JP2022548066A - 抗ｐｄ－ｌ１単一ドメイン抗体ならびにその誘導体および使用 - Google Patents

抗ｐｄ－ｌ１単一ドメイン抗体ならびにその誘導体および使用 Download PDF

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Abstract

抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）であって、ＶＨＨ鎖のＣＤＲが、以下：配列番号５ｎ＋１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；配列番号５ｎ＋２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、または配列番号２に示される配列と８５％より高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および配列番号５ｎ＋３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３；を含み、各ｎが、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が提供される。

Description

発明の詳細な説明
技術分野
本出願は、生物医学または生物薬学の技術分野、および特に、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体ならびにその誘導体ならびにその使用に関する。
背景
ＣＤ２７４としても公知の、プログラム死１リガンド１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ １ ｌｉｇａｎｄ １）（ＰＤ－Ｌ１）は、Ｂ７ファミリーのメンバーであり、ＰＤ－１のリガンドである。ＰＤ－Ｌ１は、合計２９０個のアミノ酸からなるＩ型膜貫通タンパク質であり、１つのＩｇＶ様領域、１つのＩｇＣ様領域、１つの膜貫通疎水性領域、および３０個のアミノ酸で構成される１つの細胞内領域を含む。
ＰＤ－Ｌ１は、免疫応答を負に調節する効果を生じる。ＰＤ－Ｌ１が、主に、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞などに発現することが研究を通して見出されている。リンパ球に加えて、ＰＤ－Ｌ１はまた、例えば胸腺、心臓、胎盤などの多くの他の組織の内皮細胞、および例えば黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞癌、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がん、頭頚部がんなどの様々な非リンパ球系にも発現している。ＰＤ－Ｌ１は、自己反応性Ｔ細胞およびＢ細胞を調節することならびに免疫寛容において一定の万能性を有し、末梢組織におけるＴ細胞およびＢ細胞応答において役割を果たす。腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１の高発現は、がん患者の予後不良に関連づけられる。
ＣＤ２７９としても公知の、ＰＤ－Ｌ１と組み合わされたプログラム死－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－１）（ＰＤ－１）は、Ｂ７－ＣＤ２８スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ２７９の細胞質領域は、２個のチロシン残基を含有し、Ｎ末端近くの１個は、免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）内に位置し、Ｃ末端近くのもう一方は、免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）内に位置する。ＰＤ－１は、主に、活性化Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、およびマクロファージの表面上に発現している。正常な状況下で、ＰＤ－１は、Ｔリンパ球の機能を抑制し、かつＴｒｅｇ細胞の機能を促進することができ、それにより、自己免疫応答を抑制し、かつ自己免疫疾患の発生を予防する。しかしながら、腫瘍の発生において、腫瘍細胞により発現したＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合は、リンパ球を抑制することにより腫瘍の免疫逃避（ｉｍｍｕｎｅ ｅｓｃａｐｅ）を促進することができる。ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合は、リンパ球の増殖および活性化を抑制すること、ＣＤ４＋ Ｔ細胞のＴｈ１細胞およびＴｈ１７細胞への分化を抑制すること、ならびに炎症性サイトカインの放出を抑制することなどの様々な生物学的変化および免疫調節を引き起こし得る。
がん診断および標的治療におけるモノクローナル抗体の適用の成功は、腫瘍治療に革命を起こした。伝統的なモノクローナル抗体（１５０ｋＤ）は、組織を貫通するそれらの性向を邪魔し得る高分子量を有し、結果として、腫瘍における低い効果濃度、および不十分な治療効果を生じる。加えて、伝統的な抗体の長い開発期間、高い製造費用、不十分な安定性、および多くの他の因子が、それらの臨床適用および普及を制限している。
単一ドメイン抗体は、現在、最も小さい抗体分子であり、その分子量（Ｆｃなし）は、通常の抗体の分子量の１／１０である。モノクローナル抗体の抗原反応性に加えて、単一ドメイン抗体はまた、低分子量、高い安定性、良い可溶性、容易な発現、高い組織貫通性、単純なヒト化、および低い調製費用などの独特な機能特性も有し、伝統的な抗体の欠点を克服し得る。
しかしながら、当分野において、ＰＤ－Ｌ１に対する満足できる単一ドメイン抗体は未だ存在していない。したがって、ＰＤ－Ｌ１に対して有効である特異的な単一ドメイン抗体を開発するという緊急の必要性が、この分野においてある。
概要
本出願の目的は、ＰＤ－Ｌ１に対して有効である特異的な単一ドメイン抗体のクラスを提供することである。
本出願の第１の態様において、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が提供される。ＶＨＨ鎖のＣＤＲは、以下：
配列番号５ｎ＋１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
配列番号５ｎ＋２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、または配列番号２に示される配列と８５％より高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
配列番号５ｎ＋３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３
からなる。
各ｎは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
別の好ましい実施形態において、ｎは０または１である。
別の好ましい実施形態において、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２、７、８１、８４、８７、９０、９３、または９６に示される。
別の好ましい実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、ＶＨＨ鎖のフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４によって分離されている。
本出願の第２の態様において、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖が提供される。抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖は、本出願の第１の態様によるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
別の好ましい実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、配列番号５ｎ＋４、８２、８５、８８、９１、９４、または９７に示される。
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
上記のアミノ酸配列のうちのいずれか１つは、１～８個（好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸残基の付加、欠失、修飾、および／または置換により得られ、かつ抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＰＤ－Ｌ１結合親和性を保持することができる誘導体配列も含む。
別の好ましい実施形態において、ｎは０または１である。
別の好ましい実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、配列番号４、９、８２、８５、８８、９１、９４、または９７に示される。
本出願の第３の態様において、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体が提供される。抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体は、ＰＤ－Ｌ１エピトープに対する単一ドメイン抗体であり、かつ本出願の第２の態様による抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖を有する。
本出願の第４の態様において、ポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドは、本出願の第１の態様による抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖のＣＤＲ領域、本出願の第２の態様による抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、または本出願の第３の態様による抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を含むタンパク質の群から選択されるタンパク質をコードする。
別の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号５ｎ、８３、８６、８９、９２、９５、または９８に示されるアミノ酸配列を有する。
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である。
別の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
本出願の第５の態様において、発現ベクターが提供される。発現ベクターは、本出願の第４の態様によるポリヌクレオチドを含有する。
別の好ましい実施形態において、発現ベクターはまた、免疫グロブリンのＦｃ断片をコードするヌクレオチド配列も含有する。
別の好ましい実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。
本出願の第６の態様において、宿主細胞が提供される。宿主細胞は本出願の第５の態様による発現ベクターを含有するか、または宿主細胞のゲノムが本出願の第４の態様によるポリヌクレオチドと統合されている。
別の好ましい実施形態において、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞を含む。
別の好ましい実施形態において、宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、酵母細胞、および哺乳動物細胞の群から選択される。
本出願の第７の態様において、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を作製する方法が提供され、その方法は以下のステップを含む：
（ａ）本出願の第６の態様による宿主細胞を、単一ドメイン抗体の作製に適した条件下で培養し、それにより、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を含有する培養物を得るステップ；および
（ｂ）抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を培養物から単離または回収するステップ。
別の好ましい実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体は、配列番号５ｎ＋４、８２、８５、８８、９１、９４、または９７に示されるアミノ酸配列を有する。
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
本出願の第８の態様において、単一ドメイン抗体融合タンパク質が提供される。単一ドメイン抗体融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ式Ｉに示される構造を有する。
Ｚ１－Ｚ２－Ｌ－Ｚ３ （式Ｉ）
式中、
Ｚ１は、本出願の第２の態様による抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖であり；
Ｚ２は、免疫グロブリンのＦｃ断片であり；
Ｌは、リンカー配列であり；
Ｚ３は、免疫調節性分子部分である。
別の好ましい実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。
別の好ましい実施形態において、Ｚ２のアミノ酸配列は、配列番号９９に示される。
別の好ましい実施形態において、Ｚ２のアミノ酸配列は、配列番号９９に示されるアミノ酸配列と同じまたは実質的に同じである。
別の好ましい実施形態において、Ｌは、ＧＧＧＧＳ、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４、（ＧＧＧＧＳ）５、またはこれらの組合せを含む群から選択されるアミノ酸配列を有する。
別の好ましい実施形態において、Ｌのアミノ酸配列は、配列番号１００に示される。
別の好ましい実施形態において、Ｌのアミノ酸配列は、配列番号１００に示されるアミノ酸配列と同じまたは実質的に同じである。
別の好ましい実施形態において、免疫調節性分子は、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインである。
別の好ましい実施形態において、Ｚ３のアミノ酸配列は、配列番号１０１に示される。
別の好ましい実施形態において、Ｚ３のアミノ酸配列は、配列番号１０１に示されるアミノ酸配列と同じまたは実質的に同じである。
別の好ましい実施形態において、実質的に同じとは、多くとも５０個（好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、最も好ましくは１～３個）のアミノ酸が異なることを示し、その違いは、アミノ酸の置換、欠失、または付加を含む。
別の好ましい実施形態において、実質的に同じとは、アミノ酸配列と対応するアミノ酸配列の配列同一性が、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であることを示す。
別の好ましい実施形態において、単一ドメイン抗体融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１０２に示される。
本出願の第９の態様において、イムノコンジュゲート（免疫複合体、ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）が提供される。イムノコンジュゲートは：
（ａ）本出願の第２の態様による抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、本出願の第３の態様による抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体、または本出願の第８の態様による単一ドメイン抗体融合タンパク質；および
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素を含む群から選択されるカップリング部分（ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）
を含む。
別の好ましい実施形態において、カップリング部分は、薬物または毒素である。
別の好ましい実施形態において、カップリング部分は、検出可能なマーカーである。
別の好ましい実施形態において、コンジュゲートは、蛍光もしくは発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）もしくはＣＴ（電子コンピュータＸ線断層撮影）造影剤、または検出可能な産物を産生する能力がある酵素、放射性核種、生体毒素、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２および同様のもの）、抗体、抗体Ｆｃ断片、抗体ｓｃＦｖ断片、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、磁気ナノ粒子、プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様タンパク質（ＢＰＨＬ））、化学療法剤（例えば、シスプラチン）、または任意の型のナノ粒子もしくは同様のものから選択される。
別の好ましい実施形態において、イムノコンジュゲートは、多価（例えば、二価）の、本出願の第２の態様による抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、本出願の第３の態様による抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体、または本出願の第８の態様による単一ドメイン抗体融合タンパク質を含有する。
別の好ましい実施形態において、多価とは、イムノコンジュゲートのアミノ酸配列が、複数の繰り返された、本出願の第２の態様による抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、本出願の第３の態様による抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体、または本出願の第８の態様による単一ドメイン抗体融合タンパク質を含有することを示す。
本出願の第１０の態様において、本出願の第３の態様による抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体または本出願の第８の態様による単一ドメイン抗体融合タンパク質の使用が提供され、それが、（ａ）ＰＤ－Ｌ１分子を検出するために用いられる試薬、および（ｂ）腫瘍を処置するために用いられる薬物の調製に用いられる。
別の好ましい実施形態において、検出には、フローサイトメトリーおよび細胞免疫蛍光検出が挙げられる。
本出願の第１１の態様において、薬学的組成物が提供され：
（ｉ）本出願の第１の態様による抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖のＣＤＲ、本出願の第２の態様による抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、本出願の第３の態様による抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体、本出願の第８の態様による単一ドメイン抗体融合タンパク質、または本出願の第９の態様によるイムノコンジュゲート；および
（ｉｉ）薬学的に許容される担体
を含む。
別の好ましい実施形態において、薬学的組成物は注射剤の形態をとる。
別の好ましい実施形態において、薬学的組成物は、腫瘍を処置するための薬物を製造するために用いられ、腫瘍は、胃がん、肝臓がん、白血病、腎臓腫瘍、肺がん、小腸癌、骨がん、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がん、結腸がん、子宮頚がん、リンパ腫、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、またはこれらの組合せを含む群から選択される。
本出願の第１２の態様において、以下のための、本出願の第３の態様による抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体または本出願の第８の態様による単一ドメイン抗体融合タンパク質の１つまたは複数の使用が：
（ｉ）ヒトＰＤ－Ｌ１分子の検出のため；
（ｉｉ）フローサイトメトリーのため；
（ｉｉｉ）細胞免疫蛍光検出のため；
（ｉｖ）腫瘍処置のため；および
（ｖ）腫瘍診断のため、
に提供される。
別の好ましい実施形態において、使用は非診断的および非治療的である。
本出願の第１３の態様において、組換えタンパク質が提供される。組換えタンパク質は：
（ｉ）本出願の第２の態様による重鎖可変領域ＶＨＨの配列、本出願の第３の態様による単一ドメイン抗体の配列、または本出願の第８の態様による単一ドメイン抗体融合タンパク質；ならびに
（ｉｉ）発現および／または精製を補助する任意選択のタグ配列
を含む。
別の好ましい実施形態において、タグ配列には、６Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｆｃタグ、ＨＳＡもしくは抗ＨＳＡ抗体もしくは単一ドメイン抗体、またはこれらの組合せが挙げられる。
別の好ましい実施形態において、組換えタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質と特異的に結合する。
本出願の第１４の態様において、本出願の第２の態様によるＶＨＨ鎖、本出願の第３の態様による単一ドメイン抗体、本出願の第８の態様による単一ドメイン抗体融合タンパク質、または本出願の第９の態様によるイムノコンジュゲートの使用が提供され、それが、医薬、試薬、検出プレート、またはキットの製造に用いられる。
試薬、検出プレート、またはキットは、試料におけるＰＤ－Ｌ１タンパク質を検出するために用いられる。
医薬は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質を発現する（すなわち、ＰＤ－Ｌ１陽性）腫瘍を処置または予防するために用いられる。
別の好ましい実施形態において、腫瘍には、胃がん、リンパ腫、肝臓がん、白血病、腎臓腫瘍、肺がん、小腸癌、骨がん、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がん、結腸がん、副腎腫瘍（ｄｒｅｎａｌ ｇｌａｎｄ ｔｕｍｏｒ）、またはこれらの組合せが挙げられる。
本出願の第１５の態様において、試料におけるＰＤ－Ｌ１タンパク質を検出するための方法が提供され、その方法は、以下のステップを含む：
（１）本出願の第３の態様による単一ドメイン抗体または本出願の第８の態様による単一ドメイン抗体融合タンパク質と試料を接触させるステップ；および
（２）抗原－抗体複合体が形成されているかどうかを検出するステップであって、複合体の形成が、試料におけるＰＤ－Ｌ１タンパク質の存在を示す、ステップ。
別の好ましい実施形態において、検出には、定性的検出および定量的検出が挙げられる。
本出願の第１６の態様において、疾患を処置するための方法が提供される。方法は、本出願の第３の態様による単一ドメイン抗体、本出願の第８の態様による単一ドメイン抗体融合タンパク質、または本出願の第９の態様によるイムノコンジュゲートを有効量で、必要としている対象に投与するステップを含む。
別の好ましい実施形態において、対象には哺乳動物が挙げられる。
別の好ましい実施形態において、哺乳動物はヒトである。
本出願の範囲内で、上記の本出願の技術的特徴および下で具体的に記載される技術的特徴（例えば、実施形態）が、お互いに組み合わされて、新しいまたは好ましい技術的ソルーションを形成し得ることは理解されるべきである。紙面の制約上、より多くのコンテンツを本明細書では繰り返さない。
本出願の単一ドメイン抗体が細胞表面上のヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質と結合し得ること、およびその抗体の一部の結合効果が陽性対照のそれと類似していることを示す図である。 改変型単一ドメイン抗体が細胞表面上のヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質とさらに結合し得ること、およびその抗体の結合効果が陽性対照のそれと類似していることを示す図である。 改変型単一ドメイン抗体が細胞表面上のヒトＰＤ－１タンパク質へのＰＤ－Ｌ１タンパク質の結合をさらにブロックし得ること、およびその抗体のブロッキング効果が陽性対照のそれと類似していることを示す図である。 本出願の単一ドメイン抗体がＴ細胞を効果的に活性化し得ること、およびその活性化効果が陽性対照の抗体のそれと類似しまたはそれより良いことを示す図である。 融合タンパク質の概略的構造図である。 本出願の融合タンパク質が細胞表面上のヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質と結合し得ることを示す図である。 本出願の融合タンパク質が、細胞表面上のヒトＰＤ－１タンパク質へのＰＤ－Ｌ１タンパク質の結合をブロックし得ること、および抗体のブロッキング効果が陽性対照のそれと類似していることを示す図である。 本出願の融合タンパク質がＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３と結合し得ることを示す図である。 本出願の融合タンパク質が、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤシグナル経路を効果的にブロックし得ることを示す図である。 本出願の融合タンパク質がＴ細胞を効果的に活性化し得ること、およびその活性化効果が陽性対照の抗体のそれと類似しまたはそれより良いことを示す図である。 本出願の融合タンパク質がマウスにおいて腫瘍成長を効果的に阻害し得ることを示す図である。 本出願のＰＤ－Ｌ１－ＶＨＨ結晶試料の写真を示す図である。 本出願のＰＤ－Ｌ１－ＶＨＨ複合体の結晶構造を示す図である（上方の構造がＰＤ－Ｌ１であり、下方の構造がＶＨＨである）。 本出願のＰＤ－Ｌ１－ＶＨＨの水素結合相互作用界面を示す図である（上方の構造がＰＤ－Ｌ１であり、下方の構造がＶＨＨである）。 本出願のＰＤ－Ｌ１－ＶＨＨの疎水性相互作用界面を示す図である（上方の構造がＰＤ－Ｌ１であり、下方の構造がＶＨＨである）。 ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８腫瘍を移植されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインマウスの腫瘍体積への異なる薬物群の効果を示す図である。 接種から２７日後の異なる薬物群における腫瘍の写真である。 ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８腫瘍を移植されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインマウスの腫瘍重量への薬物の各群の効果を示す図である。 ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８腫瘍を移植されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインマウスの体重への異なる薬物群の効果を示す図である。 ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８腫瘍を移植されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインマウスの腫瘍体積への異なる薬物群の効果を示す図である。 接種から２８日後の異なる薬物群における腫瘍の写真である。 ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８腫瘍を移植されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインマウスの腫瘍重量への薬物の各群の効果を示す図である。 ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８腫瘍を移植されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインマウスの体重への異なる薬物群の効果を示す図である。
詳細な説明
広範かつ徹底的な研究および広範なスクリーニング後、本発明者らは、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のクラスを開発した。実験結果は、本出願において得られたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体およびその変異誘導体が、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の相互作用を効果的にブロックすることができ、相対的に良い熱安定性を有することを示している。
具体的には、本出願は、ラマを免疫するためにヒト由来ＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質を用いて、単一ドメイン抗体遺伝子配列を含有する高品質免疫ライブラリーを得た。本発明者らは、免疫単一ドメイン抗体遺伝子ライブラリーから、相対的に高いヒト化レベル（配列同一性＞８５％）を示す遺伝子配列を有する単一ドメイン抗体についてスクリーニングした。ＰＤ－Ｌ１タンパク質分子を、ビオチン化に供し、単一ドメイン抗体の配列を含有する免疫ライブラリーを、酵母ディスプレイテクノロジーを用いてスクリーニングし、このようにして、ＰＤ－Ｌ１に特異的な候補単一ドメイン抗体の遺伝子を得た。次いで、得られた遺伝子およびその操作型変異体を、Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ細胞へ移入し、抗体親和性、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合をブロックする能力、熱安定性、およびＴ細胞活性の活性化の側面においてさらにスクリーニングして、単一ドメイン抗体のクラスおよびパネルを得、それは、ヒトＰＤ－Ｌ１抗原に対する高い結合特異性を有し、インビボで効率的に発現することができる。
加えて、実験結果は、本出願の単一ドメイン抗体（ターゲティング部分として）をＩｇＧ１ Ｆｃ断片（連結部分として）およびＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメイン（免疫調節性分子部分として）と融合することにより産生される融合タンパク質が、ＰＤ－Ｌ１と高い活性があり、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の相互作用を効果的にブロックし、ＴＧＦ－β／ＳＭＡＤシグナル経路を効果的にブロックし、ヒトＴリンパ球を効果的に活性化し、マウスにおいて腫瘍成長を効果的に阻害し得ることを示している。
加えて、実験結果は、本出願の単一ドメイン抗体が、マウスにおいて、皮下に移植された腫瘍の成長を有意に阻害し得、腫瘍重量を低下させ得ることを示している。同じモル用量における腫瘍成長への阻害効果は、類似分子、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体、およびＴＧＦ－βＲＩＩ－Ｆｃ融合タンパク質のそれより高く、疾患の動物モデルへの明らかな毒性を有さない。
これに基づいて、本出願は完成している。
本出願の単一ドメイン抗体
本明細書で用いられる場合、用語「本出願の単一ドメイン抗体」、「本出願の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体」、および「本出願のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体」は、交換可能に用いられ、全て、ＰＤ－Ｌ１（ヒトＰＤ－Ｌ１を含む）を認識し、かつそれへ結合することにおける特異性を有する単一ドメイン抗体を指す。配列番号４、９、８２、８５、８８、９１、９４、または９７に示されるＶＨＨ鎖のアミノ酸配列を有する単一ドメイン抗体が特に好ましい。
本明細書で用いられる場合、用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、２つの同一の軽鎖（Ｌ）および２つの同一の重鎖（Ｈ）からなる同じ構造特性を有する約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、重鎖に共有結合性ジスルフィド結合を通して連結されており、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間でのジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖および軽鎖はまた、規則的間隔での鎖内ジスルフィド結合も有する。各重鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＨ）、続いて複数の定常領域を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変領域（ＶＬ）および他方の末端に定常領域を有する；各軽鎖の定常領域は、対応する重鎖の第１の定常領域に関連し、各軽鎖の可変領域は、対応する重鎖の可変領域に関連する。特別なアミノ酸残基が、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域の間の界面を形成する。
本明細書で用いられる場合、用語「単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）」および「ナノボディ」は同じ意味をもち、抗体の重鎖の可変領域をクローニングし、１つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を構築することを指し、単一ドメイン抗体は、完全な機能を有する最も小さい抗原結合断片である。通常、軽鎖および重鎖定常領域１（ＣＨ１）が天然で欠損している抗体を得た後、抗体の重鎖の可変領域が、クローニングされて、１つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を構築する。
本明細書で用いられる場合、用語「可変性の」とは、抗体の可変領域のある特定の部分が配列において異なり、その結果、特定の抗原に対する様々な特異的抗体の結合および特異性が形成されることを意味する。しかしながら、可変性は、抗体の可変領域全体において均等に分布しているのではない。可変性は、ＣＤＲまたは超可変領域として公知の、軽鎖可変領域および重鎖可変領域における３つの断片に集中している。可変領域のより保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、４つのＦＲを含有し、そのＦＲは、おおまかにβ折畳み立体配置（β－ｆｏｌｄｅｄ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）にあり、接続ループを形成する３つのＣＤＲにより接続され、場合によっては、部分的β折畳み構造が形成され得る。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲによって密接に一緒に連結し、もう一つの鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位を形成する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２、Ｉ巻、６４７～６６９ページ（１９９１）参照）。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接的に関与するものではないが、それらは、抗体の抗体依存性細胞傷害性に関与するなど、様々なエフェクター機能を示す。
当業者に知られているように、イムノコンジュゲートおよび融合発現産物は、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、および他の診断用または治療用分子を本出願の抗体またはその断片に結合することにより形成されるコンジュゲートを含む。本出願はまた、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体またはその断片に結合した細胞表面マーカーまたは抗原も含む。
本明細書で用いられる場合、用語「重鎖可変領域」および「ＶＨ」は交換可能に用いられる。
本明細書で用いられる場合、用語「可変領域」および「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は交換可能に用いられる。
本出願の好ましい実施形態において、抗体の重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３であるＣＤＲを含む。
本出願の好ましい実施形態において、抗体の重鎖は、上記の重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。
本出願において、用語「本出願の抗体」、「本出願のタンパク質」、または「本出願のポリペプチド」は交換可能に用いられ、全て、ＰＤ－Ｌ１タンパク質と特異的に結合するポリペプチド、例えば重鎖可変領域を有するタンパク質またはポリペプチドを指し、それは、開始メチオニンを含有する場合も含有しない場合もある。
本出願はまた、本出願の抗体を有する他のタンパク質または融合発現産物も提供する。具体的には、本出願は、可変領域が本出願の抗体の重鎖可変領域と同一または少なくとも９０％相同、好ましくは少なくとも９５％相同である限り、可変領域を含有する重鎖を有する任意のタンパク質またはタンパク質コンジュゲートおよび融合発現産物（すなわち、イムノコンジュゲートおよび融合発現産物）を含む。
一般的に、抗体の抗原結合性質は、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）によって分離された、重鎖可変領域内に位置する、可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、３つの特異的領域により説明することができ、４つのＦＲのアミノ酸配列は相対的に保存的であり、結合反応に直接的には関与しない。これらのＣＤＲは、環状構造を形成し、その間のＦＲによって形成されたβ折畳みによる空間構造においてお互いに近接し、重鎖上のＣＤＲおよび対応する軽鎖上のＣＤＲが、抗体の抗原結合部位を構成する。同じ型の抗体のアミノ酸配列は、比較して、どのアミノ酸がＦＲまたはＣＤＲ領域を構成するのかを決定することができる。
本出願の抗体の重鎖の可変領域は特に興味深く、可変領域の少なくとも一部が、抗原への結合に関与しているからである。したがって、本出願は、そのＣＤＲが、本明細書で同定されたＣＤＲと９０％以上（好ましくは、９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有する限り、ＣＤＲを有する抗体の重鎖可変領域を有する分子を含む。
本出願は、無傷抗体（ｉｎｔａｃｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）だけでなく、免疫学的活性のある抗体の断片または抗体および他の配列により形成される融合タンパク質も含む。したがって、本出願はまた、抗体の断片、誘導体、および類似体も含む。
本明細書で用いられる場合、用語「断片」、「誘導体」、および「類似体」は、本出願の抗体と同じ生物学的機能または活性を実質的に保持するポリペプチドを指す。本出願のポリペプチド断片、誘導体、または類似体は、（ｉ）１つあるいは複数の保存的もしくは非保存的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）が置換されており、そのような置換されたアミノ酸残基が遺伝暗号によってコードされてもコードされなくてもよいポリペプチド、（ｉｉ）１つもしくは複数のアミノ酸残基内に置換基を有するポリペプチド、（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドを別の化合物（例えば、ポリエチレングリコールなどの、ポリペプチドの半減期を延ばす化合物）に融合させることにより形成されるポリペプチド、または（ｉｖ）追加のアミノ酸配列をポリペプチド配列に融合させることにより形成されるポリペプチド（例えば、リーダー配列、分泌配列、ポリペプチドを精製するために用いられる配列もしくはプロタンパク質配列、または６Ｈｉｓタグで形成された融合タンパク質）であり得る。本明細書における教示によれば、これらの断片、誘導体、および類似体は、当業者に周知の範囲内である。
本出願の抗体は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質結合活性および上記のＣＤＲを有するポリペプチドを指す。その用語はまた、上記のＣＤＲを含有し、かつ本出願の抗体と同じ機能を有する、バリアント型（ｖａｒｉａｎｔ ｆｏｒｍｓ）のポリペプチドも含む。これらのバリアント型は、１個または複数（通常、１～５０個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～２０個、最も好ましくは１～１０個）のアミノ酸の欠失、挿入、および／または置換、ならびにＣ末端および／またはＮ末端における１個または複数（通常、２０個以内、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内）のアミノ酸の付加を含む（しかし、これらに限定されない）。例えば、この分野において、同じまたは類似した性質を有するアミノ酸が置換に用いられる場合、タンパク質の機能は、通常、変化しない。別の例として、Ｃ末端および／またはＮ末端への１個または複数のアミノ酸の付加は、通常、タンパク質の機能を変化させない。その用語はまた、本出願の抗体の活性断片および活性誘導体も含む。
ポリペプチドのバリアント型は、高いまたは低いストリンジェンシー条件下で本出願の抗体のコードＤＮＡとハイブリダイズすることができる、相同配列、保存的バリアント、アレルバリアント、天然変異体、誘導変異体、ＤＮＡコード化タンパク質、ならびに本出願の抗体に対する抗血清を用いることにより得られるポリペプチドまたはタンパク質を含む。
本出願はまた、単一ドメイン抗体またはその断片を含有する融合タンパク質などの他のポリペプチドも提供する。ほぼ完全長のポリペプチドに加えて、本出願はまた、本出願の単一ドメイン抗体の断片も含む。一般的に、断片は、本出願の抗体の少なくとも約５０個の保存的アミノ酸、好ましくは少なくとも約６０個の保存的アミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０個の保存的アミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００個の保存的アミノ酸を有する。
本出願において、「本出願の抗体の保存的バリアント」は、本出願の抗体のアミノ酸配列と比較して、多くとも１０個、好ましくは多くとも８個、より好ましくは多くとも５個、最も好ましくは多くとも３個のアミノ酸の、同じまたは類似した性質を有するアミノ酸での置換により形成されるポリペプチドを指す。これらの保存的バリアントポリペプチドは、表１－１によるアミノ酸の置換を通して産生されるのが最も良い。
Figure 2022548066000002
本出願はまた、抗体またはその断片またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子も提供する。本出願のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡの型をとり得る。ＤＮＡ型には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または人工的合成ＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。
本出願の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、成熟ポリペプチドをコードするだけのコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列と様々な追加のコード配列、および非コード配列も加えた、成熟ポリペプチドのコード配列（および任意選択の追加のコード配列）が挙げられる。
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または追加のコード配列および／もしくは非コード配列も含むポリヌクレオチドを含み得る。
本出願はまた、上記の配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関し、その２つの配列間の同一性は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％である。本出願は、特に、ストリンジェントな条件下で本出願のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドに関する。本出願において、「ストリンジェントな条件」は、（１）相対的に低いイオン強度および相対的に高い温度、例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、および６０℃におけるハイブリダイゼーションおよび溶出；または（２）ハイブリダイゼーション中の変性剤、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、４２℃もしくはよく似た温度の添加；または（３）２つの配列間の同一性が少なくとも９０％以上、より好ましくは９５％以上の場合のみ起こるハイブリダイゼーションを指す。加えて、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。
本出願の抗体の完全長ヌクレオチド配列またはその断片は、通常、ＰＣＲ増幅方法、組換え方法、または人工的合成方法により得ることができる。関連配列を合成するために、特に断片長が短い場合、実行可能な方法は、人工的合成方法を用いることである。通常、非常に長い配列を有する断片は、最初、複数の小さい断片を合成し、次いで、その断片を連結することにより得ることができる。加えて、重鎖および発現タグ（例えば、６Ｈｉｓ）のコード配列は、一緒に融合されて、融合タンパク質を形成することができる。
いったん関連配列が得られたならば、組換え方法を用いて、関連配列を大量に得ることができる。関連配列は、通常、ベクターへクローニングされ、次いで細胞へ移入され、次いでその関連配列を得るために従来の方法により、増殖した宿主細胞から単離される。本出願に関わる生体分子（核酸、タンパク質、または同様のもの）には、単離された型で存在する生体分子が挙げられる。
現在、本出願のタンパク質（またはその断片またはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は、完全に化学合成を通して得ることができる。次いで、ＤＮＡ配列は、当技術分野において公知の様々な既存のＤＮＡ分子（例えば、ベクター）および細胞へ導入することができる。加えて、変異もまた、本出願のタンパク質配列へ化学合成を通して導入することができる。
本出願はまた、適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは調節配列を含有するベクターにも関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するのに適当な宿主細胞を形質転換するために用いることができる。
宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞；または酵母細胞などの下等の真核細胞；または哺乳動物細胞などの高等の真核細胞であり得る。代表的な例には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の細菌細胞、酵母などの真菌細胞、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２またはＳｆ９の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７、および２９３細胞の動物細胞、もしくは同様のものが挙げられる。
宿主細胞の組換えＤＮＡでの形質転換は、当業者に周知の従来の技術により実施することができる。宿主細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの原核生物である場合、ＤＮＡを吸収することができるコンピテント細胞は、指数関数的増殖期後、収集し得、ＣａＣｌ２方法で処理することができ、用いられるそのステップは当技術分野において周知である。別の方法はＭｇＣｌ２を用いることである。必要ならば、形質転換はまた、エレクトロポレーション法によっても実施することができる。宿主細胞が真核生物である場合、以下のＤＮＡトランスフェクション法を選択することができる：リン酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームパッケージングなどの従来の機械的方法、または同様のもの。
得られた形質転換体を、従来の方法により培養して、本出願の遺伝子によりコードされたポリペプチドを発現することができる。用いられる宿主細胞に従って、培養に用いられる培地は、様々な従来の培地から選択することができる。培養は、宿主細胞の成長に適した条件下で行われる。宿主細胞が適切な細胞密度へ増殖した後、選択されたプロモーターが、適切な方法（例えば、温度変換または化学的誘導）により誘導され、細胞は、ある期間、さらに培養される。
上記の方法における組換えポリペプチドは、細胞内もしくは細胞膜上で発現し、または細胞の外へ分泌され得る。必要ならば、組換えタンパク質は、物理的、化学的、および他の特性に従って、様々な分離方法を通して、分離および精製することができる。これらの方法は、当業者に周知である。これらの方法の例には、従来の再生処置、タンパク質沈殿剤での処置（塩析法）、遠心分離、浸透圧真菌破壊、超処理（ｕｌｔｒａ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、超遠心分離、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クラマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および他の様々な液体クロマトグラフィー技術、ならびにこれらの方法の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
本出願の抗体は、単独で用いることができ、検出可能なマーカー（診断用）、治療剤、ＰＫ（タンパク質キナーゼ）修飾部分、またはこれらの物質の任意の組合せと組み合わせる、またはカップリングさせることができる。
診断用の検出可能なマーカーには、蛍光もしくは発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）もしくはＣＴ（電子コンピュータＸ線断層撮影）造影剤、または検出可能な産物を産生する能力がある酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
本出願の抗体と組み合わせるまたはカップリングさせることができる治療剤には、１．放射性核種；２．生体毒素；３．ＩＬ－２などのサイトカイン；４．金ナノ粒子／ナノロッド；５．ウイルス粒子；６．リポソーム；７．磁気ナノ粒子；８．プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様タンパク質（ＢＰＨＬ））；９．化学療法剤（例えば、シスプラチン）、または任意の型のナノ粒子もしくは同様のものが挙げられるが、これらに限定されない。
本出願の融合タンパク質
本明細書に記載されるように、「本出願の融合タンパク質」は、本出願の第１の態様に記載された抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体と免疫調節性分子部分の両方を有する二機能性融合タンパク質を指す。
本出願において、融合タンパク質が提供され、単一ドメイン抗体融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ式Ｉにおいて示されるような構造を有する：
Ｚ１－Ｚ２－Ｌ－Ｚ３ （式Ｉ）
式中、
Ｚ１は、本出願の第２の態様による抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖であり；
Ｚ２は、免疫グロブリンのＦｃ断片であり；
Ｌは、リンカー配列であり；
Ｚ３は、免疫調節性分子部である。
好ましくは、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であり得る。
好ましい実施形態において、免疫グロブリンはＩｇＧ１であり、Ｚ２のアミノ酸配列は配列番号９９に示される。他の実施形態において、Ｚ２のアミノ酸配列は、配列番号９９に示されるアミノ酸配列と同じまたは実質的に同じである。
本出願において、Ｌは可動性アミノ酸リンカーである。好ましくは、Ｌは、ＧＧＧＧＳ、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４、（ＧＧＧＧＳ）５、またはこれらの組合せを含む群から選択されるアミノ酸配列を有する。
好ましい実施形態において、Ｌのアミノ酸配列は、配列番号１００に示される。他の実施形態において、Ｌのアミノ酸配列は、配列番号１００に示されるアミノ酸配列と同じまたは実質的に同じである。
本出願の実施形態において、免疫調節性分子は、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインである。好ましくは、Ｚ３のアミノ酸配列は配列番号１０１に示される。他の実施形態において、Ｚ３のアミノ酸配列は、配列番号１０１に示されるアミノ酸配列と同じまたは実質的に同じである。
本出願において、実質的に同じとは、多くとも５０個（好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、最も好ましくは１～３個）のアミノ酸が異なることを示し、その違いには、アミノ酸の置換、欠失、または付加が挙げられる。
好ましくは、実質的に同じとは、アミノ酸配列と対応するアミノ酸配列の配列同一性が、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であることを示す。
好ましい実施形態において、単一ドメイン抗体融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１０２に示される。
ＴＧＦβは、上皮間葉転換（ＥＭＴ）の重要な誘導因子である。同時に、ＴＧＦβは、腫瘍微小環境において強い免疫抑制効果を生じ、したがって、腫瘍発生、転移、および薬物抵抗性へ重要な調節効果を生じる。
したがって、本出願の実施形態において、ＴＧＦβ受容体ＩＩが、融合タンパク質における免疫調節性分子として選択される。本出願の融合タンパク質は、高い二重の標的結合親和性および特異性の利点を有し、それにより、抗腫瘍免疫機能をさらに増強する。
薬学的組成物
本出願はまた、組成物を提供する。好ましくは、組成物は、抗体またはその活性断片またはその融合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含有する薬学的組成物である。一般的に、これらの物質は、無毒で、不活性の、薬学的に許容される水性担体媒体中に製剤化することができ、そのｐＨは、通常、約５～８、好ましくは約６～８であるが、ｐＨは、製剤化される物質の性質および処置されることになっている疾患状態に従って変化させることができる。製剤化薬学的組成物は、従来の経路により投与することができ、その経路には、腫瘍内投与、腹腔内投与、静脈内投与、または局所投与が挙げられる（しかし、これらに限定されない）。
本出願の薬学的組成物は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質分子を結合するために直接的に用いることができ、したがって、腫瘍を処置するために用いることができる。加えて、他の治療剤もまた、同時に用いることができる。
本出願の薬学的組成物は、本出願の単一ドメイン抗体（またはそのコンジュゲート）の安全かつ有効な量（例えば、０．００１～９９重量％、好ましくは０．０１～９０重量％、より好ましくは０．１～８０重量％）、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含有する。そのような担体には、食塩水、バッファー、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せが挙げられる（しかし、これらに限定されない）。薬学的調製物は、投与様式と適合しているべきである。本出願の薬学的組成物は、注射剤型へ調製することができ、例えば、薬学的組成物は、生理食塩水またはグルコースを含有する水溶液および他のアジュバントと共に、従来の方法により調製される。注射剤および溶液などの薬学的組成物は、無菌条件下で製造されるべきである。活性成分の用量は、治療的有効量、例えば、１日あたり約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。加えて、本出願のポリペプチドはまた、他の治療剤と共に用いることもできる。
薬学的組成物が用いられる場合、イムノコンジュゲートの安全かつ有効な量が哺乳動物に投与され、その安全かつ有効な量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重であり、たいていの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重より高くない。好ましくは、用量は、約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん、投与経路および患者の健康状態などの因子もまた、特定の用量のために考慮されるべきであり、それらは、熟練した医師の能力範囲内である。
標識単一ドメイン抗体
本出願の好ましい実施形態において、単一ドメイン抗体は、検出可能なマーカーを含有する。より好ましくは、マーカーは、以下の、同位元素、コロイド金マーカー、着色マーカー、または蛍光マーカーの群から選択される。
コロイド金標識は、当業者に公知の方法により実施することができる。本出願の好ましい溶液中で、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体は、コロイド金で標識されて、コロイド金標識単一ドメイン抗体が得られる。
本出願の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体は、高い特異性および力価を有する。
検出方法
本出願はまた、ＰＤ－Ｌ１タンパク質を検出するための方法にも関する。その方法のステップは、一般的に下記の通りである：細胞および／または組織試料を得るステップ；試料を媒体に溶解するステップ；ならびに溶解された試料におけるＰＤ－Ｌ１タンパク質のレベルを検出するステップ。
本出願の検出方法において、用いられる試料は特に制限されず、代表的な例は、細胞保存溶液中に細胞を含有する試料である。
キット
本出願はまた、本出願の抗体（またはその断片）を含有するキットまたは検出プレートも提供する。本出願の好ましい実施形態において、キットは、容器、使用説明書、緩衝剤、または同様のものをさらに含む。
本出願はまた、ＰＤ－Ｌ１のレベルを検出するための検出キットを提供する。キットは、ＰＤ－Ｌ１タンパク質を同定するための抗体、試料を溶解するための溶解媒体、ならびに検出に必要とされる一般的な試薬およびバッファー、例えば、様々なバッファー、検出マーカー、検出基質、または同様のものを含む。検出キットはインビトロ診断デバイスであり得る。
使用
上記のように、本出願の単一ドメイン抗体は、生物学的使用および臨床的使用において高い価値をもち、単一ドメイン抗体の使用は、ＰＤ－Ｌ１関連疾患の診断および処置、基礎医学研究、生物学的研究、または同様のものの分野に関する。
本出願の主要な利点には以下が挙げられる：
１）本出願の単一ドメイン抗体は、正しい空間構造を以て、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対して非常に特異的である。
２）本出願の単一ドメイン抗体は高い親和性を有する。
３）本出願の単一ドメイン抗体は、作製するのが容易である。
４）単一ドメイン抗体は、ターゲティングおよび腫瘍微小環境においてＴＧＦ－βに基づいてＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を阻害し、Ｔ細胞活性を回復させ、免疫応答を増強し、腫瘍出現および発生を阻害する効果をより効果的に向上させることができる。
５）本出願の単一ドメイン抗体は、明らかな毒性を有しない。
本出願は、実施例と共にさらに下に記載される。これらの実施例は、本出願を例証するために用いられるのみであり、本出願の範囲を限定するために用いられるのではないことは、理解されるべきである。以下の実施例における特定の条件なしでの実験方法は、通常、従来の条件、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）における条件、または製造会社により推奨される条件に従って、行われる。他に規定がない限り、パーセンテージおよび部は、重量パーセンテージおよび重量部である。
実施例１：単一ドメイン抗体ライブラリーの構築
動物免疫
Ｂ細胞を刺激して、抗原特異的単一ドメイン抗体を発現させるため、１週間に１回、合計４回、１ｍｇのヒトＰＤ－Ｌ１抗原およびフロイントアジュバントを、２頭のラマを免疫するために、等体積で混合した。４回の免疫化後、５０ｍｌのラマ末梢血を抽出し、リンパ球分離溶液で分離して、リンパ球を得た。ＲＮＡ抽出試薬Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。逆転写のためにｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を用いて、全ラマｃＤＮＡを得た。
単一ドメイン抗体遺伝子増幅
ＰＣＲの第１ラウンドにおいて、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３配列をｃＤＮＡから増幅した。
Figure 2022548066000003
ＰＣＲの第１ラウンドの産物を、アガロースゲル電気泳動に供し、ゲル切断後、７５０ｂｐにおける断片を回収し、ＶＨＨ配列増幅の第２ラウンドに用いた。ＰＣＲ増幅の第２ラウンドについてのプライマーは以下の通りであった。
Figure 2022548066000004
ＰＣＲの第２ラウンドの産物を、ＰＣＲの第３ラウンドについての鋳型として用い、相同アームをＶＨＨ遺伝子に付加し、ＰＣＲの第３ラウンドについてのプライマーは以下の通りであった。
Figure 2022548066000005
標的断片を、ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮから購入）を用いることにより回収した。
ライブラリー構築
直線化された酵母ディスプレイベクターおよびＰＣＲの第３ラウンドの産物を混合し、サッカロマイセス・セレビシエ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＡＴＣＣ（登録商標）２０８２８）に電気的に形質転換し、２頭の動物由来の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体ライブラリーを構築し、そのライブラリーサイズは、４．４７×１０７および４．１４×１０７であると測定された。
実施例２：ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のスクリーニング
ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質のビオチン化
ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を、適切な体積の再蒸留水中に溶解し、ビオチン標識キット（Ｔｈｅｒｍｏから購入）の製品使用説明書に従って、ビオチンを溶解し、タンパク質溶液と混合し、次いで、４℃で２時間、インキュベートした。脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏから購入）を用いて、過剰なビオチンを除去し、脱塩カラムによる前処理および試料の収集操作のどちらも、製品使用説明書におけるステップに従って行った。
ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する酵母のＭＡＣＳ濃縮
実施例２において構築されたＶＨＨライブラリーを、ＳＤ－ＣＡＡ増幅培地（６．７ｇのＮＢ、５ｇのカザミノ酸、１３．６２ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、７．４４ｇのＮａＨ２ＰＯ４、および２％グルコースを含有する１ＬのＳＤ－ＣＡＡ増幅培地）へ接種し、接種される酵母細胞の数は、ライブラリー容量の１０倍より多く（最初の増幅濃度は０．５ＯＤ６００／ｍｌであった）、培養を、３０℃、２２５ｒｐｍで一晩行った。酵母細胞のライブラリー容量の１０倍を取り、３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離して（以下の遠心分離操作は同じであった）、培地を除去し、酵母細胞を、ＳＤ－ＣＡＡ誘導培地で再懸濁し、最初の濃度を、０．５ＯＤ６００／ｍｌであるように調整し、誘導を一晩、行った。誘導後のライブラリーの濃度を測定し、酵母細胞のライブラリー容量の１０倍を取り、遠心分離して、培地を除去した。酵母細胞を、５０ｍｌの洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）で再懸濁し、遠心分離して、上清を除去した。酵母細胞を、１０ｍｌの洗浄バッファーで再懸濁した。
ビオチン標識ＰＤ－Ｌ１タンパク質（最終濃度１００ｍＭ）を加え、室温で３０分間インキュベートし、遠心分離し、酵母細胞を収集し、５０ｍＬの洗浄バッファーで３回洗浄した。酵母細胞を、５ｍｌの洗浄バッファーで再懸濁し、２００μｌのＳＡ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉから購入）を加え、細胞を、逆さまで１０分間インキュベートした。酵母と磁気ビーズの混合物を、洗浄バッファーで３回洗浄し、次いで、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉから購入）へ加えた。ＬＳカラムを、磁気スタンド上に置き、洗浄バッファーで洗浄して、非特異的に結合した酵母細胞を除去した。カラムを、磁気スタンドから取り出し、洗浄バッファーを加えて、酵母を溶出した。溶出された酵母を遠心分離し、増幅のために２００ｍｌ ＳＤ－ＣＡＡ増幅培地へ移した。
高親和性酵母細胞を得るための蛍光活性化細胞ソーティング
ＭＡＣＳにより濃縮された酵母細胞を、ＳＤ－ＣＡＡ増幅培地へ接種し、最初の増幅濃度は０．５ＯＤ６００／ｍｌであった。振盪フラスコ培養を、３０℃、２２５ｒｐｍで一晩行った。酵母細胞を、ＳＤ－ＣＡＡ誘導培地（１ＬのＳＤ－ＣＡＡ誘導培地は、６．７ｇのＹＮＢ、５ｇのカザミノ酸、１３．６２ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、７．４４ｇのＮａＨ２ＰＯ４、２％のガラクトース、２％のラフィノース、および０．１％のグルコースを含有する）で再懸濁し、最初の濃度は０．５ＯＤ６００／ｍｌであり、誘導を一晩行った。１：２００に希釈された抗ｃ－Ｍｙｃマウス由来抗体（Ｔｈｅｒｍｏから購入）および１００ｎＭのビオチン標識ＰＤ－Ｌ１抗原を加え、室温で１０分間インキュベートした。酵母を、ＰＢＳで３回洗浄し、１：５００に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）およびストレプトアビジンＡＰＣコンジュゲート型蛍光抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を加え、暗闇中、４℃で１５分間インキュベートした。２ｍｌのＰＢＳを加えて、細胞を再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩ装置を、ソーティングに用いて、ＰＤ－Ｌ１抗原に対する高い結合親和性を有する酵母を得た。
ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体候補の遺伝子配列の取得
ＭＡＣＳおよびＦＡＣＳ濃縮により得られた、ＰＤ－Ｌ１抗原に対する高い結合能力を有する酵母液体を、ＳＤ－ＣＡＡ増幅培地中、３０℃、２２５ｒｐｍで一晩培養した。酵母プラスミドを、酵母プラスミド抽出キット（ＴＩＡＮＧＥＮから購入）の操作に従って抽出した。そのプラスミドを、アンピシリン抵抗性フラットプレート上にコーティングされたＴｏｐ１０コンピテント細胞（ＴＩＡＮＧＥＮから購入）へ電気的移入により形質転換し、３７℃で一晩培養した。単一クローンを、シーケンシングのために採取して、ＶＨＨ遺伝子配列を得た。
実施例３：重鎖抗体の構築、発現、および精製
抗体遺伝子のｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターへの構築
ＶＨＨ遺伝子配列を、ヒトＩｇＧ１（ＬＡＬＡ変異）Ｆｃ断片と連結し、相同リコンビナーゼ（Ｖａｚｙｍｅから購入）およびＥｃｏＲ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ酵素を用いることにより、直線化ｐＣＤＮＡ３．１ベクターへ導入し、そのプロセスを製品使用説明書に従って実行した。相同組換え産物を、アンピシリン抵抗性フラットプレート上にコーティングされたＴｏｐ１０コンピテント細胞へと形質転換し、３７℃で一晩培養し、単一クローンをシーケンシングのために採取した。
細胞トランスフェクション
ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系キット（Ｔｈｅｒｍｏから購入）を、プラスミドをＥｘｐｉ－ＣＨＯ細胞へ移入するために用い、トランスフェクション方法は、製品使用説明書に従った；細胞を５日間培養した後、上清を収集し、ソーティング方法により標的タンパク質を精製するために、プロテインＡ磁気ビーズ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから購入）を用いた。磁気ビーズを、適切な体積の結合バッファー（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）（磁気ビーズの体積の１～４倍）で再懸濁し、次いで、精製されるべき試料に加え、その混合物を、室温で１時間インキュベートし、その時間中、穏やかに振盪させた。その試料を磁気スタンド（Ｂｅａｖｅｒから購入）上に置き、上清を除去し、磁気ビーズを、結合バッファーで３回洗浄した。室温で５～１０分間振盪するために、磁気ビーズの体積の３～５倍の溶出バッファー（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．２）を加え、その混合物を、磁気スタンド上に戻して置き、溶出バッファーを収集し、中和バッファー（１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５４）が加えられた収集チューブへ移し、均一に混合した。
実施例４：精製された抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のヒトＰＤ－Ｌ１への結合
ヒトＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入）のｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を、トランスフェクションによりＭＣＳへクローニングして、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞）を作製した。拡大培養を受けたＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞の細胞密度を、２×１０６細胞／ｍｌに調整し、１００μｌの細胞を、９６ウェルフロープレートの各ウェルへ加え、後の使用のために遠心分離した。精製されたＰＤ－Ｌ１抗体を、ＰＢＳで希釈し、濃度が４００ｎＭである時点で、３倍希釈を、合計１２点について開始し、１００μｌの希釈された試料を、細胞を含む９６ウェルフロープレートの各ウェルへ加え、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで１００倍に希釈された１００μｌのヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＰＥ）（Ａｂｃａｍから購入）を各ウェルに加え、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を再懸濁するために、１００μｌのＰＢＳを各ウェルに加え、検出を、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ）フローサイトメーターで行い、対応するＭＦＩを計算した。
上記の方法による測定実験において、実験結果は図１に示されており、本出願の全ての精製された試料およびＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞は結合活性を有し、いくつかの精製された試料の結合活性は、対照抗体ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）（アテゾリズマブ）（ＡＴＥ；ＵＳ２０１３００３４５５９に記録され、２４３．５５．Ｓ７０としても公知である）のそれと類似していた。
実施例５：ＰＤ－Ｌ１抗体の親和性測定
ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定を、既存の方法（Ｅｓｔｅｐ，Ｐら、ｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＭＡｂｓ，２０１３年５巻（２号）：２７０～８ページ）に従って実施した。手短に言えば、センサーを、オフラインで、分析バッファー中３０分間平衡化し、次いで、オンラインで６０秒間試験して、ベースラインを確立し、上記のように得られた精製抗体をオンラインで、ＡＨＱセンサー上へロードした。次いで、センサーを、反応のために１００ｎＭ ＰＤ－Ｌ１抗原中に５分間置き、次いで、解離のために５分間ＰＢＳ中へ移した。１：１組合せモデルを、ダイナミック分析に用いた。
Figure 2022548066000006
実施例６：ＰＤ－Ｌ１抗体の遺伝子改変
Ｃ－Ｙｅ－１８における潜在的グリコシル化部位を除去するために、Ｃ－Ｙｅ－１８のアミノ酸配列のＣＤＲＨ２部分を、表５における６つの型へ点変異させた。
Figure 2022548066000007
この研究において、ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）を用いて、Ｃ－Ｙｅ－１８ ＣＤＲ領域の変異体配列のヒト化レベルを評価し、結果は表６に示されており、全てのＣ－Ｙｅ－１８変異体のヒト化レベルは、８７％より高く、後の薬物開発の必要条件を満たしている。
Figure 2022548066000008
タンパク質構築および発現精製方法は、実施例３におけるそれと同じであり、得られたタンパク質の純度をＨＰＬＣにより検出した。ＨＰＬＣ法に従って、移動相は、１５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏであり、ｐＨは７．０であった。クロマトグラフィーの条件：検出波長２８０ｎｍ、カラム温度２５℃、流速０．３５ｍｌ／分、検出時間２０分、およびＺｅｎｉｘ－Ｃ ＳＥＣ－３００クロマトグラフィーカラム（ＳＥＰＡＸ ４．６×３００ｍｍ、３μｍ）。
Figure 2022548066000009
実施例７：Ｃ－Ｙｅ－１８変異体試料のヒトＰＤ－Ｌ１への結合
この実験は、精製されたＣ－Ｙｅ－１８変異体試料とＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞の結合活性を検出した。実験方法は、実施例４におけるそれと同じであった。実験結果は図２にある。Ｃ－Ｙｅ－１８変異体試料とＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞は、良い結合活性を有し、そのレベルは、Ｃ－Ｙｅ－１８および対照抗体ＡＴＥのそれに匹敵した。
実施例８：Ｃ－Ｙｅ－１８変異体試料の親和性測定
この実験は、精製されたＣ－Ｙｅ－１８変異体試料とヒトＰＤ－Ｌ１の結合親和性を検出した。実験方法は、実施例５におけるそれと同じであった。実験結果は表８に示されている。Ｃ－Ｙｅ－１８変異体試料は、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質と非常に良い結合活性を有する。
Figure 2022548066000010
実施例９：Ｃ－Ｙｅ－１８変異体試料によるＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合のブロッキング
ヒトＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入）のｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を、トランスフェクションによりＭＣＳへクローニングして、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＰＤ－１細胞）を作製した。拡大培養を受けたＣＨＯ－ｈＰＤ－１細胞の細胞密度を、２×１０６細胞／ｍｌに調整し、１００μｌのその細胞を、９６ウェルフロープレートの各ウェルに加え、後の使用のために遠心分離した。精製された変異体試料を、ＰＢＳで希釈し、その濃度が４００ｎＭである時点で、３倍希釈を、合計１２点について開始し、６０μｌの希釈された試料を、９６ウェル試料希釈プレートの各ウェルに加え、６０μｌのビオチン化ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）を、同時に各ウェルに加え、最終濃度は５００ｎｇ／ｍｌであり、その変異体試料を、４℃で３０分間インキュベートした。１００μｌの共インキュベーション試料を、細胞を含む９６ウェルフロープレートの各ウェルに加え、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで１００倍希釈された、１００μｌのストレプトアビジン、Ｒ－フィコエリトリンコンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）を各ウェルに加え、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を再懸濁するために、１００μｌのＰＢＳを各ウェルに加え、検出を、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ）フローサイトメーターで行い、対応するＭＦＩを計算した。
上記の方法による測定実験において、実験結果は図３に示されており、本出願の全ての変異体試料は、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合をブロックすることができ、そのブロッキングレベルは、Ｃ－Ｙｅ－１８および対照抗体ＡＴＥのそれに匹敵した。
実施例１０：Ｃ－Ｙｅ－１８変異体試料の熱安定性
ＤＳＣ（示差走査熱量測定）を用いて、種々の抗体の熱安定性を検出した。試料を濃縮し、次いで、ＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌへ希釈し、５０００×蛍光発色剤Ｃｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄから購入）を超純水で５０倍希釈して、１００×蛍光発色剤Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅを得た。５０μｌの各１ｍｇ／ｍｌ試料を取り、１０μｌの１００×蛍光発色剤Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅおよび４０μｌの超純水を加え、均一に混合し、３０μｌのそれぞれを９６ウェルＰＣＲプレートに加え、各試料を３つの反復ウェルに加え、ＰＣＲ装置に置いた。温度上昇プログラムを以下の通りに設定した：２５℃の一定温度が５分間、保持され、温度は０．５℃／分の速度で９９℃へ上昇した。プログラム終了後、「融解曲線」図における曲線の最低点の温度値、すなわち、試料のＴｍ値を読み取った。具体的な結果は以下の表９に示されている。
Figure 2022548066000011
実施例１１：混合リンパ球反応実験
本実施例において、混合リンパ球反応実験（ＭＬＲ）を用いて、Ｃ－Ｙｅ－１８変異体試料のＴ細胞を活性化するために活性を検出した。具体的な実験方法は以下の通りであった。
ＰＢＭＣ細胞（ＳＡＩＬＹ ＢＩＯ、ＳＬＢ－ＨＰＢから購入）を蘇生させ、遠心分離し、１０ｍｌのＸ－ＶＩＶＯ－１５培地（ＬＯＮＺＡから購入）で再懸濁し、細胞インキュベーターにおいて３７℃で２時間接着培養に供し、非接着細胞を除去した。１０ｍｌのＤＣ培地を加え、３日間の培養のために、１０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄから購入）および２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４をＸ－ＶＩＶＯ－１５培地に加え、５ｍｌのＤＣ培地を加え、細胞を６日間連続培養し、ＤＣ成熟培地を加え、１０００Ｕ／ｍｌ ＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄから購入）、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－６（Ｒ＆Ｄから購入）、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１β（Ｒ＆Ｄから購入）、および１μＭ ＰＧＥ２（Ｔｏｃｒｉｓから購入）をＸ－ＶＩＶＯ－１５培地に加え、細胞を２日間培養し、成熟ＤＣ細胞を収集し、細胞密度を、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５培地で２×１０５細胞／ｍｌであるように調整した。
別のドナー由来のＰＢＭＣ細胞（ＳＡＩＬＹ ＢＩＯ、ＳＬＢ－ＨＰＢから購入）を解凍し、遠心分離し、１０ｍｌのＸ－ＶＩＶＯ－１５培地で再懸濁した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、ＣＤ４＋ Ｔ細胞ソーティングキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌから購入）で濃縮し、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５で再懸濁し、細胞密度を、２×１０６細胞／ｍｌであるように調整し、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、収集された成熟ＤＣ細胞と１：１の比で混合し、１００μｌの混合物を、９６ウェルＵ形底プレートの各ウェルに加えた。
Ｃ－Ｙｅ－１８変異体試料をＸ－ＶＩＶＯ－１５培地で希釈し、濃度が２００ｎＭである時点で、合計９点について３倍希釈し、１００μｌのその混合された細胞を、各ウェルに加え、５日間培養し、上清を収集し、ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入）方法を用いて、ＩＦＮ－γおよびＩＬ２の発現量を検出した。
結果は図４に示されており、Ｃ－Ｙｅ－１８変異体試料、Ｃ－Ｙｅ－１８－１、Ｃ－Ｙｅ－１８－５、およびＣ－Ｙｅ－１８－６は全て、ＭＬＲ実験において、相対的に良い生物学的活性を示し、その活性化レベルは、対照抗体ＡＴＥのそれと類似し、またはそれより優れていた。
実施例１２：融合タンパク質ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβＲＩＩのクローニングおよび発現
本実施例において、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメイン（配列番号１０１）を、融合タンパク質の免疫調節性分子部分として用い、ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ＬＡＬＡ変異）（Ｃ－Ｙｅ－１８－５、配列番号９４）を、融合タンパク質のターゲティング部分として用いて、ＰＤ－Ｌ１抗体／ＴＧＦβＲＩＩ細胞外領域融合タンパク質（ＰＭ８００１、配列番号１０２）を形成した。
分子クローニング技術に従って、本出願のＰＤ－Ｌ１単鎖抗体のＣ末端アミノ酸を、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外領域と（Ｇ４Ｓ）４Ｇによって連結し、Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ発現系によって日常的に発現させた。発現および精製方法は、実施例３におけるそれと同じであり、図５に示される構造を有する融合タンパク質ＰＭ８００１が得られた。
実施例１３：ＰＭ８００１分子のヒトＰＤ－Ｌ１への結合
精製ＰＤ－Ｌ１抗体（Ｃ－Ｙｅ－１８－５、配列番号９４）、ＰＭ８００１分子、ＴＧＦ－βＲ２－Ｆｃ融合タンパク質、陽性対照Ｍ７８２４（ＷＯ２０１５／１１８１７５ Ａ２）、および陰性対照ＩｇＧタンパク質の、細胞表面上のＰＤ－Ｌ１への結合活性を検出するための方法は、実施例４におけるそれと同じであった。上記の方法による測定実験において、実験結果は図６に示されており、本出願のＰＭ８００１分子とＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞は、結合活性を有し、その結合活性は、陽性対照分子Ｍ７８２４のそれと類似していた。
実施例１４：ＰＭ８００１分子によるＰＤ－Ｌ１タンパク質のＰＤ－１細胞への結合のブロッキング
精製ＰＤ－Ｌ１抗体（Ｃ－Ｙｅ－１８－５）、ＰＭ８００１分子、ＴＧＦ－βＲ２－Ｆｃ融合タンパク質、陽性対照Ｍ７８２４、および陰性対照ＩｇＧタンパク質によるＰＤ－Ｌ１タンパク質のＰＤ－１細胞への結合活性のブロッキングを検出するための方法は、実施例９におけるそれと同じであった。上記の方法による測定実験において、実験結果は図７に示されており、本出願のＰＭ８００１分子は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質のＰＤ－１細胞への結合をブロックすることができ、そのブロッキングレベルは、陽性対照分子Ｍ７８２４のそれに匹敵していた。
実施例１５：ＰＭ８００１分子とヒトＴＧＦ－βファミリータンパク質のＥＬＩＳＡレベル結合実験
ヒトＴＧＦ－β１（ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＴＧ１－Ｈ４２１）、ＴＧＦ－β２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、１００－３５Ｂ）、およびＴＧＦ－β３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、１００－３６Ｅ）タンパク質を、ＥＬＩＳＡコーティング溶液で希釈し、次いで、４℃で一晩、コーティングするために、ＥＬＩＳＡプレートに加えた。コーティング溶液を除去し、３回洗浄するために、２５０μｌのＰＢＳＴを各ウェルに加え、後の使用のために、ＥＬＩＳＡプレートを、５％ＢＳＡで、室温で１時間ブロッキングした。精製ＰＤ－Ｌ１抗体（Ｃ－Ｙｅ－１８－５）、ＰＭ８００１分子、ＴＧＦ－βＲ２－Ｆｃ融合タンパク質、および陽性対照Ｍ７８２４を、勾配希釈に供し、次いで、室温で２時間のインキュベーションのために、ブロッキングされたＥＬＩＳＡプレートへ加えた。３回の洗浄のためにＰＢＳＴを加え、室温で１時間のインキュベーションのために、ヤギ抗ヒトＦｃ－ＨＲＰ（ａｂｃａｍ、ａｂ９７２２５）を各ウェルに加え、３回の洗浄のためにＰＢＳＴを加えた後、ＥＬＩＳＡ発色溶液を加え、室温で３分間置き、ＥＬＩＳＡ終了溶液を加え、４５０ｎｍにおける吸光度の値を読み取った。
上記の方法による測定実験において、実験結果は図８に示されており、本出願のＰＭ８００１分子は、ＥＬＩＳＡレベルにおいてヒトＴＧＦ－β１およびＴＧＦ－β３タンパク質への相対的に良い結合、およびヒトＴＧＦ－β２タンパク質への相対的に弱い結合活性を有し、その結合レベルは、陽性対照分子Ｍ７８２４のそれに匹敵していた。
実施例１６：ＴＧＦ－β／ＳＭＡＤシグナル経路のブロッキングにおけるＰＭ８００１分子の実験
適切な量の２９３－ＴＧＦ－β／ＳＭＡＤエフェクター細胞を採取し、９６ウェル細胞培養白色底プレート上に接種し、３７℃で一晩、培養のために、５％ＣＯ２を有するインキュベーター内に置いた。精製ＰＤ－Ｌ１抗体（Ｃ－Ｙｅ－１８－５）、ＰＭ８００１分子、ＴＧＦ－βＲ２－Ｆｃ融合タンパク質、および陽性対照Ｍ７８２４を、勾配希釈に供し、ＴＧＦ－β１（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＴＧ１－Ｈ４２１）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。一晩の連続培養のために、上記の混合物を、細胞を含む白色底プレートに加えた。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ ＴＭ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、各ホールに加え、多機能マイクロプレートリーダーを用いて、蛍光シグナル値を読み取った。
上記の方法による測定実験において、実験結果は図９に示されており、本出願のＰＭ８００１分子は、インビトロでＴＧＦ－β／ＳＭＡＤシグナル経路をブロックすることができ、そのブロッキングレベルは、陽性対照分子Ｍ７８２４のそれに匹敵していた。
実施例１７：混合リンパ球反応実験
ヒトＴリンパ球の活性化において、精製ＰＤ－Ｌ１抗体（Ｃ－Ｙｅ－１８－５）、ＰＭ８００１分子、ＴＧＦ－βＲ２－Ｆｃ融合タンパク質、陽性対照Ｍ７８２４、および陰性対照ＩｇＧタンパク質を検出するために混合リンパ球を用いる方法は、実施例９におけるそれと同じであった。結果は図１０に示されており、本出願のＰＭ８００１分子は、ＭＬＲ実験において相対的に良い生物学的活性を示し、その活性化レベルは、陽性対照分子Ｍ７８２４のそれと匹敵し、またはそれより優れていた。
実施例１８：マウスにおけるＰＭ８００１の薬物動態学的評価
半分が雄で半分が雌である６匹のＳＤマウスが実験に用いられ、明と暗の調整は１２時間ごとに行われ、温度は２４＋／－２℃であり、湿度は４０～７０％であり、マウスは、自由に水を飲み、食餌をとった。マウスをＺｈｅｊｉａｎｇ Ｗｅｉｔｏｎｇ Ｌｉｈｕａ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄから購入した。実験の当日、ＰＭ８００１分子を、ＳＤマウスの尾静脈へ１０ｍｇ／Ｋｇの用量で１回、注射した。
血液収集時点：投与から３分後、４時間後、１０時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、１２０時間後、１６８時間後、２４０時間後、３３６時間後、５０４時間後、および６７２時間後、マウスの頚静脈から血液を収集した。全血試料を２～８℃で３０分間置き、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、血清を収集し、１２０００ｒｐｍ、２～８℃で５分間遠心分離し、－８０℃で保存し、血清中の遊離ＰＭ８００１の分子量を、ＥＬＩＳＡにより検出した。結果は表１０に示されている。本出願のＰＭ８００１の遊離状態分子は、ＳＤマウスにおいて約１４６時間の半減期を有する。
Figure 2022548066000012
実施例１９：ＰＭ８００１の腫瘍抑制活性に関する研究
この実験において、ＰＤ－Ｌ１トランスジェニックマウスにおけるＰＭ８００１の抗腫瘍効果を決定するためにヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８細胞（ｈ－ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ ＭＣ３８）を用いた。まず、ｈ－ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ ＭＣ３８腫瘍を有しているマウスモデルを、皮下接種により確立した。平均腫瘍体積が８０～１２０ｍｍ３である時に、分類を行い、マウスに、単回の腹腔内注射において処置の異なる抗体および異なる用量を与え、各群のマウスの腫瘍体積および体重変化を、毎週２回、合計３週間モニターし、投与の用量および様式は、表１１に示されており、マウスの腫瘍体積変化は図１１に示されている。
Figure 2022548066000013
実験結果は、図１１に示されている。ｈ－ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ ＭＣ３８での接種後、陰性対照群の腫瘍体積は、連続的に増加し、ＴＧＦ－β Ｒ ＩＩ－ＦｃおよびＣ－Ｙｅ－１８－５単回使用群の腫瘍成長は阻害されたが、ＰＭ８００１群は、ＴＧＦ－β Ｒ ＩＩ－ＦｃおよびＣ－Ｙｅ－１８－５群より腫瘍成長のより良い制御を生じ、ＰＭ８００１が有意な腫瘍抑制効力を有することを示し、その効力は、陽性対照群のそれに匹敵し、またはさらにわずかに優れていた。
実施例２０：ＰＤ－Ｌ１と単一ドメイン抗体ＶＨＨ断片の複合体の結晶構造の同定
この実験において、ＰＤ－Ｌ１と単一ドメイン抗体ＶＨＨ断片の複合体の結晶構造を同定するためにＸ線回折方法を採用した。ヒト由来ＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓタグ（配列番号１０９）を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）原核生物系により発現させた。ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体融合タンパク質（配列番号１１０）をＣＨＯ系により発現させた。ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体融合タンパク質を、ＩｄｅＳ酵素、続いて、ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ酵素で消化および精製し、最後に、ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体ＶＨＨ（配列番号１１１）が得られた。結晶化のための複合体試料を調製するために、ＰＤ－Ｌ１およびＶＨＨを、１：１のモル比で混合した。精製された複合体を、カルボキシペプチダーゼＢで消化して、ＰＤ－Ｌ１のＨｉｓタグを除去した。その複合体（７．５ｍｇ／ｍＬ）を、１：１の比で結晶化試薬と混合し、１８℃における結晶培養に供した。３日後、結晶が、ＩＮＴキット培養条件下で観察され、結晶形態は、図１２に示されている。
Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｇｈｔ ＳｏｕｒｃｅにおけるＸ線回折実験のために、単一の結晶を選択し、１．６Åの分解能での回折データが得られた。データ処理のためにＸＤＳソフトウェアを用いた。それぞれ、モデルとしてのＰＤ－Ｌ１（ＰＤＢ ＩＤ：５ｊｄｓ）およびＶＨＨ（ＰＤＢ ＩＤ：５ｍ２ｊ）構造に関する結晶相同定のために分子置換方法を採用した。結晶構造を精巧にするためにＲｅｆｍａｃ５を用いた。モデル検出、手動での再構築、および構造検証のためにＣＯＯＴを用いた。複合体結晶は、Ｐ２１空間群に属し、結晶細胞パラメータは下記である：ａ＝３４．６２Å、ｂ＝９７．９９Å、ｃ＝６７．５２Å、α＝９０．００°、β＝９０．０２°、γ＝９０．００°。
構造解析後に得られたＰＤ－Ｌ１－ＶＨＨ複合体の結晶構造は、図１３に示されている。エピトープ分析は、ＰＤ－Ｌ１とＶＨＨの間の主要な水素結合相互作用が、ＰＤ－Ｌ１上のＴｙｒ５６、Ａｓｎ６３、Ｈｉｓ６９、Ａｓｐ７３、Ｌｙｓ７５、Ｓｅｒ１１７、Ｇｌｙ１１９、Ａｌａ１２１、および他のアミノ酸に集中していることを示している（図１４）。加えて、ＰＤ－Ｌ１上のＴｙｒ５６、Ｈｉｓ６９、およびＴｙｒ１２３、ならびにＶＨＨ上のＴｙｒ３２、Ｔｒｐ３３、Ｔｙｒ３５、Ｌｅｕ４５、Ｔｒｐ４７、Ｐｒｏ１００、およびＴｙｒ１０３が、疎水性相互作用界面を構成している（図１５）。
実施例２１：ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に接種されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８モデルへのＰＭ８００１注射の成長阻害効果
この研究において、腹腔内注射により投与されたＰＭ８００１（配列番号１０２）の、ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に接種されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８マウス結腸がんの担腫瘍モデルへのインビボ抗腫瘍効果、およびｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８腫瘍を移植されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインマウスにおける安全性を調べた。
この研究において、ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８皮下腫瘍モデルを、ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８マウス結腸がん細胞をｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＣ５７ＢＬ／６マウス（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ，Ｌｔｄから購入）の皮下に接種することにより確立した。接種から１０日後、マウスを、腫瘍体積に従って５つの群（群あたり６匹のマウス）に分け、ＰＢＳ、１４．７ｍｇ／ｋｇ ＰＭ８００１、１０ｍｇ／ｋｇ ＰＭ８００１－ＮＳＤ（抗ヒトＰＤ－Ｌ１ ＶＨＨ）、１０ｍｇ／ｋｇ ＰＭ８００１－ＴＧＦ－βＲＩＩ、および２４．６ｍｇ／ｋｇ Ｍ７８２４（上記の投与群の対応するモル用量は同じであった）、それぞれの腹腔内注射に供し、投与を、３日間の間隔で２回行った。ＰＭ８００１、ＰＭ８００１－ＮＳＤ、ＰＭ８００１－ＴＧＦ－βＲＩＩ、およびＭ７８２４の担腫瘍マウスにおける抗腫瘍効果および安全性を調べた。
図１６は、ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８腫瘍を移植されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインマウスの腫瘍体積への異なる薬物群の効果を示している。図１７は、接種から２７日後の異なる薬物群の腫瘍の写真を示す。陰性対照ＰＢＳ群におけるマウスの腫瘍は急速に成長し、腫瘍体積は、接種から２７日後（すなわち、投与後１７日目）、１５００ｍｍ３またはそれ以上に達し、この実験における腫瘍モデルが成功裏に確立されたことを示している。陰性対照ＰＢＳ群と比較して、ＰＭ８００１、ＰＭ８００１－ＮＳＤ、ＰＭ８００１－ＴＧＦ－βＲＩＩ、およびＭ７８２４の同じモル用量は、腫瘍成長を、異なる程度で阻害することができ、投与後１７日目における上記群のＴＧＩは、それぞれ、８０％、７２％、１５％、および５３％であった；ＰＭ８００１注射群は、ＰＭ８００１－ＮＳＤ、ＰＭ８００１－ＴＧＦ－β Ｒ ＩＩ、および類似分子群Ｍ７８２４より高い腫瘍成長阻害効果を生じている。実験の終了時点において、腫瘍を採取して、重量を測定した。ＰＭ８００１注射群における腫瘍重量は、ＰＭ８００１－ＮＳＤ、ＰＭ８００１－ＴＧＦ－β Ｒ ＩＩ、および類似分子群Ｍ７８２４のそれより低かった。図１８は、ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８腫瘍を移植されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインマウスの腫瘍重量への薬物の各群の効果を示す。
図１９は、異なる薬物群の、ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８腫瘍を移植されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインマウスの体重への効果を示す。各群におけるマウスの状態に異常はなかった；対照群と比較して、各投与群におけるマウスの体重は、有意には減少しなかった；実験の終了時点において、各群におけるマウスの肉眼的解剖学により、主要な器官に明らかな病変は示されず、この実験における各群の薬物の用いられた投与用量が、マウスへ明らかな毒性を示さないことが示されている。
実施例２２：ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に接種されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８モデルへのＰＭ８００１の異なる用量の成長阻害効果
この研究において、ＰＭ８００１注射の３つの異なる用量の、ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＣ５７ＢＬ／６マウス（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ，Ｌｔｄから購入）の皮下に接種されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８マウス結腸がん担腫瘍モデルへのインビボ抗腫瘍効果、およびｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８腫瘍を移植されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインマウスにおける安全性を調べた。
この研究において、ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８皮下腫瘍モデルを、ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８マウス結腸がんをｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に接種することにより確立し、このモデルは、試験産物の作用機構に関連した抗腫瘍効果および疾患状態における安全性特性を評価するために用いることができる。接種から７日後、マウスを、腫瘍体積に従って５つの群（各群において６匹のマウス）に分け、ＰＢＳ、ＰＭ８００１注射の異なる用量（０．３ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、１４．７ｍｇ／ｋｇ）、または２４．６ｍｇ／ｋｇ Ｍ７８２４、それぞれの単回の腹腔内注射を投与した。ＰＭ８００１の異なる用量の抗腫瘍効果および担腫瘍マウスにおける安全性を、調べ、類似分子Ｍ７８２４と比較した。
図２０は、ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８腫瘍を移植されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインマウスの腫瘍体積への異なる薬物群の効果を示す。図２１は、接種から２８日後の異なる薬物群の腫瘍写真を示す。陰性対照ＰＢＳ群におけるマウスの腫瘍は、急速に成長し、腫瘍体積は、接種から２８日後、１３００ｍｍ３またはそれ以上に達し、この実験における腫瘍モデルが成功裏に確立されたことを示している。陰性対照ＰＢＳ群と比較して、ＰＭ８００１は、用量依存性様式で腫瘍成長を阻害することができる。ＰＭ８００１の低用量、中用量、および高用量におけるＴＧＩは、それぞれ、３１％、７６％、および９３％であった；同じモル用量において、ＰＭ８００１群（１４．６ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍成長阻害効果は、類似分子Ｍ７８２４群（２４．６ｍｇ／ｋｇ）のそれより高かった。実験の終了時点において、腫瘍を採取し、重量を測定した。ＰＭ８００１は、腫瘍重量を、用量依存性様式で低下させることができる。同じモル用量において、ＰＭ８００１群（１４．６ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍阻害率は、類似分子Ｍ７８２４群（２４．６ｍｇ／ｋｇ）のそれより高かった。図２２は、ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８腫瘍を移植されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインマウスの腫瘍重量への薬物の各群の効果を示す。
図２３は、ｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインＭＣ３８腫瘍を移植されたｈ－ＰＤ－Ｌ１ノックインマウスの体重への異なる薬物群の効果を示す。各群におけるマウスの状態に異常はなかった；対照群と比較して、各投与群におけるマウスの体重は、有意には減少しなかった；実験の終了時点において、各群におけるマウスの肉眼的解剖学により、主要な器官において明らかな病変は示されず、この実験における各群の薬物の用いられた投与用量が、マウスへ明らかな毒性を示さないことが示されている。
本出願において言及された全ての文書は、あたかも各文書が参考文献として個々に引用されているかのように、本出願において参考文献として引用されている。加えて、本出願の上記で教示する内容を読んだ後、当業者が本出願に様々な変化または改変を施し得ること、およびこれらの等価の形もまた、本出願の添付の特許請求の範囲により定義される範囲内にあることは、理解されるべきである。
本出願の配列情報
配列番号１ Ｃ－Ｙｅ－１８ ＣＤＲ１アミノ酸配列
GFTFSSYWMY
配列番号２ Ｃ－Ｙｅ－１８ ＣＤＲ２アミノ酸配列
SINSSSSSTYYRDSVKG
配列番号３ Ｃ－Ｙｅ－１８ ＣＤＲ３アミノ酸配列
AKDPGGYA
配列番号４ Ｃ－Ｙｅ－１８ ＶＨＨアミノ酸配列
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWLRQAPGKGLEWVSSINSSSSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKDPGGYAKGQGTQVTVSS
配列番号５ Ｃ－Ｙｅ－１８ ＶＨＨヌクレオチド配列
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGCGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTACTGGATGTATTGGCTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCATCTATTAATAGTAGTAGTAGTAGCACATACTATCGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAAATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAAAGATCCTGGTGGGTACGCCAAAGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号６ Ｃ－Ｙｅ－０４ ＣＤＲ１アミノ酸配列
SGFTFSSYWMY
配列番号７ Ｃ－Ｙｅ－０４ ＣＤＲ２アミノ酸配列
SINTSSSSTYYRDSVKG
配列番号８ Ｃ－Ｙｅ－０４ ＣＤＲ３アミノ酸配列
AKDPGGYA
配列番号９ Ｃ－Ｙｅ－０４ ＶＨＨアミノ酸配列
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWLRQAPGKGLEWVSSINTSSSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKDPGGYAKGQGTQVTVSS
配列番号１０ Ｃ－Ｙｅ－０４ ＶＨＨヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGCGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTACTGGATGTATTGGCTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCATCTATTAATACTAGTAGTAGTAGCACATACTATCGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAAATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAAAGATCCTGGTGGGTACGCCAAAGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号１１ Ｃ－Ｙｅ－０２ ＣＤＲ１アミノ酸配列
GRTFNNSAMGAMG
配列番号１２ Ｃ－Ｙｅ－０２ ＣＤＲ２アミノ酸配列
TITWSSGSSFYANSVKG
配列番号１３ Ｃ－Ｙｅ－０２ ＣＤＲ３アミノ酸配列
ASRKLGGVVTVVTSYDF
配列番号１４ Ｃ－Ｙｅ－０２ ＶＨＨアミノ酸配列
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNSAMGAMGWFRQAPGKEREFVATITWSSGSSFYANSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCASRKLGGVVTVVTSYDFWGQGTQVTVSS
配列番号１５ Ｃ－Ｙｅ－０２ ＶＨＨヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAATAACTCGGCCATGGGCGCCATGGGATGGTTCCGCCAGGCGCCAGGGAAAGAGCGTGAGTTTGTCGCGACAATTACCTGGAGTAGTGGTAGCTCATTTTATGCAAACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCATCACGCAAATTGGGAGGGGTTGTAACGGTAGTTACTTCGTATGACTTCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号１６ Ｃ－Ｙｅ－０６ ＣＤＲ１アミノ酸配列
GRTFDNYAMGAMG
配列番号１７ Ｃ－Ｙｅ－０６ ＣＤＲ２アミノ酸配列
TITWSSGSSFYANSVKG
配列番号１８ Ｃ－Ｙｅ－０６ ＣＤＲ３アミノ酸配列
ASRKLGGVVTVVTSYDF
配列番号１９ Ｃ－Ｙｅ－０６ ＶＨＨアミノ酸配列
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFDNYAMGAMGWFRQAPGKEREFVATITWSSGSSFYANSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPDDTAVYYCASRKLGGVVTVVTSYDFWGQGTQVTVSS
配列番号２０ Ｃ－Ｙｅ－０６ ＶＨＨヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCGATAACTATGCCATGGGCGCCATGGGATGGTTCCGCCAGGCGCCAGGGAAAGAGCGTGAGTTTGTCGCGACAATTACCTGGAGTAGTGGTAGCTCATTTTATGCAAACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGACGACACGGCCGTTTATTACTGTGCATCACGCAAATTGGGAGGGGTTGTAACGGTAGTTACTTCGTATGACTTCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号２１ Ｃ－Ｙｅ－０９ ＣＤＲ１アミノ酸配列
GRTFSTYAVG
配列番号２２ Ｃ－Ｙｅ－０９ ＣＤＲ２アミノ酸配列
GRLTWSGSRTYYADSVKG
配列番号２３ Ｃ－Ｙｅ－０９ ＣＤＲ３アミノ酸配列
AADYRSNSTWSLQSPARYEN
配列番号２４ Ｃ－Ｙｅ－０９ ＶＨＨアミノ酸配列
QVQLQESGGGLVQAGDSLGLSCTASGRTFSTYAVGWFRQAPGKGREFVGRLTWSGSRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADYRSNSTWSLQSPARYENWGQGTQVTVSS
配列番号２５ Ｃ－Ｙｅ－０９ ＶＨＨヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGGGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTACCTATGCCGTGGGGTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCGTGAATTTGTAGGACGTCTTACATGGAGCGGGAGTAGAACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCCGACTACCGAAGTAACAGTACCTGGTCCCTGCAAAGCCCGGCACGTTATGAAAATTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号２６ Ｃ－Ｙｅ－１０ ＣＤＲ１アミノ酸配列
GRTVSNYAMG
配列番号２７ Ｃ－Ｙｅ－１０ ＣＤＲ２アミノ酸配列
RITGSGSSTFYADSVKG
配列番号２８ Ｃ－Ｙｅ－１０ ＣＤＲ３アミノ酸配列
AADRWRSMVTRSDPREYEN
配列番号２９ Ｃ－Ｙｅ－１０ ＶＨＨアミノ酸配列
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTVSNYAMGWFRQAPGKEREFVARITGSGSSTFYADSVKGRFTISRNNLSNTVYLQMNSLKREDTAVYYCAADRWRSMVTRSDPREYENWGQGTQVTVSS
配列番号３０ Ｃ－Ｙｅ－１０ ＶＨＨヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGACGCACCGTCAGTAACTATGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCACGGATTACCGGGAGTGGTAGTAGCACATTCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAAACAACTTGTCGAACACGGTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAACGTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCAGATCGCTGGCGTTCAATGGTGACTAGATCTGACCCGAGGGAGTATGAGAACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号３１ Ｃ－Ｙｅ－１７ ＣＤＲ１アミノ酸配列
GRTVSNYAMG
配列番号３２ Ｃ－Ｙｅ－１７ ＣＤＲ２アミノ酸配列
RITGSGSSTFYADSVKG
配列番号３３ Ｃ－Ｙｅ－１７ ＣＤＲ３アミノ酸配列
AADRWRSMVTRSDPREYEN
配列番号３４ Ｃ－Ｙｅ－１７ ＶＨＨアミノ酸配列
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTVSNYAMGWFRQAPGKEREFVARITGSGSSTFYADSVKGLFTISRNNLSNTVYLQMNSLKREDTAVYYCAADRWRSMVTRSDPREYENWGQGTQVTVSS
配列番号３５ Ｃ－Ｙｅ－１７ ＶＨＨヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGACGCACCGTCAGTAACTATGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCACGGATTACCGGGAGTGGTAGTAGCACATTCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCTATTCACCATCTCCAGAAACAACTTGTCGAACACGGTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAACGTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCAGATCGCTGGCGTTCAATGGTGACTAGATCTGACCCGAGGGAGTATGAGAACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号３６ Ｃ－Ｙｅ－２０ ＣＤＲ１アミノ酸配列
GRTVSNYAMG
配列番号３７ Ｃ－Ｙｅ－２０ ＣＤＲ２アミノ酸配列
RITGSGSSTFYADSVKG
配列番号３８ Ｃ－Ｙｅ－２０ ＣＤＲ３アミノ酸配列
AADRWRSMVTRSYPREYEN
配列番号３９ Ｃ－Ｙｅ－２０ ＶＨＨアミノ酸配列
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTVSNYAMGWFRQAPGKEREFVARITGSGSSTFYADSVKGRFTISRDNAKNAVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADRWRSMVTRSYPREYENWGQGTQVTVSS
配列番号４０ Ｃ－Ｙｅ－２０ ＶＨＨヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGACGCACCGTCAGTAACTATGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCACGGATTACCGGGAGTGGTAGTAGCACATTCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACGCGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCAGATCGCTGGCGTTCAATGGTGACTAGATCTTACCCGAGGGAGTATGAGAACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号４１ Ｃ－Ｙｅ－２４ ＣＤＲ１アミノ酸配列
GRTVSNYAMG
配列番号４２ Ｃ－Ｙｅ－２４ ＣＤＲ２アミノ酸配列
RITGSGRTTYYADSVKG
配列番号４３ Ｃ－Ｙｅ－２４ ＣＤＲ３アミノ酸配列
AADRWRSMVTRSDPREYEN
配列番号４４ Ｃ－Ｙｅ－２４ ＶＨＨアミノ酸配列
QVQLQESGGGVVQAGDSLRLSCVASGRTVSNYAMGWFRQAPGKEREFVARITGSGRTTYYADSVKGRFTISRNNLSNTVYLQMNSLKREDTAVYYCAADRWRSMVTRSDPREYENWGQGTQVTVSS
配列番号４５ Ｃ－Ｙｅ－２４ ＶＨＨヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGTGTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGACGCACCGTCAGTAACTATGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCACGGATTACCGGGAGTGGTCGTACCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAAACAACTTGTCGAACACGGTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAACGTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCAGATCGCTGGCGTTCAATGGTGACTAGATCTGACCCGAGGGAGTATGAGAACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号４６ Ｃ－Ｙｅ－２６ ＣＤＲ１アミノ酸配列
GRTVSNYAMG
配列番号４７ Ｃ－Ｙｅ－２６ ＣＤＲ２アミノ酸配列
RITGSGSSTFYADSVKG
配列番号４８ Ｃ－Ｙｅ－２６ ＣＤＲ３アミノ酸配列
AADRWRSMVTRSDPRDYEN
配列番号４９ Ｃ－Ｙｅ－２６ ＶＨＨアミノ酸配列
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTVSNYAMGWFRQAPGKEREFVARITGSGSSTFYADSVKGRFTISRNNLSNTVYLQMNSLKREDTAVYYCAADRWRSMVTRSDPRDYENWGQGTQVTVSS
配列番号５０ Ｃ－Ｙｅ－２６ ＶＨＨヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGACGCACCGTCAGTAACTATGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCACGGATTACCGGGAGTGGTAGTAGCACATTCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAAACAACTTGTCGAACACGGTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAACGTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCAGATCGCTGGCGTTCAATGGTGACTAGATCTGACCCGAGGGATTATGAGAACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号５１ Ｃ－Ｙｅ－２７ ＣＤＲ１アミノ酸配列
GRTFSRYAVG
配列番号５２ Ｃ－Ｙｅ－２７ ＣＤＲ２アミノ酸配列
AITWSGGYTYYADSVKG
配列番号５３ Ｃ－Ｙｅ－２７ ＣＤＲ３アミノ酸配列
AVDTRNVIGPRAGDY
配列番号５４ Ｃ－Ｙｅ－２７ ＶＨＨアミノ酸配列
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSRYAVGWFRQAPGLGRDFVAAITWSGGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAVDTRNVIGPRAGDYWGQGTQVTVSS
配列番号５５ Ｃ－Ｙｅ－２７ ＶＨＨヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTAGGTATGCCGTGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGCTGGGGCGTGACTTTGTAGCAGCTATTACCTGGAGTGGTGGTTACACATACTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATTTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGTCGATACGAGGAATGTAATCGGCCCAAGAGCGGGAGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号５６ Ｃ－Ｙｅ－３０ ＣＤＲ１アミノ酸配列
GSTFSRYAVG
配列番号５７ Ｃ－Ｙｅ－３０ ＣＤＲ２アミノ酸配列
AITWSGGYTYYADSVKG
配列番号５８ Ｃ－Ｙｅ－３０ ＣＤＲ３アミノ酸配列
AVDTRNVIGPRAGDY
配列番号５９ Ｃ－Ｙｅ－３０ ＶＨＨアミノ酸配列
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTFSRYAVGWFRQAPGLGRDFVAAITWSGGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAVDTRNVIGPRAGDYWGQGTQVTVSS
配列番号６０ Ｃ－Ｙｅ－３０ ＶＨＨヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGCACCTTCAGTAGGTATGCCGTGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGCTGGGGCGTGACTTTGTAGCAGCTATTACCTGGAGTGGTGGTTACACATACTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATTTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGTCGATACGAGGAATGTAATCGGCCCAAGAGCGGGAGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号６１ Ｃ－Ｙｅ－３２ ＣＤＲ１アミノ酸配列
GRTFSRYAVG
配列番号６２ Ｃ－Ｙｅ－３２ ＣＤＲ２アミノ酸配列
AITWSGGYTYYADSVKG
配列番号６３ Ｃ－Ｙｅ－３２ ＣＤＲ３アミノ酸配列
AVDTRNVIGPRAGDY
配列番号６４ Ｃ－Ｙｅ－３２ ＶＨＨアミノ酸配列
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSRYAVGWFRQAPGLGRDFVAAITWSGGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTIYLQMNSLNVEDTGVYYCAVDTRNVIGPRAGDYWGQGTQVTVSS
配列番号６５ Ｃ－Ｙｅ－３２ ＶＨＨヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTAGGTATGCCGTGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGCTGGGGCGTGACTTTGTAGCAGCTATTACCTGGAGTGGTGGTTACACATACTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGATCTATCTCCAAATGAACAGCCTGAACGTTGAGGACACGGGCGTTTATTACTGCGCAGTCGATACGAGGAATGTAATCGGCCCAAGAGCGGGAGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号６６ Ｃ－Ｙｅ－３４ ＣＤＲ１アミノ酸配列
AASGRTFSRFAMG
配列番号６７ Ｃ－Ｙｅ－３４ ＣＤＲ２アミノ酸配列
AISWSGGMIYYTDSVKG
配列番号６８ Ｃ－Ｙｅ－３４ ＣＤＲ３アミノ酸配列
AVDTRNVIGPRAGDY
配列番号６９ Ｃ－Ｙｅ－３４ ＶＨＨアミノ酸配列
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSRFAMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGMIYYTDSVKGRFTISRDNAKNMLYLQMNSLKPEDTAVYYCAVDTRNVIGPRAGDYWGQGTQVTVSS
配列番号７０ Ｃ－Ｙｅ－３４ ＶＨＨヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACTTTCAGTAGGTTTGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCCGCTATTAGCTGGAGTGGTGGTATGATATACTATACAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACATGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGTCGATACGAGGAATGTAATCGGCCCAAGAGCGGGAGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号７１ Ｃ－Ｙｅ－３９ ＣＤＲ１アミノ酸配列
GRAFSVYPMA
配列番号７２ Ｃ－Ｙｅ－３９ ＣＤＲ２アミノ酸配列
RLTYTSNTFYADSVKG
配列番号７３ Ｃ－Ｙｅ－３９ ＣＤＲ３アミノ酸配列
AVENRSSSWSLQSPARYDD
配列番号７４ Ｃ－Ｙｅ－３９ ＶＨＨアミノ酸配列
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCTASGRAFSVYPMAWFRQAPGKEREFIARLTYTSNTFYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAVENRSSSWSLQSPARYDDWGQGTQVTVSS
配列番号７５ Ｃ－Ｙｅ－３９ ＶＨＨヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCATGTACAGCCTCTGGACGCGCCTTCAGTGTCTACCCCATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTATAGCACGTCTTACGTATACTAGTAACACATTCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGGTCGAGAACCGCAGTAGTAGTTGGTCCCTGCAAAGCCCGGCACGTTATGATGACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号７６ Ｃ－Ｙｅ－４２ ＣＤＲ１アミノ酸配列
GRTGSRYAVG
配列番号７７ Ｃ－Ｙｅ－４２ ＣＤＲ２アミノ酸配列
AITWSGGYTYYADSVKG
配列番号７８ Ｃ－Ｙｅ－４２ ＣＤＲ３アミノ酸配列
AVDTRNVIGPRAGDY
配列番号７９ Ｃ－Ｙｅ－４２ ＶＨＨアミノ酸配列
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTGSRYAVGWFRQAPGLGRDFVAAITWSGGYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCAVDTRNVIGPRAGDYWGQGTQVTVSS
配列番号８０ Ｃ－Ｙｅ－４２ ＶＨＨヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCGGCAGTAGGTATGCCGTGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGCTGGGGCGTGACTTTGTAGCAGCTATTACCTGGAGTGGTGGTTACACATACTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGATGTATCTGCAAATGAACAGCCTAAAACCTGAAGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGTCGATACGAGGAATGTAATCGGCCCAAGAGCGGGAGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号８１ Ｃ－Ｙｅ－１８－１ ＣＤＲ２アミノ酸配列
SINSGSSSTYYRDSVKG
配列番号８２ Ｃ－Ｙｅ－１８－１ ＶＨＨアミノ酸配列
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWLRQAPGKGLEWVSSINSGSSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKDPGGYAKGQGTQVTVSS
配列番号８３ Ｃ－Ｙｅ－１８－１ ＶＨＨヌクレオチド配列
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGCGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTACTGGATGTATTGGCTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCATCTATTAATAGTGGTAGTAGTAGCACATACTATCGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAAATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAAAGATCCTGGTGGGTACGCCAAAGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号８４ Ｃ－Ｙｅ－１８－２ ＣＤＲ２アミノ酸配列
SISSSSSSTYYRDSVKG
配列番号８５ Ｃ－Ｙｅ－１８－２ ＶＨＨアミノ酸配列
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWLRQAPGKGLEWVSSISSSSSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKDPGGYAKGQGTQVTVSS
配列番号８６ Ｃ－Ｙｅ－１８－２ ＶＨＨヌクレオチド配列
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGCGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTACTGGATGTATTGGCTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCATCTATTAGTAGTAGTAGTAGTAGCACATACTATCGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAAATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAAAGATCCTGGTGGGTACGCCAAAGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号８７ Ｃ－Ｙｅ－１８－３ ＣＤＲ２アミノ酸配列
SIGSSSSSTYYRDSVKG
配列番号８８ Ｃ－Ｙｅ－１８－３ ＶＨＨアミノ酸配列
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWLRQAPGKGLEWVSSIGSSSSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKDPGGYAKGQGTQVTVSS
配列番号８９ Ｃ－Ｙｅ－１８－３ ＶＨＨヌクレオチド配列
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGCGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTACTGGATGTATTGGCTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCATCTATTGGTAGTAGTAGTAGTAGCACATACTATCGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAAATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAAAGATCCTGGTGGGTACGCCAAAGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号９０ Ｃ－Ｙｅ－１８－４ ＣＤＲ２アミノ酸配列
SIYSGSSSTYYRDSVKG
配列番号９１ Ｃ－Ｙｅ－１８－４ ＶＨＨアミノ酸配列
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWLRQAPGKGLEWVSSIYSGSSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKDPGGYAKGQGTQVTVSS
配列番号９２ Ｃ－Ｙｅ－１８－４ ＶＨＨヌクレオチド配列
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGCGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTACTGGATGTATTGGCTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCATCTATTTACAGTGGTAGTAGTAGCACATACTATCGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAAATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAAAGATCCTGGTGGGTACGCCAAAGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号９３ Ｃ－Ｙｅ－１８－５ ＣＤＲ２アミノ酸配列
SINSDSSSTYYRDSVKG
配列番号９４ Ｃ－Ｙｅ－１８－５ ＶＨＨアミノ酸配列
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWLRQAPGKGLEWVSSINSDSSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKDPGGYAKGQGTQVTVSS
配列番号９５ Ｃ－Ｙｅ－１８－５ ＶＨＨヌクレオチド配列
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGCGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTACTGGATGTATTGGCTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCATCTATTAATAGTGACAGTAGTAGCACATACTATCGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAAATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAAAGATCCTGGTGGGTACGCCAAAGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号９６ Ｃ－Ｙｅ－１８－６ ＣＤＲ２アミノ酸配列
SINSGSSSTYYRDSVKG
配列番号９７ Ｃ－Ｙｅ－１８－６ ＶＨＨアミノ酸配列
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWLRQAPGKGLEWVSSISGSSSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKDPGGYAKGQGTQVTVSS
配列番号９８ Ｃ－Ｙｅ－１８－６ ＶＨＨヌクレオチド配列
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGCGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTACTGGATGTATTGGCTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCATCTATTAGTGGTAGTAGTAGTAGCACATACTATCGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAAATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAAAGATCCTGGTGGGTACGCCAAAGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAGT
配列番号９９ ＩｇＧ１ Ｆｃ断片アミノ酸配列
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
配列番号１００ 融合タンパク質リンカーアミノ酸配列
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
配列番号１０１ ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインアミノ酸配列
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
配列番号１０２ ＰＭ８００１アミノ酸配列
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWLRQAPGKGLEWVSSINSDSSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKDPGGYAKGQGTQVTVSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
配列番号１０３ 第１ラウンドについての上流プライマー
GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
配列番号１０４ 第１ラウンドについての下流プライマー
GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
配列番号１０５ 第２ラウンドについての上流プライマー
CTAGTGCGGCCGCcTGGAGACGGTGACCTGGGT
配列番号１０６ 第２ラウンドについての下流プライマー
CGCGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
配列番号１０７ 第３ラウンドについての上流プライマー
ATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTAAAAGAGAGGCTGAAGCACAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
配列番号１０８ 第３ラウンドについての下流プライマー
AGTTGTCAGTTCCTGTGCCCCCCCTCCTCCCGCGCCACCTCCGCCCGCACCTCCGCCACCAcTGGAGACGGTGACCTGGGT
配列番号１０９ ＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓタグアミノ酸配列
MFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYHHHHHH
配列番号１１０ ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体融合タンパク質アミノ酸配列
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWLRQAPGKGLEWVSSINSDSSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKDPGGYAKGQGTQVTVSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
配列番号１１１ ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体アミノ酸配列
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWLRQAPGKGLEWVSSINSDSSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKDPGGYAKGQGTQVTVSSDK

Claims (12)

  1. 抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）であって、前記ＶＨＨ鎖の前記ＣＤＲが、以下：
    配列番号５ｎ＋１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１；
    配列番号５ｎ＋２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、または配列番号２に示される配列と８５％より高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤＲ２；および
    配列番号５ｎ＋３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３
    からなり、
    各ｎが、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）。
  2. 請求項１に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖。
  3. 前記ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号９３に示される、請求項２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体。
  4. ＰＤ－Ｌ１エピトープに対する単一ドメイン抗体であり、かつ請求項２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖を有する、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体。
  5. 前記抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体の前記ＶＨＨ鎖のアミノ酸配列が配列番号９４に示される、請求項２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体。
  6. 請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖のＣＤＲ領域、請求項２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、または請求項４に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を含む群から選択されるタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
  7. Ｎ末端からＣ末端へ式Ｉに示される構造を有する、単一ドメイン抗体融合タンパク質：
    Ｚ１－Ｚ２－Ｌ－Ｚ３ （式Ｉ）
    ［式中、
    Ｚ１は、請求項２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖であり；
    Ｚ２は、免疫グロブリンのＦｃ断片であり；
    Ｌは、リンカー配列であり；
    Ｚ３は、免疫調節性分子部分である］。
  8. 前記単一ドメイン抗体融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１０２に示される、請求項７に記載の単一ドメイン抗体融合タンパク質。
  9. （ａ）請求項２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、請求項４に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体、または請求項８に記載の単一ドメイン抗体融合タンパク質；および
    （ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素を含む群から選択されるカップリング部分
    を含む、イムノコンジュゲート。
  10. （ａ）ＰＤ－Ｌ１分子を検出するために用いられる試薬および（ｂ）腫瘍を処置するために用いられる薬物の製造における、請求項４に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体または請求項８に記載の単一ドメイン抗体融合タンパク質の使用。
  11. （ｉ）請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖のＣＤＲ、請求項２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、請求項４に記載の抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体、請求項７に記載の単一ドメイン抗体融合タンパク質、または請求項９に記載のイムノコンジュゲート；および
    （ｉｉ）薬学的に許容される担体
    を含む、薬学的組成物。
  12. 医薬、試薬、検出プレート、もしくはキットの製造における、請求項２に記載のＶＨＨ鎖、請求項４に記載の単一ドメイン抗体、請求項５に記載の単一ドメイン抗体融合タンパク質、または請求項９に記載のイムノコンジュゲートの使用であって、
    前記試薬、前記検出プレート、または前記キットが試料におけるＰＤ－Ｌ１タンパク質を検出するために用いられ；
    前記医薬が、前記ＰＤ－Ｌ１タンパク質を発現する（ＰＤ－Ｌ１陽性）腫瘍を処置または予防するために用いられる、
    使用。
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