TW202305361A

TW202305361A - 預測生物製劑之藥物動力學及腦滲透性之活體外基於細胞之測定

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Publication number: TW202305361A
Application number: TW111113779A
Authority: TW
Inventors: 劉暢; 約翰學寧劉; 山鍾
Original assignee: 美商建南德克公司
Priority date: 2021-04-14
Filing date: 2022-04-12
Publication date: 2023-02-01
Also published as: JP2024515620A; WO2022221236A1; US20240085404A1; EP4323766A1

Abstract

本揭露涉及可用於測量分子之胞吞轉送作用或再循環之方法及組成物。特定而言，本揭露涉及用於評估人類及動物中之治療抗體分子及 Fc 融合蛋白之清除率之活體外受體相關胞吞轉送作用或再循環測定。

Description

預測生物製劑之藥物動力學及腦滲透性之活體外基於細胞之測定

本揭露涉及用於測量細胞層對分子之再循環的方法和組成物。特別地，本揭露涉及用於評估與 FcRn（例如，治療性抗體、Fc 融合分子和與白蛋白連接之分子）交互作用之分子之活體內藥物動力學特徵（例如，清除率和/或半衰期）和組織滲透性之活體外受體相關再循環測定以及再循環和胞吞轉送作用測定。

治療性單株抗體 (mAb) 因其在治療多種疾病方面的有效性及其理想藥理學特性而已成為全球主要的醫藥產品類別。mAb 藥物之有利藥理學特性之一係其循環半衰期通常較長。生物治療產品之延長半衰期可能允許降低給藥頻率和/或減少藥物劑量，這可能會降低照護成本、提高患者依從性和/或減少濃度相關細胞毒性/不良反應。

在理解 mAb 藥物在動物和人類中之藥物動力學 (PK) 特徵方面取得了重大進展。儘管許多 mAb 藥物表現出與內源性 IgG 相似之 PK 行為，但仍普遍觀察到 mAb 藥物在人類中之非特異性清除率存在顯著異質性。因此，針對理想 PK 特性評估和選擇臨床候選藥物係藥物開發過程中之重要早期步驟。已採用涉及電腦、活體外和活體內分析之廣泛技術來評估和/或預測 mAb 在人類中之 PK 行為（Dostalek 等人，2017, MAbs 9 (5):756-766）。然而，PK 資料從動物到人類以及從活體外測定到活體內讀數之轉換對於藥物開發人員來說仍然難以捉摸（Vugmeyster 等人，2012, World J Biol Chem 3(4):73-92）。此外，雖然一些動物模型如人類 FcRn 轉基因小鼠（Avery 等人，2016, MAbs, 8(6), 1064-1078）和非人靈長類動物（Deng 等人，2011, Drug Metab Dispos 38( 4):600-605）已成功用於預估 mAb 之人類 PK，這些研究通常耗時、成本高且涉及動物犧牲。

從動物研究和活體外測定中預測 mAb 之人類 PK 存在許多複雜性。已知標靶介導之藥物處置 (TMDD) 會影響 mAb 至劑量相關 PK 行為，從而導致非線性分佈和消除。在沒有 TMDD 的情形下，mAb 預計會表現出線性消除和非特異性清除率，這反映了標靶無關分子特異性藥物分解代謝。mAb 之非特異性清除主要由網狀內皮系統中之溶酶體降解介導，其中新生兒 Fc 受體 (FcRn) 介導之補救途徑起主要作用。結構上，FcRn 係異源二聚體，其由與主要組織相容性複合體 (MHC) I 類分子同源之跨膜重鏈 (FCGRT) 和可溶性輕鏈 β2 微球蛋白 (B2M) 組成。FcRn 在酸性 pH（小於 6.5）下與內源性 IgG 至 Fc 域結合，但在中性或鹼性 pH（大於 7.0）下僅最低限度地結合。該獨特特性使 FcRn 能夠保護含 Fc 分子免於降解，方法係在它們被吸收到細胞中後在酸性內體中與它們結合，然後將它們運輸回細胞表面並在生理 pH 下將它們釋放到循環中。相反，不與 FcRn 結合之內化分子被引導至溶酶體進行降解（參見圖 1 和 Roopenian 等人，Nat Rev Immunol. 2007 年 9 月；7(9):715-25）。

雖然 FcRn 在延長含 Fc 蛋白之半衰期方面的作用已得到廣泛認可（Roopenian 等人，2003, J Immunol, 170(7), 3528-3533），但有報導稱 FcRn 結合與人體內之 mAb 藥物之 PK 之間缺乏相關性 (Suzuki, 2010; Zheng, 2011; Hotzel, 2012), 報道表明與 FcRn 之結合親和力不是含 Fc 之蛋白之消除率的唯一決定因素。鑑於 FcRn 在細胞內運輸方面之功能，含 Fc 分子/FcRn 複合體之內體分選和運輸動力學可能會影響 FcRn 介導之補救機制之整體效率，從而影響分子之非特異性清除率。此外，藉由胞飲作用或內吞作用之細胞吸收過程以及溶酶體中之降解過程也可以在確定 mAb 降解之速率和程度方面發揮作用 (Junghans & Anderson,1996, PNAS 93(11), 5512-5516)。最後，據報導，電荷/pI、疏水性、非特異性結合和其他因素等生化特性會影響 mAb 處置（Datta-Mannan 等人，2015, MAbs7(3), 483-493；Igawa 等人，2010 Protein Eng Des Sel23(5), 385-392；Sharma 等人，2014 PNAS111(52)；Hotzel 等人，2012 MAbs4(6), 753-760）。這些分子特徵本身可能會影響 mAb 結構，從而在活體內改變與 FcRn 至「真實」交互作用，或者可能有助於改變內化模式/速率和 FcRn 介導之細胞內運輸途徑（包括再循環和胞吞轉送作用）之相對比例的非特異性細胞表面結合。

在囓齒動物和非人類靈長類動物中進行的活體內動物研究通常用於預測人類中治療性抗體之 PK（Avery 等人，MAbs, 2016, 8(6), 1064-1078；Deng 等人，MAbs 2011, 3( 1), 61-66）。這些方法涉及犧牲動物，成本效益較低，並且不能以高處理量方式進行。根據經驗比例法，在某些情況下，動物研究中之 PK 無法準確預測人類中之 PK 並顯示了跨物種之 PK 差異，其可能係由於 FcRn 結合、標靶介導之藥物處置和觸發差異免疫反應中之物種差異（Wang 等人，2016, Biopharm Drug Dispos, 37(2), 51-65）。活體外測定方面之努力已被用於評估 PK，所藉由之方法之時間和成本消耗更少，並且節省了動物。這些方法中之大多數都考慮了可能影響 PK 的分子特性中之一種或子組，諸如非特異性結合（Hotzel 等人， MAbs2012, 4(6), 753-760）、FcRn 交互作用（Schlottauer 等人， MAbs2013, 5(4), 576-586；Souders 等人， MAbs2015, 7(5), 912-921）、以及與肝素或細胞外基質之結合（de Ridder 等人， Cerebrovasc Dis2013, 35(1), 60-63；Kraft 等人, MAbs2020, 12(1)）。這些方法通常依賴臨界閾值，有時在直接 PK 預測中成效有限，並且必須與另一種方法結合來提高預測準確度。

在腦滲透性的上下文下，缺乏針對抗體之真實世界行為之活體外模型係一個特別挑戰。中樞神經系統 (CNS) 疾病是一種嚴重的健康負擔，幾十年來一直在大力推動開發針對 CNS 疾病之有限治療方法。血腦屏障係高度特化之組織，由具有緊密連接之內皮細胞（以及其他細胞）組成，其調節分子進入大腦之穿行，包括阻止絕大多數當前治療物從血流進入 CNS。雖然存在不同之方法用以改進分子的腦滲透性，但在沒有穩健模型來評估其有效性的清洗下，將這些方法應用於臨床前藥物開發非常具有挑戰性。由於現有模型與活體內效果之間之相關性較差，潛在治療物的腦滲透性通常必須進行經驗測試，這既耗時又費用浩大。

已經開發和評估了一種經過修飾以表現人類 FcRn 之人類微血管內皮細胞 (HMEC1) 系，發現再循環/殘留 mAb 比與其在人類 FcRn 轉基因小鼠中之血清半衰期相關（Grevys 等人， Nat Commun2018, 9(1), 621）。然而，資料組僅限於具有大大增強的 FcRn 結合親和力之工程化 IgG，但不包括更常用於治療性抗體之正常 IgG 框架。此外，細胞在常規細胞培養板中培養，這可能對於細胞極化不理想，並可能導致胞吞轉送成分進入再循環樣品造成污染。

因此，仍然需要預測治療性分子之活體內 PK 特性（例如清除率、半衰期或其他）和腦滲透性之方法，這些方法可以在短時間內以合理的成本進行，以幫助在評估和選擇治療性分子。

本揭露涉及用於測量所關注分子進出細胞膜之運動或運輸（包括所關注分子之再循環和所關注分子之再循環和胞吞轉送作用）之方法、測定、測定系統、套組和組成物。特別地，本揭露提供評估與分子運輸受體（例如，FcRn）交互作用之分子（包括治療性抗體、Fc 融合分子和與白蛋白連接之分子等分子）之藥物動力學特徵（包括例如活體內清除率 (CL)、分佈體積 (Vd)、曲線下面積 (AUC)、生物利用度、最大/最小血漿濃度 (Cmax/Cmin)）之活體外受體相關胞吞轉送作用和再循環測定。與其他方法相比，本文提供之方法和測定可以更好地涵蓋可能影響測試分子（包括抗體）之活體內 PK 行為之的多種因素，諸如非特異性結合和與細胞表面之交互作用、pH 相關結合（例如，FcRn 結合）和細胞內運輸途徑。與其他方法相比，本文提供之方法和測定可以更好地預測和/或模擬所關注分子（包括抗體）之活體內組織滲透率（諸如腦滲透率）。與其他方法和/或測定相比，所提供之方法和測定可進一步提供改善之細胞頂-底側極化，和/或對再循環成分與胞吞轉送作用成分之更清楚評估。

在某些實施例中，本揭露涉及確定複數個分子之再循環之方法。例如，確定可以包括：將複數個分子引入第一腔室，其中：第一腔室與第二腔室藉由細胞層隔開，並且第一腔室和第二腔室包含水溶液；在第一腔室中培養複數個分子；更換第一腔室和第二腔室中之水溶液；及測量從細胞層釋放到第一腔室中之複數個分子之量；其中水溶液處於生理 pH，並且細胞層包含表現介導分子輸送之受體之細胞。

在某些實施例中，該方法進一步包括測量複數個分子跨細胞層之胞吞轉送作用。在某些實施例中，測量胞吞轉送作用包括：在更換水溶液後，測量第二腔室中複數個分子之量。

在某些實施例中，該方法包括在第一腔室中在藥劑之存在下培養複數個分子，並確定藥劑是否影響複數個分子之再循環。

在某些實施例中，本揭露涉及一種確定複數個分子之組織滲透率之方法，包括：a) 將複數個分子引入第一腔室，其中第一腔室與第二腔室藉由細胞層隔開，並且第一腔室和第二腔室包含水溶液；其中水溶液處於生理 pH，並且細胞層包含表現介導分子輸送之受體之細胞；b) 測量從第一腔室再循環到細胞層並返回到第一腔室之複數個分子之量；c) 測量從第一腔室胞吞轉送到第二腔室之複數個分子之量；以及 d) 基於經胞吞轉送之分子與經再循環之分子之比來確定複數個分子之組織滲透率。在一些實施例中，組織滲透率係腦滲透率。

在某些實施例中，測量經再循環之複數個分子包括：在將複數個分子引入第一腔室之後，在第一腔室中培養複數個分子；更換第一腔室和第二腔室中之水溶液；及測量從細胞層釋放到第一腔室中之複數個分子之量。

在某些實施例中，測量經胞吞轉送之複數個分子包括：在將複數個分子引入第一腔室之後，在第一腔室中培養複數個分子；更換第一腔室和第二腔室中之水溶液；及測量從細胞層釋放到第二腔室中之複數個分子之量。

在某些實施例中，測量經再循環之複數個分子之量和測量經胞吞轉送之複數個分子之量獨立地包括使用酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、液體閃爍計數 (LSC)，定量 PCR、螢光分析儀系統、質譜法或它們之任何組合。在某些實施例中，組織滲透率係腦滲透率。

在某些實施例中，該方法包括在第一腔室中在藥劑之存在下培養複數個分子，並確定藥劑是否影響複數個分子之組織滲透率。

在某些實施例中，本揭露涉及一種確定複數個分子之藥物動力學 (PK) 參數之方法，包括：a) 將複數個分子引入第一腔室，其中第一腔室與第二腔室藉由細胞層隔開，並且第一腔室和第二腔室包含水溶液；其中水溶液處於生理 pH，並且細胞層包含表現介導分子輸送之受體之細胞；b) 測量從第一腔室再循環到細胞層並返回到第一腔室之複數個分子之量；c) 基於經再循環之複數個分子之量來確定 PK 參數。

在某些實施例中，細胞表現異源 FcRn。在某些實施例中，測量所再循環之複數個分子之量包括使用酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、液體閃爍計數 (LSC)、定量 PCR、螢光分析儀系統或質譜法。

在某些實施例中，PK 參數係複數個分子之活體內清除率、分佈體積、曲線下面積 (AUC)、生物利用度或活體內半衰期之量度。

在某些實施例中，該方法包括在第一腔室中在藥劑之存在下培養複數個分子，並確定藥劑是否影響複數個分子之 PK 參數。

在某些實施例中，複數個分子為複數個單一分子。在某些實施例中，複數個分子為複數個不同分子。在某些實施例中，細胞層包括細胞單層。在某些實施例中，介導分子輸送之受體為介導分子之胞內輸送之受體。在某些實施例中，介導分子輸送之受體為運鐵蛋白受體、Fc 受體、巨蛋白(megalin)或立方蛋白(cubulin)。在某些實施例中，介導分子輸送之受體為新生兒 Fc 受體 (FcRn)。

在某些實施例中，細胞為真核細胞、哺乳動物細胞或腎細胞。在某些實施例中，細胞為馬丁達比犬腎 (MDCK) 細胞。

在某些實施例中，測量從細胞層釋放之複數個分子之量包括使用酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、液體閃爍計數 (LSC)、定量 PCR、螢光分析儀系統或質譜法。

在某些實施例中，將複數個分子在第一腔室中培養約 1 小時至約 48 小時。在某些實施例中，將複數個分子在第一腔室中培養約 1 小時至約 30 小時。在某些實施例中，更換水溶液包括清洗第一腔室。在某些實施例中，該方法進一步包括在測量之前藉由替代水溶液培養第一腔室和第二腔室。在某些實施例中，在測量之前，藉由替代水溶液培養第一腔室和第二腔室 1 小時至 6 小時。在某些實施例中，培養在約 35℃ 至約 39℃ 之間之溫度下進行。

在某些實施例中，複數個分子為含 Fc 分子。在某些實施例中，含 Fc 分子為受體 Fc 融合分子。在某些實施例中，複數個分子為抗體。在某些實施例中，抗體為單株抗體。在某些實施例中，FcRn 選自由以下所組成之群組：人類 RcRn、小鼠 FcRn、大鼠 FcRn 和食蟹獼猴 FcRn。

在某些實施例中，生理 pH 為約 7.4。

在某些實施例中，本揭露涉及一種測定系統，包括：a) 第一腔室和第二腔室，其中每個腔室包括處於生理 pH 之水溶液；b) 細胞層，該細胞層將第一腔室和第二腔室隔開，其中細胞層可以介導分子從第一細胞層再循環到細胞層中並返回到第一腔室中；c) 偵測器，該偵測器用於偵測第一腔室中分子之存在；其中測定系統經組態確定偵測器分子之再循環，其中該確定包括：將複數個分子引入該第一腔室；在第一腔室中培養複數個分子；更換第一腔室和第二腔室中之水溶液；及測量從細胞層釋放到第一腔室中之複數個分子之量。

在某些實施例中，測定系統進一步包括：偵測器，該偵測器用於偵測第二腔室中分子之存在；細胞層可以介導分子從第一腔室到第二腔室之胞吞轉送作用；並且其中測定系統經組態確定複數個分子跨細胞層之胞吞轉送作用，其中確定轉胞吞作用包括：在已經替換水溶液之後，測量該第二腔室中複數個分子之量。

在某些實施例中，本揭露涉及一種套組，該套組本包括本揭露之測定系統和/或方法。

相關申請的交叉引用

本申請案主張 2021 年 4 月 14 日提出申請之美國臨時申請案第 63/174,913 號及 2021 年 5 月 12 日提出申請之美國臨時申請案第 63/187,750 號的權益，此處將該些申請案之內容以全文引用之方式併入本文。 序列表

本申請包含序列表，該序列表已經以 ASCII 格式以電子方式提交，並以引用方式以其全部內容併入本文。該 ASCII 副本創建於 2022 年 3 月 15 日，命名為「P36572-TW_SL.txt」，大小為 16,584 位元組。

在實踐當前所揭示之主題時，使用了分子生物學、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學中之許多常規技術。這些技術在以下出版物中進行了更詳細之描述：例如，Molecular Cloning: Laboratory Manual 第 3 版，J. F.Sambrook 和 D.W.Russell 編輯，Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001; Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Melvyn Little 編輯，Cambridge University Press 2009；「Oligonucleotide Synthesis」（M. J. Gait 編輯，1984）；「Animal Cell Culture」（R. I. Freshney 編輯，1987）；「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.)；「Current Protocols in Molecular Biology」（F. M. Ausubel 等人編輯，1987，以及定期更新）；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」，Mullis 等人編輯，1994）；「A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988)《噬菌體展示：實驗室手冊》（「Phage Display: A Laboratory Manual」，Barbas 等人，2001 年）。這些參考文獻和包含標準協議之其他參考文獻之內容，包括製造商之說明書，為本領域技術人員所熟知和依賴，據此以引用方式併入本文作為本揭露之一部分。 1. 定義

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術術語、符號和其他科學術語旨在具有本揭露所屬領域的技術人員通常理解的含義。在某些情況下，為了清楚和/或易於參考，本文定義了具有通常理解的含義的術語，並且在本文中包括此類定義不應解釋為表示與本領域通常理解的定義具有實質性區別。

如本文所用，術語「包含」、「包括」、「具有 (having、has)」、「可」、「含有」及其變異體意欲為不排除其他行為或結構之可能性之開放式連接詞 (open-ended transitional phrase)、術語、或字。除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一 (a、an)」及「該 (the)」包括複數個提及物。本揭露亦涵蓋「包含」本文所呈現之實施例或元件、「由其組成」及「基本上由其組成」之本文所呈現之實施例或元件，無論是否明確陳述。

如本文中所使用，術語「約」或「大約」係指特定值處於如由熟習此項技術者所確定之特定值的可接受誤差範圍內，其部分地取決於如何測量或判定該值，亦即取決於測量系統的侷限性。舉例而言，根據業內之實踐，在某些實施例中，「約」可意指 3 倍或 3 倍以上之標準偏差。可替代地，在某些實施例中，「約」可以意指至多 20%、至多 10%、至多 5% 或至多 1% 的給定值之範圍。可替代地，特別是關於生物系統或過程，該術語意指數值的一個數量級內，例如在數值的 5 倍以內，或在數值的 2 倍以內。

如本文所用，術語「培養基」和「細胞培養基」係指用於生長或維持細胞之營養源。如本領域技術人員所理解，營養源可以含有細胞生長和/或存活所需之成分，或者可以含有有助於細胞生長和/或存活之成分。維生素、必需或非必需胺基酸（例如，半胱胺酸和胱胺酸）和微量元素（例如，銅）為培養基成分之實例。本文提供之任何培養基也可以補充有胰島素、植物水解產物和動物水解產物中的任何一種或多種。

如本文所用，短語「藥物動力學 (PK) 參數」係指本領域已知的多種 PK 參數中的任何一種，包括但不限於體複數個分子之內清除率 (CL)、分佈體積 (Vd)、曲線下面積 (AUC)、生物利用度、最大/最小血漿濃度 (Cmax/Cmin) 或活體內半衰期 (t½)。

如本文所用，術語「清除率」係指分子或多肽從動物血流中清除的速率。動物可以為例如哺乳動物，諸如囓齒動物（小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠或其他囓齒動物）、非人靈長類動物（諸如食蟹獼猴）、狗或人類。

如本文所用，術語「生理 pH」係指約 6.5 至約 8.0 之 pH。在某些實施例中，生理 pH 值係介於約 6.5 與約 8.0 之間的任何值，例如，約 6.6、約 6.7、約 6.8、約 6.9、約 7.0、約7.1、約 7.2、約 7.3、約 7.4、約 7.5、約 7.6、約 7.7、約 7.8、或約 7.9，或者係約 6.5 至約 8.0 之範圍內的任何範圍。

「培養」細胞係指使細胞與細胞培養基在適於存活及/或生長及/或增殖細胞之條件下接觸。

如本文所用，「分子」通常係指作為測定對象的分子。例如，但不作為限制，分子可以為任何與 FcRn 天然結合之分子（例如，多肽、抗體、含 Fc 分子等）或已被工程化以結合 FcRn，諸如但不限於含白蛋白之分子、經工程化以經由肽標籤或其他胺基酸序列結合 FcRn 的分子、抗體、抗體片段、或如下定義之多株或單株抗體。此類多肽、蛋白、抗體、抗體片段或多株或單株抗體可以包括非天然存在的態樣，包括但不限於非天然存在的胺基酸、非胺基酸連接子或間隔物，並且可以包括與其他組成物的結合體，例如小分子或大分子治療藥。

如本文所用，「多肽」通常是指具有多於約十個胺基酸的肽及蛋白質。多肽可與宿主細胞同源，或者係與被利用之宿主細胞異源，即，外來的，諸如由中國倉鼠卵巢細胞所產生或由哺乳動物細胞所產生之酵母多肽的人蛋白。在某些實施例中，使用哺乳動物多肽 (最初來自哺乳動物生物體的多肽)，並且在某些實施例中，本揭露之多肽直接分泌到培養基中。

術語「蛋白質」係指鏈長度足以產生三級及/或四級結構之更高程度的胺基酸序列。此係用於區別「肽」或其他沒有此種結構的小分子量藥物。典型地，本文之蛋白可具有至少約 15-20 kD，以及在某些實施例中，至少約 20 kD 之分子量。涵蓋於本文定義內之蛋白質之實例包括所有哺乳動物蛋白 (尤其治療蛋白及診斷蛋白，例如治療抗體及診斷抗體) 及通常含有一個或多個二硫鍵的蛋白質 (包括含有一個或多個鏈間及/或鏈內二硫鍵之多鏈多肽)。

本文中所用之術語「抗體」為在最寬廣意義上使用且涵蓋各種類型之抗體和抗體結構，包括但不限於多株抗體或單株抗體、人類、人源化或嵌合抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）及抗體片段，其等展示出期望之抗原結合活性。

本文所用之「抗體片段」、抗體之「抗原結合部分」（或簡稱為「抗體部分」）或抗體之「抗原結合片段」係指除完整抗活體外的分子，其包含完整抗體中結合完整抗體之結合抗原和/或抗原決定基的部分。抗體片段之實例包括（但不限於）Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、二價抗體、線性抗體、單鏈抗體分子（例如 scFv）及自多特異性（例如雙特異性）抗體形成之抗體片段。

如本文所用的術語「單株抗體」或「mAb」係指獲自實質上同源抗體群體之抗體，即包含群體的個別抗體是相同的和/或結合相同的抗原決定位，除了例如含有天然生成之突變或於單株抗體製劑生產過程中產生的可能的變異體抗體之外，此等變異體通常係以少量存在。與通常包括針對不同決定位 (抗原決定基) 之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定位。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，待根據本文所揭露之標的使用的單株抗體可藉由多種技術來製造，其包括但不限於融合瘤方法、重組 DNA 方法、噬菌體展示方法、及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座之基因轉殖動物之方法，本文描述此等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法。

術語「融合瘤」係指藉由融合免疫來源之永生細胞株及抗體產生細胞所產生的雜合細胞株。該術語涵蓋異源雜合骨髓瘤融合體之子代，該等融合體係融合人類細胞及鼠類骨髓瘤細胞株且隨後與漿細胞 (通常稱為三源雜交瘤細胞株) 融合之結果。另外，該術語意欲包括產生抗體之任何永生化雜合細胞株，例如四源雜交瘤。例如參見 Milstein 等人，Nature, 537:3053 (1983)。

如本文所用，術語「細胞」指動物細胞、哺乳動物細胞、經培養細胞、宿主細胞、重組細胞及重組宿主細胞。此類細胞一般是從哺乳動物組織獲所得或衍生的細胞株，當置於含有適當營養物及/或生長因子的培養基中時，其能夠生長及存活。

如本文所用，術語「異源基因」係指編碼對所利用之宿主細胞外源的蛋白的基因，諸如編碼由中國倉鼠卵巢細胞產生之人蛋白之基因，或編碼哺乳動物細胞中產生之酵母多肽之基因。

如本文所用，「複數個分子」包括複數個單一分子和複數個不同分子。複數個單一分子例如可以為相同抗體之兩個或更多個物理分子、相同抗體片段之兩個或更多個物理分子、相同多肽之兩個或更多個物理分子、或相同含 Fc 分子之兩個或更多個物理分子或另一種所關注分子之兩個或多個物理分子。複數個不同分子可包括一種分子類型（例如，至少兩種不同抗體之物理分子、至少兩種不同抗體片段之物理分子、至少兩種不同多肽之物理分子、或至少兩種含 Fc 分子之的物理分子）之混合物，但也可以包括分子類型之間之混合物（例如，一種或多種抗體和一種或多種多肽之物理分子；或一種或多種抗體片段、一種或多種多肽和一種或多種含 Fc 分子等）。

如本文所用，「測試分子」和「所關注分子」係指本文所述之測定、方法、套組和系統中評估之複數個分子之同一性。如針對複數個分子所描述，此類術語既涵蓋單一類型之分子（例如，一種抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子），又涵蓋兩種或更多種類型之分子（例如，兩種或更多種抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子，或該類別之組合）。

如本文所用，「小分子」係指除蛋白質或多肽之外之分子，其分子量為約 2000 道爾頓 (dalton) 或更小，或較佳地約 500 道爾頓或更小。 2. 概述

本揭露涉及用於測量所關注分子進出細胞膜之運動或運輸（諸如所關注分子之再循環（如圖 1 所描繪））之方法、測定、測定系統、套組和組成物。本揭露進一步涉及用於測量所關注分子之胞吞轉送作用和再循環（如圖 1 所描繪）之方法測定、測定系統、套組和組成物。特別地，本揭露涉及用於評估治療性抗體分子之 PK 參數（諸如清除率和/或半衰期）之活體外受體相關再循環和胞吞轉送測定。如本文中所詳細揭示，藉由本揭露之方法測量之所關注分子（例如，抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之再循環（視情況與胞吞轉送進一步組合）可能與細胞之 PK 特性，諸如該分子之活體內清除率高度關聯。因此，所要求保護之用於測量所關注分子的再循環以及在某些情況下胞吞轉送作用和再循環之組合之方法可用於評估該分子之活體內清除率和其他 PK 參數，諸如複數個分子的半衰期、體積分佈 (Vd)、曲線下面積 (AUC)、生物利用度和最大/最小血漿濃度 (Cmax/Cmin)。更進一步地，藉由本揭露之方法測量之所關注分子（例如抗體或其抗體片段）之再循環（視情況與胞吞轉送作用進一步結合）可以與該所關注分子之活體內組織滲透率高度相關. 因此，在一些實施例中，所要求保護之用於測量所關注分子之再循環以及在某些情況下胞吞轉送作用和再循環之組合之方法可用於評估該所關注分子之活體內組織滲透率。組織滲透率可以包括例如腦滲透率。

在某些實施例中，方法包括：藉由測量一個或多個分子從第一腔室中的溶液中之吸收以及在原始溶液已被第二溶液替換後這些分子到第一腔室之返回，測量複數個相同所關注分子從第一腔室到相同腔室之跨細胞再循環，其中第一腔室和第二腔室中之每一者都具有生理 pH 值（例如，pH＝約 7.4）。在一些實施例中，還評估了複數個相同所關注分子從第一腔室到第二腔室之跨細胞輸送。在其他實施例中，方法包括：測量複數個不同所關注分子（例如，兩種、三種、四種、五種或更多種類型之所關注分子）之跨細胞再循環，其視情況可包括評估複數個不同所關注分子從第一腔室到第二腔室之跨細胞輸送。使用分隔第一腔室和第二腔室之細胞層進行該測定的使用。在某些實施例中，細胞層穩定地表現一種或多種介導分子輸送之受體。此類受體可以為任何所關注受體，包括但不限於運鐵蛋白受體、Fc 受體、巨蛋白或立方蛋白。

因此，例如，在一個態樣中，本文提供了一種基於細胞之測定，該測定採用穩定表現人類 FcRn 和 β2-微球蛋白基因之 MDCK 細胞來測量多肽、抗體或其他 FcRn 結合分子之再循環效率，以及進一步視情況之胞吞轉送作用，測量係在與 FcRn 介導之 IgG 補救途徑相關之條件下進行。該胞吞轉送作用和再循環測定係在生理 pH 條件下進行的，並且旨在評估 IgG 與細胞之非特異性結合、其經由胞飲作用之吸收、其與 FcRn 之 pH 相關交互作用以及細胞內運輸和分類過程之動力學中之兩者或更多者之組合效應的結果。在該特定實施例中，FcRn 之表現係促進測定中測試分子之胞吞轉送作用和再循環所必需的，並且直接有助於所觀察到之相關性。進一步地，諸如本文所提供之測定能夠正確排列臨床前物種中含 Fc 分子之電荷或醣基化變異體之清除率。實例中所提供之結果支持本文所揭示之測定作為用於評估多肽、抗體或其他 FcRn 結合分子（包括在先導選擇和優化以及針對期望藥物動力學特性之工藝開發過程中之候選抗體藥物）之節省成本、節省動物之篩選工具。

本揭露還涉及用於藉由確定複數個分子之胞吞轉送作用/再循環 (T/R) 比來確定複數個分子之組織滲透率之方法和組成物。在某些實施例中，方法包括基於經胞吞轉送之分子與經再循環之分子之比來確定複數個分子之腦滲透率。所要求保護之用於測量胞吞轉送作用和再循環以及確定所關注分子之 T/R 比之方法可用於評估分子之腦滲透率以及其他 PK 參數，諸如半衰期。諸如本文所提供之活體外測定顯示了與臨床前物種中含 Fc 分子之腦滲透率的相關性。因此，實例中所提供之結果支持本文所揭示之測定作為用於在導聯選擇和優化以及針對期望組織滲透率特性之工藝開發過程中，評估多肽、抗體或其他 FcRn 結合分子（包括候選抗體藥物）之節省成本、節省動物之篩選工具。

本揭露涉及本文所提供之方法、測定、測定系統、套組和組成物，其可用於評估複數個相同所關注分子（例如，相同類型之抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）或複數個兩種或更多種所關注分子（例如，選自抗體、抗體片段、多肽、含 Fc 分子或它們的任何混合物之兩種或更多種所關注分子）之運動或輸送（例如，再循環或再循環和胞吞轉送作用）、一個或多個PK參數和/或組織滲透率（例如，腦滲透率）。 3. 再循環以及再循環和胞吞轉送作用測定

再循環係指大分子從細胞一側到同一側之囊泡輸送。再循環係一種跨細胞輸送機制，其中細胞將細胞外物質包裹在細胞膜內陷中形成囊泡，然後在細胞內移動囊泡以藉由相反的過程將該物質透過同一細胞膜排出。參見圖 1。

胞吞轉送作用係指大分子從細胞一側到另一側之囊泡輸送，其為多細胞生物體在不改變兩種環境之獨特組成之情形下選擇性地在這兩種環境之間移動物質所使用之策略。胞吞轉送作用係一種跨細胞輸送機制，其中細胞將細胞外物質包裹在細胞膜內陷中形成囊泡，然後跨細胞移動囊泡以藉由相反的過程將物質透過透過相對細胞膜排出。參見圖 1。

在典型 FcRn 介導之胞吞轉送作用測定中，表現 FcRn 之 MDCK 細胞在轉移盤中的濾膜上生長至匯合，並且在測定之前，藉由以酸性測定緩衝液 (pH ＜ 6.0) 填充內腔室以及以鹼性測定緩衝液 (pH ＞ 7.4) 填充外腔室來產生 pH 梯度。該測定設計利用 FcRn 之 pH 相關結合特性，以藉由在酸性 pH 下與細胞表面上之 FcRn 結合和在鹼性 pH 下釋放測試分子（這兩者都提高了測定之穩健性和靈敏度），促進細胞對測試分子之吸收。然而，可以改進使用該測定對測試分子之 PK 行為進行之預測評估。所轉染之細胞通常在細胞表面上表現高水準之 FcRn，並且測試抗體在酸性環境中與細胞一起培養，因此認為在酸性 pH 下對 FcRn 表現出高結合親和力之測試分子（諸如抗體）容易結合 FcRn 並經由 FcRn 介導之內吞作用進入細胞。這與通常在活體內發生的情形形成對比，其中多肽或抗體在生理 pH 值下與細胞表面 FcRn 結合最少，並且細胞吸收主要藉由非特異性液相胞飲作用來介導。因此，不受理論之束縛，認為 pH 梯度胞吞轉送作用測定之輸出會受到多肽或抗體在酸性 pH 下之 FcRn 結合親和力之嚴重影響，因此可能並不總是充分反映其他影響 PK 之因素（諸如靜電交互作用和細胞內運輸參數）之貢獻。此外，人為 pH 條件可能本質上對細胞有害，限制了測定之持續時間並可能產生額外的人為測定結果。

因此，如實例中所更詳細描述，本文提供了一種用於評估分子在細胞環境中之輸送之改進方法，該方法可進一步用於更準確地確定或測量一個或多個 PK 參數（例如，活體內清除率 (CL)、分布體積 (Vd)、曲線下面積 (AUC)、生物利用度、最大/最小血漿濃度 (Cmax/Cmin) 或活體內半衰期 (t½)）或組織滲透率（諸如腦滲透率）。因此，例如，在某些實施例中，本揭露提供了用於確定或測量複數個分子之再循環之方法。例如，確定或測量可以包括：將複數個分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）引入第一腔室，其中：第一腔室與第二腔室藉由細胞層隔開，並且第一腔室和第二腔室包含水溶液；在第一腔室中培養複數個分子；更換第一腔室和第二腔室中之水溶液；以及測量從細胞層釋放到第一腔室中之複數個分子之量；其中水溶液處於生理 pH，並且細胞層包含表現介導分子輸送之受體之細胞。

在本文所提供之方法、測定和系統的某些實施例中，生理 pH 值為約 6.5 至約 8.0。在某些實施例中，生理 pH 值係介於約 6.5 與約 8.0 之間的任何值，例如，約 6.6、約 6.7、約 6.8、約 6.9、約 7.0、約7.1、約 7.2、約 7.3、約 7.4、約 7.5、約 7.6、約 7.7、約 7.8、或約 7.9，或者係約 6.5 至約 8.0 之範圍內的任何範圍。在某些實施例中，只要兩個腔室都具有生理 pH，每個腔室之 pH 就可以不同。例如但不作為限制，第一腔室可以具有 6.5 之 pH，而第二腔室可以具有 8.0 之 pH，或反之亦然。在某些實施例中，生理 pH 可以為約 7.4。

在某些實施例中，本揭露涉及一種確定複數個分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之藥物動力學 (PK) 參數之方法，包括：a) 將複數個分子引入第一腔室，其中第一腔室與第二腔室藉由細胞層隔開，並且第一腔室和第二腔室包含水溶液；其中水溶液處於生理 pH，並且細胞層包含表現介導分子輸送之受體之細胞；b) 測量從第一腔室再循環到細胞層並返回到第一腔室之複數個分子之量；c) 基於經再循環之複數個分子之量來確定 PK 參數。在某些實施例中，測量經再循環之複數個分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）包括：在將複數個分子引入第一腔室之後，在第一腔室中培養複數個分子；更換第一腔室和第二腔室中之水溶液；以及測量從細胞層釋放到第一腔室中之複數個分子之量。在某些實施例中，複數個分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）在第一腔室中培養約 1 小時至約 48 小時、約 1 小時至約 30 小時、約 1 小時至約 24 小時、約 1 小時至約 12 小時、約 1 小時至約 6 小時、或約 1 小時至約 4 小時，或它們中之任何值，諸如約 1 小時、約 2 小時、約 4 小時、約 6 小時、約 8 小時、約 12 小時或約 18 小時。在某些實施例中，更換水溶液包括清洗第一腔室。在某些實施例中，該方法進一步包括在測量之前藉由替代水溶液培養第一腔室和第二腔室。在某些實施例中，第一腔室和第二腔室在測量前以替代水溶液培養約 10 分鐘至約 12 小時、約 20 分鐘至約 12 小時、約 30 分鐘至約 6 小時、約 20 分鐘至約5 小時或約 1 小時至約 4 小時，或它們中之任何值，諸如 30 分鐘、1 小時、2 小時、3 小時或 4 小時。在某些實施例中，培養在約 35℃ 至約 39℃ 之間之溫度（諸如約 37℃）下進行。在一些實施例中，使用具有至少 200 pg/mL、至少 100 pg/mL、至少 50 pg/mL 或個位數 pg/mL 之較低水準定量下限 (LLOQ) 之定量方法。此類方法可包括例如使用高親和力捕獲試劑之 ELISA，該試劑可以為例如生物素化小鼠抗人 IgG-Fc，諸如生物素-R10Z。在某些實施例中，複數個分子為複數個相同分子（例如，相同類型之抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子），而在其他實施例中，複數個分子為複數個分子（例如，一個或多個不同抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 的分子，或它們之混合物）之混合物。

在某些實施例中，再循環之量度可藉由以下方法來確定：測量從第一腔室中之溶液中一個或多個分子（包括，例如，抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之吸收以及在原始溶液被第二溶液替換後這些分子到第一腔室之返回。在其中還評估了胞吞轉送作用的一些實施例中，胞吞轉送作用之量度可以藉由測量一個或多個分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）從第一腔室中之溶液到第二腔室中之溶液的胞吞轉送作用來確定其中第一腔室和第二腔室由細胞單層隔開，並且每個腔室中之溶液處於生理 pH。在某些實施例中，該細胞或複數個細胞係真核的，諸如哺乳動物的，例如源自囓齒動物（諸如小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠或其他哺乳動物）、狗、非人靈長類動物（諸如食蟹獼猴）或人類。本文更詳細地描述了可以使用之細胞。在某些實施例中，該細胞或複數個細胞可以為馬丁達比犬腎 (MDCK) 細胞。在一些實施例中，該細胞或複數個細胞為野生型。在其他實施例中，它們表現一種或多種所關注異源受體。在某些實施例中，該等細胞包含至少一種異源基因。在某些實施例中，該至少一種異源基因可以選自由以下所組成之群組：FCGRT 基因和 B2M 基因。在某些實施例中，該等細胞可以表現異源細胞表面蛋白。在某些實施例中，異源細胞表面蛋白可以包含新生兒 Fc 受體 (FcRn)。在某些實施例中，測量分子之再循環和視情況之胞吞轉送作用包括使用酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、液體閃爍計數 (LSC)、定量 PCR 或螢光分析儀系統。在一些實施例中，測量分子之再循環和視情況之胞吞轉送作用包括使用能夠評估所關注分子之亞納摩爾濃度之定量方法。在一些實施例中，使用具有至少 200 pg/mL、至少 100 pg/mL 或至少 50 pg/mL 之較低水準定量下限 (LLOQ) 之定量方法。此類方法可包括例如使用高親和力捕獲試劑之 ELISA，該試劑可以為例如生物素化小鼠抗人 IgG-Fc，諸如生物素-R10Z。在本揭露之實例部分中描述了此類敏感 ELISA 方法。在一些實施例中，此類敏感定量方法用於測量再循環，但不太敏感之（例如，納摩爾濃度下具有 LLOQ之）方法用於評估胞吞轉送作用。在一些實施例中，使用（例如來自 Quanterix、Gyrolab 或 Singulex 之）敏感自動化免疫測定平台來定量經再循環之分子和/或經胞吞轉送之分子。在某些實施例中，本揭露之方法可進一步包括基於所測量之分子數量，確定複數個分子之活體內清除率 (CL)、分佈體積 (Vd)、曲線下面積 (AUC)、生物利用度、最大/最小血漿濃度 (Cmax/Cmin)，或活體內半衰期 (t½)。在某些實施例中，該分子可以為與所關注受體天然結合的分子，或經工程化以與所關注受體結合的分子，其中所關注受體由該細胞或複數個細胞表現。因此，在一些實施例中，該分子為與 FcRn 天然結合的分子或經工程化以與 FcRn 結合的分子。在某些實施例中，該分子可以為含 Fc 分子。在某些實施例中，該分子可為抗體。在某些實施例中，該抗體可以為單株抗體。在某些實施例中，該抗體可以為抗 IgE 抗體、抗 VEGF 抗體、抗整合素抗體（例如抗 α4β7 整合素抗體）、抗 IL-6 抗體、抗 TNFa 抗體、抗 BACE1 抗體或抗 gD 抗體。在一些實施例中，該抗體可以為奧馬珠單抗 (omalizumab)、貝伐珠單抗 (bevacizumab)、維多珠單抗 (vedolizumab)、托珠單抗 (tocilizumab)、阿達木單抗 (adalimumab)、抗 BACE1 WT、抗 BACE1 變異體 YEY（突變：M252Y；N286E；N434Y）、抗 BACE1 變異體 YQAY（突變：M252Y；T307Q；Q311A；N434Y）、抗 BACE1 變異體 YPY（突變：M252Y；V308P；N434Y）、抗 BACE1 變異體 YY（突變：M252Y；N434Y)、抗 BACE1 變異體 YLY1 (Q6)（突變：M252Y；M428L；N434Y；Y436I）、或抗 BACE1 變異體 YIY (T3)（突變：M252Y；Q311I；N434Y）。在某些實施例中，該分子可以為含白蛋白分子。在某些實施例中，生理 pH 為約 6.5 至約 8.0。在某些實施例中，生理 pH 值係介於約 6.5 與約 8.0 之間的任何值，例如，約 6.6、約 6.7、約 6.8、約 6.9、約 7.0、約7.1、約 7.2、約 7.3、約 7.4、約 7.5、約 7.6、約 7.7、約 7.8、或約 7.9，或者係約 6.5 至約 8.0 之範圍內的任何範圍。在某些實施例中，只要兩個腔室都具有生理 pH，每個腔室之 pH 就可以不同。例如但不作為限制，第一腔室可以具有 6.5 之 pH，而第二腔室可以具有 8.0 之 pH，或反之亦然。在某些實施例中，生理 pH 可以為約 7.4。在某些實施例中，確定 PK 參數，諸如複數個分子之活體內清除率 (CL)、分佈體積 (Vd)、曲線下面積 (AUC)、生物利用度、最大/最小血漿濃度 (Cmax/Cmin) 、或活體內半衰期 (t½) 之量度。在其他實施例中，單獨或組合地確定組織滲透率，諸如腦滲透率。

在某些實施例中，本揭露涉及一種測定系統，包括：a) 第一腔室和第二腔室，其中每個腔室包括處於生理 pH 之水溶液；b) 細胞層，該細胞層將第一腔室和第二腔室隔開，其中細胞層可以介導分子從第一細胞層再循環到細胞層中並返回到第一腔室中；c) 偵測器，該偵測器用於偵測第一腔室中分子之存在；其中測定系統經組態確定偵測器分子之再循環，其中該確定包括：將複數個分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）引入第一腔室；在第一腔室中培養複數個分子；更換第一腔室和第二腔室中之水溶液；及測量從細胞層釋放到第一腔室中之複數個分子之量。形成細胞層之細胞可以為可以穩定生長以形成細胞層之任何細胞，如本文所進一步描述。在某些實施例中，可以將細胞以約 1 × 10 ⁵個細胞/孔之密度接種在細胞生長培養基中。細胞生長培養基可以為任何適合生長所選細胞之培養基。在某些實施例中，細胞生長培養基可以為補充有 10% FBS、100 單位青黴素/鏈黴素和 5 μg/mL 嘌呤黴素之 DMEM （高糖）。在一些實施例中，內腔室和外腔室中之培養基之體積獨立地為 25 μL 至 500 μL、或 50 μL 至 350 μL、或 50 μL 至 200 μL。在某些實施例中，內腔室中之培養基可以為 100 μL，外腔室中之培養基可以為 200 μL。在某些實施例中，該等細胞可以在鍍板後的第二天使用。在某些實施例中，可以將測試分子添加至約 100 μg/mL (0.67 μM) 之最終濃度並在 37℃ 組織培養箱中培養 24 小時。在某些實施例中，螢光黃 (Lucifer Yellow) （Lucifer Yellow CH，二鋰鹽；Sigma Aldrich；St. Louis MO）可以在細胞生長培養基中製備並且可以在 24 小時測定培養的最後 90 分鐘進行添加。在某些實施例中，可以藉由將來自外腔室之樣品中之螢光訊號除以內腔室之螢光訊號來計算測定期間螢光黃之被動穿過水準。在某些實施例中，來自在外腔室中表現出大於 0.1％的螢光黃之被動穿過的孔之胞吞轉送作用和再循環結果可以被丟棄，亦即，僅使用其中螢光黃之被動通過的小於 0.1％之孔。在一些實施例中，偵測器系統為能夠評估所關注分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之亞納摩爾(sub-nanomolar )濃度之偵測器系統，其 LLOQ 諸如至少為 200 pg/mL、至少 100 pg/mL、或至少 50 pg/mL。在一些實施例中，偵測器系統包括使用高親和力捕獲試劑之 ELISA 測定，該試劑可以為例如生物素化小鼠抗人 IgG-Fc，諸如生物素-R10Z。此類敏感方法在本文的示例中進行了描述。

在某些實施例中，可以將測試分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）添加到跨孔測定的外腔室或內腔室中，並且可以藉由以下方法測量再循環：在適當培養時段之前測量在同一腔室（例如，分別為外腔室或內腔室）中存在的測試分子之量、清除培養基並更換它（追蹤步驟）。在一些實施例中，還藉由測量存在於相對腔室（例如，分別為內腔室或外腔室）中之測試分子之量來偵測測試分子之胞吞轉送作用。在某些實施例中，測試分子從暴露於細胞之頂端膜的腔室再循環回到同一腔室。在一些實施例案中，測試分子從暴露於細胞之底側膜之腔室再循環回到同一腔室。在更進一步的實施例中，將測試分子從暴露於細胞之頂膜之腔室胞吞轉送至暴露於細胞之底側膜之腔室。

在某些實施例中，本揭露提供了用於確定或預測一種或多種分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之 PK 參數之方法，包括：a) 引入分子進入兩個腔室中之第一腔室，其中第一腔室與第二腔室由一個或複數個細胞隔開，並且其中第一腔室和第二腔室中的每一者都具有生理 pH 值；及 b) 測量從第一腔室循環到第一腔室之分子之數量。在某些實施例中，生理 pH 為約 6.5 至約 8.0。在某些實施例中，生理 pH 值係介於約 6.5 與約 8.0 之間的任何值，例如，約 6.6、約 6.7、約 6.8、約 6.9、約 7.0、約7.1、約 7.2、約 7.3、約 7.4、約 7.5、約 7.6、約 7.7、約 7.8、或約 7.9，或者係約 6.5 至約 8.0 之範圍內的任何範圍。在某些實施例中，只要兩個腔室都具有生理 pH，每個腔室之 pH 就可以不同。例如但不作為限制，第一腔室可以具有 6.5 之 pH，而第二腔室可以具有 8.0 之 pH，或反之亦然。在某些實施例中，生理 pH 可以為約 7.4。在一些實施例中，PK 參數為活體內清除率 (CL)、分佈體積 (Vd)、曲線下面積 (AUC)、生物利用度、最大/最小血漿濃度 (Cmax/Cmin) 或活體內半衰期 (t½)。在某些實施例中，PK 參數為活體內清除率。

在某些實施例中，測定系統進一步包括：偵測器，該偵測器用於偵測第一腔室中分子之存在；細胞層可以介導分子從第一腔室到第二腔室之再循環；並且其中測定系統經組態確定複數個分子從細胞層進入第一腔室之再循環，其中確定再循環包括：在已經替換水溶液之後，測量第一腔室中複數個分子之量。在一些實施例中，還測量胞吞轉送作用。在某些實施例中，測定系統進一步包括：偵測器，該偵測器用於偵測第二腔室中分子之存在；細胞層可以介導分子從第一腔室到第二腔室之胞吞轉送作用；並且其中測定系統經組態確定複數個分子跨細胞層之胞吞轉送作用，其中確定轉胞吞作用包括：在已經替換水溶液之後，測量該第二腔室中複數個分子之量。在一些實施例中，用於偵測第一腔室中分子之存在之偵測器能夠評估一種或多種所關注分子（包括，例如，抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之亞納摩爾濃度，諸如具有至少 200 pg/mL、至少 100 pg/mL 或至少 50 pg/mL 之 LLOQ。在一些實施例中，用於偵測第二腔室中分子之存在之偵測器具有相似敏感度。在其他實施例中，該偵測器沒有，例如，其可具有納摩爾濃度範圍內之 LLOQ。

在某些實施例中，本揭露提供用於測量複數個相同分子或複數個不同分子之跨細胞輸送之測定，包括第一腔室和第二腔室，第一腔室和第二腔室中之每一者都具有生理 pH 值，其中第一腔室接收複數個分子並經組態允許分子胞吞轉送到第二腔室並且允許分子再循環回到第一腔室。在某些實施例中，生理 pH 為約 6.5 至約 8.0。在某些實施例中，生理 pH 值係介於約 6.5 與約 8.0 之間的任何值，例如，約 6.6、約 6.7、約 6.8、約 6.9、約 7.0、約7.1、約 7.2、約 7.3、約 7.4、約 7.5、約 7.6、約 7.7、約 7.8、或約 7.9，或者係約 6.5 至約 8.0 之範圍內的任何範圍。在某些實施例中，只要兩個腔室都具有生理 pH，每個腔室之 pH 就可以不同。例如但不作為限制，第一腔室可以具有 6.5 之 pH，而第二腔室可以具有 8.0 之 pH，或反之亦然。在某些實施例中，生理 pH 可以為約 7.4。

在某些實施例中，本揭露提供用於確定或預測一種或多種分子之一個或多個 PK 參數之測定，包括第一腔室和第二腔室，第一腔室和第二腔室中之每一者都具有生理 pH 值，其中第一腔室接收複數個分子並且經組態允許分子從第一腔室再循環回到第一腔室，並且視情況經組態允許分子從第一腔室胞吞轉送到第二腔室。在某些實施例中，生理 pH 值為約 7.4。在一些實施例中，PK 參數為活體內清除率 (CL)、分佈體積 (Vd)、曲線下面積 (AUC)、生物利用度、最大/最小血漿濃度 (Cmax/Cmin) 或活體內半衰期 (t½)。在一些實施例中，PK 參數為活體內清除率。

在某些實施例中，第一腔室可以包含細胞單層。在某些實施例中，測定中所使用之細胞選自下文標題為「細胞」之第 4 節中提供之列表。在某些實施例中，用於在測定中之細胞為真核細胞。在一些實施例中，該等細胞為哺乳動物細胞。在某些實施例中，該等細胞為腎細胞。在一些實施例中，該腎細胞係囓齒動物、非人靈長類動物、人類或犬科動物之細胞。在一些實施例中，該等細胞為 MDCK 細胞。在某些實施例中，在本揭露中所描述之方法中使用之細胞可以包含至少一種異源基因。在某些實施例中，該至少一種異源基因可以選自由以下所組成之群組：FCGRT 基因和 B2M 基因。在某些實施例中，在本揭露中所描述之方法中使用之細胞可以表現細胞表面蛋白。在某些實施例中，細胞表面蛋白包含 Fc 受體 (FcR)。在某些實施例中，細胞表面蛋白包含新生兒 Fc 受體 (FcRn)。

在某些實施例中，分子可以被標記或未被標記。所標記之分子之非限制性實例包括 3H 標記之、螢光標記之分子或放射性同位素，例如 I-125 和 P-32。

在某些實施例中，本揭露之方法包括測量經再循環之分子和視情況之跨細胞輸送之分子之數量。在某些非限制性實施例中，可藉由酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、液體閃爍計數 (LSC)、定量 PCR、螢光分析儀系統、共聚焦顯微鏡或活細胞成像系統、或它們的任何組合來進行測量經再循環或跨細胞輸送之分子的數量。設想使用不同偵測方法來偵測經再循環之分子與經胞吞轉送之分子。在一些實施例中，測量方法為能夠評估所關注一種分子或多種分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之亞納摩爾濃度之測量方法，其 LLOQ 諸如至少為 200 pg/mL、至少 100 pg/mL、或至少 50 pg/mL。在一些實施例中，偵測器系統包括使用高親和力捕獲試劑之 ELISA 測定，該試劑可以為例如生物素化小鼠抗人 IgG-Fc，諸如生物素-R10Z。在某些實施例中，使用不同方法，其中用於測量再循環之方法能夠評估亞納摩爾濃度，而用於測量胞吞轉送作用之方法則不能夠進行評估。使用（例如來自 Quanterix、Gyrolab 或 Singulex 之）敏感自動化免疫測定平台來定量經再循環之分子和/或經胞吞轉送之分子。

在某些實施例中，本揭露提供了用於在類似於 FcRn 介導之 IgG 補救途徑之條件下，藉由表現人類 FcRn 和 B2M 之 MDCK細胞，測量所關注分子（例如，一種或多種抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之再循環和視情況之胞吞轉送作用的 FcRn 相關基於細胞之測定。在某些實施例中，該測定之輸出不僅涉及生理條件下之 Fc-FcRn 交互作用，還涉及與所關注分子之活體內 PK 行為有關之非特異性結合、細胞吸收、分選和細胞內運輸過程。在一些實施例中，所關注分子為 IgG mAb，諸如本文別處所描述之彼等。在一些實施例中，該測定測量另外兩種所關注分子之再循環和視情況之胞吞轉送作用。

在某些實施例中，本揭露提供了用於將再循環與動物（具有不同結構、功能和藥理特性之所關注分子）中一個或多個 PK 特性相關聯之方法和測定。在某些實施例中，PK 特性為活體內清除率 (CL)、分佈體積 (Vd)、曲線下面積 (AUC)、生物利用度、最大/最小血漿濃度 (Cmax/Cmin) 或活體內半衰期 (t½)。在一些實施例中，PK 參數為活體內清除率。在一些實施例中，該動物為哺乳動物，諸如人類或非人靈長類動物，諸如食蟹獼猴。在某些實施例中，本揭露提供了用於將胞吞轉送作用和再循環與具有不同結構、功能和藥理特性之所關注分子（例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 的分子）的動物中的組織滲透率相關聯之方法和測定。在一些實施例中，組織滲透率係腦滲透率。在一些實施例中，該動物為哺乳動物，諸如人類或非人靈長類動物，諸如食蟹獼猴。

在某些實施例中，可能需要表現 FcRn 以促進測定中 mAb 等所關注分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之再循環和視情況之胞吞轉送作用（如果也被評估），並有助於被評估之再循環和 PK 參數或組織滲透率之間之所觀察到之關聯性。在某些實施例中，本揭露中所描述之方法和測定能夠對臨床前物種中含 Fc 分子之電荷或醣基化變異體之清除率進行排序。在某些實施例中，本揭露中所描述之方法和測定可用作用於在導聯選擇和優化以及針對期望藥物動力學特性之工藝開發過程中，評估候選藥物（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之高時效、節省成本且節省動物之工具。

在某些實施例中，本揭露提供了基於細胞之測定和方法，其在生理相關條件下測量藥物（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之再循環效率。在某些實施例中，穩定表現人類 FcRn 和 β2-微球蛋白基因之 MDCK 細胞與本文所述之測定結合使用。

在某些實施例中，本揭露提供了在生理pH下在補充有胎牛血清之正常細胞培養基中進行之方法和測定，該胎牛血清提供已知與人類 FcRn 結合之牛白蛋白（Chaudhury C. 等人，2003, J. Exp. Med. 197, 315–322）。

在某些實施例中，本揭露提供了方法和測定，其中分子藉由非特異性胞飲作用被細胞吸收，在白蛋白之存在下與人類 FcRn 交互作用並在與 FcRn 介導之作用機制相關之條件下被細胞再循環。在一些實施例中，至少一部分該等分子被再循環回到細胞層之該等分子被從其吸收之側面。在一些實施例中，至少一部分該等分子經胞吞轉送至細胞層之相對側面。在某些實施例中，本揭露提供了用於確定或預測哺乳動物中之所關注分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之清除率（由於方法及/或測定能夠評估與細胞之非特異性結合、經由胞飲作用之吸收、與 FcRn 的 pH 相關交互作用和/或細胞內運輸和分選過程之動力學之綜合效應）的方法和測定。在一些實施例中，該哺乳動物為非人靈長類動物，諸如食蟹獼猴。在一些實施例中，哺乳動物是人。

在某些實施例中，本揭露提供了用於確定或預測所關注分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之組織滲透率之方法和測定。在某些實施例中，組織為腦組織。在某些實施例中，本揭露提供了用於藉由確定分子之 T/R 比來確定或預測所關注分子之組織滲透率之方法和測定。在某些實施例中，本揭露提供了用於確定或預測哺乳動物中之所關注分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之組織滲透率（由於方法及/或測定能夠評估與細胞之非特異性結合、經由胞飲作用之吸收、與 FcRn 的 pH 相關交互作用和/或細胞內運輸和分選過程之動力學之綜合效應）並確定所關注分子之 T/R 比之方法和測定。在一些實施例中，該哺乳動物為非人靈長類動物，諸如食蟹獼猴。在一些實施例中，哺乳動物是人。

在某些實施例中，本揭露提供了用於關聯再循環（和進一步視情況之胞吞轉送作用）輸出量之方法和測定，該輸出量係藉由哺乳動物中所關注分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之 PK 參數而獲得。在一些實施例中，PK 參數為活體內清除率 (CL)、分佈體積 (Vd)、曲線下面積 (AUC)、生物利用度、最大/最小血漿濃度 (Cmax/Cmin) 或活體內半衰期 (t½)。在某些實施例中，本揭露之方法和測定之輸出可以為內腔室（例如第一腔室）之培養基中之經再循環分子之濃度 (ng/mL)，或外腔室（例如，第二腔室）之培養基中視情況進一步之經胞吞轉送分子之濃度，並且測定之可報告值可為來自同一盤之至少 2 個重複孔之平均濃度。在某些實施例中，方法和/或測定之輸出可以為再循環速率之量度或經再循環分子相對於對照分子之相對再循環之量度。在某些實施例中，測定之輸出還可以為胞吞轉送（除再循環之外）速率之量度，或胞吞轉送分子相對於對照分子之相對胞吞轉送作用之量度。在更進一步之實施例中，單獨的情形下或相對於對照分子的情形下，測定之輸出可以為基於該再循環和視情況之胞吞轉送作用之所計算值，諸如再循環與胞吞轉送作用之比或胞吞轉送作用與再循環之比。在一些實施例中，該哺乳動物為非人靈長類動物，諸如食蟹獼猴。在一些實施例中，哺乳動物是人。

在又進一步之實施例中，本揭露提供了用於確定除測試分子之外之一種或多種藥劑對測試分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之再循環、胞吞轉送作用、組織滲透率、PK 參數或其他特性之影響。此類藥劑（也可以稱為二級分子）可以為例如小分子（例如，不是蛋白或多肽），諸如小分子藥物，或者可以為肽，或者可以為多肽，或者可以為抗體或其片段，或此類分子之複數個或組合。此類藥劑可以一種藥劑，該藥劑與測試分子結合；或者懷疑與測試分子結合；或者調節測試分子與介導分子輸送之受體的結合，諸如調節測試分子與 FcRn 的結合；或者係被評估系統中所關注受體之配體（例如，由細胞層之一種或多種細胞表現之受體的配體）；或者已知或懷疑與測試分子或細胞層所表現之受體交互作用。該藥劑可以為治療性分子，諸如處方藥或非處方 (OTC) 藥；或者為膳食補充劑、維生素、研究藥劑、成像藥劑或其他所關注藥劑。治療藥可包括用於治療免疫系統、心血管系統、內分泌系統、胃腸道、腎系統、呼吸系統或中樞神經系統之疾病或病症之彼等，或用於治療癌症或其他惡性腫瘤（包括化療藥物和免疫治療藥物）、病毒感染、細菌感染、真菌感染或寄生蟲感染之彼等。也可以評估兩種或更多種所關注藥劑之組合。因此，在一些實施例中，本文所提供之方法包括在一種或多種試劑之存在下評估測試分子之再循環或再循環和胞吞轉送作用。一種或多種藥劑可以包括在第一腔室中但不包括在第二腔室中，或者包括在第二腔室中但不包括在第一腔室中，或者包括在兩個腔室中，或者包括在第一腔室的第一溶液中但隨後在溶液被替換時不存在，或者它們的組合。在一些實施例中，在不存在一種或多種藥劑之情形下，進一步將測定輸出與再循環或再循環和胞吞轉送作用進行比較。根據本文所述之方法和測定評估一種或多種藥劑對測試分子之再循環或再循環和胞吞轉送作用之影響之能力可用於例如確定一種或多種藥物可如何影響測試分子之一個或多個 PK 參數，或者如何影響測試分子之組織滲透率（例如，腦滲透率）。例如，本文所述之方法和測定可用於了解共同投予之藥物對所關注分子之 PK 參數和/或組織滲透率之影響。例如，本文所述之方法和測定可用於研究跨細胞輸送機制、PK 參數和/或組織滲透率。

本揭露還提供了用於確定環境條件下一種或多種變化對測試分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之再循環、胞吞轉送作用、組織滲透率、PK 參數或其他特性之影響之方法和測定。此類環境條件可以包括例如一種或多種細胞培養基成分之存在、不存在或濃度、或溫度、或pH、或氧化、或它們的組合。在一些實施例中，組織滲透率係腦滲透率。

在某些實施例中，選擇本揭露之方法和測定之測試分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）可以基於臨床級材料和之可用性，該動物 PK 資料和/或動物組織滲透率資料來自可靠源（諸如但不限於處方箋資訊）、基於群體 PK 或組織滲透率模型之發表報告、或生成線性 PK 或組織滲透率資料之內部臨床試驗。在某些實施例中，使用臨床級材料可以確保測試材料之質量可以與在生成人 PK 或組織滲透率資料的臨床研究中所使用之彼等一致。

在某些實施例中，本揭露中所描述之方法和測定可用作活體外評估候選藥物（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之非特異性清除率之潛在傾向之工具以支持導聯選擇和優化，目的是對候選進行排序並減少在動物模型中所測試之分子之數量，和/或減少所需動物模型之數量。

在某些實施例中，本揭露中所描述之方法和測定可用於支持研究表現出非期望或非典型 PK 或組織滲透率行為之所關注分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子），或開發新型藥物（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 藥物），其具有改善之再循環特性，適用於特定應用，諸如穿過血腦屏障以增強腦暴露或增強在腫瘤微環境中的處置以用於改善腫瘤靶向。此類「改善之再循環特性」可包括與另一種分子相比再循環之升高，這在一些實施例中可以延長血清半衰期。在某些實施例中，本揭露中所描述之方法和測定可用於支持研究表現出非期望或非典型 PK 或組織滲透率行為之所關注分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）或開發新型藥物，其具有改善之胞吞轉送特性，適用於特定應用，諸如穿過血腦屏障以增強腦暴露或增強在腫瘤微環境中的處置以用於改善腫瘤靶向。此類「改善之胞吞轉送特性」可包括與另一種分子相比胞吞轉送作用之增強。更進一步地，在某些實施例中，本揭露中所描述之方法和測定可用於支持研究表現出非期望或非典型 PK 或組織滲透率行為之所關注分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）或開發新型藥物，其具有改善之胞吞轉送特性，適用於特定應用，諸如穿過血腦屏障以增強腦暴露或增強在腫瘤微環境中的處置以用於改善腫瘤靶向。此類「改善之胞吞轉送特性」可包括與另一種分子相比胞吞轉送作用之增強。進一步設想使用本文所述之測定來支持開發與另一種分子相比具有改善之胞吞轉送作用與再循環比之新型藥物（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）。此類「改善之胞吞轉送作用與再循環比」（T/R比）可包括比另一種分子更高之比，例如由於胞吞轉送作用增強、再循環減少，或兩者。與另一種分子相比，更高 T/R 比可導致更佳組織滲透率，諸如更佳腦滲透率。在一些實施例中，所關注分子和/或藥物為 mAb。

在某些實施例中，本揭露中所描述之方法和測定可用於開發改善之基於機制之 PK 模型以支持臨床研究中最佳劑量和給藥方案之設計。在某些實施例中，本揭露中所描述之方法和測定可用於顯示測試分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之活體外讀數和活體內 PK 資料之間的相關性。此類 PK 模型和/或資料可涉及活體內清除率 (CL)、活體內半衰期 (t½)、曲線下面積 (AUC)、生物利用度、分佈體積 (Vd) 或最大/最小血漿濃度 (Cmax/Cmin)。

在某些實施例中，所關注分子、測試分子和/或複數個分子可以為抗體。在某些實施例中，抗體可為單株或多株抗體。在某些實施例中，抗體可以具有不同結構組成（嵌合、人源化和完全人源化）。在某些實施例中，抗體可以由不同重鏈和輕鏈序列（IgG1、IgG2 和 IgG4 重鏈、κ 和 λ 輕鏈）組成。在某些實施例中，抗體可以識別不同類型之（膜結合和可溶性）靶標。在某些實施例中，抗體可以發揮不同治療作用機制（激動、拮抗和細胞毒性）。在某些實施例中，抗體可以並且經由不同途徑（例如，靜脈內、肌內或皮下）給予患者。在某些實施例中，該抗體為抗 IgE 抗體、抗 VEGF 抗體、抗整合素抗體（例如抗 α4β7 整合素抗體）、抗 IL-6 抗體、抗 TNFa 抗體、抗 BACE1 抗體、或抗 gD 抗體，或它們的片段。在一些實施例中，該抗體為奧馬珠單抗 (omalizumab)、貝伐珠單抗 (bevacizumab)、維多珠單抗 (vedolizumab)、托珠單抗 (tocilizumab)、阿達木單抗 (adalimumab)、抗 BACE1 WT、抗 BACE1 變異體 YEY（突變：M252Y；N286E；N434Y）、抗 BACE1 變異體 YQAY（突變：M252Y；T307Q；Q311A；N434Y）、抗 BACE1 變異體 YPY（突變：M252Y；V308P；N434Y）、抗 BACE1 變異體 YY（突變：M252Y；N434Y)、抗 BACE1 變異體 YLY1 (Q6)（突變：M252Y；M428L；N434Y；Y436I）、或抗 BACE1 變異體 YIY (T3)（突變：M252Y；Q311I；N434Y），或其片段。在一些實施例中，評估了兩種或更多種抗體。

在某些實施例中，所關注分子、測試分子和/或複數個分子可以攜帶可以改變其效應子功能之工程化突變（諸如但不限於阿特珠單抗 (atezolizumab)、度伐利尤單抗 (durvalumab)），使得雙特異性半抗體（諸如但不限於艾美賽珠單抗 (emicizumab)）能夠結合，或者使 IgG4 Fab 臂（諸如但不限於納武單抗 (nivolumab)、派姆單抗 (pembrolizumab)）穩定。

在某些實施例中，所關注分子、測試分子和/或複數個分子可以為表現出極高 FcRn 結合親和力之抗體。在某些實施例中，在哺乳動物（例如非人靈長類動物或人類）中所觀察到之再循環讀數與 PK 參數之間的相關性可適用於攜帶典型 Fc 區之廣泛抗體。在某些實施例中，測試分子可以為經工程化以具有改變之 FcRn 結合活性之抗體。在某些實施例中，所關注分子、測試分子和/或複數個分子可以為含白蛋白分子，或經工程化以經由肽標籤或重組蛋白結合 FcRn 之任何分子。在某些實施例中，所關注分子、測試分子和/或複數個分子可以為天然結合 FcRn 之分子。在某些實施例中，所關注分子、測試分子和/或複數個分子可以為經工程化以結合 FcRn 之分子。

在某些實施例中，本揭露中所描述之方法和測定可用於指示在再循環或再循環和胞吞轉送測定中是否需要表現人類 FcRn 以進行高效再循環，以及在一些實施例中之再循環和胞吞轉送。

在某些實施例中，本揭露之方法和測定可用於偵測和/或指示與 FcRn 之交互作用有助於觀察測試分子之再循環讀數和 PK 參數之間之相關性。在一些實施例中，活體內清除率 (CL)、活體內半衰期 (t½)、曲線下面積 (AUC)、生物利用度、分佈體積 (Vd) 或最大/最小血漿濃度 (Cmax/Cmin)。

在某些實施例中，本揭露之方法和測定可用於分析所關注分子、測試分子和/或複數個分子與受體之結合。在某些實施例中，受體可以為 FcRn 受體。在某些實施例中，測試分子可為抗體。在某些實施例中，受體可以為運鐵蛋白受體。在某些實施例中，受體為人類、小鼠、大鼠或食蟹獼猴運鐵蛋白受體。在某些實施例中，受體為運鐵蛋白 1 或運鐵蛋白 2 受體。在某些實施例中，受體為在UNIPROT P02786 (TFR1_HUMAN)、UNIPROT Q9UP52 (TFR2_HUMAN)、UNIPROT A0A2K5X958 (A0A2K5X958_MACFA, cyno)、UNIPROT Q62351 (TFR1_MOUSE)、UNIPROT Q9JKX3 (TFR2_MOUSE)、UNIPROT Q99376 (TFR1_RAT) 或 UNIPROT B2GUY2 (TFR2_RAT) 中描述之運鐵蛋白受體。在一些實施例中，受體描述於 UNIPROT P02786 (TFR1_HUMAN) 或 UNIPROT Q9UP52 (TFR2_HUMAN)。在某些實施例中，受體可以為巨蛋白受體。在某些實施例中，受體為在 UNIPROT P98164 (LRP2_HUMAN)、UNIPROT A2ARV4 (LRP2_MOUSE) 或 UNIPROT P98158 (LRP2_RAT) 中描述之巨蛋白受體。在某些實施例中，受體可以為立方蛋白受體。在一些實施例中，受體為在 UNIPROT O60494 (CUBN_HUMAN)、UNIPROT Q9JLB4 (CUBN_MOUSE)、UNIPROT O70244 (CUBN_RAT) 或 UNIPROTA0A2K5USK6 (A0A2K5USK6_MACFA，cyno) 中描述之立方蛋白受體。

在某些實施例中，本發明之方法、測定、測定系統和套組之 FcRn 受體為人類 FcRn 受體。

在某些實施例中，本發明之方法、測定、測定系統和套組之人類 FcRn 受體之重鏈具有如下序列：AESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFWVSGWLGPQQYLSYNSLRGEAEPCGAWVWENQVSWYWEKETTDLRIKEKLFLEAFKALGGKGPYTLQGLLGCELGPDNTSVPTAKFALNGEEFMNFDLKQGTWGGDWPEALAISQRWQQQDKAANKELTFLLFSCPHRLREHLERGRGNLEWKEPPSMRLKARPSSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGLAAGTGQGDFGPNSDGSFHASSSLTVKSGDEHHYCCIVQHAGLAQPLRVELESPAKSSVLVVGIVIGVLLLTAAAVGGALLWRRMRSGLPAPWISLRGDDTGVLLPTPGEAQDADLKDVNVIPATA ( SEQ ID NO: 1)。

在某些實施例中，本發明之方法、測定、測定系統和套組之人類 FcRn 受體之輕鏈具有如下序列：MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM ( SEQ ID NO: 2)。

在某些實施例中，本發明之方法、測定、測定系統和套組之 FcRn 受體為小鼠 FcRn 受體。

在某些實施例中，本發明之方法、測定、測定系統和套組之小鼠 FcRn 受體之重鏈具有如下序列：SETRPPLMYHLTAVSNPSTGLPSFWATGWLGPQQYLTYNSLRQEADPCGAWMWENQVSWYWEKETTDLKSKEQLFLEALKTLEKILNGTYTLQGLLGCELASDNSSVPTAVFALNGEEFMKFNPRIGNWTGEWPETEIVANLWMKQPDAARKESEFLLNSCPERLLGHLERGRRNLEWKEPPSMRLKARPGNSGSSVLTCAAFSFYPPELKFRFLRNGLASGSGNCSTGPNGDGSFHAWSLLEVKRGDEHHYQCQVEHEGLAQPLTVDLDSSARSSVPVVGIVLGLLLVVVAIAGGVLLWGRMRSGLPAPWLSLSGDDSGDLLPGGNLPPEAEPQGANAFPATS ( SEQ ID NO: 3)。

在某些實施例中，本發明之方法、測定、測定系統和套組之小鼠 FcRn 受體之輕鏈具有如下序列：MARSVTLVFLVLVSLTGLYAIQKTPQIQVYSRHPPENGKPNILNCYVTQFHPPHIEIQMLKNGKKIPKVEMSDMSFSKDWSFYILAHTEFTPTETDTYACRVKHDSMAEPKTVYWDRDM ( SEQ ID NO: 4)。

在某些實施例中，本發明之方法、測定、測定系統和套組之 FcRn 受體為大鼠 FcRn 受體。

在某些實施例中，本發明之方法、測定、測定系統和套組之大鼠 FcRn 受體之重鏈具有如下序列：AEPRLPLMYHLAAVSDLSTGLPSFWATGWLGAQQYLTYNNLRQEADPCGAWIWENQVSWYWEKETTDLKSKEQLFLEAIRTLENQINGTFTLQGLLGCELAPDNSSLPTAVFALNGEEFMRFNPRTGNWSGEWPETDIVGNLWMKQPEAARKESEFLLTSCPERLLGHLERGRQNLEWKEPPSMRLKARPGNSGSSVLTCAAFSFYPPELKFRFLRNGLASGSGNCSTGPNGDGSFHAWSLLEVKRGDEHHYQCQVEHEGLAQPLTVDLDSPARSSVPVVGIILGLLLVVVAIAGGVLLWNRMRSGLPAPWLSLSGDDSGDLLPGGNLPPEAEPQGVNAFPATS ( SEQ ID NO: 5)。

在某些實施例中，本發明之方法、測定、測定系統和套組之大鼠 FcRn 受體之輕鏈具有如下序列：MARSVTVIFLVLVSLAVVLAIQKTPQIQVYSRHPPENGKPNFLNCYVSQFHPPQIEIELLKNGKKIPNIEMSDLSFSKDWSFYILAHTEFTPTETDVYACRVKHVTLKEPKTVTWDRDM ( SEQ ID NO: 6)。

在某些實施例中，本發明之方法、測定、測定系統和套組之 FcRn 受體為食蟹獼猴 (cyno) FcRn 受體。

在某些實施例中，本發明之方法、測定、測定系統和套組之 cyno FcRn 受體之重鏈具有如下序列：AESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFWVSGWLGPQQYLSYDSLRGQAEPCGAWVWENQVSWYWEKETTDLRIKEKLFLEAFKALGGKGPYTLQGLLGCELSPDNTSVPTAKFALNGEEFMNFDLKQGTWGGDWPEALAISQRWQQQDKAANKELTFLLFSCPHRLREHLERGRGNLEWKEPPSMRLKARPGNPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGMAAGTGQGDFGPNSDGSFHASSSLTVKSGDEHHYCCIVQHAGLAQPLRVELETPAKSSVLVVGIVIGVLLLTAAAVGGALLWRRMRSGLPAPWISLRGDDTGSLLPTPGEAQDADSKDINVIPATA ( SEQ ID NO: 7)。

在某些實施例中，本發明之方法、測定、測定系統和套組之 cyno FcRn 受體之輕鏈具有如下序列：MSPSVALAVLALLSPSGLEAIQRTPKIQVYSRHPPENGKPNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGEKMGKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPNEKDEYACRVNHVTLSGPRTVKWDRDM ( SEQ ID NO: 8)。

在某些實施例中，本發明之方法、測定、測定系統和套組可用於評估多種因素（諸如但不限於內化、分選和細胞內運輸之動力學以及胞吐作用）對測試分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之回收過程之總效率之貢獻。在某些實施例中，本揭露之方法和測定可用於識別和/或偵測涉及 FcRn 介導之補救途徑之多個參數，以用於確定或預測測試分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之 PK。

在某些實施例中，本揭露之方法、測定、測定系統和套組可用於偵測測試分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之活體外再循環和活體內清除率之間之相關性。在某些實施例中，與 BV ELISA或 Fv 電荷/pI 相比，本揭露之測定可用於偵測分子之活體外再循環和活體內清除率之相關性。

在某些實施例中，本揭露之方法、測定、測定系統和套組可用於評估和/或研究醣基化在活體內對測試分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之分佈和分解代謝之作用。在某些實施例中，分子可以為糖型變異體。

在某些實施例中，本揭露之方法、測定、測定系統和套組可用於評估向分子添加唾液酸對細胞內運輸參數之作用。在某些實施例中，它們可用於分析其他機制在活體內清除分子之高甘露糖和高度唾液酸化糖型變異體方面之參與。

在某些實施例中，本揭露之方法、測定、測定系統和套組可以用作研究 FcRn 介導之胞吞轉送作用和再循環之工具，其作為測試分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）之與其 PK 有關之消除機制。

在某些實施例中，本揭露之方法、測定、測定系統和套組可以用作研究和闡明控制複合 FcRn 之 IgG 之分佈之分子機制之工具。

在某些實施例中，本揭露之方法、測定、測定系統和套組可以提供反映在人體中具有典型 FcRn 結合親和力之測試分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽、或含有 Fc 分子）之標靶非相關、非特異性清除機制之輸出。

在某些實施例中，本揭露之方法、測定、測定系統和套組可用於分析不同組之含 Fc 分子並響應已知影響 PK 之因素。

在某些實施例中，本實施例之方法、測定、測定系統和套組可用於剖析涉及再循環測定以及再循環和胞吞轉送作用測定之因素，以了解這些因素如何與活體內清除率相關並定義該相關性之定量性質。

在某些實施例中，本實施例之方法、測定、測定系統和套組可用於剖析涉及再循環測定以及再循環和胞吞轉送作用測定之因素，以了解這些因素如何與組織滲透率相關並定義該相關性之定量性質。在一些實施例中，組織滲透率係腦滲透率。

在某些實施例中，本揭露之方法、測定、測定系統和套組可用於研究所胞飲或內化之測試分子（包括例如抗體、抗體片段、多肽或含 Fc 分子）在各種細胞類型/組織區室中在再循環、胞吞轉送作用和降解途徑之間之分佈，並研究控制參與清除 IgG 之細胞中之此類分佈之分子機制。

在某些實施例中，本揭露涉及再循環測定系統。在某些實施例中，本揭露涉及再循環和胞吞轉送作用測定系統。例如但不作為限制，此類系統可以包括：第一腔室和第二腔室，其中第一腔室和第二腔室中之每一者均包括處於生理 pH 之水溶液；細胞層，該細胞層將第一腔室和第二腔室隔開，使得細胞層可以介導引入第一腔室之分子再循環到細胞層中並返回到第一腔室；以及偵測器，該偵測器用於偵測第一腔室中分子之存在。在某些實施例中，本文所揭示之測定系統採用真核細胞之細胞層，該等真核細胞諸如哺乳動物細胞，例如囓齒動物、犬科動物、非人靈長類動物或人類之細胞。在一些實施例中，本文所揭示之測定系統採用腎細胞之細胞層。在一些實施例中，本文所揭示之測定系統採用 MDCK 細胞之細胞層。在一些實施例中，細胞層為單細胞層。在某些實施例中，本文所揭示之測定系統採用包含至少一種異源基因之細胞。在某些實施例中，本文所揭示之測定系統採用包含至少一種選自 FCGRT 基因和 B2M 基因之異源基因之細胞。在某些實施例中，本文所揭示之測定系統採用表現異源細胞表面蛋白之細胞。在某些實施例中，本文所揭示之測定系統採用表現異源細胞表面蛋白之細胞，其中異源細胞表面蛋白包含新生兒 Fc 受體 (FcRn)。在某些實施例中，本文所揭示之測定系統可經由使用酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、液體閃爍計數 (LSC)、定量 PCR、螢光分析儀系統、自動化免疫測定平台（例如 Quanterix、Gyrolab 和 Singlex）、螢光成像或質譜法來測量經再循環之分子之數量。在某些實施例中，本文所揭示之測定系統可以使用具有至少 200 pg/mL、或至少 100 pg/mL、或至少 50 pg/mL 之 LLOQ 之方法（諸如使用高親和力捕獲藥劑（例如，生物素化小鼠抗人 IgG-Fc，諸如生物素 R10Z）之 ELISA 測定）來測量經再循環之分子之數量。在某些實施例中，在本揭露之再循環和胞吞轉送測定系統中，細胞層可以介導分子從第一腔室到第二腔室之胞吞轉送作用。在一些實施例中，測定系統進一步包括偵測器，該偵測器用於偵測分子在第二腔室中之存在。此類偵測器可以與用於偵測第一腔室中分子之存在之檢測器相同類型和/或具有相同 LLOQ，或者該偵測器可以具有另一種類型和/或不同敏感度，例如敏感度較低之類型（例如，具有納摩爾濃度範圍內之 LLOQ）。 4. 細胞

要用於本揭露之方法、測定、測定系統或套組之合適細胞包括如本文所述之原核或真核細胞。

在某些實施例中，也可以使用脊椎動物細胞。可用哺乳動物細胞株之非限制性實例為：由 SV40 (COS-7) 轉化之猴腎 CV1 系；原代人內皮細胞；人臍靜脈內皮細胞 (HUVEC)；人腦微血管內皮細胞 (HBMEC)；血管內皮細胞 (EA. hy926)；人真皮微血管內皮細胞 (HMEC)；人胚胎腎系（如 Graham 等人，J. Gen Virol. 36:59 (1977) 中所闡述之 293 或 293 細胞）；幼倉鼠腎細胞 (BHK)；小鼠賽托利 (sertoli) 細胞(如 Mather，Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980) 中所闡述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人子宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤 (MMT 060562)；TRI 細胞，如 Mather 等人，Annals N.Y.Acad. Sci. 383: 44-68 (1982) 中所闡述；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。可用哺乳動物細胞株之其他非限制性實例包括中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 DHFR-CHO 細胞（Urlaub 等人，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）。在某些實施例中，本揭露之方法可以使用融合瘤細胞。例如但不作為限制，雜交細胞株可以屬於任何物種，包括人類和小鼠。在某些實施例中，本揭露之方法可以使用原代和已建立之內皮細胞和/或上皮細胞。例如但不作為限制，內皮細胞和/或上皮細胞可以為 caco-2、T-84、HMEC-1、MHEC 2.6、HUVEC 和誘導多能幹細胞 (iPSC) 衍生細胞（參見，例如，Lidington, E. A., D. L. Moyes, 等人 (1999), 「A comparison of primary endothelial cells and endothelial cell lines for studies of immune interactions」 Transpl Immunol 7(4):239-246；或 Yamaura, Y. , B. D. Chapron 等人 (2016)，「Functional Comparison of Human Colonic Carcinoma Cell Lines and Primary Small Intestinal Epithelial Cells for Investigations of Intestinal Drug Permeability and First-Pass Metabolism」，Drug Metab Dispos 44(3):329-335）。

在某些實施例中，用於所揭示之方法、測定、測定系統或套組之細胞可以包含編碼分子（例如受體）之核酸。在某些實施例中，該核酸可以一種或多種載體存在，例如表現載體。一種載體的類型為「質體」，其係指環狀雙股 DNA 環圈，可在其中連接其他 DNA 片段。另一種載體的類型為病毒載體，其中其他 DNA 片段可連接至病毒基因體。某些載體能夠在引入他們的細胞 (例如具有細菌複製起始點的細菌載體，及附加型哺乳動物載體) 中自主複製。其他載體（例如，非附加型哺乳動物載體）在導入細胞後經嵌入到細胞的基因體中，並且從而與宿主基因體一起複製。此外，某些載體（表現載體）能夠指導與其可操作連接之基因的表現。通常來說，在重組 DNA 技術中有用的表現載體通常為質體（載體）的形式。用於本揭露中之表現載體的其他非限制性實例包括提供等效功能的病毒載體（例如複製缺陷型反轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒）。

在某些實施例中，可以將編碼分子（例如受體）之核酸引入細胞中。在某些實施例中，導入核酸至細胞中可以藉由任何本領域習知的方法來執行，本領域習知的方法包含但不限於轉染、電穿孔、顯微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌體載體感染、細胞融合、染色體媒介的基因轉移、微細胞媒介的基因轉移、球形質體融合等。在某些實施例中，該細胞為真核的，例如 MDCK 細胞。 5. 腔室

本揭露之方法、測定、測定系統或套組需要第一腔室和第二腔室，其中第一腔室和第二腔室由細胞層隔開。可以使用能夠將水溶液保持在沿細胞層相交之兩個單獨區室中之任何合適組態之腔室。該等腔室之材料可以包括例如塑膠（例如聚碳酸酯）、玻璃、陶瓷、塗覆材料（例如增塑金屬）或它們的混合物。該等腔室可以係完全封閉的，或者可以具有暴露的一側或多側，只要它們可以在兩個腔室中保持足夠水溶液並維持隔開該等腔室之細胞層。該等腔室可進一步包括其中一個腔室的體積小於另一個腔室並例如配合在另一個腔室之三維空間內（例如，作為插入件）（由細胞層隔開）之組態。在一些實施例中，較小之腔室（其也可以被描述為「內腔室」）為第一腔室，較大之腔室（其也可以被描述為「外腔室」）為第二腔室。然而，此類術語並不意味著將當前描述之測定和系統之使用限制為替代性腔室組合（例如，外腔室可以用作第一腔室，而內腔室可以用作第二腔室）。測試分子被引入第一腔室，無論使用哪種腔室組態。在一些實施例中，腔室為轉移系統。可用於本揭露之方法、測定、測定系統或套組之合適轉移系統包括但不限於：Boyden 腔室、細胞遷移測定、細胞侵襲測定、微流體遷移裝置、活體外划痕測定 (in vitro scratch assay)、細胞外基質 (ECM) 蛋白測定。本揭露之方法可以利用多種測定平台（例如，12 孔、24 孔或 96 孔多孔陣列）來進行，包括「通用」轉移平台。測定平台之非限制性實例包括 MILLICELL® 細胞培養插入件和插入式盤，以及 CORNING® TRANSWELL® 聚碳酸酯膜細胞培養插入件。 示例性實施例 E1. 一種方法，其包含確定複數個分子之再循環，其中該確定包含：將該複數個分子引至第一腔室中，其中：該第一腔室藉由細胞層與第二腔室分隔開，且該第一腔室及該第二腔室包含水溶液；在該第一腔室中培養該複數個分子；更換該第一腔室及該第二腔室兩者中之該水溶液；以及測量自該細胞層釋放至該第一腔室中之該複數個分子的量；其中該水溶液係處於生理 pH，且該細胞層包含表現介導分子輸送之受體的細胞。 E2. 如 E1 之方法，其中複數個分子為複數個單一分子。 E3. 如 E1 之方法，其中複數個分子為複數個不同分子。 E4. 如 E1 至 E3 中任一項之方法，其中該細胞層包含細胞單層。 E5. 如 E1 至 E4 中任一項之方法，其中介導分子輸送之受體為介導分子之細胞內輸送之受體。 E6. 如E1 至 E4 中任一項之方法，其中該介導分子輸送之受體為運鐵蛋白受體、Fc 受體、巨蛋白或立方蛋白。 E7. 如 E1 至 E6 中任一項之方法，其中該介導分子輸送之受體為新生兒 Fc 受體 (FcRn)。 E8. 如E1 之 E7 中任一項之方法，其中該等細胞為真核細胞或哺乳動物細胞。 E9. 如 E1 至 E7 中任一項之方法，其中該等細胞為馬丁達比犬腎 (MDCK) 細胞。 E10. 如 E1 至 E9 中任一項之方法，其中測量自細胞層釋放之複數個分子之量包括酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、液體閃爍計數 (LSC)、定量 PCR、螢光分析儀系統或質譜法之使用。 E11. 如 E1 至 E10 中任一項之方法，其中複數個分子在第一腔室中培養約 1 小時至約 48 小時。 E12. 如 E1 至 E11 中任一項之方法，其中複數個分子在第一腔室中培養約 1 小時至約 30 小時。 E13. 如 E1 至 E12 中任一項之方法，其中更換水溶液包括清洗第一腔室。 E14. 如 E1 至 E13 中任一項之方法，進一步包括在測量之前，藉由替代水溶液培養第一腔室和第二腔室。 E15. 如 E14 之方法，在測量之前，藉由替代水溶液培養第一腔室和第二腔室 1 小時至 6 小時。 E16. 如 E1 至 E15 中任一項之方法，其中培養在約 35℃ 至約 39℃ 之間之溫度下進行。 E17. 如 E1 至 E15 中任一項之方法，其中複數個分子為含 Fc 分子。 E18. 如 E17 之方法，其中含 Fc 分子為受體 Fc 融合分子。 E19. 如 E1 至 E15 中任一項之方法，其中複數個分子為抗體。 E20. 如 E19 之方法，其中該等抗體為單株抗體。 E21. 如 E20 之方法，其中抗體為抗 IgE 抗體、抗 VEGF 抗體、抗整合素抗體、抗 IL-6 抗體、抗 TNFa 抗體、抗 BACE1 抗體或抗 gD 抗體。 E22. 如 E20 之方法，其中該抗體為奧馬珠單抗、貝伐珠單抗、托珠單抗、抗 BACE1 WT、抗 BACE1 變異體 YEY、抗 BACE1 變異體 YQAY、抗 BACE1 變異體 YPY、抗 BACE1 變異體 YY、抗 BACE1 變異體 YLY1 (Q6 )或抗 BACE1 變異體 YIY (T3)。 E23. 如 E7 之方法，其中 FcRn 係選自由以下所組成之群組：人類 RcRn、小鼠 FcRn、大鼠 FcRn 及食蟹獼猴 FcRn。 E24. 如 E1 至 E23 中任一項之方法，其中該生理 pH 為約 7.4。 E25. 如 E1 至 E24 中任一項之方法，進一步包括測量複數個分子跨細胞層之胞吞轉送作用。 E26. 如 E25 之方法，其中測量胞吞轉送作用包括：在已更換該第一腔室及該第二腔室兩者中之該水溶液後，測量該第二腔室中之該複數個分子的量。 E27. 如 E1 至 E26 中任一項之方法，包括在藥劑存在下在第一腔室中培養複數個分子，以及確定藥劑是否影響複數個分子之再循環。 E28. 如 E27 之方法，其中該藥劑為小分子或多肽。 E29. 一種確定複數個分子之組織滲透率 (penetrance) 之方法，其包含： a) 將該複數個分子引至第一腔室中，其中該第一腔室藉由細胞層與第二腔室分隔開，且該第一腔室及該第二腔室包含水溶液；其中該水溶液係處於生理 pH，且該細胞層包含表現介導分子輸送之受體的細胞； b) 測量自該第一腔室再循環至該細胞層中且返回至該第一腔室之該複數個分子的量； c) 測量自該第一腔室胞吞轉送至該第二腔室之該複數個分子的量；以及 d) 基於經胞吞轉送的分子與經再循環的分子之比率，確定該複數個分子之該組織滲透率。 E30. 如 E29 之方法，其中測量經再循環之複數個分子包括：在將複數個分子引至第一腔室中後，在第一腔室中培養複數個分子；更換該第一腔室及該第二腔室兩者中之該水溶液；以及測量自該細胞層釋放至該第一腔室中之該複數個分子的量。 E31. 如 E29 或 E30 之方法，其中測量經胞吞轉送之複數個分子包括：在將複數個分子引至第一腔室中後，在第一腔室中培養複數個分子；更換該第一腔室及該第二腔室兩者中之該水溶液；以及測量自該細胞層釋放至該第二腔室中之該複數個分子的量。 E32. 如 E30 或 E31 中任一項之方法，其中複數個分子在第一腔室中培養至少約 1 小時至約 48 小時。 E33. 如 E30 或 E31 中任一項之方法，其中複數個分子在第一腔室中培養約 1 小時至約 30 小時。 E34. 如 E30 至 E33 中任一項之方法，其中更換水溶液包括清洗第一腔室。 E35. 如 E29 至 E34 中任一項之方法，進一步包括在測量之前藉由水溶液培養第一腔室和第二腔室。 E36. 如 E35 之方法，在測量之前，藉由替代水溶液培養第一腔室和第二腔室 1 小時至 6 小時。 E37. 如 E29 至 E36 中任一項之方法，其中培養在約 35℃ 至約 39℃ 之間之溫度下進行。 E38. 如 E29 至 E36 中任一項之方法，其中複數個分子為複數個單一分子。 E39. 如 E29 至 E36 中任一項之方法，其中複數個分子為複數個不同分子。 E40. 如 E29 至 E39 中任一項之方法，其中該細胞層包含細胞單層。 E41. 如 E29 至 E40 中任一項之方法，其中介導分子輸送之受體為介導分子之細胞內輸送之受體。 E42. 如 E29 至 E41 中任一項之方法，其中該介導分子輸送之受體為運鐵蛋白受體、Fc 受體、巨蛋白或立方蛋白。 E43. 如 E29 至 E42 中任一項之方法，其中該介導分子輸送之受體為新生兒 Fc 受體 (FcRn)。 E44. 如 E29 之 E43 中任一項之方法，其中該等細胞為真核細胞或哺乳動物細胞。 E45. 如 E29 至 E44 中任一項之方法，其中該等細胞為馬丁達比犬腎 (MDCK) 細胞。 E46. 如 E29 至 E45 中任一項之方法，其中測量經再循環之複數個分子之量及測量經胞吞轉送之複數個分子之量獨立地包括酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、液體閃爍計數 (LSC)、定量 PCR、螢光分析儀系統、質譜法或它們的任何組合之使用。 E47. 如 E29 至 E46 中任一項之方法，其中複數個分子為含 Fc 分子。 E48. 如 E47 之方法，其中含 Fc 分子為受體 Fc 融合分子。 E49. 如 E29 至 E48 中任一項之方法，其中複數個分子為抗體。 E50. 如 E47 之方法，其中該等抗體為單株抗體。 E51. 如 E50 之方法，其中抗體為抗 IgE 抗體、抗 VEGF 抗體、抗整合素抗體、抗 IL-6 抗體、抗 TNFa 抗體、抗 BACE1 抗體或抗 gD 抗體。 E52. 如 E50 之方法，其中該抗體為奧馬珠單抗、貝伐珠單抗、托珠單抗、抗 BACE1 WT、抗 BACE1 變異體 YEY、抗 BACE1 變異體 YQAY、抗 BACE1 變異體 YPY、抗 BACE1 變異體 YY、抗 BACE1 變異體 YLY1 (Q6 )或抗 BACE1 變異體 YIY (T3)。 E53. 如 E29 至 E52 中任一項之方法，其中該生理 pH 為約 7.4。 E54. 如 E29 至 E53 中任一項之方法，其中組織滲透率為腦滲透率。 E55. 如 E29 至 E54 中任一項之方法，包括在藥劑存在下在第一腔室中培養複數個分子，以及確定藥劑是否影響複數個分子之組織滲透率。 E56. 如 E55 之方法，其中該藥劑為小分子。 E57. 一種確定複數個分子之藥物動力學 (PK) 參數之方法，其包含： a) 將該複數個分子引至第一腔室中，其中該第一腔室藉由細胞層與第二腔室分隔開，且該第一腔室及該第二腔室包含水溶液；其中該水溶液係處於生理 pH，且該細胞層包含表現介導分子輸送之受體的細胞； b) 測量自該第一腔室再循環至該細胞層中且返回至該第一腔室之該複數個分子的量；以及 c) 基於經再循環的該複數個分子的量，確定該 PK 參數。 E58. 如 E57 之方法，其中測量經再循環之複數個分子包括：在將複數個分子引至第一腔室中後，在第一腔室中培養複數個分子；更換該第一腔室及該第二腔室兩者中之該水溶液；以及測量自該細胞層釋放至該第一腔室中之該複數個分子的量。 E59. 如 E58 之方法，其中複數個分子在第一腔室中培養至少約 1 小時至約 48 小時。 E60. 如 E58 之方法，其中複數個分子在第一腔室中培養約 1 小時至約 30 小時。 E61. 如 E58 至 E60 中任一項之方法，其中更換水溶液包括清洗第一腔室。 E62. 如 E54 至 E57 中任一項之方法，進一步包括在測量之前藉由水溶液培養第一腔室和第二腔室。 E63. 如 E62 之方法，在測量之前，藉由替代水溶液培養第一腔室和第二腔室至少約 1 小時至約 6 小時。 E64. 如 E58 至 E63 中任一項之方法，其中培養在約 35℃ 至約 39℃ 之間之溫度下進行。 E65. 如 E57 至 E63 中任一項之方法，其中複數個分子為複數個單一分子。 E66. 如 E57 至 E64 中任一項之方法，其中複數個分子為複數個不同分子。 E67. 如 E57 至 E66 中任一項之方法，其中該細胞層包括細胞單層。 E68. 如 E57 至 E67 中任一項之方法，其中該等細胞表現異源 FcRn。 E69. 如 E57 至 E68 中任一項之方法，其中該等細胞為馬丁達比犬腎 (MDCK) 細胞。 E70. 如 E57 至 E68 中任一項之方法，其中測量經再循環之複數個分子之量包括酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、液體閃爍計數 (LSC)、定量 PCR、螢光分析儀系統或質譜法之使用。 E71. 如 57 至 70 中任一項之方法，其中複數個分子為含 Fc 分子。 E72. 如 E71 之方法，其中含 Fc 分子為受體 Fc 融合分子。 E73. 如 E57 至 E72 中任一項之方法，其中複數個分子為抗體。 E74. 如 E73 之方法，其中該等抗體為單株抗體。 E75. 如 E74 之方法，其中抗體為抗 IgE 抗體、抗 VEGF 抗體、抗整合素抗體、抗 IL-6 抗體、抗 TNFa 抗體、抗 BACE1 抗體或抗 gD 抗體。 E76. 如 E74 之方法，其中該抗體為奧馬珠單抗、貝伐珠單抗、托珠單抗、抗 BACE1 WT、抗 BACE1 變異體 YEY、抗 BACE1 變異體 YQAY、抗 BACE1 變異體 YPY、抗 BACE1 變異體 YY、抗 BACE1 變異體 YLY1 (Q6 )或抗 BACE1 變異體 YIY (T3)。 E77. 如 E57 至 E76 中任一項之方法，其中該生理 pH 為約 7.4。 E78. 如 E57 至 E77 中任一項之方法，其中該 PK 參數為複數個分子之活體內清除率、分布體積、曲線下面積 (AUC) 或活體內半衰期之度量。 E79. 如 E57 至 E78 中任一項之方法，包括在藥劑存在下在第一腔室中培養複數個分子，以及確定藥劑是否影響複數個分子之 PK 參數。 E80. 如 E79 之方法，其中該藥劑為小分子。 E81. 一種測定系統，其包含： a) 第一腔室及第二腔室，其中每一腔室包含處於生理 pH 之水溶液； b) 細胞層，該細胞層將該第一腔室及該第二腔室分隔開，其中該細胞層可介導分子自該第一腔室至該細胞層中且返回至該第一腔室中之再循環； c) 用於偵測該第一腔室中之分子的存在之偵測器；其中該測定系統係經組態以確定複數個分子之再循環；其中該確定包含：將該複數個分子引至該第一腔室中；在該第一腔室中培養該複數個分子；更換該第一腔室及該第二腔室兩者中之該水溶液；以及測量自該細胞層釋放至該第一腔室中之該複數個分子的量。 E82. 如 E81 之測定系統，其中：該測定系統進一步包含用於偵測該第二腔室中之分子的存在之偵測器；該細胞層可介導分子自該第一腔室至該第二腔室之胞吞轉送作用；且其中該測定系統係經組態以確定複數個分子跨該細胞層之該胞吞轉送作用，其中確定胞吞轉送作用包含在已更換該水溶液後，測量該第二腔室中之該複數個分子的量。 E83. 如 E81 或 E82 之測定系統，其中第一腔室和第二腔室為 96 孔轉移盤之部件。 E84. 一種套組，該套組包括如 E81 至 E83 中任一項之測定系統，以及使用說明。實例

以下實例僅為對本文所揭露之標的之說明，不應被視為以任何方式作為限縮。 材料與方法 表現人類 FcRn 之 MDCK 細胞株

如前所述，生成了穩定表現人類 FcRn 重鏈 (FCGRT) 和輕鏈 (B2M) 之克隆細胞株（Chung, S. 等人， 2019, MAbs,11(5), 942-955）。簡而言之，將兩種基因 FCGRT (UniProtKB – P55899, FCGRTN_HUMAN) 和 B2M (UniProtKB – P61769, B2MG_HUMAN) 之 cDNA 藉由修飾之 pPRK 質體引入至 MDCK 細胞，然後藉由嘌呤黴素選擇並藉由螢光激活細胞分選 (FACS) 進行分選。基於 FCGRT 和 B2M 蛋白之顯著表現水準選擇用於測定之最終殖株。將 MDCK-hFcRn 細胞保持在 Dulbecco 改良之最小必需培養基 (DMEM) 中，並添加 GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)，其輔助添加有 10% FBS (HyClone, Logan, UT)、5 µg/mL 嘌呤黴素和 1% 青黴素-鏈黴素 (Thermo Fisher Scientific)。將細胞在 37℃ 和 5% CO ₂下培養，每兩到三天傳代一次。測試分子

測試分子包括一組人源化 IgG1 抗體（一組在人體研究中具有記錄或公佈之清除率值之七種治療性抗體）以及抗單純皰疹病毒醣蛋白 D 野生型（抗 gD WT），其兩種變異體具有改變 Fc-FcRn 結合親和力之工程化突變（抗-gD HAHQ 和抗-gD YTE）。在 7 種治療性抗體中，5 種為上市藥品，2 種（維多珠單抗和阿達木單抗）購自廠家。其餘治療性抗體（貝伐珠單抗、奧馬珠單抗、托珠單抗、mAbX 和 mAbY）以及抗 gD 變異體在建南德克公司（加利福尼亞州南舊金山）之工程化中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞中產生。再循環測定

將 MDCK-hFcRn 細胞以 6 X 10 ⁴個細胞/孔之密度接種到 96 孔轉移盤 (MilliporeSigma, Burlington, MA) 之內腔室中，內腔室中具有 100 µL 生長培養基，外腔室中具有 200 µL 生長培養基，並在膜過濾器上培養三天以達到匯合。為了測量再循環，清除內腔室中之培養基，將 50 µL 測試抗體以 100 µg/mL (0.67 µM) 之濃度加載到每個內腔室中，然後在 37℃ 和 5% CO ₂下培養 2 小時。藉由生長培養基清洗這些孔以清除兩個腔室中之殘留抗體，在內腔室中留下 100 µL/孔之新鮮細胞培養基，在外腔室中留下 200 µL/孔之培養基。將細胞在 5% CO ₂和 37℃ 下再培養 4 小時，然後從內腔室中取出再循環樣品，以藉由人類 IgG 特異性 ELISA 測定進行以下定量。在實驗之最後一步，藉由將 20 mM 螢光黃 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 加入內腔室並培養一小時，藉由該螢光黃評估細胞單層之完整性。然後測量從外腔室取出之樣品之螢光黃位準，被動穿過大於 0.1% 之孔之結果（藉由將來自外腔室之螢光黃訊號除以相應內腔室之訊號來測量）被認為無效，並且由於細胞單層之潛在洩漏而被丟棄。每個再循環測定測量重複 6 至 8 次，報告值為平均濃度，其藉由在同一轉移盤中平行測試之貝伐珠單抗之再循環輸出量歸一化。

取自內腔室之樣品表示再循環成分，取自外腔室之樣品表示胞吞轉送作用成分。將樣品冷凍在 -70℃ 以使用 ELISA 進行定量。

可以使用該過程之變形形式。例如，視情況，對於再循環成分（內腔室）之洗滌過程，可以使用電子移液器之最低速度來最小化對在過濾器上培養之細胞層之干擾/損壞。視情況，免疫測定之兩位數定量下限可用於確保敏感度足夠嚴格以偵測抗體之低濃度。視情況，細胞可以在達到超過 95% 之存活率的條件下培養。視情況，可以依據所使用之細胞之類型和/或所評估之測試分子來調整細胞培養基。視情況，可以使用大轉移盤（例如，12 孔或 24 孔）。可以進行額外之變化。 ELISA 方法

使用作為捕獲分子之生物素化小鼠抗人 IgG-Fc （生物素-R10Z，建南德克製備）、作為偵測分子之辣根過氧化物酶 (HRP) 結合之山羊抗人 Fab （ ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA）及用於顯色之 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺 (TMB) 溶液 (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) 的半同源橋連酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)，其用於評估樣品。具體地，將標準品、對照品和樣品在細胞培養基中稀釋至其最終濃度，並在測定稀釋劑（PBS/0.5% BSA/0.05% 聚山梨醇酯 20/0.05% ProClin 300，pH 7.4±0.1）中製備其他藥劑。連續稀釋每個治療分子標準品從 4 ng/mL 至 31.25 pg/mL（孔內濃度）。對於該測定，將 60 µL/孔之經稀釋之標準品、對照品或樣品在環境溫度下藉由 60 µL/孔之 1 µg/mL 生物素-R10Z 在密封 96 孔聚丙烯盤中輕輕攪拌培養過夜。過夜培養後，將 100 µL/孔之混合物添加到鏈黴親和素包被和預封閉之盤 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)。將該盤密封並在環境溫度下攪拌培養1 小時。每次循環用 400 μL/孔之洗滌緩衝液（PBS/0.05% 聚山梨醇酯 20，pH7.34）將該盤洗滌 4 次。接下來，添加 100 µL/孔之 0.1 µg/mL HRP 結合之山羊抗人抗體，將該盤密封並在環境溫度下培養 1 小時。每次循環用 300 µL/孔之洗滌緩衝液洗滌該盤 4 次後，加入 100 µL/孔之過氧化物酶受質溶液 B 和 TMB 過氧化物酶受質混合物 (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) 並將該盤培養 15 至 20 分鐘以進行顯色。為了停止顯色，向每個孔中加入 100µL 之 1 M H ₃PO ₄。在 SpectraMax 340 讀盤儀 (Molecular Devices, San Jose, CA) 上以 450 nm（偵測波長）和 630 nm 參比濾光片對該盤進行讀數。使用 4 參數擬合分析資料，並在 SoftMax Pro 6.5.1 軟體程式中藉由 1/y2 進行加權。實例 1 ：再循環測定之開發

使用經過工程化以表現人類 FcRn 重鏈 (FCGRT) 和輕鏈 (B2M) 之克隆 MDCK 細胞株 (MDCK-hFcRn) 來開發 FcRn 相關再循環測定。表現位準、亞細胞共定位和功能讀數先前已得到說明，指示 MDCK 細胞株中之功能性人類 FcRn (Chung, S. et al.,2019, MAbs,11(5), 942-955)。再循環測定是在脈衝追蹤實驗過程中設計的（圖 2），並且是在允許細胞更完全的頂-底側極化的轉移培養系統中設計的。將 MDCK-hFcRn 細胞接種到 96 孔轉移盤中並培養三天直至匯合。對於脈衝步驟，將抗體添加到內腔室並培養兩小時，以提供時間使抗體被細胞內化並在細胞內途徑之間分佈和達到穩態（再循環、胞吞轉送作用和降解）。在清洗內腔室和外腔室以清除現有或經胞吞轉送之抗體後，將新鮮培養基添加到兩個腔室中並將細胞培養 4 小時。在該追蹤步驟中，可能有三種可能結果：細胞內之抗體要么被再循環回到內腔室中，要么經胞吞轉送進入外腔室，要么在細胞內降解。出現在內腔室中之抗體表示經再循環之分子。因此，收集內腔室溶液用於分析。任何經胞吞轉送進入外腔室之抗體都被排除在樣品之外，避免 FcRn 介導之胞吞轉送作用對再循環測定造成任何污染。在每個實驗結束時評估單層之完整性，並從分析中排除來自受損單層之資料。

由於在 96 孔測定形式下從細胞中釋放之經再循環之抗體之數量很小，因此開發了一種敏感人類 IgG 特異性酶聯免疫吸附測定 (ELISA)。該夾心 ELISA 使用了生物素化小鼠抗人 IgG-Fc 作為捕獲物，HRP 結合之山羊抗人 Fab 作為偵測物，以及用於顯色質 TMB 溶液（圖 3A），定量下限（LLOQ）達到 50 pg /mL，這允許對再循環輸出量之亞納摩爾濃度進行定量（圖 3B）。實例 2 ：人源化 IgG1 抗體之再循環輸出量很大程度上依賴於表現 FcRn 之細胞中 FcRn 介導之機制

為了說明再循環測定中 FcRn 介導之機制的參與，將人源化 IgG1 抗體（抗單純皰疹病毒醣蛋白 D（抗 gD）野生型 (WT)）與攜帶改變 Fc-FcRn 結合親和力之 Fc 突變之兩種變異體進行比較。其中一種變異體，抗 gD HAHQ，攜帶消除 FcRn 結合之 H310A/H435Q 突變，而另一變異體，抗 gD YTE，攜帶增強 FcRn 結合之突變 M252Y/S254T/T256E。抗 gD HAHQ 之再循環輸出量為 0.6 ng/mL，顯著低於抗 gD WT (1.2 ng/mL)，而抗 gD YTE 之再循環輸出量提高 (1.9 ng/mL)（圖 4 ）。這些結果表明，該系統中循環輸出量所反映之主要機制由 FcRn 介導，並支援使用該測定來評估 FcRn 介導之 IgG 穩態。

接下來，藉由使用一組常規人源化治療性抗體（包括奧馬珠單抗、貝伐珠單抗、維多珠單抗和托珠單抗）評估再循環測量之動力學。在追蹤步驟中的不同時間點（從 20 分鐘到 4 小時）採集再循環樣品。對於每個單獨分子，觀察到再循環之累積增加，在 20 分鐘時再循環輸出量最低，在 4 小時時輸出量最高（圖 5A）。三種經評估之抗體呈現大約為 0.4 至 0.5 ng/ml 之最大再循環量，而托珠單抗具有更高之再循環值，4 小時的時候達到 1.09 ng/ml。儘管四種分子之間之再循環輸出量存在差異，但再循環之動力學相似，在整個追蹤步驟之時間過程中幾乎沒有變化（圖 5B；再循環輸出量被歸一化為同一分子之 4 小時資料點；資料列於表 1B 中）。在每個時間點進一步檢查了四種分子之再循環輸出量之排序，並歸一化為貝伐珠單抗之再循環輸出量。四個時間點之排序和歸一化再循環輸出量都相似（表 1A，歸一化至貝伐珠單抗），表明無論追蹤時間如何，再循環輸出量之相關性都一致。每個分子在四個時間點（20、30、60 和 240 分鐘）之變異係數 (CV) 小於 20%，表明具有不同絕對再循環值的抗體之相對再循環輸出量在 4-小時追蹤期間一致。相應地，選擇 4-小時脈衝步驟作為該系統之標準測定過程，因為更高之再循環輸出量使定量更可信，並且決定使用貝伐珠單抗作為內部對照品，以對藉由其他測試分子測量之再循環輸出量進行歸一化。表 1A.在每個時間點處歸一化至貝伐珠單抗的再循環輸出量。

表 1B.對於每種抗體，更早時間點處的平均再循環輸出量歸一化至在 240 分鐘時的最大值。每個時間點處計算四種抗體之經歸一化之輸出量的均值和 SD。

實例 3 ：食蟹獼猴中胞吞轉送作用 / 再循環 (T/R) 比與活體內腦血清比之相關性

在胞吞轉送/再循環雙重測定中測試了一組 7 種抗 BACE1 變異體，包括野生型 (WT) 分子和六種變異體。WO2020/132230A2 中進一步描述了抗 BACE1 抗體。六種變異體在其 Fc 區攜帶突變，其在中性 pH 下顯著增強對 FcRn 之結合親和力，pH 7.4 下 Kd 降低了 13.3-78.1 倍（表 1）。對 FcRn 之更高結合親和力將導致 mAb 受更多保護，引導 mAb 更多地朝向 FcRn 介導之再循環和胞吞轉送途徑。與 WT 分子相比，pH 7.4 變異體之再循環和胞吞轉送輸出量兩者均顯示出顯著增加。該發現可能歸因於藉由 FcRn 受體介導之吸收針對 pH 7.4 變異體增強 mAb 內化。此外，在 pH7.4 變異體中，胞吞轉送作用和再循環之間的比顯著增加。WT 分子之 T/R 比為 0.026，而 pH7.4 變異體之比範圍為 0.074 至 0.191（表 2 和圖 6），表明突變引入了對胞吞轉送途徑之偏向，這可能促進抗體跨細胞層之輸送. 表 2.

變異體	突變	7.4 下之 Kd (nM)	再循環 (ng/mL)	胞吞轉送作用 (ng/mL)	T/R 比
WT	-	5000	5.59	0.148	0.026
YEY	M252Y; N286E; N434Y	288	306.5	38.1	0.124
YQAY	M252Y; T307Q; Q311A; N434Y	153	274.6	48.4	0.176
YPY	M252Y; V308P; N434Y	64	378.4	72.3	0.191
YY	M252Y；N434Y	376	285.4	21.2	0.074
YLYI (Q6)	M252Y; M428L; N434Y; Y436I	181	423.5	52.9	0.125
YIY (T3)	M252Y; Q311I; N434Y	328	343.8	46.3	0.135

然後分析來自 cyno 研究之測定輸出和體內腦穿透結果之間之潛在相關性（5 種分子之可用 cyno 資料；表 3）。單獨的胞吞轉送作用輸出或再循環輸出與腦血清比沒有顯著相關性。然而，T/R 比與腦血清比呈現很強的相關性（皮爾遜相關係數 0.837）。較高之 T/R 比率指示有利於胞吞轉送作用之細胞內途徑發生偏向，並且與活體內較高之腦穿透行為相關（圖 7）。因此，T/R 比為預測治療候選之腦穿透能力之有意義的生物學參數。表 3 ：獲得如 WO2020/132230A2 中所述至五種分子之 Cyno 資料

突變	血清 AUC	腦血清比 - 第 2 天	7.4 下之 Kd
WT	1	0.01	5000
YQAY	0.24	0.78	153
YY	0.47	0.42	376
YLYI (Q6)	0.17	0.41	181
YIY (T3)	0.2	0.28	328

實例 3 ：活體外再循環輸出量與人體內 mAb 之活體內清除率之相關性

測試了七種治療性抗體，包括五種已上市藥物和兩種先前正在開發之藥物，並評估其與人體中活體內清除率之潛在相關性。該等七種分子為 IgG1/kappa 同型之人源化抗體，並且反映了多種特性，包括作用機制、標靶特性和投予途徑，但沒有一種分子攜帶用於修飾 PK 特性或 FcRn 交互作用之 Fc 突變。根據藥物之處方箋資訊和以前的出版物，清除率值範圍為 2.2 至 8.5 mL/天/kg。已提出類似抗體同型之間觀察到之非特異性清除率差異是由分子特性（諸如 pI、電荷或疏水性）引起 (Hotzel, I. et al., (2012), MAbs, 4(6), 753-760)。使用已確立之基於序列之演算法，我們計算了分子參數，包括 (i) pI 值，(ii) pH5.5 下之淨 Fv 電荷，以及 (iii) CDR L1、L3、H2 和 H3 上疏水性指數值之總和 (HIsum) (Sharma, V. K. et al., (2014), PNAS, 111(52), 18601-18606)。已表明，這些參數之極值指示抗體具有更快的清除速率，然而，與先前之發現一致，沒有觀察到這些參數與清除率之間之明顯相關性趨勢（圖 8A 至圖 8C；表 4）。為了探索再循環與清除率之間之相關性，在再循環測定中評估了七種分子，以獲得對 FcRn 介導之再循環過程之定量測量。藉由返回內腔室之抗體之濃度測量的每種分子之再循環輸出量被歸一化至在同一 96 孔轉移盤上作為對照品運行之貝伐珠單抗之再循環值。表 4 示出了這些分子之再循環測定之結果，以及它們的所公佈之在人體中之清除率。所有七種分子都表現出可測量之再循環輸出量，清除率值顯示更快速率之分子表現出更高之再循環輸出量。示出了再循環輸出量與人體中之清除率呈現強正相關性（對於再循環，R ²= 0.856；圖 8D）。平均測定內精密度為 10.7%，並且測定間精密度為 12.3%。該結果表明再循環作為預測治療性抗體或正在開發之候選之 PK 行為的有前景的測定方法。表 4.經評估之抗體的歸一化再循環輸出量和計算出之 PI、Fv 和 HIsum

mAb	標靶	投予途徑	人體中之清除率， mL/ 天 /Kg	再循環 4 小時，歸一化	PI	Fv 電荷	Hisum
貝伐珠單抗 (Bevacizumab)	VEGF	iv	3.1	1	8.75	3.9	4.48
奧馬珠單抗	IgE	sc	2.4	0.88	7.15	1.8	3.29
維多珠單抗 (Vedolizumab)	整合素 (α4β7)	iv	2.2	1.11	8.85	3.4	2.97
托珠單抗	IL6R	sc	4.3	2.22	9.35	9	3.79
阿達木單抗	TNFα	sc	4.1	1.68	9.15	5.2	4.04
mAbX	未揭示	sc	5.8	2.16	9.15	7.7	4.28
mAbY	未揭示	iv	8.5	2.81	9.25	5.6	4.1

iv - 靜脈；sc - 皮下

七種經評估之抗體，每一種都具有常規 Fc 區，無論 Fab 區之不同特性如何，都說明了人體中之再循環輸出量與清除率之間存在顯著之相關性。具有相同 Fc 區之 IgG 之 Pk 特性可能有很大差異，這歸因於 Fab 臂之 Fv 電荷，其可能會影響與 FcRn 之交互作用，並可能影響內化過程中之液相胞飲作用。在該研究中，針對每個分子在 4 小時時歸一化至最大值後，經測試之四種人源化治療性抗體（奧馬珠單抗、貝伐珠單抗、維多珠單抗和托珠單抗）之間之再循環動力學曲線幾乎沒有變化。儘管托珠單抗表現出更高的再循環輸出值（在 4 小時時為其他三種抗體之約兩倍），但再循環之速率（每個時間點有傾斜）相同。不受理論束縛，相似再循環動力學可表明，對於具有常規 Fc 區之 mAb，穿過再循環途徑之 FcRn 介導之輸送可能相似，因此所測得之再循環輸出量之差異可能由 FcRn 介導之輸送之上游機制造成。該等四種抗體在 pH 6.0 下對 FcRn 具有相當的結合親和力，但托珠單抗之計算出之 PI 值和 Fv 電荷更高。這可以解釋托珠單抗之高再循環值和更快的清除速率，因為正電荷可以藉由與細胞表面之陰離子硫酸肝素蛋白多醣之靜電交互作用來增強非特異性結合。這些交互作用可藉由液相胞飲作用增強托珠單抗之內化。先前之工作表明，FcRn 無關機制可在調節具有相同 Fc 但具有不同 Fab 區之 mAb 之 PK 行為中發揮作用。

不受理論束縛，鑑於再循環已被認為係使 IgG 免於溶酶體降解並將其護送回血液之補救機制，最初預計高再循環輸出量可能與清除速率負相關。令人驚訝的是，觀察到了相反的結果：更高之再循環輸出量對應更快的清除速率。不受理論束縛，清除率與 FcRn 介導之再循環之間之該正相關可與抗體在每個內化事件期間經歷消除機制之部分有關。再循環過程從循環中獲取抗體並將它們返回到同一個區室，但不會影響血藥濃度之淨量，因為它本身是唯一因素。然而，之前已說明，再循環事件可伴隨著一小部分抗體之損失，這歸因於溶酶體之降解（Grevys 等人，2018）。在目前描述之轉移培養系統中，胞吞轉送作用也可以作為引導抗體遠離再循環之消除途徑。不受理論束縛，推測每次再循環事件之此類損失（由降解和胞吞轉送作用引起）可能會減少返回循環之再循環量。因此，對於高再循環分子，損失被誇大了，並且其可能有助於更快地降低血藥濃度，並更快地測量清除率。有趣的是，對於 FcRn 結合變異體組，觀察結果似乎相反，表明Fc 工程化抗 gD 變異體之再循環輸出量和清除率之間存在負相關趨勢。與 WT 相比，顯示較慢清除速率之 YTE 突變之再循環輸出量更高（參見實例 2）。不受理論束縛，對 FcRn 之顯著增強結合可能已成為主要的生物學因素，其可能導致保護水準增高並且溶酶體降解減少，這延長了抗體之血清半衰期。為了解釋常規和 Fc 工程化 mAb 之間之差異，影響 PK 行為之主要因素可能在兩種情形下有所不同，具體取決於分子之設計。因此，在解釋該 活體外系統之結果時，應考慮抗體之生化特性和 Fc 工程化。

所評估之七種 mAb 指示，作為沒有 Fc 修飾之的 mAb 之 PK 特性的預測因數，本文所描述之再循環測定優於使用抗體之 pI、電荷或疏水性參數（特別是來自人體中循環之清除率）之其他模型。測定設計使用了三區室 活體外模型系統（內腔室、細胞和外腔室）來模擬 活體內情形（血液區室、囊泡內皮細胞和組織區室），並結合了可能影響抗體之細胞代謝之多種生物事件。再循環測定提供了對可能影響抗體之細胞代謝之多種生物因素之整體評估，並且因此與僅考慮單一因素或因素子組之其他已發表測定相比，可以更好地預測一個或多個 PK 特性，例如非特異性結合、與細胞外基質之結合和 FcRn 交互作用。

此外，不受理論束縛，兩個轉移腔室中使用之中性 pH 可能為成功預測 PK 特性之關鍵，因為這在生理學上與抗體在中性 pH 下在細胞表面被捕獲和釋放的 活體內情形更相關。這可以解釋其他 FcRn 介導之基於細胞之測定之有限應用，其中酸性緩衝液用於將抗體加載到細胞中以利用酸性 pH 下 FcRn 結合之增強（Chung 等人，(2018), J Immunol Methods, 462, 101-105；Jaramillo 等人，2017, MAbs, 9(5), 781-791；Sockolosky、JT 等人，2012, PNAS, 109(40), 16095-16100；Ying等人 , 2015, MAbs, 7(5), 922-930）。其中一些方法預測了具有增強 FcRn 結合之 Fc 工程化分子之清除率或半衰期，但預測常規 mAb 之 PK 行為之能力有限，其中 FcRn 結合之變化更加微小。此外，細胞極化可能被認為係一個重要因素，因為再循環和胞吞轉送作用都被固有地極化，並且至少部分地在極化內皮細胞頂和底側表面由獨立過程進行（Dickinson 等人，1999, J Clin Invest, 104(7), 903-911；Tzaban、S. 等人, 2009, J Cell Biol, 185(4), 673-684）。與在常規細胞培養板上進行之其他再循環測定相比，本文所描述之利用轉移細胞培養系統之測定可允許更好的極化和再循環與胞吞轉送成分之分離，這在評估常規 mAb 時可能更準確 (Grevys，A . Nat Commun, 9(1) 621)。

本文所引用之所有出版物、專利和其他參考文獻藉由引用整體併入本揭露中。

圖 1描繪了 FcRn 之作用機制之示意圖，該作用機制涉及 pH 相關捕獲和釋放，以及包括再循環、胞吞轉送作用和溶酶體降解之細胞內運輸途徑。圖 2描繪了本揭露之再循環測定之特定實施例之示意圖。圖 3A描繪了用於定量如實施例中所述之再循環之靈敏人類 IgG 特異性酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 之示意圖。圖 3B提供了圖 3A 中描述的 ELISA 測定之標準曲線，展示了偵測之下限。圖 4示出了具有差異 Fc-FcRn 結合親和力之各種人源化 IgG1 抗體之再循環和胞吞轉送輸出量受人類 FcRn 影響。圖 5A 至圖 5B提供了時間相關再循環測量之比較，展示了四種治療性抗體中相似的再循環動力學。圖 5A 提供了非歸一化資料，而圖 5B 提供了歸一化資料。圖 6示出了野生型 (WT) BACE-1 抗體分子和幾個序列變異體之胞吞轉送作用/再循環 (T/R) 比。圖 7示出了針對五種抗 BACE1 mAb 變異體的食蟹獼猴中胞吞轉送作用/再循環 (T/R) 比與腦血清比之間之關係。圖 8A 至圖 8D提供了與計算出之 pI（圖 8A）、Fv 電荷（圖 8B）、HI 總和（圖 8C）以及根據本文描述之方法和測定進行的（一組治療性抗體之）歸一化再循環測定之輸出量相比，人體中之清除率。在圖 8A 至圖 8C 中，清除率與所比較之參數之間的相關性很低或沒有相關性。圖 8D 展示了清除率與歸一化再循環輸出量之相關性。


          <![CDATA[<110> 美商建南德克公司(GENENTECH, INC.)]]>
          <![CDATA[<120> 預測生物製劑之藥物動力學及腦滲透性之活體外基於細胞之測定]]>
          <![CDATA[<130> P36572-TW]]>
          <![CDATA[<140>]]>
          <![CDATA[<141>]]>
          <![CDATA[<150> 63/187,750]]>
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          <![CDATA[<170> PatentIn 第 3.5 版]]>
          <![CDATA[<210> 1]]>
          <![CDATA[<211> 342]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
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          Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser 
          1               5                   10                  15      
          Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro 
                      20                  25                  30          
          Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys 
                  35                  40                  45              
          Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu 
              50                  55                  60                  
          Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly 
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          Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln 
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          Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro 
          145                 150                 155                 160 
          His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp 
                          165                 170                 175     
          Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly 
                      180                 185                 190         
          Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu 
                  195                 200                 205             
          Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly 
              210                 215                 220                 
          Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys Ile Val Gln His 
                          245                 250                 255     
          Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys 
                      260                 265                 270         
          Ser Ser Val Leu Val Val Gly Ile Val Ile Gly Val Leu Leu Leu Thr 
                  275                 280                 285             
          Ala Ala Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu Trp Arg Arg Met Arg Ser Gly 
              290                 295                 300                 
          Leu Pro Ala Pro Trp Ile Ser Leu Arg Gly Asp Asp Thr Gly Val Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Pro Thr Pro Gly Glu Ala Gln Asp Ala Asp Leu Lys Asp Val Asn 
                          325                 330                 335     
          Val Ile Pro Ala Thr Ala 
                      340         
          <![CDATA[<210> 2]]>
          <![CDATA[<211> 119]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 2]]>
          Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg 
                      20                  25                  30          
          His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 
              50                  55                  60                  
          Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 
                          85                  90                  95      
          Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile 
                      100                 105                 110         
          Val Lys Trp Asp Arg Asp Met 
                  115                 
          <![CDATA[<210> 3]]>
          <![CDATA[<211> 344]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 小鼠]]>
          <![CDATA[<400> 3]]>
          Ser Glu Thr Arg Pro Pro Leu Met Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Asn 
          1               5                   10                  15      
          Pro Ser Thr Gly Leu Pro Ser Phe Trp Ala Thr Gly Trp Leu Gly Pro 
                      20                  25                  30          
          Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Asn Ser Leu Arg Gln Glu Ala Asp Pro Cys 
                  35                  40                  45              
          Gly Ala Trp Met Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu 
              50                  55                  60                  
          Thr Thr Asp Leu Lys Ser Lys Glu Gln Leu Phe Leu Glu Ala Leu Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Leu Glu Lys Ile Leu Asn Gly Thr Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu 
                          85                  90                  95      
          Gly Cys Glu Leu Ala Ser Asp Asn Ser Ser Val Pro Thr Ala Val Phe 
                      100                 105                 110         
          Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Lys Phe Asn Pro Arg Ile Gly Asn 
                  115                 120                 125             
          Trp Thr Gly Glu Trp Pro Glu Thr Glu Ile Val Ala Asn Leu Trp Met 
              130                 135                 140                 
          Lys Gln Pro Asp Ala Ala Arg Lys Glu Ser Glu Phe Leu Leu Asn Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Pro Glu Arg Leu Leu Gly His Leu Glu Arg Gly Arg Arg Asn Leu 
                          165                 170                 175     
          Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Gly Asn 
                      180                 185                 190         
          Ser Gly Ser Ser Val Leu Thr Cys Ala Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro 
                  195                 200                 205             
          Glu Leu Lys Phe Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ser Gly Ser Gly 
              210                 215                 220                 
          Asn Cys Ser Thr Gly Pro Asn Gly Asp Gly Ser Phe His Ala Trp Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Leu Glu Val Lys Arg Gly Asp Glu His His Tyr Gln Cys Gln Val 
                          245                 250                 255     
          Glu His Glu Gly Leu Ala Gln Pro Leu Thr Val Asp Leu Asp Ser Ser 
                      260                 265                 270         
          Ala Arg Ser Ser Val Pro Val Val Gly Ile Val Leu Gly Leu Leu Leu 
                  275                 280                 285             
          Val Val Val Ala Ile Ala Gly Gly Val Leu Leu Trp Gly Arg Met Arg 
              290                 295                 300                 
          Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Leu Ser Leu Ser Gly Asp Asp Ser Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Leu Leu Pro Gly Gly Asn Leu Pro Pro Glu Ala Glu Pro Gln Gly 
                          325                 330                 335     
          Ala Asn Ala Phe Pro Ala Thr Ser 
                      340                 
          <![CDATA[<210> 4]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 小鼠]]>
          <![CDATA[<400> 4]]>
          Met Ala Arg Ser Val Thr Leu Val Phe Leu Val Leu Val Ser Leu Thr 
          1               5                   10                  15      
          Gly Leu Tyr Ala Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Val Tyr Ser Arg 
                      20                  25                  30          
          His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn Cys Tyr Val Thr 
                  35                  40                  45              
          Gln Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu Lys Asn Gly Lys 
              50                  55                  60                  
          Lys Ile Pro Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe Ser Lys Asp Trp 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Thr Asp 
                          85                  90                  95      
          Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Asp Ser Met Ala Glu Pro Lys Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met 
                  115                 
          <![CDATA[<210> 5]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 大鼠]]>
          <![CDATA[<400> 5]]>
          Ala Glu Pro Arg Leu Pro Leu Met Tyr His Leu Ala Ala Val Ser Asp 
          1               5                   10                  15      
          Leu Ser Thr Gly Leu Pro Ser Phe Trp Ala Thr Gly Trp Leu Gly Ala 
                      20                  25                  30          
          Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Asn Asn Leu Arg Gln Glu Ala Asp Pro Cys 
                  35                  40                  45              
          Gly Ala Trp Ile Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu 
              50                  55                  60                  
          Thr Thr Asp Leu Lys Ser Lys Glu Gln Leu Phe Leu Glu Ala Ile Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Leu Glu Asn Gln Ile Asn Gly Thr Phe Thr Leu Gln Gly Leu Leu 
                          85                  90                  95      
          Gly Cys Glu Leu Ala Pro Asp Asn Ser Ser Leu Pro Thr Ala Val Phe 
                      100                 105                 110         
          Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Arg Phe Asn Pro Arg Thr Gly Asn 
                  115                 120                 125             
          Trp Ser Gly Glu Trp Pro Glu Thr Asp Ile Val Gly Asn Leu Trp Met 
              130                 135                 140                 
          Lys Gln Pro Glu Ala Ala Arg Lys Glu Ser Glu Phe Leu Leu Thr Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Pro Glu Arg Leu Leu Gly His Leu Glu Arg Gly Arg Gln Asn Leu 
                          165                 170                 175     
          Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Gly Asn 
                      180                 185                 190         
          Ser Gly Ser Ser Val Leu Thr Cys Ala Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro 
                  195                 200                 205             
          Glu Leu Lys Phe Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ser Gly Ser Gly 
              210                 215                 220                 
          Asn Cys Ser Thr Gly Pro Asn Gly Asp Gly Ser Phe His Ala Trp Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Leu Glu Val Lys Arg Gly Asp Glu His His Tyr Gln Cys Gln Val 
                          245                 250                 255     
          Glu His Glu Gly Leu Ala Gln Pro Leu Thr Val Asp Leu Asp Ser Pro 
                      260                 265                 270         
          Ala Arg Ser Ser Val Pro Val Val Gly Ile Ile Leu Gly Leu Leu Leu 
                  275                 280                 285             
          Val Val Val Ala Ile Ala Gly Gly Val Leu Leu Trp Asn Arg Met Arg 
              290                 295                 300                 
          Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Leu Ser Leu Ser Gly Asp Asp Ser Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Leu Leu Pro Gly Gly Asn Leu Pro Pro Glu Ala Glu Pro Gln Gly 
                          325                 330                 335     
          Val Asn Ala Phe Pro Ala Thr Ser 
                      340                 
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          <![CDATA[<400> 6]]>
          Met Ala Arg Ser Val Thr Val Ile Phe Leu Val Leu Val Ser Leu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Val Leu Ala Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Val Tyr Ser Arg 
                      20                  25                  30          
          His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 
                  35                  40                  45              
          Gln Phe His Pro Pro Gln Ile Glu Ile Glu Leu Leu Lys Asn Gly Lys 
              50                  55                  60                  
          Lys Ile Pro Asn Ile Glu Met Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Thr Asp 
                          85                  90                  95      
          Val Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Val Thr Leu Lys Glu Pro Lys Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Trp Asp Arg Asp Met 
                  115                 
          <![CDATA[<210> 7]]>
          <![CDATA[<211> 342]]>
          <![CDATA[<212]]>> PRT]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;213&gt; 食蟹獼猴]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;400&gt; 7]]&gt;
          <br/><![CDATA[Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser 
          1               5                   10                  15      
          Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro 
                      20                  25                  30          
          Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asp Ser Leu Arg Gly Gln Ala Glu Pro Cys 
                  35                  40                  45              
          Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu 
              50                  55                  60                  
          Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys 
                          85                  90                  95      
          Glu Leu Ser Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu 
                      100                 105                 110         
          Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln 
              130                 135                 140                 
          Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro 
          145                 150                 155                 160 
          His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp 
                          165                 170                 175     
          Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Gly Asn Pro Gly 
                      180                 185                 190         
          Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu 
                  195                 200                 205             
          Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Met Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly 
              210                 215                 220                 
          Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys Ile Val Gln His 
                          245                 250                 255     
          Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu Glu Thr Pro Ala Lys 
                      260                 265                 270         
          Ser Ser Val Leu Val Val Gly Ile Val Ile Gly Val Leu Leu Leu Thr 
                  275                 280                 285             
          Ala Ala Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu Trp Arg Arg Met Arg Ser Gly 
              290                 295                 300                 
          Leu Pro Ala Pro Trp Ile Ser Leu Arg Gly Asp Asp Thr Gly Ser Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Pro Thr Pro Gly Glu Ala Gln Asp Ala Asp Ser Lys Asp Ile Asn 
                          325                 330                 335     
          Val Ile Pro Ala Thr Ala 
                      340         
          <![CDATA[<210> 8]]>
          <![CDATA[<211> 119]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 食蟹獼猴]]>
          <![CDATA[<400> 8]]>
          Met Ser Pro Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Pro Ser 
          1               5                   10                  15      
          Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg 
                      20                  25                  30          
          His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 
              50                  55                  60                  
          Lys Met Gly Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Asn Glu Lys Asp 
                          85                  90                  95      
          Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gly Pro Arg Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Lys Trp Asp Arg Asp Met 
                  115

Claims

一種方法，其包含確定複數個分子之再循環，其中該確定包含：將該複數個分子引至第一腔室中，其中：該第一腔室藉由細胞層與第二腔室分隔開，且該第一腔室及該第二腔室包含水溶液；在該第一腔室中培養該複數個分子；更換該第一腔室及該第二腔室兩者中之該水溶液；以及測量自該細胞層釋放至該第一腔室中之該複數個分子的量；其中該水溶液係處於生理 pH，且該細胞層包含表現介導分子輸送之受體的細胞。
如請求項 1 之方法，其中該細胞層包含細胞單層。
如請求項 1 或 2 之方法，其中該介導分子輸送之受體為運鐵蛋白受體、Fc 受體、巨蛋白 (megalin) 或立方蛋白 (cubulin)。
如請求項 1 至 3 中任一項之方法，其中該介導分子輸送之受體為新生兒 Fc 受體 (FcRn)。
如請求項 1 至 3 中任一項之方法，其中該等細胞為馬丁達比犬腎 (Madin-Darby Canine Kidney；MDCK) 細胞。
如請求項 1 至 4 中任一項之方法，其中測量自該細胞層釋放之該複數個分子的量包含酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、液體閃爍計數 (LSC)、定量 PCR、螢光分析儀系統或質譜法之使用。
如請求項 1 至 5 中任一項之方法，其中該複數個分子為含有 Fc 的分子。
如請求項 1 至 5 中任一項之方法，其中該複數個分子為抗體。
如請求項 4 之方法，其中該 FcRn 係選自由以下所組成之群組：人類 RcRn、小鼠 FcRn、大鼠 FcRn 及食蟹獼猴 (cynomolgus) FcRn。
如請求項 1 至 9 中任一項之方法，其進一步包含測量該複數個分子跨越該細胞層之胞吞轉送作用。
如請求項 10 之方法，其中測量該胞吞轉送作用包含：在已更換該第一腔室及該第二腔室兩者中之該水溶液後，測量該第二腔室中之該複數個分子的量。
如請求項 1 至 11 中任一項之方法，其包含在藥劑存在下在該第一腔室中培養該複數個分子，以及確定該藥劑是否影響該複數個分子之再循環。
一種確定複數個分子之組織滲透率 (penetrance) 之方法，其包含： a) 將該複數個分子引至第一腔室中，其中該第一腔室藉由細胞層與第二腔室分隔開，且該第一腔室及該第二腔室包含水溶液；其中該水溶液係處於生理 pH，且該細胞層包含表現介導分子輸送之受體的細胞； b) 測量自該第一腔室再循環至該細胞層中且返回至該第一腔室之該複數個分子的量； c) 測量自該第一腔室胞吞轉送至該第二腔室之該複數個分子的量；以及 d) 基於經胞吞轉送的分子與經再循環的分子之比率，確定該複數個分子之該組織滲透率。
如請求項 13 之方法，其中測量經再循環的該複數個分子包含：在將該複數個分子引至該第一腔室中後，在該第一腔室中培養該複數個分子；更換該第一腔室及該第二腔室兩者中之該水溶液；以及測量自該細胞層釋放至該第一腔室中之該複數個分子的量。
如請求項 13 或 14 之方法，其中測量經胞吞轉送的該複數個分子包含：在將該複數個分子引至該第一腔室中後，在該第一腔室中培養該複數個分子；更換該第一腔室及該第二腔室兩者中之該水溶液；以及測量自該細胞層釋放至該第二腔室中之該複數個分子的量。
如請求項 13 至 15 中任一項之方法，其中該細胞層包含細胞單層。
如請求項 13 至 16 中任一項之方法，其中該介導分子輸送之受體為運鐵蛋白受體、Fc 受體、巨蛋白 (megalin) 或立方蛋白 (cubulin)。
如請求項 13 至 17 中任一項之方法，其中該介導分子輸送之受體為新生兒 Fc 受體 (FcRn)。
如請求項 13 至 18 中任一項之方法，其中該等細胞為馬丁達比犬腎 (MDCK) 細胞。
如請求項 13 至 19 中任一項之方法，其中測量經再循環的該複數個分子的量及測量經胞吞轉送的該複數個分子的量獨立地包含酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、液體閃爍計數 (LSC)、定量 PCR、螢光分析儀系統、質譜法或其任何組合之使用。
如請求項 13 至 20 中任一項之方法，其中該複數個分子為含有 Fc 的分子。
如請求項 13 至 21 中任一項之方法，其中該複數個分子為抗體。
如請求項 22 之方法，其中該抗體為抗 IgE 抗體、抗 VEGF 抗體、抗整合素抗體、抗 IL-6 抗體、抗 TNFa 抗體、抗 BACE1 抗體或抗 gD 抗體。
如請求項 13 至 23 中任一項之方法，其中該組織滲透率為腦滲透率。
如請求項 13 至 24 中任一項之方法，其包含在藥劑存在下在該第一腔室中培養該複數個分子，以及確定該藥劑是否影響該複數個分子之該組織滲透率。
一種確定複數個分子之藥物動力學 (PK) 參數之方法，其包含： a) 將該複數個分子引至第一腔室中，其中該第一腔室藉由細胞層與第二腔室分隔開，且該第一腔室及該第二腔室包含水溶液；其中該水溶液係處於生理 pH，且該細胞層包含表現介導分子輸送之受體的細胞； b) 測量自該第一腔室再循環至該細胞層中且返回至該第一腔室之該複數個分子的量；以及 c) 基於經再循環的該複數個分子的量，確定該 PK 參數。
如請求項 26 之方法，其中測量經再循環的該複數個分子包含：在將該複數個分子引至該第一腔室中後，在該第一腔室中培養該複數個分子；更換該第一腔室及該第二腔室兩者中之該水溶液；以及測量自該細胞層釋放至該第一腔室中之該複數個分子的量。
如請求項 26 或 27 之方法，其中該細胞層包含細胞單層。
如請求項 26 至 28 中任一項之方法，其中該等細胞表現異源 FcRn。
如請求項 26 至 29 中任一項之方法，其中該等細胞為馬丁達比犬腎 (MDCK) 細胞。
如請求項 26 至 29 中任一項之方法，其中測量經再循環的該複數個分子的量包含酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、液體閃爍計數 (LSC)、定量 PCR、螢光分析儀系統或質譜法之使用。
如請求項 26 至 31 中任一項之方法，其中該複數個分子為含有 Fc 的分子。
如請求項 26 至 32 中任一項之方法，其中該複數個分子為抗體。
如請求項 33 之方法，其中該抗體為抗 IgE 抗體、抗 VEGF 抗體、抗整合素抗體、抗 IL-6 抗體、抗 TNFa 抗體、抗 BACE1 抗體或抗 gD 抗體。
如請求項 26 至 34 中任一項之方法，其中該 PK 參數為該複數個分子之活體內清除率、分布體積、曲線下面積 (AUC) 或活體內半衰期之度量 (measure)。
如請求項 26 至 35 中任一項之方法，其包含在藥劑存在下在該第一腔室中培養該複數個分子，以及確定該藥劑是否影響該複數個分子之該 PK 參數。
一種測定系統，其包含： a) 第一腔室及第二腔室，其中每一腔室包含處於生理 pH 之水溶液； b) 細胞層，該細胞層將該第一腔室及該第二腔室分隔開，其中該細胞層可介導分子自該第一腔室至該細胞層中且返回至該第一腔室中之再循環； c) 用於偵測該第一腔室中之分子的存在之偵測器；其中該測定系統係經組態以確定複數個分子之再循環；其中該確定包含：將該複數個分子引至該第一腔室中；在該第一腔室中培養該複數個分子；更換該第一腔室及該第二腔室兩者中之該水溶液；以及測量自該細胞層釋放至該第一腔室中之該複數個分子的量。
如請求項 37 之測定系統，其中：該測定系統進一步包含用於偵測該第二腔室中之分子的存在之偵測器；該細胞層可介導分子自該第一腔室至該第二腔室之胞吞轉送作用；且其中該測定系統係經組態以確定複數個分子跨越該細胞層之該胞吞轉送作用，其中確定胞吞轉送作用包含在已更換該水溶液後，測量該第二腔室中之該複數個分子的量。
如請求項 37 或 38 之測定系統，其中該第一腔室及該第二腔室為 96 孔轉移盤 (trans-well plate) 之組件。
一種套組，其包含如請求項 37 至 39 中任一項之測定系統，以及使用說明。