹を通常の飼育環境に置き、１５週齢から２７週齢までモノクローナル抗体２５－１を腹腔内投与（３００μｇ／頭／回／２日）しながら４４週齢まで飼育して、生存率及び蛋白尿症の発症率を測定した。尿蛋白はウロペーパー法により測定し、３００ｍｇ／ｄｌ以上の値を示す個体を陽性とした。また、モノクローナル抗体２５－１に代えてラットＩｇＧを腹腔内投与したＳＬＥモデルマウス８匹をコントロール群とした。その結果を図２３及び図２４に示す。
　図２３に示されるように、４４週齢の時点での生存率は、コントロール群が３７．５％であったのに対してモノクローナル抗体２５－１を投与した群は８７．５％であり、モノクローナル抗体２５－１投与によって生存率が改善することが確認された。
　また、図２４に示されるように、コントロール群と比較してモノクローナル抗体２５－１を投与した群において蛋白尿症の発症の有意な遅延が認められた。
＜実施例１２　抗ＤＲ６アゴニスト抗体の投与による免疫細胞の応答＞
　実施例１１と同条件で飼育した１０週齢（ＳＬＥ発症前）及び２４週齢（ＳＬＥ発症後）のＳＬＥモデルマウス及び同週齢の正常マウスからそれぞれ全脾臓細胞群を調製した。この細胞群におけるＴ細胞表面マーカー（ＣＤ３）、ＤＲ６、ヘルパーＴ細胞表面マーカー（ＣＤ４）及びキラーＴ細胞表面マーカー（ＣＤ８）の発現を、モノクローナル抗体２５－１、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体を用いたフローサイトメトリー法により解析した。その結果を図２５に示す。
　図２５のパネルＢに示されるように、ＳＬＥモデルマウスでは、１０週齢及び２４週齢いずれにおいてもモノクローナル抗体２５－１との結合親和性を示すＣＤ４陽性細胞、すなわちＤＲ６陽性ヘルパーＴ細胞の出現が観察された。またパネルＤに示されるように、ＳＬＥモデルマウスの２４週齢において、ＣＤ８陽性細胞全体におけるＤＲ６の発現量の増加が観察された。図２５のパネルＢ及びパネルＤで観察されたＤＲ６陽性細胞の存在率の増加（平均値）をグラフ化した図を図２６に示す。
　これらの結果は、ＳＬＥモデルマウスにおいて全身エリテマトーデスの進行につれてＤＲ６を発現している免疫細胞が増加することを示している。
＜実施例１３　抗ＤＲ６アゴニスト抗体の投与による免疫細胞の応答＞
　実施例１１と同条件で飼育した２４週齢のＳＬＥモデルマウスを、ラットＩｇＧ又はモノクローナル抗体２５－１を腹腔内投与（３００μｇ／頭／回／２日）しながらさらに２週間飼育した。投与終了後、各群のマウスから全脾臓細胞群を調製し、この細胞群におけるＤＲ６を発現しているＣＤ４陽性細胞（ヘルパーＴ細胞）の存在率を、試験例１と同様にフローサイトメトリー法により解析した。その結果（平均値）を図２７に示す（ｐ＜０．０５）。
　この試験により、蛋白尿症発症期のＳＬＥモデルマウスにモノクローナル抗体２５－１を投与することで、ＤＲ６を発現しているＣＤ４陽性細胞の存在率が低下することが確認された。
本発明の免疫制御剤は、これまでに知られていない作用機序に基づいた、すなわちＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を制御することのできる免疫制御剤として、哺乳動物の過剰な又は異常な免疫応答による疾患又は哺乳動物における免疫機能の増強が望まれる疾患の治療又は予防に利用することができる。
[規則26に基づく補充 11.12.2013]　
Figure WO-DOC-FIGURE-RO134-1

Figure WO-DOC-FIGURE-RO134-2

Claims (10)

  1. 　ＤＲ６に対する特異的結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の制御能を有する生理活性物質を有効成分とする免疫制御剤。
  2. 　生理活性物質がＳｄｃ１又はその機能的等価物である、請求項１に記載の免疫制御剤。
  3. 　生理活性物質が下記ａ）～ｄ）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項２に記載の免疫制御剤；
    　ａ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    　ｂ）配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列の４５番目及び４７番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失された及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、又は配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＲ６との特異的結合能を有するポリペプチド、
    　ｃ）配列番号１０又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、並びに
    　ｄ）配列番号１０若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列の４５番目及び４７番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失された及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、又は配列番号１０若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＲ６との特異的結合能を有するポリペプチド。
  4. 　生理活性物質がＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達に作用する抗ＤＲ６アゴニスト抗体又は抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体である、請求項１に記載の免疫制御剤。
  5. 　抗ＤＲ６アゴニスト抗体が下記ａ）～ｅ）よりなる群から選ばれる１又は複数の抗ＤＲ６抗体である、請求項４に記載の免疫制御剤；
    　ａ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、
    　ｂ）配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｙｒ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、
    　ｃ）配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号３８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号４０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号４２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、
    　ｄ）配列番号４４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号５０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、並びに
    　ｅ）配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号５６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号５８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体。
  6. 　抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体が下記ｆ）及びｇ）よりなる群から選ばれる１又は複数の抗ＤＲ６抗体である、請求項４に記載の免疫制御剤；
    　ｆ）配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号６６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号６８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号７０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＡｒｇ－Ｖａｌ－Ｓｅｒからなる軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、並びに
    　ｇ）配列番号７４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号７８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号８０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ－Ａｌａ－Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号８２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体。
  7. 　下記ａ）～ｅ）の工程を含む、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の制御能を有する生理活性物質をスクリーニングする方法。
    　ａ）ＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と、請求項３に規定されるポリペプチドの少なくとも一つと被検物質とを共存させる工程、
    　ｂ）工程ａ）におけるＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と請求項３に規定されるポリペプチドの少なくとも一つとの特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を検出する工程、
    　ｃ）被検物質の非存在下でＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と請求項３に規定されるポリペプチドの少なくとも一つとを共存させる工程、
    　ｄ）工程ｃ）におけるＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と請求項３に規定されるポリペプチドの少なくとも一つとの特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を検出する工程、及び
    　ｅ）工程ｂ）の検出結果と工程ｄ）の検出結果とを比較する工程。
  8. 　抗原提示細胞で発現しているＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質を使用する、請求項７に記載のスクリーニング方法。
  9. 　シグナル伝達の検出が、抗原提示細胞が産生するインターロイキン２の検出により行われる、請求項７又は請求項８に記載のスクリーニング方法。
  10. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７２９として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン２５－１、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３０として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１７７－１、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３１として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン８２－３０、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３２として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１８６－１８、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３３として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１８０－１０、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３４として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン４６－１５－２３及び受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１７３５として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１００－１１よりなる群から選ばれるハイブリドーマ細胞株。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
CN111040034B (zh) * 2018-10-12 2022-08-30 广东旋玉健康生物科技有限公司 一种抗人cd358的单克隆抗体及其用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0404097A2 (de) 1989-06-22 1990-12-27 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente Rezeptoren, ihre Herstellung und Verwendung
WO1993011161A1 (en) 1991-11-25 1993-06-10 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
JP2002504380A (ja) * 1998-02-27 2002-02-12 ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルベニア ワクチン、免疫療法剤およびそれらの使用法
JP2010514700A (ja) 2006-12-22 2010-05-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｄｒ６アンタゴニスト及び神経障害の治療におけるその使用法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040043022A1 (en) 2001-04-30 2004-03-04 Heuer Josef Georg Treating t-cell mediated diseases by modulating dr6 activity
FR2830107B1 (fr) 2001-09-24 2004-09-24 Gemplus Card Int Cle electronique destinee a etre connectee a un port d'un dispositif de telecommunication et procede de fabrication de la cle
ATE395379T1 (de) 2002-09-05 2008-05-15 Exxonmobil Chem Patents Inc Schrumpffolie
PT2242772E (pt) * 2007-12-26 2015-02-09 Biotest Ag Imunoconjugados dirigidos contra cd138 e as suas utilizações
WO2010062904A2 (en) * 2008-11-25 2010-06-03 Biogen Idec Ma Inc. Use of dr6 and p75 antagonists to promote survival of cells of the nervous system

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0404097A2 (de) 1989-06-22 1990-12-27 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente Rezeptoren, ihre Herstellung und Verwendung
WO1993011161A1 (en) 1991-11-25 1993-06-10 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
JP2002504380A (ja) * 1998-02-27 2002-02-12 ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルベニア ワクチン、免疫療法剤およびそれらの使用法
JP2010514700A (ja) 2006-12-22 2010-05-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｄｒ６アンタゴニスト及び神経障害の治療におけるその使用法

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEFFERIS ET AL., IMMUNOL., vol. 65, 1997, pages 111 - 128
JONES ET AL., NATURE, vol. 321, 1986, pages 522 - 525
LAMORTE ET AL.: "Syndecan-1 promotes the angiogenic phenotype of multiple myeloma endothelial cells", LEUKEMIA, vol. 26, no. 5, 2012, pages 1081 - 1090, XP055345594 *
MALI ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 265, 1990, pages 6884 - 6889
MI ET AL., NATURE MEDICINE, vol. 17, 2011, pages 816 - 821
NIKOLAEV ET AL., NATURE, vol. 457, 2009, pages 981 - 989
OSAMU KANEMITSU: "Introduction to Antibody Engineering", 1994, CHIJIN SHOKAN
PAN ET AL., FEBS LETT., vol. 431, 1998, pages 351 - 356
REITER ET AL., PROTEIN ENGINEERING, vol. 7, 1994, pages 697 - 704
RIECHMANN ET AL., NATURE, vol. 332, 1988, pages 323 - 327
SAMBROOK: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
SASAROLI ET AL.: "Novel surface targets and serum biomarkers from the ovarian cancer vasculature", CANCER BIOLOGY & THERAPY, vol. 12, no. 3, 2011, pages 169 - 180, XP055345597 *
SCHMIDT ET AL., J. IMMUNOL., vol. 175, 2005, pages 2286 - 2292
VENKATARAMAN ET AL., IMMUNOL. LETTER, vol. 106, 2006, pages 42 - 47
VERHOEYEN ET AL., SCIENCE, vol. 239, 1988, pages 1534 - 1536
WRIGHT ET AL., TIBTECH, vol. 15, 1997, pages 26 - 32
ZHAO ET AL., J. EXP. MED., vol. 194, 2001, pages 1441 - 1448

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