KR0119909B1

KR0119909B1 - 플로우 사이토미터를 이용한 고상형 면역 측정방법

Info

Publication number: KR0119909B1
Application number: KR1019930020520A
Authority: KR
Inventors: 김길현; 한미영; 윤도영; 최인성; 정태화
Original assignee: 김은영; 한국과학기술연구원
Priority date: 1993-10-05
Filing date: 1993-10-05
Publication date: 1997-10-20
Also published as: KR950012071A

Abstract

본 발명은 플로우 사이토미터를 이용한 고상형 면역 측정방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 각종 생체물질을 측정함에 있어서 종래의 면역측정법보다 더욱 정확하게 적용범위가 넓은 플로우 사이토미터(flow cytometer)를 이용한 새로운 고상형 면역 측정방법에 관한 것이다.

Description

플로우 사이토미터를 이용한 고상형 면역 측정방법

제1도는 본 발명의 방법에 따라 IgM, IgG 및 IgA 표준물질에 대한 형광강도를 나타낸 그래프이고,

제2도는 본 발명의 방법에 따라 생쥐혈청의 면역글로불린 아이소타입(isotype) 조성을 측정한 결과이고,

제3도는 본 발명의 방법에 따라 아가로오즈 비이드에 상이한 농도의 IgG 표준물질을 반응시킨후 FITC결한 항-IgG를 반응시키고 그 형광강도를 측정한 결과이고,

제4도는 본 발명의 방법에 따라 제3도에서 측정한 형광강도를 IgG 표준 물질의 농도에 대응시킨 결과를 나타낸 그래프이며,

제5도는 본 발명의 방법에 따라 측정한 HCG의 양과 형광강도 사이의 상관관계와 종래의 효소 면역 측정법으로 측정한 HCG의 양과 흡광도 사이의 상관관계를 비교한 그래프이다.

본 발명은 플로우 사이토미터를 이용한 고상형 면역 측정방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 각종 생체물질을 측정함에 있어서 종래의 면역측정법 보다 더욱 정확하고 적용범위가 넓은 플로우 사이토미터(flow cytometer)를 이용한 새로운 고상형 면역 측정방법에 관한 것이다.

플로우 사이토미터는 개개 세포들 혹은 세포구성물들이 보통 초당 500~4000개의 속도로 강하게 조명된 부분을 통과할 때 방출되는 형광이나 산란되는 빛의 양을 정량하는 것으로 원래 동식물 세포나 미생물의 표면 단백질에 대한 석에 사용되는 기기로 고안되었다. 즉, 세포표면 단백질에 대한 항체 등을 이용하여 형광물질을 세포에 부착시키고 이 형광물질의 결합정도를 측정함으로써 각종 세로표면 단백질의 구성과 분포를 측정할 수 있는 기기이다.

이 플로우 사이토미터는 단시간내에 수많은 세포(초당 500~4000개의 세포)를 분석하여 그 분석결과를 컴퓨터를 통하여 통계적으로 재구성한 후 그 최종 결과를 나타내주므로 정확한 통계적 결론을 얻을 수 있는 최첨단의 기기로서 그 사용범위가 점차로 확대되고 있으며, 그 편리성과 정확성이 매우 높이 평가되고 있다.

미량으로 존재하는 생체물질을 측정하는 방법을 본 발명의 실시예로 쓰인 인체 태반성 홀몬을 예로들어 설명하면, 인체태반성 홀몬의 역가를 측정하는 데에는 생물학적 측정법과 면역학적 측정법이 있다. 이중 생물학적 역가 측정법에는 인체태반성 홀몬을 쥐나 토끼 등의 실험동물에 주사했을 때 이 동물들의 자궁, 전립선, 고환 등과 같은 생식기관의 무게 변화가 일어남을 이용하여 그 수치를 국제 표준품의 그것과 비교하여 역가를 정하고 있다.

이러한 인체태반성 홀몬의 생물학적 역가 측정법은 몇가지 단점을 가지고 있는데, 우선 이방법은 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라 일관성 있는 결과를 얻기 위해서는 실험증후군의 획일적인 유지가 요구되며, 동물실험에 따른 문제로 말미암아 실험 수행자의 숙련 정도에 따라 그 결과가 좌우될 수 있다.

따라서 근래에는 빠른 시간내에 더욱 간편한 방법으로 객관적인 결과를 얻기 위하여 항원 항체의 반응을 이용한 면역학적 측정법이 이용되고 있다.

항원 항체의 반응을 이용한 면역측정 방법이란 측정하고자 하는 물질을 항원으로 하여 이에대한 특정항체를 만들어서 항원에 결합할 수 있도록 하고 이 결합체를 인지하여 기기를 써서 측정할 수 있는 여러 가지 표지를 사용하여 항원 항체의 결합여부와 결합정도를 측정함으로써 측정하고자 하는 생체물질을 정성, 정량하는 방법이다.

이제까지 쓰이고 있는 생체물질의 면역측정 방법으로는 사용되는 표지의 종류에 따라 구분할 수 있는데, 방사성 동위원소를 표지로 이용하는 방사성 면역 측정법과 비방사성 동위원소, 예를 들면 효소나 형광물질을 표지로 이용하는 효소면역 측정법과 형광면역 측정법이 포함되는 비방사성 면역측정법을 들 수 있다.

이중 널리 쓰이고 있는 면역 측정방법은 방사성 면역측정법인데 이 방법은 정확하고 예민도가 높으며 측정이 간편하고 쉬우며 속도도 빠르다. 또한 측정할 수 있는 감마측정기와 베타측정기 등 기기의 가격도 그리 비싸지 않다는 여러 가지 장점을 가지고 있다.

이러한 방사성 동위원소를 이용한 면역측정법의 가장 큰 단점은 인체에 해로운 방사성 폐기물이 많이 나온다는 것이며 방사성 동위원소의 사용량과 종류가 규정에 의해 제한되어 있는 불편함이 있다. 또한 방사성 표지로 쓰이는 많은 동위원소들이 반감기가 짧아 불안정하다는 단점이 있는데, 예를 들어¹²⁵I(요오드 동위원소)의 경우는 유용한 사용기간이 3주에서 3개월로 제한되어 있다. 따라서 방사성 면역측정법이 많이 개발되어야 할 필요가 있으며 실제로 이 분야에 빠른 발전이 이루어지고 있다. 비방사성 표지로 현재 많이 쓰이고 있는 것은 효소인데 과산화효소(horseradish peroxidase)와 알칼리성 탈인산효소(alkaline phosphatase) 같은 효소를 공유결합으로 항체 등의 다른 분자에 부착시켜 표지로 사용한다. 효소표지는 이론적으로 방사성물질 표지와 동일한 방법으로 쓰일 수 있으며 측정과정에서 방사성 폐기물이 생기지 않는다는 장점이 있다. 그러나 전반적으로 효소 면역측정법은 정확도와 측정속도, 간편성에서 방사성 면역측정법의 그것보다 떨어지는 것으로 나타나고 있다.

특히 측정의 용이도 측면에서는 현저히 떨어지는데, 이것은 표지로 사용한 효소의 활성도에 여러 가지 인자들이 영향을 주기 때문인 것으로 생각된다. 즉, 측정과정에서 수소이온농도(pH)와 온도의 영향때문이며 이외에도 효소를 부착시킨 면역측정판 사이에서의 흡광도의 차이와 측정판의 온도차이에서 생기는 부수적인 변수들이 또 다른 인자로 작용할 수 있다. 또한 효소표지로 널리 쓰이는 과산화 효소의 기질로 쓰이는 오르토 페닐렌디아민(o-phenylenediamine)은 강력한 돌연변이 유발성과 발암성을 가진 물질로 효소면역측정법에 쓰이는 양의 1/200 정도의 낮은 농도에서도 돌연변이를 일으킬 수 있다는 보고가 있으며 사용된 기질로부터 효소의 작용에 의해서 생긴 생성물인 파라 니트로페놀(p-nitrophenol)와 오르토 니트로페놀(o-nitrophenol)도 자극제로서의 독성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

이외에도 널리 쓰이고 있는 대분의 기질들이 피부에 닿으면 피부염을 일으킬 수 있으며 투베르쿨린형 알러지 반응(delayed-type hypersensitivity) 같은 면역반응을 초래하는 수도 있다. 반변 중요한 비방사성 표지의 다른 하나인 형과물질을 이용한 형광면역 측정법의 경우, 측정방법의 정확도, 예민도와 측정과정에서의 속도, 간편성, 용이도가 방사성 면역측정법에 비해 손색이 없으며(표 1 참조), 특히 예민도의 경우 나노몰(nanomolar)의 수준으로 존재하는 생리물질을 측정할 수 있으며 측정방법의 발전으로 거의 피코몰(picomolar)의 수준까지도 측정이 가능하게 되었다. 표지로 쓰이는 형광물질의 종류에는 여러 가지가 있으나 특이성과 예민도가 좋은 것을 택해야 하는데 플루오르신 이소치오시아네이트(fluruescene isothiocyanate: FITC)가 현재까지는 가장 널리 쓰이고 있다.

위에서 열거한 여러 가지 장점에도 불구하고 형광면역 측정법을 쉽게 적용할 수 없는 가장 큰 이유로 측정기기의 보편성을 들 수 있겠다(상기 표 1참조).

즉 형광을 측정하는데 쓰이는 형광분석기(spectroflourimeter)가 비싸고 조작하기가 다소 복잡하기 때문이다. 즉, 형광면역 측정법이 널리 쓰이기 위해서는 좀더 편리한 형광측정기의 고안이 필요하다. 따라서, 본 발명자들은 플로우 사이토미터를 이용한 형광면역 측정법을 개발하게 되었으며 아직까지 플로우 사이토미터를 이용하여 생체물질의 면역측정을 시도한 것은 보고된 바 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 플로우 사이토미터를 이용하여 종래의 면역측정법 보다 더욱 정확하고 적용범위가 넓은 생체물질 고상형 면역측정을 위한 새로운 방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명은 방사성 동위원소나 효소 대신 형광물질을 사용하고 그 형광강도를 플로우 사이토미터로 측정함으로써, 간편하고 정확하게 생체물질을 측정할 수 있는 개선된 면역측정 방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 생체물질의 면역측정 정량방법에 있어서,

(가) 아가로오즈 비이드(agarose bead)에 면역글로불린(Ig)의 아이소타입에 대한 측정 대상물질의 항체로서 항-IgG, 항-IgM 및 항-IgA를 결합시키는 단계,

(나) 항체가 결합된 상기 비이드에 측정 대상물질을 투여하여 반응시키는 단계,

(다) 반응되지 않은 IgG, IgM 및 IgA를 세척하여 제거하는 단계,

(라) IgG, IgM 및 IgA에 결합될 수 있고 형광물질이 부착된 항-Ig를 투여하여 반응시키는 단계,

(마) 반응되지 않은 투여항체를 세척, 제거하는 단계 및

(바) 플로우 사이토미터로 비이드를 분석하는 단계로 이루어지는 것을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 생체물질에 대한 면역측정 정량방법에 있어서,

(가) 측정 대상물질에 대한 항체를 비이드에 결합시키는 단계,

(나) 측정 대상물즐을 반응시켜 아이소타입 조성을 측정하는 단계,

(다) 항체가 결합된 상기 비이드에 서로 다른 농도의 IgG 표준물질을 투여하여 반응시키는 단계,

(라) 반응되지 않은 IgG를 세척하여 제거하는 단계,

(마) IgG에 결합될 수 있고 형광물질이 부착된 항-Ig를 투여하여 반응시키는 단계,

(바) 반응되지 않은 투여항체를 세척, 제거하는 단계,

(사) 플로우 사이터미터로 비이드에 대하여 형광강도를 분석하는 단계 및

(아) 형광강도를 IgG 표준물질의 농도에 대응시켜 IgG 물질을 정량하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역측정 정량방법을 포함한다.

이와같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는 플로루 사이토미터를 이용하는데 있어서 살아있는 세포 대신에 탄소화물로 구성된 아가로오즈 비이드를 고형상(solid phase)으로 사용하였다.

즉, 아가로오즈 비이드에 측정하고자 하는 물질에 대한 항체를 결합시키고 여기에 측정하고자 하는 물질을 반응시킨후, 측정하고자 하는 물질의 항체에 형광물질이 결합된 접합물을 2차 반응시켰으며, 그에 따라 아가로오즈에 부착된 형광강도를 플로우 사이토미터로 측정하였다.

이와같이 본 발명은 플로우 사이터미터를 이용하여 형광강도를 측정함으로써 간편하고 정확하게 생체물질을 측정할 수 있고, 따라서 종래의 면역측정법 보다 더욱 정확하고 적용범위가 넓은 생체물질의 면역측정 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 따라 상세히 설명하면 다음과 같으며 본 발명이 실시예에 의한 한정되는 것은 아니다. 실시예는 면역 글로불린(Immunoglobulin; Ig)의 아이소타입(isotype) 면역 글로불린 항체(anti-Ig)를 이용하여 결정하는 방법과 인체 태반성 홀몬의 정량법을 선택하였다.

[실시예 1]

입자크기가 180㎛ 이하인 아가로오즈 비이드(agarose bead)에 단백질 0.5mg의 양에 해당하는 면역글로불린(Ig)의 각 아이소타입 IgG, IgM 및 IgA에 대한 항체, 즉 항-IgG, 항-IgM 및 항-IgA를 하룻밤동안 4˚C에서 반응시켰다. 비이드에 남아 있는 활성기는 0.1M Tris-HCI(pH8.0)으로 처리하여 반응을 막아주었다.

이와같이 항체가 결합된 상기 비이드를 15ml 의 완충액(PBS)으로 현탁시킨 후, 이중 50㎕의 현탁액을 취하여 측정대상물질 20㎕를 혼합하여 상온에서 30분간 반응되지 않은 IgG, IgM 및 IgA를 제거하였다. 세척된 비이드에 IgG, IgM 및 IgA에 결합될 수 있고 형광물질인 FITC가 부착된 항-Ig를 가하여 상온에서 30분간 반응시킨 후 완충액으로 3회 세척하여 반응되지 않은 투여 항-Ig를 제거하였다.

이렇게 제조된 아가로오즈 비이드를 플로우 사이토미터를 이용하여 분석함으로써 아가로오즈에 부착된 형광물질, 즉 FITC의 양을 488nm의 레이저 광선을 조사하였을 때 발생하는 형광강도를 525nm의 필터를 사용하여 측정하였다. 그 결과는 제1도에 나타난 바와 같으며, IgG, IgM 및 IgA의 표준물질에 대한 형광강도가 현저히 증가됨을 볼 수 있다.

[실시예 2]

실시예 1에서 기술한 바와같이 항-IgG, 항-IgM 혹은 항-IgA를 결합시킨 아가로오즈 비이드에 IgG, IgM 및 IgA 표준물질 대신 생쥐의 혈청을 넣어주고 반응시킴으로써 생쥐혈청의 면역글로불린 아이소타입 조성을 측정하였다. 그 결과는 제2도에 나타난 바와같이, 제2도에서 IgG가 가장 많은 것으로 나타났으며, IgA 와 IgM 은 비슷한 수준이나 IgM이 다소 많은 것으로 나타났다.

[실시예 3]

아가로오즈 비이드에 항-IgG를 결합시키고, 서로 다른 농도의 IgG 표준물질을 반응시킨 후 FITC가 결합된 항-IgG를 반응시켜 아가로오즈에 부착된 형광강도를 측정함으로써 IgG 표준물질을 정량적으로 분석하였으며, 그 결과를 제3도, 표2 및 제4도에 나타난 바와 같다. IgG 표준물질을 각각 100㎍/ml, 25㎍/ml, 5㎍/ml, 1㎍/ml, 0.25㎍/ml 및 0.05㎍/ml로 하여 분석하였을 때 각각의 형광강도는 표2에 나타난 바와 같으며, 형광강도의 분포도는 제3도와 같다.

표2에 나타난 형광강도는 IgG 표준물질의 농도에 대해 대응시켰을 때 제4도에 나타낸 바와같은 그래프를 얻을 수 있었다. 제4도에서 알 수 있는 바와 같이 IgG 표준물질 0.25-25㎍/ml의 범위에서 형광강도의 log 값은 직선적 상관관계를 보였다.

[실시예 4]

본 실시예에서는 인체 태반성 홀몬(human chorionic gonadotropin : HCG)의 정량법에 관해 기술한다. 항HCG 항체(anti-HCG)를 아가로오즈 비이드에 결합시킨 후, 그 비이드와 HCG 표준물질을 각각10mUnit/ml,30mUnit/ml,50mUnit/ml,100mUnit/ml, 그리고 200mUnit/ml의 농도로 혼합하고 또 다른 종류의 항-HCG,를 혼합하여 반응시켰다. 여기서 사용된 항-HCG들은 서로 방해하지 않는 것을 사용하였다. 1시간동안 상온에서 반응시킨 후 비이드를 완충액으로 세척하고 플로우 사이토미터로 아가로오즈에 부착된 형광강도를 측정하여 넣어준 HCG 표준물질의 양과 측정된 형광강도를 비교하였다. 제5도에 나타난 바와같이 HCG의 양과 형광강도 사이에는 직선적 상관관계를 보였으며, 이 직선상은 최소한 200mU/ml 까지 유효하였다.

Claims

(가) 아가로오즈 비이드(agarose bead)에 면역글로불린(Ig)의 아이소타입에 대한 측정 대상물질의 항체로서 항-IgG, 항-IgM 및 항-IgA를 결합시키는 단계, (나) 항체가 결합된 상기 비이드에 측정 대상물질을 투여하여 반응시키는 단계, (다) 반응되지 않은 IgG, IgM 및 IgA를 세척하여 제거하는 단계, (라) IgG, IgM 및 IgA에 결합할 수 있는 항-Ig를 투여하여 반응시키는 단계, (마) 반응되지 않은 투여항체를 세척, 제거하는 단계를 포함하는 생체물질에 대한 면역측정방법에 있어서, 상기 (라) 단계에서는 형광물질이 부착된 항-Ig를 사용하고, (마) 단계를 거친 비이드는 플로우 사이토미터를 사용하여 분석하는 것을 특징으로 하는 플로우 사이토미터를 이용한 면역측정 방법.
제1항에 있어서, 상기 아가로오즈 비이드(agarose bead) 대신에 폴리스티렌입자, 합성폴리머 또는 천연물질의 입자를 사용하는 것을 특징으로하는 면역측정 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 고형상 입자에 대한 면역항체 결합은 폴리스티렌 입자에 면역항체가 결합하는 물리적 흡착법과 아가로오즈 비이즈에 면역항체를 공유결합으로 결합시키는 화학적 방법으로 시행함을 특징으로하는 면역측정 방법.
제1항에 있어서, 상기 아가로오즈 비이드에 면역항체 결합은 면역항체 대신 바이러스 또는 항원성물질을 결합시켜 체액에 존재하는 항체를 측정하는 방법으로 항원성물질을 이용함을 특징으로하는 면역측정 방법.
제1항에 있어서, 상기 형광물질은 플루오르신 이소치오시아네이트(FITC)를 사용하거나 그대신에 피코에리쓰린(Phycoerythrin) 또는 텍사스 레드(texas red)를 사용하는 것을 특징으로 하는 면역측정 방법.
제1항에 또는 제5항에 있어서, 상기 형광물질의 사용은 자극 파장(excitation wavelength )이 같거나 비슷하고 방출파장(emission wavelength )이 다른 형광물질을 사용하여 2종류 이상의 생체물질을 동시에 측정할 수 있도록 이용하는 것을 특징으로 하는 면역측정 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 형광물질의 부착은 항체가 아닌 아비딘(avidin)을 이용하는 것을 특징으로 하는 면역측정 방법.
(가) 측정 대상물질에 대한 항체를 비이드에 결합시키는 단계, (나) 측정 대상물질을 반응시켜 아이소타입 조성을 측정하는 단계, (다) 항체가 결합된 상기 비이드에 서로 다른 농도의 IgG 표준물질을 투여하여 반응시키는 단계, (라) 반응되지 않은 IgG를 세척하여 제거하는 단계, (마)IgG에 결합될 수 있는 항-Ig를 투여하여 반응시키는 단계, (바) 반응되지 않은 투여항체를 세척, 제거하는 단계, 그리고 (사) IgG 물질을 정량하는 단계를 포함하는 생체물질에 대한 면역측정정량방법에 있어서, 상기 (마) 단계에서는 형광물질이 부착된 항-Ig를 사용하고, (사) 단계에서는 플로우 사이토미터로 비이드에 대하여 형광강도를 분석하고, 분석한 형광강도를 IgG 표준물질의 농도에 대응시켜 IgG 물질을 정량하는 것을 특징으로 하는 플로우 사이토미터를 이용한 면역측정 방법.