WO2006109533A1 - 細胞膜表面抗原エピトープに対する抗体の作製法及びアッセイ法 - Google Patents

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WO2006109533A1
WO2006109533A1 PCT/JP2006/306001 JP2006306001W WO2006109533A1 WO 2006109533 A1 WO2006109533 A1 WO 2006109533A1 JP 2006306001 W JP2006306001 W JP 2006306001W WO 2006109533 A1 WO2006109533 A1 WO 2006109533A1
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animal
cell
antibody
cell membrane
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PCT/JP2006/306001
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Susumu Uchiyama
Kiichi Fukui
Yasuhiko Suzuki
Masami Yokoyama
Sadakazu Usuda
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Osaka University
Tottori University
Biomedics Inc.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a monoclonal antibody against a cell membrane surface antigen (extracellular domain of cell membrane antigen).
  • the present invention also relates to a method for screening or screening for an antibody that binds to a cell membrane surface antigen.
  • receptors and adhesion molecules are not always easy to prepare as antigens due to their properties and expression patterns.
  • cell membrane antigen molecules often form a complex rather than a monomer, and many cases have been reported that function in cooperation with other membrane molecules.
  • CD3 / TCR, CDlla / CD18, CD49b / CD29, etc. Therefore, in order to produce a monoclonal antibody that recognizes the three-dimensional structure of the epitope that is presented in the natural state, it is not appropriate to use a molecule prepared by genetic recombination using E. coli or yeast as the antigen. It may not be.
  • cell membrane antigens are not transmembrane, but the extracellular domain is also insoluble or difficult to dissolve, and their three-dimensional structure is only in a neutral state on the cell membrane surface of animal cells.
  • the power to be presented is also unknown.
  • CD20, Fc ⁇ RI and MDR1 are considered to correspond to these.
  • Non-patent Document 5 It is well known that it has become extremely difficult to obtain antibody-producing clones that use force (Non-patent Document 5).
  • the expression level of the target antigen on the cell membrane surface is often insufficient, and the cells are heterologous to the commonly used immunized animal (mouse or rat). Therefore, since the whole cell including the cell membrane antigen has antigenicity, it is often impossible to obtain a sufficient immune response against the target antigen.
  • Non-patent literature 1 Francois Baneyx (Editor), Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, BIOS Scientific Publishers, April 1, 2004 .; Barry Steven Selinsky (Editor), Membrane Protein Protocols: Expression, Purification, and Charac terization. , Methods in Molecular Biology, V.228, Clifton, NJ, June 1, 2003
  • Non-Patent Document 2 Julie PD et al., Imminol 2002; 107: 176-82
  • Non-Patent Document 3 Maria J. Polyak and Julie P. Deans, Studies of Existing CD Molecules: 93-95
  • Non-Patent Document 4 MS Cragg et al., Studies of Existing CD Molecules: 95- 97
  • Non-Patent Document 5 Anderson KC et al., Blood 1984; 63: 1424-33, Data Sheet: FITC label ed CD20, Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a hybridoma that produces a monoclonal antibody against a cell membrane surface antigen, and a method for producing a monoclonal antibody against a cell membrane surface antigen using the hybridoma.
  • Another subject of the present invention is a method for measuring the affinity of an antibody that binds to a cell membrane surface antigen, and an antibody that binds to a cell membrane surface antigen using the measurement method. Is to provide a way to Means for solving the problem
  • the present inventors have found that the antibody is known to be useful as a pharmaceutical in a specific combination immunization method. It was found that a monoclonal antibody that competes with c2B8 can be obtained. According to the immunization method, it has been found that the proportion of clones that produce antibodies against the target cell membrane surface antigen among the obtained clones significantly increases. It was also found that the binding affinity between a cell membrane surface antigen and an antibody against it can be measured with high sensitivity by a simple assembly method using a secondary antibody labeled with a fluorescent dye. The present invention has been completed based on these findings.
  • the present invention relates to the following.
  • a method for producing a hyperidoma that produces a monoclonal antibody that recognizes an epitope of an extracellular domain of a cell membrane antigen comprising immunizing an immunized animal multiple times, wherein at least one immunization
  • the immunized animal that expresses the antigen as a sensitizing antigen is immunization using a cell line derived from an animal belonging to another eye, and at least one immunization is carried out by genetic modification as a sensitizing antigen.
  • a positive ij ′ method characterized in that the immunization is carried out using a cell line derived from an animal belonging to the same species as the immunized animal, wherein the antigen is expressed on the surface of the cell membrane.
  • Each of a plurality of immunizations expresses the antigen as a sensitizing antigen, the immunized animal uses a cell line derived from an animal belonging to another eye, or a sensitizing antigen as a gene
  • an immunized animal that includes primary immunization, booster immunization, and final immunization, and the primary immunization and booster immunization express the antigen as a sensitizing antigen at least once Immunization using a cell line derived from an animal belonging to another eye and at least one immunization are the same as those of an immunized animal in which the antigen is expressed on the cell membrane surface by genetic recombination as a sensitizing antigen.
  • the method according to (2) wherein one of the immunizations using a cell line derived from an animal belonging to the eye is used, and the final immunization is the other.
  • the immunized animal is a rodent animal, and the cell line derived from the animal belonging to the same order as the immunized animal is a CHO cell, NSO cell, or SP2 / o cell (1) to The method according to any one of (7).
  • the antibody to be measured is bound to a floating cell presenting the antigen on the cell membrane surface, (b) the antibody to be measured bound to the cell membrane surface antigen of the cell is separated from the free antibody to be measured, c) binding to the antibody to be measured bound to the cell membrane surface antigen of the cell with a labeled substance that binds to the antibody to be measured at a site different from the antigen recognition site of the antibody to be measured; Separating the substance bound to the antibody to be measured bound to the cell membrane surface antigen of the cell from the free substance, and (e) detecting the label of the substance between the antibody to be measured and the cell membrane surface antigen.
  • a method for measuring binding affinity wherein the separation of (b) and (d) is performed by centrifugation or a filter that does not allow cells to pass through, respectively.
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody against a cell membrane surface antigen can be efficiently produced.
  • Hypridoma that produces monoclonal antibodies can also be produced.
  • by producing such a nopriposome a large amount of monoclonal antibodies against cell membrane surface antigens can be prepared.
  • the affinity of an antibody for a cell membrane surface antigen can be measured with high sensitivity, and a method for assaying or screening an antibody using this can also be provided.
  • the measurement method of the present invention is particularly suitable for measuring the affinity of a monoclonal antibody that binds to a cell membrane surface antigen or a natural epitope of its extracellular domain, which is difficult to measure the binding affinity by a general method. Yes.
  • FIG. 1 shows the structure of a protein expression vector pNOW.
  • FIG.2 Shows the measurement result by the image analyzer (half-tone image).
  • Pabgh Growth hormone gene polyA addition signal
  • Psvd Modified SV40 promoter
  • DHFR mouse dihydrofolate reductase cDNA
  • Pasv Carosignal with SV40 gene polyA
  • PBR322ori Origin of replication in E. coli
  • Amp r Selectable marker in E. coli (ampicillin resistance)
  • Neo r Selectable marker in mammalian cells (G418 resistance) BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the method for producing a hyperidoma of the present invention is a method for producing a yipridoma that produces a monoclonal antibody that recognizes an epitope of an extracellular domain of a cell membrane antigen, comprising immunizing an immunized animal multiple times, At least one immunization is an immunization using a cell line derived from an animal belonging to another eye that expresses the antigen as a sensitizing antigen, and at least one immunization.
  • the sensitizing antigen is characterized by immunization using a cell line derived from an animal belonging to the same species as the immunized animal, which is expressed on the cell membrane surface by genetic recombination.
  • the method of preparing the hyperidoma of the present invention may be the same as the method of preparing a hyperidoma that produces a normal monoclonal antibody, except that immunization of the immunized animal is performed in the specific manner described above.
  • Hybridomas producing monoclonal antibodies usually have (1) immunization of the immunized animal, (2) preparation of immunized animal lymphocytes, (3) preparation of parental cells, (4) lymphocytes and parent Made by cell fusion of cells, (5) screening and clawing. Details of each of these steps are described in, for example, Ailsa M. Campbell (Author), Toshiaki Osawa (translation) Biochemical Experimental Method Monoclonal Antibody, Tokyo Chemical Dojin, 1989.
  • the animal to be immunized is not particularly limited, but is preferably an animal that is generally used for production of antibodies.
  • Examples of such animals include rodent animals, and more specifically, mice, rats, hamsters and the like.
  • Immunization of an immunized animal is usually performed by performing injection (immunization) of a sensitizing antigen a plurality of times.
  • the immunization conditions such as the number of immunizations, the interval between immunizations, and the injection amount of the sensitizing antigen are the same as in the normal method except that the immunization of the immunized animal is performed in the specific manner described above. It's okay.
  • the first immunization is called the first immunization
  • the last immunization is called the final immunization (boost)
  • the immunization after the first immunization before the final immunization is called the booster immunization. Is selected.
  • immunization using a cell line derived from an animal belonging to another eye is used as an immunized animal, which expresses the antigen as an immunization antigen at least once. And at least one immunization is performed as a sensitizing antigen by genetic recombination.
  • the order is not limited as long as it is an immunization using a cell line derived from an animal belonging to the same species as the immunized animal in which the antigen is expressed on the cell membrane surface.
  • a cell line derived from an animal belonging to another eye is referred to as an immunized animal in which each of a plurality of immunizations expresses the antigen as a sensitizing antigen.
  • the immunization includes primary immunization, booster immunization, and final immunization, and the primary immunization and booster immunization express the antigen as a sensitizing antigen at least once.
  • Immunization using a cell line derived from an animal belonging to the eye and at least one immunization belongs to the same species as the immunized animal in which the antigen is expressed on the cell membrane surface by genetic recombination as a sensitizing antigen It is preferable that one of the immunizations using a cell line derived from an animal and the final immunization be the other.
  • the cell membrane antigen is not particularly limited, and examples thereof include CD20, TNFR (tumor necrosis factor receptor), and TGF- ⁇ (tumor growth factor) receptor.
  • the cell membrane antigen is preferably a molecule expressed in normal animal cells or linear animal cell lines. Examples of normal animal cells or linearized animal cell lines that express cell membrane antigens include leukocytes.
  • the hyperidoma of the present invention it was difficult to produce a monoclonal antibody by the conventional method.
  • the cell membrane antigen is a transmembrane molecule, or an extracellular domain presenting an epitope of the cell membrane antigen. Even when is an insoluble or soluble antigen that is difficult to dissolve, it is possible to prepare a hyperidoma that produces a monoclonal antibody against such an antigen.
  • a cell line derived from an animal belonging to another eye is not particularly limited as long as it expresses a target cell membrane antigen, and is selected according to the immunized animal to be used.
  • a human-derived cell line can be used.
  • the cell membrane antigen is CD20
  • examples of the human-derived cell line include SB cells and Raji cells.
  • An immunized animal is a cell membrane antigen in a cell line derived from an animal belonging to another eye.
  • 10 7 It is desirable that at least several grams of antigen be present in the cells.
  • Cell lines derived from an animal belonging to the same species as the immunized animal in which the target cell membrane antigen is expressed on the cell membrane surface by gene recombination are particularly limited as long as the target cell membrane antigen is expressed. Rather, it is selected according to the immunized animal used. For example, when the immunized animal is a rodent animal, CHO cells, NSO cells, SP2 / o cells and the like can be mentioned.
  • the expression density of the cell membrane antigen on the cell membrane surface of a cell line derived from an animal belonging to the same species as the immunized animal is high.
  • an expression cell is stained with a FITC-labeled monoclonal antibody, It is preferable to detect fluorescence intensity more than 5 times that of cells with antigen.
  • recombinant CHO cells expressing CD20 can present an overwhelmingly larger amount of CD20 molecules on the cell surface than natural B cell lines and are effective as immunogens. .
  • CD20 / CHO recombinant CHO cells expressing CD20
  • DAKO FITC-labeled anti-CD20 monoclonal antibody
  • the present invention also provides a method for producing a monoclonal antibody, characterized in that the hybridoma produced by the method for producing a hyperidoma of the present invention is used.
  • the method for producing a monoclonal antibody using a hybridoma is the same as that for producing a monoclonal antibody except that the hybridoma produced by the hybridoma production method of the present invention is used. Good. In the case of mass production, methods such as cell culture and mouse ascites can be mentioned.
  • the affinity measurement method of the present invention comprises: (a) binding a measured antibody to a floating cell that presents the antigen on the cell membrane surface; and (b) free antibody and a measured antibody bound to the cell membrane surface antigen of the cell. (C) a substance that binds to the antibody to be measured at a site different from the antigen recognition site of the antibody to be measured and bound to the cell membrane surface antigen of the cell. (D) separating the substance bound to the antibody to be measured bound to the cell membrane surface antigen of the cell and the free substance, and (e) detecting the label of the substance.
  • the affinity measurement method of the present invention uses floating cells that present an antigen on the cell membrane surface, and is a substance that binds to the antibody to be measured at a site different from the antigen recognition site of the antibody to be measured and is labeled
  • the affinity between the antigen and the antibody is measured, except that the substance is separated and the bound and free substances are separated (B / F separation) by centrifugation or using a filter that does not allow cells to pass.
  • the amount of floating cells is preferably about 5 ⁇ 10 5 per tube in this measurement system. It is also possible to measure using a secondary antibody without directly labeling the antibody with RI.
  • the substance that binds to the antibody to be measured at a site different from the antigen recognition site of the antibody to be measured includes an antibody to the antibody to be measured (for example, an antibody to the Fc site), protein A, protein G, and the like. It is done.
  • the label include fluorescent substances and magnetic beads.
  • the separation method is preferably the same.
  • the cells to be used are not particularly limited as long as they are floating cells that present the target antigen on the cell membrane surface, but should be normal animal cells, lined animal cell lines, or genetically engineered animal cell lines. Is preferred. Examples of such cells include Raji cells when the antigen is CD20.
  • Specific examples of the procedure include the following. (1) After reacting floating cells with mouse monoclonal antibody (primary antibody), (2) removing the free (free) primary antibody by washing and centrifuging, and (3) reacting with fluorescently labeled anti-mouse secondary antibody (4) The free secondary antibody is removed by washing and centrifuging, and then (5) the fluorescence of the secondary antibody bound to the cell via the primary antibody is measured with a fluorescence image analyzer. (6) Prepare a calibration curve by measuring the concentration and the amount of fluorescence for the fluorescently labeled secondary antibody used, and calculate the amount of secondary antibody bound by converting the measured value to the concentration. Free by pulling The amount of antibody is calculated.
  • An example of a more specific procedure includes a method including the steps described below.
  • a monoclonal antibody that binds to a cell membrane surface antigen can be assembled, or a monoclonal antibody that binds to a cell membrane surface antigen can be screened.
  • the assay and screening methods use a conventional affinity measurement method to prepare monoclonal antibodies that bind to cell membrane surface antigens. It may be the same as the method and the method of screening a monoclonal antibody that binds to a cell membrane surface antigen.
  • the immunized animal expressing the antigen is A cell line derived from an animal belonging to another eye
  • a cell of the same species or a related species a cell derived from an animal belonging to the same species as the immunized animal in which the antigen is expressed on the cell membrane surface by genetic recombination
  • the combination of strains increases the immunogenicity of the target molecule alone, thus increasing the proportion of hybridomas that produce monoclonal antibodies specific for the target molecule.
  • antibody c2B8 Since antibody c2B8 is known to be useful as a pharmaceutical, it is thought that it recognizes an epitope that is in a neutral state so that it can be divided. Monoclonal antibody that competes with this antibody in the binding reaction with CD20 The fact that a large number of clones that produce the protein are obtained suggests that the target molecule in the method of the present invention is in a natural state. This advantage is particularly effective when the three-dimensional structure of the epitope on the target molecule cannot be reproduced by a general antigen preparation method.
  • a general antigen preparation method is a method in which cells expressing an antigen molecule are lysed and the antigen is separated and purified.
  • the three-dimensional structure of the antigen in the natural state seems to be reproducible by expressing the antigen on the cell surface. Simply using the cells expressing such an antigen on the cell surface as the antigen, It is difficult to obtain monoclonal antibodies. By using the specific combination immunity as described above, it is considered that the target monoclonal antibody can be obtained at a practical rate even in such a case.
  • SB cells or Raji cells were cultured using RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS.
  • CD20 / CHO cells were cultured using CHO-S-SFM II medium (GIBCO, Cat. No. 12052-098) supplemented with 800 g / ml of G418. After centrifuging these cultures (1100 rpm, 5 minutes), Dulbecco's PBS (-) was suspended in the cells, and the cells were centrifuged again. This washing operation was repeated once more, and a suspension prepared by adding physiological saline to cells (the number of cells per ml was 1 to 3 ⁇ 10 7 ) was used for immunization.
  • All of the immunogen preparations were administered intraperitoneally to 7-11 week old Balb / c female mice.
  • the immunogen combinations used are shown in Table 1. Any one of SB cells, Raji cells or CD20 / CHO cells was repeatedly administered 2 to 3 times at various days intervals, and then different cells were administered for the final immunization. The number of cells administered was 1 to 3 ⁇ 10 7 cells per mouse.
  • mice Three days after the final immunization, spleen cells of two mice were also prepared, and the mouse myeloma (NS-1) was carried out in the presence of PEG-1500.
  • the method was according to Oi.VT and A. Herzenber g, 1980, in: Selected Methods in ellular Immunology, eas.B. Mishell and SM Shng i (Freeman and Co. San Francisco, CA) p.351. .
  • Cell ELISA was performed using 96 well plates to which CD20 / CHO cells or CHO cells (parent strain) were attached, and wells producing antibodies that specifically react with CD20 were selected. Furthermore, using the 96-well plate to which the same CD20 / CHO cells were attached, the antibody c2B8 (human 'mouse chimeric antibody prepared from the anti-CD20 mouse monoclonal antibody 2B8) is known to be useful as a pharmaceutical product. The antibodies (wells) that react in a similar manner to the c2B8 epitope were selected.
  • 150 ⁇ l of blocking solution (0.2% -gelatine, 0.5% BSA in PBS) was added and allowed to stand at 37 ° C for 1 hour.
  • 100 1 sample (diluted culture supernatant) was placed in each well and the primary reaction was performed at 37 ° C for 1 hour. .
  • a mixed solution of a sample (diluted culture supernatant) and a chimeric antibody (10 to 40 ng / ml) was prepared. After blocking reaction in the same manner as in the above Cell ELISA, this mixed solution was added to each well at 100 / zl, and the primary reaction was performed at 37 ° C for 1 hour. After washing, dilute the labeled antibody (HRP-labeled anti-human IgG (H + L) Usagi antibody (Jackson Lab. Code No. 309-035-082)) into each well at 100 / zl and perform the secondary reaction at 37 ° C for 1 hour. After washing, apply color developing solution (OPD) to each well 30 ⁇ l after addition of 100 ⁇ l, 50 ⁇ l of 4 ⁇ ⁇ -SO was added to stop the reaction, and A492 was measured.
  • HRP-labeled anti-human IgG (H + L) Usagi antibody Jackson Lab. Code No. 309-035-082
  • the limiting dilution method was used.
  • the cells were plated on a 96-well plate and cultured, and cell ELISA was performed on the culture supernatant of one colony well to select a clone producing a specific antibody.
  • Table 1 shows the immunization method, the results of screening for hybridomas obtained by the immunization method, and the competitive reaction with c2 B8.
  • CD20 / CHO cells 3 times Raji cells ⁇ Number of selected wells— A: Responds to CD20 / CHO cells. Produces rods that do not respond to CHO cells.
  • Number of selected wells B Out of the number of selected wels A, those that produced antibodies that exhibited a competitive anti-K against the control antibody.
  • CHO cells CDs derived from animals belonging to the same order as mice that expressed CD20 by gene recombination with human-derived cells (SB cells or Raji cells) (20 / CHO cells) combined with both immunizations, it is clear that cell fusion produces more cells producing specific antibodies against CD20 compared to immunization with human-derived cells alone. I helped. In addition, among the selected clones, there were many clones that produced antibodies that showed a competitive reaction with the control antibody c2B8.
  • a suspension cell Raji derived from a human B cell line expressing the antigen of interest on the cell surface and a suspension cell Jurkat derived from a human T cell line were used as cells that express the CD20 antigen.
  • RPMI1640 Nakarai, Cat. In a medium supplemented with sardine 56 degrees 30 minutes
  • the number of cells was measured using a Burker-Turk hemocytometer (catalog No. 03-303-1, Kuruma Sales Co., Ltd.).
  • the washed cells were suspended in 1% BSA (Wako Cat No. 013-07492 Lot PKH3483) -PBS solution, and the cell density was adjusted to 5xl0 6 cells / ml.
  • test antibody or a positive control antibody As a primary antibody, a test antibody or a positive control antibody (2B8) 15, 30, 50, 75, 100, 1 25, 150, 200 ng (1.5 to 5 1) each, 1.5 ml tube (BM equipment, BM) Distribute into ring lock tube Cat.No.BM-15) and prepare 4 tubes without antibody at the same time. Three samples were prepared for each test antibody. The suspension was added with 1% BSA (Wako Cat No. 013-07492 Lot PKH3483) -PBS solution at 100 1 (5xl0 5 cells) at a time, and the mixture was shaken at room temperature for 1 hour.
  • BSA Wi-A-PBS solution
  • the cells thus obtained were suspended in 100 ⁇ l PBS and transferred to 96-well flat bottom plates (Sumitomo Bakelite E LISA PLATE Cat. No. 8496F).
  • the amount of fluorescence of the secondary antibody was measured using Typhoon9210 image Nafisa (Amersnam Bioscience) under the detection conditions of Fluorescense mode, 600v, 526SP / g reen (532 nm), Focus bottom surface +3 mm.
  • PBS solution 1001 supplemented with 0, 12.5, 25, 50, 75, 100, 125, 150 ng of FITC-labeled secondary antibody was used as a control for preparing a calibration curve.
  • a calibration curve is created by measuring the amount of fluorescence at each concentration of FITC-labeled secondary antibody used as a control, and the amount (molar number or weight) of secondary antibody bound to the cell is determined. It was. Assuming that each primary antibody and FITC-labeled secondary antibody reacted at a ratio of 1: 2, the amount of primary antibody bound was calculated. The amount of free primary antibody was also determined by subtracting the amount of binding from the amount of added antibody. When the antibody concentration was converted to molar concentration, the molecular weight of the monoclonal antibody was set to 150,000.
  • the total amount [L total] of the ligand used is the sum of the free form and that bound to the receptor.
  • the total amount [R total] of the receptor is the sum of those not bound to the ligand and those bound to the ligand.
  • the number of receptors [R total] (maximum binding amount of test antibody) and affinity between the receptor and the ligand are estimated by Scatchard analysis. If the above formulas ⁇ , ⁇ , ⁇ are transformed and substituted,
  • [LR] is represented by B (bound)
  • [L] is represented by 7 (free)
  • [R total] is represented by B max (constant).
  • Fig. 2 shows the image of the image analyzer
  • Fig. 3 shows the saturation curve
  • Fig. 4 shows the results of the Scatchyard analysis.
  • Kd value was determined from the slope of the linear function obtained from the above-mentioned Scatchyard analysis. Similar experiments were repeated, and the Kd values (average) obtained were as follows.
  • the antibody 2B8 used as a positive control had a Kd value of 6.8 nM. Mit Since the Kd value of 2B8 reported in chell ER et al., Blood 1994; 82: 435-445 is 3.5 nM, an approximate Kd value was also obtained by the affinity measurement method of the present invention.

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Abstract

　本発明は、細胞膜表面抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製法およびそのハイブリドーマを用いる細胞膜表面抗原に対するモノクローナル抗体の作製法、ならびに、細胞膜表面抗原に対して結合する抗体の親和性を測定する方法、および、その測定方法を利用して、細胞膜表面抗原に対して結合する抗体をアッセイまたはスクリーニングする方法を提供する。抗体の作製のための免疫において、感作抗原として、該抗原を発現する、被免疫動物とは他の目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫と、感作抗原として、遺伝子組換により細胞膜表面上に該抗原を発現させた、被免疫動物と同目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫とを組み合わせる。抗原と抗体との親和性の測定において、抗原を細胞膜表面に提示する浮遊細胞を用いるとともに、B/F分離を遠心分離又は細胞を通さないフィルターにより行う。

Description

明 細 書
細胞膜表面抗原ェピトープに対する抗体の作製法及びアツセィ法 技術分野
[0001] 本発明は、細胞膜表面抗原 (細胞膜抗原の細胞外ドメイン）に対するモノクローナ ル抗体の作製法に関する。また、細胞膜表面抗原に対して結合する抗体をアツセィ またはスクリーニングする方法に関する。
背景技術
[0002] サイト力イン、モノ力インある!/、は細胞膜からの遊離抗原と!/ヽつた可溶性の抗原は大 腸菌などを宿主として遺伝子組換により調製されるのが一般的であり、糖鎖を含む一 部の抗原タンパクについては CHO細胞などのげつ歯類由来動物細胞を宿主として 遺伝子組換により生産される。一方、受容体や接着分子などの細胞膜上に発現する 分子は、不溶性の膜貫通部分を有するため分子全体を培養細胞から分離精製する 力または細胞外ドメインを遺伝子組換により調製するのが一般的である。（非特許文 献 1)
[0003] し力しながら、受容体や接着分子はその性状や発現様式により、その抗原としての 調製が必ずしも容易ではないものがある。例えば、細胞膜抗原分子は、単量体では なく複合体を形成することが多ぐまた他の膜分子と連携してその機能をはたす事例 が多数報告されている。例えば、 CD3/TCR、 CDlla/CD18、 CD49b/CD29などであ る。従って、ナチュラルな状態で提示される抗原のェピトープゃ立体構造を認識する モノクローナル抗体を作製するためには、大腸菌や酵母を宿主とした遺伝子組換で 調製された分子を抗原として用いる方法では適当ではないかも知れない。また、こう した細胞膜抗原には膜貫通部分ばカゝりでなく細胞外ドメインも不溶性または可溶ィ匕し 難いものがあり、その立体構造は動物細胞の細胞膜表面にあってはじめてナチユラ ルな状態と同様に提示される力も知れない。例えば、 CD20, Fc ε RIや MDR1がこれら に該当すると思われる。
[0004] 細胞膜表面抗原の特定のェピトープに対する抗体作製が困難であることは知られ て 、る。例えば CD20抗原の細胞外ドメインは不溶性でありアポトーシスのシグナル誘 導に関与するェピトープを有していることが判っている力 多くの文献によりこのェピト ープを認識する高親和性の特異抗体を得ることは非常に難 、とされて 、る (非特許 文献 2,非特許文献 3,非特許文献 4)。このため、 Rituxan (商標）のオリジンであるマ ウス抗体 2B8はヒト B細胞である SB細胞株を免疫して得られたものであり、 2H7はやは りヒト B細胞株である 6.16cl.3を用いたものである力 抗体産生クローンを得ることが困 難を極めたことはよく知られているところである (非特許文献 5)。これらのヒト細胞株を 免疫原として用いるには、細胞膜表面における目的抗原の発現量が充分ではないこ とが多ぐかつ通常に用いられる被免疫動物（マウスまたはラット）に対して異種細胞 であるために細胞膜抗原を含み細胞全体が抗原性を有することから、目的抗原に対 する充分な免疫応答が得られな ヽことも多 ヽ。
非特干文献 1： Francois Baneyx (Editor), Protein Expression Technologies: Current Status and Future Trends, BIOS Scientific Publishers, April 1, 2004.； Barry Steven Selinsky (Editor), Membrane Protein Protocols: Expression, Purification, and Charac terization., Methods in Molecular Biology, V.228, Clifton, N.J., June 1, 2003 非特許文献 2 : Julie P.D. et al., Imminol 2002; 107:176-82
非特許文献 3 : Maria J. Polyak and Julie P. Deans, Studies of Existing CD Molecules: 93-95
非特許文献 4 : M. S. Cragg et al., Studies of Existing CD Molecules:95- 97 非特許文献 5 : Anderson KC et al., Blood 1984; 63:1424-33, Data Sheet: FITC label ed CD20, Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
本発明の課題は、細胞膜表面抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブ リドーマの作製法およびそのハイプリドーマを用いる細胞膜表面抗原に対するモノク ローナル抗体の作製法を提供することである。また、本発明の別の課題は、細胞膜 表面抗原に対して結合する抗体の親和性を測定する方法、および、その測定方法を 利用して、細胞膜表面抗原に対して結合する抗体をアツセィまたはスクリーニングす る方法を提供することである。 課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、 CD20抗原を認識する抗体を作製するための免疫方法について試 行錯誤を重ねたところ、特定の組み合わせ免疫の方法で、医薬として有用なことが知 られている抗体 c2B8と競合反応するモノクローナル抗体が得られることを見出した。 その免疫方法によれば、得られるクローンのうち、目的とする細胞膜表面抗原に対す る抗体を産生するクローンの割合が顕著に増加することが判明した。また、蛍光色素 で標識した 2次抗体を用いた簡便なアツセィ方法によれば、細胞膜表面抗原とそれ に対する抗体との結合親和性を高感度で測定できることが判明した。本発明は、これ らの知見に基づき、完成されたものである。
[0007] 本発明は、以下のものに関する。
( 1)被免疫動物に複数回免疫することを含む、細胞膜抗原の細胞外ドメインのェピト ープを認識するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを作製する方法であつ て、免疫の少なくとも 1回は、感作抗原として、該抗原を発現する、被免疫動物とは他 の目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫であり、かつ、免疫の少なくとも一 回は、感作抗原として、遺伝子組換により細胞膜表面上に該抗原を発現させた、被 免疫動物と同目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫であることを特徴とす る、肯 ij '己方法。
(2)複数回の免疫のそれぞれが、感作抗原として、該抗原を発現する、被免疫動物 とは他の目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫、または、感作抗原として、 遺伝子組換により細胞膜表面上に該抗原を発現させた、被免疫動物と同目に属する 動物に由来する細胞株を用 Vヽる免疫である ( 1 )記載の方法。
(3)初回免疫、追加免疫、及び、最終免疫を行うことを含み、初回免疫及び追加免 疫が、免疫の少なくとも 1回は、感作抗原として、該抗原を発現する、被免疫動物とは 他の目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫、及び、免疫の少なくとも一回 は、感作抗原として、遺伝子組換により細胞膜表面上に該抗原を発現させた、被免 疫動物と同目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫のいずれか一方であり、 最終免疫が他方である（2)記載の方法。
(4)細胞膜抗原が正常動物細胞またはラインィ匕した動物細胞株に発現する分子であ る（1)〜（3)の 、ずれか 1項記載の方法。
(5)細胞膜抗原を発現する正常動物細胞またはラインィ匕した動物細胞株が白血球で ある (4)記載の方法。
(6)細胞膜抗原が膜貫通型分子である（1)〜 (4)の 、ずれか 1項に記載の方法。
(7)細胞膜抗原のェピトープを提示する細胞外ドメインが不溶性または可溶ィ匕し難!ヽ 抗原である（1)〜（5)の 、ずれか 1項に記載の方法。
(8)被免疫動物がげつ歯目の動物であり、被免疫動物と同目に属する動物に由来す る細胞株が CHO細胞、 NSO細胞、または、 SP2/o細胞である（1)〜（7)のいずれか 1 項に記載の方法。
(9) (1)〜（8)の 、ずれか 1項の方法により作製されたノ、イブリドーマを用いることを 特徴とするモノクローナル抗体の作製方法。
(10) (a)該抗原を細胞膜表面に提示する浮遊細胞に被測定抗体を結合させ、 (b) 該細胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体と遊離の被測定抗体を分離し、 (c )該細胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体に、被測定抗体の抗原認識部位 とは異なる部位で被測定抗体に結合する物質であって標識された物質を結合させ、 (d)該細胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体に結合した該物質と、遊離の 該物質を分離し、（e)該物質の標識を検出することを含む、被測定抗体と細胞膜表 面抗原との結合親和性を測定する方法であって、（b)及び (d)の分離を、それぞれ、 遠心分離又は細胞を通さないフィルタ一により行うことを特徴とする前記方法。
(11) (b)及び (d)の分離を、遠心分離により行う（10)に記載の方法。
(12) (b)及び (d)の分離を、細胞を通さないフィルタ一により行う（10)に記載の方法
(13)細胞が正常動物細胞、ライン化した動物細胞株または遺伝子操作された動物 細胞株である（10)〜（12)のいずれか 1項に記載の方法。
(14) (10)〜（13)のいずれか 1項に記載の方法を利用して細胞膜表面抗原に対し て結合するモノクローナル抗体をアツセィする方法。
(15) (10)〜（13)のいずれか 1項に記載の方法を利用して細胞膜表面抗原に対し て結合するモノクローナル抗体をスクリーニングする方法。 発明の効果
[0008] 本発明のハイプリドーマ作製法によれば、細胞膜表面抗原に対するモノクローナル 抗体を産生するハイブリドーマを効率よく作製することができる。特に、従来は抗体を 作製することが困難であるとされて 、た、分離精製や単なる遺伝子組換のみではナ チュラルな立体構造提示が困難な不溶性または可溶ィ匕し難い細胞膜表面抗原に対 するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマも作製できる。また、このようなノ、ィ プリドーマを作製することにより、細胞膜表面抗原に対するモノクローナル抗体を大 量作製することができる。
[0009] 本発明の測定法によれば、細胞膜表面抗原に対する抗体の親和性を高感度で測 定でき、また、これを利用して抗体をアツセィまたはスクリーニングする方法も提供さ れる。本発明の測定法は、特に、一般的な方法では結合親和性測定が困難である 細胞膜表面抗原またはその細胞外ドメインのナチュラルなェピトープに対して結合す るモノクローナル抗体の親和性の測定に適している。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]タンパク発現用ベクター pNOWの構造を示す。
[図 2]イメージアナライザーによる測定結果（中間調画像の写真)を示す。
[図 3]飽和曲線を示す。（X軸：添加抗体量 (ng)、 Y軸：蛍光強度）
[図 4]スキャッチヤード解析結果を示す。（X軸:結合量 nM、 Y軸:結合量 I遊離量） 符号の説明
[0011] Pcmv: CMVプロモーター
Pabgh:成長ホルモン遺伝子 polyA付加シグナル
Psvd:改変 SV40プロモーター
DHFR:マウスジヒドロ葉酸還元酵素 cDNA
Pasv: SV40遺伝子 polyA付カロシグナル
PBR322ori:大腸菌中での複製起点
Ampr:大腸菌中での選択マーカー（アンピシリン耐性）
Neor:哺乳動物細胞中での選択マーカー（G418耐性） 発明を実施するための最良の形態
[0012] < 1 >本発明のハイプリドーマ作製法及びモノクローナル抗体作製法
本発明のハイプリドーマ作製法は、被免疫動物に複数回免疫することを含む、細胞 膜抗原の細胞外ドメインのェピトープを認識するモノクローナル抗体を産生するノ、ィ プリドーマを作製する方法であって、免疫の少なくとも 1回は、感作抗原として、該抗 原を発現する、被免疫動物とは他の目に属する動物に由来する細胞株を用いる免 疫であり、かつ、免疫の少なくとも一回は、感作抗原として、遺伝子組換により細胞膜 表面上に該抗原を発現させた、被免疫動物と同目に属する動物に由来する細胞株 を用いる免疫であることを特徴とする。
[0013] 本発明のハイプリドーマ作製法は、被免疫動物の免疫が上記の特定の様式で行わ れる他は、通常のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマの作製法と同様でよ い。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常には、（1)被免疫動物の 免疫、（2)免疫された動物力 のリンパ球の調製、（3)親細胞の調製、（4)リンパ球と 親細胞の細胞融合、（5)スクリーニング及びクローユングによって作製される。これら のそれぞれのステップの詳細は、たとえば Ailsa M. Campbell (著)，大沢利昭（訳） 生化学実験法 モノクローナル抗体、東京化学同人、 1989年に記載されている。
[0014] 被免疫動物は、特に限定されないが、通常に、抗体の作製に用いられる動物であ ることが好ましい。このような動物としては、げっ歯類の動物、より具体的には、マウス 、ラット、ハムスターなどが挙げられる。
[0015] 被免疫動物の免疫は、通常には、感作抗原の注射 (免疫）を複数回行うことにより 行われる。これらの複数回の免疫の回数、免疫の間隔、感作抗原の注射量などの各 免疫の条件は、被免疫動物の免疫が上記の特定の様式で行われる他は、通常の方 法と同様でよい。一般に、 3回以上の免疫が行われる場合、最初の免疫を初回免疫 、最後の免疫を最終免疫 (ブースト）、初回免疫後で最終免疫前の免疫を追加免疫と 呼ばれ、それらに適した条件が選択される。
[0016] 本発明のハイプリドーマ作製法においては、免疫の少なくとも 1回力 感作抗原とし て、該抗原を発現する、被免疫動物とは他の目に属する動物に由来する細胞株を用 いる免疫であり、かつ、免疫の少なくとも一回が、感作抗原として、遺伝子組換により 細胞膜表面上に該抗原を発現させた、被免疫動物と同目に属する動物に由来する 細胞株を用いる免疫であればよぐその順序は限定されな 、。
[0017] 本発明のハイプリドーマ作製法においては、複数回の免疫のそれぞれが、感作抗 原として、該抗原を発現する、被免疫動物とは他の目に属する動物に由来する細胞 株を用いる免疫、または、感作抗原として、遺伝子組換により細胞膜表面上に該抗 原を発現させた、被免疫動物と同目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫で あることが好ましい。さらに、初回免疫、追加免疫、及び、最終免疫を行うことを含み、 初回免疫及び追加免疫が、免疫の少なくとも 1回は、感作抗原として、該抗原を発現 する、被免疫動物とは他の目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫、及び、 免疫の少なくとも一回は、感作抗原として、遺伝子組換により細胞膜表面上に該抗原 を発現させた、被免疫動物と同目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫のい ずれか一方であり、最終免疫が他方であることが好ましい。
[0018] 細胞膜抗原は、特に限定されず、 CD20、 TNFR (tumor necrosis factor receptor)や TGF- β (腫瘍増殖因子)レセプターなどがあげられる。細胞膜抗原は、正常動物細 胞またはラインィ匕した動物細胞株に発現する分子であることが好ま 、。細胞膜抗原 を発現する正常動物細胞またはラインィ匕した動物細胞株の例としては白血球が挙げ られる。
[0019] 本発明のハイプリドーマ作製法では、従来の方法では、モノクローナル抗体の作製 が困難であった、細胞膜抗原が膜貫通型分子である場合や、細胞膜抗原のェピトー プを提示する細胞外ドメインが不溶性または可溶ィ匕し難 ヽ抗原である場合でも、その ような抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを作製することがで きる。
[0020] 被免疫動物とは他の目に属する動物に由来する細胞株は、標的とする細胞膜抗原 を発現する限り、特に限定されず、用いる被免疫動物に応じて選択される。たとえば 、被免疫動物がげつ歯類の場合は、ヒト由来の細胞株を用いることができる。たとえば 、細胞膜抗原が CD20である場合、ヒト由来細胞株としては、 SB細胞、 Raji細胞などが 挙げられる。
[0021] 被免疫動物とは他の目に属する動物に由来する細胞株における細胞膜抗原の発 現量は、多い方が好ましぐたとえば、 SDS電気泳動法後 CBB染色による染色による 検出ゃゥヱスタンプロッテイング法でその抗原に対する抗体を用 、て発現量を検出し た場合、 107個の細胞に少なくとも数 gの抗原の存在することが望ましい。
[0022] 遺伝子組換により細胞膜表面上に標的とする細胞膜抗原を発現させた、被免疫動 物と同目に属する動物に由来する細胞株は、標的とする細胞膜抗原を発現する限り 、特に限定されず、用いる被免疫動物に応じて選択される。たとえば、被免疫動物が げっ歯目の動物である場合、 CHO細胞、 NSO細胞、 SP2/o細胞などが挙げられる。
[0023] 被免疫動物と同目に属する動物に由来する細胞株の細胞膜表面における細胞膜 抗原の発現密度は、高いことが好ましぐたとえば、 FITC標識モノクローナル抗体で 発現細胞を染色した場合、本来その抗原を有する細胞と比べて 5倍以上の蛍光強度 の検出されることが好ま 、。
[0024] たとえば、 CD20を発現する組換 CHO細胞 (CD20/CHO)はナチュラルな B細胞株に 較べて CD20分子を細胞表面に圧倒的に多く提示することが可能であり免疫原として 有効である。組換タンパク発現ベクターの性能に依存するが、 CD20全配列をもつ pN OWでトランスフエタトした CD20/CHOの抗原提示は極めて高密度であることが明らか となっている。このことは、市販の FITC標識抗 CD20モノクローナル抗体 (DAKO,カタ ログ番号 F0799)を用いた結合反応試験で証明されて 、る。
[0025] また、本発明により、本発明のハイプリドーマ作製方法により作製されたハイブリド 一マを用いることを特徴とするモノクローナル抗体の作製方法も提供される。
[0026] ノ、イブリドーマを用いてモノクローナル抗体を作製する方法は、本発明のハイブリド 一マ作製法で作製されたノヽイブリドーマを用いることの他は、通常の、モノクローナル 抗体の作製の方法と同様でよい。大量作製の場合には、細胞培養による方法、マウ スの腹水として作製する方法などが挙げられる。
[0027] < 2>本発明の親和性測定法
本発明の親和性測定法は、 (a)該抗原を細胞膜表面に提示する浮遊細胞に被測 定抗体を結合させ、 (b)該細胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体と遊離の 被測定抗体を分離し、（c)該細胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体に、被 測定抗体の抗原認識部位とは異なる部位で被測定抗体に結合する物質であって標 識された物質を結合させ、（d)該細胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体に 結合した該物質と、遊離の該物質を分離し、（e)該物質の標識を検出することを含む 、被測定抗体と細胞膜表面抗原との結合親和性を測定する方法であって、（b)及び (d)の分離を、それぞれ、遠心分離又は細胞を通さないフィルタ一により行うことを特 徴とする。
[0028] 本発明の親和性測定法は、抗原を細胞膜表面に提示する浮遊細胞を用いること、 被測定抗体の抗原認識部位とは異なる部位で被測定抗体に結合する物質であって 標識された物質を用いること、結合したものと遊離のものの分離 (B/F分離)を遠心分 離又は細胞を通さないフィルタ一により行うことの他は、通常の、抗原と抗体との親和 性を測定する方法と同様でよいが、浮遊細胞の量は、この測定系において 1チュー ブ当たり 5 X 105個前後にすることが好ましい。また、抗体を直接 RI標識せずに、二次 抗体を用いて測定することが可能である。
[0029] たとえば、被測定抗体の抗原認識部位とは異なる部位で被測定抗体に結合する物 質としては、被測定抗体に対する抗体 (たとえば、 Fc部位に対する抗体)、プロテイン Aやプロテイン Gなどが挙げられる。標識としては、蛍光物質、磁気ビーズなどが挙げ られる。
[0030] 本発明の親和性測定法においては、分離方法が同じであることが好ましい。
[0031] 用いる細胞は、標的とする抗原を細胞膜表面に提示する浮遊細胞である限り、特 に限定されないが、正常動物細胞、ライン化した動物細胞株または遺伝子操作され た動物細胞株であることが好ましい。このような細胞としては、抗原が CD20である場 合、 Raji細胞などが挙げられる。
[0032] 具体的な手順の例としては、次のものが挙げられる。（1)浮遊細胞とマウスモノクロ ーナル抗体 (一次抗体)を反応後、 (2)遊離 (フリー)の一次抗体を洗浄および遠心 により除去し、（3)蛍光標識された抗マウス二次抗体を反応させ、（4)洗浄および遠 心により遊離の二次抗体を除去し、その後（5)細胞に一次抗体を介して結合した二 次抗体の蛍光量を蛍光イメージアナライザーで測定する。さらに (6)用いた蛍光標識 二次抗体について濃度と蛍光量を測定することで検量線を作成し、測定値を濃度に 換算することで結合した二次抗体量を求め、添加抗体量力 結合量を引くことで遊離 の抗体量を算出する。
[0033] より具体的な手順の例としては、以下に記載するステップよりなる方法が挙げられる
1)細胞膜上の抗原発現量が多!、細胞または細胞株を選択し、充分な細胞数が得ら れるまで培養する。
2)遠心により該細胞を回収し洗浄する。
3)被検モノクローナル抗体又は陽性コントロール抗体を含む溶液中に細胞を懸濁す る。
4)一定時間振とう反応させた後、遠心して細胞を回収し、すばやく洗浄する。
5)回収した細胞を蛍光標識二次抗体を含む溶液中に懸濁する。
6)—定時間振とう反応させた後、遠心して細胞を回収し、洗浄する。
7)細胞を再度懸濁して 96ゥエルプレートのゥエルに移し、蛍光強度をイメージアナラ ィザ一で検出する。
8)検出後、結合した抗体量とフリーの抗体量を画像力 数値ィ匕し、スキャッチャ—ド' プロットから解離定数 (Kd値)を求める。
[0034] 本方法においては、細胞をホルムアルデヒドなどの架橋剤で固定せずに用いるた め、細胞表面上の立体構造を維持したままの標的とする細胞膜表面抗原とモノクロ ーナル抗体との親和性を測定することが可能である。
[0035] 本発明の親和性測定法を利用して、細胞膜表面抗原に対して結合するモノクロ一 ナル抗体をアツセィしたり、細胞膜表面抗原に対して結合するモノクローナル抗体を スクリーニングしたりすることができる。アツセィ及びスクリーニングの方法は、親和性 測定法として本発明の親和性測定法を利用する他は、通常の、親和性測定方法を 利用して、細胞膜表面抗原に対して結合するモノクローナル抗体をアツセィする方法 、及び、細胞膜表面抗原に対して結合するモノクローナル抗体をスクリーニングする 方法と同様でよい。
[0036] 本発明の効果が得られる理由は、以下の説明によって拘束されるものではないが、 以下のように考えられる。
[0037] 感作抗原として、被免疫動物物と異種の細胞 (該抗原を発現する、被免疫動物とは 他の目に属する動物に由来する細胞株）と、同種または近縁種の細胞 (遺伝子組換 により細胞膜表面上に該抗原を発現させた、被免疫動物と同目に属する動物に由来 する細胞株）を組み合わせることによって、標的分子のみの免疫原性が高められるた め、標的分子に特異的なモノクローナル抗体を産生するノ、イブリドーマの割合が増 加すると思われる。
[0038] 抗体 c2B8は、医薬品として有用なことが知られていることから分力るようにナチユラ ルな状態にあるェピトープを認識すると考えられ、 CD20との結合反応においてこの 抗体と競合するモノクローナル抗体を産生するクローンが多数得られていることは、 本発明の方法における標的分子はナチュラルな状態にあることを示唆している。この 利点は、特に、標的とする分子上のェピトープの立体構造を一般的な抗原調製方法 では再現し得ない場合に有効である。一般的な抗原調製方法とは、抗原分子を発現 している細胞を溶解し、その抗原を分離精製する方法である。ナチュラルな状態の抗 原の立体構造は、抗原を細胞表面上に発現させることによって再現できると思われる 力 このような抗原を細胞表面上に発現させた細胞を抗原として単に用いるだけでは 、目的のモノクローナル抗体を得ることは困難である。上記のような特定の組合せ免 疫を用いることにより、このような場合でも、実用的な割合で、目的のモノクローナル 抗体が得られるようになると考えられる。
[0039] 親和性測定において、浮遊細胞を用いることにより感度が上昇する理由としては、 固定化すると固相表面の面積により細胞量が限定される一方、浮遊細胞では細胞数 を多くすることができるためと考えられる。また浮遊状態での細胞には表面全体の抗 原に抗体が結合可能であるのに対し、固定ィ匕すると抗体が結合可能な細胞表面積 が減少することも理由の一つである。力 tlえて、細胞を架橋して固相化する場合には、 固相化に伴いェピトープが消滅したり、その立体構造が変化したりする可能性があり 、ナチュラルな状態の抗原に対する親和性が測定できな力つたり、親和性が低く評価 される恐れがある力 本発明の親和性測定法においてはこのような恐れがない。 実施例 1
[0040] 不溶性膜表面抗原を有する CD20分子に対するモノクローナル抗体の作製と、得ら れた抗体の結合親和性の定量的測定を、実施例を参照して説明する。 [0041] < 1 >モノクローナル抗体の作製
(1)マウス感作用免疫抗原の準備
まず CD20を発現して!/、る代表的な B細胞株である SB細胞と Raji細胞を in vitroで培 し 7こ。
次【こ Multipleし hoice cDNA human spleen, Ongene Technologies, Inc.り Taftし our t Suite 100 Rockville, MD 20850から、 CD20の全分子をコードする DNAを特異的な フフィマ1 ~~ hCD20- S- GK- Not aatgcggccgccaccatgacaacacccagaaattc (酉己列番号 1)、 及び hCD20- E- Xba gctctagattaaggagagctgtcattttc (配列番号 2)を用いてクローニン グし、それを哺乳動物細胞用高発現ベクターである pNOW (特許第 3582965号公報 、図 1)に組み込み、構築されたベクターを CHO細胞にトランスフエタトした。 FACS分 祈により、細胞表面に CD20分子を高発現している糸且換 CHO細胞（CD20/CHO細胞） を榭立した。なお、 FITC標識抗 CD20モノクローナル抗体で染色した場合に SB細胞 に比べて蛍光強度力 倍以上のものを高発現しているものとした。
[0042] (2)免疫原の調製
SB細胞または Raji細胞は 10%FCS添加 RPMI 1640培地を用 、て培養を行つた。 CD20/CHO細胞は、 G418を 800 g/ml添カ卩した CHO- S- SFM II培地（GIBCO、 Cat . No. 12052- 098)を用いて培養を行った。これらの培養液を遠心分離（1100rpm、 5分 )した後、細胞に Dulbecco's PBS (-)をカ卩えて懸濁させ再度遠心分離した。この洗浄操 作をもう一度繰り返し、細胞に生理食塩水を加えて調製した懸濁液（lml当たりの細 胞数は 1〜3 X 107である）を免疫に用いた。
[0043] (3)免疫
7〜11週令の Balb/c系雌性マウスへ、免疫原の調製液をいずれも腹腔内投与した。 使用した免疫原の組み合わせを表 1に示した。 SB細胞、 Raji細胞または CD20/CHO 細胞のうち、いずれか同じ細胞をさまざまな日数間隔で 2〜3回繰り返して投与した後 、最終免疫には異なった細胞を投与した。投与した細胞数はいずれもマウス 1匹当た り 1〜3 X 107個であった。
[0044] (4)細胞融合
最終免疫の 3日後、 2匹のマウス力も脾臓細胞を調製し、マウスミエ口—マ (NS- 1)と の融合反応を PEG- 1500の存在下で行なった。方法は、 Oi.V.T. andし A. Herzenber g, 1980, in:Selected Methods inし ellular Immunology, eas. B. Mishell and S.M. Shng i(Freeman and Co. San Francisco, CA) p.351.に従った。
[0045] (5) 1次、 2次スクリーニング
CD20/CHO細胞または CHO細胞 (親株）を付着させた 96ゥエルプレートを用いて C ell ELISAを行い、 CD20に特異的に反応する抗体を産生しているゥエルを選択した。 さらに、同じ CD20/CHO細胞を付着させた 96ゥエルプレートを用い、医薬品として有 用であることが知られて 、る抗体 c2B8 (抗 CD20マウスモノクローナル抗体 2B8から作 製されたヒト 'マウスキメラ抗体である）との競合反応を行って、 c2B8のェピトープと類 似したところに反応する抗体 (ゥエル)を選択した。
[0046] (6) Cell ELISA
Poly- L- Lysineコート 96ゥエルプレート（旭テクノグラス、 Cat.No.ll- 023- 018)に付着 させた CD20/CHO細胞または CHO細胞（親株）を Cell ELISAに用いた。その各ゥェ ルにブロッキング液（0.2%- Gelatine, 0.5%BSAの PBS溶液）を 150 μ 1入れて 37°Cで 1時 間静置した。 150mM- NaCl, 0.05%-Tween20水溶液を用いてプレートを 5回洗浄した 後、サンプル (培養上清の希釈液)を各ゥエルに 100 1入れて 1次反応を 37°Cで 1時 間行なった。洗浄後、標識抗体の希釈液〔HRP標識抗マウス IgG(H+L)ゥサギ抗体 (J ackson Lab. Code No. 315- 035- 003)、または HRP標識抗マウス IgG(Fc γ )ゥサギ抗 体（Jackson Lab. Code No. 315- 035- 008))〕〕を各ゥエルに 100 1入れて 2次反応を 3 7°Cで 1時間行なった。 1次、 2次の反応液の調製には、ブロッキング液と同じものを用 いた。洗浄後、発色液（OPD)を各ゥエルに 100 1入れ 30分後に 4N- H SOを カロ
2 4 えて反応を停止し、 A492を測定した。
[0047] (7) Cell ELISAでの競合反応
サンプル (培養上清の希釈液)とキメラ抗体（10〜40ng/ml)の混合溶液を調製した。 上記の Cell ELISAと同様にブロッキング反応をしたあと、この混合溶液を各ゥエル に 100 /z l入れて 1次反応を 37°Cで 1時間行なった。洗浄後、標識抗体の希釈液〔HRP 標識抗ヒト IgG(H+L)ゥサギ抗体 (Jackson Lab. Code No. 309- 035- 082)〕を各ゥエル に 100 /z l入れて 2次反応を 37°Cで 1時間行なった。洗浄後、発色液 (OPD)を各ゥエル に 100 μ 1入れ 30分後に 4Ν-Η SOを 50ul加えて反応を停止し、 A492を測定した。
2 4
[0048] 標識抗体はキメラ抗体のみに反応するので、 1次反応で添加したサンプル中の抗 体がキメラ抗体と競合すれば、測定値の低下が認められた。
[0049] (8)クローユング
限界希釈法で行った。細胞を 96ゥエルプレートに撒いて培養後、 1コロニーのゥェ ルの培養上清について Cell ELISAを行い、特異抗体の産生クローンを選択した。
[0050] (9)精製抗体の調製
特異抗体の産生クローンを 10%FCS添加 RPMI1640培地で培養し、細胞密度が 5 X 1 05/ml前後になった時点で無血清培地 ASF-104N (味の素）に培地を交換して培養を 行った。その 2〜4日後に培養液を遠心分離して培養上清を回収したあと、プロテイン Gカラムを用いて精製を行い、溶出されたモノクローナル抗体溶液を 150mM-NaClに 対して透析した。 0.2 mのフィルターでろ過滅菌を行ない、試験抗体 (抗ヒト CD20 マウスモノクローナル抗体）とした。
[0051] <結果 >
免疫方法と、その免疫方法により得られたノヽイブリドーマのスクリーニングおよび c2 B8との競合反応の結果を表 1に示す。
[0052] [表 1]
1次、 2次スクリーニング
免疫方法
細胞融合 CE)20/CHO細胞の CD20に対する特異性 シリーズ
初^、追加免疫、回数 選^ゥ ル数
最終免疫 免疫マウス数 測定ゥ ル赘
A B
1K 18 SB細胞、 3回 Raii細胞 2 7 2 576
I 20 Ra細胞、 3 SB細跑 2 7 0 576
SB細胞、 z CD20/CHO細胞 1
IK 14 20 9 576
SB細胞、 3回 CD20/CHO細胞 1
CD2Q/CHO細胞、 2回 Raji細胞 1
1K 17 21 > 10 576
CD20/CHO細胞、 3回 Raji細胞 Ϊ 選択ゥエル数— A： C D 2 0/ C H O細胞に反応し. C H O細胞には反応しない钪体を産生したゥ工ル
選択ゥエル数一 B：選択ゥエル数一 Aのうち、 対照抗体 との競合反 Kが認められる抗体を産生したゥエル
[0053] 表 1に示されるように、ヒト由来細胞（SB細胞又は Raji細胞）による兌疫と、遺伝子組 換えにより CD20を発現させた、マウスと同目に属する動物に由来する CHO細胞 (CD 20/CHO細胞）による免疫の両方を組み合わせて行った場合、ヒト由来細胞による免 疫のみを行った場合と比較して CD20に対する特異抗体の産生細胞が細胞融合によ つて多く得られることが分力つた。また、選択されたクローンの中には、対照抗体 c2B8 との競合反応の認められる抗体を産生するクローンが多く含まれていた。
[0054] < 2 >結合親和性測定
目的とする抗原を細胞表面で発現しているヒト B細胞株由来の浮遊細胞 Raji及び、 CD20抗原を発現して ヽな 、細胞としてヒト T細胞株由来の浮遊細胞 Jurkatを用いた。 共に RPMI1640 (ナカライ、 Cat.No.30264-85、 Lot L4K2844)に 10%ゥシ胎仔血清 FCS( BIOLOGICAL IND. Cat.No.04- 001- 1A、 Lot 815242、補体成分を非働化するためあ らカじめ 56度 30分加温したもの）を添加した培地で 37度 CO濃度 5%の COインキュべ 一ター（SANYO MCO-175M)で培養、週 2回の継代により維持した。
[0055] 細胞数の測定は、 Burker-Turk血球計算盤 (ヱルマ販売 (株) Cat.No.03-303-1)を用 いて行った。
[0056] 継代後 3〜4日目のコンフルェントな細胞の培養液を多本架冷却遠心機 LX-120 (T OMY)で室温、 3000r.p.m.で 3分間遠心し、上清を除き、細胞を回収した。ここで用い た回転数と時間は遠心分離と上清除去を繰り返し行っても細胞数が変化しない条件 である。細胞の表面に残った培地及び FCSを除くため（洗浄）、回収した細胞を Dulbe cco s Pnospnate Buffered Saline (-) without Ca and Mg [PBS (- 、 (Naし l:Wako、 Cat. No.191—01665、 Na HPO ： Wako、 Cat.No.197—02865、 Lot ASF2635、 KCl:Wako、 Ca
2 4
t.No.163— 0334T、 Lot CEQ7122 、 KH PO ： Wako、 Cat.No.169—0425、 Lot ELG7616]
2 4
で懸濁後、 3000 r.p.m.で 3分間遠心して上清を除く操作を 2回行った。洗浄を終えた 細胞を 1%BSA (Wako Cat No.013-07492 Lot PKH3483 )- PBS溶液で懸濁し、細胞密 度を 5xl06個/ mlに調整した。
[0057] 一次抗体として、試験抗体又は陽性コントロール抗体 (2B8) 15, 30, 50, 75, 100, 1 25, 150, 200 ng (1.5〜5 1)を各々、 1.5mlチューブ（ビーェム機器、 BMリングロック チューブ Cat.No.BM-15)に分注し、同時に抗体を入れないチューブも 4本用意した 。また、各々の試験抗体あたり 3点のサンプルを準備した。そこに、 1%BSA (Wako Cat No.013-07492 Lot PKH3483 )- PBS溶液で懸濁液を 100 1 (細胞数 5xl05個）ずつ加 えて混和し、室温で 1時間振とう反応させた。
[0058] 反応後、微量高速冷却遠心機 MX-100 (TOMY)で室温、 3000 r.p.m.3分間遠心分 離し、細胞を回収後、細胞の表面に残った未反応の一次抗体を除くため 200 1の PB Sで懸濁し、 3000 r.p.m.で 3分間遠心し上清を除く操作を 2回行った。
[0059] 次に細胞に結合した一次抗体を検出するため、細胞と結合した一次抗体に対して 過剰量（500ng)の FITC標識抗マウス IgG (H&L)二次抗体〔GOAT Anti-mouse IgG( H&L) Fluorescein conjugated, alhnity purified Secondary antibody ^ Cnemicon、 し at. No.AP124F、 Lot 24021014] 1% BSA- PBS溶液 100 /z 1 (500η§/100 /ζ 1)を上記細胞 に添加 ·懸濁し、遮光、室温のもと 1時間振とう反応した。反応後、 3000 r.p.m.で 3分 間遠心し、細胞を回収後、細胞の表面に残った未反応の FITC標識抗マウス IgG (H& L)抗体を除くため、 200 1の PBSで懸濁し 3000 r.p.m.で 3分間遠心し上清を除く操作 を 2回行った。
[0060] こうして得た細胞を 100 μ 1 PBSで懸濁し、 96ゥエル平底プレート（住友ベークライト E LISA PLATE Cat.No.8496F)へ移した。二次抗体の蛍光量を Typhoon9210イメージ ナフィサ ~~ (Amersnam Bioscience) 用いて、 Fluorescense mode, 600v, 526SP/g reen(532nm)、 Focus底面 +3mmの検出条件で測定した。この際、 FITC標識二次抗体 を 0, 12.5, 25, 50, 75, 100, 125, 150 ng添カ卩した PBS溶液 100 1を検量線作成用のコ ントロールとして用いた。
[0061] 検出後、画像を画像解析ソフト Image Quant (Amersham Bioscience)を使用し、数 値化を行った後、 Excel (Microsoft)で解析を行った。この際、プレート、 PBS溶液、お よび細胞に非特異的に結合した FITC標識二次抗体に由来するバックグラウンド値と して、細胞と FITC標識二次抗体のみを反応させたものの測定値を求め、その 4点の 平均値を各サンプルの蛍光強度の値から差し引いた。こうして、細胞に結合した FIT C標識二次抗体の蛍光量を得た。更に、コントロールとして用いた各濃度の FITC標 識二次抗体での蛍光量を測定することで検量線を作成し、細胞に結合して 、る二次 抗体の量 (モル数または重量)を求めた。各一次抗体と FITC標識二次抗体が 1： 2の 割合で反応していると仮定し、結合している一次抗体量を算出した。また遊離の一次 抗体量は添加量力も結合量を差し引いて求めた。抗体濃度をモル濃度に換算する 際、モノクローナル抗体の分子量を 150000とした。
[0062] 添加する一次抗体の増加に伴い結合反応が飽和して蛍光強度が一定量に達する ことを確認するとともに、細胞表面の抗原数及び解離定数 (Kd値)を算出するため、 スキャッチヤード解析（Scatchard,G.; Ann.N.Y.Acad.Sci.,51: 660-672,1949、分子生 物学研究のための新培養細胞実験法;羊土社、実験医学別冊バイオマニュアル UP シリーズ改訂第 2版、 212-217参照）を行った。このとき、数値は各サンプルについて 3 点の値の平均値を用いた。
[0063] 試験抗体：リガンド (L)と細胞表面抗原：レセプター（R)の結合はリガンド ·レセプタ 一複合体 (LR)と次の反応式で示される。
L+R< ~~ LR 遊離リガンド濃度〔L〕、非結合型レセプター濃度〔R〕、レセプターと結合したリガンド 濃度〔LR〕として、平衡下での解離定数 Kdは
Kd=〔L〕〔R〕/〔し R〕 ·'··Ι
用いるリガンドの全量〔L total]は遊離型とレセプターに結合したものとの和になる。
[L total] = [L] + [LR]----II
一方、レセプターも総量〔R total]はリガンドに結合していないものと結合したものとの 和になる。
[R total] = [R] + [LR]----III
このレセプターの数〔R total] (試験抗体の最大結合量）とレセプターとリガンドとの親 和性を Scatchard解析で推定する。上記 Ι,Π,ΠΙの式を変形、代入すると、
[LR]/[L] = - l/Kd[LR] + [R total] / Kd
〔LR〕を B (bound)、〔L〕を!7 (free) で表し、〔R total]を B max (定数）で示すと
B/F = - l/KdB + Bmax I Kd
が得られる。この式は B/Fを y軸に Bを x軸にとる一次関数となる。直線の傾き力も Kd 値を得、 y切片から Bmaxを得ることができる。 Kd値は濃度の次元をもち、低い値ほど 高い親和性を示す。（結合定数 Ka = 1/ Kd)
[0064] <結果 >
陽性コントロール（2B8)、試験抗体 A (表 1の 1K17シリーズのクローン lkl773が産生 する抗体)及び試験抗体 B (同じく 1K17シリーズの lkl782が産生する抗体)を用いて 親和性測定を行った場合の、イメージアナライザー画像を図 2に、飽和曲線を図 3に 、スキャッチヤード（Scatchard)解析の結果を図 4に示す。また、上記スキャッチヤード 解析より得られた一次関数の傾きより、解離定数（Kd値）を求めた。同様の実験を繰 り返し行い、得られた Kd値 (平均）は以下のとおりであった。
[0065] [表 2]
Figure imgf000020_0001
[0066] 陽性コントロールとして用いた抗体 2B8につ!/、て得られた Kd値は 6.8nMであった。 Mit chell ER et al., Blood 1994; 82:435- 445に報告されている 2B8の Kd値は 3.5nMである ので、近似した Kd値が本発明の親和性測定法でも得られた。

Claims

請求の範囲
[1] 被免疫動物に複数回免疫することを含む、細胞膜抗原の細胞外ドメインのェピトー プを認識するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを作製する方法であって
、免疫の少なくとも 1回は、感作抗原として、該抗原を発現する、被免疫動物とは他の 目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫であり、かつ、免疫の少なくとも一回 は、感作抗原として、遺伝子組換により細胞膜表面上に該抗原を発現させた、被免 疫動物と同目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫であることを特徴とする、 j記方法。
[2] 複数回の免疫のそれぞれが、感作抗原として、該抗原を発現する、被免疫動物と は他の目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫、または、感作抗原として、 遺伝子組換により細胞膜表面上に該抗原を発現させた、被免疫動物と同目に属する 動物に由来する細胞株を用 、る免疫である請求項 1記載の方法。
[3] 初回免疫、追加免疫、及び、最終免疫を行うことを含み、初回免疫及び追加免疫 力 免疫の少なくとも 1回は、感作抗原として、該抗原を発現する、被免疫動物とは他 の目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫、及び、免疫の少なくとも一回は、 感作抗原として、遺伝子組換により細胞膜表面上に該抗原を発現させた、被免疫動 物と同目に属する動物に由来する細胞株を用いる免疫のいずれか一方であり、最終 免疫が他方である請求項 2記載の方法。
[4] 細胞膜抗原が正常動物細胞またはラインィ匕した動物細胞株に発現する分子である 請求項 1〜3のいずれか 1項記載の方法。
[5] 細胞膜抗原を発現する正常動物細胞またはラインィ匕した動物細胞株が白血球であ る請求項 4記載の方法。
[6] 細胞膜抗原が膜貫通型分子である請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。
[7] 細胞膜抗原のェピトープを提示する細胞外ドメインが不溶性または可溶ィ匕し難い 抗原である請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の方法。
[8] 被免疫動物がげつ歯目の動物であり、被免疫動物と同目に属する動物に由来する 細胞株が CHO細胞、 NSO細胞、または、 SP2/o細胞である請求項 1〜7のいずれか 1 項に記載の方法。 請求項 1〜8のいずれか 1項の方法により作製されたハイプリドーマを用いることを 特徴とするモノクローナル抗体の作製方法。
(a)該抗原を細胞膜表面に提示する浮遊細胞に被測定抗体を結合させ、 (b)該細 胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体と遊離の被測定抗体を分離し、 (c)該 細胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体に、被測定抗体の抗原認識部位とは 異なる部位で被測定抗体に結合する物質であって標識された物質を結合させ、（d) 該細胞の細胞膜表面抗原に結合した被測定抗体に結合した該物質と、遊離の該物 質を分離し、（e)該物質の標識を検出することを含む、被測定抗体と細胞膜表面抗 原との結合親和性を測定する方法であって、（b)及び (d)の分離を、それぞれ、遠心 分離又は細胞を通さないフィルタ一により行うことを特徴とする前記方法。
(b)及び (d)の分離を、遠心分離により行う請求項 10に記載の方法。
(b)及び (d)の分離を、細胞を通さな 、フィルタ一により行う請求項 10に記載の方 法。
細胞が正常動物細胞、ライン化した動物細胞株または遺伝子操作された動物細胞 株である請求項 10〜 12のいずれか 1項に記載の方法。
請求項 10〜13のいずれか 1項に記載の方法を利用して細胞膜表面抗原に対して 結合するモノクローナル抗体をアツセィする方法。
請求項 10〜13のいずれか 1項に記載の方法を利用して細胞膜表面抗原に対して 結合するモノクローナル抗体をスクリーニングする方法。
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