JP6604989B2 - 細胞表面抗原のイムノバインダーを同定するための方法 - Google Patents
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Description
（背景情報）
抗体、その結合体および誘導体を包含するイムノバインダー（ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅ
ｒ）は、治療剤および診断剤として、非常に産業的に重要である。抗体調製もしくはスク
リーニングのための伝統的な方法は、通常は、可溶性の抗原を利用する。しかし、特定の
膜結合タンパク質抗原について、上記抗原上のコンフォメーションエピトープ（ｃｏｎｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）は、上記抗原が、上記膜から可溶化される場合
に改変され、抗体調製もしくはスクリーニングの失敗を生じる。さらに、イムノブロッテ
ィング法およびアフィニティークロマトグラフィー法における１つの重要な問題は、上記
抗原に対して中程度のアフィニティーを有する抗体が選択されることである。このことは
、多くの交叉反応性もしくは粘着性の抗体の包含を許容してしまい、連続したスクリーニ
ング手順において負担を引き起こす。膜結合抗原を発現する細胞は、抗体調製に直接使用
されてきたが、細胞表面抗原に対する高アフィニティー抗体を検出しかつ富化し得る効率
的なスクリーニング方法はなお、不足している。
抗体、その結合体および誘導体を包含するイムノバインダー（ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅ
ｒ）は、治療剤および診断剤として、非常に産業的に重要である。抗体調製もしくはスク
リーニングのための伝統的な方法は、通常は、可溶性の抗原を利用する。しかし、特定の
膜結合タンパク質抗原について、上記抗原上のコンフォメーションエピトープ（ｃｏｎｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）は、上記抗原が、上記膜から可溶化される場合
に改変され、抗体調製もしくはスクリーニングの失敗を生じる。さらに、イムノブロッテ
ィング法およびアフィニティークロマトグラフィー法における１つの重要な問題は、上記
抗原に対して中程度のアフィニティーを有する抗体が選択されることである。このことは
、多くの交叉反応性もしくは粘着性の抗体の包含を許容してしまい、連続したスクリーニ
ング手順において負担を引き起こす。膜結合抗原を発現する細胞は、抗体調製に直接使用
されてきたが、細胞表面抗原に対する高アフィニティー抗体を検出しかつ富化し得る効率
的なスクリーニング方法はなお、不足している。
（発明の要旨）
本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合し得るイムノバインダー（例えば、ｓｃＦｖ抗
体）を同定するための方法を提供する。本発明の方法は、一般に、標識された抗原発現細
胞と、標識されたイムノバインダー発現細胞とを接触させる工程および上記抗原発現細胞
に結合するイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して単離する工程を包含す
る。これら方法は、内在性膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）に存在するコンフォメーシ
ョンエピトープに対するイムノバインダーの迅速かつ効率的な同定のために特に有用であ
る。本発明はまた、本発明の方法を使用して同定された、単離されたイムノバインダーお
よびイムノバインダーをコードする核酸を提供する。
本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合し得るイムノバインダー（例えば、ｓｃＦｖ抗
体）を同定するための方法を提供する。本発明の方法は、一般に、標識された抗原発現細
胞と、標識されたイムノバインダー発現細胞とを接触させる工程および上記抗原発現細胞
に結合するイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して単離する工程を包含す
る。これら方法は、内在性膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）に存在するコンフォメーシ
ョンエピトープに対するイムノバインダーの迅速かつ効率的な同定のために特に有用であ
る。本発明はまた、本発明の方法を使用して同定された、単離されたイムノバインダーお
よびイムノバインダーをコードする核酸を提供する。
一局面において、本発明は、目的の細胞表面抗原に特異的に結合するイムノバインダー
を同定するための方法を提供する。上記方法は、第１のソート可能（ｓｏｒｔａｂｌｅ）
な標識に作動可能に連結した複数のイムノバインダー発現細胞を提供する工程；第２のソ
ート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここ
で上記目的の抗原は、上記抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程；上記抗原発
現細胞と、上記イムノバインダー発現細胞とを接触させる工程；および上記複数のイムノ
バインダー発現細胞から、上記抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上のイムノバイ
ンダー発現細胞を、セルソーター（例えば、蛍光細胞分析分離装置）を使用して分離する
工程であって、ここで単一の細胞複合体（例えば、抗原と、Ｂ細胞レセプターとの間で形
成される複合体）における上記第１のおよび第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現
細胞へのイムノバインダー発現細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合する
イムノバインダーを同定する、工程を包含する。
を同定するための方法を提供する。上記方法は、第１のソート可能（ｓｏｒｔａｂｌｅ）
な標識に作動可能に連結した複数のイムノバインダー発現細胞を提供する工程；第２のソ
ート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここ
で上記目的の抗原は、上記抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程；上記抗原発
現細胞と、上記イムノバインダー発現細胞とを接触させる工程；および上記複数のイムノ
バインダー発現細胞から、上記抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上のイムノバイ
ンダー発現細胞を、セルソーター（例えば、蛍光細胞分析分離装置）を使用して分離する
工程であって、ここで単一の細胞複合体（例えば、抗原と、Ｂ細胞レセプターとの間で形
成される複合体）における上記第１のおよび第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現
細胞へのイムノバインダー発現細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合する
イムノバインダーを同定する、工程を包含する。
いくつかの実施形態において、上記分離されたイムノバインダー発現細胞は、クローン
的に単離される。いくつかの実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、クロ
ーン性増殖に供される。他の実施形態において、上記イムノバインダーをコードする核酸
配列は、イムノバインダー発現細胞から単離される。上記イムノバインダーをコードする
核酸配列を単離するのに適した方法としては、ＰＣＲ（例えば、単一細胞ＰＣＲ（ｓｉｎ
ｇｌｅ−ｃｅｌｌ ＰＣＲ））が挙げられる。上記イムノバインダーをコードする核酸配
列は、上記細胞がクローン的に単離された後および／もしくはクローン性増殖の後に、単
離され得る。
的に単離される。いくつかの実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、クロ
ーン性増殖に供される。他の実施形態において、上記イムノバインダーをコードする核酸
配列は、イムノバインダー発現細胞から単離される。上記イムノバインダーをコードする
核酸配列を単離するのに適した方法としては、ＰＣＲ（例えば、単一細胞ＰＣＲ（ｓｉｎ
ｇｌｅ−ｃｅｌｌ ＰＣＲ））が挙げられる。上記イムノバインダーをコードする核酸配
列は、上記細胞がクローン的に単離された後および／もしくはクローン性増殖の後に、単
離され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の方法を使用して単離されたイムノバインダー発
現細胞は、上記イムノバインダーを機能的に特徴付けるために、細胞ベースのアッセイに
供される。適切な細胞ベースのアッセイとしては、ＣＥＬＩＳＡが挙げられる。
現細胞は、上記イムノバインダーを機能的に特徴付けるために、細胞ベースのアッセイに
供される。適切な細胞ベースのアッセイとしては、ＣＥＬＩＳＡが挙げられる。
いくつかの実施形態において、上記イムノバインダーは抗体である。このような抗体と
しては、マウス抗体、ウサギ抗体、ウサギ化抗体、ニワトリ抗体、ラクダ抗体、ラクダ化
抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体が挙げられる。適切な抗体形式としては、
Ｆａｂ、Ｄａｂ、ナノボディーおよびｓｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されない。
しては、マウス抗体、ウサギ抗体、ウサギ化抗体、ニワトリ抗体、ラクダ抗体、ラクダ化
抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体が挙げられる。適切な抗体形式としては、
Ｆａｂ、Ｄａｂ、ナノボディーおよびｓｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、上記目的の抗原は、外因性遺伝子から発現される。他の
実施形態において、上記目的の抗原は、遺伝的に操作された抗原である。他の実施形態に
おいて、上記目的の抗原は、内在性膜タンパク質である。適切な内在性膜タンパク質とし
ては、ＧＰＣＲ（例えば、ＣＸＣＲ２）もしくはイオンチャネルが挙げられるが、これら
に限定されない。
実施形態において、上記目的の抗原は、遺伝的に操作された抗原である。他の実施形態に
おいて、上記目的の抗原は、内在性膜タンパク質である。適切な内在性膜タンパク質とし
ては、ＧＰＣＲ（例えば、ＣＸＣＲ２）もしくはイオンチャネルが挙げられるが、これら
に限定されない。
いくつかの実施形態において、上記第１のもしくは第２のソート可能な標識は、蛍光標
識である。適切な蛍光標識としては、蛍光タンパク質、抗体／蛍光体結合体（ｆｌｕｏｒ
ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）および蛍光性細胞標識が挙げられるが、これらに限定されない。
識である。適切な蛍光標識としては、蛍光タンパク質、抗体／蛍光体結合体（ｆｌｕｏｒ
ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）および蛍光性細胞標識が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞（
例えば、ヒト細胞）である。いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、外因性
抗原を発現する。いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、発現ベクターでト
ランスフェクトされる。
例えば、ヒト細胞）である。いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、外因性
抗原を発現する。いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、発現ベクターでト
ランスフェクトされる。
いくつかの実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、酵母細胞もしくは哺
乳動物細胞である。適切な哺乳動物細胞としては、Ｂ細胞（例えば、ウサギＢ細胞）が挙
げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記Ｂ細胞は、免疫
化した動物（例えば、ＤＮＡワクチン接種によって免疫化した動物）から単離される。い
くつかの実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、発現ベクターから発現さ
れるイムノバインダーを含む。
乳動物細胞である。適切な哺乳動物細胞としては、Ｂ細胞（例えば、ウサギＢ細胞）が挙
げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記Ｂ細胞は、免疫
化した動物（例えば、ＤＮＡワクチン接種によって免疫化した動物）から単離される。い
くつかの実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、発現ベクターから発現さ
れるイムノバインダーを含む。
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって同定されたイムノバインダーをコ
ードする単離された核酸分子を提供する。
ードする単離された核酸分子を提供する。
別の局面において、本発明は、目的の抗原に結合し得るイムノバインダーを産生するた
めの方法を提供し、上記方法は、本発明の方法によって同定されたイムノバインダーをコ
ードする核酸配列を、上記コードされたイムノバインダーが産生されるように、発現環境
に導入する工程を包含する。
めの方法を提供し、上記方法は、本発明の方法によって同定されたイムノバインダーをコ
ードする核酸配列を、上記コードされたイムノバインダーが産生されるように、発現環境
に導入する工程を包含する。
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって産生されたイムノバインダーを提
供する。
供する。
別の局面において、本発明はまた、目的の細胞表面抗原に特異的に結合するＢ細胞クロ
ーンを同定するための方法を提供し、上記方法は、動物を、細胞表面抗原をコードするＤ
ＮＡで免疫化する工程；上記免疫化した動物からＢ細胞を単離する工程；上記Ｂ細胞を、
第１のソート可能な標識で標識する工程；第２のソート可能な標識に作動可能に連結した
複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで上記目的の抗原は、上記抗原発現細
胞の表面にディスプレイされる、工程；上記抗原発現細胞と、上記Ｂ細胞とを接触させる
工程；および上記複数のＢ細胞から、上記抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上の
Ｂ細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体にお
ける上記第１のおよび第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのＢ細胞の結合
を示し、それによって、目的の抗原に結合するＢ細胞クローンを同定する、工程を包含す
る。
本発明の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
目的の細胞表面抗原に特異的に結合するイムノバインダーを同定するための方法であって
、該方法は、
（ａ）第１のソート可能な標識に作動可能に連結された複数のイムノバインダー発現細
胞を提供する工程；
（ｂ）第２のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工
程であって、ここで該目的の抗原は、該抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程
；
（ｃ）該抗原発現細胞と、該イムノバインダー発現細胞とを接触させる工程；および
（ｄ）該複数のイムノバインダー発現細胞から、該抗原発現細胞に特異的に結合し得る
１個以上のイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって
、ここで単一の細胞複合体における該第１のソート可能な標識および該第２のソート可能
な標識の存在は、抗原発現細胞へのイムノバインダー発現細胞の結合を示し、それによっ
て、目的の抗原に結合するイムノバインダーを同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記工程（ｄ）において得られたイムノバインダー発現細胞をクローン的に単離し、必要
に応じて、続いて、該クローン的に単離された細胞のクローン性増殖を行う工程をさらに
包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記イムノバインダーをコードする核酸配列を、前記単離されたイムノバインダー発現細
胞から得る工程をさらに包含する、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記イムノバインダーをコードする核酸配列は、ＰＣＲによって得られる、項目３に記載
の方法。
（項目５）
前記ＰＣＲは、単一細胞ＰＣＲである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記単離されたイムノバインダー発現細胞を、細胞ベースのアッセイに供して、前記イム
ノバインダーを機能的に特徴付ける工程をさらに包含する、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記細胞ベースのアッセイが、ＣＥＬＩＳＡである、項目６に記載の方法。
（項目８）
細胞複合体が、抗原と、Ｂ細胞レセプターとの間に形成される、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記イムノバインダーは抗体である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記抗体は、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体、ラクダ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗
体およびキメラ抗体からなる群より選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記抗体は、全長免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｄａｂおよびナノボディーからなる群より選
択される、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記抗体は、ｓｃＦｖである、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記目的の抗原は、外因性遺伝子から発現される、上記項目のいずれか１項に記載の方法
。
（項目１４）
前記目的の抗原は、遺伝的に操作された抗原である、上記項目のいずれか１項に記載の方
法。
（項目１５）
前記目的の抗原は、内在性膜タンパク質である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記内在性膜タンパク質は、ＧＰＣＲである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ＧＰＣＲは、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣ
Ｒ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩ
Ｃ−１、ＣＩＣ−２、ＣＩＣ−４、ＣＩＣ−５、ＣＩＣ−７、ＣＩＣ−Ｋａ、ＣＩＣ−Ｋ
ｂ、Ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎｓ、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡレセプター、グリシンレセプタ
ー、ＡＢＣ輸送体、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ
１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン−
１−ホスフェートレセプター（Ｓ１Ｐ１Ｒ）およびＮＭＤＡチャネルからなる群より選択
される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記内在性膜タンパク質は、イオンチャネルである、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記第１のソート可能な標識もしくは前記第２のソート可能な標識は、蛍光標識である、
上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記蛍光標識は、蛍光タンパク質、抗体／蛍光体結合体および蛍光性細胞標識からなる群
より選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記セルソーターは、蛍光細胞分析分離装置である、上記項目のいずれか１項に記載の方
法。
（項目２２）
前記抗原発現細胞は、酵母細胞、酵母スフェロプラストもしくは哺乳動物細胞である、上
記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記抗原発現細胞は、ヒト細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記抗原発現細胞は、外因性抗原を発現する、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記抗原発現細胞は、発現ベクターでトランスフェクトされる、上記項目のいずれか１項
に記載の方法。
（項目２６）
前記イムノバインダー発現細胞は、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞である、上記項目のい
ずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記イムノバインダー発現細胞は、Ｂ細胞である、上記項目のいずれか１項に記載の方法
。
（項目２８）
前記Ｂ細胞は、ウサギＢ細胞である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記Ｂ細胞は、免疫化した動物から単離される、項目２７または２８のいずれか１項に記
載の方法。
（項目３０）
前記動物は、ＤＮＡワクチン接種によって免疫化される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記イムノバインダー発現細胞は、発現ベクターから発現されるイムノバインダーを含む
、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
項目１〜３１のいずれか１項に記載の方法によって選択されるイムノバインダーをコード
する、単離された核酸分子。
（項目３３）
目的の抗原に結合し得るイムノバインダーを生成する方法であって、該方法は、項目３２
に記載のイムノバインダーをコードする核酸配列を、該コードされたイムノバインダーが
生成されるように、発現環境に導入する工程を包含する、方法。
（項目３４）
項目３３に記載の方法によって生成される、イムノバインダー。
（項目３５）
目的の細胞表面抗原に特異的に結合するＢ細胞クローンを同定するための方法であって、
該方法は：
（ａ）動物を、細胞表面抗原をコードするＤＮＡで免疫化する工程、
（ｂ）Ｂ細胞を、免疫化した該動物から単離する工程、
（ｃ）該Ｂ細胞を、第１のソート可能な標識で標識する工程；
（ｄ）第２のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工
程であって、ここで該目的の抗原は、該抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程
；
（ｅ）該抗原発現細胞と、該Ｂ細胞とを接触させる工程；および
（ｆ）複数の該Ｂ細胞から、該抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上のＢ細胞を
、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体における該第
１のソート可能な標識および該第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのＢ細
胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するＢ細胞クローンを同定する、工程
、
を包含する、方法。
ーンを同定するための方法を提供し、上記方法は、動物を、細胞表面抗原をコードするＤ
ＮＡで免疫化する工程；上記免疫化した動物からＢ細胞を単離する工程；上記Ｂ細胞を、
第１のソート可能な標識で標識する工程；第２のソート可能な標識に作動可能に連結した
複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで上記目的の抗原は、上記抗原発現細
胞の表面にディスプレイされる、工程；上記抗原発現細胞と、上記Ｂ細胞とを接触させる
工程；および上記複数のＢ細胞から、上記抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上の
Ｂ細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体にお
ける上記第１のおよび第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのＢ細胞の結合
を示し、それによって、目的の抗原に結合するＢ細胞クローンを同定する、工程を包含す
る。
本発明の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
目的の細胞表面抗原に特異的に結合するイムノバインダーを同定するための方法であって
、該方法は、
（ａ）第１のソート可能な標識に作動可能に連結された複数のイムノバインダー発現細
胞を提供する工程；
（ｂ）第２のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工
程であって、ここで該目的の抗原は、該抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程
；
（ｃ）該抗原発現細胞と、該イムノバインダー発現細胞とを接触させる工程；および
（ｄ）該複数のイムノバインダー発現細胞から、該抗原発現細胞に特異的に結合し得る
１個以上のイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって
、ここで単一の細胞複合体における該第１のソート可能な標識および該第２のソート可能
な標識の存在は、抗原発現細胞へのイムノバインダー発現細胞の結合を示し、それによっ
て、目的の抗原に結合するイムノバインダーを同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記工程（ｄ）において得られたイムノバインダー発現細胞をクローン的に単離し、必要
に応じて、続いて、該クローン的に単離された細胞のクローン性増殖を行う工程をさらに
包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記イムノバインダーをコードする核酸配列を、前記単離されたイムノバインダー発現細
胞から得る工程をさらに包含する、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記イムノバインダーをコードする核酸配列は、ＰＣＲによって得られる、項目３に記載
の方法。
（項目５）
前記ＰＣＲは、単一細胞ＰＣＲである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記単離されたイムノバインダー発現細胞を、細胞ベースのアッセイに供して、前記イム
ノバインダーを機能的に特徴付ける工程をさらに包含する、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記細胞ベースのアッセイが、ＣＥＬＩＳＡである、項目６に記載の方法。
（項目８）
細胞複合体が、抗原と、Ｂ細胞レセプターとの間に形成される、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記イムノバインダーは抗体である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記抗体は、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体、ラクダ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗
体およびキメラ抗体からなる群より選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記抗体は、全長免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｄａｂおよびナノボディーからなる群より選
択される、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記抗体は、ｓｃＦｖである、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記目的の抗原は、外因性遺伝子から発現される、上記項目のいずれか１項に記載の方法
。
（項目１４）
前記目的の抗原は、遺伝的に操作された抗原である、上記項目のいずれか１項に記載の方
法。
（項目１５）
前記目的の抗原は、内在性膜タンパク質である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記内在性膜タンパク質は、ＧＰＣＲである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ＧＰＣＲは、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣ
Ｒ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩ
Ｃ−１、ＣＩＣ−２、ＣＩＣ−４、ＣＩＣ−５、ＣＩＣ−７、ＣＩＣ−Ｋａ、ＣＩＣ−Ｋ
ｂ、Ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎｓ、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡレセプター、グリシンレセプタ
ー、ＡＢＣ輸送体、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ
１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン−
１−ホスフェートレセプター（Ｓ１Ｐ１Ｒ）およびＮＭＤＡチャネルからなる群より選択
される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記内在性膜タンパク質は、イオンチャネルである、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記第１のソート可能な標識もしくは前記第２のソート可能な標識は、蛍光標識である、
上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記蛍光標識は、蛍光タンパク質、抗体／蛍光体結合体および蛍光性細胞標識からなる群
より選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記セルソーターは、蛍光細胞分析分離装置である、上記項目のいずれか１項に記載の方
法。
（項目２２）
前記抗原発現細胞は、酵母細胞、酵母スフェロプラストもしくは哺乳動物細胞である、上
記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記抗原発現細胞は、ヒト細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記抗原発現細胞は、外因性抗原を発現する、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記抗原発現細胞は、発現ベクターでトランスフェクトされる、上記項目のいずれか１項
に記載の方法。
（項目２６）
前記イムノバインダー発現細胞は、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞である、上記項目のい
ずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記イムノバインダー発現細胞は、Ｂ細胞である、上記項目のいずれか１項に記載の方法
。
（項目２８）
前記Ｂ細胞は、ウサギＢ細胞である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記Ｂ細胞は、免疫化した動物から単離される、項目２７または２８のいずれか１項に記
載の方法。
（項目３０）
前記動物は、ＤＮＡワクチン接種によって免疫化される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記イムノバインダー発現細胞は、発現ベクターから発現されるイムノバインダーを含む
、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
項目１〜３１のいずれか１項に記載の方法によって選択されるイムノバインダーをコード
する、単離された核酸分子。
（項目３３）
目的の抗原に結合し得るイムノバインダーを生成する方法であって、該方法は、項目３２
に記載のイムノバインダーをコードする核酸配列を、該コードされたイムノバインダーが
生成されるように、発現環境に導入する工程を包含する、方法。
（項目３４）
項目３３に記載の方法によって生成される、イムノバインダー。
（項目３５）
目的の細胞表面抗原に特異的に結合するＢ細胞クローンを同定するための方法であって、
該方法は：
（ａ）動物を、細胞表面抗原をコードするＤＮＡで免疫化する工程、
（ｂ）Ｂ細胞を、免疫化した該動物から単離する工程、
（ｃ）該Ｂ細胞を、第１のソート可能な標識で標識する工程；
（ｄ）第２のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工
程であって、ここで該目的の抗原は、該抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程
；
（ｅ）該抗原発現細胞と、該Ｂ細胞とを接触させる工程；および
（ｆ）複数の該Ｂ細胞から、該抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上のＢ細胞を
、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体における該第
１のソート可能な標識および該第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのＢ細
胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するＢ細胞クローンを同定する、工程
、
を包含する、方法。
（詳細な説明）
本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合し得るイムノバインダー（例えば、ｓｃＦｖ抗
体）を同定するための方法を提供する。本発明の方法は、一般に、標識した抗原発現細胞
と、標識したイムノバインダー発現細胞とを接触させる工程、および上記抗原発現細胞に
結合するイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して単離する工程を包含する
。これら方法は、内在性膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）に存在するコンフォメーショ
ンエピトープに対するイムノバインダーの迅速かつ効率的な同定のために特に有用である
。本発明はまた、本発明の方法を用いて同定された、単離されたイムノバインダーおよび
イムノバインダーをコードする核酸を提供する。
本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合し得るイムノバインダー（例えば、ｓｃＦｖ抗
体）を同定するための方法を提供する。本発明の方法は、一般に、標識した抗原発現細胞
と、標識したイムノバインダー発現細胞とを接触させる工程、および上記抗原発現細胞に
結合するイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して単離する工程を包含する
。これら方法は、内在性膜タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）に存在するコンフォメーショ
ンエピトープに対するイムノバインダーの迅速かつ効率的な同定のために特に有用である
。本発明はまた、本発明の方法を用いて同定された、単離されたイムノバインダーおよび
イムノバインダーをコードする核酸を提供する。
一局面において、本発明は、目的の細胞表面抗原に特異的に結合するイムノバインダー
を同定するための方法を提供する。上記方法は、第１のソート可能な標識に作動可能に連
結した複数のイムノバインダー発現細胞を提供する工程；第２のソート可能な標識に作動
可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで上記目的の抗原は、
上記抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程；上記抗原発現細胞と、上記イムノ
バインダー発現細胞とを接触させる工程；ならびに上記複数のイムノバインダー発現細胞
から、上記抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上のイムノバインダー発現細胞を、
セルソーター（例えば、蛍光細胞分析分離装置）を使用して分離する工程であって、ここ
で単一の細胞複合体（例えば、抗原と、Ｂ細胞レセプターとの間で形成される複合体）に
おける上記第１のおよび第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのイムノバイ
ンダー発現細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するイムノバインダーを
同定する、工程を包含する。
を同定するための方法を提供する。上記方法は、第１のソート可能な標識に作動可能に連
結した複数のイムノバインダー発現細胞を提供する工程；第２のソート可能な標識に作動
可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで上記目的の抗原は、
上記抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程；上記抗原発現細胞と、上記イムノ
バインダー発現細胞とを接触させる工程；ならびに上記複数のイムノバインダー発現細胞
から、上記抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上のイムノバインダー発現細胞を、
セルソーター（例えば、蛍光細胞分析分離装置）を使用して分離する工程であって、ここ
で単一の細胞複合体（例えば、抗原と、Ｂ細胞レセプターとの間で形成される複合体）に
おける上記第１のおよび第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのイムノバイ
ンダー発現細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するイムノバインダーを
同定する、工程を包含する。
いくつかの実施形態において、上記分離されたイムノバインダー発現細胞は、クローン
的に単離される。
的に単離される。
特定の実施形態において、上記クローン的に単離されたイムノバインダー発現細胞は、
当業者に周知の方法を使用して、クローン性増殖に供される。
当業者に周知の方法を使用して、クローン性増殖に供される。
他の実施形態において、上記イムノバインダーをコードする核酸配列は、イムノバイン
ダー発現細胞から単離される。上記核酸配列の単離は、クローン性単離の後もしくはクロ
ーン性増殖の後に起こり得る。上記イムノバインダーをコードする核酸配列の単離に適し
た方法としては、ＰＣＲ（例えば、単一細胞ＰＣＲ）が挙げられる。
ダー発現細胞から単離される。上記核酸配列の単離は、クローン性単離の後もしくはクロ
ーン性増殖の後に起こり得る。上記イムノバインダーをコードする核酸配列の単離に適し
た方法としては、ＰＣＲ（例えば、単一細胞ＰＣＲ）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本発明の方法を使用して単離されたイムノバインダー発
現細胞は、上記イムノバインダーを機能的に特徴付けるために、細胞ベースのアッセイに
供される。適切な細胞ベースのアッセイとしては、ＣＥＬＩＳＡが挙げられる。
現細胞は、上記イムノバインダーを機能的に特徴付けるために、細胞ベースのアッセイに
供される。適切な細胞ベースのアッセイとしては、ＣＥＬＩＳＡが挙げられる。
いくつかの実施形態において、上記イムノバインダーは、抗体である。このような抗体
としては、マウス抗体、ウサギ抗体、ウサギ化抗体、ニワトリ抗体、ラクダ抗体、ラクダ
化抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体が挙げられる。適切な抗体形式として
は、Ｆａｂ、Ｄａｂ、ナノボディーおよびｓｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されな
い。
としては、マウス抗体、ウサギ抗体、ウサギ化抗体、ニワトリ抗体、ラクダ抗体、ラクダ
化抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体が挙げられる。適切な抗体形式として
は、Ｆａｂ、Ｄａｂ、ナノボディーおよびｓｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されな
い。
いくつかの実施形態において、上記目的の抗原は、外因性遺伝子から発現される。他の
実施形態において、上記目的の抗原は、遺伝的に操作された抗原である。他の実施形態に
おいて、上記目的の抗原は、内在性膜タンパク質である。適切な内在性膜タンパク質とし
ては、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ（例えば、ＣＸＣＲ２））もしくはイオン
チャネルが挙げられるが、これらに限定されない。
実施形態において、上記目的の抗原は、遺伝的に操作された抗原である。他の実施形態に
おいて、上記目的の抗原は、内在性膜タンパク質である。適切な内在性膜タンパク質とし
ては、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ（例えば、ＣＸＣＲ２））もしくはイオン
チャネルが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、上記第１のもしくは第２のソート可能な標識は、蛍光標
識である。適切な蛍光標識としては、蛍光タンパク質、抗体／蛍光体結合体および蛍光性
細胞標識が挙げられるが、これらに限定されない。
識である。適切な蛍光標識としては、蛍光タンパク質、抗体／蛍光体結合体および蛍光性
細胞標識が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞（
例えば、ヒト細胞）である。いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、外因性
抗原を発現する。いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、発現ベクターでト
ランスフェクトされる。
例えば、ヒト細胞）である。いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、外因性
抗原を発現する。いくつかの実施形態において、上記抗原発現細胞は、発現ベクターでト
ランスフェクトされる。
いくつかの実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、酵母細胞もしくは哺
乳動物細胞である。適切な哺乳動物細胞としては、Ｂ細胞（例えば、ウサギＢ細胞）が挙
げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記Ｂ細胞は、免疫
化した動物（例えば、ＤＮＡワクチン接種によって免疫化した動物）から単離される。い
くつかの実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、発現ベクターから発現さ
れたイムノバインダーを含む。
乳動物細胞である。適切な哺乳動物細胞としては、Ｂ細胞（例えば、ウサギＢ細胞）が挙
げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記Ｂ細胞は、免疫
化した動物（例えば、ＤＮＡワクチン接種によって免疫化した動物）から単離される。い
くつかの実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、発現ベクターから発現さ
れたイムノバインダーを含む。
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって同定されたイムノバインダーをコ
ードする単離された核酸分子を提供する。
ードする単離された核酸分子を提供する。
別の局面において、本発明は、目的の抗原に結合し得るイムノバインダーを産生するた
めの方法を提供し、上記方法は、本発明の方法によって同定されたイムノバインダーをコ
ードする核酸配列を、上記コードされたイムノバインダーが産生されるように、発現環境
に導入する工程を包含する。
めの方法を提供し、上記方法は、本発明の方法によって同定されたイムノバインダーをコ
ードする核酸配列を、上記コードされたイムノバインダーが産生されるように、発現環境
に導入する工程を包含する。
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって産生されたイムノバインダーを提
供する。
供する。
別の局面において、本発明はまた、目的の細胞表面抗原に特異的に結合するＢ細胞クロ
ーンを同定するための方法を提供し、上記方法は、動物を、細胞表面抗原をコードするＤ
ＮＡで免疫化する工程；Ｂ細胞を、上記免疫化した動物から単離する工程；上記Ｂ細胞を
、第１のソート可能な標識で標識する工程；第２のソート可能な標識に作動可能に連結し
た複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで上記目的の抗原は、上記抗原発現
細胞の表面にディスプレイされる、工程；上記抗原発現細胞と、上記Ｂ細胞とを接触させ
る工程；ならびに上記複数のＢ細胞から、上記抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以
上のＢ細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体
における上記第１のおよび第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのＢ細胞の
結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するＢ細胞クローンを同定する、工程を包
含する。
ーンを同定するための方法を提供し、上記方法は、動物を、細胞表面抗原をコードするＤ
ＮＡで免疫化する工程；Ｂ細胞を、上記免疫化した動物から単離する工程；上記Ｂ細胞を
、第１のソート可能な標識で標識する工程；第２のソート可能な標識に作動可能に連結し
た複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで上記目的の抗原は、上記抗原発現
細胞の表面にディスプレイされる、工程；上記抗原発現細胞と、上記Ｂ細胞とを接触させ
る工程；ならびに上記複数のＢ細胞から、上記抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以
上のＢ細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体
における上記第１のおよび第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのＢ細胞の
結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するＢ細胞クローンを同定する、工程を包
含する。
（定義）
本発明が、より容易に理解され得るように、特定の用語が、以下のとおりに定義される
。さらなる定義は、詳細な説明全体に記載される。
本発明が、より容易に理解され得るように、特定の用語が、以下のとおりに定義される
。さらなる定義は、詳細な説明全体に記載される。
用語「抗体」とは、完全な抗体および任意の抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原
結合部分」、「抗原結合ポリペプチド」、もしくは「イムノバインダー」）またはその一
本鎖をいう。「抗体」とは、ジスルフィド結合で相互に連結されている少なくとも２個の
重（Ｈ）鎖および２個の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはこれらの抗原結合部分を
いう。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと省略される）および重鎖定常領
域から構成される。上記重鎖定常領域は、３個のドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３
）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと省略される）およ
び軽鎖定常領域から構成される。上記軽鎖定常領域は、１個のドメイン、ＣＬから構成さ
れる。上記ＶＨおよびＶＬ領域は、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）といわれる）
にさらに分けられ得、超可変領域の間により保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ
）といわれる）が散在している。各ＶＨおよびＶＬは、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲか
ら構成され、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと並べられる：ＦＲ１、ＣＤ
Ｒ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。上記重鎖および軽鎖の可変領域は
、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。上記抗体の定常領域は、宿主組織もしくは宿
主因子（免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成
分（Ｃｌｑ）が挙げられる）への上記免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
結合部分」、「抗原結合ポリペプチド」、もしくは「イムノバインダー」）またはその一
本鎖をいう。「抗体」とは、ジスルフィド結合で相互に連結されている少なくとも２個の
重（Ｈ）鎖および２個の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはこれらの抗原結合部分を
いう。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと省略される）および重鎖定常領
域から構成される。上記重鎖定常領域は、３個のドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３
）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと省略される）およ
び軽鎖定常領域から構成される。上記軽鎖定常領域は、１個のドメイン、ＣＬから構成さ
れる。上記ＶＨおよびＶＬ領域は、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）といわれる）
にさらに分けられ得、超可変領域の間により保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ
）といわれる）が散在している。各ＶＨおよびＶＬは、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲか
ら構成され、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと並べられる：ＦＲ１、ＣＤ
Ｒ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。上記重鎖および軽鎖の可変領域は
、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。上記抗体の定常領域は、宿主組織もしくは宿
主因子（免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成
分（Ｃｌｑ）が挙げられる）への上記免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
用語「キメラ抗体」とは、（ａ）上記抗原結合部位（可変領域）が、異なるかもしくは
変化したクラス、エフェクター機能および／もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に
新たな特性を付与する全く異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物
など）に連結されるように、上記定常領域もしくはその一部が、改変されているか、置換
されているか、もしくは交換されている抗体分子；あるいは（ｂ）上記可変領域もしくは
その一部が、異なるかもしくは変化した抗原特異性を有する可変領域で改変されているか
、置換されているかもしくは交換されている抗体分子をいう。
変化したクラス、エフェクター機能および／もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に
新たな特性を付与する全く異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物
など）に連結されるように、上記定常領域もしくはその一部が、改変されているか、置換
されているか、もしくは交換されている抗体分子；あるいは（ｂ）上記可変領域もしくは
その一部が、異なるかもしくは変化した抗原特異性を有する可変領域で改変されているか
、置換されているかもしくは交換されている抗体分子をいう。
用語、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）は、抗原（例えば、ＴＮＦ
）に特異的に結合する能力を保持している抗体の１種以上のフラグメントに言及する。あ
る抗体の抗原結合機能が全長抗体のフラグメントによって発揮され得ることが示された。
用語、抗体の「抗原結合部分」内に含まれる結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａ
ｂフラグメント（ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインから
なる一価のフラグメント）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスル
フィド結合によって連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント）；
（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント（ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる）；（ｉｖ）
Ｆｖフラグメント（抗体の単腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる）；（ｖ）ｄ
Ａｂフラグメントのような１個のドメイン（Ｗａｒｄら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３
４１：５４４−５４６）（これは、ＶＨドメインからなる）；ならびに（ｖｉ）単離され
た相補性決定領域（ＣＤＲ）または（ｖｉｉ）２個以上の単離されたＣＤＲの組み合わせ
（これは、合成リンカーによって必要に応じて結合され得る）が挙げられる。さらに、上
記Ｆｖフラグメントの２個のドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は別個の遺伝子によってコード
されるものの、それらは、上記ＶＬ領域およびＶＨ領域が、一価の分子を形成するように
対になった１個のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって
、組換え法を使用して結合され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉ
ｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（
１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３
を参照のこと）。このような一本鎖抗体はまた、用語、抗体の「抗原結合部分」内に含ま
れることが意図される。これら抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を使用し
て得られ、上記フラグメントは、インタクトな抗体と同じ様式で、有用性についてスクリ
ーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな免疫
グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって、産生され得る。抗体は、異なるアイソ
タイプ（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サ
ブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ抗体）のものであり
得る。
）に特異的に結合する能力を保持している抗体の１種以上のフラグメントに言及する。あ
る抗体の抗原結合機能が全長抗体のフラグメントによって発揮され得ることが示された。
用語、抗体の「抗原結合部分」内に含まれる結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａ
ｂフラグメント（ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインから
なる一価のフラグメント）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスル
フィド結合によって連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント）；
（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント（ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる）；（ｉｖ）
Ｆｖフラグメント（抗体の単腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる）；（ｖ）ｄ
Ａｂフラグメントのような１個のドメイン（Ｗａｒｄら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３
４１：５４４−５４６）（これは、ＶＨドメインからなる）；ならびに（ｖｉ）単離され
た相補性決定領域（ＣＤＲ）または（ｖｉｉ）２個以上の単離されたＣＤＲの組み合わせ
（これは、合成リンカーによって必要に応じて結合され得る）が挙げられる。さらに、上
記Ｆｖフラグメントの２個のドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は別個の遺伝子によってコード
されるものの、それらは、上記ＶＬ領域およびＶＨ領域が、一価の分子を形成するように
対になった１個のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって
、組換え法を使用して結合され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉ
ｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（
１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３
を参照のこと）。このような一本鎖抗体はまた、用語、抗体の「抗原結合部分」内に含ま
れることが意図される。これら抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を使用し
て得られ、上記フラグメントは、インタクトな抗体と同じ様式で、有用性についてスクリ
ーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな免疫
グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって、産生され得る。抗体は、異なるアイソ
タイプ（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サ
ブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ抗体）のものであり
得る。
用語「イムノバインダー」とは、抗体の抗原結合部位のうちの全てもしくは一部（例え
ば、上記重鎖可変ドメインおよび／もしくは軽鎖可変ドメインのうちの全てもしくは一部
）を含む分子に言及し、そのため上記イムノバインダーは、標的抗原を特異的に認識する
。イムノバインダーの非限定的例としては、全長免疫グロブリン分子およびｓｃＦｖ、な
らびに抗体フラグメント（（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、Ｃ
ＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）
２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された２個のＦａｂフラグ
メントを含む二価のフラグメント）；（ｉｉｉ）Ｆａｂ’フラグメント（これは、本質的
に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである）（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯ
ＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ ｅｄ．，３．ｓｕｐ．ｒｄ ｅｄ．１９９３）を参照のこと）；（
ｉｖ）Ｆｄフラグメント（ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる）；（ｖ）Ｆｖフ
ラグメント（抗体の単腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる）；（ｖｉ）単一ド
メイン抗体、例えば、Ｄａｂフラグメント（Ｗａｒｄら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３
４１：５４４−５４６）（これは、ＶＨドメインもしくはＶＬドメインからなる）、ラク
ダ科の動物の抗体（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４
６−４４８（１９９３）、およびＤｕｍｏｕｌｉｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ
１１：５００−５１５（２００２）を参照のこと）またはサメ抗体（例えば、サメＩｇ
−ＮＡＲｓ ナノボディー（登録商標））；ならびに（ｖｉｉ）ナノボディー（１個の可
変ドメインおよび２個の定常ドメインを含む重鎖可変領域）が挙げられるが、これらに限
定されない）が挙げられる。
ば、上記重鎖可変ドメインおよび／もしくは軽鎖可変ドメインのうちの全てもしくは一部
）を含む分子に言及し、そのため上記イムノバインダーは、標的抗原を特異的に認識する
。イムノバインダーの非限定的例としては、全長免疫グロブリン分子およびｓｃＦｖ、な
らびに抗体フラグメント（（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、Ｃ
ＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）
２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された２個のＦａｂフラグ
メントを含む二価のフラグメント）；（ｉｉｉ）Ｆａｂ’フラグメント（これは、本質的
に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである）（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯ
ＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ ｅｄ．，３．ｓｕｐ．ｒｄ ｅｄ．１９９３）を参照のこと）；（
ｉｖ）Ｆｄフラグメント（ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる）；（ｖ）Ｆｖフ
ラグメント（抗体の単腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる）；（ｖｉ）単一ド
メイン抗体、例えば、Ｄａｂフラグメント（Ｗａｒｄら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３
４１：５４４−５４６）（これは、ＶＨドメインもしくはＶＬドメインからなる）、ラク
ダ科の動物の抗体（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４
６−４４８（１９９３）、およびＤｕｍｏｕｌｉｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ
１１：５００−５１５（２００２）を参照のこと）またはサメ抗体（例えば、サメＩｇ
−ＮＡＲｓ ナノボディー（登録商標））；ならびに（ｖｉｉ）ナノボディー（１個の可
変ドメインおよび２個の定常ドメインを含む重鎖可変領域）が挙げられるが、これらに限
定されない）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「機能的特性」とは、改善（例えば、従来のポリペプ
チドと比較して）が当業者にとって望ましいおよび／もしくは有利である（例えば、上記
ポリペプチドの製造特性もしくは治療効力を改善するために）、ポリペプチド（例えば、
イムノバインダー）の特性である。一実施形態において、上記機能的特性は、改善された
安定性（例えば、熱安定性）である。別の実施形態において、上記機能的特性は、改善さ
れた溶解度（例えば、細胞条件下で）である。なお別の実施形態において、上記機能的特
性は、非凝集性である。さらに別の実施形態において、上記機能的特性は、発現における
改善（例えば、原核生物細胞における）である。なお別の実施形態において、上記機能的
特性は、封入体精製プロセス後の再折りたたみ収率における改善である。特定の実施形態
において、上記機能的特性は、抗原結合アフィニティーにおける改善ではない。
チドと比較して）が当業者にとって望ましいおよび／もしくは有利である（例えば、上記
ポリペプチドの製造特性もしくは治療効力を改善するために）、ポリペプチド（例えば、
イムノバインダー）の特性である。一実施形態において、上記機能的特性は、改善された
安定性（例えば、熱安定性）である。別の実施形態において、上記機能的特性は、改善さ
れた溶解度（例えば、細胞条件下で）である。なお別の実施形態において、上記機能的特
性は、非凝集性である。さらに別の実施形態において、上記機能的特性は、発現における
改善（例えば、原核生物細胞における）である。なお別の実施形態において、上記機能的
特性は、封入体精製プロセス後の再折りたたみ収率における改善である。特定の実施形態
において、上記機能的特性は、抗原結合アフィニティーにおける改善ではない。
用語「フレームワーク」とは、より多様なＣＤＲ領域の間に存在する抗体可変領域の当
該分野で認識された部分である。このようなフレームワーク領域は、代表的には、フレー
ムワーク１〜４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）といわれ、三次元空間におい
て、上記ＣＤＲが、抗原結合表面を形成し得るように、重鎖抗体可変領域もしくは軽鎖抗
体可変領域において見いだされる３個のＣＤＲを保持するための足場を提供する。このよ
うなフレームワークはまた、足場と言及され得る。なぜなら、それらは、より多様なＣＤ
Ｒの提示のための支持物を提供するからである。上記免疫グロブリンスーパーファミリー
の他のＣＤＲおよびフレームワーク（例えば、アンキリン反復およびフィブロネクチン）
は、抗原結合分子として使用され得る（例えば、米国特許第６，３００，０６４号、同第
６，８１５，５４０号および米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号もまた参照の
こと）。
該分野で認識された部分である。このようなフレームワーク領域は、代表的には、フレー
ムワーク１〜４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）といわれ、三次元空間におい
て、上記ＣＤＲが、抗原結合表面を形成し得るように、重鎖抗体可変領域もしくは軽鎖抗
体可変領域において見いだされる３個のＣＤＲを保持するための足場を提供する。このよ
うなフレームワークはまた、足場と言及され得る。なぜなら、それらは、より多様なＣＤ
Ｒの提示のための支持物を提供するからである。上記免疫グロブリンスーパーファミリー
の他のＣＤＲおよびフレームワーク（例えば、アンキリン反復およびフィブロネクチン）
は、抗原結合分子として使用され得る（例えば、米国特許第６，３００，０６４号、同第
６，８１５，５４０号および米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号もまた参照の
こと）。
用語「エピトープ」もしくは「抗原決定基」とは、免疫グロブリンもしくは抗体が特異
的に結合する抗原上の部位をいう。エピトープは、代表的には、特有の空間的コンフォメ
ーション中に、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個
、１２個、１３個、１４個、もしくは１５個のアミノ酸を含む。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ
Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参
照のこと。
的に結合する抗原上の部位をいう。エピトープは、代表的には、特有の空間的コンフォメ
ーション中に、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個
、１２個、１３個、１４個、もしくは１５個のアミノ酸を含む。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ
Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参
照のこと。
用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」、および「特異的に結合
する」とは、抗体が所定の抗原上のエピトープに結合することに言及する。代表的には、
上記抗体は、ほぼ１０−７Ｍ未満のアフィニティー（ＫＤ）（例えば、ほぼ１０−８Ｍ未
満、１０−９Ｍ未満もしくは１０−１０Ｍ未満もしくはさらにそれを下回る）で結合する
。
する」とは、抗体が所定の抗原上のエピトープに結合することに言及する。代表的には、
上記抗体は、ほぼ１０−７Ｍ未満のアフィニティー（ＫＤ）（例えば、ほぼ１０−８Ｍ未
満、１０−９Ｍ未満もしくは１０−１０Ｍ未満もしくはさらにそれを下回る）で結合する
。
用語「ＫＤ」とは、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数をいう。代表的には、本
発明の抗体は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ機器において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術
を使用して決定される場合、ほぼ１０−７Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）（例えば、ほぼ
１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満もしくは１０−１０Ｍ未満もしくはさらにそれを下回る
）で抗原に結合する。
発明の抗体は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ機器において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術
を使用して決定される場合、ほぼ１０−７Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）（例えば、ほぼ
１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満もしくは１０−１０Ｍ未満もしくはさらにそれを下回る
）で抗原に結合する。
本明細書で使用される場合、「同一性」とは、２個のポリペプチド、分子の間、または
２個の核酸の間の配列マッチングをいう。上記２個の比較される配列の両方における一部
が、同じ塩基もしくはアミノ酸のモノマーサブユニットによって占有されている場合（例
えば、２個のＤＮＡ分子のうちの各々におけるある位置が、アデニンによって占有される
場合、または２つのポリペプチドのうちの各々におけるある位置がリジンによって占有さ
れる場合）、それぞれの分子が、その位置において同一である。２個の配列の間の「パー
センテージ同一性」は、上記２個の配列によって共有されるマッチング位置の数を、比較
される位置の数で除算して、それを×１００する関数である。例えば、２個の配列におけ
る位置１０個のうちの６個がマッチしている場合、上記２個の配列は、６０％同一性を有
する。例示すると、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴは、５０％同一性（６個の合
計位置のうちの３個がマッチしている）を共有する。一般に、比較は、２個の配列が最大
同一性を与えるように整列される場合に行われる。このようなアラインメントは、例えば
、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の
方法を使用して提供され得、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）のよう
なコンピュータープログラムによって従来通り実行され得る。上記２個のアミノ酸配列の
間の％同一性はまた、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティー１２、およ
びギャップペナルティー４を使用するＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）
へ組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂ
ｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを使用して、決定され得る
。さらに、２個のアミノ酸配列の間の％同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリクスもし
くはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびにギャップ重み付け１６、１４、１２、
１０、８、６、もしくは４、および長さ重み付け１、２、３、４、５、もしくは６を使用
するＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）におけるＧＡ
Ｐプログラムへと組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して決定され得る
。
２個の核酸の間の配列マッチングをいう。上記２個の比較される配列の両方における一部
が、同じ塩基もしくはアミノ酸のモノマーサブユニットによって占有されている場合（例
えば、２個のＤＮＡ分子のうちの各々におけるある位置が、アデニンによって占有される
場合、または２つのポリペプチドのうちの各々におけるある位置がリジンによって占有さ
れる場合）、それぞれの分子が、その位置において同一である。２個の配列の間の「パー
センテージ同一性」は、上記２個の配列によって共有されるマッチング位置の数を、比較
される位置の数で除算して、それを×１００する関数である。例えば、２個の配列におけ
る位置１０個のうちの６個がマッチしている場合、上記２個の配列は、６０％同一性を有
する。例示すると、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴは、５０％同一性（６個の合
計位置のうちの３個がマッチしている）を共有する。一般に、比較は、２個の配列が最大
同一性を与えるように整列される場合に行われる。このようなアラインメントは、例えば
、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の
方法を使用して提供され得、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）のよう
なコンピュータープログラムによって従来通り実行され得る。上記２個のアミノ酸配列の
間の％同一性はまた、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティー１２、およ
びギャップペナルティー４を使用するＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）
へ組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂ
ｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを使用して、決定され得る
。さらに、２個のアミノ酸配列の間の％同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリクスもし
くはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびにギャップ重み付け１６、１４、１２、
１０、８、６、もしくは４、および長さ重み付け１、２、３、４、５、もしくは６を使用
するＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）におけるＧＡ
Ｐプログラムへと組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して決定され得る
。
「類似する」配列は、整列される場合、同一および類似のアミノ酸残基を共有する配列
であり、ここで類似の残基は、整列された参照配列における対応するアミノ酸残基につい
ての保存的置換である。この点において、参照配列における残基の「保存的置換」は、例
えば、類似の大きさ、形状、電荷、化学的特性（共有結合もしくは水素結合などを形成す
る能力を含む）を有する、上記対応する参照残基に物理的にもしくは機能的に類似の残基
による置換である。従って、「保存的置換で改変された」配列は、１個以上の保存的置換
が存在するという点で、参照配列もしくは野生型配列とは異なるものである。２個の配列
の間の上記「パーセンテージ類似性」は、上記２個の配列によって共有されるマッチする
残基もしくは保存的置換を含む位置の数を、比較される位置の数で除算して、それを×１
００する関数である。例えば、２個の配列における位置の１０個のうちの６個がマッチし
、１０個の位置のうちの２個が、保存的置換を含む場合、上記２個の配列は、８０％陽性
類似性を有する。
であり、ここで類似の残基は、整列された参照配列における対応するアミノ酸残基につい
ての保存的置換である。この点において、参照配列における残基の「保存的置換」は、例
えば、類似の大きさ、形状、電荷、化学的特性（共有結合もしくは水素結合などを形成す
る能力を含む）を有する、上記対応する参照残基に物理的にもしくは機能的に類似の残基
による置換である。従って、「保存的置換で改変された」配列は、１個以上の保存的置換
が存在するという点で、参照配列もしくは野生型配列とは異なるものである。２個の配列
の間の上記「パーセンテージ類似性」は、上記２個の配列によって共有されるマッチする
残基もしくは保存的置換を含む位置の数を、比較される位置の数で除算して、それを×１
００する関数である。例えば、２個の配列における位置の１０個のうちの６個がマッチし
、１０個の位置のうちの２個が、保存的置換を含む場合、上記２個の配列は、８０％陽性
類似性を有する。
本明細書で使用される場合、用語「保存的配列改変」とは、アミノ酸配列を含む抗体の
結合特徴にネガティブに影響しないかもしくは上記結合特徴を改変しないアミノ酸改変に
言及することが意図される。このような保存的配列改変としては、ヌクレオチドおよびア
ミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。例えば、改変は、当該分野で公知の標準的
技術（例えば、部位指向性変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発）によって導入され得る
。保存的アミノ酸置換としては、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置
換されているものが挙げられる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該
分野で既に定義されている。これらファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（
例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アス
パラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン
、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトフ
ァン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイ
シン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例え
ば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、
チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。従って、所
定の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換され得る。抗
原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定するための方法は、当
該分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−
１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）
：８７９−８８４（１９９９）；およびＢｕｒｋｓら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４１２−４１７（１９９７）を参照のこと）。
結合特徴にネガティブに影響しないかもしくは上記結合特徴を改変しないアミノ酸改変に
言及することが意図される。このような保存的配列改変としては、ヌクレオチドおよびア
ミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。例えば、改変は、当該分野で公知の標準的
技術（例えば、部位指向性変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発）によって導入され得る
。保存的アミノ酸置換としては、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置
換されているものが挙げられる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該
分野で既に定義されている。これらファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（
例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アス
パラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン
、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトフ
ァン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイ
シン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例え
ば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、
チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。従って、所
定の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換され得る。抗
原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定するための方法は、当
該分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−
１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）
：８７９−８８４（１９９９）；およびＢｕｒｋｓら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４１２−４１７（１９９７）を参照のこと）。
「アミノ酸コンセンサス配列」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも２個、お
よび好ましくは、より多くの整列されたアミノ酸配列のマトリクスを使用し、各位置にお
ける最も頻度の高いアミノ酸残基を決定することが可能になるようにアラインメントにお
けるギャップを可能にして、生成され得るアミノ酸配列に言及する。上記コンセンサス配
列は、最も頻繁に各位置において現れるアミノ酸を含む配列である。２個以上のアミノ酸
が単一の位置において等しく現れる事象において、上記コンセンサス配列は、それらアミ
ノ酸の両方もしくは全てを含む。
よび好ましくは、より多くの整列されたアミノ酸配列のマトリクスを使用し、各位置にお
ける最も頻度の高いアミノ酸残基を決定することが可能になるようにアラインメントにお
けるギャップを可能にして、生成され得るアミノ酸配列に言及する。上記コンセンサス配
列は、最も頻繁に各位置において現れるアミノ酸を含む配列である。２個以上のアミノ酸
が単一の位置において等しく現れる事象において、上記コンセンサス配列は、それらアミ
ノ酸の両方もしくは全てを含む。
タンパク質のアミノ酸配列は、種々のレベルで分析され得る。例えば、保存性もしくは
変動性は、上記単一の残基レベル、複数の残基レベル、ギャップを有する複数の残基など
で示され得る。残基は、同一の残基の保存を示し得るか、またはクラスレベルで保存され
得る。アミノ酸クラスの例としては、極性であるが、非荷電性のＲ基（セリン、スレオニ
ン、アスパラギンおよびグルタミン）；正に荷電したＲ基（リジン、アルギニン、および
ヒスチジン）；負に荷電したＲ基（グルタミン酸およびアスパラギン酸）；疎水性Ｒ基（
アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、
バリンおよびチロシン）；ならびに特別のアミノ酸（システイン、グリシンおよびプロリ
ン）が挙げられる。他のクラスは、当業者に公知であり、置換可能性を評価するために、
構造的決定もしくは他のデータを使用して定義され得る。その意味において、置換可能な
アミノ酸は、置換され得かつその位置において機能的な保存を維持し得る任意のアミノ酸
に言及し得る。
変動性は、上記単一の残基レベル、複数の残基レベル、ギャップを有する複数の残基など
で示され得る。残基は、同一の残基の保存を示し得るか、またはクラスレベルで保存され
得る。アミノ酸クラスの例としては、極性であるが、非荷電性のＲ基（セリン、スレオニ
ン、アスパラギンおよびグルタミン）；正に荷電したＲ基（リジン、アルギニン、および
ヒスチジン）；負に荷電したＲ基（グルタミン酸およびアスパラギン酸）；疎水性Ｒ基（
アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、
バリンおよびチロシン）；ならびに特別のアミノ酸（システイン、グリシンおよびプロリ
ン）が挙げられる。他のクラスは、当業者に公知であり、置換可能性を評価するために、
構造的決定もしくは他のデータを使用して定義され得る。その意味において、置換可能な
アミノ酸は、置換され得かつその位置において機能的な保存を維持し得る任意のアミノ酸
に言及し得る。
しかし、同じクラスのアミノ酸は、それらの生物物理学的特性によって程度が様々であ
り得ることは、認識される。例えば、特定の疎水性Ｒ基（例えば、アラニン）は、他の疎
水性Ｒ基（例えば、バリンもしくはロイシン）より親水性である（すなわち、親水性が高
いかもしくは疎水性が低い）ことが認識される。相対的な親水性もしくは疎水性は、当該
分野で認識される方法を使用して決定され得る（例えば、Ｒｏｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２２９：８３４−８３８（１９８５）およびＣｏｒｎｅｔｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．，１９５：６５９−６８５（１９８７）を参照のこと）。
り得ることは、認識される。例えば、特定の疎水性Ｒ基（例えば、アラニン）は、他の疎
水性Ｒ基（例えば、バリンもしくはロイシン）より親水性である（すなわち、親水性が高
いかもしくは疎水性が低い）ことが認識される。相対的な親水性もしくは疎水性は、当該
分野で認識される方法を使用して決定され得る（例えば、Ｒｏｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２２９：８３４−８３８（１９８５）およびＣｏｒｎｅｔｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．，１９５：６５９−６８５（１９８７）を参照のこと）。
本明細書で使用される場合、１個のアミノ酸配列（例えば、第１のＶＨ配列もしくはＶ
Ｌ配列）が、１個以上のさらなるアミノ酸配列（例えば、データベース中の１個以上のＶ
Ｈ配列もしくはＶＬ配列）とアラインされる場合、１個の配列（例えば、上記第１のＶＨ
配列もしくはＶＬ配列）におけるアミノ酸位置は、上記１個以上のさらなるアミノ酸配列
における「対応する位置」に対して比較され得る。本明細書で使用される場合、上記「対
応する位置」は、比較されている配列（複数可）が最適にアラインされる場合に、すなわ
ち、上記配列が、最高の％同一性もしくは％類似性を達成するようにアラインされる場合
に、比較されている配列における等価な位置を表す。
Ｌ配列）が、１個以上のさらなるアミノ酸配列（例えば、データベース中の１個以上のＶ
Ｈ配列もしくはＶＬ配列）とアラインされる場合、１個の配列（例えば、上記第１のＶＨ
配列もしくはＶＬ配列）におけるアミノ酸位置は、上記１個以上のさらなるアミノ酸配列
における「対応する位置」に対して比較され得る。本明細書で使用される場合、上記「対
応する位置」は、比較されている配列（複数可）が最適にアラインされる場合に、すなわ
ち、上記配列が、最高の％同一性もしくは％類似性を達成するようにアラインされる場合
に、比較されている配列における等価な位置を表す。
用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子に言及する。核酸分子は、一本鎖
であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。核酸は、別の核
酸配列と機能的な関係に配置されている場合に、「作動可能に連結」されている。例えば
、プロモーターもしくはエンハンサーは、それらがコード配列の転写に影響を及ぼす場合
に、上記配列に作動可能に連結されている。
であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。核酸は、別の核
酸配列と機能的な関係に配置されている場合に、「作動可能に連結」されている。例えば
、プロモーターもしくはエンハンサーは、それらがコード配列の転写に影響を及ぼす場合
に、上記配列に作動可能に連結されている。
用語「ベクター」とは、それが連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。ベク
ターの１つのタイプは「プラスミド」であり、プラスミドは、さらなるＤＮＡセグメント
が連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別のタイプは、ウイルスベ
クターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントは、上記ウイルスゲノムへと連結され得
る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的に複製し得る（例え
ば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性の哺乳動物ベクター）。他
のベクター（例えば、非エピソーム性の哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると
、上記宿主細胞のゲノムへと組み込まれ得、それによって、宿主ゲノムとともに複製され
る。
ターの１つのタイプは「プラスミド」であり、プラスミドは、さらなるＤＮＡセグメント
が連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別のタイプは、ウイルスベ
クターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントは、上記ウイルスゲノムへと連結され得
る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的に複製し得る（例え
ば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性の哺乳動物ベクター）。他
のベクター（例えば、非エピソーム性の哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると
、上記宿主細胞のゲノムへと組み込まれ得、それによって、宿主ゲノムとともに複製され
る。
用語「宿主細胞」とは、発現ベクターが導入される細胞をいう。宿主細胞としては、細
菌細胞、微生物細胞、植物細胞もしくは動物細胞が挙げられ得る。細菌（これは、形質転
換しやすい）としては、腸内細菌科（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉもしく
はＳａｌｍｏｎｅｌｌａの株）；Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、および
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのメンバーが挙げられる。適切な微生物
としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐ
ａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。適切な動物宿主細胞株としては、ＣＨＯ（チャイニーズ・
ハムスター卵巣株）およびＮＳ０細胞が挙げられる。
菌細胞、微生物細胞、植物細胞もしくは動物細胞が挙げられ得る。細菌（これは、形質転
換しやすい）としては、腸内細菌科（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉもしく
はＳａｌｍｏｎｅｌｌａの株）；Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、および
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのメンバーが挙げられる。適切な微生物
としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐ
ａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。適切な動物宿主細胞株としては、ＣＨＯ（チャイニーズ・
ハムスター卵巣株）およびＮＳ０細胞が挙げられる。
用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、本明細書で記載される治療的手段もしくは予防的手段をい
う。「処置」方法は、障害もしくは再発している障害の１個以上の症状を予防するため、
治癒させるため、遅延させるため、、もしくはその重篤度を軽減するためか、またはそれ
ら症状を改善するために、あるいはこのような処置（本発明の抗体）の非存在下で予測さ
れるものを超えて被験体の生存を長期化するために、このような処置（本発明の抗体）を
必要とする被験体（例えば、ＧＰＣＲ媒介性障害を有する被験体もしくはこのような障害
を最終的に獲得し得る被験体）に投与することを使用する。
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、本明細書で記載される治療的手段もしくは予防的手段をい
う。「処置」方法は、障害もしくは再発している障害の１個以上の症状を予防するため、
治癒させるため、遅延させるため、、もしくはその重篤度を軽減するためか、またはそれ
ら症状を改善するために、あるいはこのような処置（本発明の抗体）の非存在下で予測さ
れるものを超えて被験体の生存を長期化するために、このような処置（本発明の抗体）を
必要とする被験体（例えば、ＧＰＣＲ媒介性障害を有する被験体もしくはこのような障害
を最終的に獲得し得る被験体）に投与することを使用する。
用語「有効用量」もしくは「有効投与量」とは、所望の効果を達成するかもしくは少な
くとも部分的に達成するに十分な量をいう。用語「治療上有効な用量」とは、上記疾患に
既に罹患している患者において、上記疾患およびその合併症を治癒させるかもしくは少な
くとも部分的に抑えるに十分な量として定義される。この使用に有効な量は、処置されて
いる障害の重篤度および患者自身の免疫系の全般的な状態に依存する。
くとも部分的に達成するに十分な量をいう。用語「治療上有効な用量」とは、上記疾患に
既に罹患している患者において、上記疾患およびその合併症を治癒させるかもしくは少な
くとも部分的に抑えるに十分な量として定義される。この使用に有効な量は、処置されて
いる障害の重篤度および患者自身の免疫系の全般的な状態に依存する。
用語「被験体」とは、任意のヒトもしくは非ヒト動物をいう。例えば、本発明の方法お
よび組成物は、ＧＰＣＲ媒介性障害を有する被験体を処置するために使用され得る。
よび組成物は、ＧＰＣＲ媒介性障害を有する被験体を処置するために使用され得る。
用語「ウサギ（ｒａｂｂｉｔ）」とは、本明細書で使用される場合、ウサギ科（ｌｅｐ
ｏｒｉｄａｅ）のファミリーに属する動物をいう。
ｏｒｉｄａｅ）のファミリーに属する動物をいう。
用語「セルソーター」とは、検出可能な「ソート可能な」標識の存在に基づいて細胞を
分離するための任意の手段に言及する。このような手段としては、蛍光細胞分析分離装置
が挙げられるが、これらに限定されない。任意の細胞標識が、ソート可能な標識として使
用され得る。上記標識としては、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、抗体
／蛍光体結合体および蛍光性細胞標識（例えば、蛍光性カルシウムイオンイオノフォア）
が挙げられるが、これらに限定されない。
分離するための任意の手段に言及する。このような手段としては、蛍光細胞分析分離装置
が挙げられるが、これらに限定されない。任意の細胞標識が、ソート可能な標識として使
用され得る。上記標識としては、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、抗体
／蛍光体結合体および蛍光性細胞標識（例えば、蛍光性カルシウムイオンイオノフォア）
が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「細胞複合体」とは、１個以上のイムノバインダー発現細胞に結合した１個以上の
抗原発現細胞に言及し、ここで上記結合は、上記抗原発現細胞の表面上の抗原によって媒
介される。いくつかの実施形態において、イムノバインダー発現細胞への抗原発現細胞の
結合は、上記抗原発現細胞の表面上の抗原と、上記イムノバインダー発現細胞の表面上の
イムノバインダーとの間の直接相互作用からなる。
抗原発現細胞に言及し、ここで上記結合は、上記抗原発現細胞の表面上の抗原によって媒
介される。いくつかの実施形態において、イムノバインダー発現細胞への抗原発現細胞の
結合は、上記抗原発現細胞の表面上の抗原と、上記イムノバインダー発現細胞の表面上の
イムノバインダーとの間の直接相互作用からなる。
用語「クローン的に単離する」とは、細胞集団から個々の細胞クローンを単離するため
の任意の手段に言及する。適切な手段としては、各ウェルが１個を超えない細胞のみを含
むようにする、複数ウェルプレートへの細胞の限界希釈および移動が挙げられるが、これ
らに限定されない。
の任意の手段に言及する。適切な手段としては、各ウェルが１個を超えない細胞のみを含
むようにする、複数ウェルプレートへの細胞の限界希釈および移動が挙げられるが、これ
らに限定されない。
用語「イムノバインダーをコードする核酸配列を得る工程」とは、イムノバインダー発
現細胞によって発現されるイムノバインダーの核酸配列を得るための任意の手段に言及す
る。適切な手段としては、上記イムノバインダー発現細胞からの、イムノバインダーをコ
ードする核酸配列の核酸単離、ＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定が挙げられるが、これら
に限定されない。いくつかの実施形態において、イムノバインダーをコードする核酸配列
は、１個の細胞からのＰＣＲ（すなわち、単一細胞ＰＣＲ）によって増幅される。
現細胞によって発現されるイムノバインダーの核酸配列を得るための任意の手段に言及す
る。適切な手段としては、上記イムノバインダー発現細胞からの、イムノバインダーをコ
ードする核酸配列の核酸単離、ＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定が挙げられるが、これら
に限定されない。いくつかの実施形態において、イムノバインダーをコードする核酸配列
は、１個の細胞からのＰＣＲ（すなわち、単一細胞ＰＣＲ）によって増幅される。
用語「外因性抗原」とは、特定の宿主細胞において通常発現されない抗原に言及する。
例えば、外因性抗原は、上記宿主細胞とは異なる界、門、綱、目、属もしくは種に由来し
得る（例えば、酵母細胞において発現されるヒト抗原）。さらにもしくは代わりに、外因
性抗原は、同じ種に由来するが、その宿主細胞において不適切に発現され得る（例えば、
脳細胞において発現される肺特異的抗原）。「外因性抗原」はまた、正常な細胞において
通常見いだされない変異抗原（例えば、肺細胞において発現されるがん特異的変異抗原）
に言及する。
例えば、外因性抗原は、上記宿主細胞とは異なる界、門、綱、目、属もしくは種に由来し
得る（例えば、酵母細胞において発現されるヒト抗原）。さらにもしくは代わりに、外因
性抗原は、同じ種に由来するが、その宿主細胞において不適切に発現され得る（例えば、
脳細胞において発現される肺特異的抗原）。「外因性抗原」はまた、正常な細胞において
通常見いだされない変異抗原（例えば、肺細胞において発現されるがん特異的変異抗原）
に言及する。
用語「遺伝的に操作された抗原」とは、組換えＤＮＡ技術によって産生された任意の抗
原に言及し、キメラであるか、または点変異、欠失および／もしくは挿入を含む抗原を包
含する。別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は
、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明
細書に記載されるものに類似もしくは等価な方法および材料は、本発明の実施もしくは試
験において使用され得るが、適切な方法および材料が、以下に記載される。矛盾する場合
は、定義を含め、本明細書が優先する。さらに、上記材料、方法および例は、例示に過ぎ
ず、限定することを意図しない。
原に言及し、キメラであるか、または点変異、欠失および／もしくは挿入を含む抗原を包
含する。別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は
、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明
細書に記載されるものに類似もしくは等価な方法および材料は、本発明の実施もしくは試
験において使用され得るが、適切な方法および材料が、以下に記載される。矛盾する場合
は、定義を含め、本明細書が優先する。さらに、上記材料、方法および例は、例示に過ぎ
ず、限定することを意図しない。
本発明の種々の局面は、以下の小節においてさらに詳細に記載される。上記種々の実施
形態、選択および範囲は、随意に組み合わされ得ることが理解される。さらに、特定の実
施形態に依存して、選択された定義、実施形態もしくは範囲は、当てはまらない可能性が
ある。
形態、選択および範囲は、随意に組み合わされ得ることが理解される。さらに、特定の実
施形態に依存して、選択された定義、実施形態もしくは範囲は、当てはまらない可能性が
ある。
本発明は、対応する抗原を発現する細胞に付着したイムノバインダー発現細胞を同定お
よび分離するために、ＦＡＣＳを使用するスクリーニング法を提供する。特定の実施形態
において、上記イムノバインダーは、抗体である。
よび分離するために、ＦＡＣＳを使用するスクリーニング法を提供する。特定の実施形態
において、上記イムノバインダーは、抗体である。
（抗原発現）
抗体調製のための標的抗原は、可溶性であるか、もしくは細胞表面上に発現されるか、
もしくは形質膜に結合されている任意のタンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、炭水化物
、脂質、および他の分子であり得る。抗原は、天然抗原であっても合成抗原であってもよ
い。好ましくは、標的抗原は、タンパク質もしくはペプチドである。標的抗原の非限定的
例としては、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１
、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ−
１、ＣＩＣ−２、ＣＩＣ−４、ＣＩＣ−５、ＣＩＣ−７、ＣＩＣ−Ｋａ、ＣＩＣ−Ｋｂ、
Ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎｓ、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡレセプター、グリシンレセプター、
ＡＢＣ輸送体、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．
５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン−１−
ホスフェートレセプター（Ｓ１Ｐ１Ｒ）、ＮＭＤＡチャネルなどが挙げられる。一実施形
態において、上記標的抗原は、膜貫通タンパク質である。別の実施形態において、上記標
的抗原は、マルチスパン（ｍｕｌｔｉｓｐａｎ）膜貫通タンパク質（例えば、Ｇタンパク
質共役レセプター（ＧＰＣＲ）、イオンチャネルなど）である。
抗体調製のための標的抗原は、可溶性であるか、もしくは細胞表面上に発現されるか、
もしくは形質膜に結合されている任意のタンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、炭水化物
、脂質、および他の分子であり得る。抗原は、天然抗原であっても合成抗原であってもよ
い。好ましくは、標的抗原は、タンパク質もしくはペプチドである。標的抗原の非限定的
例としては、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１
、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ−
１、ＣＩＣ−２、ＣＩＣ−４、ＣＩＣ−５、ＣＩＣ−７、ＣＩＣ−Ｋａ、ＣＩＣ−Ｋｂ、
Ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎｓ、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡレセプター、グリシンレセプター、
ＡＢＣ輸送体、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．
５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン−１−
ホスフェートレセプター（Ｓ１Ｐ１Ｒ）、ＮＭＤＡチャネルなどが挙げられる。一実施形
態において、上記標的抗原は、膜貫通タンパク質である。別の実施形態において、上記標
的抗原は、マルチスパン（ｍｕｌｔｉｓｐａｎ）膜貫通タンパク質（例えば、Ｇタンパク
質共役レセプター（ＧＰＣＲ）、イオンチャネルなど）である。
ＧＰＣＲのファミリーは、少なくとも２５０個のメンバーを有する（Ｓｔｒａｄｅｒら
ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９：７４５−７５４，１９９５；Ｓｔｒａｄｅｒら Ａｎｎｕ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３：１０１−３２，１９９４）。ヒト遺伝子のうちの１％は
、ＧＰＣＲをコードし得ると推測されてきた。ＧＰＣＲは、広く種々のリガンド（光子、
低分子の生体アミン（すなわち、エピネフリンおよびヒスタミン）、ペプチド（すなわち
、ＩＬ−８）から、大きな糖タンパク質ホルモン（すなわち、副甲状腺ホルモン）に及ぶ
）に結合する。リガンド結合の際に、ＧＰＣＲは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質
（Ｇタンパク質）を活性化することによって細胞内シグナル伝達経路を調節する。興味深
いことに、ＧＰＣＲは、ヒトサイトメガロウイルスおよびヘルペスウイルスにおいて機能
的ホモログを有し、このことは、ＧＰＣＲが、ウイルス病因の展開の間に獲得され得たこ
とを示唆する（Ｓｔｒａｄｅｒら，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９：７４５−７５４，１９９５；
Ａｒｖａｎｉｔａｋｉｓら Ｎａｔｕｒｅ，３８５：３４７−３５０，１９９７；Ｍｕｒ
ｐｈｙ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：５９３−６３３，１９９４）。
ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９：７４５−７５４，１９９５；Ｓｔｒａｄｅｒら Ａｎｎｕ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３：１０１−３２，１９９４）。ヒト遺伝子のうちの１％は
、ＧＰＣＲをコードし得ると推測されてきた。ＧＰＣＲは、広く種々のリガンド（光子、
低分子の生体アミン（すなわち、エピネフリンおよびヒスタミン）、ペプチド（すなわち
、ＩＬ−８）から、大きな糖タンパク質ホルモン（すなわち、副甲状腺ホルモン）に及ぶ
）に結合する。リガンド結合の際に、ＧＰＣＲは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質
（Ｇタンパク質）を活性化することによって細胞内シグナル伝達経路を調節する。興味深
いことに、ＧＰＣＲは、ヒトサイトメガロウイルスおよびヘルペスウイルスにおいて機能
的ホモログを有し、このことは、ＧＰＣＲが、ウイルス病因の展開の間に獲得され得たこ
とを示唆する（Ｓｔｒａｄｅｒら，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９：７４５−７５４，１９９５；
Ａｒｖａｎｉｔａｋｉｓら Ｎａｔｕｒｅ，３８５：３４７−３５０，１９９７；Ｍｕｒ
ｐｈｙ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：５９３−６３３，１９９４）。
今までに知られている大部分のＧＰＣＲの独特の特徴は、疎水性アミノ酸残基の７個の
クラスタが、１次構造に位置し、その各領域において細胞膜を貫通する（横切る）ことで
ある。上記ドメインは、３個の細胞内ループ、３個の細胞外ループ、ならびにアミノ末端
ドメインおよびカルボキシル末端ドメインによって接続された膜貫通α−ヘリックスを表
すと考えられている（Ｋ．Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９，７３９−
４５（２０００））。大部分のＧＰＣＲは、機能的タンパク質構造を安定化させると考え
られるジスルフィド結合を形成する最初の２個の細胞外ループの各々に、１個の保存され
たシステイン残基を有する。上記７個の膜貫通領域は、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４
、ＴＭ５、ＴＭ６、およびＴＭ７と称される。上記で詳述されるこれら構造は、Ｇタンパ
ク質共役レセプタータンパク質の中で共通しており、上記タンパク質が膜を貫通する上記
領域（膜を横切る領域もしくは膜貫通領域）に対応するアミノ酸配列、および上記膜を横
切る領域付近のアミノ酸配列は、しばしば、上記レセプターの中で高度に保存されている
ことは、周知である。従って、ＧＰＣＲにおける高い相同性の程度に起因して、新規ＧＰ
ＣＲの同定、ならびにこのような新規メンバーの細胞内部分および細胞外部分両方の同定
は、当業者によって容易に達成される。例示であるが、Ｗａｔｓｏｎ ａｎｄ Ａｒｋｉ
ｎｓｔａｌｌ（１９９４）の書籍（本明細書に参考として援用される）は、５０個より多
くのＧＰＣＲの配列を提供する。上記書籍は、各配列について、上記膜貫通ドメインの各
々を含む正確な残基をさらに記載する。
クラスタが、１次構造に位置し、その各領域において細胞膜を貫通する（横切る）ことで
ある。上記ドメインは、３個の細胞内ループ、３個の細胞外ループ、ならびにアミノ末端
ドメインおよびカルボキシル末端ドメインによって接続された膜貫通α−ヘリックスを表
すと考えられている（Ｋ．Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９，７３９−
４５（２０００））。大部分のＧＰＣＲは、機能的タンパク質構造を安定化させると考え
られるジスルフィド結合を形成する最初の２個の細胞外ループの各々に、１個の保存され
たシステイン残基を有する。上記７個の膜貫通領域は、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４
、ＴＭ５、ＴＭ６、およびＴＭ７と称される。上記で詳述されるこれら構造は、Ｇタンパ
ク質共役レセプタータンパク質の中で共通しており、上記タンパク質が膜を貫通する上記
領域（膜を横切る領域もしくは膜貫通領域）に対応するアミノ酸配列、および上記膜を横
切る領域付近のアミノ酸配列は、しばしば、上記レセプターの中で高度に保存されている
ことは、周知である。従って、ＧＰＣＲにおける高い相同性の程度に起因して、新規ＧＰ
ＣＲの同定、ならびにこのような新規メンバーの細胞内部分および細胞外部分両方の同定
は、当業者によって容易に達成される。例示であるが、Ｗａｔｓｏｎ ａｎｄ Ａｒｋｉ
ｎｓｔａｌｌ（１９９４）の書籍（本明細書に参考として援用される）は、５０個より多
くのＧＰＣＲの配列を提供する。上記書籍は、各配列について、上記膜貫通ドメインの各
々を含む正確な残基をさらに記載する。
Ｇタンパク質共役レセプターの低分子リガンドの結合部位は、細胞外表面付近に位置し
かついくつかのＧタンパク質共役レセプター膜貫通ドメインによって形成される親水性ソ
ケット（このソケットは、上記Ｇタンパク質共役レセプターの疎水性残基が取り囲んでい
る）を含むと考えられている。各Ｇタンパク質共役レセプター膜貫通ヘリックスの親水性
側が、内側へ向き、極性リガンド結合部位を形成すると仮定される。ＴＭ３は、リガンド
結合部位（例えば、ＴＭ３アスパラギン酸残基を含む）を有するとして、いくつかのＧタ
ンパク質共役レセプターに影響を与えてきた。さらに、ＴＭ５ セリン、ＴＭ６アスパラ
ギンおよびＴＭ６もしくはＴＭ７フェニルアラニンもしくはチロシンはまた、リガンド結
合に関わっている。ペプチドホルモンレセプターおよび他のより大きなリガンド、例えば
、糖タンパク質（ＬＨ、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＴＳＨ）を有するレセプター、ならびにレセプ
ターのＣａ２＋／グルタミン酸／ＧＡＢＡクラスのリガンド結合部位は、上記細胞外ドメ
インおよびループにあるようである。
かついくつかのＧタンパク質共役レセプター膜貫通ドメインによって形成される親水性ソ
ケット（このソケットは、上記Ｇタンパク質共役レセプターの疎水性残基が取り囲んでい
る）を含むと考えられている。各Ｇタンパク質共役レセプター膜貫通ヘリックスの親水性
側が、内側へ向き、極性リガンド結合部位を形成すると仮定される。ＴＭ３は、リガンド
結合部位（例えば、ＴＭ３アスパラギン酸残基を含む）を有するとして、いくつかのＧタ
ンパク質共役レセプターに影響を与えてきた。さらに、ＴＭ５ セリン、ＴＭ６アスパラ
ギンおよびＴＭ６もしくはＴＭ７フェニルアラニンもしくはチロシンはまた、リガンド結
合に関わっている。ペプチドホルモンレセプターおよび他のより大きなリガンド、例えば
、糖タンパク質（ＬＨ、ＦＳＨ、ｈＣＧ、ＴＳＨ）を有するレセプター、ならびにレセプ
ターのＣａ２＋／グルタミン酸／ＧＡＢＡクラスのリガンド結合部位は、上記細胞外ドメ
インおよびループにあるようである。
レセプターを不活性から活性へと切り替えるための重要な事象は、７個の膜貫通の横切
るヘリックスを有する上記ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス３（ＴＭ３）および６（ＴＭ６）
のリガンド誘導性コンフォメーション変化である（Ｕ．Ｇｅｔｈｅｒ， ａｎｄ Ｂ．Ｋ
．Ｋｏｌｂｉｌｋａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１７９７９−１７９８２（１９
９８））。これらヘリックスの動きは、続いて、上記レセプターの細胞内ループのコンフ
ォメーションを変化させて、会合ヘテロトリマーＧタンパク質の活性化を促進する。変異
誘発研究（Ｓ．Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ， Ｊ．Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ， Ｍ．Ａ．Ｋｊｅｌｓ
ｂｅｒｇ， Ｍ．Ｇ．Ｃａｒｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６７，１６３３−１６３９（１９９２）；Ｅ．Ｋｏｓｔｅｎｉｓ， Ｂ．
Ｒ．Ｃｏｎｋｌｉｎ ａｎｄ Ｊ．Ｗｅｓｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６，１４８
７−１４９５（１９９７）；Ｍ．Ａ．Ｋｊｅｌｓｂｅｒｇ， Ｓ．Ｃｏｔｅｅｃｈｉａ，
Ｊ．Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ， Ｍ．Ｇ．Ｃａｒｏｎ， ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｌｅｆｋｏｗｉ
ｔｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１４３０−１４３３（１９９２））は、第３の
細胞内ループ（ｉ３）が、レセプターとＧタンパク質との間の共役の大部分を媒介するこ
とを示した。ミニ遺伝子として発現されるＩ３ループはまた、Ｇｑ結合についてアドレナ
リン作動性レセプターと直接的に競合することが示され（Ｌ．Ｍ．Ｌｕｔｔｒｅｌｌ，
Ｊ．Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ， Ｓ．Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ， Ｈ．Ｋｅｎｄａｌ ａｎｄ Ｒ
．Ｊ．Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９，１４５３−１４５７（１９９３）
）、または、無細胞条件下で可溶性ペプチドとしてＧタンパク質を活性化し得る（Ｔ．Ｏ
ｋａｍｏｔｏら，Ｃｅｌｌ ６７，７２３−７３０（１９９１））。
るヘリックスを有する上記ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス３（ＴＭ３）および６（ＴＭ６）
のリガンド誘導性コンフォメーション変化である（Ｕ．Ｇｅｔｈｅｒ， ａｎｄ Ｂ．Ｋ
．Ｋｏｌｂｉｌｋａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１７９７９−１７９８２（１９
９８））。これらヘリックスの動きは、続いて、上記レセプターの細胞内ループのコンフ
ォメーションを変化させて、会合ヘテロトリマーＧタンパク質の活性化を促進する。変異
誘発研究（Ｓ．Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ， Ｊ．Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ， Ｍ．Ａ．Ｋｊｅｌｓ
ｂｅｒｇ， Ｍ．Ｇ．Ｃａｒｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６７，１６３３−１６３９（１９９２）；Ｅ．Ｋｏｓｔｅｎｉｓ， Ｂ．
Ｒ．Ｃｏｎｋｌｉｎ ａｎｄ Ｊ．Ｗｅｓｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６，１４８
７−１４９５（１９９７）；Ｍ．Ａ．Ｋｊｅｌｓｂｅｒｇ， Ｓ．Ｃｏｔｅｅｃｈｉａ，
Ｊ．Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ， Ｍ．Ｇ．Ｃａｒｏｎ， ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｌｅｆｋｏｗｉ
ｔｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１４３０−１４３３（１９９２））は、第３の
細胞内ループ（ｉ３）が、レセプターとＧタンパク質との間の共役の大部分を媒介するこ
とを示した。ミニ遺伝子として発現されるＩ３ループはまた、Ｇｑ結合についてアドレナ
リン作動性レセプターと直接的に競合することが示され（Ｌ．Ｍ．Ｌｕｔｔｒｅｌｌ，
Ｊ．Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ， Ｓ．Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ， Ｈ．Ｋｅｎｄａｌ ａｎｄ Ｒ
．Ｊ．Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９，１４５３−１４５７（１９９３）
）、または、無細胞条件下で可溶性ペプチドとしてＧタンパク質を活性化し得る（Ｔ．Ｏ
ｋａｍｏｔｏら，Ｃｅｌｌ ６７，７２３−７３０（１９９１））。
上記目的の抗原は、標的細胞（ときおり、抗原発現細胞ともいわれる）における内因性
供給源のものであり得る。あるいは、外因性分子は、細胞へと導入されて、上記抗原を発
現し得る。細胞への上記抗原の導入は、当業者に公知の任意の方法によって行われ得る。
一実施形態において、上記抗原をポリペプチドとしてコードするポリヌクレオチドは、イ
ンビトロでベクターに挿入され得る。上記ベクターは、発現のために、標的細胞にさらに
導入され得る。上記ポリヌクレオチドは、上記標的抗原のｃＤＮＡ配列、ＤＮＡ配列、も
しくは当該分野で公知の他の配列を含み得る。上記ベクターは、プラスミド、コスミド、
リポソーム、または当該分野で公知の他の天然のもしくは人工のベクターであり得る。上
記導入は、トランスフェクション、形質転換、感染、物質の直接マイクロインジェクショ
ン、微粒子銃粒子送達（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、
エレクトロポレーション、もしくは当該分野で公知の他の方法のプロセスであり得る。上
記抗原を発現する標的細胞は、当該分野で公知の任意の細胞（例えば、動物から直接採取
された細胞（例えば、がん細胞、非がん細胞、初代細胞など）、または分子操作された細
胞（例えば、培養細胞、例えば、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ
２９３細胞など）、不死化細胞、トランスフェクトされた／感染させられた細胞、Ｔ細胞
などが挙げられる）であり得る。あるいは、上記標的細胞は、非動物供給源（例えば、細
菌、昆虫など）に由来し得る。一実施形態において、上記標的抗原を発現する細胞は、酵
母細胞、好ましくは、酵母スフェロプラスト（ｓｐｈｅｒｏｂｌａｓｔ）である。あるい
は、上記標的「細胞」は、人工細胞様体（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ
ｂｏｄｙ）もしくは構造（例えば、リポソーム、単層膜体など）であり得る。上記標的細
胞もしくは細胞様体における上記抗原の発現は、一過性であり得（すなわち、上記発現は
、比較的短期間（例えば、数分から数日）の後に弱まるかもしくは止まる）、または安定
であり得る（すなわち、上記発現は、比較的長期間（例えば、数日後もしくは細胞の数世
代後）にわたって比較的安定なレベルを維持する）。１つの好ましい実施形態において、
上記抗原は、上記標的細胞の形質膜の細胞外表面上に発現される。別の好ましい実施形態
において、上記抗原は、内在性膜抗原もしくはマルチスパン膜抗原である。形質膜上のそ
の位置に達するために、上記抗原は、これら位置で直接発現され得るか、または上記標的
細胞の細胞質におけるその発現後に、これら位置へとその位置が変えられ得る。この位置
移動は、上記標的細胞の天然のプロセスであり得、あるいは、上記抗原発現の前もしくは
その後に、その位置移動をもたらす、例えば、シグナル／タグ分子（例えば、ゴルジソー
ティングシグナル、特定の膜結合分子に対する抗体など）を結合させること、グラフト（
ｇｒａｆｔ）を固定すること（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）（例えば、グリコシルホスファチジ
ルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー）、もしくは上記抗原に化学架橋をすること、上記抗
原を変異させること、または当該分野で公知の他の方法による、操作されたプロセスであ
り得る。
供給源のものであり得る。あるいは、外因性分子は、細胞へと導入されて、上記抗原を発
現し得る。細胞への上記抗原の導入は、当業者に公知の任意の方法によって行われ得る。
一実施形態において、上記抗原をポリペプチドとしてコードするポリヌクレオチドは、イ
ンビトロでベクターに挿入され得る。上記ベクターは、発現のために、標的細胞にさらに
導入され得る。上記ポリヌクレオチドは、上記標的抗原のｃＤＮＡ配列、ＤＮＡ配列、も
しくは当該分野で公知の他の配列を含み得る。上記ベクターは、プラスミド、コスミド、
リポソーム、または当該分野で公知の他の天然のもしくは人工のベクターであり得る。上
記導入は、トランスフェクション、形質転換、感染、物質の直接マイクロインジェクショ
ン、微粒子銃粒子送達（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、
エレクトロポレーション、もしくは当該分野で公知の他の方法のプロセスであり得る。上
記抗原を発現する標的細胞は、当該分野で公知の任意の細胞（例えば、動物から直接採取
された細胞（例えば、がん細胞、非がん細胞、初代細胞など）、または分子操作された細
胞（例えば、培養細胞、例えば、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ
２９３細胞など）、不死化細胞、トランスフェクトされた／感染させられた細胞、Ｔ細胞
などが挙げられる）であり得る。あるいは、上記標的細胞は、非動物供給源（例えば、細
菌、昆虫など）に由来し得る。一実施形態において、上記標的抗原を発現する細胞は、酵
母細胞、好ましくは、酵母スフェロプラスト（ｓｐｈｅｒｏｂｌａｓｔ）である。あるい
は、上記標的「細胞」は、人工細胞様体（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ
ｂｏｄｙ）もしくは構造（例えば、リポソーム、単層膜体など）であり得る。上記標的細
胞もしくは細胞様体における上記抗原の発現は、一過性であり得（すなわち、上記発現は
、比較的短期間（例えば、数分から数日）の後に弱まるかもしくは止まる）、または安定
であり得る（すなわち、上記発現は、比較的長期間（例えば、数日後もしくは細胞の数世
代後）にわたって比較的安定なレベルを維持する）。１つの好ましい実施形態において、
上記抗原は、上記標的細胞の形質膜の細胞外表面上に発現される。別の好ましい実施形態
において、上記抗原は、内在性膜抗原もしくはマルチスパン膜抗原である。形質膜上のそ
の位置に達するために、上記抗原は、これら位置で直接発現され得るか、または上記標的
細胞の細胞質におけるその発現後に、これら位置へとその位置が変えられ得る。この位置
移動は、上記標的細胞の天然のプロセスであり得、あるいは、上記抗原発現の前もしくは
その後に、その位置移動をもたらす、例えば、シグナル／タグ分子（例えば、ゴルジソー
ティングシグナル、特定の膜結合分子に対する抗体など）を結合させること、グラフト（
ｇｒａｆｔ）を固定すること（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）（例えば、グリコシルホスファチジ
ルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー）、もしくは上記抗原に化学架橋をすること、上記抗
原を変異させること、または当該分野で公知の他の方法による、操作されたプロセスであ
り得る。
（イムノバインダー発現細胞および免疫化）
一実施形態において、本明細書に記載される方法によって選択されるべきイムノバイン
ダー発現細胞は、哺乳動物Ｂ細胞、好ましくは、ウサギＢ細胞である。
一実施形態において、本明細書に記載される方法によって選択されるべきイムノバイン
ダー発現細胞は、哺乳動物Ｂ細胞、好ましくは、ウサギＢ細胞である。
好ましい実施形態において、上記Ｂ細胞は、目的の標的で免疫化した動物に由来する。
上記動物の免疫化は、当業者に公知の任意の方法によって実施され得る。代表的には、上
記Ｂ細胞は、免疫化した動物のリンパ器官（例えば、脾臓もしくはリンパ節）から単離さ
れる。
上記動物の免疫化は、当業者に公知の任意の方法によって実施され得る。代表的には、上
記Ｂ細胞は、免疫化した動物のリンパ器官（例えば、脾臓もしくはリンパ節）から単離さ
れる。
好ましい一実施形態において、上記目的の抗原の免疫化は、ＤＮＡ免疫化／ワクチン接
種によって行われる。あるいは、上記標的抗原を発現する細胞は、免疫化のために、動物
（例えば、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなど）へと注
射される。この免疫化工程のために好ましい動物は、ウサギである。ＤＮＡ免疫化／ワク
チン接種は、急激な免疫応答を誘導し、ならびに、標的抗原の天然の発現（通常、天然の
発現のみ）を可能にする。このことは、組換えタンパク質の発現および取り扱いを要しな
いので、このプロセスは、組換えタンパク質を用いた従来の免疫化より効率的かつ費用効
果的である。さらに、より重要なことには、上記インビボで発現された抗原は、その天然
の状況における標的タンパク質と同じ二次構造を有し、同じ翻訳後修飾を有しさえし得る
。このことは、上記標的抗原に対する調製された抗体による認識の正確さを改善する。例
示的ＤＮＡ免疫化は、カナダ国特許出願ＣＡ２３５００７８およびＷＯ０４／０８７２１
６に示される。具体的には、上記標的抗原として上記ポリペプチドをコードするＤＮＡは
、遺伝子銃法を通じて動物に直接導入され、上記動物においてポリペプチドの発現を生じ
、その発現は、上記ポリペプチドに対する抗体の形成を引き起こす。より強い抗体の形成
を達成するために、いわゆる遺伝子アジュバントを、上記ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａと同時に適用する。これら遺伝子アジュバントは、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳ
Ｆ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０）を発現しかつ実験動物の体液性免疫応答を刺激するプラ
スミドである。好ましい一実施形態において、上記標的抗原に対する抗体は、Ｂ細胞レセ
プター（ＢＣＲ）としてＢ細胞の細胞表面上に発現される。別の好ましい実施形態におい
て、上記抗体発現細胞は、いかなるＩｇＭもその表面に存在しないことによって特徴付け
られ、通常のＢ細胞とは区別される記憶Ｂ細胞である。
種によって行われる。あるいは、上記標的抗原を発現する細胞は、免疫化のために、動物
（例えば、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなど）へと注
射される。この免疫化工程のために好ましい動物は、ウサギである。ＤＮＡ免疫化／ワク
チン接種は、急激な免疫応答を誘導し、ならびに、標的抗原の天然の発現（通常、天然の
発現のみ）を可能にする。このことは、組換えタンパク質の発現および取り扱いを要しな
いので、このプロセスは、組換えタンパク質を用いた従来の免疫化より効率的かつ費用効
果的である。さらに、より重要なことには、上記インビボで発現された抗原は、その天然
の状況における標的タンパク質と同じ二次構造を有し、同じ翻訳後修飾を有しさえし得る
。このことは、上記標的抗原に対する調製された抗体による認識の正確さを改善する。例
示的ＤＮＡ免疫化は、カナダ国特許出願ＣＡ２３５００７８およびＷＯ０４／０８７２１
６に示される。具体的には、上記標的抗原として上記ポリペプチドをコードするＤＮＡは
、遺伝子銃法を通じて動物に直接導入され、上記動物においてポリペプチドの発現を生じ
、その発現は、上記ポリペプチドに対する抗体の形成を引き起こす。より強い抗体の形成
を達成するために、いわゆる遺伝子アジュバントを、上記ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａと同時に適用する。これら遺伝子アジュバントは、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳ
Ｆ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０）を発現しかつ実験動物の体液性免疫応答を刺激するプラ
スミドである。好ましい一実施形態において、上記標的抗原に対する抗体は、Ｂ細胞レセ
プター（ＢＣＲ）としてＢ細胞の細胞表面上に発現される。別の好ましい実施形態におい
て、上記抗体発現細胞は、いかなるＩｇＭもその表面に存在しないことによって特徴付け
られ、通常のＢ細胞とは区別される記憶Ｂ細胞である。
一実施形態において、上記イムノバインダー発現細胞は、酵母細胞であり、上記イムノ
バインダーは、好ましくは、抗体フラグメント、より好ましくは、ｓｃＦｖである。
バインダーは、好ましくは、抗体フラグメント、より好ましくは、ｓｃＦｖである。
（蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用するスクリーニング）
免疫化工程の後、上記標的抗原に特異的に結合するＢ細胞上の膜結合抗体は、非特異的
抗体を発現する他の細胞から区別される必要がある。好ましい一実施形態において、上記
抗原−抗体結合を通じて、その形質膜上に上記特異的抗体を発現するＢ細胞は、上記抗原
を発現する標的細胞に付着する。もう一つの好ましい実施形態において、他のもしくはよ
り多くの相互作用（例えば、同じもしくは異なる抗原−抗体相互作用、化学的架橋、リガ
ンド−レセプター相互作用など）は、Ｂ細胞と標的細胞との間で起こり得る。上記Ｂ細胞
は、種々の抗体を発現するＢ細胞のプール中に、または上記免疫動物から直接、免疫化し
た／免役状態にしていない動物のプールから、もしくはインビトロ操作プロセス（例えば
、Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝的組み換え技術により異なる抗体を発現するＢ細胞のライブラリー）か
ら集められる他の免疫細胞と組み合わせて存在し得る。
免疫化工程の後、上記標的抗原に特異的に結合するＢ細胞上の膜結合抗体は、非特異的
抗体を発現する他の細胞から区別される必要がある。好ましい一実施形態において、上記
抗原−抗体結合を通じて、その形質膜上に上記特異的抗体を発現するＢ細胞は、上記抗原
を発現する標的細胞に付着する。もう一つの好ましい実施形態において、他のもしくはよ
り多くの相互作用（例えば、同じもしくは異なる抗原−抗体相互作用、化学的架橋、リガ
ンド−レセプター相互作用など）は、Ｂ細胞と標的細胞との間で起こり得る。上記Ｂ細胞
は、種々の抗体を発現するＢ細胞のプール中に、または上記免疫動物から直接、免疫化し
た／免役状態にしていない動物のプールから、もしくはインビトロ操作プロセス（例えば
、Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝的組み換え技術により異なる抗体を発現するＢ細胞のライブラリー）か
ら集められる他の免疫細胞と組み合わせて存在し得る。
上記標的抗原に対して特異的な抗体を発現するＢ細胞の分離は、当該分野で公知の任意
の方法で行われ得る。これらとしては、抗原上でのパニング、限界希釈、アフィニティー
精製、または上記発現された抗体もしくは上記抗体生成Ｂ細胞の特徴を利用する他の方法
が挙げられるが、これらに限定されない。
の方法で行われ得る。これらとしては、抗原上でのパニング、限界希釈、アフィニティー
精製、または上記発現された抗体もしくは上記抗体生成Ｂ細胞の特徴を利用する他の方法
が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい一実施形態において、上記抗原発現細胞は、上記付着したＢ細胞の将来的な検
出および／もしくは単離のために有用なタグで標識される。上記タグは、架橋剤（ｃｒｏ
ｓｓｌｉｎｋｅｒ）、抗原／抗体、低分子（例えば、グルタチオン（ＧＳＨ）、ビオチン
／アビジンなど）、磁性粒子、蛍光タグなどであり得る。好ましい一実施形態において、
上記抗原発現細胞は、蛍光タンパク質／ペプチドで標識される。別の実施形態において、
上記抗体生成Ｂ細胞はまた、タグ、好ましくは、異なる蛍光タンパク質／ペプチドで標識
される。なお別の実施形態において、上記抗原発現細胞に付着した上記Ｂ細胞は、Ｂ細胞
上で標識された上記蛍光タンパク質／ペプチドからの蛍光放出によって検出され得る。さ
らに別の実施形態において、上記Ｂ細胞および上記付着した抗原発現細胞は、それらの上
で標識された２種の異なる蛍光タンパク質／ペプチドからの蛍光放出によって検出され得
る。好ましい一実施形態において、上記標的抗原に対して特異的な抗体を発現するＢ細胞
は、それらの上でおよび付着したＡＰＣ上で標識された蛍光タンパク質／ペプチドから、
両方の蛍光の放出によって、検出され得、かつ他の抗体生成Ｂ細胞とはさらに分離され得
る。好ましくは、この検出および分離は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）技術
によって行われ得る。
出および／もしくは単離のために有用なタグで標識される。上記タグは、架橋剤（ｃｒｏ
ｓｓｌｉｎｋｅｒ）、抗原／抗体、低分子（例えば、グルタチオン（ＧＳＨ）、ビオチン
／アビジンなど）、磁性粒子、蛍光タグなどであり得る。好ましい一実施形態において、
上記抗原発現細胞は、蛍光タンパク質／ペプチドで標識される。別の実施形態において、
上記抗体生成Ｂ細胞はまた、タグ、好ましくは、異なる蛍光タンパク質／ペプチドで標識
される。なお別の実施形態において、上記抗原発現細胞に付着した上記Ｂ細胞は、Ｂ細胞
上で標識された上記蛍光タンパク質／ペプチドからの蛍光放出によって検出され得る。さ
らに別の実施形態において、上記Ｂ細胞および上記付着した抗原発現細胞は、それらの上
で標識された２種の異なる蛍光タンパク質／ペプチドからの蛍光放出によって検出され得
る。好ましい一実施形態において、上記標的抗原に対して特異的な抗体を発現するＢ細胞
は、それらの上でおよび付着したＡＰＣ上で標識された蛍光タンパク質／ペプチドから、
両方の蛍光の放出によって、検出され得、かつ他の抗体生成Ｂ細胞とはさらに分離され得
る。好ましくは、この検出および分離は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）技術
によって行われ得る。
頭字語ＦＡＣＳは、商標登録されておりかつＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒ
ａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）が所有している。本明細書で使用される場合、用語Ｆ
ＡＣＳは、フローサイトメトリーベースのセルソーティングの任意の形態を表すものとす
る。
ａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）が所有している。本明細書で使用される場合、用語Ｆ
ＡＣＳは、フローサイトメトリーベースのセルソーティングの任意の形態を表すものとす
る。
蛍光活性化セルソーティングは、フローサイトメトリーの特別なタイプである。それは
、各細胞の特異的光散乱および蛍光特徴に基づいて、２個以上の容器の中に、一度に１細
胞、生物学的細胞の不均一な混合物をソートするための方法を提供する。それは、個々の
細胞からの蛍光シグナルの迅速で、客観的かつ定量的な記録、ならびに特に目的の細胞の
物理的分離を提供するので、有用な科学機器である。
、各細胞の特異的光散乱および蛍光特徴に基づいて、２個以上の容器の中に、一度に１細
胞、生物学的細胞の不均一な混合物をソートするための方法を提供する。それは、個々の
細胞からの蛍光シグナルの迅速で、客観的かつ定量的な記録、ならびに特に目的の細胞の
物理的分離を提供するので、有用な科学機器である。
代表的ＦＡＣＳシステムにおいて、細胞懸濁物は、狭く、急激に流れる液体ストリーム
の中心に運ばれる。その流れは、それらの直径に対して細胞間で大まかな分離がされるよ
うに、調整される。振動機構は、細胞のストリームを、個々の液滴へとばらばらにする。
上記システムは、１個より多くの細胞が液滴中に存在する可能性を低くするように調節さ
れる。上記ストリームが液滴へとばらばらになる直前に、上記流れは、各細胞の目的の蛍
光特徴が測定される蛍光測定ステーションを通る。電荷をかける環（ｅｌｅｃｔｒｉｃａ
ｌ ｃｈａｒｇｉｎｇ ｒｉｎｇ）が、上記ストリームが液滴へとばらばらになるちょう
どその地点に配置される。電荷は、直前の蛍光強度測定値に基づいて上記環にかけられ、
その逆の電荷が、上記ストリームからばらばらになるにつれて、上記液滴上に捕捉される
。上記荷電した液滴は、次いで、それらの電荷に基づいて、容器の中へと液滴をそらす静
電的偏向システムを通って落ちる。いくつかのシステムにおいて、上記電荷は、上記スト
リームに直接印加され、ばらばらになっている液滴は、上記ストリームと同じ符号の電荷
を保持する。次いで、上記ストリームは、上記液滴がばらばらになった後に、中性に戻さ
れる。
の中心に運ばれる。その流れは、それらの直径に対して細胞間で大まかな分離がされるよ
うに、調整される。振動機構は、細胞のストリームを、個々の液滴へとばらばらにする。
上記システムは、１個より多くの細胞が液滴中に存在する可能性を低くするように調節さ
れる。上記ストリームが液滴へとばらばらになる直前に、上記流れは、各細胞の目的の蛍
光特徴が測定される蛍光測定ステーションを通る。電荷をかける環（ｅｌｅｃｔｒｉｃａ
ｌ ｃｈａｒｇｉｎｇ ｒｉｎｇ）が、上記ストリームが液滴へとばらばらになるちょう
どその地点に配置される。電荷は、直前の蛍光強度測定値に基づいて上記環にかけられ、
その逆の電荷が、上記ストリームからばらばらになるにつれて、上記液滴上に捕捉される
。上記荷電した液滴は、次いで、それらの電荷に基づいて、容器の中へと液滴をそらす静
電的偏向システムを通って落ちる。いくつかのシステムにおいて、上記電荷は、上記スト
リームに直接印加され、ばらばらになっている液滴は、上記ストリームと同じ符号の電荷
を保持する。次いで、上記ストリームは、上記液滴がばらばらになった後に、中性に戻さ
れる。
ＦＡＣＳ技術のための蛍光標識は、蛍光色素を励起するために使用されるランプもしく
はレーザー、および利用可能な検出器に依存する。最も一般に利用可能な、シングルレー
ザー機械のレーザーは、青色アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）である。この種のレーザー
で機能できる蛍光標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１）緑色
蛍光（通常、ＦＬ１で表される）：ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、ＧＦＰ
、ＣＦＳＥ、ＣＦＤＡ−ＳＥ、およびＤｙＬｉｇｈｔ ４８８；２）橙色オレンジ蛍光（
通常、ＦＬ２）：ＰＥ、およびＰＩ；３）赤色蛍光（通常、ＦＬ３）：ＰｅｒＣＰ、ＰＥ
−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、ＰＥ−Ｃｙ５（ＴＲＩ−ＣＯＬＯＲ）、およびＰＥ
−Ｃｙ５．５；ならびに４）赤外蛍光（通常、ＦＬ４；いくつかのＦＡＣＳ機械において
）：ＰＥ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、およびＰＥ−Ｃｙ７。他のレーザーおよび
それらの対応する蛍光標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１）
赤色ダイオードレーザー（６３５ｎｍ）：アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＰＣ−Ｃｙ
７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ｃｙ５、およびＤｒａｑ−５；ならびに２）紫色
レーザー（４０５ｎｍ）：Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ、Ａｍｉｎｅ Ａｑｕａ、Ｐａ
ｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、
およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５。
はレーザー、および利用可能な検出器に依存する。最も一般に利用可能な、シングルレー
ザー機械のレーザーは、青色アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）である。この種のレーザー
で機能できる蛍光標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１）緑色
蛍光（通常、ＦＬ１で表される）：ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、ＧＦＰ
、ＣＦＳＥ、ＣＦＤＡ−ＳＥ、およびＤｙＬｉｇｈｔ ４８８；２）橙色オレンジ蛍光（
通常、ＦＬ２）：ＰＥ、およびＰＩ；３）赤色蛍光（通常、ＦＬ３）：ＰｅｒＣＰ、ＰＥ
−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、ＰＥ−Ｃｙ５（ＴＲＩ−ＣＯＬＯＲ）、およびＰＥ
−Ｃｙ５．５；ならびに４）赤外蛍光（通常、ＦＬ４；いくつかのＦＡＣＳ機械において
）：ＰＥ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、およびＰＥ−Ｃｙ７。他のレーザーおよび
それらの対応する蛍光標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１）
赤色ダイオードレーザー（６３５ｎｍ）：アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＰＣ−Ｃｙ
７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ｃｙ５、およびＤｒａｑ−５；ならびに２）紫色
レーザー（４０５ｎｍ）：Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ、Ａｍｉｎｅ Ａｑｕａ、Ｐａ
ｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、
およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５。
好ましい実施形態において、Ｂ細胞は、標識された抗ＩｇＧ抗体および抗ＩｇＭ抗体で
染色され、上記抗ＩｇＧ抗体でのみ陽性染色されるが、抗ＩｇＭ抗体で染色されない記憶
Ｂ細胞を優先的に選択する。ＩｇＧは、一般に、ＩｇＭより高いアフィニティーを有する
；表面にＩｇＧを発現するが、ＩｇＭを発現しない（これは、記憶Ｂ細胞に特徴的である
）陽性Ｂ細胞は、それによって選択される。上記目的のために、マルチカラー染色が、好
ましくは使用され、ここでＩｇＧに対して特異的な抗体およびＩｇＭに対して特異的な抗
体が、別々に、例えば、ＡＰＣおよびＦＩＴＣでそれぞれ標識される。好ましくは、上記
標的抗原および／もしくは上記標的抗原を発現する標的細胞はまた、標識される。一実施
形態において、上記標的抗原は、上記標的抗原を発現する細胞を、細胞内蛍光色素で染色
することによって、間接的に染色される。
染色され、上記抗ＩｇＧ抗体でのみ陽性染色されるが、抗ＩｇＭ抗体で染色されない記憶
Ｂ細胞を優先的に選択する。ＩｇＧは、一般に、ＩｇＭより高いアフィニティーを有する
；表面にＩｇＧを発現するが、ＩｇＭを発現しない（これは、記憶Ｂ細胞に特徴的である
）陽性Ｂ細胞は、それによって選択される。上記目的のために、マルチカラー染色が、好
ましくは使用され、ここでＩｇＧに対して特異的な抗体およびＩｇＭに対して特異的な抗
体が、別々に、例えば、ＡＰＣおよびＦＩＴＣでそれぞれ標識される。好ましくは、上記
標的抗原および／もしくは上記標的抗原を発現する標的細胞はまた、標識される。一実施
形態において、上記標的抗原は、上記標的抗原を発現する細胞を、細胞内蛍光色素で染色
することによって、間接的に染色される。
本発明は、Ｂ細胞プールをスクリーニングするためにＦＡＣＳを使用する方法を提供し
、ここでＢ細胞は、目的の標的抗原に特異的に結合する抗体を生成するＢ細胞を同定しか
つさらに単離するために、上記標的抗原を発現する細胞に付着し得る。好ましくは、上記
Ｂ細胞は、蛍光標識で標識され、上記標的抗原を発現する細胞は、異なる蛍光標識で別個
に標識される。これら標識は、細胞内、細胞外、もしくは形質膜中に組み込まれるかのい
ずれかで存在し得る。免疫化および抗体の生成後に、全てのＢ細胞は一緒にプールされ、
ＦＡＣＳシステムを通り抜ける。上記標的抗原に対して特異的な抗体を生成するＢ細胞の
みが、上記抗原発現細胞に付着する。それらの付着は、他の個々の細胞の間での大まかな
分離と比較して、上記流れ中のこれら２種の細胞の間の距離を短くし、このことは、それ
らが走査レーザービームを同時に通る間に検出可能な「バイカラー事象」をもたらす。従
って、上記目的の抗体を生成するＢ細胞は、同定され得、次いで、他の非特異的Ｂ細胞と
は異なる収集チューブへとソートされ得る。
、ここでＢ細胞は、目的の標的抗原に特異的に結合する抗体を生成するＢ細胞を同定しか
つさらに単離するために、上記標的抗原を発現する細胞に付着し得る。好ましくは、上記
Ｂ細胞は、蛍光標識で標識され、上記標的抗原を発現する細胞は、異なる蛍光標識で別個
に標識される。これら標識は、細胞内、細胞外、もしくは形質膜中に組み込まれるかのい
ずれかで存在し得る。免疫化および抗体の生成後に、全てのＢ細胞は一緒にプールされ、
ＦＡＣＳシステムを通り抜ける。上記標的抗原に対して特異的な抗体を生成するＢ細胞の
みが、上記抗原発現細胞に付着する。それらの付着は、他の個々の細胞の間での大まかな
分離と比較して、上記流れ中のこれら２種の細胞の間の距離を短くし、このことは、それ
らが走査レーザービームを同時に通る間に検出可能な「バイカラー事象」をもたらす。従
って、上記目的の抗体を生成するＢ細胞は、同定され得、次いで、他の非特異的Ｂ細胞と
は異なる収集チューブへとソートされ得る。
別の好ましい実施形態において、上記Ｂ細胞と上記対応する抗原発現細胞との間の相互
作用が、細胞特徴の特定の改変（例えば、脱分極、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
など）をもたらす場合、より多くの蛍光標識が、このような改変を可能にする細胞へと添
加され得る。従って、Ｂ細胞および接触した抗原発現細胞は、「トリカラー」事象もしく
は同時にさらに３色より多くの色を含む事象を表す。
作用が、細胞特徴の特定の改変（例えば、脱分極、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
など）をもたらす場合、より多くの蛍光標識が、このような改変を可能にする細胞へと添
加され得る。従って、Ｂ細胞および接触した抗原発現細胞は、「トリカラー」事象もしく
は同時にさらに３色より多くの色を含む事象を表す。
あるいは、付着したＢ細胞の同定およびソーティングは、蛍光標識の存在を必要としな
い。一実施形態において、上記細胞−細胞相互作用は、いずれか細胞においても機能的変
化をもたらす。別の実施形態において、これら機能的変化は、上記標的抗原に特異的に結
合する抗体を生成するＢ細胞を同定しさらに分離するために使用され得る。例えば、上記
細胞−細胞相互作用は、何れの細胞においてもレセプターシグナル伝達を機能的にブロッ
クもしくは活性化し得、このことは、上記ＦＡＣＳシステムによって検出可能な細胞変化
（例えば、Ｃａ２＋流出変化など）をもたらす。従って、これら検出可能な機能的変化を
モニターすることによって、目的のＢ細胞はまた、同定されかつ分離され得る。レセプタ
ーシグナル伝達を機能的にブロックするかもしくは活性化する１つの特定の実施形態は、
Ｂ細胞を、ＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役レセプター）を機能的に発現する細胞とインキュ
ベートすることである。ＧＰＣＲを介してシグナル伝達するアゴニストは、小胞体（ｅｎ
ｄｏｐｌａｓｍａｔｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）からＧＰＤＲ媒介性Ｃａ２＋流出を誘導
するために、上記混合物に添加され得る。Ｂ細胞上に提示される抗体がアゴニストシグナ
ル伝達を機能的にブロックする場合、Ｃａ２＋流出もまた、この細胞−細胞相互作用によ
って結果的にブロックされる。Ｃａ２＋流出は、例えば、フローサイトメトリーによって
定量的に測定され得る。従って、Ｃａ２＋流出の増大もしくは低下のいずれかを示すＢ細
胞／標的細胞集団（ｃｏｎｇｌｏｍｅｒａｔｅ）のみが、ソートされる。
い。一実施形態において、上記細胞−細胞相互作用は、いずれか細胞においても機能的変
化をもたらす。別の実施形態において、これら機能的変化は、上記標的抗原に特異的に結
合する抗体を生成するＢ細胞を同定しさらに分離するために使用され得る。例えば、上記
細胞−細胞相互作用は、何れの細胞においてもレセプターシグナル伝達を機能的にブロッ
クもしくは活性化し得、このことは、上記ＦＡＣＳシステムによって検出可能な細胞変化
（例えば、Ｃａ２＋流出変化など）をもたらす。従って、これら検出可能な機能的変化を
モニターすることによって、目的のＢ細胞はまた、同定されかつ分離され得る。レセプタ
ーシグナル伝達を機能的にブロックするかもしくは活性化する１つの特定の実施形態は、
Ｂ細胞を、ＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役レセプター）を機能的に発現する細胞とインキュ
ベートすることである。ＧＰＣＲを介してシグナル伝達するアゴニストは、小胞体（ｅｎ
ｄｏｐｌａｓｍａｔｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）からＧＰＤＲ媒介性Ｃａ２＋流出を誘導
するために、上記混合物に添加され得る。Ｂ細胞上に提示される抗体がアゴニストシグナ
ル伝達を機能的にブロックする場合、Ｃａ２＋流出もまた、この細胞−細胞相互作用によ
って結果的にブロックされる。Ｃａ２＋流出は、例えば、フローサイトメトリーによって
定量的に測定され得る。従って、Ｃａ２＋流出の増大もしくは低下のいずれかを示すＢ細
胞／標的細胞集団（ｃｏｎｇｌｏｍｅｒａｔｅ）のみが、ソートされる。
（単離されたＢ細胞によって生成される抗体に対するアフィニティーアッセイ）
特定の実施形態において、Ｂ細胞は、抗体が培養培地へと分泌されるように、適切な条
件下で培養される。生成された抗体は、例えば、モノクローナル抗体である。上記培養は
、ヘルパー細胞株（例えば、胸腺腫ヘルパー細胞株（例えば、ＥＬ４−Ｂ５（Ｚｕｂｌｅ
ｒら，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３４（６）：３６６２−３６６８を参照のこ
と））の使用を伴い得る。
特定の実施形態において、Ｂ細胞は、抗体が培養培地へと分泌されるように、適切な条
件下で培養される。生成された抗体は、例えば、モノクローナル抗体である。上記培養は
、ヘルパー細胞株（例えば、胸腺腫ヘルパー細胞株（例えば、ＥＬ４−Ｂ５（Ｚｕｂｌｅ
ｒら，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３４（６）：３６６２−３６６８を参照のこ
と））の使用を伴い得る。
必要に応じて、さらなるアフィニティーアッセイが、上記単離されたＢ細胞によって生
成される抗体の選択性およびリガンドと競合する能力を評価するために、さらなる処理の
前に行われ得る。これらアッセイとしては、細胞ベースのアッセイ（例えば、細胞ＥＬＩ
ＳＡ（ＣＥＬＩＳＡ）（これは、細胞全体がコーティングに使用される改変ＥＬＩＳＡプ
ロセスである）が挙げられるが、これに限定されない。ＣＡ２３５００７８において議論
されるように、ＣＥＬＩＳＡは、実施例において以下に記載されるとおりに行われ得る。
上記確認工程は、上記標的に特異的に結合することについて、例えば、上記標的タンパク
質以外の細胞表面に発現されるタンパク質に対して指向される抗体を排除することについ
て、生成された抗体を試験するために、行われ得る。
成される抗体の選択性およびリガンドと競合する能力を評価するために、さらなる処理の
前に行われ得る。これらアッセイとしては、細胞ベースのアッセイ（例えば、細胞ＥＬＩ
ＳＡ（ＣＥＬＩＳＡ）（これは、細胞全体がコーティングに使用される改変ＥＬＩＳＡプ
ロセスである）が挙げられるが、これに限定されない。ＣＡ２３５００７８において議論
されるように、ＣＥＬＩＳＡは、実施例において以下に記載されるとおりに行われ得る。
上記確認工程は、上記標的に特異的に結合することについて、例えば、上記標的タンパク
質以外の細胞表面に発現されるタンパク質に対して指向される抗体を排除することについ
て、生成された抗体を試験するために、行われ得る。
あるいは、上記同定されかつ単離された目的のＢ細胞は、抗体アフィニティーについて
直接試験され得、上記Ｂ細胞は、処理の前に、付着した抗原発現細胞から分離させられ得
る。
直接試験され得、上記Ｂ細胞は、処理の前に、付着した抗原発現細胞から分離させられ得
る。
（抗体生成のための、単離されたＢ細胞のさらなる処理）
上記同定されかつ単離された（必要に応じて、アフィニティーアッセイ（例えば、ＣＥ
ＬＩＳＡ）によって試験された）Ｂ細胞は、目的のイムノバインダーを生成するためにさ
らに処理され得る。伝統的なハイブリドーマ技術が、例えば、使用され得る。これは、上
記イムノバインダーを精製し、それらのアミノ酸配列および／もしくは核酸配列を解明す
るような工程を伴い得る。
上記同定されかつ単離された（必要に応じて、アフィニティーアッセイ（例えば、ＣＥ
ＬＩＳＡ）によって試験された）Ｂ細胞は、目的のイムノバインダーを生成するためにさ
らに処理され得る。伝統的なハイブリドーマ技術が、例えば、使用され得る。これは、上
記イムノバインダーを精製し、それらのアミノ酸配列および／もしくは核酸配列を解明す
るような工程を伴い得る。
あるいは、上記バインダーの特徴付けは、それらのｓｃＦｖ形式において行われる。こ
の目的のために、ソートされたＢ細胞上に発現されるバインダーのＣＤＲ配列が、培養さ
れ、ソートされた細胞から、もしくは単一細胞から直接のいずれかで、ＲＴ−ＰＣＲによ
って回収される。一方のオリゴヌクレオチドプールが上記ＣＤＲをコードし、第２のプー
ルが適切なｓｃＦｖ足場のフレームワーク領域をコードする部分的に重複するオリゴヌク
レオチドの２個のプールの組み合わせは、１工程のＰＣＲ手順で、ヒト化ｓｃＦｖの精製
を可能にする。ＨＴ配列決定、クローニングおよび生成は、細胞培養上清中の分泌ＩｇＧ
を特徴付ける代わりに、上記生成されたヒト化ｓｃＦｖの性能に基づいて、クローン選択
を行うことを可能にする。任意のウサギ抗体由来のＣＤＲを受容するに適したｓｃＦｖ足
場が、同定されかつ特徴付けられてきた（「ウサギ化」ヒトＦＷもしくはウサギアクセプ
ターＲａｂＴｏｒ；ＷＯ０９／１５５７２６を参照のこと（これは、その全体が本明細書
に参考として援用される））。いくつかの場合において、上記ウサギ特異的ＣＤＲ間ジス
ルフィド結合をさらに含む種々のＣＤＲの概念の証明が、示された。
の目的のために、ソートされたＢ細胞上に発現されるバインダーのＣＤＲ配列が、培養さ
れ、ソートされた細胞から、もしくは単一細胞から直接のいずれかで、ＲＴ−ＰＣＲによ
って回収される。一方のオリゴヌクレオチドプールが上記ＣＤＲをコードし、第２のプー
ルが適切なｓｃＦｖ足場のフレームワーク領域をコードする部分的に重複するオリゴヌク
レオチドの２個のプールの組み合わせは、１工程のＰＣＲ手順で、ヒト化ｓｃＦｖの精製
を可能にする。ＨＴ配列決定、クローニングおよび生成は、細胞培養上清中の分泌ＩｇＧ
を特徴付ける代わりに、上記生成されたヒト化ｓｃＦｖの性能に基づいて、クローン選択
を行うことを可能にする。任意のウサギ抗体由来のＣＤＲを受容するに適したｓｃＦｖ足
場が、同定されかつ特徴付けられてきた（「ウサギ化」ヒトＦＷもしくはウサギアクセプ
ターＲａｂＴｏｒ；ＷＯ０９／１５５７２６を参照のこと（これは、その全体が本明細書
に参考として援用される））。いくつかの場合において、上記ウサギ特異的ＣＤＲ間ジス
ルフィド結合をさらに含む種々のＣＤＲの概念の証明が、示された。
ウサギ化抗体を作製するための一般的説明は、以下に記載される。
（イムノバインダーのグラフト化（ｇｒａｆｔｉｎｇ））
本発明の方法を用いて同定されたイムノバインダーの抗原結合領域もしくはＣＤＲは、
アクセプター抗体フレームワークへとグラフト化され得る。このようなグラフト化は、例
えば、イムノバインダーの免疫原性を低下させ得るか、またはその機能的特性を改善し得
る（例えば、熱力学的安定性を改善し得る）。
本発明の方法を用いて同定されたイムノバインダーの抗原結合領域もしくはＣＤＲは、
アクセプター抗体フレームワークへとグラフト化され得る。このようなグラフト化は、例
えば、イムノバインダーの免疫原性を低下させ得るか、またはその機能的特性を改善し得
る（例えば、熱力学的安定性を改善し得る）。
ヒトアクセプターフレームワークへＣＤＲをグラフト化するための一般的方法は、米国
特許第５，２２５，５３９号（これは、その全体が本明細書に参考として援用される）に
おいてＷｉｎｔｅｒによって開示された。
特許第５，２２５，５３９号（これは、その全体が本明細書に参考として援用される）に
おいてＷｉｎｔｅｒによって開示された。
ウサギモノクローナル抗体由来のＣＤＲをグラフト化するための具体的なストラテジー
は、米国仮特許出願第６１／０７５，６９７号および同第６１／１５５，０４１号（これ
らは、その全体が本明細書に参考として援用される）に開示されている。これらストラテ
ジーは、Ｗｉｎｔｅｒのものに関連するが、上記アクセプター抗体フレームワークが、全
てのヒトもしくは非ヒトのドナー抗体についての普遍的アクセプターとして特に適してい
るという点で、異なっている。特に、上記ヒト一本鎖フレームワークＦＷ１．４（配列番
号１（ＷＯ０３／０９７６９７においてａ４３と称される）および配列番号２（ＷＯ０３
／０９７６９７）においてＫＩ２７と称される）の組み合わせ）は、ウサギ抗体の抗原結
合部位と非常に適合していることが示された。従って、上記ＦＷ１．４は、ウサギループ
のグラフト化に由来する安定なヒト化ｓｃＦｖ抗体フラグメントを構築するための適切な
足場を表す。
は、米国仮特許出願第６１／０７５，６９７号および同第６１／１５５，０４１号（これ
らは、その全体が本明細書に参考として援用される）に開示されている。これらストラテ
ジーは、Ｗｉｎｔｅｒのものに関連するが、上記アクセプター抗体フレームワークが、全
てのヒトもしくは非ヒトのドナー抗体についての普遍的アクセプターとして特に適してい
るという点で、異なっている。特に、上記ヒト一本鎖フレームワークＦＷ１．４（配列番
号１（ＷＯ０３／０９７６９７においてａ４３と称される）および配列番号２（ＷＯ０３
／０９７６９７）においてＫＩ２７と称される）の組み合わせ）は、ウサギ抗体の抗原結
合部位と非常に適合していることが示された。従って、上記ＦＷ１．４は、ウサギループ
のグラフト化に由来する安定なヒト化ｓｃＦｖ抗体フラグメントを構築するための適切な
足場を表す。
さらに、ＦＷ１．４が、ＦＷ１．４の重鎖中の５個もしくは６個の残基位置を置換する
ことによって、および／またはＦＷ１．４の軽鎖中の１個の位置を置換することによって
最適化され得ることが、見いだされた。それによって、上記ＶＨ中の非常に種々のウサギ
ＣＤＲのループコンフォメーションが、上記ドナーフレームワークの配列とはほとんど無
関係に、完全に維持され得ることが、驚くべきことに見いだされた。ＦＷ１．４の重鎖中
の５個もしくは６個の残基およびＦＷ１．４の軽鎖中の１個の位置は、ウサギ抗体におい
て保存されている。上記重鎖中の５個もしくは６個の位置のコンセンサス残基、ならびに
上記軽鎖中の１個の位置は、ウサギレパートリーから導き出され、ヒトアクセプターフレ
ームワークの配列へ導入された。結果として、改変フレームワーク１．４（そこでは、ｒ
ＦＷ１．４もといわれる）は、実質的に任意のウサギＣＤＲと適合性である。ウサギ野生
型一本鎖とは対照的に、異なるウサギＣＤＲを含むｒＦＷ１．４は、十分に発現され、本
来のドナーウサギ抗体のアフィニティーをほとんど完全に保持する。
ことによって、および／またはＦＷ１．４の軽鎖中の１個の位置を置換することによって
最適化され得ることが、見いだされた。それによって、上記ＶＨ中の非常に種々のウサギ
ＣＤＲのループコンフォメーションが、上記ドナーフレームワークの配列とはほとんど無
関係に、完全に維持され得ることが、驚くべきことに見いだされた。ＦＷ１．４の重鎖中
の５個もしくは６個の残基およびＦＷ１．４の軽鎖中の１個の位置は、ウサギ抗体におい
て保存されている。上記重鎖中の５個もしくは６個の位置のコンセンサス残基、ならびに
上記軽鎖中の１個の位置は、ウサギレパートリーから導き出され、ヒトアクセプターフレ
ームワークの配列へ導入された。結果として、改変フレームワーク１．４（そこでは、ｒ
ＦＷ１．４もといわれる）は、実質的に任意のウサギＣＤＲと適合性である。ウサギ野生
型一本鎖とは対照的に、異なるウサギＣＤＲを含むｒＦＷ１．４は、十分に発現され、本
来のドナーウサギ抗体のアフィニティーをほとんど完全に保持する。
よって、例示的イムノバインダーアクセプターフレームワークは、以下を含む：
（ｉ）配列番号１に対して少なくとも７０％同一性、好ましくは、少なくとも７５％、
８０％、８５％、９０％、より好ましくは、少なくとも９５％同一性を有する可変重鎖フ
レームワーク；および／または
（ｉｉ）配列番号２に対して少なくとも７０％同一性、好ましくは、少なくとも７５％
、８０％、８５％、９０％、より好ましくは、少なくとも９５％同一性を有する可変軽鎖
フレームワーク。
（ｉ）配列番号１に対して少なくとも７０％同一性、好ましくは、少なくとも７５％、
８０％、８５％、９０％、より好ましくは、少なくとも９５％同一性を有する可変重鎖フ
レームワーク；および／または
（ｉｉ）配列番号２に対して少なくとも７０％同一性、好ましくは、少なくとも７５％
、８０％、８５％、９０％、より好ましくは、少なくとも９５％同一性を有する可変軽鎖
フレームワーク。
好ましい実施形態において、上記可変軽鎖は、８７位（ＡＨｏ番号付け）にスレオニン
（Ｔ）を含む。
（Ｔ）を含む。
好ましい実施形態において、上記イムノバインダーアクセプターフレームワークは、以
下を含む：
（ｉ）配列番号１、配列番号４および配列番号６からなる群より選択される可変重鎖フ
レームワーク；および／または
（ｉｉ）配列番号２もしくは配列番号９の可変軽鎖フレームワーク。
下を含む：
（ｉ）配列番号１、配列番号４および配列番号６からなる群より選択される可変重鎖フ
レームワーク；および／または
（ｉｉ）配列番号２もしくは配列番号９の可変軽鎖フレームワーク。
好ましい実施形態において、上記可変重鎖フレームワークは、リンカーを介して可変軽
鎖フレームワークに連結される。上記リンカーは、任意の適切なリンカー（例えば、配列
ＧＧＧＧＳ（配列番号１０）の１〜４回反復、好ましくは、（ＧＧＧＧＳ）４ペプチド（
配列番号８）を含むリンカー、またはＡｌｆｔｈａｎら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ
ｎｇ．８：７２５−７３１に開示されるリンカー）であり得る。
鎖フレームワークに連結される。上記リンカーは、任意の適切なリンカー（例えば、配列
ＧＧＧＧＳ（配列番号１０）の１〜４回反復、好ましくは、（ＧＧＧＧＳ）４ペプチド（
配列番号８）を含むリンカー、またはＡｌｆｔｈａｎら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ
ｎｇ．８：７２５−７３１に開示されるリンカー）であり得る。
最も好ましい実施形態において、上記イムノバインダーアクセプターフレームワークは
、配列番号３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好まし
くは、少なくとも９５％の同一性を有する配列である。より好ましくは、上記イムノバイ
ンダーアクセプターフレームワークは、配列番号３を含むか、または配列番号３である。
、配列番号３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好まし
くは、少なくとも９５％の同一性を有する配列である。より好ましくは、上記イムノバイ
ンダーアクセプターフレームワークは、配列番号３を含むか、または配列番号３である。
別の好ましい実施形態において、上記イムノバインダーアクセプターフレームワークは
、配列番号５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好まし
くは、少なくとも９５％の同一性を有する配列である。より好ましくは、上記イムノバイ
ンダーアクセプターフレームワークは、配列番号５を含むか、または配列番号５である。
、配列番号５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好まし
くは、少なくとも９５％の同一性を有する配列である。より好ましくは、上記イムノバイ
ンダーアクセプターフレームワークは、配列番号５を含むか、または配列番号５である。
別の好ましい実施形態において、上記イムノバインダーアクセプターフレームワークは
、配列番号７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好まし
くは少なくとも９５％の同一性を有する配列である。より好ましくは、上記イムノバイン
ダーアクセプターフレームワークは、配列番号７を含むか、または配列番号７である。
、配列番号７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好まし
くは少なくとも９５％の同一性を有する配列である。より好ましくは、上記イムノバイン
ダーアクセプターフレームワークは、配列番号７を含むか、または配列番号７である。
さらに、配列番号１の例示的な可変重鎖フレームワークが、使用され得、これは、一般
に、ウサギイムノバインダーに由来するＣＤＲのコンフォメーションを支持する１個以上
のアミノ酸残基をさらに含む。特に、上記残基は、２４Ｈ、２５Ｈ、５６Ｈ、８２Ｈ、８
４Ｈ、８９Ｈおよび１０８Ｈ（ＡＨｏ番号付け）からなる群より選択される１個以上のア
ミノ酸位置に存在する。これら位置は、ＣＤＲコンフォメーションに影響を与えることが
証明されているので、ドナーＣＤＲに適合させるための変異が企図される。好ましくは、
上記１個以上の残基は、２４位のスレオニン（Ｔ）、２５位のバリン（Ｖ）、５６位のグ
リシンもしくはアラニン（Ｇ／Ａ）、８２位のリジン（Ｋ）、８４位のスレオニン（Ｔ）
、８９位のバリン（Ｖ）および１０８位のアルギニン（Ｒ）（ＡＨｏ番号付け）からなる
群より選択される。
に、ウサギイムノバインダーに由来するＣＤＲのコンフォメーションを支持する１個以上
のアミノ酸残基をさらに含む。特に、上記残基は、２４Ｈ、２５Ｈ、５６Ｈ、８２Ｈ、８
４Ｈ、８９Ｈおよび１０８Ｈ（ＡＨｏ番号付け）からなる群より選択される１個以上のア
ミノ酸位置に存在する。これら位置は、ＣＤＲコンフォメーションに影響を与えることが
証明されているので、ドナーＣＤＲに適合させるための変異が企図される。好ましくは、
上記１個以上の残基は、２４位のスレオニン（Ｔ）、２５位のバリン（Ｖ）、５６位のグ
リシンもしくはアラニン（Ｇ／Ａ）、８２位のリジン（Ｋ）、８４位のスレオニン（Ｔ）
、８９位のバリン（Ｖ）および１０８位のアルギニン（Ｒ）（ＡＨｏ番号付け）からなる
群より選択される。
好ましい実施形態において、上記可変重鎖フレームワークは、配列番号４もしくは配列
番号６を含むか、または配列番号４もしくは配列番号６である。両方の可変重鎖フレーム
ワークは、例えば、任意の適切な軽鎖フレームワークと組み合わされ得る。
番号６を含むか、または配列番号４もしくは配列番号６である。両方の可変重鎖フレーム
ワークは、例えば、任意の適切な軽鎖フレームワークと組み合わされ得る。
上記で開示される配列は、以下である（Ｘ残基は、ＣＤＲ挿入部位である）：
従って、Ｗｉｎｔｅｒの一般的方法とは異なって、本発明のヒト化方法に使用される上
記フレームワーク配列は、必ずしも、上記ドナーＣＤＲが由来する非ヒト（例えば、ウサ
ギ）抗体の配列に対して最大の配列類似性を示すフレームワーク配列ではない。さらに、
ＣＤＲコンフォメーションを支持するための上記ドナー配列からグラフト化するフレーム
ワーク残基は、必要とされない。
上記アクセプター抗体フレームワークはまた、米国仮特許出願第６１／０７５，６９２
号（これは、その全体が本明細書に参考として援用される）に記載されている安定性増強
変異のうちの１個以上を含み得る。上記重鎖フレームワークにおける例示的な溶解度増強
置換は、１２位、１０３位および１４４位（ＡＨｏ番号付け）で見いだされる。より好ま
しくは、上記重鎖フレームワークは、（ａ）１２位にセリン（Ｓ）；（ｂ）１０３位にセ
リン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）、および／または（ｃ）１４４位にセリン（Ｓ）も
しくはスレオニン（Ｔ）を含む。さらに、安定性増強アミノ酸は、上記可変軽鎖フレーム
ワーク（ＡＨｏ番号付け）の１位、３位、４位、１０位、４７位、５７位、９１位、およ
び１０３位の１個以上の位置で存在し得る。より好ましくは、上記可変軽鎖フレームワー
クは、１位にグルタミン酸（Ｅ）、３位にバリン（Ｖ）、４位にロイシン（Ｌ）、１０位
にセリン（Ｓ）；４７位にアルギニン（Ｒ）、５７位にセリン（Ｓ）、９１位にフェニル
アラニン（Ｆ）および／もしくは１０３位にバリン（Ｖ）を含む。
号（これは、その全体が本明細書に参考として援用される）に記載されている安定性増強
変異のうちの１個以上を含み得る。上記重鎖フレームワークにおける例示的な溶解度増強
置換は、１２位、１０３位および１４４位（ＡＨｏ番号付け）で見いだされる。より好ま
しくは、上記重鎖フレームワークは、（ａ）１２位にセリン（Ｓ）；（ｂ）１０３位にセ
リン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）、および／または（ｃ）１４４位にセリン（Ｓ）も
しくはスレオニン（Ｔ）を含む。さらに、安定性増強アミノ酸は、上記可変軽鎖フレーム
ワーク（ＡＨｏ番号付け）の１位、３位、４位、１０位、４７位、５７位、９１位、およ
び１０３位の１個以上の位置で存在し得る。より好ましくは、上記可変軽鎖フレームワー
クは、１位にグルタミン酸（Ｅ）、３位にバリン（Ｖ）、４位にロイシン（Ｌ）、１０位
にセリン（Ｓ）；４７位にアルギニン（Ｒ）、５７位にセリン（Ｓ）、９１位にフェニル
アラニン（Ｆ）および／もしくは１０３位にバリン（Ｖ）を含む。
実施例全体を通じて、別段示されなければ、以下の材料および方法を使用した。
（材料および方法）
一般に、本発明の実施は、別段示されなければ、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術
、免疫学の従来技術（特に、例えば、抗体技術）、およびポリペプチド調製の標準的技術
を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）
，５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄ．，Ｉｒｌ
Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
，Ｈａｒｌｏｗら，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）；およびＣｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．
Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照のこと。
一般に、本発明の実施は、別段示されなければ、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術
、免疫学の従来技術（特に、例えば、抗体技術）、およびポリペプチド調製の標準的技術
を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）
，５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄ．，Ｉｒｌ
Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
，Ｈａｒｌｏｗら，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）；およびＣｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．
Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照のこと。
（細胞ＥＬＩＳＡ（ＣＥＬＩＳＡ））
以下の実施例は、ＣＸＣＲ２を発現する細胞を分析するためのＣＥＬＩＳＡの使用を記
載する：
ＣＸＣＲ２を発現するＣＨＯ細胞を、９６ウェルの半分の面積のプレートに、５０，０
００細胞／ウェルの密度で播種し得る。３７℃で一晩インキュベートした後、細胞を、Ｐ
ＢＳ中１％ ホルムアルデヒドで３０分間、室温で固定し得る。細胞層を３回洗浄し得、
非特異的結合部位を、１時間にわたって室温で、細胞培養培地でブロックし得る。次に、
３回の洗浄工程の後、その上清を、培養培地で１：１に希釈し得、上記ウェルに添加し得
る。３個のコントロールウェル中、市販のウサギ抗ＣＸＣＲ２抗体を、上清中において添
加し得る。次いで、上清を、１時間半にわたって、室温で、上記細胞層上でインキュベー
トし得る。最後に、ウサギＩｇＧを、ＨＲＰに結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ抗体
で検出する。ペルオキシダーゼ基質（Ｒｏｃｈｅの青色ＰＯＤ基質）を添加して、比色反
応を行い、これを、１Ｍ ＨＣｌで２５分後に停止させ得る。吸光度を、４５０ｎｍにお
いて測定し得る。
以下の実施例は、ＣＸＣＲ２を発現する細胞を分析するためのＣＥＬＩＳＡの使用を記
載する：
ＣＸＣＲ２を発現するＣＨＯ細胞を、９６ウェルの半分の面積のプレートに、５０，０
００細胞／ウェルの密度で播種し得る。３７℃で一晩インキュベートした後、細胞を、Ｐ
ＢＳ中１％ ホルムアルデヒドで３０分間、室温で固定し得る。細胞層を３回洗浄し得、
非特異的結合部位を、１時間にわたって室温で、細胞培養培地でブロックし得る。次に、
３回の洗浄工程の後、その上清を、培養培地で１：１に希釈し得、上記ウェルに添加し得
る。３個のコントロールウェル中、市販のウサギ抗ＣＸＣＲ２抗体を、上清中において添
加し得る。次いで、上清を、１時間半にわたって、室温で、上記細胞層上でインキュベー
トし得る。最後に、ウサギＩｇＧを、ＨＲＰに結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ抗体
で検出する。ペルオキシダーゼ基質（Ｒｏｃｈｅの青色ＰＯＤ基質）を添加して、比色反
応を行い、これを、１Ｍ ＨＣｌで２５分後に停止させ得る。吸光度を、４５０ｎｍにお
いて測定し得る。
（実施例１：可溶性抗原を使用するＢ細胞スクリーニングシステム）
本発明において記載されるＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）ベースのスクリー
ニングシステムをここで例示し、このシステムは、Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）を介して
目的の標的（特に、可溶性タンパク質）に結合し得るＢ細胞を選択し得る。この実施例に
おいて、上記標的は、蛍光色素（ＰＥおよびＰｅｒＣＰ）で標識した一本鎖抗ＶＥＧＦ抗
体ＥＳＢＡ９０３であった。リンパ球懸濁物を、組換え標的で免疫化したウサギの脾臓か
ら調製した。次いで、細胞を、ＰＥおよびＰｅｒＣＰで標識したｓｃＦｖと、ならびにＩ
ｇＧに特異的な抗体（ＡＰＣ標識）もしくはＩｇＭに特異的な抗体（ＦＩＴＣ標識）と、
インキュベートした。表面にＩｇＧを発現するが、ＩｇＭを発現しないＥＳＢＡ９０３陽
性Ｂ細胞をソートし、９６ウェルプレート中に選択した（図２）。図２のパネルＡに示さ
れるように、リンパ球を、前方散乱および側方散乱に従ってゲート制御した。それらの中
で、ＩｇＧ＋ＩｇＭ−細胞（おそらく、記憶Ｂ細胞）を選択した（パネルＢ）。ｓｃＦｖ
−ＰＥおよびｓｃＦｖ−ＰｅｒＣＰで二重染色された細胞を、上記ｓｃＦｖに対する高ア
フィニティーＩｇＧをコードすると予測した（パネルＣ）。最も明るい蛍光を示す細胞を
、パネルＤにおいて列挙したソーティング統計を用いて、９６ウェルプレートにソートし
た。胸腺腫ヘルパー細胞株（ＥＬ４−Ｂ５：Ｚｕｂｌｅｒら，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１３４（６）：３６６２−３６６８を参照のこと）によって、選択されたＢ細胞を
増殖させ、形質細胞へと分化させ、次いで、抗体を分泌させた。これらＩｇＧ分子の標的
タンパク質に対するアフィニティーを、ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ測定によって確
認した。動力学的パラメーターを、７個の選択されたクローンについて表１に示す。これ
らクローン（約２００個のソートした細胞のプールに由来）は、低ｎＭ〜ｐＭ範囲で高い
結合アフィニティーを示す。最後に、分泌ＩｇＧ分子のｍＲＮＡを、６個の目的のクロー
ンから単離し、そのＣＤＲを、ＥＳＢＡＴｅｃｈ 一本鎖フレームワーク ＲａｂＴｏｒ
（フレームワーク ｒＦＷ１．４ともいわれる）にグラフト化した。
本発明において記載されるＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）ベースのスクリー
ニングシステムをここで例示し、このシステムは、Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）を介して
目的の標的（特に、可溶性タンパク質）に結合し得るＢ細胞を選択し得る。この実施例に
おいて、上記標的は、蛍光色素（ＰＥおよびＰｅｒＣＰ）で標識した一本鎖抗ＶＥＧＦ抗
体ＥＳＢＡ９０３であった。リンパ球懸濁物を、組換え標的で免疫化したウサギの脾臓か
ら調製した。次いで、細胞を、ＰＥおよびＰｅｒＣＰで標識したｓｃＦｖと、ならびにＩ
ｇＧに特異的な抗体（ＡＰＣ標識）もしくはＩｇＭに特異的な抗体（ＦＩＴＣ標識）と、
インキュベートした。表面にＩｇＧを発現するが、ＩｇＭを発現しないＥＳＢＡ９０３陽
性Ｂ細胞をソートし、９６ウェルプレート中に選択した（図２）。図２のパネルＡに示さ
れるように、リンパ球を、前方散乱および側方散乱に従ってゲート制御した。それらの中
で、ＩｇＧ＋ＩｇＭ−細胞（おそらく、記憶Ｂ細胞）を選択した（パネルＢ）。ｓｃＦｖ
−ＰＥおよびｓｃＦｖ−ＰｅｒＣＰで二重染色された細胞を、上記ｓｃＦｖに対する高ア
フィニティーＩｇＧをコードすると予測した（パネルＣ）。最も明るい蛍光を示す細胞を
、パネルＤにおいて列挙したソーティング統計を用いて、９６ウェルプレートにソートし
た。胸腺腫ヘルパー細胞株（ＥＬ４−Ｂ５：Ｚｕｂｌｅｒら，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１３４（６）：３６６２−３６６８を参照のこと）によって、選択されたＢ細胞を
増殖させ、形質細胞へと分化させ、次いで、抗体を分泌させた。これらＩｇＧ分子の標的
タンパク質に対するアフィニティーを、ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ測定によって確
認した。動力学的パラメーターを、７個の選択されたクローンについて表１に示す。これ
らクローン（約２００個のソートした細胞のプールに由来）は、低ｎＭ〜ｐＭ範囲で高い
結合アフィニティーを示す。最後に、分泌ＩｇＧ分子のｍＲＮＡを、６個の目的のクロー
ンから単離し、そのＣＤＲを、ＥＳＢＡＴｅｃｈ 一本鎖フレームワーク ＲａｂＴｏｒ
（フレームワーク ｒＦＷ１．４ともいわれる）にグラフト化した。
（選択された文献：）
Ｚｕｂｅｒら Ｍｕｔａｎｔ ＥＬ−４ ｔｈｙｍｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｐｏｌｙｃｌ
ｏｎａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ
ｖｉａ ｄｉｒｅｃｔ ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１９８５；１３４（６）：３６６２−３６６８。
（膜貫通標的）
上記で記載されたスクリーニングシステムは、上記標的が可溶性である場合、および組
換えタンパク質が利用可能である場合に効率的に機能する。しかし、いくつかの目的の標
的は、マルチスパン膜貫通タンパク質（例えば、ＧＰＣＲおよびイオンチャネル）である
。組換えタンパク質での伝統的な免疫化は、これらの場合において、得策ではないか、ま
たは不可能である。さらに、Ｂ細胞のＦＡＣＳ選択は、上記抗原が内在性膜タンパク質で
ある場合に、精製され標識されたタンパク質の結合に基づいて行うことができない。これ
らの課題に対処するために、上記の手順の以下の改善を行った。
上記で記載されたスクリーニングシステムは、上記標的が可溶性である場合、および組
換えタンパク質が利用可能である場合に効率的に機能する。しかし、いくつかの目的の標
的は、マルチスパン膜貫通タンパク質（例えば、ＧＰＣＲおよびイオンチャネル）である
。組換えタンパク質での伝統的な免疫化は、これらの場合において、得策ではないか、ま
たは不可能である。さらに、Ｂ細胞のＦＡＣＳ選択は、上記抗原が内在性膜タンパク質で
ある場合に、精製され標識されたタンパク質の結合に基づいて行うことができない。これ
らの課題に対処するために、上記の手順の以下の改善を行った。
１）組換えタンパク質の代わりに、ＤＮＡでの免疫化：
ＤＮＡワクチン接種は、ネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）抗原に対して迅速な免疫応答を誘
導する。組換えタンパク質が必要とされないので、この技術は、一方で非常に費用効率的
であり、他方で、より重要なことには、この方法は、内在性膜複合体および／もしくはマ
ルチスパン膜タンパク質のネイティブ発現を可能にする。
ＤＮＡワクチン接種は、ネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）抗原に対して迅速な免疫応答を誘
導する。組換えタンパク質が必要とされないので、この技術は、一方で非常に費用効率的
であり、他方で、より重要なことには、この方法は、内在性膜複合体および／もしくはマ
ルチスパン膜タンパク質のネイティブ発現を可能にする。
２）内在性標的膜タンパク質を発現する細胞に結合するＢ細胞のＦＡＣＳ選択：
フローサイトメトリーは、通常、単一の細胞がレーザービームを横切るときに、上記単
一の細胞によって発せられる蛍光を測定する。しかし、いくらかの研究者らは、細胞−細
胞相互作用（例えば、カドヘリンによって媒介される接着（Ｐａｎｏｒｃｈａｎら，２０
０６，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１９，６６−７４；Ｌｅｏｎｇ ｅｔ Ｈｉｂ
ｍａ，２００５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３０２，１１６−１２４）もし
くはインテグリンによって媒介される接着（Ｇａｗａｚら，１９９１，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ，８８，１１２８−１１３４））を調査するために血球計算器を既に使用して
きた。しかし、このような研究は、このような細胞−細胞相互作用がセルソーティングの
物理的工程の間に損なわれないままであるか否かを実証しなかった。さらに、Ｂ細胞レセ
プターの、別の細胞の表面に存在するその標的への結合が、このような物理的ソーティン
グを許容にするのに十分強いことを決して示さなかった。
フローサイトメトリーは、通常、単一の細胞がレーザービームを横切るときに、上記単
一の細胞によって発せられる蛍光を測定する。しかし、いくらかの研究者らは、細胞−細
胞相互作用（例えば、カドヘリンによって媒介される接着（Ｐａｎｏｒｃｈａｎら，２０
０６，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１９，６６−７４；Ｌｅｏｎｇ ｅｔ Ｈｉｂ
ｍａ，２００５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３０２，１１６−１２４）もし
くはインテグリンによって媒介される接着（Ｇａｗａｚら，１９９１，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ，８８，１１２８−１１３４））を調査するために血球計算器を既に使用して
きた。しかし、このような研究は、このような細胞−細胞相互作用がセルソーティングの
物理的工程の間に損なわれないままであるか否かを実証しなかった。さらに、Ｂ細胞レセ
プターの、別の細胞の表面に存在するその標的への結合が、このような物理的ソーティン
グを許容にするのに十分強いことを決して示さなかった。
膜貫通標的に結合するＢ細胞を選択するために、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞もしくはＨ
ＥＫ２９３細胞）を、選択した標的で一過性にもしくは優先的に安定にトランスフェクト
し得るか、または上記選択した標的を天然に発現する細胞を、使用し得る。このような標
的細胞を、細胞内蛍光色素（例えば、カルセイン）で染色し、免疫化したウサギの記憶Ｂ
リンパ球とインキュベートする。Ｂリンパ球を、細胞表面特異的マーカーに結合する蛍光
性の抗体で染色する。従って、ＢＣＲ−標的相互作用を通じて、本来互いに付着する２つ
の細胞にあるバイカラー「事象」の選択（図１を参照のこと）が、達成され得る。
ＥＫ２９３細胞）を、選択した標的で一過性にもしくは優先的に安定にトランスフェクト
し得るか、または上記選択した標的を天然に発現する細胞を、使用し得る。このような標
的細胞を、細胞内蛍光色素（例えば、カルセイン）で染色し、免疫化したウサギの記憶Ｂ
リンパ球とインキュベートする。Ｂリンパ球を、細胞表面特異的マーカーに結合する蛍光
性の抗体で染色する。従って、ＢＣＲ−標的相互作用を通じて、本来互いに付着する２つ
の細胞にあるバイカラー「事象」の選択（図１を参照のこと）が、達成され得る。
これらＢ細胞のさらなる処理を、上記のように行うと、モノクローナル抗体の生成（例
えば、ＩｇＧもしくはｓｃＦｖ形式において）がもたらされる．これら抗体の上記標的に
対する親和性を推測するために、ＣＥＬＩＳＡ（ＥＬＩＳＡ（ここで、コーティング工程
は、細胞全体を用いて行われる））を行う。この方法を用いると、抗体の選択性および上
記リガンドと競合する能力が、評価され得る。最後に、目的のクローンのＣＤＲを、オリ
ゴ伸長法での遺伝子合成によって、本発明者らのウサギ化フレームワーク（ＲａｂＴｏｒ
）へとクローニングする。
えば、ＩｇＧもしくはｓｃＦｖ形式において）がもたらされる．これら抗体の上記標的に
対する親和性を推測するために、ＣＥＬＩＳＡ（ＥＬＩＳＡ（ここで、コーティング工程
は、細胞全体を用いて行われる））を行う。この方法を用いると、抗体の選択性および上
記リガンドと競合する能力が、評価され得る。最後に、目的のクローンのＣＤＲを、オリ
ゴ伸長法での遺伝子合成によって、本発明者らのウサギ化フレームワーク（ＲａｂＴｏｒ
）へとクローニングする。
Ｂ細胞ソーティングの読み取りは、必ずしも、細胞−細胞相互作用を制限しないが、こ
の相互作用がレセプターシグナル伝達を機能的にブロック／活性化する能力を選択するた
めにも使用され得る。例えば、Ｂ細胞を、ＧＰＣＲを機能的に発現する細胞とインキュベ
ートし得る。ＧＰＣＲを通じてシグナル伝達するアゴニストを、小胞体からのＧＰＣＲ媒
介性Ｃａ２＋流出を誘導するために、上記混合物へ添加し得る。Ｂ細胞上に提示された抗
体がアゴニストシグナル伝達を機能的にブロックする場合、Ｃａ２＋流出はまた、結果的
にこの細胞−細胞相互作用によってブロックされ得る。Ｃａ２＋流出を、フローサイトメ
トリーによって定量的に測定し得る。従って、Ｃａ２＋流出を示さないＢ細胞／標的細胞
集団のみが、ソートされる。
の相互作用がレセプターシグナル伝達を機能的にブロック／活性化する能力を選択するた
めにも使用され得る。例えば、Ｂ細胞を、ＧＰＣＲを機能的に発現する細胞とインキュベ
ートし得る。ＧＰＣＲを通じてシグナル伝達するアゴニストを、小胞体からのＧＰＣＲ媒
介性Ｃａ２＋流出を誘導するために、上記混合物へ添加し得る。Ｂ細胞上に提示された抗
体がアゴニストシグナル伝達を機能的にブロックする場合、Ｃａ２＋流出はまた、結果的
にこの細胞−細胞相互作用によってブロックされ得る。Ｃａ２＋流出を、フローサイトメ
トリーによって定量的に測定し得る。従って、Ｃａ２＋流出を示さないＢ細胞／標的細胞
集団のみが、ソートされる。
（実施例２：抗ＴＮＦα抗体でコーティングしたビーズと、膜結合ＴＮＦαを発現する
ＣＨＯ細胞との間の相互作用の検出）
膜貫通タンパク質に対するＢ細胞スクリーニングを始める前に、細胞−細胞相互作用（
および、特に、ＢＣＲと、標的細胞上の膜貫通タンパク質との間の相互作用）が、ＦＡＣ
Ｓで確かに選択され得ることを実証しなければならない。フローサイトメトリーストリー
ムにおける高圧が、２個の細胞の間の非共有結合を壊すか否かを決定するために、以下の
実験を行った。
ＣＨＯ細胞との間の相互作用の検出）
膜貫通タンパク質に対するＢ細胞スクリーニングを始める前に、細胞−細胞相互作用（
および、特に、ＢＣＲと、標的細胞上の膜貫通タンパク質との間の相互作用）が、ＦＡＣ
Ｓで確かに選択され得ることを実証しなければならない。フローサイトメトリーストリー
ムにおける高圧が、２個の細胞の間の非共有結合を壊すか否かを決定するために、以下の
実験を行った。
膜結合ＴＮＦα（ＴＮＦαリガンドの切断および分離（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を妨げるＴ
ＡＣＥ切断部位に点変異を含む変異体膜結合ＴＮＦαを含む；例えば、Ｓｃａｌｌｏｎら
Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ２００２；３０１：４１８〜２６を参照
のこと）で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（Ｂ−２２０細胞）を、ＰＥ標識抗Ｔ
ＮＦα抗体でコーティングしたビーズとインキュベートした。この設定において、上記ビ
ーズは、記憶Ｂ細胞を模倣する。陰性コントロールとして、トランスフェクトしていない
ＣＨＯ細胞を使用し、同様に、ＡＰＣ標識した非関連抗体（抗ＣＤ１９）でコーティング
したビーズも使用した。撹拌しながら４℃で２時間にわたってインキュベートした後、上
記細胞−ビーズ懸濁物を、ＦＡＣＳ（１３０μｍノズルを使用する）によって分析した。
図３は、抗ＴＮＦαビーズとＴＮＦαトランスフェクトしたＣＨＯ細胞との間の特異的結
合が、ＦＡＣＳで明らかに検出可能であったことを示す。実際に、このサンプル（上部パ
ネル）において、上記ビーズの約２／３が、細胞に結合した（５８５結合 対 ２６７非
結合）。対照的に、上記コントロールサンプル（中央パネルおよび下部パネル）において
、ほとんどのビーズは、ＣＨＯ細胞に結合しなかった。さらに、両方のビーズ集団（抗Ｔ
ＮＦα−ＰＥおよび抗ＣＤ１９−ＡＰＣ）を、ＴＮＦαトランスフェクトしたＣＨＯ細胞
と一緒に混合した。図４は、抗ＴＮＦαビーズのうちの約１／２がＣＨＯ細胞に結合した
のに対して、上記抗ＣＤ１９ビーズのうちの大部分が、結合しないままであったことを示
す。各サンプルにおける上記細胞に結合するビーズの割合を、表２に詳述する。従って、
内在性標的膜タンパク質にそれらのＢ細胞レセプターを通じて結合する単一のＢ細胞の特
異的選択が、フローサイトメトリーを使用して可能であったことが実証された。
ＡＣＥ切断部位に点変異を含む変異体膜結合ＴＮＦαを含む；例えば、Ｓｃａｌｌｏｎら
Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ２００２；３０１：４１８〜２６を参照
のこと）で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（Ｂ−２２０細胞）を、ＰＥ標識抗Ｔ
ＮＦα抗体でコーティングしたビーズとインキュベートした。この設定において、上記ビ
ーズは、記憶Ｂ細胞を模倣する。陰性コントロールとして、トランスフェクトしていない
ＣＨＯ細胞を使用し、同様に、ＡＰＣ標識した非関連抗体（抗ＣＤ１９）でコーティング
したビーズも使用した。撹拌しながら４℃で２時間にわたってインキュベートした後、上
記細胞−ビーズ懸濁物を、ＦＡＣＳ（１３０μｍノズルを使用する）によって分析した。
図３は、抗ＴＮＦαビーズとＴＮＦαトランスフェクトしたＣＨＯ細胞との間の特異的結
合が、ＦＡＣＳで明らかに検出可能であったことを示す。実際に、このサンプル（上部パ
ネル）において、上記ビーズの約２／３が、細胞に結合した（５８５結合 対 ２６７非
結合）。対照的に、上記コントロールサンプル（中央パネルおよび下部パネル）において
、ほとんどのビーズは、ＣＨＯ細胞に結合しなかった。さらに、両方のビーズ集団（抗Ｔ
ＮＦα−ＰＥおよび抗ＣＤ１９−ＡＰＣ）を、ＴＮＦαトランスフェクトしたＣＨＯ細胞
と一緒に混合した。図４は、抗ＴＮＦαビーズのうちの約１／２がＣＨＯ細胞に結合した
のに対して、上記抗ＣＤ１９ビーズのうちの大部分が、結合しないままであったことを示
す。各サンプルにおける上記細胞に結合するビーズの割合を、表２に詳述する。従って、
内在性標的膜タンパク質にそれらのＢ細胞レセプターを通じて結合する単一のＢ細胞の特
異的選択が、フローサイトメトリーを使用して可能であったことが実証された。
（実施例３：抗ＴＮＦα抗体で免疫化したウサギから単離されたＢ細胞と、抗ＴＮＦα
抗体で飽和状態にした膜結合ＴＮＦαを発現するＣＨＯ細胞との間の相互作用の検出）
図５に示される実験については、リンパ球を、抗ＴＮＦα抗体（ＥＳＢＡ１０５，内部
で生成）で免疫化したウサギの脾臓もしくは免疫化していないウサギの脾臓のいずれかか
ら単離した。それらを、抗ウサギＩｇＧ−ＡＰＣおよび抗ウサギＩｇＭ−ＦＩＴＣ（Ａｂ
Ｄ ｓｅｒｏｔｅｃ）で染色し、その後、記憶Ｂ細胞（ＩｇＧ＋／ＩｇＭ−）の純粋な集
団を得るために、予めソートした。並行して、ＴＮＦα発現ＣＨＯ細胞（Ｄｒ．Ｐ Ｓｃ
ｈｅｕｒｉｃｈ（Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）によって寄付）に、１μｇ／ｍ
Ｌ カルセイン−レッド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（生細胞を蛍光染色する細胞質色素）
を添加した。次いで、これら細胞を、１回洗浄し１００μｇ／ｍＬのＥＳＢＡ１０５と（
あるいは陰性コントロールについては、なし）インキュベートし、最後に、ＰＢＳで再び
３回洗浄した。記憶Ｂ細胞を、約１：１０の比率で上記ＣＨＯ細胞と最終的に混合し、回
転プレート上で、４℃で２時間の間インキュベートした（濃度：３×１０７細胞／ｍＬ）
。
以下のサンプルを調製した：
１）ＣＨＯ−ＴＮＦα細胞＋ＥＳＢＡ１０５＋ＥＳＢＡ１０５で免疫化したウサギの記
憶Ｂ細胞
２）ＣＨＯ−ＴＮＦα細胞＋ＥＳＢＡ１０５＋免疫化していないウサギの記憶Ｂ細胞
３）ＣＨＯ−ＴＮＦα細胞＋ＥＳＢＡ１０５で免疫化したウサギの記憶Ｂ細胞 。
１）ＣＨＯ−ＴＮＦα細胞＋ＥＳＢＡ１０５＋ＥＳＢＡ１０５で免疫化したウサギの記
憶Ｂ細胞
２）ＣＨＯ−ＴＮＦα細胞＋ＥＳＢＡ１０５＋免疫化していないウサギの記憶Ｂ細胞
３）ＣＨＯ−ＴＮＦα細胞＋ＥＳＢＡ１０５で免疫化したウサギの記憶Ｂ細胞 。
２時間のインキュベーション後、上記３サンプルを、７０μｍノズルを使用して、ＦＡ
ＣＳによって測定した。表３ａに示される集団階層によれば、ＥＳＢＡ１０５で免疫化し
た細胞のうちの５％は、「ＥＳＢＡ１０５でコーティングした」ＴＮＦαトランスジェニ
ックＣＨＯ細胞に結合する。比較すると、ほんの０．５％の免疫化していないＢ細胞が、
これら「ＥＳＢＡ１０５でコーティングした」ＴＮＦαトランスジェニックＣＨＯ細胞に
結合し（表３ｂ）、０．６％の免疫化したＢ細胞が、ＣＨＯ細胞上のＥＳＢＡ１０５の非
存在下で結合する（表３ｃ）。これら結果は、ＢＣＲ（Ｂ細胞レセプター）と、膜貫通標
的との間の特異的相互作用が、ＦＡＣＳによって検出され得ることを示す。
ＣＳによって測定した。表３ａに示される集団階層によれば、ＥＳＢＡ１０５で免疫化し
た細胞のうちの５％は、「ＥＳＢＡ１０５でコーティングした」ＴＮＦαトランスジェニ
ックＣＨＯ細胞に結合する。比較すると、ほんの０．５％の免疫化していないＢ細胞が、
これら「ＥＳＢＡ１０５でコーティングした」ＴＮＦαトランスジェニックＣＨＯ細胞に
結合し（表３ｂ）、０．６％の免疫化したＢ細胞が、ＣＨＯ細胞上のＥＳＢＡ１０５の非
存在下で結合する（表３ｃ）。これら結果は、ＢＣＲ（Ｂ細胞レセプター）と、膜貫通標
的との間の特異的相互作用が、ＦＡＣＳによって検出され得ることを示す。
（実施例４：ＥＳＢＡ１０５で免疫化したウサギから単離されたＢ細胞と、ＥＳＢＡ１
０５で飽和状態にした膜結合ＴＮＦαを発現するＣＨＯ細胞との間の相互作用の検出）
さらなる実験において、記憶Ｂ細胞の予備ソーティングは行わなかった。リンパ球集団
全体を、染色したＣＨＯ−ＴＮＦα−ＥＳＢＡ１０５細胞とインキュベートした。トラン
スジェニックＣＨＯ細胞を、上記のように調製した。しかし、９６ウェルプレートにおけ
るソート後にＢ細胞培養培地中でのそれらの増殖を妨げるために、上記細胞を、カルセイ
ン染色の前にマイトマイシンＣ（Ｍ４２８７−２ＭＧ）処理することによって、細胞周期
を停止させた。ＥＳＢＡ１０５免疫化ウサギのリンパ球を３：１の比で、上記染色したＣ
ＨＯ細胞と混合し（細胞懸濁物の濃度：約３−１０７細胞／ｍＬ）、回転プレート上で、
４℃で２時間の間インキュベートした。その後、上記細胞懸濁物を、ＦＡＣＳ分析し、Ｃ
ＨＯ−ＴＮＦα−ＥＳＢＡ１０５に結合している記憶Ｂ細胞を、図６に示されるゲートに
従ってソートした（表３に示されるように、１細胞／ウェル、１０細胞／ウェルもしくは
１００細胞／ウェルで）。ソートした細胞は、上記記憶Ｂ細胞集団のうちの５．５％（そ
れぞれ、合計事象のうちの０．２％）を表した。
ソートした細胞を、９６ウェルプレート中に集め、５％ ＣＯ２で、３７℃で１３日間
培養した。その後、培養上清を集め、直接ＥＬＩＳＡで試験して、ＥＳＢＡ１０５結合Ｉ
ｇＧの存在について調べた。ＥＬＩＳＡ結果（表３）は、ＥＳＢＡ１０５特異的抗体が多
くのウェルにおいて検出でき、単一のＢ細胞をソートしたウェルにおいても検出できたこ
とを示す。これら上清のＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）分析（表４）は
、これら抗体がＥＳＢＡ１０５標的に実際に結合することを確認した。
培養した。その後、培養上清を集め、直接ＥＬＩＳＡで試験して、ＥＳＢＡ１０５結合Ｉ
ｇＧの存在について調べた。ＥＬＩＳＡ結果（表３）は、ＥＳＢＡ１０５特異的抗体が多
くのウェルにおいて検出でき、単一のＢ細胞をソートしたウェルにおいても検出できたこ
とを示す。これら上清のＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）分析（表４）は
、これら抗体がＥＳＢＡ１０５標的に実際に結合することを確認した。
（実施例５：ＣＸＣＲ２（ソート２７／２９）で免疫化したウサギのリンパ球のスクリ
ーニング）
３羽のウサギを、ＣＸＣＲ２発現ベクターで免疫化した。ＣＸＣＲ２−ｃＤＮＡの数回
の皮内適用の後に、血清を採取し、ＣＸＣＲ２トランスフェクトした細胞で特異的抗体の
存在について試験した。次いで、リンパ節細胞を取り出し、各１．６×１０７細胞ずつ５
つのアリコートに分けて凍結し、液体窒素タンク中に保存した。
アリコートを融解し、ＩｇＧに対して特異的な抗体（ＡＰＣ標識）もしくはＩｇＭに対
して特異的な抗体（ＦＩＴＣ標識）で染色した。並行して、ＣＸＣＲ２発現ＣＨＯ細胞を
、上記細胞を死滅させることなくさらなる増殖を妨げるために、マイトマイシンＣで処理
し、１μｇ／ｍＬ カルセイン−レッドを添加した。次いで、両方の細胞調製物を、最終
濃度１０７細胞／ｍｌの、ＣＸＣＲ２トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の２倍程度のリン
パ球と混合した。４℃で穏やかに攪拌しながら２時間インキュベートした後、細胞懸濁物
を、５０μｍフィルタで濾過し、ＦＡＣＳにかけた。図６に記載されるようにゲート制御
を行った。１つの「事象」（ＣＸＣＲ２トランスフェクトしたＣＨＯ細胞に結合した記憶
Ｂ細胞）を、合計１０×９６ウェルプレート（合計９００事象）で、１ウェルあたりにソ
ートした。ソートした事象は、上記記憶Ｂ細胞集団のうちの３．１％（それぞれ、上記サ
ンプル中の合計細胞量の０．０３５％）を表した。
して特異的な抗体（ＦＩＴＣ標識）で染色した。並行して、ＣＸＣＲ２発現ＣＨＯ細胞を
、上記細胞を死滅させることなくさらなる増殖を妨げるために、マイトマイシンＣで処理
し、１μｇ／ｍＬ カルセイン−レッドを添加した。次いで、両方の細胞調製物を、最終
濃度１０７細胞／ｍｌの、ＣＸＣＲ２トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の２倍程度のリン
パ球と混合した。４℃で穏やかに攪拌しながら２時間インキュベートした後、細胞懸濁物
を、５０μｍフィルタで濾過し、ＦＡＣＳにかけた。図６に記載されるようにゲート制御
を行った。１つの「事象」（ＣＸＣＲ２トランスフェクトしたＣＨＯ細胞に結合した記憶
Ｂ細胞）を、合計１０×９６ウェルプレート（合計９００事象）で、１ウェルあたりにソ
ートした。ソートした事象は、上記記憶Ｂ細胞集団のうちの３．１％（それぞれ、上記サ
ンプル中の合計細胞量の０．０３５％）を表した。
選択したリンパ球を、３７℃のインキュベーター中で２１日間培養した。２〜３日毎に
、１００μＬの培養上清を上記ウェルから集め、新鮮な培地と交換した。この培養期間の
間、Ｂ細胞は増殖し、形質細胞へと分化し、抗体を分泌した。どの上清がＣＸＣＲ２特異
的抗体を含んでいたかを可視化するために、ＣＥＬＩＳＡを行った。このために、ＣＸＣ
Ｒ２を発現するＣＨＯ細胞を、９６ウェルの半分の面積のプレートに、５０，０００細胞
／ウェルの密度で播種した。３７℃で一晩インキュベートした後、細胞を、ＰＢＳ中１％
ホルムアルデヒドで、室温で３０分間にわたって固定した。次いで、細胞層を、３回洗
浄し、非特異的結合部位を、室温で１時間、細胞培養培地でブロックした。次に、３回の
洗浄工程の後、上記上清を培養培地中で１：１希釈し、各ウェルに添加した。３個のコン
トロールウェルにおいて、市販のウサギ抗ＣＸＣＲ２抗体を、上清中に添加した。上清を
、室温で１時間半、上記細胞層上でインキュベートした。最後に、ウサギＩｇＧを、ＨＲ
Ｐに結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ抗体で検出した。ペルオキシダーゼ基質（Ｒｏ
ｃｈｅの青色ＰＯＤ基質）を添加して、比色反応を行って、１Ｍ ＨＣｌで２５分後に停
止させた。吸光度を４５０ｎｍで測定した。
、１００μＬの培養上清を上記ウェルから集め、新鮮な培地と交換した。この培養期間の
間、Ｂ細胞は増殖し、形質細胞へと分化し、抗体を分泌した。どの上清がＣＸＣＲ２特異
的抗体を含んでいたかを可視化するために、ＣＥＬＩＳＡを行った。このために、ＣＸＣ
Ｒ２を発現するＣＨＯ細胞を、９６ウェルの半分の面積のプレートに、５０，０００細胞
／ウェルの密度で播種した。３７℃で一晩インキュベートした後、細胞を、ＰＢＳ中１％
ホルムアルデヒドで、室温で３０分間にわたって固定した。次いで、細胞層を、３回洗
浄し、非特異的結合部位を、室温で１時間、細胞培養培地でブロックした。次に、３回の
洗浄工程の後、上記上清を培養培地中で１：１希釈し、各ウェルに添加した。３個のコン
トロールウェルにおいて、市販のウサギ抗ＣＸＣＲ２抗体を、上清中に添加した。上清を
、室温で１時間半、上記細胞層上でインキュベートした。最後に、ウサギＩｇＧを、ＨＲ
Ｐに結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ抗体で検出した。ペルオキシダーゼ基質（Ｒｏ
ｃｈｅの青色ＰＯＤ基質）を添加して、比色反応を行って、１Ｍ ＨＣｌで２５分後に停
止させた。吸光度を４５０ｎｍで測定した。
このＣＥＬＩＳＡは、陽性シグナルを示す１．８％のウェルを生じた（１６／９００）
。全ての陽性を、第２のＣＥＬＩＳＡで確認した。上清をまた、他の細胞株：ＣＨＯ−Ｋ
１（野生型）に対して試験して、起こり得る非特異的結合クローン（ＣＨＯ−ヒトＣＸＣ
Ｒ１およびＣＨＯ−マウスＣＸＣＲ２）を明らかにして、密に関連するレセプターもしく
は種対応物に対する交叉反応性を実証した。最後に、上清を、４８個のＣＸＣＲ２ Ｎ末
端アミノ酸からなるペプチドへの結合について、直接ＥＬＩＳＡにおいて試験した。結果
を表５に示す。全ての選択した上清は、ＣＥＬＩＳＡにおいて、ヒトＣＸＣＲ２に対して
強いＯＤ４５０シグナルを生成した。それらのうちのいくつかはまた、ＣＨＯ野生型細胞
を用いたコントロール実験において僅かに陽性であった。このことは、それらが非特異的
な様式で結合し得ることを意味する。上記クローンのうちのいずれも、ヒトＣＸＣＲ１と
も、マウスＣＸＣＲ２とも交叉反応しなかった。最後に、いくつかのクローン（しかし、
それらのうちの全てではない）は、上記ＣＸＣＲ２ Ｎ末端ペプチドに結合した。このこ
とは、ＣＸＣＲ２上のあり得る代替の結合部位を示す。Ｂｉａｃｏｒｅチップに細胞全体
を固定化することが不可能であるとすると、ＣＸＣＲ２レセプターに対する選択された抗
体の親和性を定量的に測定することは、現在不可能である。しかし、集められたデータは
、ヒトＣＸＣＲ２に特異的な抗体が、上記の細胞−細胞相互作用ソーティングシステムを
使用して選択されたことを示すように収束している。
。全ての陽性を、第２のＣＥＬＩＳＡで確認した。上清をまた、他の細胞株：ＣＨＯ−Ｋ
１（野生型）に対して試験して、起こり得る非特異的結合クローン（ＣＨＯ−ヒトＣＸＣ
Ｒ１およびＣＨＯ−マウスＣＸＣＲ２）を明らかにして、密に関連するレセプターもしく
は種対応物に対する交叉反応性を実証した。最後に、上清を、４８個のＣＸＣＲ２ Ｎ末
端アミノ酸からなるペプチドへの結合について、直接ＥＬＩＳＡにおいて試験した。結果
を表５に示す。全ての選択した上清は、ＣＥＬＩＳＡにおいて、ヒトＣＸＣＲ２に対して
強いＯＤ４５０シグナルを生成した。それらのうちのいくつかはまた、ＣＨＯ野生型細胞
を用いたコントロール実験において僅かに陽性であった。このことは、それらが非特異的
な様式で結合し得ることを意味する。上記クローンのうちのいずれも、ヒトＣＸＣＲ１と
も、マウスＣＸＣＲ２とも交叉反応しなかった。最後に、いくつかのクローン（しかし、
それらのうちの全てではない）は、上記ＣＸＣＲ２ Ｎ末端ペプチドに結合した。このこ
とは、ＣＸＣＲ２上のあり得る代替の結合部位を示す。Ｂｉａｃｏｒｅチップに細胞全体
を固定化することが不可能であるとすると、ＣＸＣＲ２レセプターに対する選択された抗
体の親和性を定量的に測定することは、現在不可能である。しかし、集められたデータは
、ヒトＣＸＣＲ２に特異的な抗体が、上記の細胞−細胞相互作用ソーティングシステムを
使用して選択されたことを示すように収束している。
（等価物）
本発明に対する多くの改変および代替の実施形態は、前述の説明に鑑みれば、当業者に
明らかである。よって、この説明は、例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実
施するためのベストモードを当業者に教示する目的である。構造の詳細は、本発明の趣旨
から逸脱することなく実質的に変動し得、添付の特許請求の範囲内にある全ての改変の独
占的な使用は確保され得る。本発明は、添付の特許請求の範囲および適用可能な法の支配
によって必要とされる程度にのみ限定されることが意図される。
本願において引用される全ての文献および類似の資料（特許、特許出願、文献、書籍、
条約、論文、ウェブページ、図面および／もしくは付録を含む）は、このような文献およ
び類似の資料の形式に拘わらず、それらの全体が本明細書に参考として援用される。援用
される文献および類似の資料のうちの１つ以上が、定義された用語、擁護の使用法、記載
された技術などを含め、本願と異なるか矛盾する場合には、本願が優先する。
条約、論文、ウェブページ、図面および／もしくは付録を含む）は、このような文献およ
び類似の資料の形式に拘わらず、それらの全体が本明細書に参考として援用される。援用
される文献および類似の資料のうちの１つ以上が、定義された用語、擁護の使用法、記載
された技術などを含め、本願と異なるか矛盾する場合には、本願が優先する。
Claims (6)
- 目的の抗原に結合し得るヒト化イムノバインダーを生成する方法であって、以下：
（ｉ）目的の抗原に特異的に結合するイムノバインダーを同定する工程であって、
（ａ）非ヒト動物由来の複数のＢ細胞を提供する工程；
（ｂ）該複数のＢ細胞と、第１のソート可能な標識を含む該目的の抗原とを接触させ、かつ、該複数のＢ細胞を、第２のソート可能な標識を含む抗ＩｇＧ抗体および第３のソート可能な標識を含む抗ＩｇＭ抗体で染色する工程；ならびに
（ｃ）セルソーターを使用して、該複数のＢ細胞から、該目的の抗原に特異的に結合し得る１個以上のＢ細胞を分離する工程であって、複合体において、該第１および第２のソート可能な標識が存在するが、該第３のソート可能な標識が存在しないことは、目的の抗原へのＢ細胞の結合を示し、それによって、該目的の抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖のＣＤＲを有するイムノバインダーを同定する、工程
を含む、工程と；
（ｉｉ）工程（ｃ）の該イムノバインダー由来の重鎖ＣＤＲを、配列番号４の可変重鎖フレームワークに導入する工程であって、該可変重鎖フレームワークが、２４位のスレオニン（Ｔ）、２５位のバリン（Ｖ）、５６位のグリシンもしくはアラニン（Ｇ／Ａ）、８２位のリジン（Ｋ）、８４位のスレオニン（Ｔ）、８９位のバリン（Ｖ）および１０８位のアルギニン（Ｒ）（ＡＨｏの番号付け）からなる群より選択される１個以上のアミノ酸残基を有する、工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｃ）の該イムノバインダー由来の軽鎖ＣＤＲを、３個の軽鎖ＣＤＲと軽鎖フレームワーク配列を含む可変軽鎖に導入する工程と
を含む、方法。 - 前記ヒト化イムノバインダーが、全長免疫グロブリン、ＦａｂまたはｓｃＦｖである、請求項１に記載の方法。
- 前記ソート可能な標識が蛍光標識である、請求項１に記載の方法。
- 前記目的の抗原が可溶性抗原である、請求項１に記載の方法。
- 前記Ｂ細胞がウサギ由来のＢ細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記ウサギが目的の抗原で免疫化された、請求項５に記載の方法。
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| PCT/CH2009/000222 WO2009155726A2 (en) | 2008-06-25 | 2009-06-25 | Humanization of rabbit antibodies using a universal antibody framework |
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| KR0119909B1 (ko) * | 1993-10-05 | 1997-10-20 | 김은영 | 플로우 사이토미터를 이용한 고상형 면역 측정방법 |
| KR100654645B1 (ko) * | 1995-04-27 | 2007-04-04 | 아브게닉스, 인크. | 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체 |
| JP2000516452A (ja) * | 1996-07-16 | 2000-12-12 | プリュックテュン，アンドレアス | 可溶性が増大した免疫グロブリンスーパーファミリードメインおよびフラグメント |
| DK2332989T3 (en) * | 2002-05-22 | 2015-05-11 | Esbatech Alcon Biomed Res Unit | IMMUNGLOBULIN FRAMEWORKS PROVIDING IMPROVED STABILITY IN THE INTRACELLULAR ENVIRONMENT AND PROCEDURES FOR IDENTIFICATION THEREOF |
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| WO2004044584A1 (en) * | 2002-11-13 | 2004-05-27 | Micromet Ag | Method for identifying antigen specific b cells |
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| EP1623229A2 (en) * | 2003-05-15 | 2006-02-08 | Cytos Biotechnology AG | Selection of b cells with specificity of interest: method of preparation and use |
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