KR101817279B1 - 세포-표면 항원의 면역결합제를 동정하는 방법 - Google Patents

세포-표면 항원의 면역결합제를 동정하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 표면 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, scFv와 같은, 면역결합제를 동정하는 방법, 및 상기 방법에 따라서 동정된 조성물을 제공한다.

Description

세포-표면 항원의 면역결합제를 동정하는 방법 {METHODS FOR IDENTIFYING IMMUNOBINDERS OF CELL-SURFACE ANTIGENS}
본 발명은 세포 표면 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, scFv 항체와 같은, 면역결합제를 동정하는 방법을 제공한다.
항체, 이들의 접합체 및 유도체를 포함한, 면역결합제는 치료 및 진단제로서 상업적으로 매우 중요하다. 항체를 제조 또는 선별하기 위한 전통적인 방법은 통상적으로 가용성 항원을 이용한다. 그러나, 특정의 막-결합된 단백질 항원의 경우, 항원이 막으로부터 가용화 된다면, 항원 상의 입체형태 에피토프 (conformational epitopes)가 변형되어, 항체 제조 또는 선별에 실패하게 된다. 또한, 면역블로팅 및 친화성 크로마토그라피 방법에 있어서 주요 문제점 중 하나는 항원에 대한 친화성이 중간 정도인 항체를 선택하는 것이다. 이는 수많은 교차-반응성 또는 점착성 항체가 포함되어, 순차적 선별 공정에 부담이 되게 한다. 막-결합된 항원을 발현하는 세포가 항체 제조에 직접 사용되고 있지만, 세포-표면 항원에 대한 친화성이 높은 항체를 검출하고 농후화할 수 있는 효율적인 선별법이 아직까지 부족하다.
발명의 개요
본 발명은 세포 표면 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, scFv 항체와 같은, 면역결합제를 동정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 일반적으로 표지된 항원-발현 세포를 표지된 면역결합제-발현 세포와 접촉시키고 세포 분류기 (cell sorter)를 사용하여 항원-발현 세포에 결합하는 면역결합제-발현 세포를 분리시킴을 특징으로 한다. 이들 방법은 GPCRs와 같은, 내재막 단백질 (integral membrane proteins)에 존재하는 입체형태 에피토프에 대한 면역결합제의 신속하고 효율적인 동정에 특히 유용하다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법을 사용하여 동정되는, 단리된 면역결합제 및 면역결합제-암호화 핵산을 제공한다.
하나의 태양으로, 본 발명은 당해 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 면역결합제의 동정 방법을 제공한다. 본 방법은 제1의 분류가능 표지물에 기능적으로 결합되어 있는 다수의 면역결합제-발현 세포를 제공하고; 제2의 분류가능 표지물에 기능적으로 결합되어 있는 다수의 항원-발현 세포를 제공하며 (여기서 당해 항원은 상기 항원 발현 세포의 표면에 표시된다); 상기 항원-발현 세포와 상기 면역결합제-발현 세포를 접촉시키고; 다수의 면역결합제-발현 세포로부터, 세포 분류기 (예, 형광 활성화된 세포 분류기)를 사용하여 항원-발현 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 면역결합제-발현 세포 하나 이상을 분리시키며, 여기서 단일 세포 복합체 (예, 항원과 B-세포 수용체 사이에 형성된 복합체)인 제1 및 제2 분류가능한 표지물의 존재는 항원-발현 세포에 대한 면역결합제-발현 세포의 결합 지표로, 이에 의해 당해 항원에 결합하는 면역결합제를 동정하게 됨을 특징으로 한다.
양태로서, 상기 분리된 면역결합제-발현 세포는 클론적으로 분리된다. 양태로, 면역결합제-발현 세포를 클론적으로 팽창시킨다. 다른 양태로, 상기 면역결합제-암호화 핵산 서열은 면역결합제-발현 세포로부터 단리된다. 면역결합제-암호화 핵산 서열의 적합한 분리법으로는 PCR, 예, 단일-세포 PCR이 있다. 면역결합제-암호화 핵산 서열은 세포를 클론적으로 분리시킨 후 및(또는) 클론 팽창시킨 후 분리시킬 수 있다.
양태로서, 본 발명의 방법을 사용하여 분리된 면역결합제-발현 세포를 세포-기반 검정하여 면역결합제를 기능적으로 특징화한다. 적합한 세포-기반 검정법으로는 CELISA가 있다.
양태로서, 상기 면역결합제가 항체이다. 그러한 항체로는, 쥐, 토끼, 토끼화, 닭, 낙타, 낙타화, 인간, 인간화 및 키메릭 항체가 있다. 적합한 항체 포맷으로는 제한없이, Fab, Dab, 나노바디 (Nanobody) 및 scFv가 있다.
양태로, 당해 항원이 이종성 유전자로부터 발현된다. 다른 양태로, 당해 항원이 유전자 조작된 항원이다. 다른 양태로, 당해 항원이 내재막 단백질이다. 적합한 내재막 단백질로는 비제한적으로, GPCRs (예, CXCR2) 또는 이온 채널이 있다.
양태로서, 제1 또는 제2 분류가능한 표지물이 형광 표지물이다. 적합한 형광 표지물로는 비제한적으로, 형광 단백질, 항체/플루오르 접합체 및 형광 세포 표지물이 있다.
양태로서, 항원-발현 세포가 효모 또는 포유동물의 세포 (예, 인간 세포)이다. 양태로서, 항원-발현 세포는 외인성 항원을 발현시킨다. 양태로서, 항원-발현 세포를 발현 벡터로 형질감염시킨다.
양태로서, 면역결합제-발현 세포가 효모 또는 포유동물의 세포이다. 적합한 포유동물의 세포로는, 비제한적으로, B-세포, 예를 들면, 토끼 B-세포가 있다. 양태로, 상기 B-세포가 면역화된 동물, 예를 들면 DNA 백신화에 의해 면역화된 동물로부터 분리된다. 양태로서, 면역결합제-발현 세포가 발현 벡터로부터 발현된 면역결합제를 포함한다.
다른 태양으로, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 동정된 면역결합제를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
다른 태양으로, 본 발명은 본 발명에 의해 동정된 면역결합제-암호화 핵산 서열을 암호화된 면역결합제가 생산되도록하는 발현 환경에 도입시킴을 특징으로 하여, 당해 항원에 결합할 수 있는 면역결합제를 생산하는 방법을 제공한다.
다른 태양으로, 본 발명은 본 발명의 방법으로 생산된 면역결합제를 제공한다.
다른 태양으로, 본 발명은 또한 동물을 세포 표면 항원을 암호화하는 DNA로 면역시키고; 면역화된 동물로부터 B-세포를 분리시키며; 상기 B-세포를 제1 분류가능한 표지물로 표지시키고; 제2 분류가능한 표지물에 기능적으로 결합되어 있는, 다수의 항원-발현 세포를 제공하여 (여기서 당해 항원은 항원 발현 세포의 표면에 표시된다); 세포 분류기를 사용하여 상기 항원-발현 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 B-세포 하나 이상을, 상기 다수의 B-세포로부터 분리 (여기서, 단일 세포 복합체중 상기 제1 및 제2의 분류가능한 표지물의 존재는 항원-발현 세포에 대한 B-세포의 결합 지표로서, 이에 의해 당해 항원에 결합하는 B-세포 클론을 동정할 수 있다)함을 특징으로 하여, 당해 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 B-세포 클론을 동정하는 방법을 제공한다.
도 1은 세포내 염료 3으로 염색한 표적-발현 세포와 상호반응하는 형광 항체 2로 표지시킨 B-세포를 도식적으로 나타낸 것이다. (4: 선택된 표적/항원; 5: B 세포 수용체 (BCR)).
도 2: ESBA903 가용성 표적에 결합하는 토끼의 B 세포의 FACS 선택공정. 도 2A: 림프구는 전방에 따라서 통과되고 측면에서 흩어진다. 도 2B: 이들 중에서 IgG+ IgM- 세포 (아마도 메모리 B 세포)가 선택된다 (원으로 나타냄). 도 2C: ESBA903-PE 및 ESBA903-PerCP (원으로 나타냄)로 이중-염색된 세포는 ESBA903에 대한 고친화성 IgGs를 암호화할 것으로 기대된다. 가장 밝은 형광을 나타내는 세포 (원으로 표시되지 않음)를 96개-웰 플레이트에서 분류한다.
도 3: 항-TNF알파 항체로 코팅한 비드 (PE 표지)는 TNF알파-형질감염된 CHO 세포에 결합한다 (상부 패널). 항-CD19 항체로 코팅한 대조용 비드 (APC 표지)는 TNF알파-형질감염된 CHO 세포에 결합하지 않는다 (중간 패널). 항-TNF알파 항체로 코팅한 비드 (PE 표지)는 야생형 (wt) CHO 세포에 결합하지 않는다 (하부 패널). 좌측의 점 플롯은 전방과 측면 흩어짐을 나타내는 것으로, 각각 이벤트의 크기와 입상도를 나타낸다. 단일 비드 (대략 3 ㎛) 집단은 P2에서 통과한다. 궁극적으로 비드 (대략 3 ㎛)에 결합된 CHO 세포는 P1에서 통과한다. 중간의 점 플롯은 이들의 PE 또는 APC 염색에 대한 P1 이벤트 (CHO 세포)를 나타낸다. 따라서, 항-TNF알파 비드와 상호반응하는 세포는 P3 게이트에 나타나며, 항-CD19 비드와 상반응하는 세포는 P4 게이트에 나타난다. 우측에, 각 샘플에 대한 통계가 세부적으로 제시되어 있다.
도 4: 항-TNF알파-PE로 코팅된 비드와 항-CD19-APC로 코팅된 비드를 TNF알파-형질감염된 CHO 세포와 함께 혼합한다. CHO 세포가 통과하고 (P1), 이들 중에서, 항-TNF알파PE 코팅된 비드 또는 항-CD19-APC 코팅된 비드에 결합하는 세포는 각각 P3 및 P4에 나타난다. 미결합 비드는 게이트 P2에서 볼 수 있다.
도 5a: 3개의 CHO-TNF알파-메모리 B 세포 현탁액의 FACS 분석. 상부 좌측: 세포 현탁액이 전방과 측면에서 흩어짐을 나타내는 점 플롯. 유전자전이 CHO 세포의 거대 집단과 메모리 B 세포의 소집단을 포함하는 살아있는 세포가 통과된다. 하부 좌측: APC 및 FITC 형광을 나타내는 점 플롯. 여기서, 메모리 B 세포 (IgG+/IgM-)가 통과된다. 이들 2개의 점 플롯은 3개의 샘플 모두에 대해 동일하다; 따라서, 이들은 단지 1회 나타난다.
도 5b: 3개의 샘플의 히스토그램 및 집단 계통: 상부: ESBA105 면역화된 토끼의 CHO-TNF알파 세포 + ESBA105 + 메모리 B 세포; 중간: 비-면역화된 토끼의 CHO-TNF알파 세포 + ESBA105 + 메모리 B 세포; 하부: ESBA105 면역화된 토끼의 CHO-TNF알파 세포 + 메모리 B 세포. 히스토그램에서, CHO 세포에 결합하는 메모리 B 세포가 통과된다.
도 6: ESBA105로 "코팅된" TNF알파 유전자전이 CHO 세포와 혼합된 면역화되림프구로 이루어진 현탁액의 FACS 분석. 도 6a: 현탁액인 전방과 측면에서 흩어짐을 나타내는 점 플롯. 유전자전이 CHO 세포의 거대 집단과 림프구의 소집단을 포함하는 살아있는 세포가 통과된다. 도 6b: APC 및 FITC 형광을 나타내는 점 플롯. 여기서, 메모리 B 세포 (IgG+/IgM-)가 통과된다. 도 6c: 통과된 메모리 B 세포의 칼세인 형광을 나타내는 히스토그램. 통과된 집단이 분류된다 (CHO-TNF알파-ESBA105 복합체에 결합하는 메모리 B 세포).
도 7: CHO-TNF알파(B220) 유전자전이 세포와 상호반응하는 항-TNF알파 IgG로 코팅된 비드의 명 필드 (bright field) 현미경 사진.
도 8: B 세포에 결합된 CHO-TNF알파/ESBA105 세포 (큰 세포) (이는 표면에 항-EABA105 항체 (더 작은 세포)를 갖는다)의 명 필드 현미경 사지 (좌측 컬럼) 및 형광 현미경 사진 (우측 컬럼).
상세한 설명
본 발명은 세포 표면 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, scFv 항체와 같은, 면역결합제를 동정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 일반적으로 표지된 항원-발현 세포를 표지된 면역결합제-발현 세포와 접촉시키고 세포 분류기 (cell sorter)를 사용하여 항원-발현 세포에 결합하는 면역결합제-발현 세포를 분리시킴을 특징으로 한다. 이들 방법은 GPCRs와 같은, 내재막 단백질 (integral membrane proteins)에 존재하는 입체형태 에피토프에 대한 면역결합제의 신속하고 효율적인 동정에 특히 유용하다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법을 사용하여 동정되는, 분리된 면역결합제 및 면역결합제-암호화 핵산을 제공한다.
하나의 태양으로, 본 발명은 당해 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 면역결합제의 동정 방법을 제공한다. 본 방법은 제1의 분류가능 표지물에 기능적으로 결합되어 있는 다수의 면역결합제-발현 세포를 제공하고; 제2의 분류가능 표지물에 기능적으로 결합되어 있는 다수의 항원-발현 세포를 제공하며 (여기서 당해 항원은 상기 항원 발현 세포의 표면에 표시된다); 상기 항원-발현 세포와 상기 면역결합제-발현 세포를 접촉시키고; 다수의 면역결합제-발현 세포로부터, 세포 분류기 (예, 형광 활성화된 세포 분류기)를 사용하여 항원-발현 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 면역결합제-발현 세포 하나 이상을 분리 (여기서 단일 세포 복합체 (예, 항원과 B-세포 수용체 사이에 형성된 복합체)인 제1 및 제2 분류가능한 표지물의 존재는 항원-발현 세포에 대한 면역결합제-발현 세포의 결합 지표로, 이에 의해 당해 항원에 결합하는 면역결합제를 동정할 수 있다)함을 특징으로 한다.
양태로서, 상기 분리된 면역결합제-발현 세포는 클론적으로 단리된다.
특정 양태로, 상기 클론적으로 단리된 면역결합제-발현 세포는 당해 분야의 숙련가에게 숙지된 방법을 사용하여 클론 팽창시킨다.
다른 양태로, 상기 면역결합제-암호화 핵산 서열이 면역결합제-발현 세포로부터 분리된다. 상기 핵산 서열의 분리는 클론 분리 후 또는 클론팽창 후 일어날 수 있다. 면역결합제-암호화 핵산 서열의 적합한 분리법으로는 PCR, 예, 단일-세포 PCR이 있다.
양태로서, 본 발명의 방법을 사용하여 분리된 면역결합제-발현 세포를 세포-기반 검정하여 면역결합제를 기능적으로 특징화한다. 적합한 세포-기반 검정법으로는 CELISA가 있다.
양태로서, 면역결합제가 항체이다. 그러한 항체로는, 쥐, 토끼, 토끼화, 닭, 낙타, 낙타화, 인간, 인간화 및 키메릭 항체가 있다. 적합한 항체 포맷으로는 제한없이, Fab, Dab, 나노바디 및 scFv가 있다.
양태로, 당해 항원이 이종성 유전자로부터 발현된다. 다른 양태로, 당해 항원이 유전자 조작된 항원이다. 다른 양태로, 당해 항원이 내재막 단백질이다. 적합한 내재막 단백질로는 비제한적으로, G-단백질 커플링된 수용체 (GPCRs (예, CXCR2)) 또는 이온 채널이 있다.
양태로서, 제1 또는 제2 분류가능한 표지물이 형광 표지물이다. 적합한 형광 표지물로는 비제한적으로, 형광 단백질, 항체/플루오르 접합체 및 형광 세포 표지물이 있다.
양태로서, 항원-발현 세포가 효모 또는 포유동물의 세포 (예, 인간 세포)이다. 양태로서, 항원-발현 세포는 외인성 항원을 발현시킨다. 양태로서, 항원-발현 세포를 발현 벡터로 형질감염시킨다.
양태로서, 면역결합제-발현 세포가 효모 또는 포유동물의 세포이다. 적합한 포유동물의 세포로는, 비제한적으로, B-세포, 예를 들면, 토끼 B-세포가 있다. 양태로, 상기 B-세포가 면역화된 동물, 예를 들면 DNA 백신화에 의해 면역화된 동물로부터 분리된다. 양태로서, 면역결합제-발현 세포가 발현 벡터로부터 발현된 면역결합제를 포함한다.
다른 태양으로, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 동정된 면역결합제를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
다른 태양으로, 본 발명은 본 발명에 의해 동정된 면역결합제-암호화 핵산 서열을 암호화된 면역결합제가 생산되도록하는 발현 환경에 도입시킴을 특징으로 하여, 당해 항원에 결합할 수 있는 면역결합제를 생산하는 방법을 제공한다.
다른 태양으로, 본 발명은 본 발명의 방법으로 생산된 면역결합제를 제공한다.
다른 태양으로, 본 발명은 또한 동물을 세포 표면 항원을 암호화하는 DNA로 면역시키고; 면역화된 동물로부터 B-세포를 분리시키며; 상기 B-세포를 제1 분류가능한 표지물로 표지시키고; 제2 분류가능한 표지물에 기능적으로 결합되어 있는, 다수의 항원-발현 세포를 제공하여 (여기서 당해 항원은 항원 발현 세포의 표면에 표시된다); 세포 분류기를 사용하여 상기 항원-발현 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 B-세포 하나 이상을, 상기 다수의 B-세포로부터 분리 (여기서, 단일 세포 복합체중 상기 제1 및 제2의 분류가능한 표지물의 존재는 항원-발현 세포에 대한 B-세포의 결합 지표로서, 이에 의해 당해 항원에 결합하는 B-세포 클론을 동정할 수 있다)함을 특징으로 하여, 당해 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 B-세포 클론을 동정하는 방법을 제공한다.
정의
본 발명의 이해를 더욱 용이하게 하기 위하여, 특정 용어를 다음과 같이 정의한다. 추가적인 정의는 상세한 설명을 통하여 기재된다.
용어 "항체"는 항체 전체 및 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분", "항원 결합 폴리펩티드", 또는 "면역결합제") 또는 이들의 단일쇄를 언급한다. "항체"는 이황화 결합에 의해 쇄간에 연결되어 있는 적어도 2개의 중쇄 (heavy: H) 및 2개의 경쇄 (light: L)를 포함하는 당단백질, 또는 이들의 항원 결합 부분을 언급한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (여기서는 VH로 약어로 표시)과 중쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3로 이루어져 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 ( 여기서는 VL로 약어로 표시) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어져 있다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 이루어져 있다. VH 및 VL 영역은 또한 프레임워크 영역 (FR)으로 명명된, 더욱 잘 보존된 영역과 함께 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명된, 초가변성 영역으로 나누어질 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음 순서로 아미노-말단에서부터 카복시-말단으로 배열된, 3개의 CDRs와 4개의 FRs로 이루어져 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호반응하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역글로불린이 면역 시스템의 여러가지 세포 (예, 효과기 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)을 포함하여, 숙주 조직 또는 인자에 대한 결합을 매개할 수 있다.
용어 "키메릭 항체"는 (a) 불변 영역, 또는 이의 부분이 변형, 대체 또는 교환되어 항원 결합 부위 (가변 영역)가 상이하거나 변형된 부류의, 효과기 기능 및(또는) 종의 불변 영역, 또는 키메릭 항체에 새로운 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예를 들면, 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 결합되어 있거나; (b) 가변 영역, 또는 이의 부분이 상이한 또는 변형된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변형, 대체 또는 교환되어 있는 항체 분자를 언급한다.
용어 항체의 "항원-결합 부분" (또는 단순하게 "항체 부분")은 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 단편 (예, TNF) 1개 이상을 언급한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포괄되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인, F(ab')2; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진, dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 342:544-546)과 같은, 단독 도메인; 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 (vii) 합성 링커에 의해 임의로 연결될 수 있는 2개 이상의 분리된 CDRs의 조합이 있다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, VL과 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩된다 하여도, 이들은 재조합 방법을 사용하여, VL과 VH 영역이 쌍을 이뤄 1가 분자 (단일쇄 Fv (scFv)로 공지; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조)를 형성하도록 이들이 단일 단백질 쇄가 되도록 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 상기와 같은 단일쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분"내에 포함된다. 이들 항체 단편은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 통상의 기술을 사용하여 수득하며, 단편을 본래의 항체와 동일한 방법으로 유용성에 대해 선별한다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 본래의 면역글로불린의 효소 또는 화학적 분할에 의해 제조할 수 있다. 항체는 상이한 동종형일 수 있으며, 예를 들면, IgG (예, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입), IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM 항체일 수 있다.
용어 "면역결합제"는 면역결합제가 표적 항원을 특이적으로 인식하는 것과 같이, 항체의 항원 결합 부위 모두 또는 일부, 예를 들면, 중쇄 및(또는) 경쇄 가변 도메인을 함유하는 분자를 언급한다. 면역결합제의 비-제한적 예로서 전장 면역글로불린 분자 및 scFv, 뿐만 아니라 비제한적으로 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인, F(ab')2; (iii) 필수적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab인, Fab' 단편 (참조: FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3. sup.rd ed. 1993); (iv) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (v) 항체의 단일 암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (vi) VH 또는 VL 도메인으로 이루어진, Dab 단편 (Ward et al., (1989) Nature 342:544-546), Camelid (참조: Hamers-Casterman, et al., Nature 363:446-448 (1993), 및 Dumoulin et al., Protein Science 1:500-515 (2002)) 또는 Shark 항체 (예, 상어의 Ig-NARs Nanobodies®)와 같은 단일 도메인 항체; 및 (vii) 단일 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 함유하는 중쇄 가변 영역인, 나노바디를 포함한, 항체 단편이 있다.
여기서 사용되는 바와 같은 용어 "기능적 특성"은 예를 들어, 폴리펩타이드의 제조 특성 또는 치료 효과를 개선하기 위하여, 개선 (예, 통상의 폴리펩타이드에 대해 상대적으로)이 요구되고(되거나) 당해 분야의 숙련가에게 유리한 폴리펩타이드 (예, 면역결합제)의 특성이다. 하나의 양태로, 기능적 특성이 향상된 안정성 (예, 열 안정성)이다. 다른 양태로, 기능적 특성이 향상된 가용성 (예, 세포 조건하에서)이다. 다른 양태로, 기능적 특성이 비-응집성이다. 또 다른 양태로, 기능적 특성이 발현 (예, 원핵 세포에서)에서의 개선이다. 다른 양태로, 기능적 특성이 체내 도입 후 정제 과정에 따른 리폴딩 (refolding) 수율에서의 개선이다. 특정 양태로, 기능적 특성이 항원 결합 친화성에서의 개선이 아닌 것이다.
용어 "프레임워크 (frameworks)"는 더욱 분기적인 CDR 영역 사이에 존재하는 항체 가변 영역의 기술 인식된 부분을 언급한다. 그러한 프레임워크 영역을 전형적으로 프레임워크 1 내지 4 (FR1, FR2, FR3, 및 FR4)로 언급하며 CDRs가 항원-결합 표면을 형성할 수 있도록 하는 것과 같이, 중쇄 또는 경쇄 항체 가변 영역에서 발견되는 3개의 CDRs를 3차원 공간에서 유지시키기 위한 스캐폴드를 제공한다. 그러한 프레임워크는 또한 이들이 더욱 분기적인 CDRs의 표현을 위한 지지체를 제공하는 것과 같이 스캐폴드로 언급될 수 있다. 안키린 반복체 (ankyrin repeats) 및 피브로넥틴과 같은, 면역글로불린 슈퍼족의 다른 CDRs 및 프레임워크가 항원 결합 분자로 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,300,064호, 제6,815,540호 및 미국 공개 공보 제20040132028호 참조).
용어 "에피토프" 또는 "항원결정기"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원상의 부위를 언급한다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 배열에 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 다음 문헌을 참조한다: Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996).
용어 "특이적 결합", "선택적 결합", "선택적으로 결합한다", 및 "특이적으로 결합한다"는 예정된 항원 상에서 에피토프에 결합하는 항체를 언급한다. 전형적으로 항체는 대략 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만 또는 훨씬 더 낮은 것과 같이, 대략 10-7 M 미만의 친화성 (KD)을 갖고 결합한다.
용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호반응의 해리 평형 상수를 언급한다. 전형적으로, 본 발명의 항체는, 예를 들어, BIACORE 장치로 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술을 사용하여 측정한 바, 대략 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만 또는 훨씬 더 낮은 것과 같이, 대략 10-7 M 미만의 해리 평형 상수로 항원에 결합한다.
여기서 사용되는 바와 같은 "동일성 (identity)"은 2개의 폴리펩타이드, 분자 간 또는 2개의 핵산 간의 서열 매칭을 언급한다. 2개의 비교된 서열 모두의 위치를 동일한 염기 또는 아미노산 모노머 서브유니트가 차지한 경우 (예를 들어, 2개의 DNA 분자 각각에서의 위치를 아데닌이 차지한 경우), 각각의 분자는 해당 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 "동일성 퍼센트"는 x100 비교된 위치의 수로 나눈 두 서열에 의해 공유된 매칭 위치의 수의 함수이다. 예를 들어, 두 서열에서 위치 10개 중 6개가 매치되는 경우, 두 서열의 동일성은 60%이다. 일례로, DNA 서열 CTGACT 및 CAGGTTT는 50% 동일성을 공유한다 (총 6개의 위치중 3개가 매치된다). 일반적으로, 최대의 동일성을 위하여 두 서열을 정렬했을 때 비교한다. 그러한 정렬은 Align program (DNAstar, Inc.)와 같은 컴퓨터 프로그램으로 편리하게 수행되는, 예를 들어, 문헌: Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453의 방법을 사용하여 제공될 수 있다. 두 아미노산 서열 간의 동일성 퍼센트는 또한 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하는, ALIGN 프로그램 (2.0 버전)에 포함시킨, E. Meyers and W. Miller의 알고리즘 (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))을 사용하여 측정할 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 간의 동일성 퍼센트는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스와 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량을 사용하는, GCG 소프트웨어 팩키지 (www.gcg.com에서 입수가능) 중 GAP 프로그램에 포함시킨 Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) 알고리즘을 사용하여 측정할 수 있다.
"유사한" 서열은 정렬되었을 때, 동일하고 유사한 아미노산 잔기를 공유하는 것들로, 여기서 유사한 잔기는 정렬된 참고용 서열 중 대응하는 아미노산 잔기를 대신하는 보존적 치환이다. 이에 대하여, 참고 서열에서의 잔기의 "보존적 치환"이란 대응하는 참고 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한 잔기로 치환되는 것으로, 예를 들면, 공유 또는 화학 결합을 형성할 수 있는 능력 등을 포함하여, 유사한 크기, 형태, 전기적 전하, 화학적 특성을 갖는 것이다. 따라서, "보존적 치환 개질된" 서열은 보존적 치환이 1개 이상 존재하는 참고 서열 또는 야생형 서열과 다른 것이다. 두 서열 간 "유사성 퍼센트"는 x100 비교된 위치의 수로 나눈 두 서열에 의해 공유된 매칭 잔기 또는 보존적 치환을 함유하는 위치의 수의 함수이다. 예를 들어, 두 서열의 위치 10개 중 6개가 매칭되고 10개 중 2개는 보존적 치환을 함유한다면, 두 서열의 포지티브 유사성은 80%이다.
여기서 사용되는 바와 같은 용어 "보존적 서열 개질"은 네가티브하게 영향을 주거나 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징을 변화시키지 않는 아미노산 개질을 언급하고자 함이다. 그러한 보존적 서열 개질로는 뉴클레오티드 및 아미노산 치환, 첨가 및 결실이 있다. 예를 들어, 부위-지시된 돌연변이 및 PCR-매개된 돌연변이와 같이, 당해 분야에 공지된 표준 기술로 개질을 도입시킬 수 있다. 보존적 아미노산 치환으로는 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체한 것들이 있다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 족은 당해 분야에 정의되어 있다. 이들 족으로는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산 (예, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 있다. 따라서, 예측되는 비필수 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 족으로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환의 동정 방법은 당해 분야에 숙지되어 있다 (예를 들어, Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 및 Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997) 참조).
여기서 사용되는 바와 같은 "아미노산 공통서열"은 적어도 2개, 바람직하게는 그 이상의 정렬된 아미노산 서열의 매트릭스를 사용하여, 정렬 중 갭이 각각의 위치에서 가장 흔한 아미노산 잔기를 결정할 수 있도록 하여 발생시킬 수 있는 아미노산 서열을 언급한다. 공통서열은 각각의 위치에서 가장 빈번하게 나타나는 아미노산을 포함하는 서열이다. 2개 이상의 아미노산이 단일 위치에서 동등하게 표시되는 경우, 공통서열은 이들 아미노산을 둘다 또는 모두 포함한다.
단백질의 아미노산 서열은 여러 가지 레벨로 분석할 수 있다. 예를 들어, 보존 또는 변이성은 단일 잔기 레벨, 다중 잔기 레벨, 갭을 갖는 다중 잔기 등에서 표시할 수 있다. 잔기는 동일한 잔기의 보존을 나타낼 수 있거나 클래스 레벨에서 보존될 수 있다. 아미노산 클래스의 예로는 극성이지만 하전되지 않은 R 그룹 (세린, 트레오닌, 아스파라긴 및 글루타민); 양으로 하전된 R 그룹 (리신, 아르기닌, 및 히스티딘); 음으로 하전된 R 그룹 (글루탐산 및 아스파르트산); 소수성 R 그룹 (알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 발린 및 티로신); 및 특별 아미노산 (시스테인, 글리신 및 프롤린)이 있다. 기타 클래스가 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 치환성을 평가하기 위한 구조 결정법 또는 기타 데이타를 사용하여 정의할 수 있다. 그런 의미에서, 치환가능한 아미노산은 치환될 수 있고 그 위치에서 기능적 보존을 유지할 수 있는 아미노산을 언급할 수 있다.
그러나, 동일 클래스의 아미노산은 이들의 생리학적 특성에 의한 정도로 변화될 수 있다. 예를 들어, 특정의 소수성 R 그룹 (예, 알라닌)은 다른 소수성 R 그룹 (예, 발린 또는 류신) 보다 더욱 친수성 (즉, 더 높은 친수성 또는 더 낮은 소수성)인 것으로 인식된다. 상대적인 친수성 또는 소수성은 당해-인지된 방법 (참조: 예를 들면 Rose et al., Science, 229:834-838 (1985) 및 Cornette et al., J. Mol. Biol., 195:659-685 (1987))을 사용하여 측정할 수 있다.
여기서 사용되는 바와 같이, 하나의 아미노산 서열 (예, 제1 VH 또는 VL 서열)을 다른 하나 이상의 추가 아미노산 서열 (예, 데이타베이스 중 하나 이상의 VH 또는 VL 서열)과 정렬할 때, 하나의 서열 (예, 제1 VH 또는 VL 서열) 중 아미노산 위치를 하나 이상의 추가의 아미노산 서열 중 "대응하는 위치"와 비교할 수 있다. 여기서 사용되는 바와 같은, "대응하는 위치"란 서열을 최적으로 정렬시켰을 때, 즉, 서열을 정렬시켜 최고의 동일성 퍼센트 또는 유사성 퍼센트를 성취할 때 비교되는 서열에서 대등한 위치를 나타낸다.
용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 언급한다. 핵산 분자는 단일사 또는 이중사일 수 있지만, 바람직하게는 이중사 DNA이다. 핵산이 다른 핵산 서열과의 기능적 관계에 있을 때 "기능적으로 연결"된다. 예를 들면, 프로모터 또는 인헨서는 서열의 전사에 영향을 줄 때 암호화 서열에 기능적으로 연결되어 있다.
용어 "벡터"는 연결되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 언급한다. 벡터의 타입 중 하나가 "플라즈미드"로, 이는 추가의 DNA 절편이 결찰될 수 있는, 환형의 이중사 DNA 루프를 언급한다. 다른 타입의 벡터는 바이러스성 벡터로, 여기에서는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈중으로 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포내에서 자가 복제할 수 있다 (예, 세균성 벡터는 세균 기원의 복제와 에피솜 포유동물 벡터를 갖는다). 다른 벡터 (예, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입시 숙주 세포의 게놈중으로 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다.
용어 "숙주 세포"는 발현 벡터가 도입된 세포를 언급한다. 숙주 세포는 세균, 미생물, 식물 또는 동물 세포일 수 있다. 형질전환되기 쉬운 세균은 에쉐리키아 콜리 (Escherichia coli) 또는 살모넬라 (Salmonella)와 같은 엔테로박테리아세 (enterobacteriaceae); 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)와 같은 바실라세 (Bacillaceae); 뉴모코커스 (Pneumococcus); 스트렙토코커스 (Streptococcus), 및 해모필러스 (Haemophilus) 인플루엔자 중 일원이다. 적합한 미생물은 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces erevisiae) 및 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)이다. 적합한 동물 숙주 세포주는 CHO (Chinise Hamster Ovary lines) 및 NS0 세포이다.
용어 "처치하다", "처치하는" 및 "처치"는 여기에 기재된 치료적 또는 예방적 방법을 언급한다. "처치"의 방법은 그러한 처치를 필요로 하는 환자에게, 예를 들면, GPCR-매개 질환 환자 또는 궁극적으로 그러한 질환에 걸릴 수 있는 환자에게, 질환 또는 재발하는 질환의 심화도 또는 증상 하나 이상을 방지, 치료, 지연, 감소시키거나, 그러한 처치의 부재하에서 기대되는 것 보다 환자의 생존을 연장시키기 위하여 본 발명의 항체를 투여하는 것이다.
용어 "유효 용량" 또는 "유효 투여량"은 목적하는 효과를 성취하거나 적어도 부분적으로 성취하기에 충분한 양을 언급한다. 용어 "치료적으로 유효 용량"은 질병 및 이미 질병을 앓고 있는 환자에서 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 정의된다. 이 용도에 유효한 양은 치료할 질병의 심화도 및 환자 자신의 면역 시스템의 일반적인 상태에 따른다.
용어 "환자"는 인간 또는 비-인간 동물을 언급한다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 조성물은 GPCR-매개 질환 환자를 처치하기 위하여 사용할 수 있다.
여기서 사용되는 바와 같은 용어 "토끼 (rabbit)"는 토끼과에 속하는 동물을 언급한다.
용어 "세포 분류기"는 검출가능한 "분류가능한" 표지물의 존재를 기본으로 하는 세포 분리 수단을 언급한다. 그러한 수단으로는 제한없이, 형광 활성화 세포 분류기가 있다. 제한없이, 형광 단백질, 예를 들면, Green 형광 단백질, 항체/플루오르 접합체 및 형광 세포 표지물, 예를 들면, 형광 칼슘 이오노포어 (ionophores)를 포함한, 세포 표지물을 분류가능한 표지물로서 사용할 수 있다.
용어 "세포 복합체"는 면역결합제-발현 세포 1개 이상에 결합되어 있는 항원-발현 세포 1개 이상을 언급하는 것으로, 여기서 결합은 항원-발현 세포의 표면상의 항원에 의해 매개된다. 일부 양태로, 면역결합제-발현 세포에 대한 항원-발현 세포의 결합은 항원-발현 세포의 표면상의 항원과 면역결합제-발현 세포의 표면상의 면역결합제 간의 직접적인 상호반응으로 이루어진다.
용어 "클론적으로 단리"란 세포 집단으로부터 개별적인 세포 클론의 단리를 위한 수단을 의미한다. 적합한 수단으로는, 제한없이, 한계 희석하여 세포를 각 웰이 더이상 단일 세포를 함유하지 않도록 멀티웰 플레이트로 옮기는 것이다.
용어 "면역결합제-암호화 핵산 서열을 수득"이란 면역결합제-발현 세포에 의해 발현된 면역결합제의 핵산 서열을 수득하기 위한 수단을 언급한다. 적합한 수단으로는 제한 없이, 면역결합제-발현 세포로부터 면역결합제-암호화 핵산 서열의 핵산 단리법, PCR 증폭 및 DNA 서열화를 포함한다. 일부 양태로, 면역결합제-암호화 핵산 서열은 단일 세포로부터 PCR에 의해 증폭되는 것으로, 즉, "단일 세포 PCR"이다.
용어 "외인성 항원"은 특정 숙주 세포에서 정상적으로 발현되지 않은 항원을 언급한다. 예를 들어, 외인성 항원은 숙주 세포로부터 상이한 계, 문, 강, 목, 속 또는 종으로부터 일 수 있으며, 예를 들면, 효모 세포에서 발현된 인간의 항원이 있다. 추가로 또는 달리, 외인성 항원은 동일한 종으로부터 일 수 있지마 숙주 세포에서 부적당하게 발현될 수 있으며, 예를 들면, 뇌세포에서 발현된 폐 특이적 항원이 있다. "외인성 항원"은 또한 정상적인 세포에서 정상적으로 발견되지 않는 항원 돌연변이체, 예를 들면, 폐 세포에서 발현된 암 특이적 돌연변이 항원이 있다.
용어 "유전자 조작된 항원"은 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 항원을 언급하는 것으로 키메라인 항원이 있거나 점 돌연변이, 결실 및(또는) 삽입을 함유한다. 달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 기술 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에 기재된 것들과 유사하거나 대등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재된다. 대립되는 경우, 정의를 포함한 본 발명의 명세서는 조절될 것이다. 또한, 재료, 방법, 및 실시예는 단지 설명을 하는 것이며 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 다양한 태양이 이후 더욱 상세하게 기재된다. 다양한 양태, 바람직한 것 및 범위가 뜻대로 조합될 수 있다. 또한, 특정 양태에 따라서, 선택된 정의, 양태 또는 범위를 적용시킬 수 없다.
본 발명은 항원을 발현시키는 세포와 함께 부착되어 있는 면역결합제-발현 세포를 동정하고 분리하기 위하여 FACS를 사용하는 선별법을 제공한다. 특정 양태로, 면역결합제가 항체이다.
항원 발현
항제 제조용 표적 항원은 가용성이거나 세포 표면상에서 발현되거나 혈장막에 통합되는 단백질, 펩타이드, 뉴클레오티드, 탄수화물, 지질, 및 기타 분자일 수 있다. 항원은 천연 또는 합성일 수 있다. 바람직하게는, 표적 항원이 단백질 또는 펩타이드이다. 표적 항원의 비-제한적 예로서 CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8, CFTR, CIC-1, CIC-2, CIC-4, CIC-5, CIC-7, CIC-Ka, CIC-Kb, Bestrophins, TMEM16A, GABA 수용체, 글리신 수용체, ABC 운반체, NAV1.1, NAV1.2, NAV1.3, NAV1.4, NAV1.5, NAV1.6, NAV1.7, NAV1.8, NAV1.9, 스핑고신-1-포스페이트 수용체 (S1P1R), NMDA 채널 등이 있다. 하나의 양태로, 표적 항원이 막관통 단백질이다. 다른 양태로, 표적 항원이 멀티스팬 (multispan) 막관통 단백질, 예를 들면, G 단백질 커플링된 수용체 (GPCRs), 이온 채널 등이다.
GPCRs 족에는 적어도 250종이 있다 (Strader et al. FASEB J., 9:745-754, 1995; Strader et al. Annu. Rev. Biochem., 63:101-32, 1994). 인간 유전자의 1%가 GPCRs를 암호화할 수 있는 것으로 평가되었다. GPCRs는 광자, 작은 생체아민 (즉, 에피네프린 및 히스타민), 펩타이드 (즉, IL-8)부터 거대한 당단백질 호르몬 (즉, 부갑상선 호르몬)에 이르기까지 매우 다양한 리간드에 결합한다. 리간드 결합시, GPCRs는 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 (G 단백질)을 활성화시켜 세포내 시그날화 경로를 조절한다. 흥미롭게도, GPCRs는 인간 사이토메갈로바이러스 및 헤르페스바이러스 중의 기능성 동족체를 갖는데, 이는 GPCRs가 바이러스성 병원체발생을 위한 진화중에 요구될 수 있음을 제시하는 것이다 (Strader et al., FASEB J., 9:745-754, 1995; Arvanitakis et al. Nature, 385:347-350, 1997; Murphy, Annu. Rev. Immunol. 12:593-633, 1994).
지금까지 공지되어 있는 대부분의 GPCRs의 특징은 소수성 아미노산 잔기의 7개의 클러스터가 1차 구조에 위치하며 이들 각각의 영역에서 세포막을 통과 (걸친다: span)한다는 것이다. 상기 도메인은 3개의 세포내 루프, 3개의 세포외 루프, 및 아미노- 및 카복실-말단 도메인으로 연결된 막관통 알파-헬릭스를 나타내는 것으로 생각된다 (K. Palczewski et al., Science 289, 739-45 (2000)). 대부분의 GPCRs는 기능성 단백질 구조를 안정화시키는 것으로 생각되는 이황화 결합을 형성하는 제1의 세포외 루프 2개 각각에 단일 보존된 시스테인 잔기를 갖는다. 상기 7개의 막관통 영역을 TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6, 및 TM7으로 표시한다. 상기에서 상세하게 설명된 이들 구조는 G 단백질 커플링된 수용체 단백질 중에서 통상적이며 단백질이 막을 통과하는 지역 (막-스패닝 영역 또는 막관통 영역)에 대응하는 아미노산 서열 및 상기 막-스패닝 영역 근처의 아미노산 서열은 보통 상기 수용체사이에서 높게 보존되는 것으로 숙지되어 있다. 따라서, GPCRs에서의 높은 동족성 수준으로 인하여, 신규한 GPCRs의 동정, 뿐만 아니라 상기와 같은 신규 물질의 세포내 및 세포외 부분 둘 다의 동정은 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 수행된다. 실례로서, 여기서 참고로 인용되는 문헌: Watson and Arkinstall (1994)에 50종이 넘는 GPCRs의 서열이 제공되어 있다. 상기 문헌에는 또한 각 서열에 대한, 각각의 막관통 도메인을 포함하는 정확한 잔기가 기재되어 있다.
G-단백질 커플링된 수용체의 작은 리간드에 대한 결합 부위는 세포외 표면 근처에 위치하며 수개의 G-단백질 커플링된 수용체 막관통 도메인에 의해 형성되는 친수성 소켓을 포함하는 것으로 생각되며, 상기 소켓은 G-단백질 커플링된 수용체의 소수성 잔기로 둘러싸여 있다. 각각의 G-단백질 커플링된 수용체 막관통 헬릭스의 친수성 측면은 안쪽으로 대면하여 극성 리간드 결합 부위를 형성하는 것으로 가정된다. TM3은 TM3 아스파테이트 잔기를 포함하는 것과 같은, 리간드 결합 부위를 갖는 것으로 수개의 G-단백질 커플링된 수용체에 관련되어 있다. 또한, TM5 세린, TM6 아스파라긴 및 TM6 또는 TM7 페닐알라닌 또는 티로신이 또한 리간드 결합과 관련되어 있다. 펩타이드 호르몬 수용체 및 당단백질 (LH, FSH, hCG, TSH)와 같이 다른 더 큰 리간드를 갖는 수용체, 및 Ca2+/글루타메이트/GABA 부류의 수용체에 대한 리간드 결합 부위도 마찬가지로 세포외 도메인 및 루프 중 잔기를 갖는다.
수용체를 불활성 내지 활성으로 스위치하는데 있어서 중요한 것은 7개의 막관통 스패닝 헬릭스를 갖는 GPCRs의 막관통 헬릭스 3 (TM3) 및 6 (TM6)의 리간드-유발된 구조적 변화이다 (U. Gether, and B. K. Kolbilka, J. Biol. Chem. 273, 17979-17982 (1998)). 이들 헬릭스 움직임은 차례로 수용체의 세포내 루프의 구조를 변화시켜 관련된 헤테로트리머성 G 단백질의 활성화를 촉진한다. 돌연변이유발 연구 (S. Cotecchia, J. Ostrowski, M.A. Kjelsberg, M. G. Caron and R. J. Lefkowitz, J. Biol. Chem. 267, 1633-1639 (1992); E. Kostenis, B.R. Conklin and J. Wess, Biochemistry 36, 1487-1495 (1997); M. A. Kjelsberg, S. Coteechia, J. Ostrowski, M. G. Caron, and R. J. Lefkowitz, J. Biol. Chem. 267, 1430-1433 (1992))로 제3의 세포내 루프 (i3)가 수용체와 G 단백질간의 커플링 중 커다란 부분을 매개하는 것이 증명되었다. 미니유전자로 발현된 I3 루프가 또한 Gq 결합에 있어서 아드레날린성 수용체와 직접 경쟁하는 것으로 밝혀졌거나 (L.M. Luttrell, J. Ostrowski, S. Cotecchia, H. Kendal and R. J. Lefkowitz, Science 259, 1453-1457 (1993)), 세포-유리 조건에서 가용성 펩타이드로서 G 단백질을 활성화시킬 수 있는 것 (T. Okamoto et al., Cell 67, 723-730 (1991))으로 밝혀졌다.
당해 항원은 표적 세포 중 내인성 공급원의 것일 수 있다 (때로는 항원-발현 세포로 언급됨). 달리, 외인성 분자를 세포내로 도입시켜 항원을 발현시킬 수 있다. 항원을 세포내로 도입시키는 것은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법으로 실행할 수 있다. 하나의 양태로, 폴리펩타이드로서 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 벡터내로 시험관내 삽입할 수 있는데, 이 벡터는 추가로 발현용 표적 세포내로 도입될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 항원의 cDNA 서열, DNA 서열, 또는 당해 분야에 공지된 기타 서열을 함유할 수 있다. 상기 벡터는 플라즈미드, 코즈미드, 리포좀, 또는 당해 분야에 공지된 천연 또는 인공 벡터일 수 있다. 도입은 형질감염, 형질전환, 감염, 물질의 직접적인 마이크로-주사, 바이오리스틱 (biolistic) 입자 전달, 전기천공법 (electroporation), 또는 당해 분야에 공지된 기타 방법일 수 있다. 항원을 발현시키는 표적 세포는 예를 들어, 동물로부터 직접 획득한 세포, 예로서, 암세포, 비-암세포, 초기세포 등, 또는 분자조작한 세포, 예로서, 배양 세포 (예, Chinese Hamster Ovary (CHO) 세포, HEK293 세포 등), 불멸화 세포, 형질감염된/감염된 세포, T 세포 등을 포함하여, 당해 분야에 공지된 세포 중 하나일 수 있다. 달리, 표적 세포가 비-동물 기원, 예를 들면, 세균, 곤충 등으로부터 유래될 수 있다. 하나의 양태로, 표적 항원을 발현시키는 세포가 효모 세포, 바람직하게는 효모 스페로블라스트 (yeast spheroblasts)이다. 달리, 표적 "세포"는 인공 세포-유사체 또는 구조물, 예로서, 리포좀, 단일막 바디 (single-layer membrane body) 등일 수 있다. 표적 세포 또는 세포-유사체에서의 항원의 발현은 일시적, 즉, 발현이 비교적 단기간 후 (예, 수분 내지 수일) 약화되거나 중단될 수 있거나, 안정, 즉, 발현이 비교적 긴 시간 동안 (예, 수일 또는 여러 세대의 세포 발생 후) 비교적 안정한 수준으로 유지될 수 있다. 바람직한 양태로, 항원이 표적 세포의 플라즈마 막의 세포외 표면에서 발현된다. 다른 바람직한 양태로, 항원이 내재막 항원 또는 멀티스팬 (multispan) 막 항원이다. 플라즈마 막에 놓기 위하여, 항원을 이들 위치에서 직접 발현시킬 수 있거나, 표적 세포의 세포질에서 발현시킨 후, 이들 위치로 전좌시킬 수 있다. 상기 전좌는 표적 세포의 자연적 공정 또는 항원 발현 전 또는 후에, 예를 들어, 시그날/태그 분자 (예, Golgi 분류 시그날, 특정 막-결합 분자에 대한 항체 등)의 부착, 앵커링 그라프트 (anchoring graft; 예, 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커), 또는 항원에 대한 화학적 가교결합, 항원을 돌연변이시키는 것, 또는 당해 분야에 공지된 기타 방법에 의해 전좌시키는, 조작된 공정일 수 있다.
면역결합제-발현 세포 및 면역화
하나의 양태로, 여기에 기재된 방법으로 선택될 면역결합제-발현 세포는 포유동물의 B 세포, 바람직하게는 토끼의 B-세포이다.
바람직한 양태로, B 세포는 당해 표적으로 면역시킨 동물로부터 기원한다. 동물의 면역화는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법으로 실행할 수 있다. 전형적으로, B-세포는 면역화된 동물의 림프 기관 (예, 비장 또는 림프절)으로부터 단리된다.
바람직한 양태로, 당해 항원의 면역화를 DNA 면역화/백신화에 의해 수행한다. 달리, 표적 항원을 발현시키는 세포를 면역화를 위하여 동물 (예, 토끼, 래트, 마우스, 햄스터, 양, 염소, 닭 등)에 주사한다. 상기 면역화 단계에 바람직한 동물은 토끼이다. DNA 면역화/백신화는 신속한 면역 반응을 유발하며 표적 항원의 본래의 발현, 통상적으로 본래의 발현만 일어나도록 한다. 재조합 단백질의 발현 및 조작에는 연관이 없기 때문에, 본 공정은 재조합 단백질을 사용하는 전통적인 면역화 방법 보다 더욱 효율적이며 비용-효과적이다. 또한, 더욱 중요한 것은, 생체내 발현된 항원은 동일한 2차 구조를 갖고 있으며 심지어 천연적인 면에서 표적 단백질과 동일한 전사후 개질을 가질 수 있는데, 이는 표적 항원에 대해 제조된 항체에 의한 인식의 정확도를 향상시킨다. DNA 면역화의 일례가 캐나다 특허원 CA2350078 및 WO04/087216에 설명되어 있다. 상술한다면, 표적 항원으로서 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 유전자 총 방법 (gene gun method)을 통하여 동물에 직접 도입시켜, 동물에서 폴리펩타이드를 발현시키고, 이 발현으로 상기 폴리펩타이드에 대한 항체가 형성된다. 더욱 강력한 항체 형성을 성취하기 위하여, 소위 유전자 애주번트 (adjuvants)를 폴리펩타이드-암호화 DNA와 함께 동시에 적용시킨다. 이들 유전자 애주번트는 사이토킨 (예, GM-CSF, IL-4 및 IL-10)을 발현시키며 실험실 동물에서 체액성 면역 반응을 자극하는 플라즈미드이다. 바람직한 양태로, 표적 항원에 대한 항체가 B 세포 수용체 (BCR)로서 B 세포의 표면에서 발현된다. 다른 바람직한 양태로, 항체-발현 세포가 표면상에 IgM이 없는 것으로 특징되며 통상의 B 세포와 구별될 수 있는, 메모리 B 세포이다.
바람직한 양태로, 면역결합제-발현 세포가 효모 세포이고 면역결합제가 바람직하게는 항체 단편, 더욱 바람직하게는 scFv이다.
형광-활성화된 세포 분류법 (FACS)을 사용한 선별
면역화 단계 후, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 B 세포상의 막-결합된 항체를 비-특이적 항체를 발현시키는 다른 세포로부터 분리할 필요가 있다. 바람직한 양태로, 항원-항체 결합을 통하여, 혈장막에서 특이적 항체를 발현시키는 B 세포는 항원을 발현시키는 표적 세포에 부착된다. 다른 바람직한 양태로, 하나 이상의 상호반응 (예, 동일하거나 상이한 항원-항체 상호반응, 화학적 가교결합, 리간드-수용체 상호반응 등)이 B 세포와 표적 세포 사이에 일어날 수 있다. B 세포는 상이한 항체를 발현시키는 B 세포의 풀 (pool)로 존재할 수 있거나, 면역화된 동물로부터, 면역화된/비-면역화된 동물의 풀로부터, 또는 시험관내 조작 공정으로부터, 예를 들면, V(Ｄ)J 유전자 재조합 기술에 의해 상이한 항체를 발현시키는 B 세포의 라이브러리로부터 직접 수집한, 다른 면역 세포와 함께 존재할 수 있다.
표적 항원에 대해 특이적인 항체를 발현시키는 B 세포의 분리는 당해 분야에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 이들 방법으로는 비제한적으로, 항원상에서의 패닝, 제한된 희석, 친화성 정제, 또는 발현된 항체 또는 항체-생산 B 세포의 특징을 이용하는 기타 방법이 있다.
바람직한 양태로, 항원-발현 세포를 이후의 검출 및(또는) 부착된 B 세포의 단리에 유용한 tag로 표지시킨다. tag는 가교결합제, 항원/항체, 소분자 (예, 글루타티온 (GSH), 바이오틴/아비딘 등), 자기 입자, 형광 tag 등일 수 있다. 바람직한 양태로, 항원-발현 세포를 형광 단백질/펩타이드로 표지시킨다. 다른 양태로, 항체-생산 B 세포를 또한 tag로, 바람직하게는 상이한 형광 단백질/펩타이드로 표지시킨다. 또 다른 양태로, 항원-발현 세포에 부착되어 있는 B 세포를 B 세포상에 표지된 형광 단백질/펩타이드로부터 형광을 방출시켜 검출할 수 있다. 또 다른 양태로, 부착되어 있는 B 세포와 항원-발현 세포를 이들 상에 표지된 2개의 상이한 형광 단백질/펩타이드로부터 형광을 방출시켜 검출할 수 있다. 바람직한 양태로, 표적 항원에 특이적인 항체를 발현시키는 B 세포를 검출하고 이들 및 부착된 APCs상의 표지된 형광 단백질/펩타이드로부터 형광을 둘다에서 방출시켜 다른 항체-생산 B 세포로부터 추가로 분리할 수 있다. 바람직하게는, 상기 검출과 분리를 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 기술로 수행할 수 있다.
머리글자 FACS는 상표명이며 Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) 소유이다. 여기서 사용되는 바와 같은 용어 FACS는 세포 분류를 기본으로 하는 유세포 분석기의 형태를 나타내는 것이다.
형광-활성화된 세포 분류는 특화된 타입의 유세포 분석기이다. 이는 각 세포의 특이적 광 산란 및 형광 특성을 기본으로 하여, 시간에 따라 1종의 세포를, 생물학적 세포의 이종성 혼합물을 2개 이상의 용기로 분류하는 방법을 제공한다. 각각의 세포로부터 형광 시그날을 신속하고, 객관적이며 정량적으로 기록할 뿐만 아니라 특정의 세포를 물리적으로 분리하는 것과 같이, 유용한 과학 도구이다.
전형적인 FACS 시스템에서는, 세포 현탁액을 액체 스트림이 신속하게 유동되는 좁은 중심부에 넣는다. 상기 흐름 (flow)은 세포간에 이들의 직경에 비하여 큰 것이 분리되도록 배열된다. 진동 메카니즘으로 세포의 스트림이 각각의 소적으로 파괴시킨다. 상기 시스템은 소적으로 존재하는 세포가 1종 이상일 확률이 낮도록 조절한다. 스트림이 소적으로 파괴시키기 직전에 각 세포의 당해 형광 특성을 측정하는 형광 측정 스테이션을 통하여 상기 흐름 (flow)을 통과시킨다. 충전 고리 (electric charging ring)를 스트림이 소적으로 파괴하는 바로 그 지점에 배치한다. 직전의 형광 강도 측정치를 기준으로 하여 상기 고리에 전하를 가하고 스트림으로부터 파괴됨에 따라 소적 상에 반대 전하가 포획된다. 이어서 하전된 소적은 소적의 전하를 기본으로 용기내로 분류시키는 정전기 편향 시스템을 통하여 낙하한다. 어떤 시스템에서는 스트림에 전하를 직접 인가하여 소적이 파괴되면서 스트림과 동일한 사인 (sign)의 전하를 보유한다. 이어서 소적 파괴 후 상기 스트림을 중성으로 되돌린다.
FACS 기술에 대한 형광 표지물은 형광색소를 여기시키기 위하여 사용되는 램프 또는 레이져 및 입수가능한 검출기에 따른다. 단일 레이져 기계에 대해 가장 통상적으로 입수가능한 레이져는 청색 아르곤 레이져 (488 nm)이다. 이런 종류의 레이져에 대해 작동가능한 형광 표지물로는 비제한적으로, 1) 녹색 형광의 경우 (통상적으로 표지된 FL1): FITC, Alexa Fluor 488, GFP, CFSE, CFDA-SE, 및 DyLight 488; 2) 오렌지색 형광의 경우 (통상적으로 FL2): PE, 및 PI; 3) 적색 형광의 경우 (통상적으로 FL3): PerCP, PE-Alexa Fluor 700, PE-Cy5 (TRI-COLOR), 및 PE-Cy5.5; 및 4) 적외선 형광의 경우 (통상적으로 FL4; 일부 FACS 기계에서): PE-Alexa Fluor 750, 및 PE-Cy7이 있다. 다른 레이져 및 이들의 상응하는 형광 표지물로는 비제한적으로, 1) 적색 다이오드 레이져 (635 nm): Allophycocyanin (APC), APC-Cy7, Alexa Fluor 700, Cy5, 및 Draq-5; 및 2) 보라색 레이져 (405 nm): Pacific Orange, Amine Aqua, Pacific Blue, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI), 및 Alexa Fluor 405가 있다.
바람직한 양태로, B 세포를 표지된 항-IgG 및 항-IgM 항체로 염색하고 메모리 B 세포만 항-IgM 항체는 제외하고 항-IgG 항체로 포지티브하게 염색하는 것을 우선적으로 선택한다. 이로써 IgG는 일반적으로 IgM 보다 친화성이 더 높고; 표면에서 IgG는 발현시키지만 IgM은 발현시키지 않는 포지티브 B-세포 (이것이 메모리 B-세포에 대한 특징이다)가 선택된다. 상기 목적으로, 멀티칼라 염색법이 바람직하게 사용되는데, 여기서 IgG 및 IgM에 대해 특이적인 항체는 예를 들어, 각각 APC 및 FITC로 다르게 표지시킨다. 바람직하게는, 표적 항원 및(또는) 표적 항원을 발현시키는 표적 세포를 또한 표지시킨다. 하나의 양태로, 표적 항원을 발현시키는 세포를 세포내 형광 염료로 염색시킴으로써 표적 항원을 간접적으로 염색한다.
본 발명은 B 세포가 표적 항원을 발현시키는 세포에 부착하여 당해 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 B 세포를 동정하여 단리시킬 수 있는, B 세포 풀을 선별하기 위하여 FACS를 사용하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, B 세포를 형광 표지물로 표지시키고 표적 항원을 발현시키는 세포를 상이한 형광 표지물로 별도로 표지시킨다. 이들 표지물은 세포내, 세포외, 또는 혈장막에 통합된 것일 수 있다. 면역시켜 항체를 생산한 후, 모든 B 세포를 함께 모아 FACS 시스템에 통과시킨다. 표적 항원에 특이적인 항체를 생산하는 B 세포만이 항원-발현 세포에 부착될 것이다. 이들의 부착은 다른 각 세포간의 거대한 분리와 비교하여, 흐름중 이들 두 세포간의 거리를 단축시켜, 스캐닝 레이져 빔을 통과시킴과 동시에 검출가능한 "바이-칼라 이벤트 (bi-color event)"를 발생시킨다. 따라서, 당해 항체를 생산하는 B 세포를 동정하여 다른 비-특이적 B 세포와 상이한 수집 튜브로 분류시킬 수 있다.
다른 바람직한 양태로, B 세포와 대응하는 항원-발현 세포간 상호반응으로 세포 특징, 예를 들어, 탈분극, 형광 공명 에너지 전이 (FRET) 등을 일정 부분 개질시키는 경우, 형광성이 더 큰 표지물을 상기와 같이 개질시킬 수 있는 세포에 첨가할 수 있다. 따라서, B 세포와 항원-발현 세포가 접촉하게 되면 "트리-칼라" 이벤트 또는 동시에 3가지 이상의 색상을 함유하는 이벤트가 일어날 것이다.
달리, 부착된 상태의 B 세포의 동정 및 분류에는 형광 표지물이 존재할 필요가 없다. 하나의 양태로, 세포-세포 상호반응으로 세포 중 하나에서 기능적 변화가 일어난다. 다른 양태로, 이들 기능적 변화를 사용하여 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 B 세포를 동정하고 추가로 분리할 수 있다. 예를 들어, 세포-세포 상호반응으로 세포 중 하나에서 수용체 시그날화를 기능적으로 차단하거나 활성화시킬 수 있어, FACS 시스템으로 검출가능한 세포 변화, 예를 들면 Ca2 + 유출 변화 등을 일으킨다. 따라서, 이들 검출가능한 기능적 변화를 모니터함으로써, 당해 B 세포를 또한 동정하고 분리할 수 있다. 수용체 시그날화를 기능적으로 차단하거나 활성화시키는 특정 양태 중 하나가 B-세포를 GPCR (G-단백질-커플링된 수용체)을 기능적으로 발현시키는 세포와 함께 배양 (incubating)시키는 것이다. GPCR을 통하여 시그날을 상기 혼합물에 가하여 GPDR을 유발시킬 수 있는 효능제는 소포체로부터 Ca2 + 유출되는 것을 매개한다. B-세포에 존재하는 항체가 효능제 시그날화를 기능적으로 차단하는 경우, Ca2 + 유출은 결과적으로 상기 세포-세포 상호반응에 의해 차단된다. Ca2 + 유출은 예를 들어, 유세포 분석기로 정량적으로 측정할 수 있다. 따라서, Ca2 + 유출에서의 증가 또는 감소를 나타내는 B-세포/표적 세포 집합체만이 분류된다.
단리된 B 세포에 의해 생산된 항체에 대한 친화성 분석
특정 양태로, B-세포를 항체가 배양 배지로 분비되도록 하기에 적합한 조건하에서 배양한다. 상기 생산된 항체는 예를 들면, 모노클로날 항체이다. 배양에 흉선종 헬퍼 세포주 (예, EL4-B5, 참조: Zubler et al., 1985, J. Immunol., 134(6):3662-3668)와 같은 헬퍼 세포주를 사용할 수 있다.
임의로, 단리된 B 세포에 의해 생산된 항체의 선택성 및 경쟁 능력을 평가하기 위한 추가 공정 전에 추가의 친화성 검정법을 수행할 수 있다. 이들 검정법으로는 비제한적으로, 세포-기반 검정법 (예, 세포 ELISA (CELISA), 이는 전체 세포를 코팅용으로 사용하는 개량된 ELISA 공법이다)이 있다. CA2350078에 논의된 바와 같이, CELISA는 하기 실시예에 기재되는 바와 같이 실시할 수 있다. 검증 (validation) 단계를 수행하여 표적에 대한 특이적 결합용으로 발생된 항체를 예를 들면, 표적 단백질 이외의 세포 표면에서 발현되는 단백질에 대해 지시되는 항체를 배제시키기 위하여 시험한다.
달리, 동정되어 단리된 당해 B 세포를 항체 친화성에 대해 직접 조사할 수 있으며 B 세포를 공정 전에 부착된 항원-발현 세포로부터 분리시킬 수 있다.
항체 생산을 위하여 단리된 B 세포의 추가 가공
동정되고 단리되며, 임의로 친화성 검정법 (예, CELISA)으로 시험된 B 세포를 당해 면역결합제를 생산하기 위하여 추가로 가공할 수 있다. 예를 들어, 전통적인 하이브리도마 기술 (hybridoma technique)을 사용할 수 있다. 이는 면역결합제의 정제, 이들의 아미노산 서열 및(또는) 핵산 서열의 설명과 같은 단계를 포함한다.
달리, 결합제의 특성화는 이들의 scFv 포맷으로 수행한다. 이 방식의 경우 분류된 B-세포에서 발현된 결합제의 CDR 서열을 배양된 분류 세포 또는 단일 세포로부터 직접 RT-PCR에 의해 복원시킨다. 부분적으로 중첩되는 올리고뉴클레오티드 풀 2개 (여기서 올리고뉴클레오티드 풀 중 하나는 CDRs에 대해 암호화하고 제2의 풀은 적합한 scFv 스캐폴드의 프레임워크 영역을 암호화한다)를 합하면 1-단계 PCR 공정으로 인간화된 scFv가 발생되도록 한다. HT 서열화, 클로닝 및 생산으로 세포 배양 상등액중 분비된 IgG의 특성화 대신, 정제된 인간화 scFv의 성능을 기본으로한 클론 선택을 수행토록 한다. 토끼 항체로부터 CDRs를 취하기에 적합한 scFv 스캐폴드가 동정되어 특성화되어 있다 ("토끼화" 인간 FW 또는 토끼 수용체 RabTor; WO09/155726 참조, 이는 여기서 전문 참고로 인용됨). 어떠 경우 심지어 토끼 특이적 인터-CDR 이황화 결합을 함유하는 다양한 CRs에 대한 컨셉의 증거가 밝혀져 있다.
토끼화 항체의 일반적인 설명이 이후 기재된다.
면역결합제의 그라프팅 (grafting)
본 발명의 방법으로 동정된 면역결합제의 항원 결합 영역 또는 CDRs를 수용체 항체 프레임워크중으로 그르프팅시킬 수 있다. 상기와 같은 그라프팅은 예를 들면 면역결합제의 면역원성을 감소시킬 수 있거나 이의 기능적 특성을 향상, 예를 들면 열역학적 안정성을 향상시킬 수 있다.
인간 수용체 프레임워크중으로 CDRs를 그라프팅시키는 일반적인 방법이 하기 문헌에 기재되어 있으며, 이 문헌은 여기서 참고로 전문 인용된다: Winter, 미국 특허 제5,225,539호.
토끼 모노클로날 항체로부터의 CDRs를 그라프팅시키기 위한 특이적 전략이 미국 임시 특허원 제61/075,697호, 및 제61/155,041호에 개시되어 있으며, 이들 문헌은 여기서 전문 참고로 인용된다. 이들 전략은 Winter의 것과 관련되어 있지만 수용체 항체 프레임워크가 모든 인간 또는 비-인간 공여체 항체에 대한 범용 수용체로서 특히 적합하다는 점에서 달라진다. 특히, 인간 단일쇄 프레임워크 FW1.4 (SEQ ID NO:1 (WO03/097697에 a43으로 명명)과 SEQ ID NO:2 (WO03/097697에 K127로 명명)의 배합물)는 토끼 항체의 항원-결합 부위와의 화합성이 높은 것으로 밝혀졌다. 따라서, FW1.4는 토끼 루프의 그라프팅으로부터 유래된 안정한 인간화 scFv 항체 단편을 작제하는데 적합한 스캐폴드이다.
또한, FW1.4는 FW1.4의 중쇄 중 5번 또는 6번 잔기 위치를 치환하고(하거나) FW1.4의 경쇄 중 1번 위치를 치환하여 최적화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이에 의해, 놀랍게도 공여체 프레임워크의 서열과는 완전히 별개로 VH에서 온갖 종류의 토끼 CDRs의 루프 배열이 완전히 유지될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 FW1.4의 중쇄 중 5번 또는 6번 잔기 뿐만 아니라 경쇄 중 1번 위치는 토끼 항체에서 보존된다. 중쇄 중 5번 또는 6번 위치, 뿐만 아니라 경쇄 중 1번 위치에 대한 공동 잔기는 토끼 레퍼토리로부터 추론되어 인간의 수용체 프레임워크의 서열중으로 도입시킨다. 그 결과, 개질된 프레임워크 1.4 (그 문헌에서는 rFW1.4로 명명)는 실질적으로 토끼 CDR과 호환될 수 있다. 토끼의 야생형 단일쇄와는 대조적으로, 상이한 토끼 CDRs를 함유하는 rFW1.4는 발현이 잘되며 원래의 공여체 토끼 항체의 친화성을 거의 완전히 유지한다.
따라서, 일례의 면역결합제 수용체 프레임워크는
(i) SEQ ID No.1과 동일성이 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%인 가변성 중쇄 프레임워크; 및(또는)
(ii) SEQ ID No.2와 동일성이 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%인 가변성 경쇄 프레임워크를 포함한다.
바람직한 양태로, 상기 가변성 경쇄가 87번 위치 (AHo 번호매기기)에서 트레오닌 (T)을 포함한다.
바람직한 양태로, 상기 면역결합제 수용체 프레임워크는
(i) SEQ ID No.1, SEQ ID No.4 및 SEQ ID No.6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가변성 중쇄 프레임워크; 및(또는)
(ii) SEQ ID No.2 또는 SEQ ID No.9의 가변성 경쇄 프레임워크를 포함한다.
바람직한 양태로, 상기 가변성 중쇄 프레임워크는 링커를 통하여 가변성 경쇄 프레임워크에 결합된다. 상기 링커는 적합한 링커, 예를 들어, 서열 GGGGS (SEQ ID No.10)의 1 내지 4개의 반복체, 바람직하게는 (GGGGS)4 펩타이드 ( SEQ ID No.8)를 포함하는 링커, 또는 문헌: Alfthan et al. (1995) Protein Eng. 8:725-731에 개시된 바와 같은 링커일 수 있다.
가장 바람직한 양태로, 상기 면역결합제 수용체 프레임워크는 SEQ ID No.3과 동일성이 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%인 서열이다. 더욱 바람직하게는, 상기 면역결합제 수용체 프레임워크가 SEQ ID No.3을 포함하거나 SEQ ID No.3이다.
다른 바람직한 양태로, 상기 면역결합제 수용체 프레임워크가 SEQ ID No.5와 동일성이 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%인 서열이다. 더욱 바람직하게는, 상기 면역결합제 수용체 프레임워크가 SEQ ID No.5를 포함하거나 SEQ ID No.5이다.
다른 바람직한 양태로, 상기 면역결합제 수용체 프레임워크가 SEQ ID No.7과 동일성이 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%인 서열이다. 더욱 바람직하게는, 상기 면역결합제 수용체 프레임워크가 SEQ ID No.7을 포함하거나 SEQ ID No.7이다.
또한, 토끼 면역결합제로부터 유래된 CDRs의 배열을 일반적으로 지지하는 아미노산 잔기 1개 이상을 추가로 포함하는, SEQ ID No.1의 일례의 가변성 중쇄 프레임워크를 사용할 수 있다. 특히, 상기 잔기는 24H, 25H, 56H, 82H, 84H, 89H 및 108H (AHo 번호매기기)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 위치 1개 이상에 존재한다. 이들 위치는 CDR 배열에 영향을 주는 것으로 증명되었으며 따라서 공여체 CDRs를 수용하기 위한 돌연변이용으로 고려된다. 바람직하게는, 상기 잔기 중 1개 이상은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 24번 위치에서의 트레오닌 (T), 25번 위치에서의 발린 (V), 56번 위치에서의 글리신 또는 알라닌 (G/A), 82번 위치에서의 리신 (K), 84번 위치에서의 트레오닌 (T), 89번 위치에서의 발린 (V) 및 108번 위치에서의 아르기닌 (R) (AHo 번호매기기).
바람직한 양태로, 상기 가변성 중쇄 프레임워크는 SEQ ID No.4 또는 SEQ ID No.6이거나 이들을 포함한다. 상기 두 가변성 중쇄 프레임워크는 예를 들어 적합한 경쇄 프레임워크와 혼합될 수 있다.
상기 개시된 서열은 다음과 같다 (X 잔기는 CDR 삽입 부위이다):
SEQ ID No.1: FW1.4(a43)의 가변성 중쇄 프레임워크
Figure 112016125119246-pat00001
SEQ ID No.2: FW1.4(K127)의 가변성 경쇄 프레임워크
Figure 112016125119246-pat00002
SEQ ID No.3: FW1.4의 프레임워크
Figure 112016125119246-pat00003
SEQ ID No.4: rFW1.4의 가변성 중쇄 프레임워크
Figure 112016125119246-pat00004
SEQ ID No.5: rFW1.4의 프레임워크
Figure 112016125119246-pat00005
SEQ ID No.6: rFW1.4(V2)의 가변성 중쇄 프레임워크
Figure 112016125119246-pat00006
SEQ ID No.7: rFW1.4(V2)의 프레임워크
Figure 112016125119246-pat00007
SEQ ID No.8: 링커
Figure 112016125119246-pat00008
SEQ ID No.6: FW1.4의 치환된 가변성 경쇄 프레임워크
Figure 112016125119246-pat00009
따라서, Winter의 일반적인 방법과는 달리, 본 발명의 인간화 방법에 사용되는 프레임워크 서열은 공여체 CDRs가 유래되는 비-인간 (예, 토끼) 항체의 서열과 최대의 서열 유사성을 나타내는 프레임워크 서열이 필수적인 것은 아니다. 또한, CDR 배열을 지지하기 위하여 공여체 서열로부터 그라프팅되는 프레임워크 잔기가 필요하지 않다.
수용체 항체 프레임워크는 또한 미국 임시 특허원 제61/075,692호 (이는 여기서 전문 참고로 인용된다)에 기재된 안정성 향상 돌연변이 1개 이상을 포함할 수 있다. 중쇄 프레임워크 중 가용성 향상 치환의 일례는 12번, 103번 및 144번 위치 (AHo 번호매기기)에서 발견되었다. 더욱 바람직하게는 중쇄 프레임워크가 (a) 12번 위치에서 세린(S); (b) 103번 위치에서 세린(S) 또는 트레오닌(T) 및(또는) (c) 144번 위치에서 세린(S) 또는 트레오닌(T)를 포함한다. 또한, 안정성 향상 아미노산이 가변성 경쇄 프레임워크의 1번, 3번, 4번, 10번, 47번, 57번, 91번 및 103번 위치 (AHo 번호매기기) 중 1개 이상에 존재할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 가변성 경쇄 프레임워크가 1번 위치에서 글루탐산(E), 3번 위치에서 발린(V), 4번 위치에서 류신(L), 10번 위치에서 세린(S); 47번 위치에서 아르기닌(R), 57번 위치에서 세린(S), 91번 위치에서 페닐알라닌(F) 및(또는) 103번 위치에서 발린(V)을 포함한다.
실시예
실시예를 통하여, 달리 언급되지 않는 한, 다음 물질과 방법이 사용된다.
물질 및 방법
일반적으로, 달리 표시되지 않는 한, 본 발명의 실시에 통상의 화학 기술, 분자생물학, 재조합 DNA 기술, 면역학 (특히, 예를 들면 항체 기술), 및 폴리펩타이드 제조의 표준 기술이 사용된다. 예를 들어 다음 문헌을 참고한다: Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); 및 Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).
세포 ELISA (CELISA)
다음 실시예에는 CXCR2를 발현시키는 세포를 분석하기 위하여 CELISA를 사용하는 것이 설명된다:
CXCR2를 발현시키는 CHO 세포를 50,000개 세포/웰의 밀도로 96개-웰 하프 면적 플레이트에 씨딩할 수 있다. 37 ℃에서 밤새 배양시킨 후, 세포를 PBS 중 1% 포름알데히드로 30분간 실온에서 고정시킬 수 있다. 세포층을 3회 세척할 수 있으며 비 특이적 결합 부위는 세포 배양 배지로 실온에서 1시간 동안 차단시킬 수 있다. 이어서, 3회의 세척 단계를 거친 후, 상등액을 배양 배지에 1:1로 희석하여 상기 웰에 가할 수 있다. 3개의 대조용 웰에, 시판되는 토끼 항-CXCR2 항체를 상등액에 스파이킹시킬 수 있다. 이어서 상등액을 상기 세포층 위에서 1시간 30분 동안 실온에서 배양시킬 수 있다. 최종적으로, 토끼 IgGs를 HRP에 커플링되어 있는 염소의 항-토끼 IgG Fc 항체로 검출한다. 퍼옥시다제 기질 (Roche로부터의 Blue POD 기질) 첨가시, 색도계 반응이 전개되며 이는 25분 후 1M HCl로 중단시킬 수 있다. 흡광도는 450 nm에서 측정할 수 있다.
실시예 1
가용성 항원을 사용한 B 세포 선별 시스템
여기에서는 본 발명에 기재되어 있는 FACS (형광-활성화된 세포 분류)-기재 선별 시스템이 B 세포 수용체 (BCR)를 통하여, 당해 표적, 구체적으로, 가용성 단백질에 결합하는 B 세포를 선택할 수 있는 것으로 설명된다. 본 실시예에서는, 표적이 형광 염료 (PE 및 PerCP)로 표지된 단일쇄 항-VEGF 항체 ESBA903이다. 재조합 표적으로 면역시킨 토끼의 비장으로부터 림프구 현탁액을 제조한다. 이어서 세포를 PE 및 PerCP 표지된 scFv 뿐만 아니라 IgG (APC-표지된) 또는 IgM (FITC 표지된)에 특이적인 항체와 함께 배양시킨다. 표면상에서 IgG는 발현시키지만 IgM은 발현시키지 않는 ESBA903-포지티브 B-세포를 분류하고 96개-웰 플레이트에서 선택한다 (도 2). 도 2의 패널 A로 나타낸 바와 같이, 림프구가 전방에 따라서 통과되고 측면에서 흩어진다. 이들 중에서, IgG+ IgM- 세포 (아마도 메모리 B 세포)가 선택된다 (패널 B). scFv-PE 및 scFv-PerCP로 이중-염색된 세포는 scFv에 대한 고친화성 IgGs를 암호화할 것으로 기대된다 (패널 C). 가장 밝은 형광을 나타내는 세포를 패널 D에 나열된 분류 통계학으로 96개-웰 플레이트에서 분류한다. 흉선종 헬퍼 세포주 (EL4-B5: Zubler et al, 1985, J. Immunol. 134(6):3662-3668 참조)를 사용하여, 선택된 B 세포를 증폭시키고, 혈장 세포로 분화시킨 다음 항체를 분비시킨다. 이들 IgG 분자의 표적 단백질에 대한 친화성을 ELISA 및 Biacore 측정법으로 확인한다. 7개의 선택된 클론에 대한 동력학 지표를 표 1에 표시하였다. 대략 200개의 분류된 세포로부터의 이들 클론은 낮은 나노몰 내지 피코놀 범위에서 높은 결합 친화성을 나타낸다. 최종적으로, 분비된 IgG 분자에 대한 mRNAs를 당해 6개의 클론으로부터 단리하고 CDRs를 Framework rFW1.4로도 명명된, ESBATech 단일쇄 프레임워크 RabTor상에 그라프팅시킨다.
표 1: 7개의 B 세포 배양 상등액에 대한 동력학적 수치
Figure 112016125119246-pat00010
표 1a: 도 2에 대한 분류 통계학
Figure 112016125119246-pat00011
선택된 문헌:
Zuber et al. Mutant EL-4 thymoma cells polyclonally activate murine and human B cells via direct cell interaction. J Immunol. 1985; 134(6):3662-3668.
막관통 표적
상기한 선별 시스템은 표적이 가용성일 때, 또한 재조합 단백질이 입수가능할 때 효율적으로 작동한다. 그러나, 당해 표적 중 일부는 멀트스팬 막관통 단백질 (예, GPCRs 및 이온 채널)이다. 재조합 단백질을 사용한 전통적인 면역화는 이들 경우에 있어서 권할만하지 못하거나 불가능하다. 또한, B 세포의 FACS 선택은 항원이 내재막 단백질인 경우 정제되고 표지된 단백질의 결합을 기본으로 하여 수행될 수 없다. 이런 문제점에 맞추어, 상기 언급한 공정을 다음과 같이 개선하였다.
1) 재조합 단백질 대신 DNA로 면역화시킴:
DNA 백신화는 천연 항원에 대해 신속한 면역 반응을 일으킨다. 재조합 단백질이 필요치 않기 때문에, 이 기술은 한편으로는 비용면에서 매우 효과적이며, 다른 한편으로, 더욱 중요하게는, 이 방법은 내재막 복합체 및(또는) 멀티스팬 막 단백질의 자연적 발현이 가능하도록 한다.
2) 내재막 표적 단백질을 발현시키는 세포에 결합하는 B-세포의 FACS 선택:
유세포 분석기는 통상적으로 단일 세포들이 레이져 빔과 교차될 때 단일 세포에 의해 방출되는 형광을 측정한다. 그러나, 연구원중 일부는 이미 세포-세포 상호반응, 예를 들면, 캐드헤드린 (cadhedrins; Panorchan et al, 2006, J. Cell Science, 119, 66-74; Leong et Hibma, 2005, J. Immunol. Methods, 302, 116-124) 또는 인테그린 (integrins; Gawaz et al, 1991, J. Clin. Invest, 88, 1128-1134)에 의해 매개되는 부착을 조사하기 위하여 세포측정기를 사용하였다. 그러나, 그러한 연구는 그러한 세포-세포 상호반응이 세포 분류의 물리적 단계중 천연 그대로 유지되는지에 대해 증명하지 않았다. 또한, B 세포 수용체가 다른 세포의 표면에 존재하는 이의 표적에 결합하는 것이 그러한 물질적 분류가 가능하도록 하기에 충분히 강력하다는 것을 제시한 바 없다.
막관통 표적에 결합하는 B-세포를 선택하기 위하여, 세포 (예, CHO 또는 HEK293 세포)를 일시적으로 또는 우선적으로 안정하게 선택한 표적으로 형질감염시킬 수 있거나, 천연적으로 선택한 표적을 발현시키는 세포를 사용할 수 있다. 그러한 표적 세포는 세포내 형광 염료 (예, 칼세인)로 염색하고 면역화된 토끼의 메모리 B 림프구와 함께 배양시킨다. B 림프구는 세포 표면 특이적 마커에 결합하는 형광 항체로 염색한다. 따라서, BCR-표적 상호반응을 통하여 서로에 부착하는 2개의 세포로 이루어진 바이-칼라 "이벤트" (도 1 참조)를 선택할 수 있다.
이들 B 세포의 추가적인 가공을 상술한 바와 같이 수행하는데, 이로써 예를 들어 IgG 또는 scFv 포맷으로 모노클로날 항체가 생산된다. 표적에 대한 이들 항체의 친화성을 평가하기 위하여, CELISA (ELISA, 여기서 코팅 단계는 전체 세포로 수행한다)를 수행한다. 이 방법으로 항체의 선택성 및 리간드와의 경쟁 능력을 평가할 수 있다. 최종적으로, 당해 클론의 CDRs를 올리고 연장법을 이용한 유전자 합성에 의해 본 발명의 토끼화 프레임워크 (RabTor)중으로 클로닝시킨다.
B-세포 분류에 대한 판독을 세포-세포 상호반응으로 제한하는 것이 필수적인 것은 아니지만, 상기 상호반응의 수용체 시그날화를 기능적으로 차단/활성화시키는 능력에 대해 선택하기 위하여 사용할 수도 있다. 예를 들어, B-세포를 GPCR을 기능적으로 발현시키는 세포와 함께 배양시킬 수 있다. GPCR을 통하여 시그날화하는 효능제를 혼합물에 가하여 소포체로부터 GPCR 매개된 Ca2+ 유출을 유발할 수 있다. B-세포에 존재하는 항체가 효능제 시그날화를 기능적으로 차단하는 경우, Ca2+ 유출이 또한 결과적으로 상기 세포-세포 상호반응에 의해 차단된다. Ca2+ 유출은 유세포 분석기로 정량적으로 측정할 수 있다. 따라서, Ca2+ 유출을 나타내지 않는 B-세포/표적 세포 응집체만이 분류된다.
실시예 2
항- TNFα 항체로 코팅된 비드와 막- 결합된 TNFα를 발현시키는 CHO 세포간 상호반응의 검출
막관통 단백질에 대한 B 세포 선별을 개시하기 전에, 세포-세포 상호반응 (및 특히 BCR과 표적 세포상의 막관통 단백질 사이의 상호반응)이 FACS에 의해 포지티브하게 선택될 수 있음을 증명하여야 한다. 유세포-분석기 스트림에서 높은 압력이 두 세포간 비-공유결합을 파괴하는지 측정하기 위하여, 다음 실험을 수행하였다.
막-결합된 TNFα (B-220 세포) (TNFα리간드의 절단 및 쉐딩을 방지하는 TACE 절단 부위에 점 돌연변이를 함유하는 돌연변이체 막-결합된 TNFα를 함유; 예를 들어 Scallon et al. J Pharmacol Exp Ther 2002; 301:418-26 참조)로 안정하게 형질감염시킨 CHO 세포를 PE-표지된 항-TNFα항체로 코팅된 비드와 함께 배양한다. 상기 셋-업에서 비드는 메모리 B 세포를 모방한 것이다. 네가티브 대조물로서, 비-형질감염된 CHO 세포, 뿐만 아니라 APC-표지된 비관련 항체 (항-CD19)로 코팅한 비드를 사용한다. 4 ℃에서 교반시키며 2시간 동안 배양시킨 후, 세포-비드 현탁액을 FACS로 분석한다 (130 ㎛ 노즐 사용). 도 3은 항-TNFα 비드와 TNFα-형질감염된 CHO 세포간의 특이적 결합이 FACS에 의해 명백하게 검출될 수 있음을 나타낸다. 사실, 이 샘플 (상부 패널)에서 비드의 2/3가 세포에 결합하였다 (585개 결합 대 267개 비결합). 대조적으로, 대조용 샘플에서는 (중간 및 하부 패널), CHO 세포에 결합된 비드가 거의 없었다. 또한, 비드 집단 둘 다 (항-TNFα-PE 및 항-CD19-APC)를 TNFα-형질감염된 CHO 세포와 함께 혼합한다. 도 4는 항-TNFα 비드의 약 절반이 CHO 세포에 결합하는 반면, 항-CD19 비드의 거의 대부분이 미결합 상태로 남아 있음을 나타낸다. 각 샘플에서 세포에 결합하는 비드의 퍼센트가 표 2에 상세하게 기재되어 있다. 따라서, B 세포 수용체를 통하여 내재막 표적 단백질에 결합하는 단일 B 세포의 특이적 선택이 유세포-분석기를 사용하여 가능할 수 있는 것으로 증명된다.
표 2: 각 샘플에서 CHO 세포에 결합된 비드의 퍼센트
Figure 112016125119246-pat00012
표 2a: 도 3의 상부 패널에 대한 분류 통계학; 항-TNFα 항체로 코팅된 비드는 TNFα-형질감염된 CHO 세포에 결합
Figure 112016125119246-pat00013
표 2b:도 3의 중간 패널에 대한 분류 통계학; 항-CD19 항체로 코팅된 비드는 TNFα-형질감염된 CHO 세포에 결합하지 않음
Figure 112016125119246-pat00014
표 2c: 도 3의 하부 패널에 대한 분류 통계학; 항-TNFα항체로 코팅된 비드는 CHO 야생형 세포에 결합하지 않음
Figure 112016125119246-pat00015
표 2d: 도 4에 대한 분류 통계학
Figure 112016125119246-pat00016
실시예 3
항- TNFα항체 면역화된 토끼로부터 단리된 B 세포와 항- TNFα항체로 포화시 킨 막-결합된 TNFα를 발현시키는 CHO 세포간 상호반응의 검출
도 5에 나타낸 실험을 위하여, 림프구를 항-TNFα항체 (ESBA105, 내부적으로 생산) 면역화된 토끼 비장 또는 비-면역화된 토끼 비장으로부터 단리한다. 이들을 항-토끼 IgG-APC 및 항-토끼 IgM-FITC (AbD serotec)으로 염색한 다음 미리-분류하여 메모리 B 세포 (IgG+/IgM-)의 순수한 집단을 수득한다. 동시에, TNFα-발현 CHO 세포 (Dr. P Scheurich, Univ. of Stuttgart가 기증)에 살아있는 세포를 형광적으로 염색하는 세포질 염료인 calcein-red (Invitrogen) 1 ㎍/㎖를 부하한다. 이어서 이들 세포를 1회 세척하고 ESBA105 100 ㎍/㎖와 함께 (또는 네가티브 대조용으로, 없이) 배양한 다음, 최종적으로 PBS로 다시 3회 세척한다. 마지막으로 메모리 B 세포를 약 1:10의 비율로 CHO 세포와 혼합하여 4 ℃ 회전판 상에서 (농도: 3*107 세포/㎖) 2시간 동안 배양시킨다.
다음 샘플을 제조한다:
1) ESBA105 면역화된 토끼의 CHO-TNFα세포+ESBA105+메모리 B 세포
2) 비-면역화된 토끼의 CHO-TNFα세포+ESBA105+메모리 B 세포
3) ESBA105 면역화된 토끼의 CHO-TNFα세포+메모리 B 세포
2시간 배양한 후, 70 ㎛ 노즐을 사용하는, FACS로 3종의 샘플을 측정한다. 표 3a에 나타낸 집단 체계에 따라서, 5%의 ESBA105 면역화된 세포는 "ESBA105-코팅된" TNFα유전자이식 CHO 세포에 결합한다. 비교해보면, 비-면역화된 B 세포의 0.5% 만이 이들 "ESBA105-코팅된" TNFα유전자이식 CHO 세포에 결합하며 (표 3b), 면역화된 B 세포의 0.6%가 ESBA105의 부재하에서 CHO 세포 표면상에 결합한다 (표 3c). 이들 결과는 BCR (B 세포 수용체)과 막관통 표적 간의 특이적 상호반응이 FACS에 의해 검출될 수 있음을 나타내는 것이다.
표 3a: 도 5b의 상부 패널에 대한 분류 통계학
Figure 112016125119246-pat00017
표 3b: 도 5b의 중간 패널에 대한 분류 통계학
Figure 112016125119246-pat00018
표 3c: 도 5b의 하부 패널에 대한 분류 통계학
Figure 112016125119246-pat00019
실시예 4
ESBA105 면역화된 토끼로부터 단리된 B 세포와 ESBA105 로 포화시킨 막- 결합된 TNFα를 발현시키는 CHO 세포간 상호반응의 검출
추가적인 실험에서는, 메모리 B 세포의 예비-분류를 하지 않는다. 전체 림프구 집단을 염색한 CHO-TNFα-ESBA105 세포와 함께 배양한다. 유전자전이 CHO 세포를 상기한 바와 같이 제조한다. 그러나, 96개-웰 플레이트에서의 분류후 B 세포 배양 배지에서 이들의 증식을 방지하기 위하여, 칼세인 염색 전에 미토마이신 C (M4287-2MG)로 상기 세포의 세포-사이클을 중지시킨다. ESBA105 면역화된 토끼의 림프구를 염색한 CHO 세포와 3:1의 비율로 혼합하고 (세포 현탁액의 농도: 대략 3-107 세포/㎖), 4 ℃ 회전판 상에서 2시간 동안 배양시킨다. 이후, 상기 세포 현탁액을 FACS 분석하고 CHO-TNFα-ESBA105에 결합하는 메모리 B 세포를 표 3에 나타낸 바와 같이 1, 10 또는 100개의 세포/㎖인, 도 6에 제시된 게이트에 따라서 분류한다. 분류된 세포는 메모리 B 세포 집단의 5.5%이며, 각각 전체 이벤트의 0.2%이다.
분류된 세포를 96개-웰 플레이트에 수집하고 5% CO2와 함께 37 ℃에서 13일간 배양시킨다. 이후, 배양 상등액을 수집하고 직접적인 ELISA에 처리하여 IgGs에 결합하는 ESBA105의 존재에 대해 체크한다. ELISA의 결과 (표 3)는 ESBA105 특이적 항체가 수많은 웰, 및 또한 단일 B 세포가 분류되는 웰에서 검출될 수 있음을 나타낸다. 이들 상등액의 Biacore (GE Healthcare) 분석 (표 4)으로 이들 항체가 진정으로 ESBA105 표적에 결합함을 확인한다.
표 3: 분류한 지 13일 후 채취한 B 세포 배양 상등액의 ELISA 분석. OD450 시그날의 특이성을 확인하기 위한 A열 웰에 분류되는 B 세포는 없었다. A11 및 A12웰에는, 폴리클로날 토끼 항-ESBA105 항체 (AK3A; 2 ㎍/㎖)를 상등액에 포지티브 대조물로서 스파이크시킨다. OD450이 기준치보다 현저하게 더 높은 웰은 진한게 강조하였다.
Figure 112016125119246-pat00020
표 4: B 세포 배양 상등액에 대해 Biacore에 의해 측정된 동력학적 수치 및 농도. 웰 당 1개의 세포가 분류되는 상등액만을 측정하였다. BLQ: 수량화 한계치 이하
Figure 112016125119246-pat00021
실시예 5
CXCR2로 면역시킨 토끼의 림프구의 선별 (27개 분류/29개)
3마리의 토끼를 CXCR2 발현 벡터로 면역시킨다. CXCR2-cDNA를 수회 피내 적용시킨 후, 혈청을 채취하여 CXCR2 형질감염된 세포 상에서 특이적 항체의 존재에 대해 시험한다. 이어서 림프절 세포를 제거하여 각각 1.6x107개 세포로 하여 5개로 나누어 동결시키고 액체 질소 탱크에 보관한다.
분취량 하나를 해동시켜 IgG (APC-표지된) 또는 IgM (FITC 표지된)에 대해 특이적인 항체로 염색한다. 동시에, CXCR2-발현 CHO 세포를 미토마이신 C로 처리하여 세포를 사멸시키지 않고 추가적인 성장을 방지하여, 1 ㎍/㎖ 칼세인-레드와 함께 부하한다. 이어서 두 세포 제제를 107개 세포의 최종 세포 농도로 혼합하고, 이때 림프구는 CXCR2-형질감염된 CHO 세포 만큼 풍부하게 2배로 하다. 부드럽게 교반시키며 4 ℃에서 2시간 동안 배양시킨 후, 세포 현탁액을 50-㎛ 필터를 통하여 여과하여 FACS 상에 부하한다. 도 6에 기재된 바와 같이 게이팅을 수행한다. 총 10 x 96개-웰 플레이트에서 월 당 하나의 "이벤트" (CXCR2-형질감염된 CHO 세포에 결합된 메모리 B 세포)가 분류된다 (전체적으로 900개 이벤트). 분류된 이벤트는 메모리 B 세포 집단의 3.1%로, 이는 각각 샘플중 세포 총량의 0.035%를 나타낸다.
선택된 림프구를 37 ℃ 인큐베이터에서 21일간 배양시킨다. 2 내지 3일 마다, 배양 상등액 100 ㎕를 웰로부터 수집하여 신선 배지로 대체한다. 상기 배양 기간 중, B 세포가 증식되며 혈장 세포로 분화되어 항체를 분비한다. 상등액이 CXCR2 특이적 항체를 함유하는 것을 가시화하기 위하여, CELISA를 수행한다. 이를 위하여, CXCR2를 발현시키는 CHO 세포를 96개-웰 플레이트의 절반 면적에 50,000개 세포/웰의 밀도로 씨딩한다. 37 ℃에서 밤새 배양시킨 후, 세포를 PBS 중 1% 포름알데히드로 실온에서 30분간 고정시킨다. 이어서 세포층을 3회 세척하고 비 특이적 결합 부위를 세포 배양 배지로 실온에서 1시간 동안 차단시킨다. 다음, 3회의 세척 단계 후, 상등액을 배양 배지에 1:1로 희석하여 웰에 가한다. 3개의 대조용 웰에, 시판되는 토끼 항-CXCR2 항체를 상등액에 스파이킹시킨다. 상등액을 실온에서 1시간 30분 동안 세포층 상에서 배양시킨다. 최종적으로, 토끼 IgGs를 HRP에 커플링되어 있는 염소의 항-토끼 IgG Fc 항체로 검출한다. 퍼옥시다제 기질 (Roch로 부터의 Blue POD 기질) 첨가시, 색도계 반응이 전재되며 이는 25분 후 1M HCl 로 중단시킨다. 흡광도는 450 nm에서 측정한다.
상기 CELISA로 웰의 1.8% (16/900)가 포지티브 시그날을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 모든 포지티브는 제2의 CELISA로 확인한다. 상등액은 또한 다른 세포주: 궁극적인 비특이적 결합 클론을 밝히고자 할 경우 CHO-K1 (야생형), 밀접한 관련이 있는 수용체 또는 종의 카운터파트에 대한 교반-활성을 증명하고자 할 경우 CHO-인간 CXCR1 및 CHO-마우스 CXCR2에 대해 시험한다. 최종적으로, 상등액을 48개의 CXCR2 N-말단 아미노산으로 이루어진 펩타이드에 대한 결합에 대해 직접적인 ELISA로 시험한다. 결과를 표 5에 제시하였다. 선택된 상등액은 모두 CELISA에서 사람의 CXCR2에 대해 강력한 OD450 시그날을 생산하였다. 이들 중 일부는 CHO 야생형 세포에 대한 대조 실험에서도 약간 포지티브였는데, 이는 이들이 비특이적 방식으로 결합할 수 있음을 의미힌다. 상기 클론 중 사람의 CXCR1 또는 마우스 CXCR2와 교차-반응성인 것은 하나도 없었다. 최종적으로, 클론 중 일부만이 CXCR2 N-말단 펩타이드에 결합하였는데, 이는 CXCR2 상에 다른 결합 부위의 가능성을 나타내는 것이다. Biacore 칩 상에 전체 세포를 고정시킬 가능성이 없다면, 현재 CXCR2 수용체에 대해 선택된 항체의 친화성을 정량적으로 측정할 수 없다. 그러나, 모아진 데이타는 사람의 CXCR2에 대해 특이적인 항체가 상기한 세포-세포 상호반응 분류 시스템을 사용하여 선택됨을 나타낸다.
표 5: 분류 27 및 29 동안 단리된 항-CXCR2 클론으로부터의 CELISA 결과의 요약
Figure 112016125119246-pat00022
등가물
본 발명의 수많은 개량과 대안적 양태가 상기한 기재 내용의 관점에서 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다. 따라서, 본 기재 내용은 설명을 위한 것으로 간주되어야 하며 당해 분야의 숙련가에게 본 발명을 실시하기 위한 최상의 방식을 교시할 목적인 것이다. 구조의 세부 사항은 본 발명의 정신으로부터 실질적으로 벗어나지 않으면서 변화될 수 있으며, 첨부되는 특허청구의 범위의 범주 내에 있는 모든 개량의 배타적 사용은 보존된다. 본 발명은 첨부되는 특허청구의 범위 및 적용될 수 있는 법률에 의해 요구되는 정도로만 제한된다.
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SEQUENCE LISTING <110> ESBATECH, AN ALCON BIOMEDICAL RESEARCH UNIT <120> mETHODS FOR IDENTIFYING IMMUNOBINDERS OF CELL-SURFACE ANTIGENS <130> CELL-CELL INTERACTION <150> CH00832/09 <151> 2009-06-02 <150> US61/155,105 <151> 2009-02-24 <150> US61/155,041 <151> 2009-02-24 <150> PCT/CH2009/000222 <151> 2009-06-25 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable heavy chain framework of FW1.4 (a43) <220> <221> CDR <222> (26)..(75) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <220> <221> CDR <222> (90)..(139) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <220> <221> CDR <222> (172)..(221) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. 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Xaa can be any naturally occurring amino acid. <400> 3 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 245 250 255 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 260 265 270 Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275 280 285 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 290 295 300 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 325 330 335 Glu Trp Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 340 345 350 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 355 360 365 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 370 375 380 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 385 390 395 400 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 405 410 415 Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 420 425 430 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 435 440 445 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 450 455 460 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 465 470 475 480 Val Ser Ser <210> 4 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable heavy chain framework of rFW1.4 <220> <221> CDR <222> (26)..(75) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. 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Xaa can be any naturally occurring amino acid. <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala 65 70 75 80 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser 130 135 140 Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 145 150 155 160 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln 210 215 220 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 <210> 5 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> framework of rFW1.4 <220> <221> CDR <222> (24)..(73) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <220> <221> CDR <222> (89)..(138) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <220> <221> CDR <222> (171)..(220) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <220> <221> CDR <222> (277)..(326) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <220> <221> CDR <222> (341)..(390) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <220> <221> CDR <222> (423)..(472) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <400> 5 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 245 250 255 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 260 265 270 Cys Thr Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275 280 285 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 290 295 300 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 325 330 335 Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 340 345 350 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 355 360 365 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 370 375 380 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys 385 390 395 400 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 405 410 415 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 420 425 430 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 435 440 445 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 450 455 460 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 465 470 475 480 Val Ser Ser <210> 6 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable heavy chain framework of rFW1.4(V2) <220> <221> CDR <222> (26)..(75) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <220> <221> CDR <222> (90)..(138) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <220> <221> CDR <222> (171)..(220) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala 65 70 75 80 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Lys 130 135 140 Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 145 150 155 160 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 <210> 7 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> framework of rFW1.4(V2) <220> <221> CDR <222> (24)..(73) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <220> <221> CDR <222> (89)..(138) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <220> <221> CDR <222> (171)..(220) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <220> <221> CDR <222> (277)..(326) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <220> <221> CDR <222> (341)..(390) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <220> <221> CDR <222> (423)..(472) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <400> 7 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 245 250 255 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 260 265 270 Cys Thr Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275 280 285 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 290 295 300 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 325 330 335 Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 340 345 350 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 355 360 365 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 370 375 380 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 385 390 395 400 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 405 410 415 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 420 425 430 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 435 440 445 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 450 455 460 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 465 470 475 480 Val Ser Ser <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 9 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> substituted variable light chain framework of FW1.4 <220> <221> CDR <222> (24)..(73) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <220> <221> CDR <222> (89)..(138) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <220> <221> CDR <222> (171)..(220) <223> CDR; at least 1 and up to 50 amino acids can be present or absent. Xaa can be any naturally occurring amino acid. <400> 9 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 10 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (5)

  1. (a) 제1의 분류가능한 표지물에 기능적으로 결합되어 있는 다수의 면역결합제-발현 세포를 제공하고;
    (b) 제2의 분류가능한 표지물에 기능적으로 결합되어 있는 다수의 항원-발현 세포를 제공하고, 여기서 당해 항원은 항원 발현 세포의 표면에 드러나 있고;
    (c) 상기 항원-발현 세포와 상기 면역결합제-발현 세포를 접촉시키고; 그리고
    (d) 세포 분류기를 사용하여 다수의 면역결합제-발현 세포로부터 항원 발현 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 면역결합제-발현 세포를 하나 이상 분리시키는 것;을 포함하며, 여기서 단일 세포 복합체 중 제1 및 제2의 분류가능한 표지물의 존재는 항원-발현 세포에 대한 면역결합제-발현 세포의 결합의 지표로서, 이에 의해 당해 항원에 결합하는 면역결합제를 동정하는 것인,
    당해 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 면역결합제를 동정하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
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