JPS6035264A - 保護結合検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は特異的結合検定の分野に関し、さらに詳しくは
非タンパク質リガンドの凝集検定における非特異性タン
パク質の干渉の克服に関する。凝集検定法は極めて高感
度であって各種の物質の測定に使用されている。この検
定法は、例えばトリヨード−し−チロニン（Ｔ３）およ
び（または）チロキシン（Ｔ４）の検出に使用されるよ
うな市販の試験用キットとして具体化されている。。

特異的結合検定技術の発達により、成体媒質中に非常に
低磯度で現れる、診断上、医療上、環境上および産業上
重装な種々の有機物質を測定する極めて有用な分析方法
が提供された。特異的結合検定法はリガンド、すなわち
測定すべき、結合し得る被分析物とこれに対する結合性
パートナ−すなわち受容体との特異的干渉に基くもので
ある。

リガンドとその結合性パートナ−とのうち−っが抗体で
あり他の一つが対応するハプテンまたは抗原である場合
はこの検定は免疫検定として知られている。

これらの特異的結合検定は、分析用素子または試験用細
片、被覆管、粒子結合試剤等を含む種々の固体状の形態
として提供されてきた。凝集検定は固体状特異的結合検
定のうち、通常免疫検定として、最も広く使用されてい
るものの一つであって、偵接、間接（受動）または阻害
型凝集検定に分類しＷる。直接凝集検定においては、特
異的結合性ペアの一つのメンバー（例えば受容体）であ
る表面成分を有する粒子を、特異的結合性ペアの他の一
つのメンバー（例えばリガンド）を分析すべき試料と反
応させる。間接（受動）凝集形態においては、特異的結
合性ペアの−っのメンバー（例えは受容体）を固体基質
粒子に結合し、この粒子に結合したメンバーを、そのベ
アのもう一方のメンバー（例えばリカンド）を分析すべ
き試料と反応させる。阻害型凝集検定においては、結合
性ベアの一つのメンバーを測定すべき試料を、先スその
結合性ベアのもう一方のメンバーを官有する材中に存在
すると考えられる結合性ベアのメンバーを含有する（直
接）がそれを結合した（間接）粒子と反応させる。凝集
検定についてはすでに文献に要約されている。例えばペ
ランティ（Ｂｅ１ｌａｎｔｉ）著、免疫学（Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ　）、　ダブリュー、ヒー、ソーンダス社（
、Ｗ、］３．５ａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏ、、　１フイラデ
ルフイア（１９７１年刊）、１３９ページ以降、および
フデンベルグ（Ｉｉ”ｕｄｅｎｂｅｒｇ　）ら、基礎及
び臨床免疫学（Ｂａ５ｉｃ　＆　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　）−ランゲ九メティヵル、パブリ
ヶーションズ、（Ｌａｎｇｅ　ＭｅｄｉｃａｌＰｕｂｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロス　アルトス、カルホルニア（
１９７６年刊）３０８ページ以降参照。また沢井ら、米
国特許第４，１１８，１９２号および４，２０８．１８
５号は凝集検定に関している。同様に凝集検定に関連の
あるより以前の文献としてはシンカー（Ｓｉｎｇｅｒ　
）ら、Ｊ、　Ｃｏ１１ｏｉｄ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｆａ
ｃｅ　５ｃｉｅｎｃｅ、　４５．６０８−６１４（１９
７３）およびファウレ（Ｆａｕｒｅ）ら、ＰｒｏＬｉｄ
ｅｓｏｆ　ｔｈｅ　１３ｉｏ１ｏｇｉｃａｌ　Ｆｌｕｉ
ｄｓ、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅＣｏｌ
ｌｏｑ＋１ｉｕｍ、　２０　、５８９−５９３　（１９
７２）がある。

特定の被分析物捷たげリガンド用の多数の凝集検定用試
験キットが市販されて居シ、丑だ文献に記載されている
。例えばローズ（Ｒｏｓｅ）　’）　（編）、臨床免疫
学マニュアル（Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃ１ｉｎｉｃａｌ
ＩＣ１１ｎｉｃａｌＩ　）、アメリカ微生物学会（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ　）ワシントンＤ、Ｃ。

（１９７８年刊）参照。

複雑な液体例えばヒト血清の分析の場合は、多種の非堝
異性蛋白質例えばりボタンバクや自己抗体か凝集反応を
阻害する。従ってりカント纏度を正確に測定するために
はこれらのタンパク質を破壊しなければならない。従前
技術においては検定と別個に１）″ｊＪ処理を行うこと
が必要であった。例えば小林らＣ５ｔｅｒｏｉｄｓ、　
３４　、８２９−８３４（１９７９）　〕は、非特異性
血清タンパク質の螢光標識ハブテン（コルチゾル）との
結合をドデシル硫酸す）　ＩＪウム（５ＬＩＳ　）によ
って排除する、血清コルチソルの直接螢光偏光免疫検定
を開示している。８１）Ｓは検定実施自ｉＪに除去され
なかった。

非タンパク質りカントの検定における非特異性タンパク
質の干渉はタンパク質分解酵素例えばペプシンを使用し
て先ずそのタンパク質を消化することによって克服する
ことができる。次いで酵素を検定前に不活性化または破
壊する。例えはコレットーカサール（Ｃｏ１１ｅｔ　−
Ｃａ、５ｓａｒｔ　）ら、ＣＣ１１ｎ。

Ｃｈｅｍ、　、　２７　、１２０５−０９（１９８１）
　〕は、ペペランで予備消化した試料中のジゴキシンの
粒子計数免疫検定（ＰＡＣＩＡ　）を開示している。消
化はペプシンを不活性化するトリス（ヒドロキシメチル
）メチルアミンの添加により停止させた。なおヂャウ（
Ｃｈａ、ｕ）ら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、、　４２．１８９−１９２（１９
７６）　ｆ：も参照のこと。

Ｔ３およびＴ４測定用のものを含め又今日１て利用し得
た凝集検定は非特異性タンパク質の干渉に悩んできた。

この干渉の原因を除去するには予備的操作を実施するこ
とが必ず必要であった。−ノーなわち、上記の文献に反
映されている努力にもが＼わらず、予備処理を必要とせ
ずにこの干渉の影響を防止し得るような特異的結合凝集
検定全提供する問題に答えた者は今寸で誰も居なかった
。

本発明によれば、非特異性タンパク質干渉の影響を予備
処理工程を必要とせずに防止ないし克服する特異的結合
検定法が提供される。すなわち今や、この干渉を克服し
かつ自動分析系に使用するのに特に適当な均一系免疫検
定の形態を提供することが可能である。

これらの利点は本発明の特異的結合性耐酵素性リガンド
検定試験材料によって達成され、本材料は（ａ）該リガ
ンドまたはその結合性類似体とそれに対する特異的結合
性タンパク質とから成る特異的結合性ペアの一方のパー
トナ−と一体化した固相、（ｂ）前記ベアの特異的結合
性タンパク質がそのパートナ−と結合する場合に前者を
酵素による不活性化から保護する物質と一体化した、前
記特異的結合性ペアの他方のパートナ−を含有して成る
複合体、および（ｃ）活性なタンパク質不活性化酵素を
含有して成る。

本発明はさらに、試料中の制酵素性リガンドの検定用で
あって、本質的に次の工程すなわち、（Ｉ）反応混合物
中において前記試料を（ａ）前記リガンドまたはその結
合性類似体とそれに対する特異的結合性タンパク質とか
ら成る特異的結合性ペアの一方のツメ−１−ナーと一体
化した固相、（ｂ）前記ペアの特異的結合性タンパク質
がそのパートナ−と結合する場合に前者を酵素による不
活性化から保護する物質と一体化した、前記特異的結合
性ペアの他方のパートナ−を含有して成る複合体、およ
び（ｃｌ活性なタンパク質不活性化酵素と結合させ、そ
して（１１）前記反応混合物中に生成する結合を検出す
る工程から成る特異的結合検定方法を提供する。

この方法を含みまたはこれを使用する種々の態様も考え
られる。例えば、前記試験利料を試験用キットの一部と
して提供することができる。このキットにこの試験材料
の構成要素をおさめた容器またはその構成要素を組込ん
だ装置１個以上の、任意の神々の物理的形態を有する組
合せセットから成っている。

本発明の好ましい態様には、粒子結合凝集検定試薬組成
物、この試験用組成物の１個以上の構成要素をそれぞれ
組込んだ容器または装置を他の構成要素または材料とセ
ットに組合せたものから成る試験キット、および本発明
の試験用組成物およびキットを使用する方法が包含され
る。以下の記述は特定の態様のみに関するものであるが
それに使用される特定の用語は特に示さない限りすべて
の態様に対して適用されるものである。

試験対象の流体には生物学的、生理学的、産業的、環境
的等の液体が包含される。特に興味があるのは生物学的
流体例えば血清、血漿、尿、脳を髄液、唾液、乳、肉汁
その他の培養基およびこれらの上清ならびに画分である
。興味のある生理学的流体の例としては輸液、緩衝液、
保存剤または抗菌液等が挙げられる。産業的流体として
は発酵媒質その他の、例えば医薬、乳製品および麦芽飲
料の製造に使用される反応工程液が挙げられる。

その他の、従来の方法によって試験される試料液の源も
この用語の意味内に含まれ、同様に本発明によって検定
することができる。

本発明の記述において「リガンド」なる用語は、タンパ
ク質不活性化酵素に作用されず、かつ例えば上記したよ
うな試料流体中におけるその存在を定性的にまたは定量
的に測定すべき任意の物質、または関連する物質の分類
を指す。本検定は、それに対する特異的結合性パートナ
−が存在する任意のかかるリガンドの検出、および逆に
、ある液体がかかるリガンドを（通常試料中のそのリガ
ンドに対する結合性パートナ−の存在によって）結合す
る能力の検出に適用することができる。リガンドは通鹿
、これに対する特異的結合性パートナ−が存在するかま
たはこれを発現させることかできる有機分子である。リ
ガンドは、機能的に云えば通常、抗原、ハプテン、ホル
モン、ビタミン、中間代謝物および薬理学的剤、ならび
にそれらの受容体および結合性物質から選ばれる。本発
明を使用して検出し得るリガントの具体例としては、ホ
ルモン例えばチロキシン（Ｔ４）およびトリョードチロ
ニン（Ｔ３）、抗原およびハプテン例えばフェリチン、
ブラジキニン、プロスタクランジンおよび１１ｆｆｉ　
ｉ特異性抗原、ビタミン例えばヒオチン、ビタミンＢ１
２　葉酸、ビタミンＥ、ビタミンＡおよびアスコルビン
酸、中間代謝物例えば３ζ５７−ゲアノシンモノホスフ
エート、薬理学的剤または医薬例エバ、ケンタマイシン
、アミカシン、シソマイシンのような抗生物質、または
乱用性医薬例えばアヘンアルカロイドおよび麦角誘導体
が挙げられる。

「特異的結合性タンパク質」または「受容体」なる用語
は、他の物質には結合せずにリガンドに対して特異的に
結合する親和力を壱する任意の物質、または物質分類を
意味する。本発明の具体的態様の多くにおいては、試料
中のりガントまたはその結合能力と互いに免疫化学的に
作用する特異的結合検定試薬が組入れられている。すな
わち試薬および（またｌ′ｉ）試料中のりガントまたは
その結合能力との間には抗原−抗体またはハプテン−抗
体の関係がある。従ってかがる検定は免疫検定と名づけ
られ、リガンドとその受容体または結合性パートナ−と
の間の特殊な相互作用は免疫化学的結合である。ポリク
ローナルの、またはモノクローナルの抗体のいずれかの
使用が考えられる。

さらに、リガンドと結合性パートナ−との間のその他の
相互結合作用、例えばホルモン、ビタミン、中間代謝物
および薬理学的剤とそれらのそれぞれの受容体および結
合性物質との間の相互結合作用が特異的結合検定法の基
礎として役立つことは、当業界においてよく理解し得る
ところである。例えば結合性剤またはパートナ−として
のポリペプチドホルモン受容体についてはランガン（Ｌ
ａｎｇａｎ）ら（編）、リガンドアッセイ（Ｌｉｇａｎ
ｄ　Ａｓ５ａｙ　）、マラソンパブリッシング（Ｍａｓ
ｓｏｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　）ＵＳＡ社、ニューヨ
ーク、２１１ページ以降（１９８１年刊）に論じられて
いる。

本発明における［活性なタンパク質不活性化酵素、」と
は、タンパク質（通常生体内起源のタンパク質）に特異
的結合凝集検定反応に対する非特異性干渉効果を生じさ
せるその化学的または生物学的性質を無効にするに有効
な任意の酵素のことである。これらの干渉効果の減少ま
たは排除にががる酵素を使用することは、実際の検定操
作とは別に試料の予備処理においてすでに既裁されてい
る。

それに記載された、または実質的に同様の効果を有する
任意の酵素を使用することができる。例としては先ずタ
ンパク質分解酵素例えばトリプシン、ペプシン、キモト
リプシン、カルボキシペプチターゼ、およびプロテアー
ゼ混合物例えばプロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ　）混合酵
素剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ社、Ｌａ
　Ｊｏｌｌａ、カルホルニア）が挙げられる。

かかるタンパク質不活性化酵素はベルルマンおよびロラ
ンド（Ｐｅｒｌｍａｎｎ　＆　Ｌｏｒａｎｄ　）　（編
）、酵素学の方法−タンパク質分解酵素（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎ−ｚｙｍｏｌｏｇｙ　−Ｐｒｏｔｅｏｌ
ｙｔｉｃ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　）　、１９巻、Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ　、ニューヨーク（１９７０年刊）
に詳細に論じられている。

本発明における「固体状（態）」または「同相」は種々
の形状をとることができ、従って広い意味を表わすもの
である。これは、類似のまたは異なる吸収特注その他の
物理的特性を有する一種以上の適当な月料または媒質を
含有して成る単相または多相のものであってよく、疎水
性でも親水性でも、また吸水性でも非多孔質でもよい。

最も効果的は態様においては、固相は使用すべき特定の
特異的結合検定系の特性に適合するよう注意深く調製さ
れる。

一つの態様においては固相は特異的結合検定試剤と一体
化し得るマトリックスまたは表面である。

その形状は化学的および酵素的溶液分析に使用する如き
抽々の公知のものであってよい。固相試験装置は特異的
結合検定に使用されてきた。よく使用される固相装置は
非多孔質表面ｆｌｌえば試験管その他の容器の内部表面
に吸着または共有結合によって抗体を伺加または被覆し
たものである。同様に、抗体試薬を流通カラム内に保持
されたマトリックスに固定した特異的結合検定用の装置
が知られている（米国特許第４　、０３６　、９４−７
号明細書、４，０３９　、６５２号明細書、４　、０５
９　、６８４号明細書、４，１５３゜６７５号明細書、
および４，１６６．１０２号明細書）。

米国特許第３，８２６，６１９号明細書、４，００１，
５８３号明細書、４　、０１７　、５９７号明細書およ
び４，１０５．４１０号明細刊−は抗体で被覆した試験
管の放射免疫検定への使用に関している。同相試験装置
はまた酵素免疫検定（米国特許；Ｍ’　４，０１６，０
４３号明細書および４．１４７，７５２号明細書）およ
び螢光免疫検定（米国特許第４，０２５，３１０号明細
書および４，０５６，７２４号明細１、英国特許明細書
オ１．，５５２，３７４号明細書）に使用されている。

かかる不均一系特異的結合検定試験装置の使用の好例は
米国特許第４，１３５，８８４号明細書に示されている
。試験装置は抗体試薬と一体化されて、液体試料および
反応系の残りの試薬と接触させられる。インキュベーシ
ョン期間後、固相装置を物理的に反応液から取去り、溶
液内または試験装置上の標識を測定する。好ましい一態
様においては、この素子はポリスチレンのような材料で
、少くとも１個の反応用くぼみを通常その中央部に有す
るように成形された試験用スライドの形であってよい。

このくほみは通常直径が約１．０ないし約２．５ｃｎ＋
、深さが約１．０ないし約１０ｍｍ、好ましくは約２な
いし約６　ｍｍである。

最も好ましい固相の形態は粒子である。先に述べた通り
、粒子結合凝集検定には、特異的結合性ペアのメンバー
を表面成分として有する粒子または、かかる成分があら
かじめ結合された基質粒イさは好ましくは直径約０．１
ないし約５．０ミクロンで、バクテリア基質粒子の直径
は通常約１ないし約３ミクロンである。特異的結合性ペ
アメンバーの担体として使用されてきた基質粒子の例と
しては真核生物赤血球（未変化のまたは褐色化したもの
）、シリカ質粘土（例えばベントナイト）、ラテックス
および原核生物性粒子（例えばバクテリア細胞）が挙げ
られる。いわゆるラテックス粒子は通常合成ポリマー材
料例えばポリスチレンから成っている。その他の適当な
有機ポリマーとしてはブタジェン、スチレン−ブタジェ
ンコポリマー、アクリルポリマーまたはこれらの混合物
が挙げられる。原核生物粒子例えはバクテリアまたは菌
類の細胞またはビルス粒子も凝集検定における基質粒子
として広く使用されてきた。基質粒子として使用される
バクテリアにはぶどう状球菌属のもの、特に黄色ぶどう
状球菌（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ　）が含まれる。

例えば黄色ぶどう状球菌〔コヮン（Ｃｏｗａｎ）　Ｉ型
〕はその細胞壁表面から延びているＡタンパク質分子を
介して結合性パートナ−と結合された。

多くの有機分子は非共有結合的吸着により容易にかかる
基質粒子に付着する。例えば赤血球は多くの多糖類を容
易に吸着する。また、コワンＩ型黄色ぶどう状球菌中の
Ａタンパク質はある種の免疫グロブリンのＦｃ座に特異
的に結合する。　しかしタンパク質をイ」着させるため
には通常先ず粒子を処理するか、タンパク質を例えば結
合原子団を介して共有結合させることが必要である。現
在捷でに使用された結合原子団の例としてはビスジアゾ
ベンジジン、グルタルアルデヒドおよび１，３−ジフル
オロ−４，６−シニトロベンゼンがある。その他のもの
はフデンベルグ（Ｆｕｄｅｎｂｅｒｇ）ら（編）、基礎
および臨床免疫学（Ｂａ５ｉｃ　＆　Ｃ１１ｎｉｃａｌ
　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）ランゲメジ力ルパブリケーシ
ョンズ、ロスアルトス、カリホルニア、３１０ページ（
１９７６年刊）に論じられている。

特異的結合性ペアの特異的結合性タンパク質がそのパー
トナ−と結合する場合に「前者を酵素による不活性化か
ら保護する物質」とは、それ自体はタンパク質不活性化
酵素の作用を受けず、かつ金属封鎖、偽装好ましくは結
合等によって特異的結合性タンパク質と結びついてこれ
をタンパク質不活性化酵素に作用されないようにするこ
とのできる任意の天然または合成の分子を意味する。こ
の目的に使用し得る物質の例としては結合性タンパク質
と結合した場合これを酵素の攻撃から立体的に保護する
大型分子が挙げられる。かかる大型分子の適当な例とし
てはテキストランまたはフィニル（Ｆｉｃｏｌｌ　）　
（ファルマシアファインケミカルズ社（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、）　
、ニューマーケット、ニュージャーシイ〕（エビクロロ
ヒドリンとスクロースとの反応によるポリマー性生成物
）の如き高分子量ポリマーが挙げられる。

本発明の試験材料には、ペアの一方の特異的結合性タン
パク質がそのパートナ−と結合する場合に前者を酵素の
不活性化作用から保護する物質と一体化した、特異的結
合性タンパク質がリガントかのいずれであるにせよ、固
相に結びついた種に対する結合性パートナ−を含有して
成る複合体が含まれる。この複合体は、その含有する結
合性パートナ−の特異性を害したり変化させたシしない
ような慣用の有機合成技法を使用して形成される。

本発明は次の機構を論拠としなければならぬものではな
いが、凝集結合性タンパク質保護において予期しなかっ
た成果が達成されたことに対する説明として少くとも一
つの機構を述べることができる。すべての場合に、リガ
ンドまたはその結合性類似体とそれに対する特異的結合
性タンパク質とから成る特異的結合性ペアの一方のパー
トナ−と一体化された同相が存在する。こ＼に提出する
機構においては、複合体は前記特異的結合性ペアの一力
のパートナ−を含有して成り、（このパートナ−はある
結合活性を有し、かつある濃度で存在し、両者合せであ
る之・−の結合速度を与える）、このパートナ−は前記
ベアの特異的結合性タンパク質がそのパートナ−と結合
する場合にタンパク質を酵素による不活性化から保護す
る物質と一体化しており、また活性なタンパク質不活性
化酵素はある結合活性を有しかつある濃度で存在し、両
度を与える。

この機構およびその他の可能な機構に従えば、特異的結
合性タンパク質例えば抗体の反応混合物中における濃度
は約帆０４％（Ｗ／Ｖ）以上、好ましくは約帆０４％（
Ｗ／Ｖ）ないし約０．０７％（Ｗ／Ｖ）である。同様に
、タンパク質不活性化酵素の濃度は約４．０”１ｇ／−
以下、好ましくは約２．０ないし約４　、０　’Ｗ／ｍ
ｌ　である。この−例は、（ａ）粒子に結合したチロキ
シンまたはトリョードチロニン抗体ｔｍ度約帆０４ない
し約１０７％（Ｗ／Ｖ）、（ｂ）トリプシンを濃度約２
．０ないし約４．０〃ｌＷ／ゴ、そして（Ｃ）上記した
ような複合体を濃度約０．２２ないし約ｏ、８８μｆ／
／ｍｌ含有する特異的結合検定用組成物または拐ネ」で
ある。

以下の実施例は本発明の開発に当って実施した実験を記
載するものである。可能な場合は常に、標準的な市販試
薬級薬品を使用した。

例　１ 全血清チロキシン（Ｔ４）の１ｌｌｌｌ定は甲状腺機能
測定のための唯一の最も重要な試験である。正常なＴ４
　の範囲は４．５−１２．０μｔ７ａｔであるが、　試
験では１　、０７１　？／ｄｔの低濃度から２４．０μ
？／ｃｌｔの高濃度まで測定可能でなければならない。

これは甲状腺障害を有する患者を正確に識別するために
必要である。本例は、本発明による非同位元素的均−系
免疫検定を説明する実験について報告する。

抗血清製造 Ｔに対する抗体は、ニューシーラントウサギに、等容量
のフロイントの見金補助液中に乳化したウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）に′１４ｆ：共有結合的に結合した複合
体４００μ７を皮肉にオー次注射を行って誘発させた。

オニ次増強免疫は、等容量のフロインド不完全補助液中
に乳化したＴ４−　ＢＳＡ複合体４００μ７　を１月に
１回投与して行った。動物は週に３回採血した。

抗体ｌｈ製 Ｔ４に対して特異性の抗体を免疫吸着によって単離した
。免疫吸着剤はセファロース４Ｂ（ファルマシアファイ
ンケミカルズ社、ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　、ニューシャ
ーシー）に共有結合的に結合したＴ４　から成る。この
拐料はサンドバークおよびポラス（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ　
ａｎｄ　Ｐｏｒａｔｈ　）がＪ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ、
、９０゜８７−９８　（１９７４）に記載したビスオキ
シラン法によって製造した。免疫吸着剤５ｍ７！を、２
×２０ｃｔｎのカラス製クロマトカラム中のセファデッ
クスＧ−２５（ファルマシア社、上記）２５ｍ７！の上
に充填した。

前記のように製造した抗血清５−をカラムに加え、その
赤色または琥珀色が免疫吸着剤とセファテックスの境界
に達するまで流入させたのち、抗血清をさらに３０分間
室温で引続き吸着剤と接触させた。次に免疫吸着剤をカ
ラム容量の２倍量のバルビタール緩衝食塩水（バルビツ
ール０　、０５Ｍ　、　ＮａＣｔＯ，１５Ｍ　、　Ｎａ
Ｎ３０．１　％　、ｐＨ８，６）で洗浄、次で流出液の
２８０ナノメートル（ｎ、、、）における吸光度を０．
０１以下とするに十分な量のホウ酸塩緩衝食塩水（ホウ
酸塩０−０４Ｍ　、Ｎａ（−１０，１５Ｍ　１ＮａＮ３
０−１％、ｐＨ８，１）で洗浄した。次に、吸着された
抗体を１．０Ｍ酢酸溶液で溶離した。溶出液をフラクシ
ョンコレフターによりＪｒｎｌずつのアリコートとして
採取した。２８０ｎｍにおける吸光度が０．１より犬き
く　ｐＨ７，０より大きい両分を合一し、使用する迄−
２０℃で貯蔵した。１−の抗血清から通常１−２　ｙｒ
ｙの精製抗体が単離された。

抗体感作ラテックスの製造 上記の精製抗体を、マラソン（Ｍａｓｓｏｎ）らの方法
［Ｍ、ｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、
　７９　、１０６−１３９（１９８１）：］の変形法に
よってクロロメチルスチレンラテ゛ンクスに結合した。

前記抗体を使用しマラソンらの方法（同上）と全く同じ
方法により製造することもできる。

Ｔ４　？ｉ：ミニ臭化シアン性化したフィニル４００（
ファルマシア社、前出）に共有結合的に結合した。

フィニル１００Ｉｌ？を０．４　Ｍ　Ｋ２ＣＯ３溶液６
ゴに溶解しｐＨを１１．０に調節した。溶液を急速にか
きまぜ、臭化シアン溶液（Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド中３３３　”Ｗ　／　ｍｌ　）　５０μｔを３回添加
した。フイコル溶液のｐＩ（ば２Ｎ　ＮａＯＨ溶液を添
加して１１．０に保った。

内に行い、最終添加後浴液を４分間インキュベートした
。次に２　ＮＩ（ｃｔによってｐＨを１０．０とし、Ｔ
４溶液（Ｊ、５ｍ１．を加えた（　０−４　Ｍ　Ｋ２Ｃ
Ｏ３１１−１５滴によってアルカリ性としたＮ、Ｎ−ジ
メチルホルムアミド中ｓｏ　ｒｔｌｙ　／　ｍｌ　）。

反応混合物を室温で２時間かきまぜた後０．０１　Ｍ　
Ｎａ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ９，０）により徹底的に透析
した。通常、ソイコル１モル当りＴ４６０−７０モルが
結合された。

Ｔｉミニ−（−ぞ−少一更一含一体−／側−シー１−ビ
ービー氏夢−挟虜一前記により製造したＴ４−フイコル
複合体、ポリエチレングリコール８０００　［ジエー、
ティー、ベーカーケミカル社（Ｊ、　’ｆ’、　Ｂａｋ
ｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）。

ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ニュージャーシイ〕、トウ
イー７（’ｒｗｅｅｎ）−２０［テクニコンインストル
メンツ社（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ　Ｃｏｒｐ、）、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ。

ニュージャージ、〕、ＣａＣＡ２、およびウシｉ−Ｉ＊
トリプシン〔シグマケミカル社（Ｓｉｇｒｎａ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）。

Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、ミズリー〕をバルビタール緩衝共
塩水（ｐＩ−Ｉ　８．６）中に最終濃度がそれぞれ１．
２μｆ／ｍｌ、３．７６　％　（Ｗ／Ｖ）、ｏ、ｕ％　
（Ｖ／Ｖ）、１爾および７．３”Ｖ　／　＋ｎｌ　Ｋな
るように混合した。

前記の如く製造した抗体感作ラテックス、８−アニリツ
ー１−ナフタレンスルホン酸〔イーストマンコダック社
（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ、）、Ｒｏｃｈｅ
ｓｔｅｒ。

ニューヨーク〕、トウイーン−２０およびフィニル４０
０を、炭酸塩０．３５　Ｍ、バルビタール帆０１５Ｍ。

塩化すトリウム０．１５　Ｍおよび窒化ナトリウム０．
１係から成る緩衝液（ｐＨ９，７）中、最終濃度が仇ぞ
れ０．１７係（Ｗ／Ｖ）、０．１０３　”較１．０．１
１％（Ｖ／Ｖ　）、および０．８６　ｉｎＷ　／　ｍｌ
となるように混合した。

参考法 参考法は固相被覆管ガンマコー）　（Ｇａｍｍａ　Ｃｏ
ａ、ｔ）（登録商標）放射免疫検定（ＲＩＡ　）　（ク
リニカルアツセイズ（Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ａｓ５ａｙｓ
　）、トラベノールラボラトリーズ社（Ｔｒａｖｅｎｏ
ｌ　Ｉ、ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）の−事業部、Ｃａ
ｍｂｒｉｄｇｅ　、マサチュセツツ〕で、製造業者の指
示に従って使用した。

本発明の検定は分光光度計または自動臨床化学分析器を
使用して行うことができる。ここに報告する結果の大部
分にはテクニコン（Ｔｅｃｈｎ　１ｃｏｎ）ＲＡ−１０
ＧＯ（登録商標）装置系を使用した。下記の各実験にお
いて検定は２６μｔの試験血清、対照または標準を１７
５μｔのＴ４−ソイコル／トリプシン試薬に添加して開
始しブζ。次で反応混合物を３７℃で２分間インキュベ
ートした後、抗体感作ラテックス試薬１７５μを添加し
た。全反応混合物をさらに」分間インキュベートした後
、６００ｎｍにおける吸光度を１５秒おきに２分間記録
した。吸光度変化速度を吸光度と時間のデータから最小
自乗法によってめた。この直線の傾斜は試験試料中のＴ
４濃度に反比例した。データのログーロジット変換によ
って直線状標準曲線を得、これを下記のように未知試料
の分析に使用した。

オ一段階として、Ｔ４−フィニルによる結合抗体の保護
を実証した。抗体感作ラテックス試薬、１゛４−フイコ
ル／トリプシン試薬および血清をヘースとするＴ４　を
含まぬ標準品を帆５筋の石英キュベット中で混合した。

キュベツトをベックマンＤＵ−８分光光度引〔ベツクマ
ンインスツルメンツ社（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、　）、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ　。

カルホルニア〕内に置き、６００ｎｍ　Ｋおける吸光度
を時間の関数として測定した。凝集速度はフアツジ（ｐ
ａｕｒｅ　）ら［Ｐｒｏｔｉｄｅｓ　ｏｆ　ｔｈ４　Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌＦｌｕｉｄｓ、　２０　、５８９−
５９３（１９７２）　〕およびシンカー（Ｓｉｎｇｅｔ
）ら〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏ１１ｏｉｄ　ａｎｄ
　ＩｎｔｅｒｆａｃｅＳｃｉｅｎｃｅ、　４５．６０８
−６１４（１９７３）　：ｌが述べた通ｐ光学濃度の変
化速度に正比例する。第１図のデータは光学濃度が急速
に増加した後約１０分間のインキュベーションの後半に
な９始めることを示す。これらの粒子は一夜インキュベ
ーション後もなお凝集したままであった。

次にヒト血清１０３個を、テクニコンＲＡ−１０００装
置系で自動化した本発明の方法、および先に記したＲＩ
Ａ参考法によって分析し、三方法による結果の相関の程
度をめた。データを第２図に示す。

相関データを直交線型回帰法によって解析した結果をま
とめて下に示す。

チロキシン保護結合検定とＲＩＡとの相関Ｎ　ＸＹ＊　
Ｙ平均　０８　Ｙ９＋片　Ｖ２Ｏ３９，３ｇ／ｄ７８．
６ｕｙ／ｄｔ０．９６　−０．２６ｕｐａ！　０．９４
これと比較のため、反応混合物中にトリプシンを加えぬ
以外は本発明について前記したと同様にして、ヒト血清
２１個を分析した。データを第３図に示し、まとめた結
果を下に示す。

２１　７．８ｕ３’ｄ７１６．２ｕｆ／ｃｌ／Ｓ　２．
０８　０．０２ｕｐｃＬ／：　０．８２結論 第１図の結果は特異的抗体−ラテックス／Ｔ４−フイコ
ル凝集が高濃度のトリプシンの存在においても生成し持
続することを示している。この観察に対する可能な一つ
の説明は、Ｔ４−フィニルと抗体−ラテックスの組合せ
がタンパク質分解醇素の接近を立体的に障害し、酵素が
抗体を分解するのを防止するということである。

タンパク質分解酵素例えばトリプシンを反応混合物に加
えることによってもたらされた改善効果は第２図と第３
図との差から証明される。第３図に示すように、トリプ
シン不在の場合はラテックス免疫検定法によって得られ
る値の約２倍であった。これは非特異的血清干渉による
もので、血清試料に誤って高い測定値を与えられる結果
となった。この非特異的干渉は第２図に示す通９トリプ
シンによって破壊され、この結果トリプシンの存在での
ラテックス免疫検定と参考法との優れた相関性が得られ
る。

例２ Ｔ４　保護結合検定法におけるＴ４　−デキストランの
使用 ここに報告する実験はＴ４　−デキストランの使用とＴ
４　−フイコル複合体の使用とを比較するものである。

抗血清製造、抗体精製、抗体感作ラテックスおよび抗体
感作ラテックス試薬の製造、Ｔ４−フイコル複合体およ
びＴ４−ソイコル複合体／トリプシン試薬の製造、およ
び分析操作は例１に述べたのと同一である。

Ｔ４−デキストラン複合体製造 例１においてＴ４−フィニルについて述べたと全く同様
の操作によってＴ４　を臭化シアン活性化テキストラン
Ｔ　５００　（ファルマシア社、前出）と共有結合的に
結合させた。

′Ｌ′タニｊ寸−子−ｊ−５−７−讐−會一快一４−Ｖ
リプシン試薬製造Ｔ４−デキストラン、ポリエチレング
リコール８０００、トウィーン−２０、ＣａＣｔ２、お
よびウシ膵臓トリプシンを最終濃度がそれぞれ１．０μ
？／ｍｔ、３．７６％（Ｗ／Ｖ）、０．１１　％　（Ｖ
／Ｖ）、１＋ｎＭおよび７．３〃り／　ｍｌとなるよう
に混合した。旧材はすべてバルビタール緩衝食塩水（ｐ
Ｈ８，６）に溶解した。

検定操作および結果 Ｔ４標準曲線はテクニコンＩ（Ａ−１０００装置系を使
用し、Ｔ４−フィニルがＴ−デキストランかのいずれか
を用いてめた。第４図のデータは、とのＴ４結合保護ラ
テックス免疫検定に対してＴ４−フィニルとＴ４−デキ
ストランのいずれもが「保護剤」として機能することを
示す。Ｔ４−フィニルの場合の方がＴ４−テキストラン
よりも大きな信号変化が認められたが、Ｔ４−デキスト
ランで得られる信号はポリエチレングリコール濃度を増
すことにより増大する。

結論 Ｔ４−デキストランおよびＴ４−フィニルの両者とも抗
原保護ラテックス免疫検定において機能して適尚な服量
反応曲線を生ずる。高分子量の非タンパク質分子はこの
目的に有効な部類の材料である。

例３ Ｔ４保保護金検定法におけるキモトリプシンの使用ここ
に報告する実験はタンパク質分解酵素としてのキモトリ
プシンの使用をトリプシンの使用と比較するものである
。抗血清製造、抗体精製、抗体感作ラテックスと抗体感
作ラテックス試薬との製造、Ｔ４−フィニル複合体と一
−フィコル複合体／トリプシン試薬との製造、および分
析操作は例１に記したものと同一であった。

′Ｅ生ニー乙乱ゴ！−！−含−−４十−言一層？−看ビ
ーこ醪−誓一！ゼエ埠この試薬は、ウシ膵臓２−キモト
リプシン（シグマケミカル社、前出）を試薬中に最終嬢
度７．３−フイコル複合体／トリプシン試薬について記
したと全く同様にして製造した。

ヒト血清２１個をテクニコンＲＡ−１０００装置系を使
用し、トリプシンがキモトリプシンかのいずれかの存在
において抗原保護ラテックス免疫検定法により分析した
。データを第５図に分散プロットとして示し、次の通り
直交線型回帰法によｐ解析した。

２１　１１、坊凶Ａ　１３．１ｕ建　１．０２　１．７
２ｕシ披　ｏ、９９結論 キモトリプシンは本発明の保護結合検定においてトリプ
シンの代りに使用し得る。反応混合物中にトリプシンま
たはキモトリプシンのいずれが含まれる場合も第５図に
示す通シ同等の結果が得らレタ。Ｔ４−フィニルは結合
抗体をキモトリプシンのタンパク質分解作用から保護し
たが、キモトリプシンは血清タンパク質を消化してラテ
ックス粒子との非特異的干渉が除かれ正しい１値が得ら
れるように作用した。

例４ Ｔ４保保護金検定法におけるプロナーゼの使用ここＶこ
報告する実験はプロナーゼ〔８級、カルビオケムーベー
リング社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−ＢｅｈｒｉｎｇＣｏ
ｒｐ、）、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ　、カリホルニア〕タンパ
ク質分解酵素混合物の使用をトリプシンの使用と比較す
るものである。抗血清製造、抗体精製、抗体感作ラテッ
クスと抗体感作ラテックス試薬との製造、Ｔ４−フィニ
ル複合体とＴ４−フィニル複合体／トリプシン試薬との
製造、および分析操作は例１に記したものと同一である
。

この試薬は、プロナーゼを試薬中に最終濃度７．３〃１
７　／　Ｈｅ加えた以外は′１゛４１゛４−フィニル複
トリプシン試薬について例１に記したと全く同様にして
製造した。

ヒト血清２１個をテクニコンＲＡ−［１００装置系を使
用し、トリプシンまたはプロナーゼのいずれかの存在に
おいて抗原保護ラテックス免疫検定により分析した。デ
ータを第６図に今散プロットとして示し、直交線型回帰
法により次の通り解析した。

２１　１１．２ｕＶｄｔ１１．６ｕｖｄｔ１．０２　０
．０７ｕＭａ／、０．９５結論 プロナーゼは本発明の保護結合検定においてトリプシン
の代りに使用し得る。本検定にトリプシンかプロナーゼ
かのいずれを使用した場合も第６図に示す通り同等の結
果が得られた。両酵素ともほぼ同しＴ４平均値すなわち
トリプシンの場合１１．２μｙ／ｄｔ、プロナーゼの場
合１１．６μｙ／ｄｔを与え、相関プロットの傾斜は１
，０２であった。反応混合物中のＴ４−フィニルはトリ
プシンによるタンパク質分解作用から抗体を保護したが
、′Ｘ４測定に干渉するタンパク質を破壊した。

例　５ テオフィリン保護結合検定法 テオフィリン（１，３−ジメチルキサンチン）は気管支
喘息の治療にひろく使用される。この薬は治療範囲が１
０−２０μ９／ｍｌと狭く２０μｆ／ｍ１以上の濃度で
は重責のことがあるため、血清中の濃度を綿密に監視し
なければならない。以下に報告する実験は本発明の抗原
保護ラテックス免疫検定法が血清中のテオフィリン濃度
を正確に定量するのに使用し得ることを実証するもので
ある。

抗血清製造 ウザギ抗テオフィリン抗血清はカレスタド（Ｋａ−ＩＬ
ｅｓｔａｄ）、（Ａｕｓｔｉｎ、テキサス）から購入し
た。

抗体精製 抗体は硫酸アンモニウム沈殿法によって単離した。抗血
清はあらかじめｐＨ８に調節した飽和硫酸アンモニラ溶
液と等容量に混合した。溶液を４℃で２時間かきまぜた
後沈殿した抗体を遠心分離によシ単頗ｒした。沈殿物は
元の抗血清の容積と等容の、ｐｌ（８，０の５０％飽和
硫酸アンモニウム溶液で２回洗浄した。次に沈殿を元の
抗血清の容積と等た。次にこの抗体溶液をホウ酸塩緩衝
食塩水（ｐＨ８，１）により十分に透析し、遠心分離に
よって清澄化した。単離した抗体は使用する１で一２０
゛Ｃで貯蔵した。

抗体感作ラテックス製造 前記の精製抗体をマラソン（Ｍａｓｓｏｎ　）らの方法
ＣＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ユ４
　、１０６−１３９（１９８１））を変形した方法によ
りクロロメチルスチレンラテックスに結合した。前記抗
体を使用してマラソンら（同上）と全く同じ方法により
製造することもできる。

８−Ｅカルボキシプロピルテオフィリンの合成８−Ｅカ
ルボキシプロピルテオフィリンはタック（Ｃｏｏｋ）ら
〔Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　
ｉｎ　ＣｈｅｍｉｃａｌＰａｔｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　
Ｐｈａｒｍａ、ｃｏｌｏｇｙ　、　１３　、４９７−５
０５（１９７６）　）の方法と全く同様にして合成した
。

Ｎ−（２−アミノエチル）カルバミルメチル化フイコル
の合成Ｎ−（２−アミノエチル）カルバミルメチル化フ
イコル（ＡＥＣＭ−フィニル）はインマン（Ｉｎｍａｎ
）らの方法（Ｊ、　■ｍｍｕｎｏ１．世、７０４−７０
９（１９７５）　〕と全く同様にして合成した。

テオフイリンーフイコル゛複合体製造 ８−Ｅカルボキシプロピルテオフィリンをカルボジイミ
ドカップリング法を使用してＡＥＣＭ−フィニルに結合
した。１−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−３−エ
チルカルボジイミドヒドロクロリド〔アルドリツヒケミ
カル社（Ａｌｄｒｉｃｈ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、）、
Ｍｅｔｕｃｈｅｎ　、ニュージャーシイ）２３”Ｉｆ／
をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド１ｍ７！に溶解したｌ
Ｑ　ｕｑの８−Ｅ−カルボキシプロピル−テオフィリン
に加えた。溶液を室温で４０分間放置活性化した後、こ
の溶液３２０μｔを、０．１Ｍ炭酸塩緩術液（ｐｉ（６
，３）に溶解したＡＥＣＭ−フィニルの１０η／−溶液
０．５−に加え、反応混合物を４℃で１夜インキユベー
トした。過剰の試薬は帆ＩＭ酢酸すｌ−ＩＪウム緩衝液
（ｐｌ■４．５）　２　ｔ、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐＪ１９．５　）　２　ｔ、ホウ酸塩緩衝食塩水
（ｐＨ８，１）２ｔ、さらに新しいホウ酸塩緩衝食塩水
（ｐＨ８，１）２ｔにより逐次透析して除去した。ＡＥ
ＣＩＶＩ−ソイコル１モル当り６０ないし７０モルのテ
オフィリンが結合した。

テオフィリン−ソイコル複合体／トリプシン試薬製造 前記のようにして製造したテオフイリンーフイコル複合
体、トウィーン２０、ＣａＣ１□およびウシ膵臓トリプ
シンをポウ酸塩緩衝食塩水（ｐｌ■８．１）中に最終濃
度がそれぞれ１．２５１ｔｆ／ｍｌ、０．１係＜ｖ、’
ｖ＞、１ｍＭおよび６〜／　ｍｌ　Ｋなるように混合し
た０、抗体感作ラテックス試薬製造 前記のようにした製造した抗体感作ラテックスとトウイ
ーン−２０とをウシ血清アルブミン帆１係（Ｗ／Ｖ）を
含むホウ酸塩緩衝食塩水（ｐＨ８，１）中で混合した。

抗体感作ラテックスの最終濃度は０．１２％（Ｗ／Ｖ）
でトウイージー２０は０　、１係（Ｗ／Ｖ）であった。

参考法 参考法をエミトアード（Ｅｍｉ　ｔ−ａａｄ　）テオフ
ィリン検定〔シバ（Ｓｙｖａ）（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ　
、カリポルニア）〕で、製造業者の指示に従って使用し
た。

検定操作および結果 本発明の検定は分光光度計か自動臨床化学分析器かを使
用して実施することができる。ここに報告する結果には
すべてテクニコンＲＡ−１０００（Ｒ録商標）装置系を
使用した。検定は２μｔの試験血清、対照または標準を
２００μｔの抗体感作ラテックス試薬に添加して開始し
た。次に反応混合物を３７℃で１５秒間インキュベート
した後テオフィリン−ソイコル／トリプシン試薬２００
μｔを加えた。全反応混合物を３７℃でさらに３０秒間
インキュベートした後、６００ｎｍにおける吸光度を１
５秒おきに２分間記録した。吸光度の変化速度は吸光度
対時間のデータから最小自乗法によってめた。この傾斜
は試験試料中のテオフィリン濃度に反比例した。データ
をログーロジット変換して直線状標準曲線を得、これを
未知試料の分析に使用した。

テオフィリンによる治療を行っている患者からヒト血清
８１個を得た。これらの血清をカレスタドポリクローナ
ル抗体を使用する本発明の方法およびシバエミト参考法
によって分析し、二つの方に示す。相関データを直交線
型回帰法によって解析して下記に示す。

８１　１０．６ｕｆｉ／Ｆｎ／＝　１１．５ｕ稈１．０
９　−０．０６ｕ’／／ｒｒ＜　０．９９結論 相関データはテオフィリン保護結合検定法と参考法とが
極めてよく一致することを示す。本発明の方法によって
得られる平均値１１．５μｆｌ／ｍｌ　は参考法による
平均値１０．６μｆ／ｍＡとほとんど等しい。

分散プロットの傾斜は１に近く、切片は無視し得る程小
さく、相関係数は０．９９であった。これらはすべて、
本方法゛が参考法と同等の結果を与えることを示してい
る。

例６ モノクロナール抗体を使用するテオフィリン保護結合検
定 ここに報告する実験は、テオフィリン保護結合検定にお
けるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の比較を
行うものである。すべての材料、製造および操作は例５
に記したと同一で、このほかモノクローナルのマウス抗
テオフィリンもカレスタド（Ａｕ５ｔｉｎ　、テキサス
）から購入した。

結果 ポリクローナルおよびモノクローナル抗体について得た
収量反応曲線を第８図に示す。二種の抗体は本発明の検
定に使用する場合類似の動的範囲および感度を示す。

結論 ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は本発明の検
定に使用し得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、例１の実験で述べた吸光度の時間的変化に基
く、本発明の保護結合検定法（ＰＢＡ）により達成され
る、凝集複合体における特異的結合性タンパク質の保護
を説明するグラフである。 第２図は例１の実験に基く、本発明のＴ４保保護台検定
法と参考法の放射免疫検定法との相関の分散プロットで
ある。 第３図はやけ９例１の実験に基く、トリプシンを含まぬ
従来のＴ４　凝集検定法と参考法の放射免疫検定法との
相関の分散プロットである。　−第４図は例２の実験に
基く、Ｔ４−フィコル捷たはＴ４−デキストラン複合体
のいずれかを組込んだ本発明の保護結合検定法を使用す
る種々のＴ４濃度における吸光度を示すグラフである。 第５図は例３の実験に基く、本発明のＴ４　保護結合検
定法において唯一の相異点としてトリプシンかキモトリ
プシンかのいずれがを使用した場合の間の相関の分散プ
ロットである。 第６図は例４の実験に基く、本発明のＴ４　保護結合検
定法において唯一の相異点として１．　ＩＪプシンかプ
ロナーゼがのいずれがを使用した場合の間の相関の分散
プロットである。 オフ図は例５の実験に基く、本発明のテオフィリン保護
結合検定法と参考法との相関の分散プロットである。 第８図は例６の実験に基く、ポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体のいずれがを結合した本発明の保護結合
検定法を使用する、種々のテオフィリン濃度における吸
光度を示すグラフである。 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、１ ＦｊＧ、２ ＲＩＡ−７４（ｕｇ／ｄｌｌ ＦＩＧ、３ ＲＩＡ−７４（ｕｇ／ｄｌｌ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ ＰＢＡ　−７４１ｕｇ／ｄｌｌ ＦＩＧ、６ ＰＢＡ　−Ｔ４　ｔｕｇ／ｄｌｌ ＦＩＧ、７ −ａａｄ　ｉｕｇ／ｍｌｌ 手続補正書（方式） 昭和５９年８月１０日 特許庁　長　官　殿 １、事件の表示　昭和５９年特許願第８４１７０号３　
補正をする者　事件との関係　特許出願人テクニコン、
インストルメンツ、コーポレーション４　代　理　人　
東京都港区赤坂１丁目１番１４号・溜池合意ビル８、補
正の内容　別紙のとおり

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　試料中の耐酵素性リガンド（配位子）の測定用
   であって、 （ａ＋　前記リガンドまたはその結合性類似体とこれに
   対する特異的結合性タンパク質とから成る特異的結合性
   ペア（対）の一方のパートナ−（相手）と一体化した固
   相、 （ｂ）　１）ｉｌ　Ａｅペアの特異的結合性タンパク質
   がそのパートナ−と結合する場合に前者を酵素による不
   活性化から保護する物質と一体化した、前記肋異的結合
   性ペアの他方のパートナ−を含有して成る複合体、およ
   び （ｃ）　活性なタンパク質不活性化酵素を含有して成る
   特異的結合検定試験用組成物。 （２）特異的結合性パートナ−と一体化した前記固相が
   、特異的結合タンパク質表面部分を有する粒子を含有し
   て成る、前項（１）に記載の組成物。 （３）　特異的結合性パートナ−と一体化した前記固相
   が、特異的結合性タンパク質に結合した基質粒子を含有
   して成る、前項は）に記載の組成物。 （４）　前記基質粒子が真核生物細胞、原核生物細胞お
   よび合成粒子から選ばれる、前項（３）に記載の組成物
   。 （５）　前記合成粒子がラテックスである、前項（４）
   に記載の組成物。 （６）　前記特異的結合性タンパク質が抗体である、前
   項（１）に記載の組成物。 （７）　前記抗体がトリョードチロニンに対し特異的で
   ある、前項（６）に記載の組成物。 （８）　前記抗体がチロキシンに対し特異的である、前
   項（６）に記載の組成物。 （９）　前記抗体が少くとも約０．０４パーセントの濃
   度で存在する、前項（６）に記載の組成物。 （１０）　前記抗体が約０．０４ないし約帆０７パーセ
   ントの濃度で存在する、前項（９）に記載の組成物。 （１υ　前記耐酵素性リガンドの前記複合体が、高分子
   量担体と一体化されたりガントまたはその特異重結合性
   類似体を含有して成る、前項用に記載の組成物。 （１２）前記複合体が、高分子量担体と共有結合により
   結合したりガント捷たはその特異的結合性類似体を含有
   して成る、前項ｑ１１に記載の組成物。 ０３）前記高分子量担体がポリマーである、前項（１２
   ）に記載の組成物。 α４　前記ポリマーがデキストランである、前項α３）
   に記載の組成物。 （１Ｇ　前記ポリマーがエビクロロヒドリンとスクロー
   スとの槁かけ生成物である、前項（１３）に記載の組成
   ｑｌ／ＩＪ。 α０　前記リガンドがトリョードチロニンである、前項
   口υに記載の組成物。 面　前記リガンドがチロキシンである、前項１１１）に
   記載の組成物。 α８）　前記タンパク質不活性化酵素がトリプシンであ
   る、前項＋Ｕに記載の組成物。 σ印　前記タンパク質不活性化酵素がペプシンである、
   前項用に記載の組成物。 １２０）前記タンパク質不活性化酵素が約４．０　ミｌ
   ）グラム／ミリリットル以下の濃度で存在する、前項（
   １）に記載の組成物。 Ｑ］）＠記タンパク質不活性化酵素が約２．０ないし約
   ４．０ミリグラム／ミリリットルの濃度で存在する、前
   項（２０）に記載の組成物。 ■　（ａ）粒子と結合したチロキシンまたはトリョード
   チロニン抗体、 （ｂ）トリプシン、および （ｃｌ高分子量ポリマーと共有結合により結合したチロ
   キシンまたはトリョードナロニンを含有して成る複合体 を含有して成る、チロキシンまたはトリヨートチロニン
   用特異的結合検定試験用組成物。 （イ）ｔａ＋前記の粒子と結合したチロキシンまたは１
   −リョードチロニン抗体の濃度が約０．０４ないｕ’Ｊ
   ＯＵ　７パーセントの濃度で存在し、 （ｂ）前記トリプシンが約２．０ないし約４．０ミリグ
   ラム／ミリリツトルの濃度で存在し、そして（ｃ＋前記
   複合体が約０．２２ないし約０．８８マイ′クロダラム
   ／ミリリツトルの濃度で存在する前項（イ）に記載の特
   異的結合検定用組成物。 （ハ）　試料中の耐酵素性リガンドの検定用であって、
   本質的に次の工程すなわち １）反応混合物中において前記試料を （ａ）　ＡｉＪ記リカすドまたはその結合性類似体とこ
   れに対する特異的結合性タンパク質とから成る特異的結
   合性ペアの一方のパートナ−と一体化した固相、 ｔｂ＋前記ペアの特異的結合性タンパク質がそのパート
   ナ−と結合する場合に前者を酵素による不活性化から保
   護する物質を一体化した、前記特異的結合性ペアの他方
   のパートナ−を含有して成る複合体、および （Ｃ１活性なタンパク質不油性化酵素 と結合させ、そして １１）前記の反応混合物中に生成する結合を検出する 工程から成る、特異的結合検定方法。 婚　前記の粒子に結合した特異的結合性タンパク質が、
   特異的結合性タンパク質表面部分を有する粒子を含有し
   て成る、前項（ハ）に記載の方法。 （ハ）前記の粒子顛結合した特異的結合性タンパク質が
   、特異的結合性タンパク質に結合した基質粒子を含有し
   て成る、前項（ハ）に記載の方法。 （財）前記基質粒子が真核生物細胞、原核生物細胞、お
   よび合成粒子から選ばれる、前項（ハ）に記載の方法。 （財）　前記合成粒子がラテックス粒子である、Ａｉ１
   項ψカに記載の方法。 シ９）　前記特異的結合性タンパク質が抗体でめる、前
   項（ハ）に記載の方法。 □□□　前記抗体がトリョードチロニンに対し特異的で
   ある、前ＪＪ？ｉ、２９）に記載の方法。 ０■　前記抗体がチロキシンに対し特異的である、前項
   −に記載の方法。 ０）　前記抗体が少くとも約帆０４パーセントの濃度で
   存在する、前項（ハ）に記載の方法。 ０３　前記抗体が約０．０４ないし約０．０７パーセン
   トの濃度で存在する、前項０■に記載の方法。 （３◆　前記タンパク質不活性化酵素がトリプシンであ
   る、前項Ｑ艷に記載の方法。 ６Ｇ　前記タンパク質不活性化酵素がペプシンである、
   前項（財）に記載の方法。 （３６）　前記の活性はタンパク質不活性化酵素が約４
   ．０ミリグラム／ミリリツトル以下の濃度で存在する、
   前項（ハ）に記載の方法。 ０乃　前記タンパク質不活性化酵素が約２．０ないし約
   ４．０　ミＩＪグラム／ミリリットルの濃度で存在する
   前項＋ｉｌｉ＋に記載の方法。 ０→　１）ＩＪ記複合体が、高分子量担体と一体化した
   耐酵素性リガンドまたはその特異的結合性類似体を含有
   して成る、前項（ハ）に記載の方法。 ０１　前記複合体が、高分子量担体と共有結合により結
   合したリガンドまたはその特異的結合性類似体を含有し
   て成る、前項０→に記載の方法。 ＧＩＧ　ｒ？ｉＪ記高分子量担体がポリマーである、前
   項国に記載の方法。 θη　前記ポリマーがデキストランである、前項００に
   記載の方法。 Ｏ■　前記ポリマーがエピクロロヒドリンとスクロース
   との橋かけ生成物である、前項顛に記載の方法。 ０３　前記リガンドがトリョードチロニンである、前項
   （イ）に記載の方法。 Ｉ４→　前記リガンドがチロキシンである、前項０→に
   記載の方法。 四　本質的に Ｉ）反応混合物中において試料を （ａ）粒子に結合したチロキシンまたはトリョードチロ
   ニン抗体、 （ｂｌ高分子量ポリマーと共有結合的に結合したチロキ
   シンまたはトリョードチロニンを含有して成る複合体、
   および （ｃ）トリプシン と結合させ、そして １１）前記反応混合物に生成する結合を検出することか
   ら成る、試料中のチロキシンまたはトリョードチロニン
   の特異的結合検定方法。 （１６（ａ）前記の粒子に結合したチロキシンまたはト
   リョードチロニン抗体が約帆０４ないし約０．０７パー
   セントの濃度で存在し、 （１））前記トリプシンが約２，０ないし約４．０ミリ
   グラム／ミリリツトルの濃度で存在し、そして （Ｃ１前記複合体が約０．２２ないし約帆８８マイクロ
   グラム／ミリリットルの濃度で存在する前項りＱに記載
   の特異的結合検定方法。 １７）　（ａｌ試料中の測定すべきリガンドまたはその
   結合性類似体とそれに対する特異的結合性タンパク質と
   を含有して成る特異的結合性ペアの一方のパートナ−と
   一体化した固相、（ｂ）前記ペアの特異的結合性タンパ
   ク質がそのパートナ−と結合する場合に前者を酵素によ
   る不活性化から保護する物質と一体化した、前記特異的
   結合性ペアの他方のパートナ−を含有して成る複合体、
   および （ｅ）活性なタンパク質不活性化酵素 を組込んだ１個以上の構成要素の組合せセットから成る
   、試料中のリガンドの特異的結合検定法による測定用の
   試験キャット。