ES2618181T3 - Métodos para identificar inmunoaglutinantes de antígenos de superficie celular - Google Patents
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Abstract
Un método para identificar una célula que expresa anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de superficie celular de interés, que comprende: (a) proporcionar una pluralidad de células B que expresan anticuerpo originadas en un animal que se ha inmunizado con un antígeno diana o con ADN que codifica un antígeno de superficie celular, unido de forma funcional a un primer marcador clasificable; (b) proporcionar una pluralidad de células que expresan antígeno unidas de forma funcional a un segundo marcador clasificable, en el que el antígeno de interés se presenta en la superficie de la célula que expresa antígeno; (c) poner en contacto las células que expresan antígeno con las células que expresan anticuerpo; y (d) separar de la pluralidad de células que expresan anticuerpo, una o más células que expresan anticuerpo que pueden unirse específicamente a las células que expresan antígeno usando un clasificador celular, en el que la presencia del primero y segundo marcador clasificable en un complejo celular individual es indicativa de la unión de una célula que expresa anticuerpo a una célula que expresa antígeno, identificando de ese modo una célula que expresa un anticuerpo que se une a un antígeno de interés.
Description
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mantener, en el espacio tridimensional, las tres CDR encontradas en una región variable de anticuerpo de cadena pesada o ligera, de modo que las CDR puedan formar una superficie de unión a antígeno. Dichas regiones flanqueantes también pueden mencionarse como estructuras que proporcionan soporte para la presentación de las CDR más divergentes. Otras CDR y regiones flanqueantes de la superfamilia de inmunoglobulinas, tales como repeticiones de anquirina y fibronectina, pueden usarse como moléculas de unión a antígeno (véanse también, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.º 6.300.064, 6.815.540 y la publicación de Estados Unidos n.º 20040132028).
El término "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une específicamente una inmunoglobulina o anticuerpo. Un epítopo típicamente incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).
Las expresiones "unión específica", "unión selectiva", "se une selectivamente" y "se une específicamente" se refieren a la unión del anticuerpo a un epítopo en un antígeno predeterminado. Típicamente, el anticuerpo se une con una afinidad (KD) de aproximadamente menos de 10-7 M, tal como de aproximadamente menos de 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso inferior.
El término "KD", se refiere a la constante en equilibrio de disociación de una interacción particular de anticuerpoantígeno. Típicamente, los anticuerpos de la invención se unen a un antígeno con una constante en equilibrio de disociación (KD) de menos de aproximadamente 10-7 M, tal como menos de aproximadamente 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso inferior, por ejemplo, como se determina usando tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) en un instrumento BIACORE.
Como se usa en este documento, "identidad" se refiere a la coincidencia de secuencia entre dos polipéptidos, moléculas o entre dos ácidos nucleicos. Cuando una posición en las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma base o subunidad monomérica de aminoácido (por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, o una posición en cada uno de los dos polipéptidos está ocupada por una lisina), entonces las moléculas respectivas son idénticas en esa posición. El "porcentaje de identidad" entre dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones coincidentes compartidas por las dos secuencias dividida por la cantidad de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias son coincidentes, entonces las dos secuencias tienen un 60 % de identidad. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT comparten un 50 % de identidad (3 de las 6 posiciones totales son coincidentes). Generalmente, una comparación se hace cuando dos secuencias se alinean para dar la identidad máxima. Dicha alineación puede proporcionarse usando, por ejemplo, el método de Needleman et al., (1970) J. Mol. Biol. 48: 443453, implementado convenientemente por programas informáticos tales como el programa Align (DNAstar, Inc.). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también puede determinarse usando el algoritmo de
E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de restos ponderados PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud 1, 2, 3, 4, 5, o 6.
Secuencias "similares" son aquellas que, cuando se alinean, comparten restos de aminoácido idénticos y similares, donde restos similares son sustituciones conservativas para restos correspondientes de aminoácido en una secuencia de referencia alineada. A este respecto, una "sustitución conservativa" de un resto en una secuencia de referencia es una sustitución por un resto que es física o funcionalmente similar al resto de referencia correspondiente, por ejemplo, que tiene un tamaño, forma, carga eléctrica, propiedades químicas similares, incluyendo la capacidad de formar enlaces covalentes o de hidrógeno, o similares. Por tanto, una secuencia "modificada por sustitución conservativa" es una que difiere de una secuencia de referencia o una secuencia de tipo silvestre en que están presentes una o más sustituciones conservativas. El "porcentaje de similitud" entre dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones que contienen restos coincidentes o sustituciones conservativas compartidas por las dos secuencias dividida por la cantidad de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias son coincidentes y 2 de 10 posiciones contienen sustituciones conservativas, entonces las dos secuencias tienen un 80 % de similitud positiva.
Como se usa en este documento, la expresión "modificaciones conservativas de secuencia" pretende hacer referencia a modificaciones de aminoácidos que no afectan negativamente o alteran las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Dichas modificaciones conservativas de secuencia incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de nucleótidos y aminoácidos. Por ejemplo, pueden introducirse modificaciones por técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen aquellas en que el resto de aminoácidos se remplaza con un resto de aminoácido que tienen una cadena lateral similar. Las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen
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El método de cribado puede ser usando FACS para identificar y separar células que expresan anticuerpo en adherencia con células que expresan el antígeno correspondiente.
Expresión de antígeno
El antígeno diana para la preparación de anticuerpos puede ser cualquier proteína, péptido, nucleótido, carbohidrato, lípido y otras moléculas que son solubles o se expresan sobre la superficie celular o están integradas en la membrana plasmática. Los antígenos pueden ser nativos o sintéticos. Preferiblemente, un antígeno diana es una proteína o péptido. Ejemplos no limitantes de un antígeno diana incluyen CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8, CFTR, CIC-1, CIC-2, CIC-4, CIC-5, CIC-7, CIC-Ka, CIC-Kb, bestrofinas, TMEM16A, receptor de GABA, receptor de glicina, transportadores ABC, NAV1.1, NAV1.2, NAV1.3, NAV1.4, NAV1.5, NAV1.6, NAV1.7, NAV1.8, NAV1.9, receptor de esfingosina-1-fosfato (S1P1R), canal de NMDA, etc. En una realización, el antígeno diana es una proteína transmembrana. En otra realización, el antígeno diana es una proteína de múltiples dominios transmembrana, por ejemplo, receptores acoplados a proteína G (GPCR), canales de iones, etc.
La familia de GPCR tiene al menos 250 miembros (Strader et al., FASEB J., 9:745-754, 1995; Strader et al., Annu. Rev. Biochem., 63:101-32, 1994).se ha estimado que el uno por ciento de los genes humanos pueden codificar GPCR. Los GPCR se unen a una amplia diversidad de ligandos que varían desde fotones, aminas biogénicas pequeñas (es decir, epinefrina e histamina), péptidos (es decir, IL-8), hasta hormonas glucoproteicas grandes (es decir, hormona paratiroidea). Tras la unión a ligando, los GPCR regulan las rutas de señalización intracelular activando proteínas que se unen a nucleótidos de guanina (proteínas G). De forma interesante, los GPCR tienen homólogos funcionales en citomegalovirus y herpesvirus humanos, lo que sugiere que los GPCR se pueden haber adquirido durante la evolución por patogénesis vírica (Strader et al., FASEB J., 9:745-754, 1995; Arvanitakis et al., Nature, 385:347-350, 1997; Murphy, Annu. Rev. Immunol. 12:593-633, 1994).
El rasgo característico de la mayoría de GPCR que se conoce hasta ahora es que siete grupos de restos de aminoácidos hidrófobos están localizados en la estructura primaria y pasan a través (abarcan) la membrana celular en cada región de la misma. Se cree que los dominios representan hélices alfa transmembrana conectadas por tres bucles intracelulares, tres bucles extracelulares y dominios amino y carboxilo terminales (K. Palczewski et al., Science 289, 739-45 (2000)). La mayoría de GPCR tienen restos de cisteína conservados individuales en cada uno de los dos primeros bucles extracelulares que forman enlaces disulfuro que se cree que estabilizan la estructura de la proteína funcional. Las 7 regiones transmembrana se denominan TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6, y TM7. Se sabe bien que estas estructuras detalladas anteriormente son comunes entre las proteínas receptoras acopladas a proteína G y que las secuencias de aminoácidos correspondientes al área donde la proteína pasa a través de la membrana (región que abarca membrana o región transmembrana) y las secuencias de aminoácidos cerca de la región que abarca membrana a menudo están altamente conservadas entre los receptores. Por tanto, debido al alto grado de homología en los GPCR, la identificación de novedosos GPCR, así como la identificación de partes tanto intracelulares como extracelulares de dichos novedosos miembros, se consigue fácilmente por los expertos en la materia. A modo de ejemplo, el libro de Watson y Arkinstall (1994) proporciona las secuencias de más de 50 GPCR. El libro describe adicionalmente, para cada secuencia, los restos precisos que comprenden cada uno de los dominios transmembrana.
Los sitios de unión para ligandos pequeños de receptores acoplados a proteína G se cree que comprenden un bolsillo hidrófilo localizado cerca de la superficie extracelular y formado por varios dominios transmembrana receptores acoplados a proteína G, estando rodeado dicho bolsillo por restos hidrófobos de los receptores acoplados a proteína G. El lado hidrófilo de cada hélice transmembrana de receptor acoplado a proteína G se postula que está enfocado hacia dentro y forma el sitio de unión del ligando polar. TM3 se ha implicado en varios receptores acoplados a proteína G que tiene un sitio de unión a ligando, tal como incluyendo el resto aspartato en TM3. Adicionalmente, las serinas en TM5, una asparagina en TM6 y fenilalaninas o tirosinas en TM6 o TM7 también están implicadas en la unión del ligando. El sitio de unión al ligando para receptores de hormonas peptídicas y receptores con otros ligandos más grandes tales como glucoproteínas (LH, FSH, hCG, TSH), y las clases Ca2+/glutamato/GABA de receptores probablemente residen en los dominios y bucles extracelulares.
Un evento clave del cambio de receptor inactivo a activo es, los cambios conformacionales inducidos por ligando de las hélices transmembrana 3 (TM3) y 6 (TM6) de los GPCR que tienen 7 hélices transmembrana (U. Gether, y B. K. Kolbilka, J. Biol. Chem. 273, 17979-17982 (1998)). Estos movimientos de las hélices, a su vez, alteran la conformación de los bucles intracelulares del receptor para promover la activación de proteínas G heterotriméricas asociadas. Estudios de mutagénesis (S. Cotecchia, J. Ostrowski, M. A. Kjelsberg, M. G. Caron y R. J. Lefkowitz, J. Biol. Chem. 267, 1633-1639 (1992); E. Kostenis, B. R. Conklin y J. Wess, Biochemistry 36, 1487-1495 (1997); M. A. Kjelsberg, S. Coteechia, J. Ostrowski, M. G. Caron, y R. J. Lefkowitz, J. Biol. Chem. 267, 1430-1433 (1992)) demostraron que el tercer bucle intracelular (i3) media una gran parte del acoplamiento entre el receptor y la proteína G. Los bucles i3 expresados como minigenes también han demostrado competir directamente con receptores adrenérgicos por la unión a Gq (L. M. Luttrell, J. Ostrowski, S. Cotecchia, H. Kendal y R. J. Lefkowitz, Science 259, 1453-1457 (1993)), o pueden activar proteínas G como péptidos solubles en condiciones sin células (T.
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- (i)
- una región flanqueante de cadena pesada variable seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 4 y SEQ ID NO. 6; y/o
- (ii)
- una región flanqueante de cadena ligera variable de la SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 9.
En una realización preferida, la región flanqueante de cadena pesada variable está unida a una región flanqueante de cadena ligera variable mediante un enlazador. El enlazador puede ser cualquier enlazador adecuado, por ejemplo, un enlazador que comprende de 1 a 4 repeticiones de la secuencia GGGGS (SEQ ID NO. 10), preferiblemente un péptido (GGGGS)4 (SEQ ID NO. 8), o un enlazador como se describe en Alfthan et al., (1995) Protein Eng. 8:725-731.
En una realización más preferida, la región flanqueante aceptora de inmunoaglutinante es una secuencia que tienen al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, más preferiblemente al menos un 95 % de identidad, con la SEQ ID NO. 3. Más preferiblemente, la región flanqueante aceptora de inmunoaglutinante comprende o es la SEQ ID NO. 3.
En otra realización preferida, la región flanqueante aceptora de inmunoaglutinante es una secuencia que tienen al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, más preferiblemente al menos un 95 % de identidad, con la SEQ ID NO.
5. Más preferiblemente, la región flanqueante aceptora de inmunoaglutinante comprende o es la SEQ ID NO. 5.
En otra realización preferida, la región flanqueante aceptora de inmunoaglutinante es una secuencia que tienen al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, más preferiblemente al menos un 95 % de identidad, con la SEQ ID NO.
7. Más preferiblemente, la región flanqueante aceptora de inmunoaglutinante comprende o es la SEQ ID NO. 7.
Además, puede emplearse una región flanqueante de cadena pesada variable ejemplar de la SEQ ID NO. 1, que comprende adicionalmente uno o más restos de aminoácido que generalmente dan soporte a la conformación de las CDR derivadas de un inmunoaglutinante de conejo. En particular, dichos restos están presentes en una o más posiciones de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste en 24H, 25H, 56H, 82H, 84H, 89H y 108H (numeración AHo). Se demuestra que estas posiciones afectan a la conformación de las CDR y, por lo tanto, se contemplan para mutación para acomodar CDR donantes. Preferiblemente, dicho uno o más restos se seleccionan del grupo que consiste en: treonina (T) en la posición 24, valina (V) en la posición 25, glicina o alanina (G/A) en la posición 56, lisina (K) en la posición 82, treonina (T) en la posición 84, valina (V) en la posición 89 y arginina (R) en la posición 108 (numeración AHo).
En una realización preferida, dicha región flanqueante de cadena pesada variable es o comprende la SEQ ID NO. 4
o SEQ ID NO. 6. Ambas regiones flanqueantes de cadena pesada variable pueden combinarse, por ejemplo, con cualquier región flanqueante de cadena ligera adecuada.
Las secuencias descritas anteriormente son las siguientes (los restos X son sitios de inserción de CDR):
SEQ ID NO. 1: región flanqueante de cadena pesada variable de FW1.4(a43)
SEQ ID NO. 2: región flanqueante de cadena ligera variable de FW1.4(KI27)
SEQ ID NO. 3: región flanqueante de FW1.4
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SEQ ID NO. 4: región flanqueante de cadena pesada variable de rFW1.4
SEQ ID NO. 5: región flanqueante de rFW1.4
SEQ ID NO. 6: región flanqueante de cadena pesada variable de rFW1.4(V2)
SEQ ID NO. 7: región flanqueante de rFW1.4(V2)
SEQ ID NO. 8: enlazador
SEQ ID NO. 9: región flanqueante de cadena ligera variable sustituida de FW1.4
Por tanto, a diferencia del método general de Winter, la secuencia flanqueante usada para los métodos de
15 humanización de la invención no es necesariamente la secuencia flanqueante que muestra la mayor similitud de secuencia con la secuencia del anticuerpo no humano (por ejemplo, de conejo) del que se obtienen las CDR donantes. Además, el resto flanqueante que se injerta desde la secuencia donante para dar soporte a la conformación de las CDR no es necesario.
Las regiones flanqueantes del anticuerpo aceptor también pueden comprender una o más de las mutaciones
20 potenciadoras de estabilidad descritas en la solicitud provisional de Estados Unidos n.º de serie 61/075.692. Las sustituciones ejemplares que potencian la solubilidad en la región flanqueante de cadena pesada se encuentran en las posiciones 12, 103 y 144 (numeración (AHo). Más preferiblemente, la región flanqueante de cadena pesada comprende (a) serina (S) en la posición 12; (b) serina (S) o treonina (T) en la posición 103 y/o (c) serina (S) o
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