JP6161655B2 - 細胞表面抗原のイムノバインダーを同定するための方法 - Google Patents
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Description
抗体、その結合体および誘導体を包含するイムノバインダー(immunobinder)は、治療剤および診断剤として、非常に産業的に重要である。抗体調製もしくはスクリーニングのための伝統的な方法は、通常は、可溶性の抗原を利用する。しかし、特定の膜結合タンパク質抗原について、上記抗原上のコンフォメーションエピトープ(conformational epitope)は、上記抗原が、上記膜から可溶化される場合に改変され、抗体調製もしくはスクリーニングの失敗を生じる。さらに、イムノブロッティング法およびアフィニティークロマトグラフィー法における1つの重要な問題は、上記抗原に対して中程度のアフィニティーを有する抗体が選択されることである。このことは、多くの交叉反応性もしくは粘着性の抗体の包含を許容してしまい、連続したスクリーニング手順において負担を引き起こす。膜結合抗原を発現する細胞は、抗体調製に直接使用されてきたが、細胞表面抗原に対する高アフィニティー抗体を検出しかつ富化し得る効率的なスクリーニング方法はなお、不足している。
本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合し得るイムノバインダー(例えば、scFv抗体)を同定するための方法を提供する。本発明の方法は、一般に、標識された抗原発現細胞と、標識されたイムノバインダー発現細胞とを接触させる工程および上記抗原発現細胞に結合するイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して単離する工程を包含する。これら方法は、内在性膜タンパク質(例えば、GPCR)に存在するコンフォメーションエピトープに対するイムノバインダーの迅速かつ効率的な同定のために特に有用である。本発明はまた、本発明の方法を使用して同定された、単離されたイムノバインダーおよびイムノバインダーをコードする核酸を提供する。
conjugate)および蛍光性細胞標識が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
目的の細胞表面抗原に特異的に結合するイムノバインダーを同定するための方法であって、該方法は、
(a)第1のソート可能な標識に作動可能に連結された複数のイムノバインダー発現細胞を提供する工程;
(b)第2のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで該目的の抗原は、該抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程;
(c)該抗原発現細胞と、該イムノバインダー発現細胞とを接触させる工程;および
(d)該複数のイムノバインダー発現細胞から、該抗原発現細胞に特異的に結合し得る1個以上のイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体における該第1のソート可能な標識および該第2のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのイムノバインダー発現細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するイムノバインダーを同定する、工程、
を包含する、方法。
(項目2)
前記工程(d)において得られたイムノバインダー発現細胞をクローン的に単離し、必要に応じて、続いて、該クローン的に単離された細胞のクローン性増殖を行う工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記イムノバインダーをコードする核酸配列を、前記単離されたイムノバインダー発現細胞から得る工程をさらに包含する、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記イムノバインダーをコードする核酸配列は、PCRによって得られる、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記PCRは、単一細胞PCRである、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記単離されたイムノバインダー発現細胞を、細胞ベースのアッセイに供して、前記イムノバインダーを機能的に特徴付ける工程をさらに包含する、項目2に記載の方法。
(項目7)
前記細胞ベースのアッセイが、CELISAである、項目6に記載の方法。
(項目8)
細胞複合体が、抗原と、B細胞レセプターとの間に形成される、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記イムノバインダーは抗体である、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記抗体は、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体、ラクダ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体からなる群より選択される、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記抗体は、全長免疫グロブリン、Fab、Dabおよびナノボディーからなる群より選択される、項目9に記載の方法。
(項目12)
前記抗体は、scFvである、項目9に記載の方法。
(項目13)
前記目的の抗原は、外因性遺伝子から発現される、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記目的の抗原は、遺伝的に操作された抗原である、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
前記目的の抗原は、内在性膜タンパク質である、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記内在性膜タンパク質は、GPCRである、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記GPCRは、CXCR2、CXCR1、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC−1、CIC−2、CIC−4、CIC−5、CIC−7、CIC−Ka、CIC−Kb、Bestrophins、TMEM16A、GABAレセプター、グリシンレセプター、ABC輸送体、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、スフィンゴシン−1−ホスフェートレセプター(S1P1R)およびNMDAチャネルからなる群より選択される、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記内在性膜タンパク質は、イオンチャネルである、項目15に記載の方法。
(項目19)
前記第1のソート可能な標識もしくは前記第2のソート可能な標識は、蛍光標識である、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
前記蛍光標識は、蛍光タンパク質、抗体/蛍光体結合体および蛍光性細胞標識からなる群より選択される、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記セルソーターは、蛍光細胞分析分離装置である、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
前記抗原発現細胞は、酵母細胞、酵母スフェロプラストもしくは哺乳動物細胞である、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
前記抗原発現細胞は、ヒト細胞である、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記抗原発現細胞は、外因性抗原を発現する、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目25)
前記抗原発現細胞は、発現ベクターでトランスフェクトされる、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記イムノバインダー発現細胞は、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞である、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
前記イムノバインダー発現細胞は、B細胞である、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目28)
前記B細胞は、ウサギB細胞である、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記B細胞は、免疫化した動物から単離される、項目27または28のいずれか1項に記載の方法。
(項目30)
前記動物は、DNAワクチン接種によって免疫化される、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記イムノバインダー発現細胞は、発現ベクターから発現されるイムノバインダーを含む、上記項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
項目1〜31のいずれか1項に記載の方法によって選択されるイムノバインダーをコードする、単離された核酸分子。
(項目33)
目的の抗原に結合し得るイムノバインダーを生成する方法であって、該方法は、項目32に記載のイムノバインダーをコードする核酸配列を、該コードされたイムノバインダーが生成されるように、発現環境に導入する工程を包含する、方法。
(項目34)
項目33に記載の方法によって生成される、イムノバインダー。
(項目35)
目的の細胞表面抗原に特異的に結合するB細胞クローンを同定するための方法であって、該方法は:
(a)動物を、細胞表面抗原をコードするDNAで免疫化する工程、
(b)B細胞を、免疫化した該動物から単離する工程、
(c)該B細胞を、第1のソート可能な標識で標識する工程;
(d)第2のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで該目的の抗原は、該抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程;
(e)該抗原発現細胞と、該B細胞とを接触させる工程;および
(f)複数の該B細胞から、該抗原発現細胞に特異的に結合し得る1個以上のB細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体における該第1のソート可能な標識および該第2のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのB細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するB細胞クローンを同定する、工程、
を包含する、方法。
本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合し得るイムノバインダー(例えば、scFv抗体)を同定するための方法を提供する。本発明の方法は、一般に、標識した抗原発現細胞と、標識したイムノバインダー発現細胞とを接触させる工程、および上記抗原発現細胞に結合するイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して単離する工程を包含する。これら方法は、内在性膜タンパク質(例えば、GPCR)に存在するコンフォメーションエピトープに対するイムノバインダーの迅速かつ効率的な同定のために特に有用である。本発明はまた、本発明の方法を用いて同定された、単離されたイムノバインダーおよびイムノバインダーをコードする核酸を提供する。
本発明が、より容易に理解され得るように、特定の用語が、以下のとおりに定義される。さらなる定義は、詳細な説明全体に記載される。
11:500−515(2002)を参照のこと)またはサメ抗体(例えば、サメIg−NARs ナノボディー(登録商標));ならびに(vii)ナノボディー(1個の可変ドメインおよび2個の定常ドメインを含む重鎖可変領域)が挙げられるが、これらに限定されない)が挙げられる。
抗体調製のための標的抗原は、可溶性であるか、もしくは細胞表面上に発現されるか、もしくは形質膜に結合されている任意のタンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、炭水化物、脂質、および他の分子であり得る。抗原は、天然抗原であっても合成抗原であってもよい。好ましくは、標的抗原は、タンパク質もしくはペプチドである。標的抗原の非限定的例としては、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC−1、CIC−2、CIC−4、CIC−5、CIC−7、CIC−Ka、CIC−Kb、Bestrophins、TMEM16A、GABAレセプター、グリシンレセプター、ABC輸送体、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、スフィンゴシン−1−ホスフェートレセプター(S1P1R)、NMDAチャネルなどが挙げられる。一実施形態において、上記標的抗原は、膜貫通タンパク質である。別の実施形態において、上記標的抗原は、マルチスパン(multispan)膜貫通タンパク質(例えば、Gタンパク質共役レセプター(GPCR)、イオンチャネルなど)である。
FASEB J.,9:745−754,1995;Straderら Annu.Rev.Biochem.,63:101−32,1994)。ヒト遺伝子のうちの1%は、GPCRをコードし得ると推測されてきた。GPCRは、広く種々のリガンド(光子、低分子の生体アミン(すなわち、エピネフリンおよびヒスタミン)、ペプチド(すなわち、IL−8)から、大きな糖タンパク質ホルモン(すなわち、副甲状腺ホルモン)に及ぶ)に結合する。リガンド結合の際に、GPCRは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)を活性化することによって細胞内シグナル伝達経路を調節する。興味深いことに、GPCRは、ヒトサイトメガロウイルスおよびヘルペスウイルスにおいて機能的ホモログを有し、このことは、GPCRが、ウイルス病因の展開の間に獲得され得たことを示唆する(Straderら,FASEB J.,9:745−754,1995;Arvanitakisら Nature,385:347−350,1997;Murphy,Annu.Rev.Immunol.12:593−633,1994)。
一実施形態において、本明細書に記載される方法によって選択されるべきイムノバインダー発現細胞は、哺乳動物B細胞、好ましくは、ウサギB細胞である。
免疫化工程の後、上記標的抗原に特異的に結合するB細胞上の膜結合抗体は、非特異的抗体を発現する他の細胞から区別される必要がある。好ましい一実施形態において、上記抗原−抗体結合を通じて、その形質膜上に上記特異的抗体を発現するB細胞は、上記抗原を発現する標的細胞に付着する。もう一つの好ましい実施形態において、他のもしくはより多くの相互作用(例えば、同じもしくは異なる抗原−抗体相互作用、化学的架橋、リガンド−レセプター相互作用など)は、B細胞と標的細胞との間で起こり得る。上記B細胞は、種々の抗体を発現するB細胞のプール中に、または上記免疫動物から直接、免疫化した/免役状態にしていない動物のプールから、もしくはインビトロ操作プロセス(例えば、V(D)J遺伝的組み換え技術により異なる抗体を発現するB細胞のライブラリー)から集められる他の免疫細胞と組み合わせて存在し得る。
特定の実施形態において、B細胞は、抗体が培養培地へと分泌されるように、適切な条件下で培養される。生成された抗体は、例えば、モノクローナル抗体である。上記培養は、ヘルパー細胞株(例えば、胸腺腫ヘルパー細胞株(例えば、EL4−B5(Zublerら,1985,J.Immunol.,134(6):3662−3668を参照のこと))の使用を伴い得る。
上記同定されかつ単離された(必要に応じて、アフィニティーアッセイ(例えば、CELISA)によって試験された)B細胞は、目的のイムノバインダーを生成するためにさらに処理され得る。伝統的なハイブリドーマ技術が、例えば、使用され得る。これは、上記イムノバインダーを精製し、それらのアミノ酸配列および/もしくは核酸配列を解明するような工程を伴い得る。
本発明の方法を用いて同定されたイムノバインダーの抗原結合領域もしくはCDRは、アクセプター抗体フレームワークへとグラフト化され得る。このようなグラフト化は、例えば、イムノバインダーの免疫原性を低下させ得るか、またはその機能的特性を改善し得る(例えば、熱力学的安定性を改善し得る)。
(i)配列番号1に対して少なくとも70%同一性、好ましくは、少なくとも75%、80%、85%、90%、より好ましくは、少なくとも95%同一性を有する可変重鎖フレームワーク;および/または
(ii)配列番号2に対して少なくとも70%同一性、好ましくは、少なくとも75%、80%、85%、90%、より好ましくは、少なくとも95%同一性を有する可変軽鎖フレームワーク。
(i)配列番号1、配列番号4および配列番号6からなる群より選択される可変重鎖フレームワーク;および/または
(ii)配列番号2もしくは配列番号9の可変軽鎖フレームワーク。
一般に、本発明の実施は、別段示されなければ、化学、分子生物学、組換えDNA技術、免疫学の従来技術(特に、例えば、抗体技術)、およびポリペプチド調製の標準的技術を使用する。例えば、Sambrook,Fritsch and Maniatis,Molecular Cloning:Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology),510,Paul,S.,Humana Pr(1996);Antibody Engineering:A Practical Approach(Practical Approach Series,169),McCafferty,Ed.,Irl Pr(1996);Antibodies:A Laboratory Manual,Harlowら,C.S.H.L.Press,Pub.(1999);およびCurrent Protocols in Molecular Biology,eds.Ausubelら,John Wiley & Sons(1992)を参照のこと。
以下の実施例は、CXCR2を発現する細胞を分析するためのCELISAの使用を記載する:
CXCR2を発現するCHO細胞を、96ウェルの半分の面積のプレートに、50,000細胞/ウェルの密度で播種し得る。37℃で一晩インキュベートした後、細胞を、PBS中1% ホルムアルデヒドで30分間、室温で固定し得る。細胞層を3回洗浄し得、非特異的結合部位を、1時間にわたって室温で、細胞培養培地でブロックし得る。次に、3回の洗浄工程の後、その上清を、培養培地で1:1に希釈し得、上記ウェルに添加し得る。3個のコントロールウェル中、市販のウサギ抗CXCR2抗体を、上清中において添加し得る。次いで、上清を、1時間半にわたって、室温で、上記細胞層上でインキュベートし得る。最後に、ウサギIgGを、HRPに結合させたヤギ抗ウサギIgG Fc抗体で検出する。ペルオキシダーゼ基質(Rocheの青色POD基質)を添加して、比色反応を行い、これを、1M HClで25分後に停止させ得る。吸光度を、450nmにおいて測定し得る。
本発明において記載されるFACS(蛍光活性化セルソーティング)ベースのスクリーニングシステムをここで例示し、このシステムは、B細胞レセプター(BCR)を介して目的の標的(特に、可溶性タンパク質)に結合し得るB細胞を選択し得る。この実施例において、上記標的は、蛍光色素(PEおよびPerCP)で標識した一本鎖抗VEGF抗体ESBA903であった。リンパ球懸濁物を、組換え標的で免疫化したウサギの脾臓から調製した。次いで、細胞を、PEおよびPerCPで標識したscFvと、ならびにIgGに特異的な抗体(APC標識)もしくはIgMに特異的な抗体(FITC標識)と、インキュベートした。表面にIgGを発現するが、IgMを発現しないESBA903陽性B細胞をソートし、96ウェルプレート中に選択した(図2)。図2のパネルAに示されるように、リンパ球を、前方散乱および側方散乱に従ってゲート制御した。それらの中で、IgG+IgM−細胞(おそらく、記憶B細胞)を選択した(パネルB)。scFv−PEおよびscFv−PerCPで二重染色された細胞を、上記scFvに対する高アフィニティーIgGをコードすると予測した(パネルC)。最も明るい蛍光を示す細胞を、パネルDにおいて列挙したソーティング統計を用いて、96ウェルプレートにソートした。胸腺腫ヘルパー細胞株(EL4−B5:Zublerら,1985,J.Immunol.134(6):3662−3668を参照のこと)によって、選択されたB細胞を増殖させ、形質細胞へと分化させ、次いで、抗体を分泌させた。これらIgG分子の標的タンパク質に対するアフィニティーを、ELISAおよびBiacore測定によって確認した。動力学的パラメーターを、7個の選択されたクローンについて表1に示す。これらクローン(約200個のソートした細胞のプールに由来)は、低nM〜pM範囲で高い結合アフィニティーを示す。最後に、分泌IgG分子のmRNAを、6個の目的のクローンから単離し、そのCDRを、ESBATech 一本鎖フレームワーク RabTor(フレームワーク rFW1.4ともいわれる)にグラフト化した。
Zuberら Mutant EL−4 thymoma cells polyclonally activate murine and human B cells via direct cell interaction. J Immunol.1985;134(6):3662−3668。
上記で記載されたスクリーニングシステムは、上記標的が可溶性である場合、および組換えタンパク質が利用可能である場合に効率的に機能する。しかし、いくつかの目的の標的は、マルチスパン膜貫通タンパク質(例えば、GPCRおよびイオンチャネル)である。組換えタンパク質での伝統的な免疫化は、これらの場合において、得策ではないか、または不可能である。さらに、B細胞のFACS選択は、上記抗原が内在性膜タンパク質である場合に、精製され標識されたタンパク質の結合に基づいて行うことができない。これらの課題に対処するために、上記の手順の以下の改善を行った。
DNAワクチン接種は、ネイティブ(native)抗原に対して迅速な免疫応答を誘導する。組換えタンパク質が必要とされないので、この技術は、一方で非常に費用効率的であり、他方で、より重要なことには、この方法は、内在性膜複合体および/もしくはマルチスパン膜タンパク質のネイティブ発現を可能にする。
フローサイトメトリーは、通常、単一の細胞がレーザービームを横切るときに、上記単一の細胞によって発せられる蛍光を測定する。しかし、いくらかの研究者らは、細胞−細胞相互作用(例えば、カドヘリンによって媒介される接着(Panorchanら,2006,J.Cell Science,119,66−74;Leong et Hibma,2005,J.Immunol.Methods,302,116−124)もしくはインテグリンによって媒介される接着(Gawazら,1991,J.Clin.Invest,88,1128−1134))を調査するために血球計算器を既に使用してきた。しかし、このような研究は、このような細胞−細胞相互作用がセルソーティングの物理的工程の間に損なわれないままであるか否かを実証しなかった。さらに、B細胞レセプターの、別の細胞の表面に存在するその標的への結合が、このような物理的ソーティングを許容にするのに十分強いことを決して示さなかった。
膜貫通タンパク質に対するB細胞スクリーニングを始める前に、細胞−細胞相互作用(および、特に、BCRと、標的細胞上の膜貫通タンパク質との間の相互作用)が、FACSで確かに選択され得ることを実証しなければならない。フローサイトメトリーストリームにおける高圧が、2個の細胞の間の非共有結合を壊すか否かを決定するために、以下の実験を行った。
J Pharmacol Exp Ther 2002;301:418〜26を参照のこと)で安定にトランスフェクトしたCHO細胞(B−220細胞)を、PE標識抗TNFα抗体でコーティングしたビーズとインキュベートした。この設定において、上記ビーズは、記憶B細胞を模倣する。陰性コントロールとして、トランスフェクトしていないCHO細胞を使用し、同様に、APC標識した非関連抗体(抗CD19)でコーティングしたビーズも使用した。撹拌しながら4℃で2時間にわたってインキュベートした後、上記細胞−ビーズ懸濁物を、FACS(130μmノズルを使用する)によって分析した。図3は、抗TNFαビーズとTNFαトランスフェクトしたCHO細胞との間の特異的結合が、FACSで明らかに検出可能であったことを示す。実際に、このサンプル(上部パネル)において、上記ビーズの約2/3が、細胞に結合した(585結合 対 267非結合)。対照的に、上記コントロールサンプル(中央パネルおよび下部パネル)において、ほとんどのビーズは、CHO細胞に結合しなかった。さらに、両方のビーズ集団(抗TNFα−PEおよび抗CD19−APC)を、TNFαトランスフェクトしたCHO細胞と一緒に混合した。図4は、抗TNFαビーズのうちの約1/2がCHO細胞に結合したのに対して、上記抗CD19ビーズのうちの大部分が、結合しないままであったことを示す。各サンプルにおける上記細胞に結合するビーズの割合を、表2に詳述する。従って、内在性標的膜タンパク質にそれらのB細胞レセプターを通じて結合する単一のB細胞の特異的選択が、フローサイトメトリーを使用して可能であったことが実証された。
図5に示される実験については、リンパ球を、抗TNFα抗体(ESBA105,内部で生成)で免疫化したウサギの脾臓もしくは免疫化していないウサギの脾臓のいずれかから単離した。それらを、抗ウサギIgG−APCおよび抗ウサギIgM−FITC(AbD serotec)で染色し、その後、記憶B細胞(IgG+/IgM−)の純粋な集団を得るために、予めソートした。並行して、TNFα発現CHO細胞(Dr.P Scheurich(Univ.of Stuttgart)によって寄付)に、1μg/mL カルセイン−レッド(Invitrogen)(生細胞を蛍光染色する細胞質色素)を添加した。次いで、これら細胞を、1回洗浄し100μg/mLのESBA105と(あるいは陰性コントロールについては、なし)インキュベートし、最後に、PBSで再び3回洗浄した。記憶B細胞を、約1:10の比率で上記CHO細胞と最終的に混合し、回転プレート上で、4℃で2時間の間インキュベートした(濃度:3×107細胞/mL)。
1)CHO−TNFα細胞+ESBA105+ESBA105で免疫化したウサギの記憶B細胞
2)CHO−TNFα細胞+ESBA105+免疫化していないウサギの記憶B細胞
3)CHO−TNFα細胞+ESBA105で免疫化したウサギの記憶B細胞 。
さらなる実験において、記憶B細胞の予備ソーティングは行わなかった。リンパ球集団全体を、染色したCHO−TNFα−ESBA105細胞とインキュベートした。トランスジェニックCHO細胞を、上記のように調製した。しかし、96ウェルプレートにおけるソート後にB細胞培養培地中でのそれらの増殖を妨げるために、上記細胞を、カルセイン染色の前にマイトマイシンC(M4287−2MG)処理することによって、細胞周期を停止させた。ESBA105免疫化ウサギのリンパ球を3:1の比で、上記染色したCHO細胞と混合し(細胞懸濁物の濃度:約3−107細胞/mL)、回転プレート上で、4℃で2時間の間インキュベートした。その後、上記細胞懸濁物を、FACS分析し、CHO−TNFα−ESBA105に結合している記憶B細胞を、図6に示されるゲートに従ってソートした(表3に示されるように、1細胞/ウェル、10細胞/ウェルもしくは100細胞/ウェルで)。ソートした細胞は、上記記憶B細胞集団のうちの5.5%(それぞれ、合計事象のうちの0.2%)を表した。
3羽のウサギを、CXCR2発現ベクターで免疫化した。CXCR2−cDNAの数回の皮内適用の後に、血清を採取し、CXCR2トランスフェクトした細胞で特異的抗体の存在について試験した。次いで、リンパ節細胞を取り出し、各1.6×107細胞ずつ5つのアリコートに分けて凍結し、液体窒素タンク中に保存した。
ホルムアルデヒドで、室温で30分間にわたって固定した。次いで、細胞層を、3回洗浄し、非特異的結合部位を、室温で1時間、細胞培養培地でブロックした。次に、3回の洗浄工程の後、上記上清を培養培地中で1:1希釈し、各ウェルに添加した。3個のコントロールウェルにおいて、市販のウサギ抗CXCR2抗体を、上清中に添加した。上清を、室温で1時間半、上記細胞層上でインキュベートした。最後に、ウサギIgGを、HRPに結合させたヤギ抗ウサギIgG Fc抗体で検出した。ペルオキシダーゼ基質(Rocheの青色POD基質)を添加して、比色反応を行って、1M HClで25分後に停止させた。吸光度を450nmで測定した。
本発明に対する多くの改変および代替の実施形態は、前述の説明に鑑みれば、当業者に明らかである。よって、この説明は、例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実施するためのベストモードを当業者に教示する目的である。構造の詳細は、本発明の趣旨から逸脱することなく実質的に変動し得、添付の特許請求の範囲内にある全ての改変の独占的な使用は確保され得る。本発明は、添付の特許請求の範囲および適用可能な法の支配によって必要とされる程度にのみ限定されることが意図される。
Claims (18)
- 目的の抗原に特異的に結合するイムノバインダーを同定するための方法であって、該方法は、
(a)非ヒト動物由来の複数のB細胞を提供する工程;
(b)該複数のB細胞を該目的の抗原と接触させる工程であって、該目的の抗原が第1のソート可能な標識を含む、工程、および該複数のB細胞を第2のソート可能な標識を含む抗IgG抗体および第3のソート可能な標識を含む抗IgM抗体で染色する工程;ならびに
(c)該複数のB細胞から該目的の抗原に特異的に結合することができる1つ以上のB細胞をセルソーターを使用することで分離する工程であって、複合体中の該第1および第2のソート可能な標識が存在するが、該第3のソート可能な標識は存在しないことが目的の抗原に対するB細胞の結合を示し、それによって該目的の抗原に特異的に結合するイムノバインダーを同定する、工程
を包含する、方法。 - 前記複数のB細胞が複数のリンパ球中に提供される、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において前記複数のB細胞が前記目的の抗原と接触させられる前に染色される、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において前記複数のB細胞が前記目的の抗原と接触させられた後に染色される、請求項1に記載の方法。
- 前記イムノバインダーの同定が、工程(c)において得られた前記B細胞をクローン的に単離し、必要に応じて、続いて、該クローン的に単離された細胞のクローン性増殖を行う工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- イムノバインダーをコードする核酸分子を単離するための方法であって、請求項5に記載の方法によって同定される、目的の抗原に結合する前記B細胞クローン由来のイムノバ
インダーをコードする核酸分子を単離する工程を含む、方法。 - 目的の抗原に結合することができるイムノバインダーを生成するための方法であって、該方法は、
(i)目的の抗原に特的に結合するイムノバインダーを同定する工程であって、
(a)非ヒト動物由来の複数のB細胞を提供する工程;
(b)該複数のB細胞を該目的の抗原と接触させる工程であって、該目的の抗原が第1のソート可能な標識を含む、工程、および該複数のB細胞を第2のソート可能な標識を含む抗IgG抗体および第3のソート可能な標識を含む抗IgM抗体で染色する工程;ならびに
(c)該複数のB細胞から該目的の抗原に特異的に結合することができる1つ以上のB細胞をセルソーターを使用することで分離する工程であって、複合体中の該第1および第2のソート可能な標識が存在するが、該第3のソート可能な標識は存在しないことが目的の抗原に対するB細胞の結合を示し、それによって該目的の抗原に特異的に結合するイムノバインダーを同定する、工程
を含む工程
(ii)請求項6に記載の方法により単離された、工程(c)によって同定された目的の抗原に結合する前記B細胞クローン由来のイムノバインダーをコードする前記核酸分子を、該コードされたイムノバインダーが生成されるように発現環境に導入することによって該イムノバインダーを生成する工程
を含む、方法。 - 抗体が培養培地に分泌されるように前記単離されたB細胞が適切な条件下で培養される、請求項1に記載の方法。
- 前記目的の抗原への特異的な結合に関して前記抗体が試験される、請求項8に記載の方法。
- 前記抗体がマウス、ウサギ、ラット、ハムスター、ヒツジ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ、またはヒト抗体である、請求項8に記載の方法。
- 前記ソート可能な標識が蛍光標識である、請求項1に記載の方法。
- 前記目的の抗原が可溶性抗原である、請求項1に記載の方法。
- 前記B細胞がウサギ由来のB細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記ウサギが目的の抗原で免疫化された、請求項13に記載の方法。
- 目的の抗原と特異的に結合する非ヒトB細胞クローンを同定するための方法であって、該方法は、
(a)非ヒト動物を目的の抗原で免疫化する工程;
(b)該免疫化した動物から複数のB細胞を単離する工程;
(c)該複数のB細胞を該目的の抗原と接触させる工程であって、該目的の抗原が第1のソート可能な標識を含む、工程、および該複数のB細胞を第2のソート可能な標識を含む抗IgG抗体および第3のソート可能な標識を含む抗IgM抗体で染色する工程;ならびに
(d)該複数のB細胞から該目的の抗原に特異的に結合することができる1つ以上のB細胞をセルソーターを使用することで分離する工程であって、複合体中の該第1および第2のソート可能な標識が存在するが、該第3のソート可能な標識は存在しないことが目的
の抗原に対するB細胞の結合を示し、それによって該目的の抗原に結合するB細胞クローンを同定する、工程
を包含する、方法。 - 前記ソート可能な標識が蛍光標識である、請求項15に記載の方法。
- 前記目的の抗原が可溶性抗原である、請求項15に記載の方法。
- 前記動物がウサギである、請求項15に記載の方法。
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