JP2000086699A - 細胞表面抗原ｃｄ１４を認識する新規なモノクローナル抗体 - Google Patents
細胞表面抗原ｃｄ１４を認識する新規なモノクローナル抗体Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 敗血症等の病態の解明と治療に好適な、マク
ロファージ細胞表面リセプターであるＣＤ１４のリポポ
リサッカライド結合部位を認識するモノクローナル抗体
を提供する。 【解決手段】 マクロファージ細胞表面リセプターＣＤ
１４のリポポリサッカライド結合部位を認識し、単球ま
たはマクロファージ系細胞に対する結合活性を有するモ
ノクローナル抗体。
ロファージ細胞表面リセプターであるＣＤ１４のリポポ
リサッカライド結合部位を認識するモノクローナル抗体
を提供する。 【解決手段】 マクロファージ細胞表面リセプターＣＤ
１４のリポポリサッカライド結合部位を認識し、単球ま
たはマクロファージ系細胞に対する結合活性を有するモ
ノクローナル抗体。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、マクロファージ細
胞表面リセプターＣＤ１４のリポポリサッカライド結合
部位を認識し、単球またはマクロファージ系細胞で免疫
された哺乳動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合し
て得られるハイブリドーマにより産生されるモノクロー
ナル抗体に関する。
胞表面リセプターＣＤ１４のリポポリサッカライド結合
部位を認識し、単球またはマクロファージ系細胞で免疫
された哺乳動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合し
て得られるハイブリドーマにより産生されるモノクロー
ナル抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】リポポリサッカライド（以下「ＬＰＳ」
という）に対する親和性の高い細胞表面リセプターであ
るＣＤ１４は、ＬＰＳと血清中のＬＰＳ結合タンパク
（ＬＰＳＢｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ、以下「ＬＢ
Ｐ」という）との複合体（以下「ＬＰＳ−ＬＢＰ複合
体」という）を認識することにより、ＴＮＦやＩＬ−６
等の炎症性サイトカインやＮＯ等の因子を単球やマクロ
ファージから細胞外に放出する。これらの因子は、微量
でも生体における敗血症の発症と重篤化に極めて重要な
役割を演じていることが報告されている。
という）に対する親和性の高い細胞表面リセプターであ
るＣＤ１４は、ＬＰＳと血清中のＬＰＳ結合タンパク
（ＬＰＳＢｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ、以下「ＬＢ
Ｐ」という）との複合体（以下「ＬＰＳ−ＬＢＰ複合
体」という）を認識することにより、ＴＮＦやＩＬ−６
等の炎症性サイトカインやＮＯ等の因子を単球やマクロ
ファージから細胞外に放出する。これらの因子は、微量
でも生体における敗血症の発症と重篤化に極めて重要な
役割を演じていることが報告されている。
【０００３】また、可溶性ＣＤ１４抗原も敗血症の病態
と密接に関連する可能性があり、従来までＣＤ１４抗原
に対する抗体を用いた様々な敗血症の病態解析が行われ
ている。例えば、特表平８−５１０９０９号公報には、
抗原として遺伝子組換えＣＤ１４で免疫して得られたハ
イブリドーマより産生される抗体が開示されている。ま
た、特表平５−５０１３９９号公報にはＬＰＳ−ＬＢＰ
複合体のＣＤ１４への結合を競争的に阻害するＣＤ１４
モノクローナル抗体の敗血症治療への用途が開示されて
いる。
と密接に関連する可能性があり、従来までＣＤ１４抗原
に対する抗体を用いた様々な敗血症の病態解析が行われ
ている。例えば、特表平８−５１０９０９号公報には、
抗原として遺伝子組換えＣＤ１４で免疫して得られたハ
イブリドーマより産生される抗体が開示されている。ま
た、特表平５−５０１３９９号公報にはＬＰＳ−ＬＢＰ
複合体のＣＤ１４への結合を競争的に阻害するＣＤ１４
モノクローナル抗体の敗血症治療への用途が開示されて
いる。
【０００４】しかし、これらの従来の抗体は組換えＣＤ
１４を使用して製造されたものであり、細胞表面上に様
々な存在様式で存在している実際の抗原には親和性を示
さず、また抗原としての組換えＣＤ１４が精製の段階で
変性してしまうことにより所望の認識特性を有する抗体
が得られない可能性がある等、特異性に問題があり、敗
血症等の病態の解明と治療への応用には不十分なもので
あった。
１４を使用して製造されたものであり、細胞表面上に様
々な存在様式で存在している実際の抗原には親和性を示
さず、また抗原としての組換えＣＤ１４が精製の段階で
変性してしまうことにより所望の認識特性を有する抗体
が得られない可能性がある等、特異性に問題があり、敗
血症等の病態の解明と治療への応用には不十分なもので
あった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、敗血症等の病態の解明と治療に好適な、マクロファ
ージ細胞表面リセプターであるＣＤ１４のＬＰＳ結合部
位を認識するモノクローナル抗体を提供することを目的
とする。
は、敗血症等の病態の解明と治療に好適な、マクロファ
ージ細胞表面リセプターであるＣＤ１４のＬＰＳ結合部
位を認識するモノクローナル抗体を提供することを目的
とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、単球また
はマクロファージ系細胞を抗原として免疫した動物の細
胞を使用してハイブリドーマを作製し、単球またはマク
ロファージ系細胞に対する結合活性を有する抗体を産生
するハイブリドーマのクローンのみを蛍光活性化セルソ
ーター（ＦＡＣＳ）を用いてスクリーニングし、これら
の抗体と反応する抗原の分子性状を詳細に検討し、細胞
表面ＣＤ１４抗原と結合する抗体のみをクローニングし
た。その結果、ＣＤ１４のＬＰＳ結合部位を認識し、Ｌ
ＰＳとの結合を拮抗的に阻害することによりＴＮＦ、Ｉ
Ｌ−６及びＮＯ等の炎症性メディエーターの産生を抑え
る新規なモノクローナル抗体を見出し、本発明を完成し
た。
はマクロファージ系細胞を抗原として免疫した動物の細
胞を使用してハイブリドーマを作製し、単球またはマク
ロファージ系細胞に対する結合活性を有する抗体を産生
するハイブリドーマのクローンのみを蛍光活性化セルソ
ーター（ＦＡＣＳ）を用いてスクリーニングし、これら
の抗体と反応する抗原の分子性状を詳細に検討し、細胞
表面ＣＤ１４抗原と結合する抗体のみをクローニングし
た。その結果、ＣＤ１４のＬＰＳ結合部位を認識し、Ｌ
ＰＳとの結合を拮抗的に阻害することによりＴＮＦ、Ｉ
Ｌ−６及びＮＯ等の炎症性メディエーターの産生を抑え
る新規なモノクローナル抗体を見出し、本発明を完成し
た。
【０００７】すなわち本発明は、マクロファージ細胞表
面リセプターであるＣＤ１４のＬＰＳ結合部位を認識
し、単球またはマクロファージ系細胞に対する結合活性
を有するモノクローナル抗体を提供するものである。
面リセプターであるＣＤ１４のＬＰＳ結合部位を認識
し、単球またはマクロファージ系細胞に対する結合活性
を有するモノクローナル抗体を提供するものである。
【０００８】本発明のモノクローナル抗体は、単球また
はマクロファージ系細胞で免疫された哺乳動物の脾臓細
胞とミエローマ細胞とを融合して得られるハイブリドー
マにより産生される。
はマクロファージ系細胞で免疫された哺乳動物の脾臓細
胞とミエローマ細胞とを融合して得られるハイブリドー
マにより産生される。
【０００９】単球またはマクロファージ系細胞は好まし
くはマウス由来のＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．ＴＩＢ７１）である。
くはマウス由来のＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．ＴＩＢ７１）である。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明のモノクローナル抗
体について詳細に説明する。
体について詳細に説明する。
【００１１】本発明のモノクローナル抗体は、マクロフ
ァージ細胞表面リセプターであるＣＤ１４のＬＰＳ結合
部位を認識するとともに、単球またはマクロファージ系
細胞に対する結合活性を有し、単球またはマクロファー
ジ系細胞で免疫された哺乳動物の脾臓細胞とミエローマ
細胞とを融合して得られるハイブリドーマにより産生さ
れるモノクローナル抗体である。
ァージ細胞表面リセプターであるＣＤ１４のＬＰＳ結合
部位を認識するとともに、単球またはマクロファージ系
細胞に対する結合活性を有し、単球またはマクロファー
ジ系細胞で免疫された哺乳動物の脾臓細胞とミエローマ
細胞とを融合して得られるハイブリドーマにより産生さ
れるモノクローナル抗体である。
【００１２】以下、本発明のモノクローナル抗体の製造
方法について詳述する。
方法について詳述する。
【００１３】本発明のモノクローナル抗体の製造方法自
体は公知のものであってよく、例えばKohlerとMilstein
の方法(Nature, 256, 495-497 (1975))によって製造す
ることができる。
体は公知のものであってよく、例えばKohlerとMilstein
の方法(Nature, 256, 495-497 (1975))によって製造す
ることができる。
【００１４】例えば、マウス等に由来する単球またはマ
クロファージ系細胞を抗原とし、これをマウス、ラッ
ト、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、
イヌ、ネコ、ニワトリ等の被免疫動物の腹腔内、皮下、
足蹠（footpad）等に投与する。これらの被免疫動物の
なかでもラットを用いることが好ましい。
クロファージ系細胞を抗原とし、これをマウス、ラッ
ト、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、
イヌ、ネコ、ニワトリ等の被免疫動物の腹腔内、皮下、
足蹠（footpad）等に投与する。これらの被免疫動物の
なかでもラットを用いることが好ましい。
【００１５】マクロファージ系細胞としては、ＲＡＷ２
６４．７細胞を使用することが好ましい（この細胞は、
ATCC Catalogue of CELL LINES & HYBRIDOMAS（１９９
２年第７版）記載のATCC No．TIB71であり、American T
ype Culture Collection、Rockville、MDから容易に入
手できる）。
６４．７細胞を使用することが好ましい（この細胞は、
ATCC Catalogue of CELL LINES & HYBRIDOMAS（１９９
２年第７版）記載のATCC No．TIB71であり、American T
ype Culture Collection、Rockville、MDから容易に入
手できる）。
【００１６】また、単球またはマクロファージ系細胞は
あらかじめＬＰＳまたはβ−Ｄ−グルカンで刺激してお
くことが好ましい。
あらかじめＬＰＳまたはβ−Ｄ−グルカンで刺激してお
くことが好ましい。
【００１７】被免疫動物から脾臓細胞、リンパ細胞、末
梢血液等の抗体産生細胞を採取し、これらと腫瘍細胞株
であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドー
マを調製する。細胞融合に用いるミエローマ細胞として
は、種々の哺乳動物の細胞株を利用することができる
が、被免疫動物と同種の動物の細胞株を用いることが好
ましい。
梢血液等の抗体産生細胞を採取し、これらと腫瘍細胞株
であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドー
マを調製する。細胞融合に用いるミエローマ細胞として
は、種々の哺乳動物の細胞株を利用することができる
が、被免疫動物と同種の動物の細胞株を用いることが好
ましい。
【００１８】また、ミエローマ細胞は、細胞融合の後に
未融合細胞と融合細胞とを区別できるようにし、未融合
のミエローマ細胞を排除してハイブリドーマだけを増殖
させることができるように、例えばサルベージ経路を欠
損させる等、選別可能なマーカーを有するものを用いる
ことが好ましい。また、ハイブリドーマの培養上清から
目的の抗体を取得することを容易にするため、ミエロー
マ細胞として固有のイムノグリブリンを分泌しない株を
使用することが好ましい。
未融合細胞と融合細胞とを区別できるようにし、未融合
のミエローマ細胞を排除してハイブリドーマだけを増殖
させることができるように、例えばサルベージ経路を欠
損させる等、選別可能なマーカーを有するものを用いる
ことが好ましい。また、ハイブリドーマの培養上清から
目的の抗体を取得することを容易にするため、ミエロー
マ細胞として固有のイムノグリブリンを分泌しない株を
使用することが好ましい。
【００１９】このようなミエローマ細胞としては公知の
細胞を用いることができ、特に限定されるものではない
が、ＮＳ−１細胞が好ましい（このミエローマ細胞は、
ATCCCatalogue of CELL LINES & HYBRIDOMAS（１９９２
年第７版）記載のATCC No．TIB18であり、American Typ
e Culture Collection、Rockville、MDから容易に入手
できる）。
細胞を用いることができ、特に限定されるものではない
が、ＮＳ−１細胞が好ましい（このミエローマ細胞は、
ATCCCatalogue of CELL LINES & HYBRIDOMAS（１９９２
年第７版）記載のATCC No．TIB18であり、American Typ
e Culture Collection、Rockville、MDから容易に入手
できる）。
【００２０】得られたハイブリドーマを、例えばヒポキ
サンチン(H)、アミノプテリン(A)、チミジン(T)を含むH
AT培地等、前記マーカーによる選別に適した細胞培養培
地中で選択的に増殖させ、単球またはマクロファージ系
細胞を用いて蛍光活性化セルソーター等で前記培養の培
養上清をスクリーニングすることにより該細胞に特異的
に結合する抗体を継続的に産生するハイブリドーマ株を
選別する。
サンチン(H)、アミノプテリン(A)、チミジン(T)を含むH
AT培地等、前記マーカーによる選別に適した細胞培養培
地中で選択的に増殖させ、単球またはマクロファージ系
細胞を用いて蛍光活性化セルソーター等で前記培養の培
養上清をスクリーニングすることにより該細胞に特異的
に結合する抗体を継続的に産生するハイブリドーマ株を
選別する。
【００２１】このようして選別されたハイブリドーマ株
を適当な培地で培養することによって、培地中にモノク
ローナル抗体が得られる。
を適当な培地で培養することによって、培地中にモノク
ローナル抗体が得られる。
【００２２】また、マウスの腹腔等の生体内で前記ハイ
ブリドーマ株を培養し、腹水等から単離することによっ
て、モノクローナル抗体を大量に製造することもでき
る。
ブリドーマ株を培養し、腹水等から単離することによっ
て、モノクローナル抗体を大量に製造することもでき
る。
【００２３】このようにして得られたモノクローナル抗
体は、通常の抗体の精製方法によって精製してもよい。
抗体の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニ
ウム等による塩析、低温アルコール沈殿及びポリエチレ
ングリコールまたは等電点による選択的沈殿分別法、電
気泳動法、ジエチルアミノエステル（ＤＥＡＥ）誘導
体、カルボキシメチル（ＣＭ）誘導体等のイオン交換体
を用いたイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡ
またはプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグ
ラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグライー、ゲル
濾過法及び超遠心法等を挙げることができる。
体は、通常の抗体の精製方法によって精製してもよい。
抗体の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニ
ウム等による塩析、低温アルコール沈殿及びポリエチレ
ングリコールまたは等電点による選択的沈殿分別法、電
気泳動法、ジエチルアミノエステル（ＤＥＡＥ）誘導
体、カルボキシメチル（ＣＭ）誘導体等のイオン交換体
を用いたイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡ
またはプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグ
ラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグライー、ゲル
濾過法及び超遠心法等を挙げることができる。
【００２４】上記のようにして得られる本発明のモノク
ローナル抗体の免疫グロブリンクラスは特に限定される
ものではないが、ＩｇＧ２ｂのものが例示される。
ローナル抗体の免疫グロブリンクラスは特に限定される
ものではないが、ＩｇＧ２ｂのものが例示される。
【００２５】また、本発明のモノクローナル抗体として
は、典型的にはハイブリドーマによって生産された抗体
が挙げられるが、このような抗体を、その抗原結合部位
（Ｆａｂ）を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミ
ン、ペプシン、バパイン等）で処理して得られたＦａ
ｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）2等の抗体フラグメントで
あっても、上記本発明のモノクローナル抗体の性質を保
持する限り本発明のモノクローナル抗体に包含される。
は、典型的にはハイブリドーマによって生産された抗体
が挙げられるが、このような抗体を、その抗原結合部位
（Ｆａｂ）を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミ
ン、ペプシン、バパイン等）で処理して得られたＦａ
ｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）2等の抗体フラグメントで
あっても、上記本発明のモノクローナル抗体の性質を保
持する限り本発明のモノクローナル抗体に包含される。
【００２６】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、この実施例は本発明の一例を示すものであ
り、これに限定されるものではない。
説明するが、この実施例は本発明の一例を示すものであ
り、これに限定されるものではない。
【００２７】実施例１ モノクローナル抗体の作製 （ａ）免疫 グリフォラン（β-D-グルカン；Adachi et al., Biolog
ical Pharm. Bull. 17(12) 1554-1560, 1994）２５０μ
ｇ／ｍｌで一晩刺激しておいた５×１０7個のＲＡＷ２
６４．７細胞を２週間おきに３回、６週齢の雄性ＤＡラ
ット（日本ＳＬＣ社製）の腹腔内へ注射した。
ical Pharm. Bull. 17(12) 1554-1560, 1994）２５０μ
ｇ／ｍｌで一晩刺激しておいた５×１０7個のＲＡＷ２
６４．７細胞を２週間おきに３回、６週齢の雄性ＤＡラ
ット（日本ＳＬＣ社製）の腹腔内へ注射した。
【００２８】（ｂ）脾臓細胞の調製 ４回目の注射の日から３日後に、ラットをクロロホルム
麻酔により屠殺し、脾臓を摘出した。これをダルベッコ
改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、日水製薬社製）中で細片
化した後、５分間氷冷し、その上清を１２００ｒｐｍで
５分間遠心した。得られた細胞をＡＣＫ−溶解バッファ
ー（８．２９ｇ／ｌ ＮＨ4Ｃｌ、１ｇ／ｌ ＫＨＣ
Ｏ3、３７．２ｍｇ／ｌ ＥＤＴＡ・２Ｎａ；ｐＨ７．
２）１５ｍｌで処理し、ＤＭＥＭで２回洗浄後、５×１
０8個の細胞を得た。
麻酔により屠殺し、脾臓を摘出した。これをダルベッコ
改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、日水製薬社製）中で細片
化した後、５分間氷冷し、その上清を１２００ｒｐｍで
５分間遠心した。得られた細胞をＡＣＫ−溶解バッファ
ー（８．２９ｇ／ｌ ＮＨ4Ｃｌ、１ｇ／ｌ ＫＨＣ
Ｏ3、３７．２ｍｇ／ｌ ＥＤＴＡ・２Ｎａ；ｐＨ７．
２）１５ｍｌで処理し、ＤＭＥＭで２回洗浄後、５×１
０8個の細胞を得た。
【００２９】（ｃ）ミエローマ細胞の調製 上記の操作と並行して、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）
を含むＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）培養液中で培
養しておいたマウスミエローマ細胞株ＮＳ−１を回収
し、ＤＭＥＭで２回洗浄後、１〜３×１０7個の細胞を
調製した。
を含むＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）培養液中で培
養しておいたマウスミエローマ細胞株ＮＳ−１を回収
し、ＤＭＥＭで２回洗浄後、１〜３×１０7個の細胞を
調製した。
【００３０】（ｄ）細胞融合 （ｂ）で調製した脾臓細胞と（ｃ）で調製したＮＳ−１
細胞を混合し、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を
完全に除去した後、あらかじめ用意しておいた３７℃の
水浴中に遠心管ごと入れた。この３７℃の水浴中で、Ｄ
ＭＥＭに溶解した５０％ポリエチレングリコール１ｍｌ
を１分間かけて加え、続いてＤＭＥＭ２ｍｌを２分間か
けて加えた後、ＤＭＥＭ６ｍｌをゆっくり撹拌しながら
加えた。これを１０００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞を
２０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ２０ｍｌに懸濁し、この懸濁液
の１０ｍｌをガラスピペットで９６ウェルプレートに２
滴／ウェルずつ播種した。
細胞を混合し、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を
完全に除去した後、あらかじめ用意しておいた３７℃の
水浴中に遠心管ごと入れた。この３７℃の水浴中で、Ｄ
ＭＥＭに溶解した５０％ポリエチレングリコール１ｍｌ
を１分間かけて加え、続いてＤＭＥＭ２ｍｌを２分間か
けて加えた後、ＤＭＥＭ６ｍｌをゆっくり撹拌しながら
加えた。これを１０００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞を
２０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ２０ｍｌに懸濁し、この懸濁液
の１０ｍｌをガラスピペットで９６ウェルプレートに２
滴／ウェルずつ播種した。
【００３１】（ｅ）ハイブリドーマのスクリーニング及
びクローニング （ｄ）で調製した細胞を播種したプレートを３７℃、５
％ＣＯ2のインキュベーターで一晩培養した後、ＨＡＴ
選択培地を加え、以後２日おきに２週間、ＨＡＴ選択培
地を交換した。２週間後、増殖した細胞の上清を蛍光活
性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いてＲＡＷ２６４．
７細胞に結合する抗体を産生するハイブリドーマのクロ
ーンをスクリーニングした。陽性クローンのみをさらに
培養し、増殖させた後、４８ウェルプレートに移して培
養した。この陽性クローンについて限界希釈を行った。
融合細胞を増殖培地（２０％Ｐ３８８Ｄ1（培地名）培
養上清、２０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ）中に懸濁し、９６ウ
ェルプレートに１細胞／ウェルとなるように播種した。
これを３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターで約２週
間培養した後、形成されたコロニーの培養上清を再度ス
クリーニングし、陽性クローンを再び限界希釈し（０．
３細胞／ウェル）、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベー
ターで約２週間培養した後、得られたクローンをハイブ
リドーマとした。
びクローニング （ｄ）で調製した細胞を播種したプレートを３７℃、５
％ＣＯ2のインキュベーターで一晩培養した後、ＨＡＴ
選択培地を加え、以後２日おきに２週間、ＨＡＴ選択培
地を交換した。２週間後、増殖した細胞の上清を蛍光活
性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いてＲＡＷ２６４．
７細胞に結合する抗体を産生するハイブリドーマのクロ
ーンをスクリーニングした。陽性クローンのみをさらに
培養し、増殖させた後、４８ウェルプレートに移して培
養した。この陽性クローンについて限界希釈を行った。
融合細胞を増殖培地（２０％Ｐ３８８Ｄ1（培地名）培
養上清、２０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ）中に懸濁し、９６ウ
ェルプレートに１細胞／ウェルとなるように播種した。
これを３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターで約２週
間培養した後、形成されたコロニーの培養上清を再度ス
クリーニングし、陽性クローンを再び限界希釈し（０．
３細胞／ウェル）、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベー
ターで約２週間培養した後、得られたクローンをハイブ
リドーマとした。
【００３２】（ｆ）ハイブリドーマの培養 得られたハイブリドーマを、１０％非働化ＦＣＳを含む
ＤＭＥＭ培養液中で３７℃で５％ＣＯ2の存在下に数日
間培養した後、５％非働化ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培養液
中で培養することにより馴化させた。さらに約２％非働
化ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培養液に馴化させた後、無血清
培地であるＰＭ−１０００（栄研化学社製）培養液中、
３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターで培養した。抗
体調製のために少なくとも３００ｍｌの培養を行い、そ
の上清を回収した。
ＤＭＥＭ培養液中で３７℃で５％ＣＯ2の存在下に数日
間培養した後、５％非働化ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培養液
中で培養することにより馴化させた。さらに約２％非働
化ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培養液に馴化させた後、無血清
培地であるＰＭ−１０００（栄研化学社製）培養液中、
３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターで培養した。抗
体調製のために少なくとも３００ｍｌの培養を行い、そ
の上清を回収した。
【００３３】（ｇ）腹腔マクロファージの調製と培養 ＩＣＲあるいはＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（日本ＳＬＣ社
製）に４％チオグリコレート（Ｄｉｆｃｏ社製）２ｍｌ
を腹腔内投与し、３日後にマウスをクロロホルム麻酔に
より屠殺した。腹腔内を５Ｕ／ｍｌヘパリン（和光純薬
社製）含有ハンクス液（日水製薬社製）５ｍｌで２回洗
浄した。得られた細胞をＲＰＭＩ１６４０で洗浄後、１
００μｌの１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、
平底プレート（２４ウェル）に１×１０6個の細胞を播
種し、培養した。
製）に４％チオグリコレート（Ｄｉｆｃｏ社製）２ｍｌ
を腹腔内投与し、３日後にマウスをクロロホルム麻酔に
より屠殺した。腹腔内を５Ｕ／ｍｌヘパリン（和光純薬
社製）含有ハンクス液（日水製薬社製）５ｍｌで２回洗
浄した。得られた細胞をＲＰＭＩ１６４０で洗浄後、１
００μｌの１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、
平底プレート（２４ウェル）に１×１０6個の細胞を播
種し、培養した。
【００３４】（ｈ）抗体の精製 ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＧ（ファルマシア社製）
を用いて抗体精製を行った。カラム容積の３倍量以上の
スタートバッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７．０）でカラムを洗浄後、２ｍｌ以上のスタートバ
ッファーでカラムの平衡化を行った。次に上述のハイブ
リドーマの培養上清をペリスタポンプ（ＡＴＴＯ）を用
いてカラムにアプライし、５ｍｌのスタートバッファー
で洗浄後、３〜５ｍｌの溶出バッファー（０．１Ｍ グ
リシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７）で、あらかじめ１Ｍトリ
ス−ＨＣｌを１００μｌ入れておいたチューブ中に抗体
を溶出させた。溶出画分をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）で透析し、ＢＣＡ法（Bicinchoninic acid法、Smit
h P.K. et al., Analytical Biochem., 150, 76-85, 19
85）によるタンパク質の定量により抗体濃度を測定し、
フィルター濾過（０．４５μｍ）により滅菌して抗体試
料を得た。試料は４℃で保存した。この抗体を４Ｃ１抗
体と命名した。
を用いて抗体精製を行った。カラム容積の３倍量以上の
スタートバッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７．０）でカラムを洗浄後、２ｍｌ以上のスタートバ
ッファーでカラムの平衡化を行った。次に上述のハイブ
リドーマの培養上清をペリスタポンプ（ＡＴＴＯ）を用
いてカラムにアプライし、５ｍｌのスタートバッファー
で洗浄後、３〜５ｍｌの溶出バッファー（０．１Ｍ グ
リシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７）で、あらかじめ１Ｍトリ
ス−ＨＣｌを１００μｌ入れておいたチューブ中に抗体
を溶出させた。溶出画分をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）で透析し、ＢＣＡ法（Bicinchoninic acid法、Smit
h P.K. et al., Analytical Biochem., 150, 76-85, 19
85）によるタンパク質の定量により抗体濃度を測定し、
フィルター濾過（０．４５μｍ）により滅菌して抗体試
料を得た。試料は４℃で保存した。この抗体を４Ｃ１抗
体と命名した。
【００３５】実施例２ サブクラスの決定 ０．１Ｍ炭酸水素塩バッファー（ｐＨ９．６）で希釈し
た抗ラットＩｇＧ１抗体（５００倍希釈）、抗ラットＩ
ｇＧ２ａ抗体（５０００倍希釈）、抗ラットＩｇＧ２ｂ
抗体（１０００倍希釈）、抗ラットＩｇＧ２ｃ抗体（５
００倍希釈）（すべてＳＩＧＭＡ社製）をそれぞれ５０
μｌずつ９６ウェルプレート（ＮＣＮＣ）の２ウェルに
入れ、４℃で一晩インキュベートした。０．０５％のＴ
ｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄後、
０．５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（ＢＰＢＳ
Ｔ）で３７℃で４０分間ブロッキングし、前記抗体試料
（４Ｃ１抗体）５０μｌを加え、３７℃で４０分間反応
を行った。そしてプレートをＰＢＳＴで洗浄後、ペルオ
キシダーゼ標識化ヤギ抗ラットＩｇＧ（１００００倍希
釈）（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）５０μｌを加え、３７
℃で４０分間反応させた後、ペルオキシダーゼ基質（Ｔ
ＭＢ ｍｉｃｒｏ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔ
ｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ；ＫＰＬ社製）で適度に発色さ
せ、１Ｎリン酸塩で反応を停止させた後、マイクロプレ
ートリーダーで４５０ｎｍ（対照：６３０ｎｍ）での吸
光度を測定した。その結果、４Ｃ１抗体はＩｇＧ２ｂの
サブクラス抗体であることが明らかとなった。従って以
下の実験においては、ＣＤ１４を認識せず、マクロファ
ージに反応性を持たない対照抗体としては抗ラットＩｇ
Ｇ２ｂモノクローナル抗体（４Ｂ１２抗体）を用いた。
た抗ラットＩｇＧ１抗体（５００倍希釈）、抗ラットＩ
ｇＧ２ａ抗体（５０００倍希釈）、抗ラットＩｇＧ２ｂ
抗体（１０００倍希釈）、抗ラットＩｇＧ２ｃ抗体（５
００倍希釈）（すべてＳＩＧＭＡ社製）をそれぞれ５０
μｌずつ９６ウェルプレート（ＮＣＮＣ）の２ウェルに
入れ、４℃で一晩インキュベートした。０．０５％のＴ
ｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄後、
０．５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（ＢＰＢＳ
Ｔ）で３７℃で４０分間ブロッキングし、前記抗体試料
（４Ｃ１抗体）５０μｌを加え、３７℃で４０分間反応
を行った。そしてプレートをＰＢＳＴで洗浄後、ペルオ
キシダーゼ標識化ヤギ抗ラットＩｇＧ（１００００倍希
釈）（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）５０μｌを加え、３７
℃で４０分間反応させた後、ペルオキシダーゼ基質（Ｔ
ＭＢ ｍｉｃｒｏ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔ
ｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ；ＫＰＬ社製）で適度に発色さ
せ、１Ｎリン酸塩で反応を停止させた後、マイクロプレ
ートリーダーで４５０ｎｍ（対照：６３０ｎｍ）での吸
光度を測定した。その結果、４Ｃ１抗体はＩｇＧ２ｂの
サブクラス抗体であることが明らかとなった。従って以
下の実験においては、ＣＤ１４を認識せず、マクロファ
ージに反応性を持たない対照抗体としては抗ラットＩｇ
Ｇ２ｂモノクローナル抗体（４Ｂ１２抗体）を用いた。
【００３６】実施例３ ４Ｃ１抗体が認識する抗原の分
子量の同定 １×１０8個のＲＡＷ２６４．７細胞を１ｍｌのＰＢＳ
に懸濁し、ＮＨＳ−ビオチン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）１
００μｌと氷上で３０分間反応させた後、細胞をＰＢＳ
で洗浄し、溶解バッファー（２０ｍＭ トリス−ＨＣ
ｌ、１４０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ
８．２のストック溶液、１％ＮＰ−４０（Ｃａｌｂｉｏ
ｃｈｅｍ−Ｎａｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）、５ｍＭ ヨ
ードアセタミド（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ フェニル
メタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ、ＳＩＧＭＡ社
製）、５０μＭ ４−（２−アミノエチル）ベンゼンス
ルホニルフルオリド（ＡＥＢＳＦ、ＳＩＧＭＡ社製））
中で氷上で３０分間反応させ、細胞を可溶化し、遠心し
（１５０００ｒｐｍ、１０分間）、得られた上清を免疫
沈降の検体とした。
子量の同定 １×１０8個のＲＡＷ２６４．７細胞を１ｍｌのＰＢＳ
に懸濁し、ＮＨＳ−ビオチン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）１
００μｌと氷上で３０分間反応させた後、細胞をＰＢＳ
で洗浄し、溶解バッファー（２０ｍＭ トリス−ＨＣ
ｌ、１４０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ
８．２のストック溶液、１％ＮＰ−４０（Ｃａｌｂｉｏ
ｃｈｅｍ−Ｎａｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）、５ｍＭ ヨ
ードアセタミド（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｍＭ フェニル
メタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ、ＳＩＧＭＡ社
製）、５０μＭ ４−（２−アミノエチル）ベンゼンス
ルホニルフルオリド（ＡＥＢＳＦ、ＳＩＧＭＡ社製））
中で氷上で３０分間反応させ、細胞を可溶化し、遠心し
（１５０００ｒｐｍ、１０分間）、得られた上清を免疫
沈降の検体とした。
【００３７】この上清１００μｌとアガロース抗ラット
ＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）５０μｌを４℃で一晩
振盪した後に遠心し、その上清を本発明及び対照の各モ
ノクローナル抗体（５μｇ）と４℃で２時間振盪して反
応させた後、１０μｌのアガロース抗ラットＩｇＧを加
え４℃で１時間振盪して反応させた。これを３０００ｒ
ｐｍで５分間遠心した後、上清を除去し、沈殿物を溶解
バッファーで５回洗浄し、サンプルバッファーを４０μ
ｌ加えて１００℃で５分間加熱した後、１０％ポリアク
リルアミドゲルに３０μｌをアプライし、ドデシル硫酸
ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）を行った。その後これをポリフッ化ビニリデ
ン（ＰＶＤＦ）膜（日本ジェネティクス社製）に転写し
た（２００ｍＡ、１．５時間）。転写後膜をＰＢＳＴで
１５分間洗浄した後、３％ＢＳＡ−ＰＢＳとともに４℃
で一晩あるいは３７℃で１時間振盪することによりブロ
ッキングを行った。その後ストレプトアビジンペルオキ
シダーゼ（２５００倍希釈）を加え、３７℃で１時間振
盪し、ＰＢＳＴで洗浄後、ＥＣＬ ＷｅｓｔｅｒｎＢｌ
ｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ社製）でバンドを化学発光させ、Ｘ線フ
ィルム（Ｘ−ＯＭＡＴ、Ｋｏｄａｋ社製）に露出した。
ＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）５０μｌを４℃で一晩
振盪した後に遠心し、その上清を本発明及び対照の各モ
ノクローナル抗体（５μｇ）と４℃で２時間振盪して反
応させた後、１０μｌのアガロース抗ラットＩｇＧを加
え４℃で１時間振盪して反応させた。これを３０００ｒ
ｐｍで５分間遠心した後、上清を除去し、沈殿物を溶解
バッファーで５回洗浄し、サンプルバッファーを４０μ
ｌ加えて１００℃で５分間加熱した後、１０％ポリアク
リルアミドゲルに３０μｌをアプライし、ドデシル硫酸
ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）を行った。その後これをポリフッ化ビニリデ
ン（ＰＶＤＦ）膜（日本ジェネティクス社製）に転写し
た（２００ｍＡ、１．５時間）。転写後膜をＰＢＳＴで
１５分間洗浄した後、３％ＢＳＡ−ＰＢＳとともに４℃
で一晩あるいは３７℃で１時間振盪することによりブロ
ッキングを行った。その後ストレプトアビジンペルオキ
シダーゼ（２５００倍希釈）を加え、３７℃で１時間振
盪し、ＰＢＳＴで洗浄後、ＥＣＬ ＷｅｓｔｅｒｎＢｌ
ｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ社製）でバンドを化学発光させ、Ｘ線フ
ィルム（Ｘ−ＯＭＡＴ、Ｋｏｄａｋ社製）に露出した。
【００３８】なお、分子量マーカーとして、ビオチン標
識化ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ−
ＲＡＤ社製）を検体と同時に泳動して検出されたバンド
の分子量を測定した。結果を図１に示す。
識化ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ−
ＲＡＤ社製）を検体と同時に泳動して検出されたバンド
の分子量を測定した。結果を図１に示す。
【００３９】図１に示すように、本発明の４Ｃ１抗体が
認識する抗原については分子量約５２〜５７ｋＤａ付近
にバンドが観察された。
認識する抗原については分子量約５２〜５７ｋＤａ付近
にバンドが観察された。
【００４０】実施例４ ４Ｃ１抗体が認識する抗原の分
子構造の同定 ＲＡＷ２６４．７細胞、骨髄マクロファージ及びカゼイ
ン誘導性顆粒球をそれぞれ２％ＦＣＳ−ＰＢＳに懸濁
し、０．１２５Ｕ／ｍｌのホスファチジルイノシトール
特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ、フナコシ社
製）とともに３７℃で３０分間反応を行った。その後細
胞を洗浄し、２μｇの４Ｃ１抗体と氷上で３０分間反応
させた。その後細胞を２％ＦＣＳ−ＰＢＳで２回洗浄
し、再度５０μｌの２％ＦＣＳ−ＰＢＳに懸濁させ、
０．４ｍｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｆ（ａ
ｂ'）2（和光純薬社製）と氷上で３０分間反応させた。
反応後細胞を２％ＦＣＳ−ＰＢＳで２回洗浄し、２％Ｆ
ＣＳ−ＰＢＳ ４００μｌに懸濁した後１０％中性緩衝
ホルムアルデヒド液（ナカライテスク社製）１００μｌ
を加え、細胞を固定しＦＡＣＳで解析した。また、対照
抗体（４Ｂ１２抗体）を用いて同様にＦＡＣＳで解析し
た。ＦＡＣＳで解析した結果を表１に示す。表１に示し
た結果から明らかなように、ＰＩ−ＰＬＣ処理細胞にお
いては蛍光強度が未処理の細胞に比べて減少し、４Ｃ１
抗体の抗原がＰＩ−ＰＬＣによって分解されるグリコシ
ルホスファチジルイノシトール結合型（ＧＰＩアンカー
型）タンパク質であることが判明した。
子構造の同定 ＲＡＷ２６４．７細胞、骨髄マクロファージ及びカゼイ
ン誘導性顆粒球をそれぞれ２％ＦＣＳ−ＰＢＳに懸濁
し、０．１２５Ｕ／ｍｌのホスファチジルイノシトール
特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ、フナコシ社
製）とともに３７℃で３０分間反応を行った。その後細
胞を洗浄し、２μｇの４Ｃ１抗体と氷上で３０分間反応
させた。その後細胞を２％ＦＣＳ−ＰＢＳで２回洗浄
し、再度５０μｌの２％ＦＣＳ−ＰＢＳに懸濁させ、
０．４ｍｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｆ（ａ
ｂ'）2（和光純薬社製）と氷上で３０分間反応させた。
反応後細胞を２％ＦＣＳ−ＰＢＳで２回洗浄し、２％Ｆ
ＣＳ−ＰＢＳ ４００μｌに懸濁した後１０％中性緩衝
ホルムアルデヒド液（ナカライテスク社製）１００μｌ
を加え、細胞を固定しＦＡＣＳで解析した。また、対照
抗体（４Ｂ１２抗体）を用いて同様にＦＡＣＳで解析し
た。ＦＡＣＳで解析した結果を表１に示す。表１に示し
た結果から明らかなように、ＰＩ−ＰＬＣ処理細胞にお
いては蛍光強度が未処理の細胞に比べて減少し、４Ｃ１
抗体の抗原がＰＩ−ＰＬＣによって分解されるグリコシ
ルホスファチジルイノシトール結合型（ＧＰＩアンカー
型）タンパク質であることが判明した。
【００４１】
【表１】
【００４２】実施例５ 抗ＣＤ１４抗体を用いたウェス
タンブロット解析 １×１０8個のＲＡＷ２６４．７細胞を溶解バッファー
中で氷上で３０分間反応させて細胞を可溶化し、遠心
（１５０００ｒｐｍ、１０分間）して得られた上清を免
疫沈降の検体とした。
タンブロット解析 １×１０8個のＲＡＷ２６４．７細胞を溶解バッファー
中で氷上で３０分間反応させて細胞を可溶化し、遠心
（１５０００ｒｐｍ、１０分間）して得られた上清を免
疫沈降の検体とした。
【００４３】この上清１００μｌとアガロース抗ラット
ＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）５０μｌを４℃で一晩
振盪して反応させ、その後遠心してその上清を公知のＣ
Ｄ１４抗体（ｒｍＣ５−３、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社
製）、４Ｃ１抗体及び対照抗体（４Ｂ１２抗体）の各５
μｇと４℃で２時間振盪して反応させ、さらにアガロー
ス抗ラットＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）１０μｌと
４℃で１時間振盪して反応させた。これを３０００ｒｐ
ｍ、５分間で遠心した後、上清を除去し、沈殿物を溶解
バッファーで５回洗浄し、サンプルバッファーを４０μ
ｌ加え、１００℃で５分間加熱した後、１０％ポリアク
リルアミドゲルに３０μｌアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを行った。
ＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）５０μｌを４℃で一晩
振盪して反応させ、その後遠心してその上清を公知のＣ
Ｄ１４抗体（ｒｍＣ５−３、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社
製）、４Ｃ１抗体及び対照抗体（４Ｂ１２抗体）の各５
μｇと４℃で２時間振盪して反応させ、さらにアガロー
ス抗ラットＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）１０μｌと
４℃で１時間振盪して反応させた。これを３０００ｒｐ
ｍ、５分間で遠心した後、上清を除去し、沈殿物を溶解
バッファーで５回洗浄し、サンプルバッファーを４０μ
ｌ加え、１００℃で５分間加熱した後、１０％ポリアク
リルアミドゲルに３０μｌアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを行った。
【００４４】その後泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜
（日本ジェネティクス社製）に転写した（２００ｍＡ、
１．５時間）。転写後、ＰＶＤＦ膜をＰＢＳで１５分間
洗浄し、３％ＢＳＡ−ＰＢＳと室温で２時間振盪するこ
とによりブロッキングを行った。そして公知の抗ＣＤ１
４抗体（ｒｍＣ５−３）と４℃で一晩反応させた。反応
後、ＰＶＤＦ膜をペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗ラット
ＩｇＧ抗体（５０００倍希釈、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社
製）と室温で２時間振盪し、ＰＢＳで洗浄した後、ＥＣ
Ｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔ
ｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）でバン
ドを化学発光させ、Ｘ線フィルム（Ｘ−ＯＭＡＴ、Ｋｏ
ｄａｋ社製）に露出した。なお、分子量マーカーとして
Ｋａｌｅｉｏｓｃｏｐｅ ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ｓｔ
ａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて分子量
を決定した。結果を図２に示す。
（日本ジェネティクス社製）に転写した（２００ｍＡ、
１．５時間）。転写後、ＰＶＤＦ膜をＰＢＳで１５分間
洗浄し、３％ＢＳＡ−ＰＢＳと室温で２時間振盪するこ
とによりブロッキングを行った。そして公知の抗ＣＤ１
４抗体（ｒｍＣ５−３）と４℃で一晩反応させた。反応
後、ＰＶＤＦ膜をペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗ラット
ＩｇＧ抗体（５０００倍希釈、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社
製）と室温で２時間振盪し、ＰＢＳで洗浄した後、ＥＣ
Ｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔ
ｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）でバン
ドを化学発光させ、Ｘ線フィルム（Ｘ−ＯＭＡＴ、Ｋｏ
ｄａｋ社製）に露出した。なお、分子量マーカーとして
Ｋａｌｅｉｏｓｃｏｐｅ ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ｓｔ
ａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて分子量
を決定した。結果を図２に示す。
【００４５】図２に示したように、公知のＣＤ１４抗体
（ｒｍＣ５−３）で免疫沈降したものと同じ分子量のバ
ンドが４Ｃ１抗体による免疫沈降物の中に検出された。
一方、対照抗体（４Ｂ１２抗体）で免疫沈降したものは
バンドが検出されなかった。実施例３及び４、及び本実
施例の結果から、４Ｃ１抗体はマウスのＣＤ１４を認識
する抗体であることが判明した。
（ｒｍＣ５−３）で免疫沈降したものと同じ分子量のバ
ンドが４Ｃ１抗体による免疫沈降物の中に検出された。
一方、対照抗体（４Ｂ１２抗体）で免疫沈降したものは
バンドが検出されなかった。実施例３及び４、及び本実
施例の結果から、４Ｃ１抗体はマウスのＣＤ１４を認識
する抗体であることが判明した。
【００４６】実施例６ 抗マウスＣＤ１４抗体（ｒｍＣ
５−３）で前処理した細胞に対する４Ｃ１抗体の結合 ＣＤ１４抗体（ｍｒＣ５−３）で前処理した細胞に対す
る４Ｃ１抗体の結合性を、４Ｃ１抗体をＦＩＴＣで標識
した複合体（ＦＩＴＣ結合４Ｃ１抗体）を用いてＦＡＣ
Ｓで解析した。
５−３）で前処理した細胞に対する４Ｃ１抗体の結合 ＣＤ１４抗体（ｍｒＣ５−３）で前処理した細胞に対す
る４Ｃ１抗体の結合性を、４Ｃ１抗体をＦＩＴＣで標識
した複合体（ＦＩＴＣ結合４Ｃ１抗体）を用いてＦＡＣ
Ｓで解析した。
【００４７】（ａ）４Ｃ１抗体のＦＩＴＣ標識化 ４Ｃ１抗体をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩ
ＴＣ）標識用バッファー（０．０５Ｍホウ酸、０．２Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ９．２）に対し４℃で２日間透析した。
透析後、吸光度Ａ280を測定し抗体濃度を求めた（抗体
濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝Ａ280×０．７４×希釈倍率）。
４Ｃ１抗体１ｍｇに対して５ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ中の
ＦＩＴＣを２０μｌ加え、室温で２時間反応させた。そ
の後、透析バッファー（０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ、
０．１％（ｖ／ｖ）ＮａＮ3、０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７．４）に対し４℃で２日間透析した。透析後、透析
内液の吸光度Ａ280及びＡ492を測定し、ＦＩＴＣ結合４
Ｃ１抗体の濃度を求めた（タンパク（ｍｇ／ｍｌ）＝Ａ
280−（Ａ492×０．３５）／１．４）。
ＴＣ）標識用バッファー（０．０５Ｍホウ酸、０．２Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ９．２）に対し４℃で２日間透析した。
透析後、吸光度Ａ280を測定し抗体濃度を求めた（抗体
濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝Ａ280×０．７４×希釈倍率）。
４Ｃ１抗体１ｍｇに対して５ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ中の
ＦＩＴＣを２０μｌ加え、室温で２時間反応させた。そ
の後、透析バッファー（０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ、
０．１％（ｖ／ｖ）ＮａＮ3、０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７．４）に対し４℃で２日間透析した。透析後、透析
内液の吸光度Ａ280及びＡ492を測定し、ＦＩＴＣ結合４
Ｃ１抗体の濃度を求めた（タンパク（ｍｇ／ｍｌ）＝Ａ
280−（Ａ492×０．３５）／１．４）。
【００４８】（ｂ）抗マウスＣＤ１４抗体（ｍｒＣ５−
３）で処理した細胞に対する４Ｃ１抗体の結合 ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０6細胞）を５０μｌの
２％ＦＣＳ−ＰＢＳに懸濁し、５μｌの４Ｃ１抗体、公
知のＣＤ１４抗体（ｍｒＣ５−３）、あるいは対照抗体
と氷上で３０分間反応させた。その後細胞を２％ＦＣＳ
−ＰＢＳで２回洗浄し、再度５０μｌの２％ＦＣＳ−Ｐ
ＢＳに懸濁し、０．５μｇのＦＩＴＣ結合４Ｃ１抗体と
氷上で３０分間反応させた。反応後、細胞を２％ＦＣＳ
−ＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌの２％ＦＣＳ−ＰＢＳ
に懸濁した後、１０％中性緩衝ホルムアルデヒド液（ナ
カライテスク社製）１００μｌを加え細胞を固定した。
その後上記と同様に細胞に結合したＦＩＴＣ結合４Ｃ１
抗体濃度を求めた。未処理のＲＡＷ２６４．７細胞につ
いても同様にＦＩＴＣ結合４Ｃ１抗体と反応させ、結合
した抗体濃度を求めた。結果を図３に示す。
３）で処理した細胞に対する４Ｃ１抗体の結合 ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０6細胞）を５０μｌの
２％ＦＣＳ−ＰＢＳに懸濁し、５μｌの４Ｃ１抗体、公
知のＣＤ１４抗体（ｍｒＣ５−３）、あるいは対照抗体
と氷上で３０分間反応させた。その後細胞を２％ＦＣＳ
−ＰＢＳで２回洗浄し、再度５０μｌの２％ＦＣＳ−Ｐ
ＢＳに懸濁し、０．５μｇのＦＩＴＣ結合４Ｃ１抗体と
氷上で３０分間反応させた。反応後、細胞を２％ＦＣＳ
−ＰＢＳで２回洗浄し、５０μｌの２％ＦＣＳ−ＰＢＳ
に懸濁した後、１０％中性緩衝ホルムアルデヒド液（ナ
カライテスク社製）１００μｌを加え細胞を固定した。
その後上記と同様に細胞に結合したＦＩＴＣ結合４Ｃ１
抗体濃度を求めた。未処理のＲＡＷ２６４．７細胞につ
いても同様にＦＩＴＣ結合４Ｃ１抗体と反応させ、結合
した抗体濃度を求めた。結果を図３に示す。
【００４９】図３に示したように、未標識の４Ｃ１抗体
で前処理した細胞において蛍光強度が減少し、ＦＩＴＣ
結合４Ｃ１抗体の細胞への結合が阻害された。しかし、
公知のＣＤ１４抗体（ｒｍＣ３−５）で前処理した細胞
においては蛍光強度が減少しなかった。これらの結果か
ら、４Ｃ１抗体は公知のＣＤ１４抗体（ｒｍＣ３−５）
が認識するエピトープと異なる部位に結合することが示
された。
で前処理した細胞において蛍光強度が減少し、ＦＩＴＣ
結合４Ｃ１抗体の細胞への結合が阻害された。しかし、
公知のＣＤ１４抗体（ｒｍＣ３−５）で前処理した細胞
においては蛍光強度が減少しなかった。これらの結果か
ら、４Ｃ１抗体は公知のＣＤ１４抗体（ｒｍＣ３−５）
が認識するエピトープと異なる部位に結合することが示
された。
【００５０】実施例７ ＬＰＳで誘導されるサイトカイ
ン産生に及ぼす４Ｃ１抗体の影響 ＲＡＷ２６４．７細胞を１×１０6細胞／ｍｌの濃度で
２４ウェルプレートの各ウェルに播種し、ＬＰＳ（１０
ｎｇ／ｍｌ）及び図４に示した各種濃度（１、１０、２
５、５０μｇ／ｍｌ）の４Ｃ１抗体の存在下で細胞を培
養し、得られた培養上清中のＴＮＦ−α及びＩＬ−６の
量をＥＬＩＳＡ法により、ＮＯ（亜硝酸）の量をＧｒｉ
ｅｓｓ試薬を用いてそれぞれ測定した。培養時間はＴＮ
Ｆ−α及びＮＯの測定については１２時間、ＩＬ−６の
測定については２４時間とした。結果を図４（ａ）〜
（ｃ）に示す。
ン産生に及ぼす４Ｃ１抗体の影響 ＲＡＷ２６４．７細胞を１×１０6細胞／ｍｌの濃度で
２４ウェルプレートの各ウェルに播種し、ＬＰＳ（１０
ｎｇ／ｍｌ）及び図４に示した各種濃度（１、１０、２
５、５０μｇ／ｍｌ）の４Ｃ１抗体の存在下で細胞を培
養し、得られた培養上清中のＴＮＦ−α及びＩＬ−６の
量をＥＬＩＳＡ法により、ＮＯ（亜硝酸）の量をＧｒｉ
ｅｓｓ試薬を用いてそれぞれ測定した。培養時間はＴＮ
Ｆ−α及びＮＯの測定については１２時間、ＩＬ−６の
測定については２４時間とした。結果を図４（ａ）〜
（ｃ）に示す。
【００５１】図４（ａ）〜（ｃ）に示したように、４Ｃ
１抗体はＬＰＳにより誘導されたマクロファージのＴＮ
Ｆ−α、ＩＬ−６及びＮＯの産生を濃度依存的に抑制し
た。これらの結果から、４Ｃ１抗体はマクロファージの
機能に抑制的に作用することが示された。
１抗体はＬＰＳにより誘導されたマクロファージのＴＮ
Ｆ−α、ＩＬ−６及びＮＯの産生を濃度依存的に抑制し
た。これらの結果から、４Ｃ１抗体はマクロファージの
機能に抑制的に作用することが示された。
【００５２】実施例８ ４Ｃ１抗体での経時的処理によ
るマクロファージの機能変化 実施例７と同様にＲＡＷ２６４．７細胞を培養したが、
ＬＰＳを添加して刺激する１、２、３時間前、０、１、
２時間後の時点でＲＡＷ２６４．７細胞を４Ｃ１抗体で
処理し（１００μｌ）、１２時間（ＴＮＦ−α及びＮＯ
の測定について）及び２４時間（ＩＬ−６の測定につい
て）培養した。ＬＰＳにより誘導されたＴＮＦ−α、Ｉ
Ｌ−６及びＮＯの量を実施例７と同様に測定した。結果
は図５に示す。結果は４Ｃ１抗体を添加しなかった場合
に対するサイトカインの産生量の減少率（産生抑制率）
で表す。
るマクロファージの機能変化 実施例７と同様にＲＡＷ２６４．７細胞を培養したが、
ＬＰＳを添加して刺激する１、２、３時間前、０、１、
２時間後の時点でＲＡＷ２６４．７細胞を４Ｃ１抗体で
処理し（１００μｌ）、１２時間（ＴＮＦ−α及びＮＯ
の測定について）及び２４時間（ＩＬ−６の測定につい
て）培養した。ＬＰＳにより誘導されたＴＮＦ−α、Ｉ
Ｌ−６及びＮＯの量を実施例７と同様に測定した。結果
は図５に示す。結果は４Ｃ１抗体を添加しなかった場合
に対するサイトカインの産生量の減少率（産生抑制率）
で表す。
【００５３】図５に示したように、４Ｃ１抗体で刺激の
前に処理した場合、及び同時に処理した場合（０時間）
は、ＬＰＳにより誘導されるＴＮＦ−α、ＩＬ−６及び
ＮＯの産生が抑制された。ＩＬ−６産生においては、３
時間前処理から同時処理まで高い抑制率を示したが、刺
激後に処理した場合は抑制作用が全く見られなかった。
ＴＮＦ−α及びＮＯ産生においては、前処理したときの
抑制率が、ＴＮＦ−αで３０〜５０％、ＮＯで１５％〜
３０％でありＩＬ−６と比べて低かったが、刺激後に処
理した場合はＩＬ−６と同様に抑制作用がほとんどみら
れなかった。以上の結果から、４Ｃ１抗体はマクロファ
ージの活性化の初期段階に対して抑制的に作用すること
が示された。
前に処理した場合、及び同時に処理した場合（０時間）
は、ＬＰＳにより誘導されるＴＮＦ−α、ＩＬ−６及び
ＮＯの産生が抑制された。ＩＬ−６産生においては、３
時間前処理から同時処理まで高い抑制率を示したが、刺
激後に処理した場合は抑制作用が全く見られなかった。
ＴＮＦ−α及びＮＯ産生においては、前処理したときの
抑制率が、ＴＮＦ−αで３０〜５０％、ＮＯで１５％〜
３０％でありＩＬ−６と比べて低かったが、刺激後に処
理した場合はＩＬ−６と同様に抑制作用がほとんどみら
れなかった。以上の結果から、４Ｃ１抗体はマクロファ
ージの活性化の初期段階に対して抑制的に作用すること
が示された。
【００５４】実施例９ ＦＩＴＣ結合ＬＰＳを用いたＬ
ＰＳ結合阻害に関する解析 １×１０6のＲＡＷ２６４．７細胞を１００μｌの１０
％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、ＦＩＴＣ結合Ｌ
ＰＳ（５μｇ／ｍｌ、ＳＩＧＭＡ社製）の存在下、ＬＰ
Ｓ（５００μｇ／ｍｌ）、４Ｃ１抗体（２５μｇ／ｍ
ｌ）あるいは対照としての４Ｂ１２抗体を加え、４℃で
１８時間反応させた後、細胞を５０％ＦＣＳ−ＰＢＳに
懸濁し、遠心した。上清を除去した後細胞を２％ＦＣＳ
−ＰＢＳに懸濁し、ＦＡＣＳにより解析した。結果を図
６に示す。
ＰＳ結合阻害に関する解析 １×１０6のＲＡＷ２６４．７細胞を１００μｌの１０
％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、ＦＩＴＣ結合Ｌ
ＰＳ（５μｇ／ｍｌ、ＳＩＧＭＡ社製）の存在下、ＬＰ
Ｓ（５００μｇ／ｍｌ）、４Ｃ１抗体（２５μｇ／ｍ
ｌ）あるいは対照としての４Ｂ１２抗体を加え、４℃で
１８時間反応させた後、細胞を５０％ＦＣＳ−ＰＢＳに
懸濁し、遠心した。上清を除去した後細胞を２％ＦＣＳ
−ＰＢＳに懸濁し、ＦＡＣＳにより解析した。結果を図
６に示す。
【００５５】図６に示したように、 ＦＩＴＣ結合ＬＰ
Ｓの１００倍量の未標識のＬＰＳを共存させたとき、何
も存在させなかった細胞（無処理）に比べて蛍光強度が
減少したことから、ＦＩＴＣ結合ＬＰＳのマクロファー
ジへの結合が阻害されたことが示された。また４Ｃ１抗
体を共存させた場合においても同様にＦＩＴＣ結合ＬＰ
Ｓのマクロファージへの結合が阻害されたことが示され
た。一方、対照抗体（４Ｂ１２抗体）を用いた場合はそ
のような現象は認められなかった。以上の結果より、４
Ｃ１抗体の認識部位はＣＤ１４のＬＰＳ結合部位であ
り、またＬＰＳにより誘導されるサイトカイン及びＮＯ
産生に対して４Ｃ１抗体が抑制作用を示す現象は、ＬＰ
Ｓが細胞表面上の結合部位に結合するのを４Ｃ１抗体が
阻害していることによるものであることが示された。
Ｓの１００倍量の未標識のＬＰＳを共存させたとき、何
も存在させなかった細胞（無処理）に比べて蛍光強度が
減少したことから、ＦＩＴＣ結合ＬＰＳのマクロファー
ジへの結合が阻害されたことが示された。また４Ｃ１抗
体を共存させた場合においても同様にＦＩＴＣ結合ＬＰ
Ｓのマクロファージへの結合が阻害されたことが示され
た。一方、対照抗体（４Ｂ１２抗体）を用いた場合はそ
のような現象は認められなかった。以上の結果より、４
Ｃ１抗体の認識部位はＣＤ１４のＬＰＳ結合部位であ
り、またＬＰＳにより誘導されるサイトカイン及びＮＯ
産生に対して４Ｃ１抗体が抑制作用を示す現象は、ＬＰ
Ｓが細胞表面上の結合部位に結合するのを４Ｃ１抗体が
阻害していることによるものであることが示された。
【００５６】
【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、マクロ
ファージ細胞表面リセプターＣＤ１４のリポポリサッカ
ライド結合部位を認識し、ＬＰＳとの結合を拮抗的に阻
害することにより、初期段階においてＴＮＦ、ＩＬ−６
及びＮＯ等の炎症性メディエーターの産生を抑えること
から、敗血症発症のメカニズムの解明及び治療に有用で
ある。
ファージ細胞表面リセプターＣＤ１４のリポポリサッカ
ライド結合部位を認識し、ＬＰＳとの結合を拮抗的に阻
害することにより、初期段階においてＴＮＦ、ＩＬ−６
及びＮＯ等の炎症性メディエーターの産生を抑えること
から、敗血症発症のメカニズムの解明及び治療に有用で
ある。
【図１】 ビオチン標識化ＲＡＷ２６４．７細胞溶解物
の免疫沈降から得た４Ｃ１抗体が結合する抗原のＳＤＳ
−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
の免疫沈降から得た４Ｃ１抗体が結合する抗原のＳＤＳ
−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図２】 ＲＡＷ２６４．７細胞溶解物の４Ｃ１抗体に
よる免疫沈降から得た４Ｃ１抗体が結合する抗原のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
よる免疫沈降から得た４Ｃ１抗体が結合する抗原のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図３】 ＣＤ１４抗体で処理したＲＡＷ２６４．７細
胞に対する４Ｃ１抗体の結合性のＦＡＣＳによる分析の
結果を示す図である。
胞に対する４Ｃ１抗体の結合性のＦＡＣＳによる分析の
結果を示す図である。
【図４】 ＬＰＳで刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞に
よるサイトカイン及びＮＯの産生における４Ｃ１抗体の
阻害効果の試験結果を示す図である。
よるサイトカイン及びＮＯの産生における４Ｃ１抗体の
阻害効果の試験結果を示す図である。
【図５】 ＲＡＷ２６４．７細胞の活性化における４Ｃ
１抗体の阻害効果の試験結果を示す図である。
１抗体の阻害効果の試験結果を示す図である。
【図６】 ＲＡＷ２６４．７へのＦＩＴＣ標識化ＬＰＳ
結合における４Ｃ１抗体の競合効果の試験結果を示す図
である。
結合における４Ｃ１抗体の競合効果の試験結果を示す図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA43 DA02 GA03 GA18 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 CE12 DA01 4H045 AA11 CA40 DA76 EA24 FA72 GA26
Claims (3)
- 【請求項１】 マクロファージ細胞表面リセプターＣＤ
１４のリポポリサッカライド結合部位を認識し、単球ま
たはマクロファージ系細胞に対する結合活性を有するモ
ノクローナル抗体。 - 【請求項２】 単球またはマクロファージ系細胞で免疫
された哺乳動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合し
て得られるハイブリドーマにより産生される請求項１に
記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 単球またはマクロファージ系細胞がマウ
ス由来のＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩ
Ｂ７１）である請求項１または２に記載のモノクローナ
ル抗体。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10253002A JP2000086699A (ja) | 1998-09-07 | 1998-09-07 | 細胞表面抗原ｃｄ１４を認識する新規なモノクローナル抗体 |
| CA2264509A CA2264509C (en) | 1998-09-07 | 1999-03-04 | Novel monoclonal antibody recognizing cell surface antigen cd14 |
| US09/262,313 US6245897B1 (en) | 1998-09-07 | 1999-03-04 | Monoclonal antibody recognizing cell surface antigen CD14 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10253002A JP2000086699A (ja) | 1998-09-07 | 1998-09-07 | 細胞表面抗原ｃｄ１４を認識する新規なモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000086699A true JP2000086699A (ja) | 2000-03-28 |
Family
ID=17245131
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10253002A Pending JP2000086699A (ja) | 1998-09-07 | 1998-09-07 | 細胞表面抗原ｃｄ１４を認識する新規なモノクローナル抗体 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6245897B1 (ja) |
| JP (1) | JP2000086699A (ja) |
| CA (1) | CA2264509C (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001072993A1 (fr) * | 2000-03-31 | 2001-10-04 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Inhibiteur de liaison entre le recepteur de type toll et cd14 |
| JPWO2006109533A1 (ja) * | 2005-03-31 | 2008-10-23 | 国立大学法人大阪大学 | 細胞膜表面抗原エピトープに対する抗体の作製法及びアッセイ法 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070055367A1 (en) * | 2000-03-15 | 2007-03-08 | Orbus Medical Technologies, Inc. | Medical device with coating that promotes endothelial cell adherence and differentiation |
| US8460367B2 (en) * | 2000-03-15 | 2013-06-11 | Orbusneich Medical, Inc. | Progenitor endothelial cell capturing with a drug eluting implantable medical device |
| US20030229393A1 (en) * | 2001-03-15 | 2003-12-11 | Kutryk Michael J. B. | Medical device with coating that promotes cell adherence and differentiation |
| US20070141107A1 (en) * | 2000-03-15 | 2007-06-21 | Orbusneich Medical, Inc. | Progenitor Endothelial Cell Capturing with a Drug Eluting Implantable Medical Device |
| ATE362382T1 (de) | 2000-03-15 | 2007-06-15 | Orbusneich Medical Inc | Beschichtung welche ein anhaften von endothelzellen stimuliert |
| US9522217B2 (en) | 2000-03-15 | 2016-12-20 | Orbusneich Medical, Inc. | Medical device with coating for capturing genetically-altered cells and methods for using same |
| US8088060B2 (en) | 2000-03-15 | 2012-01-03 | Orbusneich Medical, Inc. | Progenitor endothelial cell capturing with a drug eluting implantable medical device |
| WO2005107817A2 (en) * | 2004-04-30 | 2005-11-17 | Orbus Medical Technologies, Inc. | Medical device with coating for capturing genetically-altered cells and methods of using same |
| TWI726228B (zh) * | 2017-08-09 | 2021-05-01 | 國立臺灣大學 | Ｃｄ１４拮抗分子用於治療癌症 |
| CN116444673B (zh) * | 2023-06-14 | 2023-09-15 | 北京汇智和源生物技术有限公司 | 人源膜cd14单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4701408A (en) * | 1984-01-30 | 1987-10-20 | Smithkline Beckman Corporation | Monoclonal antibody to activated macrophages |
-
1998
- 1998-09-07 JP JP10253002A patent/JP2000086699A/ja active Pending
-
1999
- 1999-03-04 CA CA2264509A patent/CA2264509C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-04 US US09/262,313 patent/US6245897B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001072993A1 (fr) * | 2000-03-31 | 2001-10-04 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Inhibiteur de liaison entre le recepteur de type toll et cd14 |
| JPWO2006109533A1 (ja) * | 2005-03-31 | 2008-10-23 | 国立大学法人大阪大学 | 細胞膜表面抗原エピトープに対する抗体の作製法及びアッセイ法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2264509C (en) | 2010-07-06 |
| US6245897B1 (en) | 2001-06-12 |
| CA2264509A1 (en) | 2000-03-07 |
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