JP3585399B2 - 抗マウスｔｒａｉｌモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マウス等非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに特異的に結合する抗ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体、その製造方法及びかかるモノクローナル抗体を有効成分として含有するＴＲＡＩＬ機能解析用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ：以下「ＴＮＦ」という）は、ある種の癌細胞にアポトーシス（細胞死）を誘導するサイトカインの一種であり、疎水性ペプチドをＮ末端側に有するＩＩ型細胞膜貫通蛋白質として知られている。また、ＴＮＦとよく似た構造を有する細胞膜貫通蛋白質として、Ｆａｓ抗原のリガンド、Ｂ細胞表層抗原ＣＤ４０のリガンド、Ｔ細胞表層抗原ＣＤ２７やＣＤ３０のリガンドなどが存在し、これらはＴＮＦファミリーと呼ばれ、かかるＴＮＦファミリーに属する分子の受容体群はＴＮＦ受容体ファミリーと呼ばれている。
【０００３】
ＴＮＦファミリーの一員である腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ：以下「ＴＲＡＩＬ」という）は、ＴＮＦファミリー間における相同性に基づくデータベース検索によって、３０ｋＤａのＩＩ型細胞表面蛋白としてクローニングされ、またＴＲＡＩＬの細胞外領域は、ＴＮＦファミリー間においては、アポトーシス誘導分子の１つであるＦａｓリガンド（以下「ＦａｓＬ」という）に対して最も高い相同性を示し（アミノ酸レベルで２８％）、さらに、ＦａｓＬ同様、さまざまな腫瘍細胞にアポトーシスを誘導することが報告されている。
【０００４】
またこれまでに、ＴＲＡＩＬに対応するレセプターとして、少なくとも４分子、すなわちＴＲＡＩＬレセプター１（ＤＲ４ともいう）、ＴＲＡＩＬレセプター２（ＤＲ５、ＴＲＩＣＫ２あるいはｋｉｌｌｅｒともいう）、ＴＲＡＩＬレセプター３（ＴＲＩＤ、ＤｃＲ１あるいはＬＩＴともいう）及びＴＲＡＩＬレセプター４（ＴＲＵＮＤＤあるいはＤｃＲ２ともいう）が存在し、これらレセプターは、ＴＲＡＩＬに対してほぼ同程度の親和性を示すが、その機能や存在様式については異なることが明らかとなっている。例えば、ＴＲＡＩＬレセプター１及びＴＲＡＩＬレセプター２は細胞内領域にデスドメインと呼ばれるアポトーシスの誘導に必要とされる部位を有し、三量体ＴＲＡＩＬとこれらレセプター分子が結合すると、ＦａｓＬのレセプターであるＦａｓと同様に、カスパーゼと呼ばれる一連の蛋白質分解酵素群を介して細胞にアポトーシスを誘導する。
【０００５】
一方、ＴＲＡＩＬレセプター３は細胞内領域を完全に欠いており、細胞膜上の糖脂質（グリコホスファチジルイノシトール：ＧＰＩ）に結合することにより細胞表面上に存在すると考えられている。このＴＲＡＩＬレセプター３は、細胞内にアポトーシスシグナルを誘導することはできないが、ＴＲＡＩＬレセプター１やＴＲＡＩＬレセプター２とＴＲＡＩＬへの結合をめぐって拮抗的に作用することから、ＴＲＡＩＬの機能を抑制するものと考えられている。また、ＴＲＡＩＬはＦａｓＬとは異なり、腫瘍細胞のみに選択的にアポトーシスを誘導し、正常細胞に対しては無力であることが知られているが、ＴＲＡＩＬレセプター３のメッセンジャーＲＮＡの発現が正常細胞のみにおいて検出され、腫瘍細胞では認められないことから、正常細胞のＴＲＡＩＬに対する耐性の獲得にＴＲＡＩＬレセプター３が関与する可能性が示唆されている。
【０００６】
第４のレセプター分子であるＴＲＡＩＬレセプター４は、ＴＲＡＩＬレセプター１やＴＲＡＩＬレセプター２と同様、Ｉ型膜構造形態をとるもののデスドメインの大半を失っており、アポトーシスの誘導は不可能とされている。しかしながら、ＴＲＡＩＬレセプター４はＮＦ−κＢを介したアポトーシス抑制性のシグナルを誘導することが可能であることから、ＴＲＡＩＬレセプター１及びＴＲＡＩＬレセプター２からのアポトーシスシグナルに対して抑制的にはたらくものと考えられている。ＴＲＡＩＬのアポトーシス誘導作用に対する細胞側の感受性は、アポトーシスを誘導するレセプター（ＴＲＡＩＬレセプター１及びＴＲＡＩＬレセプター２）の発現とアポトーシスに対して抑制的にはたらくレセプター（ＴＲＡＩＬレセプター３及びＴＲＡＩＬレセプター４）の発現との絶対的及び相対的な差によって一義的に決定されると考えられている。しかしながら、細胞側のＴＲＡＩＬに対する耐性獲得の要因としてレセプターの発現以外にもＦＡＤＤ様インターロイキン１β変換酵素抑制蛋白質（ＦＬＩＰ：Ｆａｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ−ｌｉｋｅ ＩＬ−１β−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）等の細胞内でアポトーシスシグナルを抑制する分子の存在が関与する可能性も報告されており、これら細胞内外のさまざまな要因によりＴＲＡＩＬに対する感受性が決まると推測されている。
【０００７】
ＲＮＡレベルでのＴＲＡＩＬ及びＴＲＡＩＬレセプター１〜４の発現は多くの組織や細胞で認められるが、これら分子の蛋白質レベルでの発現や生理的機能についてはいまだ不明な点が多い。最近、本発明者らは、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞クローンが恒常的にＴＲＡＩＬを表出し、ヒト由来Ｔ細胞リンパ種Ｊｕｒｋａｔや不死化した角化細胞であるＨａＣａＴといった標的細胞をＴＲＡＩＬを介して破壊することを見い出した。また、トーマスらも同様にメラノーマに対するＣＤ４＋Ｔ細胞クローンがＴＲＡＩＬを介して標的細胞を破壊することを報告している。
【０００８】
上記のように、ＴＲＡＩＬとほかの標的細胞破壊機構がどのように使い分けられているかは、未だ不明な点が多く、また、ＴＲＡＩＬ発現が誘導するメカニズムは、まだ明らかとなっていない。さらに、最近、ＨＩＶに感染するとＴ細胞がＴＲＡＩＬに対して感受性を示すようになり、アポトーシスが誘導されやすくなることや、ＨＩＶ感染患者由来末梢血Ｔ細胞の抗ＣＤ３抗体刺激によるアポトーシス（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）にＴＲＡＩＬが関与することから、ＨＩＶ感染細胞の排除やＡＩＤＳ発症児におけるリンパ球減少などの病態形成にＴＲＡＩＬが関与する可能性が示唆されているものの、そのメカニズムの詳細は明らかになっていない。以上のことから、これらＴＲＡＩＬの発現誘導機構や標的細胞破壊機構以外のほかの生理的機能について、そのメカニズム解析に有用な試薬の存在が期待されていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
上記ＴＲＡＩＬの生理的役割及び病理的役割を解明するためには、細胞死を誘導する他のＴＮＦファミリーやＴＮＦレセプターファミリーと交差反応性を示さず、ＴＲＡＩＬと特異的に結合するモノクローナル抗体等の蛋白質が必要であり、また、生理的機能を有する分子の機能解析はインビボで実験可能なマウスやラット等の非ヒト動物を用いて行うことが必要である。抗ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体として、本発明者らは既に、ヒト由来のＴＲＡＩＬに結合する抗ヒトＴＲＡＩＬモノクローナル抗体について報告している（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２， ２６３９−， １９９９）が、抗ヒトＴＲＡＩＬモノクローナル抗体は、上記のように、マウス等を用いたインビボでの実験に実際に使用することができないという問題があった。
【００１０】
本発明の課題は、上記ＴＲＡＩＬの発現誘導機構や標的細胞破壊機構以外の他の生理的機能をインビトロ又はインビボで解析する際、ＦａｓやＴＮＦ等のＴＮＦファミリーやＴＮＦレセプターファミリーに対して交差反応せず、ＴＲＡＩＬに特異的に作用してその細胞障害活性を完全に阻害することができる抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナルラット抗体などの抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法や、かかる製造方法により得られる抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体や、かかるモノクローナル抗体を有効成分として含有し、簡便かつ精確にＴＲＡＩＬを検出することができるＴＲＡＩＬ機能解析用試薬を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を克服するために、マウス由来ＴＲＡＩＬのｃＤＮＡをトランスフェクションしたマウスＢリンパ腫２ＰＫ−３細胞を作製し、その２ＰＫ−３細胞で免疫したラットの脾細胞と、マウスミエローマとを融合することによってハイブリドーマを作製し、かかるハイブリドーマから、ＦａｓやＴＮＦと交差反応せず、特異的にマウス由来ＴＲＡＩＬに結合し、かつ、ＴＲＡＩＬの細胞障害活性を完全に阻害する抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体が産生されることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに対して特異的に反応し、非ヒト動物由来のＦａｓリガンドや非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子に対して交差反応せず、かつ、該非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの細胞障害活性を完全に阻害するモノクローナル抗体の製造方法であって、非ヒト動物由来ＴＲＡＩＬのｃＤＮＡを該非ヒト動物と同種の株化細胞にトランスフェクションして形質転換細胞を調製し、該形質転換細胞で免疫した異種の非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と同種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養することを特徴とする抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法（請求項１）や、非ヒト動物が齧歯類動物であることを特徴とする請求項１記載の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法（請求項２）や、齧歯類動物として、マウスとラットを用いることを特徴とする請求項２記載の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法（請求項３）や、株化細胞が、マウスＢリンパ腫２ＰＫ−３細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法（請求項４）に関する。
【００１３】
また本発明は、マウス由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに対して特異的に反応し、マウス由来のＦａｓリガンドやマウス由来の腫瘍壊死因子に対して交差反応せず、かつ、該マウス由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの細胞障害活性を完全に阻害することを特徴とする抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体（請求項５）に関する。
【００１４】
さらに本発明は、請求項５記載の抗マウス動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を有効成分として含有することを特徴とするＴＲＡＩＬ機能解析用試薬（請求項６）に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法は、非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに対して特異的に反応し、非ヒト動物由来のＦａｓリガンドや非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子に対して交差反応せず、かつ、該非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの細胞障害活性を完全に阻害するモノクローナル抗体の製造方法であって、非ヒト動物由来ＴＲＡＩＬのｃＤＮＡを非ヒト動物と同種の株化細胞にトランスフェクションした形質転換細胞を調製し、該形質転換細胞で免疫した異種の非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と同種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養することを特徴とする。非ヒト動物としては齧歯類動物が材料の入手性や取り扱い安さの点で好ましく、かかる齧歯類動物としてはマウスやラットを具体的に挙げることができる。以下、抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体として、抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナルラット抗体を例に挙げて説明する。
【００１６】
本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体としては、マウス由来ＴＲＡＩＬと特異的に結合し、マウスＦａｓＬやマウスＴＮＦに対して交差反応することなく、かつ、マウスＴＲＡＩＬの細胞障害活性を完全に阻害するモノクローナル抗体であればどのようなものでもよく、かかる抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体は、抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により培養することにより生産することができる。例えば、インビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。
【００１７】
抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、一般的にはマウスＴＲＡＩＬで免疫したラットの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを、常法により細胞融合させることにより作製することができる。このようにマウスＴＲＡＩＬを用いてラットを免疫するとその抗原性が増加する。また、実際のＴＲＡＩＬの機能解析の場合に必要とされるＴＲＡＩＬの細胞外領域をエピトープとして認識する抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることが好ましく、このため、マウスＴＲＡＩＬのｃＤＮＡをマウスの株化細胞、例えばＢリンパ腫２ＰＫ−３細胞にトランスフェクションし、安定発現する形質転換細胞を選択・調製し、該形質転換細胞でラットを常法により免疫し、免疫されたラットの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを、常法により細胞融合させ、ＨＡＴ培地で選択し、その中からＬ９２９細胞に対してＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞の細胞障害活性を抑制することができるものをスクリーンすることにより、抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的に例示することができる。
【００１８】
本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体は、前記のように、マウスＴＲＡＩＬに対して特異的に反応し、マウスＦａｓＬやマウスＴＮＦに対して交差反応せず、かつ、マウスＴＲＡＩＬの細胞障害活性を完全に阻害することを特徴とするが、ここでＴＲＡＩＬの細胞障害活性とは、標的腫瘍細胞を破壊するなど、標的細胞に何らかの病理的な変化をもたらす活性のことをいい、マウスＴＲＡＩＬの細胞障害活性を完全に阻害するとは、例えば、エフェクター細胞表面上に発現したＴＲＡＩＬの細胞障害活性により標的細胞がＴＲＡＩＬ特異的に受ける障害が実質的に阻害されることをいう。
【００１９】
本発明のＴＲＡＩＬ機能解析用試薬としては、抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を有効成分として含有するものであれば特に制限されるものでなく、例えば、抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものを具体的に例示することができる。かかるＴＲＡＩＬ機能解析用試薬を用いたＴＲＡＩＬの機能解析には通常の免疫学的測定方法を適用することができ、かかる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００２０】
【実施例】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
（マウスＴＲＡＩＬの調製）
６週齢の雄のＢ６（Ｃ５７ＢＬ／６）マウス（ＳＬＣ社製）をコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）により刺激した後、このマウスの脾細胞から全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡを含む抽出物を、文献（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３， ６７３−， １９９５）記載のマウスＴＲＡＩＬのｃＤＮＡ配列の５′末端側の６つのコドンからなるプライマーと、３′末端側の６つのコドンからなるプライマーとの２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＸｈｏＩとＮｏｔＩによるＲＴ−ＰＣＲ法を行い、マウスＴＲＡＩＬのｃＤＮＡ（８５０ｂｐ）を増幅し精製した。
【００２１】
（ＴＲＡＩＬ検出用標識ＤＲ５−Ｉｇの作製）
文献（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２， ２６３９−， １９９９、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４， ３９１４−， １９９７）記載の方法により、可溶化ＤＲ５−Ｉｇ（ＴＲＡＩＬレセプター２−免疫グロブリン）融合蛋白質を次のようにして作製した。マウスＴＲＡＩＬと結合するヒト由来のＤＲ５（ＴＲＡＩＬレセプター２）の細胞外領域（アミノ末端側の１番目から１８３番目のアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲ法で増幅させ、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとを使用して、ダイジェスションした。そのｃＤＮＡ（５５０ｂｐ）を、ヒトＩｇのＣγ１の遺伝子配列を持つｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩのＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩの部位に挿入し、その後、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩでダイジェスションすることによって、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分にＤＲ５の細胞外領域を有するＤＲ５−Ｉｇの融合体を得た。その融合体をＰＳＧ５発現ベクター（ストラタジーン社製）のＥｃｏＲＩからＮｏｔＩまでの部位に挿入し、ＣＯＳ７細胞にトランスフェクションした。１６時間後、無血清の培養培地に移して９６時間培養し、プロテインＧカラムにより精製した。このＤＲ５−Ｉｇをビオチン化し、続いて、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ：ＰＥ）で標識した抗ヒトＩｇＧ（ファーミンジェン社製）と結合させることによって標識化したＤＲ５−Ｉｇ複合体を作製した。
【００２２】
（マウス由来ＴＲＡＩＬのトランスフェクタントの作製）
上記マウスＴＲＡＩＬのｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）ベクターにサブクローンし、オートシークエンサー（アプライドバイオシステム社製）又は蛍光式オートシークエンサーを用いて、それらの塩基配列を確認した。確認後、東京医科歯科大学の丸山博士から提供されたｐＭＫＩＴＮｅｏ発現ベクターのＸｈｏＩからＮｏｔＩまでの部位に、マウスＴＲＡＩＬのｃＤＮＡを挿入した。このマウスＴＲＡＩＬ／ｐＭＫＩＴＮｅｏベクターを、ジーンパルサー（バイオラッド社製）を用いてエレクトポレーション法（２９０Ｖ，９６−９６０μＦ）により、ＲＰＭＩ１６４０培地（最終濃度で１０％のＦＣＳ、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンとペニシリン、及び２ｍＭのグルタミンを含む培地）であらかじめ培養しておいた２ＰＫ−３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ−２０３）に導入した。その後、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８に対して耐性のある細胞を選択し、続いて限界希釈法によりクローニングして、安定なマウスＴＲＡＩＬのトランスフェクタント、すなわち、ｍＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞を得た。この得られた細胞でマウス由来ＴＲＡＩＬが安定的に発現するかどうかを、以下の方法により確認した。
【００２３】
（ｍＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞でのマウスＴＲＡＩＬ発現の確認）
２ＰＫ−３細胞とマウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞をそれぞれ１μｇの上記標識化したＤＲ５−Ｉｇ複合体と共に４℃で１時間インキュベートして染色した。結果を図１（図１での実線）に示す。また、コントロールとして、ヒトＩｇＧとＰＥ標識抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を用いて同様にインキュベートして染色した（図１での点線）。これらの結果から、ＤＲ５−ＩｇによってマウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞のみ染色されることから、マウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞においてマウスＴＲＡＩＬが発現することが確認できた。また同様に、文献（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４， ３９１４−， １９９７）記載の方法で精製した抗マウスＦａｓＬモノクローナル抗体をＤＲ５−Ｉｇのかわりに用いた場合、マウスＦａｓＬ／２ＰＫ−３細胞を染色するが、マウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞を染色しないことがわかった。このことから、抗マウスＦａｓＬモノクローナル抗体は、マウスＴＲＡＩＬに対して交差反応を示さないことが確認できた。
【００２４】
（マウス腫瘍細胞の感受性）
インビトロにおいて、種々のヒト腫瘍細胞は、ＴＲＡＩＬ誘導の細胞障害に対して感受性であることが知られているが、マウス腫瘍細胞［マウス繊維肉腫Ｌ９２９（Ｈ−２ｋ）（日本キャンサーリサーチリソースバンク）、肥満細胞腫Ｐ８１５（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−６４）、黒色腫Ｂ１６、Ｔリンパ腫ＹＡＣ−１（Ｈ−２ｂ）（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１６０）］は、ＴＲＡＩＬ誘導の細胞障害に対して感受性を有するかどうかはほとんど知られていない。そこで、マウス由来ＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞とマウス由来ＦａｓＬ／２ＰＫ−３細胞の２種類のトランスフェクタントを用いて、ＴＲＡＩＬとＦａｓＬがそれぞれ誘導する細胞障害に対して、これらのマウス腫瘍細胞の感受性を以下のように測定した。
【００２５】
文献（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ４９３０−， １９９４）記載の方法により５１Ｃｒ遊離測定を以下のように行った。あらかじめ標的細胞として用いる腫瘍細胞を５１Ｃｒ含有ＲＰＭＩ１６４０で培養した。９６ウエルＵ底マイクロプレートに、５１Ｃｒでラベルした標的細胞（１×１０４）とエフェクター細胞とを１：１０の割合で混合した後、８時間インキュベートし、無細胞の上清を集めてγ−チューブに移し、γ−カウンターで放射能を測定した。特異的５１Ｃｒ遊離のパーセンテージは、文献（Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４， １０４９−， １９９２）記載の計算方法により算出した。これらの結果を図２に示す。マウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞（黒枠）及びマウスＦａｓＬ／２ＰＫ−３細胞（斜線枠）は、８時間の５１Ｃｒ遊離測定においてＬ９２９細胞を効果的に溶解しているが、コントロールである２ＰＫ−３細胞（白枠）は細胞障害を示さなかった。
【００２６】
Ｌ９２９細胞はＴＮＦを介する細胞障害に対して非常に敏感であることから、抗ＴＮＦモノクローナル抗体の存在下で、マウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞又はマウスＦａｓＬ／２ＰＫ−３細胞のＬ９２９細胞に対する細胞障害活性阻害について調べたところ、５０μｇ／ｍｌの抗ＴＮＦモノクローナル抗体の存在下ですら、マウスＴＲＡＩＬやマウスＦａｓＬによる細胞障害活性を阻害することがなかった。さらに、上清中の可溶化ＴＮＦ活性やこれらの細胞上の膜結合ＴＮＦも検出することができなかった。これらの結果から、Ｌ９２９細胞に対するこれらのトランスフェクタントの細胞障害において、ＴＮＦが関与していないことが確認された。
【００２７】
また図２からわかるように、Ｐ８１５細胞はＦａｓＬに対して感受性を有するがＴＲＡＩＬに対しては感受性がなく、Ｂ１６細胞とＹＡＣ−１細胞は、ＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬに対して共に耐性を有する。これら標的細胞に対するマウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞又はマウスＦａｓＬ／２ＰＫ−３細胞による細胞障害を、［３Ｈ］−ＴｄＲ遊離測定法によっても測定したが、これら標的細胞のアポトーシスによる細胞死を示す同様な結果が得られた。
【００２８】
（ラット由来の脾細胞の調製）
Ｆ３４４／ＤｕＣｒｊラット（ＳＬＣ社製）の腹腔内に、前記マウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞（２×１０７ ｃｅｌｌｓ）を投与し、１０日おきに数回免疫した。最終免疫から３日経過後、脾臓細胞をこのラットから無菌的に摘出し、抗体産生細胞として細胞融合に使用した。
【００２９】
（細胞融合）
上記脾細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９７）とを、文献（Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６， １２４１−， １９９２）記載の方法により融合させた。すなわち、３７℃に加温しておいたＲＰＭＩ１６４０（最終濃度で１０％のＦＣＳ、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンとペニシリン、及び２ｍＭのグルタミンを含む培地）でそれぞれの細胞を洗浄し、これらの細胞を遠沈させた。脾細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とを融合させた後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む細胞培養用培地）でハイブリドーマを選択した。ＨＡＴ培地で選択されたハイブリドーマの培養上清を用いて、マウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞のＬ９２９細胞に対する細胞障害活性を抑制するハイブリドーマをスクリーニングした。なお、これらの実験は全て無菌的に行った。
【００３０】
（抗マウス由来ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の精製）
上記スクリーニングされたハイブリドーマを培養し、遠心分離により細胞を取り除いた上清をプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーにより処理し、Ｎ２Ｂ１及びＮ２Ｂ２と名付けられた２つのモノクローナル抗体を分離・精製した。
【００３１】
（抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の結合特異性）
上記２つの抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体、Ｎ２Ｂ１とＮ２Ｂ２とをビオチン化し、このビオチン化した抗体のそれぞれを、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識したアビジンと結合させ、ＰＥ標識化抗体を調製した。次に、２ＰＫ−３細胞とマウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞のそれぞれを１μｇの上記ＰＥ標識化抗体と共に４℃で１時間インキュベートして染色した。結果を図３（図３での実線）に示す。また、コントロールとして、ヒトＩｇＧとＰＥ標識抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を用いて同様にインキュベートして染色した（図３での点線）。これらの結果から、２つの抗体Ｎ２Ｂ１とＮ２Ｂ２とは、マウス由来ＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞に結合するが、ＴＲＡＩＬを発現しない２ＰＫ−３細胞には結合しないことがわかった。また、これらの抗体はマウス由来ＴＲＡＩＬ／ＢＨＫとは結合するが、ＢＨＫには結合しないことも確認された。
【００３２】
（抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の細胞障害活性抑制作用）
抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体のＬ９２９細胞に対する細胞障害活性抑制作用を調べるために、前記の５１Ｃｒ遊離測定を行い、特異的５１Ｃｒ遊離のパーセンテージを算出した。結果を図４に示す。図４中、○はＮ２Ｂ１を、●はＮ２Ｂ２を、▲はこれら抗体の不存在をそれぞれ表す。これらの結果から、抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体、Ｎ２Ｂ１とＮ２Ｂ２とは、投与量０．４μｇ／ｍｌでＬ９２９細胞に対するマウス由来ＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞の細胞障害活性を完全に阻害した。しかし、これら２つの抗体は、Ｌ９２９細胞に対する組換えマウスＴＮＦ／２ＰＫ−３や組換えマウスＦａｓＬ／２ＰＫ−３の細胞障害活性を阻害せず、また、膜ＴＮＦを発現するマウスＦａｓＬ／２ＰＫ−３細胞やＬＰＳで刺激したＲＡＷ２６４細胞を染色することはなかった。これらのことから、これら２つの抗体はマウスＦａｓＬやマウスＴＮＦに対して交差反応しないことが明らかとなった。
【００３３】
（サイトカイン未活性化リンパ球でのマウスＴＲＡＩＬの発現）
未成熟Ｂ６脾細胞（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）（ＳＰＣ）を培養培地で培養し、この培養後のＢ６脾細胞（リンパ球）と、ＦＩＴＣで標識した抗ＮＫ１．１モノクローナル抗体又はペリジニンクロロフィルプロテイン（ＰｅｒＣｐ）で標識した抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ファーミンジェン社製）とを、４℃で１時間インキュベートし反応させ、ＣＤ３とＮＫ１．１の発現を調べることで４つの個体群［ＣＤ３＋ＮＫ１．１−（Ｔ細胞：Ｒ１）、ＣＤ３−ＮＫ１．１−（殆どのＢ細胞：Ｒ２）、ＣＤ３−ＮＫ１．１＋（ＮＫ細胞：Ｒ３）、ＣＤ３＋ＮＫ１．１＋（ＮＫＴ細胞：Ｒ４）］に分類した（図５上段参照）。
【００３４】
本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体（Ｎ２Ｂ２）を用いて、上記分類した４つの個体群（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４）において、ＴＲＡＩＬとＦａｓＬが発現しているかどうかを以下のように調べた。Ｎ２Ｂ２と抗マウスＦａｓＬモノクローナル抗体（以下「ＭＦＬ２」という）をそれぞれビオチン化し、このビオチン化した抗体のそれぞれをフィコエリトリン（ＰＥ）で標識したアビジンと共に４℃で１時間インキュベートして結合させ、これらＰＥ標識化抗体１μｇを、上記Ｒ１〜Ｒ４に分類された細胞と反応させ、ＰＢＳにて洗浄した後、３カラーフローサイトメトリー分析によりＴＲＡＩＬやＦａｓＬの発現を測定した。結果を図５（図５での実線）に示す。また、コントロールとして、ヒトＩｇＧとＰＥ標識抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を用いて同様にインキュベートし、染色した（図５での点線）。これらの結果、全ての個体群においてＴＲＡＩＬは発現していなかった。同様に、新しく単離された胸腺細胞においても、リンパヌード細胞においても、ＴＲＡＩＬは発現していなかった。また、ＦａｓＬの細胞表面での発現を調べた結果、ＮＫ細胞（Ｒ３）ではＦａｓＬの発現をかなりのレベルで確認でき、他の細胞では確認することができなかった。
【００３５】
（サイトカイン活性化リンパ球でのマウスＴＲＡＩＬの発現）
ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８等のサイトカインにより刺激されたＴ細胞とＮＫ細胞において、ＦａｓＬをアップレギュレーション（発現上昇）することができるという報告（Ｂｌｏｏｄ ９２， ４２４８−， １９９８、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７４， ５４−， １９９６、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７， ３９６７−， １９９６、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７， １９１９−， １９９６）があることから、これらサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）によりＴＲＡＩＬを誘導することができるかどうかを調べた。Ｂ６脾細胞（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）（ＳＰＣ）を６日間、ＩＬ−２（５００ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１５０ｎｇ／ｍｌ）又はＩＬ−１８（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養して刺激した。次いで、これら細胞に前記ＰＥ標識化抗体を作用させて、３カラーフローサイトメトリー分析によりＴＲＡＩＬの発現を測定した。結果を図６に示す。
【００３６】
図６の結果から、ＩＬ−２で刺激されたリンパ芽球は、２つの個体群［ＣＤ３＋ＮＫ１．１−（Ｔ細胞：Ｒ１）、ＣＤ３−ＮＫ１．１＋（ＮＫ細胞：Ｒ２）］に分けることができ、このうちＮＫ細胞ではＴＲＡＩＬの著しい発現レベルを検出できたが、Ｔ細胞では検出できなかった。ＩＬ−１５で刺激した場合は、ＩＬ−２とレセプター複合体のβとγサブユニットを共有するとの報告どおり（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４， ９６５−， １９９４、Ｅｍｂｏ． Ｊ． １４， ３６５４−， １９９５、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ４９４０−， １９９４）、ＩＬ−２の場合と同様な結果を示し、Ｔ細胞（Ｒ３）とＮＫ細胞（Ｒ４）の２つの個体群が作出され、また、ＮＫ細胞において選択的にＴＲＡＩＬの発現が誘導されることがわかった。これに対し、レセプター（ＩＬ−１８Ｒ／ＩＬ−１Ｒｒｐ）を刺激するＩＬ−１８は、ＮＫフェノタイプのリンパ芽球（Ｒ５）だけを誘導したが、該リンパ芽球にＴＲＡＩＬ発現を確認することはできなかった。これらのことから、ＩＬ−１８と異なりＩＬ−２とＩＬ−１５は、マウスＮＫ細胞でＴＲＡＩＬ発現に対して強いインデューサー作用を有することがわかった。
【００３７】
Ｂ６脾細胞をＩＬ−２で刺激後、ＮＫ細胞における経時的なＴＲＡＩＬ発現の動態を測定した。結果を図７に示す。ＩＬ−２刺激によるＴＲＡＩＬの発現は、２日後に確認でき、５日後ピークに達した。同様な結果がＩＬ−１５刺激においても観察された。他方、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１８でそれぞれ刺激した細胞において、ＦａｓＬの細胞表面発現をアップレギュレートすることができるかどうかを調べた結果、これらのサイトカインが、Ｔ細胞とＮＫ細胞においてＦａｓＬ発現をアップレギュレートすることがわかった（図６参照）。これらの結果は、これらのサイトカインによるＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬの発現の異なる調節機構の存在を示している。
【００３８】
（ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１８ブラストのＬＡＫ活性）
ＩＬ−２で活性化されたリンパ球は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）非拘束性であり、Ｐ８１５等のＮＫ耐性標的細胞を含む種々の腫瘍細胞に対するＡｇ非依存性細胞障害、いわゆるリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）活性を示すことが知られている（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７， １９１９−， １９９６、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４， ６８１−， １９８６）。そこで、いくつかの標的細胞に対して、ＩＬ−２ブラスト（○）、ＩＬ−１５ブラスト（●）又はＩＬ−１８ブラスト（△）のＬＡＫ活性を比較した。結果を図８に示す。その結果、Ｂ６マウス由来のＩＬ−２ブラスト及びＩＬ−１５ブラストは、ＮＫ細胞感受性のＹＡＣ−１のみならず、ＭＨＣ非拘束性で、ＮＫ細胞耐性の標的細胞Ｂ１６、Ｐ８１５、Ｌ９２９をも自発的に殺した。また、ＩＬ−１８ブラストにおいては、ＩＬ−２ブラストやＩＬ−１５ブラストより、全ての標的細胞に対しより高い細胞障害活性を示すことがわかった。
【００３９】
（サイトカイン活性化ＮＫ細胞の細胞障害におけるＴＲＡＩＬの関与）
ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１８が、ＦａｓＬ及び／又はパーフォリンを介する細胞障害をアップレギュレートし、Ｔ細胞とＮＫ細胞の細胞障害を増大するという報告がある（Ｂｌｏｏｄ ９２， ４２４８−， １９９８、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７４， ５４−， １９９６、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７， ３９６７−， １９９６、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２， １６６２−， １９９９、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７， １９１９−， １９９６）。そこで、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１８ブラストのＬＡＫ活性に対するＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ及びパーフォリンの関与を検討した。Ｂ６脾細胞（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に、ＩＬ−２（５００ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１５０ｎｇ／ｍｌ）又はＩＬ−１８（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えて６日間刺激し、培養培地で培養した。また、あらかじめ標的細胞として用いる腫瘍細胞を５１Ｃｒの共存下ＲＰＭＩ１６４０で培養した。次に、９６ウエルＵ底マイクロプレートに、５１Ｃｒでラベルされた標的細胞（１×１０４）とエフェクター細胞とを１：５の割合で混合し、２０ｎＭのコンカナマイシン（以下「ＣＭＡ」という）の存在又は非存在下、各々１０μｇ／ｍｌのＮ２Ｂ２及び／又はＭＦＬ２を添加し、８時間インキュベートした。その無細胞上清を集めてγ−チューブに移し、γ−カウンターで放射能を測定し、遊離５１Ｃｒの測定を行った。
【００４０】
ＣＭＡで前処理した不活性化パーフォリンを、パーフォリンの関与を評価するのに用い、ＦａｓＬ耐性の標的細胞（ＹＡＣ−１）やＴＲＡＩＬ耐性の標的細胞（Ｂ１６）等に対する、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１８ブラストの細胞障害活性を調べた。結果を図９に示す。図９からわかるように、ＩＬ−２やＩＬ−１５で活性化されたブラストの細胞障害活性はＣＭＡ処理によりほとんど完全に阻害され、パーフォリンの関与を明らかに示した。これに対し、Ｂ１６に対するＩＬ−１８ブラストの細胞障害活性はＣＭＡ処理によりほとんど完全に阻害されたが、ＹＡＣ−１に対してはＣＭＡ、あるいは、ＣＭＡとＭＦＬ２及び／又はＮ２Ｂ２との組み合わせの場合であっても、完全に抑制することができなかった。これらのことから、パーフォリン、ＦａｓＬ又はＴＲＡＩＬに依存しない他の細胞障害経路の存在が示唆された。また、ＦａｓＬ感受性でＴＲＡＩＬ耐性のＰ８１５に対する、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１８ブラストの細胞障害活性を、ＣＭＡはほとんど阻害し、ＭＦＬ２との組み合わせでは完全に阻害した。このことは、Ｐ８１５に対する細胞障害活性にパーフォリンは重要で、ＦａｓＬは重要でないことを示している。ＴＲＡＩＬ又はＦａｓＬに敏感なＬ９２９では、ＣＭＡはただＩＬ−２ブラストとＩＬ−１５ブラストの細胞障害活性を一部阻害し、ＣＭＡとＭＦＬ２又はＮ２Ｂ２と組み合わせることでより阻害することができた。さらに、ＣＭＡと２つの抗体を組み合わせることでほとんど完全に阻害できることがわかった。
【００４１】
これらの結果は、パーフォリンやＦａｓＬに加えてＴＲＡＩＬが、Ｌ９２９に対するＩＬ−２又はＩＬ−１５ブラストの細胞障害活性に関係することを示している。これに対して、ＣＭＡとＭＦＬ２との組み合わせは、Ｎ２Ｂ２の非存在下でＬ９２９に対してＩＬ−１８ブラストの細胞障害活性を完全に阻害することから、ＩＬ−１８ブラストの細胞障害活性は、パーフォリン及びＦａｓＬに依存し、ＴＲＡＩＬに非依存性であることがわかった。
【００４２】
次に、ＮＫ細胞とＴ細胞の２つの個体群においてエフェクターのメカニズムを調べるため、Ｌ９２９に対してこれらエフェクター細胞の細胞障害活性を、上記と同様にＣＭＡ、ＣＭＡとＭＦＬ２及び／又はＮ２Ｂ２の存在下あるいは非存在下で調べてみた。結果を図１０に示す。これらの結果から、ＩＬ−２で刺激されたＮＫ細胞は、Ｔ細胞より十分高い細胞障害性を示し、ＣＭＡ、Ｎ２Ｂ２及びＭＦＬ２の組み合わせは、Ｌ９２９に対してＩＬ−２で刺激されたＮＫ細胞の細胞障害活性を完全に阻害することがわかった。これに対して、Ｎ２Ｂ２はＩＬ−２で刺激されたＴ細胞の細胞障害の阻害に必要とされないことがわかった。また、ＩＬ−１５ブラストでも同様な結果を得た。これらの結果から、ＩＬ−２又はＩＬ−１５で刺激されたＮＫ細胞では機能的にＴＲＡＩＬを発現するが、Ｔ細胞では発現しないことが明らかとなった。
【００４３】
【発明の効果】
本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を使用することで、インビトロ又はインビボでの種々のＴＲＡＩＬ機能の解析が可能となり、ＴＲＡＩＬの生理的役割及び病理的役割を解明することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】トランスフェクタントにおけるマウスＴＲＡＩＬの発現をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す図である。
【図２】標的腫瘍細胞に対するマウスＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬ発現細胞の細胞障害活性を示す図である。
【図３】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体と細胞表面マウスＴＲＡＩＬとの結合を示すフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。
【図４】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体によるマウスＴＲＡＩＬの細胞障害活性抑制の結果を示す図である。
【図５】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を用いたサイトカイン未活性化リンパ球におけるＴＲＡＩＬの発現結果を示す図である。
【図６】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を用いたサイトカイン活性化リンパ球におけるＴＲＡＩＬの発現結果を示す図である。
【図７】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を用いたＩＬ−２活性化ＮＫ細胞におけるＴＲＡＩＬ発現の経時変化を示す図である。
【図８】各種標的腫瘍細胞に対するサイトカイン活性化リンパ球のＬＡＫ活性を示す図である。
【図９】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を用いたサイトカイン活性化リンパ球の腫瘍細胞に対する細胞障害におけるＴＲＡＩＬの関与を示す図である。
【図１０】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を用いたサイトカイン活性化リンパ球の腫瘍細胞Ｌ９２９に対する細胞障害におけるＴＲＡＩＬの関与を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、マウス等非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに特異的に結合する抗ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体、その製造方法及びかかるモノクローナル抗体を有効成分として含有するＴＲＡＩＬ機能解析用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ：以下「ＴＮＦ」という）は、ある種の癌細胞にアポトーシス（細胞死）を誘導するサイトカインの一種であり、疎水性ペプチドをＮ末端側に有するＩＩ型細胞膜貫通蛋白質として知られている。また、ＴＮＦとよく似た構造を有する細胞膜貫通蛋白質として、Ｆａｓ抗原のリガンド、Ｂ細胞表層抗原ＣＤ４０のリガンド、Ｔ細胞表層抗原ＣＤ２７やＣＤ３０のリガンドなどが存在し、これらはＴＮＦファミリーと呼ばれ、かかるＴＮＦファミリーに属する分子の受容体群はＴＮＦ受容体ファミリーと呼ばれている。
【０００３】
ＴＮＦファミリーの一員である腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ：以下「ＴＲＡＩＬ」という）は、ＴＮＦファミリー間における相同性に基づくデータベース検索によって、３０ｋＤａのＩＩ型細胞表面蛋白としてクローニングされ、またＴＲＡＩＬの細胞外領域は、ＴＮＦファミリー間においては、アポトーシス誘導分子の１つであるＦａｓリガンド（以下「ＦａｓＬ」という）に対して最も高い相同性を示し（アミノ酸レベルで２８％）、さらに、ＦａｓＬ同様、さまざまな腫瘍細胞にアポトーシスを誘導することが報告されている。
【０００４】
またこれまでに、ＴＲＡＩＬに対応するレセプターとして、少なくとも４分子、すなわちＴＲＡＩＬレセプター１（ＤＲ４ともいう）、ＴＲＡＩＬレセプター２（ＤＲ５、ＴＲＩＣＫ２あるいはｋｉｌｌｅｒともいう）、ＴＲＡＩＬレセプター３（ＴＲＩＤ、ＤｃＲ１あるいはＬＩＴともいう）及びＴＲＡＩＬレセプター４（ＴＲＵＮＤＤあるいはＤｃＲ２ともいう）が存在し、これらレセプターは、ＴＲＡＩＬに対してほぼ同程度の親和性を示すが、その機能や存在様式については異なることが明らかとなっている。例えば、ＴＲＡＩＬレセプター１及びＴＲＡＩＬレセプター２は細胞内領域にデスドメインと呼ばれるアポトーシスの誘導に必要とされる部位を有し、三量体ＴＲＡＩＬとこれらレセプター分子が結合すると、ＦａｓＬのレセプターであるＦａｓと同様に、カスパーゼと呼ばれる一連の蛋白質分解酵素群を介して細胞にアポトーシスを誘導する。
【０００５】
一方、ＴＲＡＩＬレセプター３は細胞内領域を完全に欠いており、細胞膜上の糖脂質（グリコホスファチジルイノシトール：ＧＰＩ）に結合することにより細胞表面上に存在すると考えられている。このＴＲＡＩＬレセプター３は、細胞内にアポトーシスシグナルを誘導することはできないが、ＴＲＡＩＬレセプター１やＴＲＡＩＬレセプター２とＴＲＡＩＬへの結合をめぐって拮抗的に作用することから、ＴＲＡＩＬの機能を抑制するものと考えられている。また、ＴＲＡＩＬはＦａｓＬとは異なり、腫瘍細胞のみに選択的にアポトーシスを誘導し、正常細胞に対しては無力であることが知られているが、ＴＲＡＩＬレセプター３のメッセンジャーＲＮＡの発現が正常細胞のみにおいて検出され、腫瘍細胞では認められないことから、正常細胞のＴＲＡＩＬに対する耐性の獲得にＴＲＡＩＬレセプター３が関与する可能性が示唆されている。
【０００６】
第４のレセプター分子であるＴＲＡＩＬレセプター４は、ＴＲＡＩＬレセプター１やＴＲＡＩＬレセプター２と同様、Ｉ型膜構造形態をとるもののデスドメインの大半を失っており、アポトーシスの誘導は不可能とされている。しかしながら、ＴＲＡＩＬレセプター４はＮＦ−κＢを介したアポトーシス抑制性のシグナルを誘導することが可能であることから、ＴＲＡＩＬレセプター１及びＴＲＡＩＬレセプター２からのアポトーシスシグナルに対して抑制的にはたらくものと考えられている。ＴＲＡＩＬのアポトーシス誘導作用に対する細胞側の感受性は、アポトーシスを誘導するレセプター（ＴＲＡＩＬレセプター１及びＴＲＡＩＬレセプター２）の発現とアポトーシスに対して抑制的にはたらくレセプター（ＴＲＡＩＬレセプター３及びＴＲＡＩＬレセプター４）の発現との絶対的及び相対的な差によって一義的に決定されると考えられている。しかしながら、細胞側のＴＲＡＩＬに対する耐性獲得の要因としてレセプターの発現以外にもＦＡＤＤ様インターロイキン１β変換酵素抑制蛋白質（ＦＬＩＰ：Ｆａｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ−ｌｉｋｅ ＩＬ−１β−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）等の細胞内でアポトーシスシグナルを抑制する分子の存在が関与する可能性も報告されており、これら細胞内外のさまざまな要因によりＴＲＡＩＬに対する感受性が決まると推測されている。
【０００７】
ＲＮＡレベルでのＴＲＡＩＬ及びＴＲＡＩＬレセプター１〜４の発現は多くの組織や細胞で認められるが、これら分子の蛋白質レベルでの発現や生理的機能についてはいまだ不明な点が多い。最近、本発明者らは、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞クローンが恒常的にＴＲＡＩＬを表出し、ヒト由来Ｔ細胞リンパ種Ｊｕｒｋａｔや不死化した角化細胞であるＨａＣａＴといった標的細胞をＴＲＡＩＬを介して破壊することを見い出した。また、トーマスらも同様にメラノーマに対するＣＤ４＋Ｔ細胞クローンがＴＲＡＩＬを介して標的細胞を破壊することを報告している。
【０００８】
上記のように、ＴＲＡＩＬとほかの標的細胞破壊機構がどのように使い分けられているかは、未だ不明な点が多く、また、ＴＲＡＩＬ発現が誘導するメカニズムは、まだ明らかとなっていない。さらに、最近、ＨＩＶに感染するとＴ細胞がＴＲＡＩＬに対して感受性を示すようになり、アポトーシスが誘導されやすくなることや、ＨＩＶ感染患者由来末梢血Ｔ細胞の抗ＣＤ３抗体刺激によるアポトーシス（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）にＴＲＡＩＬが関与することから、ＨＩＶ感染細胞の排除やＡＩＤＳ発症児におけるリンパ球減少などの病態形成にＴＲＡＩＬが関与する可能性が示唆されているものの、そのメカニズムの詳細は明らかになっていない。以上のことから、これらＴＲＡＩＬの発現誘導機構や標的細胞破壊機構以外のほかの生理的機能について、そのメカニズム解析に有用な試薬の存在が期待されていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
上記ＴＲＡＩＬの生理的役割及び病理的役割を解明するためには、細胞死を誘導する他のＴＮＦファミリーやＴＮＦレセプターファミリーと交差反応性を示さず、ＴＲＡＩＬと特異的に結合するモノクローナル抗体等の蛋白質が必要であり、また、生理的機能を有する分子の機能解析はインビボで実験可能なマウスやラット等の非ヒト動物を用いて行うことが必要である。抗ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体として、本発明者らは既に、ヒト由来のＴＲＡＩＬに結合する抗ヒトＴＲＡＩＬモノクローナル抗体について報告している（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２， ２６３９−， １９９９）が、抗ヒトＴＲＡＩＬモノクローナル抗体は、上記のように、マウス等を用いたインビボでの実験に実際に使用することができないという問題があった。
【００１０】
本発明の課題は、上記ＴＲＡＩＬの発現誘導機構や標的細胞破壊機構以外の他の生理的機能をインビトロ又はインビボで解析する際、ＦａｓやＴＮＦ等のＴＮＦファミリーやＴＮＦレセプターファミリーに対して交差反応せず、ＴＲＡＩＬに特異的に作用してその細胞障害活性を完全に阻害することができる抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナルラット抗体などの抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法や、かかる製造方法により得られる抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体や、かかるモノクローナル抗体を有効成分として含有し、簡便かつ精確にＴＲＡＩＬを検出することができるＴＲＡＩＬ機能解析用試薬を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を克服するために、マウス由来ＴＲＡＩＬのｃＤＮＡをトランスフェクションしたマウスＢリンパ腫２ＰＫ−３細胞を作製し、その２ＰＫ−３細胞で免疫したラットの脾細胞と、マウスミエローマとを融合することによってハイブリドーマを作製し、かかるハイブリドーマから、ＦａｓやＴＮＦと交差反応せず、特異的にマウス由来ＴＲＡＩＬに結合し、かつ、ＴＲＡＩＬの細胞障害活性を完全に阻害する抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体が産生されることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに対して特異的に反応し、非ヒト動物由来のＦａｓリガンドや非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子に対して交差反応せず、かつ、該非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの細胞障害活性を完全に阻害するモノクローナル抗体の製造方法であって、非ヒト動物由来ＴＲＡＩＬのｃＤＮＡを該非ヒト動物と同種の株化細胞にトランスフェクションして形質転換細胞を調製し、該形質転換細胞で免疫した異種の非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と同種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養することを特徴とする抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法（請求項１）や、非ヒト動物が齧歯類動物であることを特徴とする請求項１記載の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法（請求項２）や、齧歯類動物として、マウスとラットを用いることを特徴とする請求項２記載の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法（請求項３）や、株化細胞が、マウスＢリンパ腫２ＰＫ−３細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法（請求項４）に関する。
【００１３】
また本発明は、マウス由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに対して特異的に反応し、マウス由来のＦａｓリガンドやマウス由来の腫瘍壊死因子に対して交差反応せず、かつ、該マウス由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの細胞障害活性を完全に阻害することを特徴とする抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体（請求項５）に関する。
【００１４】
さらに本発明は、請求項５記載の抗マウス動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を有効成分として含有することを特徴とするＴＲＡＩＬ機能解析用試薬（請求項６）に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法は、非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに対して特異的に反応し、非ヒト動物由来のＦａｓリガンドや非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子に対して交差反応せず、かつ、該非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの細胞障害活性を完全に阻害するモノクローナル抗体の製造方法であって、非ヒト動物由来ＴＲＡＩＬのｃＤＮＡを非ヒト動物と同種の株化細胞にトランスフェクションした形質転換細胞を調製し、該形質転換細胞で免疫した異種の非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と同種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養することを特徴とする。非ヒト動物としては齧歯類動物が材料の入手性や取り扱い安さの点で好ましく、かかる齧歯類動物としてはマウスやラットを具体的に挙げることができる。以下、抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体として、抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナルラット抗体を例に挙げて説明する。
【００１６】
本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体としては、マウス由来ＴＲＡＩＬと特異的に結合し、マウスＦａｓＬやマウスＴＮＦに対して交差反応することなく、かつ、マウスＴＲＡＩＬの細胞障害活性を完全に阻害するモノクローナル抗体であればどのようなものでもよく、かかる抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体は、抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により培養することにより生産することができる。例えば、インビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。
【００１７】
抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、一般的にはマウスＴＲＡＩＬで免疫したラットの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを、常法により細胞融合させることにより作製することができる。このようにマウスＴＲＡＩＬを用いてラットを免疫するとその抗原性が増加する。また、実際のＴＲＡＩＬの機能解析の場合に必要とされるＴＲＡＩＬの細胞外領域をエピトープとして認識する抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることが好ましく、このため、マウスＴＲＡＩＬのｃＤＮＡをマウスの株化細胞、例えばＢリンパ腫２ＰＫ−３細胞にトランスフェクションし、安定発現する形質転換細胞を選択・調製し、該形質転換細胞でラットを常法により免疫し、免疫されたラットの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを、常法により細胞融合させ、ＨＡＴ培地で選択し、その中からＬ９２９細胞に対してＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞の細胞障害活性を抑制することができるものをスクリーンすることにより、抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的に例示することができる。
【００１８】
本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体は、前記のように、マウスＴＲＡＩＬに対して特異的に反応し、マウスＦａｓＬやマウスＴＮＦに対して交差反応せず、かつ、マウスＴＲＡＩＬの細胞障害活性を完全に阻害することを特徴とするが、ここでＴＲＡＩＬの細胞障害活性とは、標的腫瘍細胞を破壊するなど、標的細胞に何らかの病理的な変化をもたらす活性のことをいい、マウスＴＲＡＩＬの細胞障害活性を完全に阻害するとは、例えば、エフェクター細胞表面上に発現したＴＲＡＩＬの細胞障害活性により標的細胞がＴＲＡＩＬ特異的に受ける障害が実質的に阻害されることをいう。
【００１９】
本発明のＴＲＡＩＬ機能解析用試薬としては、抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を有効成分として含有するものであれば特に制限されるものでなく、例えば、抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものを具体的に例示することができる。かかるＴＲＡＩＬ機能解析用試薬を用いたＴＲＡＩＬの機能解析には通常の免疫学的測定方法を適用することができ、かかる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００２０】
【実施例】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
（マウスＴＲＡＩＬの調製）
６週齢の雄のＢ６（Ｃ５７ＢＬ／６）マウス（ＳＬＣ社製）をコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）により刺激した後、このマウスの脾細胞から全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡを含む抽出物を、文献（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３， ６７３−， １９９５）記載のマウスＴＲＡＩＬのｃＤＮＡ配列の５′末端側の６つのコドンからなるプライマーと、３′末端側の６つのコドンからなるプライマーとの２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＸｈｏＩとＮｏｔＩによるＲＴ−ＰＣＲ法を行い、マウスＴＲＡＩＬのｃＤＮＡ（８５０ｂｐ）を増幅し精製した。
【００２１】
（ＴＲＡＩＬ検出用標識ＤＲ５−Ｉｇの作製）
文献（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２， ２６３９−， １９９９、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４， ３９１４−， １９９７）記載の方法により、可溶化ＤＲ５−Ｉｇ（ＴＲＡＩＬレセプター２−免疫グロブリン）融合蛋白質を次のようにして作製した。マウスＴＲＡＩＬと結合するヒト由来のＤＲ５（ＴＲＡＩＬレセプター２）の細胞外領域（アミノ末端側の１番目から１８３番目のアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲ法で増幅させ、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとを使用して、ダイジェスションした。そのｃＤＮＡ（５５０ｂｐ）を、ヒトＩｇのＣγ１の遺伝子配列を持つｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩのＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩの部位に挿入し、その後、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩでダイジェスションすることによって、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分にＤＲ５の細胞外領域を有するＤＲ５−Ｉｇの融合体を得た。その融合体をＰＳＧ５発現ベクター（ストラタジーン社製）のＥｃｏＲＩからＮｏｔＩまでの部位に挿入し、ＣＯＳ７細胞にトランスフェクションした。１６時間後、無血清の培養培地に移して９６時間培養し、プロテインＧカラムにより精製した。このＤＲ５−Ｉｇをビオチン化し、続いて、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ：ＰＥ）で標識した抗ヒトＩｇＧ（ファーミンジェン社製）と結合させることによって標識化したＤＲ５−Ｉｇ複合体を作製した。
【００２２】
（マウス由来ＴＲＡＩＬのトランスフェクタントの作製）
上記マウスＴＲＡＩＬのｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）ベクターにサブクローンし、オートシークエンサー（アプライドバイオシステム社製）又は蛍光式オートシークエンサーを用いて、それらの塩基配列を確認した。確認後、東京医科歯科大学の丸山博士から提供されたｐＭＫＩＴＮｅｏ発現ベクターのＸｈｏＩからＮｏｔＩまでの部位に、マウスＴＲＡＩＬのｃＤＮＡを挿入した。このマウスＴＲＡＩＬ／ｐＭＫＩＴＮｅｏベクターを、ジーンパルサー（バイオラッド社製）を用いてエレクトポレーション法（２９０Ｖ，９６−９６０μＦ）により、ＲＰＭＩ１６４０培地（最終濃度で１０％のＦＣＳ、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンとペニシリン、及び２ｍＭのグルタミンを含む培地）であらかじめ培養しておいた２ＰＫ−３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ−２０３）に導入した。その後、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８に対して耐性のある細胞を選択し、続いて限界希釈法によりクローニングして、安定なマウスＴＲＡＩＬのトランスフェクタント、すなわち、ｍＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞を得た。この得られた細胞でマウス由来ＴＲＡＩＬが安定的に発現するかどうかを、以下の方法により確認した。
【００２３】
（ｍＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞でのマウスＴＲＡＩＬ発現の確認）
２ＰＫ−３細胞とマウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞をそれぞれ１μｇの上記標識化したＤＲ５−Ｉｇ複合体と共に４℃で１時間インキュベートして染色した。結果を図１（図１での実線）に示す。また、コントロールとして、ヒトＩｇＧとＰＥ標識抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を用いて同様にインキュベートして染色した（図１での点線）。これらの結果から、ＤＲ５−ＩｇによってマウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞のみ染色されることから、マウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞においてマウスＴＲＡＩＬが発現することが確認できた。また同様に、文献（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４， ３９１４−， １９９７）記載の方法で精製した抗マウスＦａｓＬモノクローナル抗体をＤＲ５−Ｉｇのかわりに用いた場合、マウスＦａｓＬ／２ＰＫ−３細胞を染色するが、マウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞を染色しないことがわかった。このことから、抗マウスＦａｓＬモノクローナル抗体は、マウスＴＲＡＩＬに対して交差反応を示さないことが確認できた。
【００２４】
（マウス腫瘍細胞の感受性）
インビトロにおいて、種々のヒト腫瘍細胞は、ＴＲＡＩＬ誘導の細胞障害に対して感受性であることが知られているが、マウス腫瘍細胞［マウス繊維肉腫Ｌ９２９（Ｈ−２ｋ）（日本キャンサーリサーチリソースバンク）、肥満細胞腫Ｐ８１５（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−６４）、黒色腫Ｂ１６、Ｔリンパ腫ＹＡＣ−１（Ｈ−２ｂ）（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１６０）］は、ＴＲＡＩＬ誘導の細胞障害に対して感受性を有するかどうかはほとんど知られていない。そこで、マウス由来ＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞とマウス由来ＦａｓＬ／２ＰＫ−３細胞の２種類のトランスフェクタントを用いて、ＴＲＡＩＬとＦａｓＬがそれぞれ誘導する細胞障害に対して、これらのマウス腫瘍細胞の感受性を以下のように測定した。
【００２５】
文献（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ４９３０−， １９９４）記載の方法により５１Ｃｒ遊離測定を以下のように行った。あらかじめ標的細胞として用いる腫瘍細胞を５１Ｃｒ含有ＲＰＭＩ１６４０で培養した。９６ウエルＵ底マイクロプレートに、５１Ｃｒでラベルした標的細胞（１×１０４）とエフェクター細胞とを１：１０の割合で混合した後、８時間インキュベートし、無細胞の上清を集めてγ−チューブに移し、γ−カウンターで放射能を測定した。特異的５１Ｃｒ遊離のパーセンテージは、文献（Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４， １０４９−， １９９２）記載の計算方法により算出した。これらの結果を図２に示す。マウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞（黒枠）及びマウスＦａｓＬ／２ＰＫ−３細胞（斜線枠）は、８時間の５１Ｃｒ遊離測定においてＬ９２９細胞を効果的に溶解しているが、コントロールである２ＰＫ−３細胞（白枠）は細胞障害を示さなかった。
【００２６】
Ｌ９２９細胞はＴＮＦを介する細胞障害に対して非常に敏感であることから、抗ＴＮＦモノクローナル抗体の存在下で、マウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞又はマウスＦａｓＬ／２ＰＫ−３細胞のＬ９２９細胞に対する細胞障害活性阻害について調べたところ、５０μｇ／ｍｌの抗ＴＮＦモノクローナル抗体の存在下ですら、マウスＴＲＡＩＬやマウスＦａｓＬによる細胞障害活性を阻害することがなかった。さらに、上清中の可溶化ＴＮＦ活性やこれらの細胞上の膜結合ＴＮＦも検出することができなかった。これらの結果から、Ｌ９２９細胞に対するこれらのトランスフェクタントの細胞障害において、ＴＮＦが関与していないことが確認された。
【００２７】
また図２からわかるように、Ｐ８１５細胞はＦａｓＬに対して感受性を有するがＴＲＡＩＬに対しては感受性がなく、Ｂ１６細胞とＹＡＣ−１細胞は、ＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬに対して共に耐性を有する。これら標的細胞に対するマウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞又はマウスＦａｓＬ／２ＰＫ−３細胞による細胞障害を、［３Ｈ］−ＴｄＲ遊離測定法によっても測定したが、これら標的細胞のアポトーシスによる細胞死を示す同様な結果が得られた。
【００２８】
（ラット由来の脾細胞の調製）
Ｆ３４４／ＤｕＣｒｊラット（ＳＬＣ社製）の腹腔内に、前記マウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞（２×１０７ ｃｅｌｌｓ）を投与し、１０日おきに数回免疫した。最終免疫から３日経過後、脾臓細胞をこのラットから無菌的に摘出し、抗体産生細胞として細胞融合に使用した。
【００２９】
（細胞融合）
上記脾細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９７）とを、文献（Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６， １２４１−， １９９２）記載の方法により融合させた。すなわち、３７℃に加温しておいたＲＰＭＩ１６４０（最終濃度で１０％のＦＣＳ、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンとペニシリン、及び２ｍＭのグルタミンを含む培地）でそれぞれの細胞を洗浄し、これらの細胞を遠沈させた。脾細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とを融合させた後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む細胞培養用培地）でハイブリドーマを選択した。ＨＡＴ培地で選択されたハイブリドーマの培養上清を用いて、マウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞のＬ９２９細胞に対する細胞障害活性を抑制するハイブリドーマをスクリーニングした。なお、これらの実験は全て無菌的に行った。
【００３０】
（抗マウス由来ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の精製）
上記スクリーニングされたハイブリドーマを培養し、遠心分離により細胞を取り除いた上清をプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーにより処理し、Ｎ２Ｂ１及びＮ２Ｂ２と名付けられた２つのモノクローナル抗体を分離・精製した。
【００３１】
（抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の結合特異性）
上記２つの抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体、Ｎ２Ｂ１とＮ２Ｂ２とをビオチン化し、このビオチン化した抗体のそれぞれを、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識したアビジンと結合させ、ＰＥ標識化抗体を調製した。次に、２ＰＫ−３細胞とマウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞のそれぞれを１μｇの上記ＰＥ標識化抗体と共に４℃で１時間インキュベートして染色した。結果を図３（図３での実線）に示す。また、コントロールとして、ヒトＩｇＧとＰＥ標識抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を用いて同様にインキュベートして染色した（図３での点線）。これらの結果から、２つの抗体Ｎ２Ｂ１とＮ２Ｂ２とは、マウス由来ＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞に結合するが、ＴＲＡＩＬを発現しない２ＰＫ−３細胞には結合しないことがわかった。また、これらの抗体はマウス由来ＴＲＡＩＬ／ＢＨＫとは結合するが、ＢＨＫには結合しないことも確認された。
【００３２】
（抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の細胞障害活性抑制作用）
抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体のＬ９２９細胞に対する細胞障害活性抑制作用を調べるために、前記の５１Ｃｒ遊離測定を行い、特異的５１Ｃｒ遊離のパーセンテージを算出した。結果を図４に示す。図４中、○はＮ２Ｂ１を、●はＮ２Ｂ２を、▲はこれら抗体の不存在をそれぞれ表す。これらの結果から、抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体、Ｎ２Ｂ１とＮ２Ｂ２とは、投与量０．４μｇ／ｍｌでＬ９２９細胞に対するマウス由来ＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞の細胞障害活性を完全に阻害した。しかし、これら２つの抗体は、Ｌ９２９細胞に対する組換えマウスＴＮＦ／２ＰＫ−３や組換えマウスＦａｓＬ／２ＰＫ−３の細胞障害活性を阻害せず、また、膜ＴＮＦを発現するマウスＦａｓＬ／２ＰＫ−３細胞やＬＰＳで刺激したＲＡＷ２６４細胞を染色することはなかった。これらのことから、これら２つの抗体はマウスＦａｓＬやマウスＴＮＦに対して交差反応しないことが明らかとなった。
【００３３】
（サイトカイン未活性化リンパ球でのマウスＴＲＡＩＬの発現）
未成熟Ｂ６脾細胞（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）（ＳＰＣ）を培養培地で培養し、この培養後のＢ６脾細胞（リンパ球）と、ＦＩＴＣで標識した抗ＮＫ１．１モノクローナル抗体又はペリジニンクロロフィルプロテイン（ＰｅｒＣｐ）で標識した抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ファーミンジェン社製）とを、４℃で１時間インキュベートし反応させ、ＣＤ３とＮＫ１．１の発現を調べることで４つの個体群［ＣＤ３＋ＮＫ１．１−（Ｔ細胞：Ｒ１）、ＣＤ３−ＮＫ１．１−（殆どのＢ細胞：Ｒ２）、ＣＤ３−ＮＫ１．１＋（ＮＫ細胞：Ｒ３）、ＣＤ３＋ＮＫ１．１＋（ＮＫＴ細胞：Ｒ４）］に分類した（図５上段参照）。
【００３４】
本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体（Ｎ２Ｂ２）を用いて、上記分類した４つの個体群（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４）において、ＴＲＡＩＬとＦａｓＬが発現しているかどうかを以下のように調べた。Ｎ２Ｂ２と抗マウスＦａｓＬモノクローナル抗体（以下「ＭＦＬ２」という）をそれぞれビオチン化し、このビオチン化した抗体のそれぞれをフィコエリトリン（ＰＥ）で標識したアビジンと共に４℃で１時間インキュベートして結合させ、これらＰＥ標識化抗体１μｇを、上記Ｒ１〜Ｒ４に分類された細胞と反応させ、ＰＢＳにて洗浄した後、３カラーフローサイトメトリー分析によりＴＲＡＩＬやＦａｓＬの発現を測定した。結果を図５（図５での実線）に示す。また、コントロールとして、ヒトＩｇＧとＰＥ標識抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を用いて同様にインキュベートし、染色した（図５での点線）。これらの結果、全ての個体群においてＴＲＡＩＬは発現していなかった。同様に、新しく単離された胸腺細胞においても、リンパヌード細胞においても、ＴＲＡＩＬは発現していなかった。また、ＦａｓＬの細胞表面での発現を調べた結果、ＮＫ細胞（Ｒ３）ではＦａｓＬの発現をかなりのレベルで確認でき、他の細胞では確認することができなかった。
【００３５】
（サイトカイン活性化リンパ球でのマウスＴＲＡＩＬの発現）
ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８等のサイトカインにより刺激されたＴ細胞とＮＫ細胞において、ＦａｓＬをアップレギュレーション（発現上昇）することができるという報告（Ｂｌｏｏｄ ９２， ４２４８−， １９９８、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７４， ５４−， １９９６、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７， ３９６７−， １９９６、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７， １９１９−， １９９６）があることから、これらサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）によりＴＲＡＩＬを誘導することができるかどうかを調べた。Ｂ６脾細胞（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）（ＳＰＣ）を６日間、ＩＬ−２（５００ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１５０ｎｇ／ｍｌ）又はＩＬ−１８（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養して刺激した。次いで、これら細胞に前記ＰＥ標識化抗体を作用させて、３カラーフローサイトメトリー分析によりＴＲＡＩＬの発現を測定した。結果を図６に示す。
【００３６】
図６の結果から、ＩＬ−２で刺激されたリンパ芽球は、２つの個体群［ＣＤ３＋ＮＫ１．１−（Ｔ細胞：Ｒ１）、ＣＤ３−ＮＫ１．１＋（ＮＫ細胞：Ｒ２）］に分けることができ、このうちＮＫ細胞ではＴＲＡＩＬの著しい発現レベルを検出できたが、Ｔ細胞では検出できなかった。ＩＬ−１５で刺激した場合は、ＩＬ−２とレセプター複合体のβとγサブユニットを共有するとの報告どおり（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４， ９６５−， １９９４、Ｅｍｂｏ． Ｊ． １４， ３６５４−， １９９５、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ４９４０−， １９９４）、ＩＬ−２の場合と同様な結果を示し、Ｔ細胞（Ｒ３）とＮＫ細胞（Ｒ４）の２つの個体群が作出され、また、ＮＫ細胞において選択的にＴＲＡＩＬの発現が誘導されることがわかった。これに対し、レセプター（ＩＬ−１８Ｒ／ＩＬ−１Ｒｒｐ）を刺激するＩＬ−１８は、ＮＫフェノタイプのリンパ芽球（Ｒ５）だけを誘導したが、該リンパ芽球にＴＲＡＩＬ発現を確認することはできなかった。これらのことから、ＩＬ−１８と異なりＩＬ−２とＩＬ−１５は、マウスＮＫ細胞でＴＲＡＩＬ発現に対して強いインデューサー作用を有することがわかった。
【００３７】
Ｂ６脾細胞をＩＬ−２で刺激後、ＮＫ細胞における経時的なＴＲＡＩＬ発現の動態を測定した。結果を図７に示す。ＩＬ−２刺激によるＴＲＡＩＬの発現は、２日後に確認でき、５日後ピークに達した。同様な結果がＩＬ−１５刺激においても観察された。他方、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１８でそれぞれ刺激した細胞において、ＦａｓＬの細胞表面発現をアップレギュレートすることができるかどうかを調べた結果、これらのサイトカインが、Ｔ細胞とＮＫ細胞においてＦａｓＬ発現をアップレギュレートすることがわかった（図６参照）。これらの結果は、これらのサイトカインによるＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬの発現の異なる調節機構の存在を示している。
【００３８】
（ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１８ブラストのＬＡＫ活性）
ＩＬ−２で活性化されたリンパ球は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）非拘束性であり、Ｐ８１５等のＮＫ耐性標的細胞を含む種々の腫瘍細胞に対するＡｇ非依存性細胞障害、いわゆるリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）活性を示すことが知られている（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７， １９１９−， １９９６、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４， ６８１−， １９８６）。そこで、いくつかの標的細胞に対して、ＩＬ−２ブラスト（○）、ＩＬ−１５ブラスト（●）又はＩＬ−１８ブラスト（△）のＬＡＫ活性を比較した。結果を図８に示す。その結果、Ｂ６マウス由来のＩＬ−２ブラスト及びＩＬ−１５ブラストは、ＮＫ細胞感受性のＹＡＣ−１のみならず、ＭＨＣ非拘束性で、ＮＫ細胞耐性の標的細胞Ｂ１６、Ｐ８１５、Ｌ９２９をも自発的に殺した。また、ＩＬ−１８ブラストにおいては、ＩＬ−２ブラストやＩＬ−１５ブラストより、全ての標的細胞に対しより高い細胞障害活性を示すことがわかった。
【００３９】
（サイトカイン活性化ＮＫ細胞の細胞障害におけるＴＲＡＩＬの関与）
ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１８が、ＦａｓＬ及び／又はパーフォリンを介する細胞障害をアップレギュレートし、Ｔ細胞とＮＫ細胞の細胞障害を増大するという報告がある（Ｂｌｏｏｄ ９２， ４２４８−， １９９８、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７４， ５４−， １９９６、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７， ３９６７−， １９９６、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２， １６６２−， １９９９、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７， １９１９−， １９９６）。そこで、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１８ブラストのＬＡＫ活性に対するＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ及びパーフォリンの関与を検討した。Ｂ６脾細胞（２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に、ＩＬ−２（５００ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１５０ｎｇ／ｍｌ）又はＩＬ−１８（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えて６日間刺激し、培養培地で培養した。また、あらかじめ標的細胞として用いる腫瘍細胞を５１Ｃｒの共存下ＲＰＭＩ１６４０で培養した。次に、９６ウエルＵ底マイクロプレートに、５１Ｃｒでラベルされた標的細胞（１×１０４）とエフェクター細胞とを１：５の割合で混合し、２０ｎＭのコンカナマイシン（以下「ＣＭＡ」という）の存在又は非存在下、各々１０μｇ／ｍｌのＮ２Ｂ２及び／又はＭＦＬ２を添加し、８時間インキュベートした。その無細胞上清を集めてγ−チューブに移し、γ−カウンターで放射能を測定し、遊離５１Ｃｒの測定を行った。
【００４０】
ＣＭＡで前処理した不活性化パーフォリンを、パーフォリンの関与を評価するのに用い、ＦａｓＬ耐性の標的細胞（ＹＡＣ−１）やＴＲＡＩＬ耐性の標的細胞（Ｂ１６）等に対する、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１８ブラストの細胞障害活性を調べた。結果を図９に示す。図９からわかるように、ＩＬ−２やＩＬ−１５で活性化されたブラストの細胞障害活性はＣＭＡ処理によりほとんど完全に阻害され、パーフォリンの関与を明らかに示した。これに対し、Ｂ１６に対するＩＬ−１８ブラストの細胞障害活性はＣＭＡ処理によりほとんど完全に阻害されたが、ＹＡＣ−１に対してはＣＭＡ、あるいは、ＣＭＡとＭＦＬ２及び／又はＮ２Ｂ２との組み合わせの場合であっても、完全に抑制することができなかった。これらのことから、パーフォリン、ＦａｓＬ又はＴＲＡＩＬに依存しない他の細胞障害経路の存在が示唆された。また、ＦａｓＬ感受性でＴＲＡＩＬ耐性のＰ８１５に対する、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１８ブラストの細胞障害活性を、ＣＭＡはほとんど阻害し、ＭＦＬ２との組み合わせでは完全に阻害した。このことは、Ｐ８１５に対する細胞障害活性にパーフォリンは重要で、ＦａｓＬは重要でないことを示している。ＴＲＡＩＬ又はＦａｓＬに敏感なＬ９２９では、ＣＭＡはただＩＬ−２ブラストとＩＬ−１５ブラストの細胞障害活性を一部阻害し、ＣＭＡとＭＦＬ２又はＮ２Ｂ２と組み合わせることでより阻害することができた。さらに、ＣＭＡと２つの抗体を組み合わせることでほとんど完全に阻害できることがわかった。
【００４１】
これらの結果は、パーフォリンやＦａｓＬに加えてＴＲＡＩＬが、Ｌ９２９に対するＩＬ−２又はＩＬ−１５ブラストの細胞障害活性に関係することを示している。これに対して、ＣＭＡとＭＦＬ２との組み合わせは、Ｎ２Ｂ２の非存在下でＬ９２９に対してＩＬ−１８ブラストの細胞障害活性を完全に阻害することから、ＩＬ−１８ブラストの細胞障害活性は、パーフォリン及びＦａｓＬに依存し、ＴＲＡＩＬに非依存性であることがわかった。
【００４２】
次に、ＮＫ細胞とＴ細胞の２つの個体群においてエフェクターのメカニズムを調べるため、Ｌ９２９に対してこれらエフェクター細胞の細胞障害活性を、上記と同様にＣＭＡ、ＣＭＡとＭＦＬ２及び／又はＮ２Ｂ２の存在下あるいは非存在下で調べてみた。結果を図１０に示す。これらの結果から、ＩＬ−２で刺激されたＮＫ細胞は、Ｔ細胞より十分高い細胞障害性を示し、ＣＭＡ、Ｎ２Ｂ２及びＭＦＬ２の組み合わせは、Ｌ９２９に対してＩＬ−２で刺激されたＮＫ細胞の細胞障害活性を完全に阻害することがわかった。これに対して、Ｎ２Ｂ２はＩＬ−２で刺激されたＴ細胞の細胞障害の阻害に必要とされないことがわかった。また、ＩＬ−１５ブラストでも同様な結果を得た。これらの結果から、ＩＬ−２又はＩＬ−１５で刺激されたＮＫ細胞では機能的にＴＲＡＩＬを発現するが、Ｔ細胞では発現しないことが明らかとなった。
【００４３】
【発明の効果】
本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を使用することで、インビトロ又はインビボでの種々のＴＲＡＩＬ機能の解析が可能となり、ＴＲＡＩＬの生理的役割及び病理的役割を解明することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】トランスフェクタントにおけるマウスＴＲＡＩＬの発現をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す図である。
【図２】標的腫瘍細胞に対するマウスＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬ発現細胞の細胞障害活性を示す図である。
【図３】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体と細胞表面マウスＴＲＡＩＬとの結合を示すフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。
【図４】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体によるマウスＴＲＡＩＬの細胞障害活性抑制の結果を示す図である。
【図５】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を用いたサイトカイン未活性化リンパ球におけるＴＲＡＩＬの発現結果を示す図である。
【図６】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を用いたサイトカイン活性化リンパ球におけるＴＲＡＩＬの発現結果を示す図である。
【図７】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を用いたＩＬ−２活性化ＮＫ細胞におけるＴＲＡＩＬ発現の経時変化を示す図である。
【図８】各種標的腫瘍細胞に対するサイトカイン活性化リンパ球のＬＡＫ活性を示す図である。
【図９】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を用いたサイトカイン活性化リンパ球の腫瘍細胞に対する細胞障害におけるＴＲＡＩＬの関与を示す図である。
【図１０】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を用いたサイトカイン活性化リンパ球の腫瘍細胞Ｌ９２９に対する細胞障害におけるＴＲＡＩＬの関与を示す図である。
Claims (6)
- 非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに対して特異的に反応し、非ヒト動物由来のＦａｓリガンドや非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子に対して交差反応せず、かつ、該非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの細胞障害活性を完全に阻害するモノクローナル抗体の製造方法であって、非ヒト動物由来ＴＲＡＩＬのｃＤＮＡを該非ヒト動物と同種の株化細胞にトランスフェクションして形質転換細胞を調製し、該形質転換細胞で免疫した異種の非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と同種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養することを特徴とする抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法。
- 非ヒト動物が齧歯類動物であることを特徴とする請求項１記載の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法。
- 齧歯類動物として、マウスとラットを用いることを特徴とする請求項２記載の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法。
- 株化細胞が、マウスＢリンパ腫２ＰＫ−３細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法。
- マウス由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに対して特異的に反応し、マウス由来のＦａｓリガンドやマウス由来の腫瘍壊死因子に対して交差反応せず、かつ、該マウス由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの細胞障害活性を完全に阻害することを特徴とする抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体。
- 請求項５記載の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を有効成分として含有することを特徴とするＴＲＡＩＬ機能解析用試薬。
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