JP2001037496A - 抗マウスｔｒａｉｌモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＴＲＡＩＬの発現誘導機構や標的細胞破壊機
構以外の他の生理的機能をインビトロ又はインビボで簡
便かつ精確に解析することができる抗マウスＴＲＡＩＬ
モノクローナル抗体を提供すること。 【解決手段】 マウスＴＲＡＩＬのｃＤＮＡをトランス
フェクションしたマウスＢリンパ腫２ＰＫ−３細胞を作
製し、その２ＰＫ−３細胞で免疫したラットの脾細胞
と、マウスミエローマとを融合することによってハイブ
リドーマを作製し、かかるハイブリドーマを培養し、Ｆ
ａｓやＴＮＦと交差反応せず、特異的にマウス由来ＴＲ
ＡＩＬに結合し、かつ、ＴＲＡＩＬの細胞障害活性を完
全に阻害する抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を
製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、マウス等非ヒト動
物由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに
特異的に結合する抗ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体、そ
の製造方法及びかかるモノクローナル抗体を有効成分と
して含有するＴＲＡＩＬ機能解析用試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】腫瘍壊死因子（tumor necrosis facto
r：以下「ＴＮＦ」という）は、ある種の癌細胞にアポ
トーシス（細胞死）を誘導するサイトカインの一種であ
り、疎水性ペプチドをＮ末端側に有するII型細胞膜貫通
蛋白質として知られている。また、ＴＮＦとよく似た構
造を有する細胞膜貫通蛋白質として、Ｆａｓ抗原のリガ
ンド、Ｂ細胞表層抗原ＣＤ４０のリガンド、Ｔ細胞表層
抗原ＣＤ２７やＣＤ３０のリガンドなどが存在し、これ
らはＴＮＦファミリーと呼ばれ、かかるＴＮＦファミリ
ーに属する分子の受容体群はＴＮＦ受容体ファミリーと
呼ばれている。

【０００３】ＴＮＦファミリーの一員である腫瘍壊死因
子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＮＦ−related ap
optosis-inducing ligand：以下「ＴＲＡＩＬ」とい
う）は、ＴＮＦファミリー間における相同性に基づくデ
ータベース検索によって、３０ｋＤａのII型細胞表面蛋
白としてクローニングされ、またＴＲＡＩＬの細胞外領
域は、ＴＮＦファミリー間においては、アポトーシス誘
導分子の１つであるＦａｓリガンド（以下「ＦａｓＬ」
という）に対して最も高い相同性を示し（アミノ酸レベ
ルで２８％）、さらに、ＦａｓＬ同様、さまざまな腫瘍
細胞にアポトーシスを誘導することが報告されている。

【０００４】またこれまでに、ＴＲＡＩＬに対応するレ
セプターとして、少なくとも４分子、すなわちＴＲＡＩ
Ｌレセプター１（ＤＲ４ともいう）、ＴＲＡＩＬレセプ
ター２（ＤＲ５、ＴＲＩＣＫ２あるいはｋｉｌｌｅｒと
もいう）、ＴＲＡＩＬレセプター３（ＴＲＩＤ、ＤｃＲ
１あるいはＬＩＴともいう）及びＴＲＡＩＬレセプター
４（ＴＲＵＮＤＤあるいはＤｃＲ２ともいう）が存在
し、これらレセプターは、ＴＲＡＩＬに対してほぼ同程
度の親和性を示すが、その機能や存在様式については異
なることが明らかとなっている。例えば、ＴＲＡＩＬレ
セプター１及びＴＲＡＩＬレセプター２は細胞内領域に
デスドメインと呼ばれるアポトーシスの誘導に必要とさ
れる部位を有し、三量体ＴＲＡＩＬとこれらレセプター
分子が結合すると、ＦａｓＬのレセプターであるＦａｓ
と同様に、カスパーゼと呼ばれる一連の蛋白質分解酵素
群を介して細胞にアポトーシスを誘導する。

【０００５】一方、ＴＲＡＩＬレセプター３は細胞内領
域を完全に欠いており、細胞膜上の糖脂質（グリコホス
ファチジルイノシトール：ＧＰＩ）に結合することによ
り細胞表面上に存在すると考えられている。このＴＲＡ
ＩＬレセプター３は、細胞内にアポトーシスシグナルを
誘導することはできないが、ＴＲＡＩＬレセプター１や
ＴＲＡＩＬレセプター２とＴＲＡＩＬへの結合をめぐっ
て拮抗的に作用することから、ＴＲＡＩＬの機能を抑制
するものと考えられている。また、ＴＲＡＩＬはＦａｓ
Ｌとは異なり、腫瘍細胞のみに選択的にアポトーシスを
誘導し、正常細胞に対しては無力であることが知られて
いるが、ＴＲＡＩＬレセプター３のメッセンジャーＲＮ
Ａの発現が正常細胞のみにおいて検出され、腫瘍細胞で
は認められないことから、正常細胞のＴＲＡＩＬに対す
る耐性の獲得にＴＲＡＩＬレセプター３が関与する可能
性が示唆されている。

【０００６】第４のレセプター分子であるＴＲＡＩＬレ
セプター４は、ＴＲＡＩＬレセプター１やＴＲＡＩＬレ
セプター２と同様、Ｉ型膜構造形態をとるもののデスド
メインの大半を失っており、アポトーシスの誘導は不可
能とされている。しかしながら、ＴＲＡＩＬレセプター
４はＮＦ−κＢを介したアポトーシス抑制性のシグナル
を誘導することが可能であることから、ＴＲＡＩＬレセ
プター１及びＴＲＡＩＬレセプター２からのアポトーシ
スシグナルに対して抑制的にはたらくものと考えられて
いる。ＴＲＡＩＬのアポトーシス誘導作用に対する細胞
側の感受性は、アポトーシスを誘導するレセプター（Ｔ
ＲＡＩＬレセプター１及びＴＲＡＩＬレセプター２）の
発現とアポトーシスに対して抑制的にはたらくレセプタ
ー（ＴＲＡＩＬレセプター３及びＴＲＡＩＬレセプター
４）の発現との絶対的及び相対的な差によって一義的に
決定されると考えられている。しかしながら、細胞側の
ＴＲＡＩＬに対する耐性獲得の要因としてレセプターの
発現以外にもＦＡＤＤ様インターロイキン１β変換酵素
抑制蛋白質（ＦＬＩＰ：Fas-associated death domain-
like IL-1β-converting enzyme-inhibitory protein）
等の細胞内でアポトーシスシグナルを抑制する分子の存
在が関与する可能性も報告されており、これら細胞内外
のさまざまな要因によりＴＲＡＩＬに対する感受性が決
まると推測されている。

【０００７】ＲＮＡレベルでのＴＲＡＩＬ及びＴＲＡＩ
Ｌレセプター１〜４の発現は多くの組織や細胞で認めら
れるが、これら分子の蛋白質レベルでの発現や生理的機
能についてはいまだ不明な点が多い。最近、本発明者ら
は、ヒトＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンが恒常的にＴＲＡＩＬ
を表出し、ヒト由来Ｔ細胞リンパ種Ｊｕｒｋａｔや不死
化した角化細胞であるＨａＣａＴといった標的細胞をＴ
ＲＡＩＬを介して破壊することを見い出した。また、ト
ーマスらも同様にメラノーマに対するＣＤ４⁺Ｔ細胞ク
ローンがＴＲＡＩＬを介して標的細胞を破壊することを
報告している。

【０００８】上記のように、ＴＲＡＩＬとほかの標的細
胞破壊機構がどのように使い分けられているかは、未だ
不明な点が多く、また、ＴＲＡＩＬ発現が誘導するメカ
ニズムは、まだ明らかとなっていない。さらに、最近、
ＨＩＶに感染するとＴ細胞がＴＲＡＩＬに対して感受性
を示すようになり、アポトーシスが誘導されやすくなる
ことや、ＨＩＶ感染患者由来末梢血Ｔ細胞の抗ＣＤ３抗
体刺激によるアポトーシス（activation-induced cell
death）にＴＲＡＩＬが関与することから、ＨＩＶ感染
細胞の排除やＡＩＤＳ発症児におけるリンパ球減少など
の病態形成にＴＲＡＩＬが関与する可能性が示唆されて
いるものの、そのメカニズムの詳細は明らかになってい
ない。以上のことから、これらＴＲＡＩＬの発現誘導機
構や標的細胞破壊機構以外のほかの生理的機能につい
て、そのメカニズム解析に有用な試薬の存在が期待され
ていた。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】上記ＴＲＡＩＬの生理
的役割及び病理的役割を解明するためには、細胞死を誘
導する他のＴＮＦファミリーやＴＮＦレセプターファミ
リーと交差反応性を示さず、ＴＲＡＩＬと特異的に結合
するモノクローナル抗体等の蛋白質が必要であり、ま
た、生理的機能を有する分子の機能解析はインビボで実
験可能なマウスやラット等の非ヒト動物を用いて行うこ
とが必要である。抗ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体とし
て、本発明者らは既に、ヒト由来のＴＲＡＩＬに結合す
る抗ヒトＴＲＡＩＬモノクローナル抗体について報告し
ている（J. Immunol. 162, 2639-, 1999）が、抗ヒトＴ
ＲＡＩＬモノクローナル抗体は、上記のように、マウス
等を用いたインビボでの実験に実際に使用することがで
きないという問題があった。

【００１０】本発明の課題は、上記ＴＲＡＩＬの発現誘
導機構や標的細胞破壊機構以外の他の生理的機能をイン
ビトロ又はインビボで解析する際、ＦａｓやＴＮＦ等の
ＴＮＦファミリーやＴＮＦレセプターファミリーに対し
て交差反応せず、ＴＲＡＩＬに特異的に作用してその細
胞障害活性を完全に阻害することができる抗マウスＴＲ
ＡＩＬモノクローナルラット抗体などの抗非ヒト動物Ｔ
ＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法や、かかる製造
方法により得られる抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクロー
ナル抗体や、かかるモノクローナル抗体を有効成分とし
て含有し、簡便かつ精確にＴＲＡＩＬを検出することが
できるＴＲＡＩＬ機能解析用試薬を提供することにあ
る。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を克服するために、マウス由来ＴＲＡＩＬのｃＤＮＡ
をトランスフェクションしたマウスＢリンパ腫２ＰＫ−
３細胞を作製し、その２ＰＫ−３細胞で免疫したラット
の脾細胞と、マウスミエローマとを融合することによっ
てハイブリドーマを作製し、かかるハイブリドーマか
ら、ＦａｓやＴＮＦと交差反応せず、特異的にマウス由
来ＴＲＡＩＬに結合し、かつ、ＴＲＡＩＬの細胞障害活
性を完全に阻害する抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル
抗体が産生されることを見い出し、本発明を完成するに
至った。

【００１２】すなわち本発明は、非ヒト動物由来ＴＲＡ
ＩＬのｃＤＮＡを該非ヒト動物と同種の株化細胞にトラ
ンスフェクションして形質転換細胞を調製し、該形質転
換細胞で免疫した異種の非ヒト動物の脾細胞と、前記非
ヒト動物と同種のミエローマ細胞とを融合することによ
って得られるハイブリドーマを培養することを特徴とす
る抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方
法（請求項１）や、非ヒト動物が齧歯類動物であること
を特徴とする請求項１記載の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモ
ノクローナル抗体の製造方法（請求項２）や、齧歯類動
物として、マウスとラットを用いることを特徴とする請
求項２記載の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗
体の製造方法（請求項３）や、株化細胞が、マウスＢリ
ンパ腫２ＰＫ−３細胞であることを特徴とする請求項１
〜３のいずれか記載の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクロ
ーナル抗体の製造方法（請求項４）に関する。

【００１３】また本発明は、請求項１〜４のいずれか記
載の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造
方法により得られることを特徴とする抗非ヒト動物ＴＲ
ＡＩＬモノクローナル抗体（請求項５）や、非ヒト動物
由来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに対
して特異的に反応し、非ヒト動物由来のＦａｓリガンド
や非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子に対して交差反応せ
ず、かつ、該非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子関連アポト
ーシス誘導リガンドの細胞障害活性を完全に阻害するこ
とを特徴とする請求項５記載の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬ
モノクローナル抗体（請求項６）や、非ヒト動物がマウ
スであることを特徴とする請求項５又は６記載の抗非ヒ
ト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体（請求項７）に関
する。

【００１４】さらに本発明は、抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬ
モノクローナル抗体を有効成分として含有することを特
徴とするＴＲＡＩＬ機能解析用試薬（請求項８）や、非
ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項８記載
のＴＲＡＩＬ機能解析用試薬（請求項９）に関する。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬ
モノクローナル抗体の製造方法は、非ヒト動物由来ＴＲ
ＡＩＬのｃＤＮＡを非ヒト動物と同種の株化細胞にトラ
ンスフェクションした形質転換細胞を調製し、該形質転
換細胞で免疫した異種の非ヒト動物の脾細胞と、前記非
ヒト動物と同種のミエローマ細胞とを融合することによ
って得られるハイブリドーマを培養することを特徴とす
る。非ヒト動物としては齧歯類動物が材料の入手性や取
り扱い安さの点で好ましく、かかる齧歯類動物としては
マウスやラットを具体的に挙げることができる。以下、
抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体として、抗
マウスＴＲＡＩＬモノクローナルラット抗体を例に挙げ
て説明する。

【００１６】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナ
ル抗体としては、マウス由来ＴＲＡＩＬと特異的に結合
し、マウスＦａｓＬやマウスＴＮＦに対して交差反応す
ることなく、かつ、マウスＴＲＡＩＬの細胞障害活性を
完全に阻害するモノクローナル抗体であればどのような
ものでもよく、かかる抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナ
ル抗体は、抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により
培養することにより生産することができる。例えば、イ
ンビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又は
ラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ
系においては、動物細胞培養用培地で培養することによ
り得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを
培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペ
ニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥ
Ｍ等の細胞培養培地を例示することができる。

【００１７】抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマは、一般的にはマウスＴＲＡＩＬで免
疫したラットの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを、
常法により細胞融合させることにより作製することがで
きる。このようにマウスＴＲＡＩＬを用いてラットを免
役するとその抗原性が増加する。また、実際のＴＲＡＩ
Ｌの機能解析の場合に必要とされるＴＲＡＩＬの細胞外
領域をエピトープとして認識する抗マウスＴＲＡＩＬモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ること
が好ましく、このため、マウスＴＲＡＩＬのｃＤＮＡを
マウスの株化細胞、例えばＢリンパ腫２ＰＫ−３細胞に
トランスフェクションし、安定発現する形質転換細胞を
選択・調製し、該形質転換細胞でラットを常法により免
疫し、免疫されたラットの脾臓細胞とマウスミエローマ
細胞とを、常法により細胞融合させ、ＨＡＴ培地で選択
し、その中からＬ９２９細胞に対してＴＲＡＩＬ／２Ｐ
Ｋ−３細胞の細胞障害活性を抑制することができるもの
をスクリーンすることにより、抗マウスＴＲＡＩＬモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することがで
きる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方
法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方
法であればどのような方法でもよく、アフィニティーク
ロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的
に例示することができる。

【００１８】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナ
ル抗体は、前記のように、マウスＴＲＡＩＬに対して特
異的に反応し、マウスＦａｓＬやマウスＴＮＦに対して
交差反応せず、かつ、マウスＴＲＡＩＬの細胞障害活性
を完全に阻害することを特徴とするが、ここでＴＲＡＩ
Ｌの細胞障害活性とは、標的腫瘍細胞を破壊するなど、
標的細胞に何らかの病理的な変化をもたらす活性のこと
をいい、マウスＴＲＡＩＬの細胞障害活性を完全に阻害
するとは、例えば、エフェクター細胞表面上に発現した
ＴＲＡＩＬの細胞障害活性により標的細胞がＴＲＡＩＬ
特異的に受ける障害が実質的に阻害されることをいう。

【００１９】本発明のＴＲＡＩＬ機能解析用試薬として
は、抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を有効成分
として含有するものであれば特に制限されるものでな
く、例えば、抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体
を、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテ
トラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、
^{12 5}Ｉ、³²Ｐ、³⁵Ｓ又は³Ｈ等のラジオアイソトープや、
アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラ
クトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識した
ものを具体的に例示することができる。かかるＴＲＡＩ
Ｌ機能解析用試薬を用いたＴＲＡＩＬの機能解析には通
常の免疫学的測定方法を適用することができ、かかる免
疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍
光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、
オクタロニー法等の方法を挙げることができる。

【００２０】

【実施例】以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体
的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施
例に限定されるものではない。 （マウスＴＲＡＩＬの調製）６週齢の雄のＢ６（Ｃ５７
ＢＬ／６）マウス（ＳＬＣ社製）をコンカナバリンＡ
（ＣｏｎＡ）により刺激した後、このマウスの脾細胞か
ら全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡを含む抽出物を、文
献（Immunity 3, 673-, 1995）記載のマウスＴＲＡＩＬ
のｃＤＮＡ配列の５′末端側の６つのコドンからなるプ
ライマーと、３′末端側の６つのコドンからなるプライ
マーとの２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用い
て、ＸｈｏＩとＮｏｔＩによるＲＴ−ＰＣＲ法を行い、
マウスＴＲＡＩＬのｃＤＮＡ（８５０ｂｐ）を増幅し精
製した。

【００２１】（ＴＲＡＩＬ検出用標識ＤＲ５−Ｉｇの作
製）文献（J. Immunol. 162, 2639-, 1999、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 94, 3914-, 1997）記載の方法によ
り、可溶化ＤＲ５−Ｉｇ（ＴＲＡＩＬレセプター２−免
疫グロブリン）融合蛋白質を次のようにして作製した。
マウスＴＲＡＩＬと結合するヒト由来のＤＲ５（ＴＲＡ
ＩＬレセプター２）の細胞外領域（アミノ末端側の１番
目から１８３番目のアミノ酸配列を有する蛋白質）をコ
ードするｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲ法で増幅させ、
ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとを使用して、ダイジェスショ
ンした。そのｃＤＮＡ（５５０ｂｐ）を、ヒトＩｇのＣ
γ１の遺伝子配列を持つｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIのＥ
ｃｏＲＩからＢａｍＨＩの部位に挿入し、その後、Ｅｃ
ｏＲＩとＮｏｔＩでダイジェスションすることによっ
て、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分にＤＲ５の細胞外領域を有
するＤＲ５−Ｉｇの融合体を得た。その融合体をＰＳＧ
５発現ベクター（ストラタジーン社製）のＥｃｏＲＩか
らＮｏｔＩまでの部位に挿入し、ＣＯＳ７細胞にトラン
スフェクションした。１６時間後、無血清の培養培地に
移して９６時間培養し、プロテインＧカラムにより精製
した。このＤＲ５−Ｉｇをビオチン化し、続いて、フィ
コエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ：ＰＥ）で
標識した抗ヒトＩｇＧ（ファーミンジェン社製）と結合
させることによって標識化したＤＲ５−Ｉｇ複合体を作
製した。

【００２２】（マウス由来ＴＲＡＩＬのトランスフェク
タントの作製）上記マウスＴＲＡＩＬのｃＤＮＡをｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ（＋）ベクターにサブクロ
ーンし、オートシークエンサー（アプライドバイオシス
テム社製）又は蛍光式オートシークエンサーを用いて、
それらの塩基配列を確認した。確認後、東京医科歯科大
学の丸山博士から提供されたｐＭＫＩＴＮｅｏ発現ベク
ターのＸｈｏＩからＮｏｔＩまでの部位に、マウスＴＲ
ＡＩＬのｃＤＮＡを挿入した。このマウスＴＲＡＩＬ／
ｐＭＫＩＴＮｅｏベクターを、ジーンパルサー（バイオ
ラッド社製）を用いてエレクトポレーション法（２９０
Ｖ，９６−９６０μＦ）により、ＲＰＭＩ１６４０培地
（最終濃度で１０％のＦＣＳ、１００μｇ／ｍｌのスト
レプトマイシンとペニシリン、及び２ｍＭのグルタミン
を含む培地）であらかじめ培養しておいた２ＰＫ−３細
胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＴＩＢ−２０３）に導入した。その
後、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８に対して耐性のある細胞を
選択し、続いて限界希釈法によりクローニングして、安
定なマウスＴＲＡＩＬのトランスフェクタント、すなわ
ち、ｍＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞を得た。この得られ
た細胞でマウス由来ＴＲＡＩＬが安定的に発現するかど
うかを、以下の方法により確認した。

【００２３】（ｍＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞でのマウ
スＴＲＡＩＬ発現の確認）２ＰＫ−３細胞とマウスＴＲ
ＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞をそれぞれ１μｇの上記標識化
したＤＲ５−Ｉｇ複合体と共に４℃で１時間インキュベ
ートして染色した。結果を図１（図１での実線）に示
す。また、コントロールとして、ヒトＩｇＧとＰＥ標識
抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を用いて同様にインキ
ュベートして染色した（図１での点線）。これらの結果
から、ＤＲ５−ＩｇによってマウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ
−３細胞のみ染色されることから、マウスＴＲＡＩＬ／
２ＰＫ−３細胞においてマウスＴＲＡＩＬが発現するこ
とが確認できた。また同様に、文献（Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 94, 3914-, 1997）記載の方法で精製した
抗マウスＦａｓＬモノクローナル抗体をＤＲ５−Ｉｇの
かわりに用いた場合、マウスＦａｓＬ／２ＰＫ−３細胞
を染色するが、マウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞を染
色しないことがわかった。このことから、抗マウスＦａ
ｓＬモノクローナル抗体は、マウスＴＲＡＩＬに対して
交差反応を示さないことが確認できた。

【００２４】（マウス腫瘍細胞の感受性）インビトロに
おいて、種々のヒト腫瘍細胞は、ＴＲＡＩＬ誘導の細胞
障害に対して感受性であることが知られているが、マウ
ス腫瘍細胞［マウス繊維肉腫Ｌ９２９（Ｈ−２^k）（日
本キャンサーリサーチリソースバンク）、肥満細胞腫Ｐ
８１５（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−６４）、黒色腫Ｂ１６、Ｔ
リンパ腫ＹＡＣ−１（Ｈ−２^b）（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−
１６０）］は、ＴＲＡＩＬ誘導の細胞障害に対して感受
性を有するかどうかはほとんど知られていない。そこ
で、マウス由来ＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞とマウス由
来ＦａｓＬ／２ＰＫ−３細胞の２種類のトランスフェク
タントを用いて、ＴＲＡＩＬとＦａｓＬがそれぞれ誘導
する細胞障害に対して、これらのマウス腫瘍細胞の感受
性を以下のように測定した。

【００２５】文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4
930-, 1994）記載の方法により⁵¹Ｃｒ遊離測定を以下の
ように行った。あらかじめ標的細胞として用いる腫瘍細
胞を ⁵¹Ｃｒ含有ＲＰＭＩ１６４０で培養した。９６ウエ
ルＵ底マイクロプレートに、 ⁵¹Ｃｒでラベルした標的細
胞（１×１０⁴）とエフェクター細胞とを１：１０の割
合で混合した後、８時間インキュベートし、無細胞の上
清を集めてγ−チューブに移し、γ−カウンターで放射
能を測定した。特異的⁵¹Ｃｒ遊離のパーセンテージは、
文献（Int. Immunol. 4, 1049-, 1992）記載の計算方法
により算出した。これらの結果を図２に示す。マウスＴ
ＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞（黒枠）及びマウスＦａｓＬ
／２ＰＫ−３細胞（斜線枠）は、８時間の⁵¹Ｃｒ遊離測
定においてＬ９２９細胞を効果的に溶解しているが、コ
ントロールである２ＰＫ−３細胞（白枠）は細胞障害を
示さなかった。

【００２６】Ｌ９２９細胞はＴＮＦを介する細胞障害に
対して非常に敏感であることから、抗ＴＮＦモノクロー
ナル抗体の存在下で、マウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細
胞又はマウスＦａｓＬ／２ＰＫ−３細胞のＬ９２９細胞
に対する細胞障害活性阻害について調べたところ、５０
μｇ／ｍｌの抗ＴＮＦモノクローナル抗体の存在下です
ら、マウスＴＲＡＩＬやマウスＦａｓＬによる細胞障害
活性を阻害することがなかった。さらに、上清中の可溶
化ＴＮＦ活性やこれらの細胞上の膜結合ＴＮＦも検出す
ることができなかった。これらの結果から、Ｌ９２９細
胞に対するこれらのトランスフェクタントの細胞障害に
おいて、ＴＮＦが関与していないことが確認された。

【００２７】また図２からわかるように、Ｐ８１５細胞
はＦａｓＬに対して感受性を有するがＴＲＡＩＬに対し
ては感受性がなく、Ｂ１６細胞とＹＡＣ−１細胞は、Ｔ
ＲＡＩＬ及びＦａｓＬに対して共に耐性を有する。これ
ら標的細胞に対するマウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞
又はマウスＦａｓＬ／２ＰＫ−３細胞による細胞障害
を、[³Ｈ]−ＴｄＲ遊離測定法によっても測定したが、
これら標的細胞のアポトーシスによる細胞死を示す同様
な結果が得られた。

【００２８】（ラット由来の脾細胞の調製）Ｆ３４４／
ＤｕＣｒｊラット（ＳＬＣ社製）の腹腔内に、前記マウ
スＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞（２×１０⁷ cells）を
投与し、１０日おきに数回免疫した。最終免疫から３日
経過後、脾臓細胞をこのラットから無菌的に摘出し、抗
体産生細胞として細胞融合に使用した。

【００２９】（細胞融合）上記脾細胞とマウスミエロー
マ細胞Ｐ３Ｕ１（P3X63Ag8U.1；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１
５９７）とを、文献（J.Exp. Med. 176, 1241-, 1992）
記載の方法により融合させた。すなわち、３７℃に加温
しておいたＲＰＭＩ１６４０（最終濃度で１０％のＦＣ
Ｓ、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンとペニシリ
ン、及び２ｍＭのグルタミンを含む培地）でそれぞれの
細胞を洗浄し、これらの細胞を遠沈させた。脾細胞とマ
ウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とを融合させた後、ＨＡＴ
培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを
含む細胞培養用培地）でハイブリドーマを選択した。Ｈ
ＡＴ培地で選択されたハイブリドーマの培養上清を用い
て、マウスＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞のＬ９２９細胞
に対する細胞障害活性を抑制するハイブリドーマをスク
リーニングした。なお、これらの実験は全て無菌的に行
った。

【００３０】（抗マウス由来ＴＲＡＩＬモノクローナル
抗体の精製）上記スクリーニングされたハイブリドーマ
を培養し、遠心分離により細胞を取り除いた上清をプロ
テインＧアフィニティークロマトグラフィーにより処理
し、Ｎ２Ｂ１及びＮ２Ｂ２と名付けられた２つのモノク
ローナル抗体を分離・精製した。

【００３１】（抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体
の結合特異性）上記２つの抗マウスＴＲＡＩＬモノクロ
ーナル抗体、Ｎ２Ｂ１とＮ２Ｂ２とをビオチン化し、こ
のビオチン化した抗体のそれぞれを、フィコエリトリン
（ＰＥ）で標識したアビジンと結合させ、ＰＥ標識化抗
体を調製した。次に、２ＰＫ−３細胞とマウスＴＲＡＩ
Ｌ／２ＰＫ−３細胞のそれぞれを１μｇの上記ＰＥ標識
化抗体と共に４℃で１時間インキュベートして染色し
た。結果を図３（図３での実線）に示す。また、コント
ロールとして、ヒトＩｇＧとＰＥ標識抗ヒトＩｇＧモノ
クローナル抗体を用いて同様にインキュベートして染色
した（図３での点線）。これらの結果から、２つの抗体
Ｎ２Ｂ１とＮ２Ｂ２とは、マウス由来ＴＲＡＩＬ／２Ｐ
Ｋ−３細胞に結合するが、ＴＲＡＩＬを発現しない２Ｐ
Ｋ−３細胞には結合しないことがわかった。また、これ
らの抗体はマウス由来ＴＲＡＩＬ／ＢＨＫとは結合する
が、ＢＨＫには結合しないことも確認された。

【００３２】（抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体
の細胞障害活性抑制作用）抗マウスＴＲＡＩＬモノクロ
ーナル抗体のＬ９２９細胞に対する細胞障害活性抑制作
用を調べるために、前記の⁵¹Ｃｒ遊離測定を行い、特異
的⁵¹Ｃｒ遊離のパーセンテージを算出した。結果を図４
に示す。図４中、○はＮ２Ｂ１を、●はＮ２Ｂ２を、▲
はこれら抗体の不存在をそれぞれ表す。これらの結果か
ら、抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗体、Ｎ２Ｂ１
とＮ２Ｂ２とは、投与量０．４μｇ／ｍｌでＬ９２９細
胞に対するマウス由来ＴＲＡＩＬ／２ＰＫ−３細胞の細
胞障害活性を完全に阻害した。しかし、これら２つの抗
体は、Ｌ９２９細胞に対する組換えマウスＴＮＦ／２Ｐ
Ｋ−３や組換えマウスＦａｓＬ／２ＰＫ−３の細胞障害
活性を阻害せず、また、膜ＴＮＦを発現するマウスＦａ
ｓＬ／２ＰＫ−３細胞やＬＰＳで刺激したＲＡＷ２６４
細胞を染色することはなかった。これらのことから、こ
れら２つの抗体はマウスＦａｓＬやマウスＴＮＦに対し
て交差反応しないことが明らかとなった。

【００３３】（サイトカイン未活性化リンパ球でのマウ
スＴＲＡＩＬの発現）未成熟Ｂ６脾細胞（２×１０⁶ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌ）（ＳＰＣ）を培養培地で培養し、この
培養後のＢ６脾細胞（リンパ球）と、ＦＩＴＣで標識し
た抗ＮＫ１．１モノクローナル抗体又はペリジニンクロ
ロフィルプロテイン（ＰｅｒＣｐ）で標識した抗ＣＤ３
モノクローナル抗体（ファーミンジェン社製）とを、４
℃で１時間インキュベートし反応させ、ＣＤ３とＮＫ
１．１の発現を調べることで４つの個体群［ＣＤ３⁺Ｎ
Ｋ１．１^-（Ｔ細胞：Ｒ１）、ＣＤ３^-ＮＫ１．１^-（殆
どのＢ細胞：Ｒ２）、ＣＤ３^-ＮＫ１．１⁺（ＮＫ細胞：
Ｒ３）、ＣＤ３⁺ＮＫ１．１⁺（ＮＫＴ細胞：Ｒ４）］に
分類した（図５上段参照）。

【００３４】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナ
ル抗体（Ｎ２Ｂ２）を用いて、上記分類した４つの個体
群（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４）において、ＴＲＡＩＬと
ＦａｓＬが発現しているかどうかを以下のように調べ
た。Ｎ２Ｂ２と抗マウスＦａｓＬモノクローナル抗体
（以下「ＭＦＬ２」という）をそれぞれビオチン化し、
このビオチン化した抗体のそれぞれをフィコエリトリン
（ＰＥ）で標識したアビジンと共に４℃で１時間インキ
ュベートして結合させ、これらＰＥ標識化抗体１μｇ
を、上記Ｒ１〜Ｒ４に分類された細胞と反応させ、ＰＢ
Ｓにて洗浄した後、３カラーフローサイトメトリー分析
によりＴＲＡＩＬやＦａｓＬの発現を測定した。結果を
図５（図５での実線）に示す。また、コントロールとし
て、ヒトＩｇＧとＰＥ標識抗ヒトＩｇＧモノクローナル
抗体を用いて同様にインキュベートし、染色した（図５
での点線）。これらの結果、全ての個体群においてＴＲ
ＡＩＬは発現していなかった。同様に、新しく単離され
た胸腺細胞においても、リンパヌード細胞においても、
ＴＲＡＩＬは発現していなかった。また、ＦａｓＬの細
胞表面での発現を調べた結果、ＮＫ細胞（Ｒ３）ではＦ
ａｓＬの発現をかなりのレベルで確認でき、他の細胞で
は確認することができなかった。

【００３５】（サイトカイン活性化リンパ球でのマウス
ＴＲＡＩＬの発現）ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８
等のサイトカインにより刺激されたＴ細胞とＮＫ細胞に
おいて、ＦａｓＬをアップレギュレーション（発現上
昇）することができるという報告（Blood 92, 4248-, 1
998、Cell Immunol. 174, 54-, 1996、J. Immunol. 15
7, 3967-, 1996、J. Immunol. 157, 1919-, 1996）があ
ることから、これらサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−１
５、ＩＬ−１８）によりＴＲＡＩＬを誘導することがで
きるかどうかを調べた。Ｂ６脾細胞（２×１０⁶ｃｅｌ
ｌｓ／ｍｌ）（ＳＰＣ）を６日間、ＩＬ−２（５００ｕ
／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１５０ｎｇ／ｍｌ）又はＩＬ−
１８（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養して刺激し
た。次いで、これら細胞に前記ＰＥ標識化抗体を作用さ
せて、３カラーフローサイトメトリー分析によりＴＲＡ
ＩＬの発現を測定した。結果を図６に示す。

【００３６】図６の結果から、ＩＬ−２で刺激されたリ
ンパ芽球は、２つの個体群［ＣＤ３ ⁺ＮＫ１．１^-（Ｔ細
胞：Ｒ１）、ＣＤ３^-ＮＫ１．１⁺（ＮＫ細胞：Ｒ２）］
に分けることができ、このうちＮＫ細胞ではＴＲＡＩＬ
の著しい発現レベルを検出できたが、Ｔ細胞では検出で
きなかった。ＩＬ−１５で刺激した場合は、ＩＬ−２と
レセプター複合体のβとγサブユニットを共有するとの
報告どおり（Science264, 965-, 1994、Embo. J. 14, 3
654-, 1995、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4940-,
1994）、ＩＬ−２の場合と同様な結果を示し、Ｔ細胞
（Ｒ３）とＮＫ細胞（Ｒ４）の２つの個体群が作出さ
れ、また、ＮＫ細胞において選択的にＴＲＡＩＬの発現
が誘導されることがわかった。これに対し、レセプター
（ＩＬ−１８Ｒ／ＩＬ−１Ｒｒｐ）を刺激するＩＬ−１
８は、ＮＫフェノタイプのリンパ芽球（Ｒ５）だけを誘
導したが、該リンパ芽球にＴＲＡＩＬ発現を確認するこ
とはできなかった。これらのことから、ＩＬ−１８と異
なりＩＬ−２とＩＬ−１５は、マウスＮＫ細胞でＴＲＡ
ＩＬ発現に対して強いインデューサー作用を有すること
がわかった。

【００３７】Ｂ６脾細胞をＩＬ−２で刺激後、ＮＫ細胞
における経時的なＴＲＡＩＬ発現の動態を測定した。結
果を図７に示す。ＩＬ−２刺激によるＴＲＡＩＬの発現
は、２日後に確認でき、５日後ピークに達した。同様な
結果がＩＬ−１５刺激においても観察された。他方、Ｉ
Ｌ−２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１８でそれぞれ刺激した
細胞において、ＦａｓＬの細胞表面発現をアップレギュ
レートすることができるかどうかを調べた結果、これら
のサイトカインが、Ｔ細胞とＮＫ細胞においてＦａｓＬ
発現をアップレギュレートすることがわかった（図６参
照）。これらの結果は、これらのサイトカインによるＴ
ＲＡＩＬ及びＦａｓＬの発現の異なる調節機構の存在を
示している。

【００３８】（ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１８ブ
ラストのＬＡＫ活性）ＩＬ−２で活性化されたリンパ球
は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）非拘束性で
あり、Ｐ８１５等のＮＫ耐性標的細胞を含む種々の腫瘍
細胞に対するＡｇ非依存性細胞障害、いわゆるリンホカ
イン活性化キラー（ＬＡＫ）活性を示すことが知られて
いる（J. Immunol. 157, 1919-, 1996、Annu. Rev. Imm
unol.4, 681-, 1986）。そこで、いくつかの標的細胞に
対して、ＩＬ−２ブラスト（○）、ＩＬ−１５ブラスト
（●）又はＩＬ−１８ブラスト（△）のＬＡＫ活性を比
較した。結果を図８に示す。その結果、Ｂ６マウス由来
のＩＬ−２ブラスト及びＩＬ−１５ブラストは、ＮＫ細
胞感受性のＹＡＣ−１のみならず、ＭＨＣ非拘束性で、
ＮＫ細胞耐性の標的細胞Ｂ１６、Ｐ８１５、Ｌ９２９を
も自発的に殺した。また、ＩＬ−１８ブラストにおいて
は、ＩＬ−２ブラストやＩＬ−１５ブラストより、全て
の標的細胞に対しより高い細胞障害活性を示すことがわ
かった。

【００３９】（サイトカイン活性化ＮＫ細胞の細胞障害
におけるＴＲＡＩＬの関与）ＩＬ−２、ＩＬ−１５又は
ＩＬ−１８が、ＦａｓＬ及び／又はパーフォリンを介す
る細胞障害をアップレギュレートし、Ｔ細胞とＮＫ細胞
の細胞障害を増大するという報告がある（Blood 92, 42
48-, 1998、Cell Immunol. 174, 54-, 1996、J. Immuno
l. 157, 3967-, 1996、J. Immunol. 162, 1662-, 199
9、J. Immunol. 157, 1919-, 1996）。そこで、ＩＬ−
２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１８ブラストのＬＡＫ活性に
対するＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ及びパーフォリンの関与を
検討した。Ｂ６脾細胞（２×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）
に、ＩＬ−２（５００ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１５０
ｎｇ／ｍｌ）又はＩＬ−１８（１００ｎｇ／ｍｌ）を加
えて６日間刺激し、培養培地で培養した。また、あらか
じめ標的細胞として用いる腫瘍細胞を⁵¹Ｃｒの共存下Ｒ
ＰＭＩ１６４０で培養した。次に、９６ウエルＵ底マイ
クロプレートに、⁵¹Ｃｒでラベルされた標的細胞（１×
１０⁴）とエフェクター細胞とを１：５の割合で混合
し、２０ｎＭのコンカナマイシン（以下「ＣＭＡ」とい
う）の存在又は非存在下、各々１０μｇ／ｍｌのＮ２Ｂ
２及び／又はＭＦＬ２を添加し、８時間インキュベート
した。その無細胞上清を集めてγ−チューブに移し、γ
−カウンターで放射能を測定し、遊離⁵¹Ｃｒの測定を行
った。

【００４０】ＣＭＡで前処理した不活性化パーフォリン
を、パーフォリンの関与を評価するのに用い、ＦａｓＬ
耐性の標的細胞（ＹＡＣ−１）やＴＲＡＩＬ耐性の標的
細胞（Ｂ１６）等に対する、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又は
ＩＬ−１８ブラストの細胞障害活性を調べた。結果を図
９に示す。図９からわかるように、ＩＬ−２やＩＬ−１
５で活性化されたブラストの細胞障害活性はＣＭＡ処理
によりほとんど完全に阻害され、パーフォリンの関与を
明らかに示した。これに対し、Ｂ１６に対するＩＬ−１
８ブラストの細胞障害活性はＣＭＡ処理によりほとんど
完全に阻害されたが、ＹＡＣ−１に対してはＣＭＡ、あ
るいは、ＣＭＡとＭＦＬ２及び／又はＮ２Ｂ２との組み
合わせの場合であっても、完全に抑制することができな
かった。これらのことから、パーフォリン、ＦａｓＬ又
はＴＲＡＩＬに依存しない他の細胞障害経路の存在が示
唆された。また、ＦａｓＬ感受性でＴＲＡＩＬ耐性のＰ
８１５に対する、ＩＬ−２、ＩＬ−１５又はＩＬ−１８
ブラストの細胞障害活性を、ＣＭＡはほとんど阻害し、
ＭＦＬ２との組み合わせでは完全に阻害した。このこと
は、Ｐ８１５に対する細胞障害活性にパーフォリンは重
要で、ＦａｓＬは重要でないことを示している。ＴＲＡ
ＩＬ又はＦａｓＬに敏感なＬ９２９では、ＣＭＡはただ
ＩＬ−２ブラストとＩＬ−１５ブラストの細胞障害活性
を一部阻害し、ＣＭＡとＭＦＬ２又はＮ２Ｂ２と組み合
わせることでより阻害することができた。さらに、ＣＭ
Ａと２つの抗体を組み合わせることでほとんど完全に阻
害できることがわかった。

【００４１】これらの結果は、パーフォリンやＦａｓＬ
に加えてＴＲＡＩＬが、Ｌ９２９に対するＩＬ−２又は
ＩＬ−１５ブラストの細胞障害活性に関係することを示
している。これに対して、ＣＭＡとＭＦＬ２との組み合
わせは、Ｎ２Ｂ２の非存在下でＬ９２９に対してＩＬ−
１８ブラストの細胞障害活性を完全に阻害することか
ら、ＩＬ−１８ブラストの細胞障害活性は、パーフォリ
ン及びＦａｓＬに依存し、ＴＲＡＩＬに非依存性である
ことがわかった。

【００４２】次に、ＮＫ細胞とＴ細胞の２つの個体群に
おいてエフェクターのメカニズムを調べるため、Ｌ９２
９に対してこれらエフェクター細胞の細胞障害活性を、
上記と同様にＣＭＡ、ＣＭＡとＭＦＬ２及び／又はＮ２
Ｂ２の存在下あるいは非存在下で調べてみた。結果を図
１０に示す。これらの結果から、ＩＬ−２で刺激された
ＮＫ細胞は、Ｔ細胞より十分高い細胞障害性を示し、Ｃ
ＭＡ、Ｎ２Ｂ２及びＭＦＬ２の組み合わせは、Ｌ９２９
に対してＩＬ−２で刺激されたＮＫ細胞の細胞障害活性
を完全に阻害することがわかった。これに対して、Ｎ２
Ｂ２はＩＬ−２で刺激されたＴ細胞の細胞障害の阻害に
必要とされないことがわかった。また、ＩＬ−１５ブラ
ストでも同様な結果を得た。これらの結果から、ＩＬ−
２又はＩＬ−１５で刺激されたＮＫ細胞では機能的にＴ
ＲＡＩＬを発現するが、Ｔ細胞では発現しないことが明
らかとなった。

【００４３】

【発明の効果】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクロー
ナル抗体を使用することで、インビトロ又はインビボで
の種々のＴＲＡＩＬ機能の解析が可能となり、ＴＲＡＩ
Ｌの生理的役割及び病理的役割を解明することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】トランスフェクタントにおけるマウスＴＲＡＩ
Ｌの発現をフローサイトメトリーにより測定した結果を
示す図である。

【図２】標的腫瘍細胞に対するマウスＴＲＡＩＬ及びＦ
ａｓＬ発現細胞の細胞障害活性を示す図である。

【図３】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗
体と細胞表面マウスＴＲＡＩＬとの結合を示すフローサ
イトメトリーの測定結果を示す図である。

【図４】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗
体によるマウスＴＲＡＩＬの細胞障害活性抑制の結果を
示す図である。

【図５】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗
体を用いたサイトカイン未活性化リンパ球におけるＴＲ
ＡＩＬの発現結果を示す図である。

【図６】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗
体を用いたサイトカイン活性化リンパ球におけるＴＲＡ
ＩＬの発現結果を示す図である。

【図７】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗
体を用いたＩＬ−２活性化ＮＫ細胞におけるＴＲＡＩＬ
発現の経時変化を示す図である。

【図８】各種標的腫瘍細胞に対するサイトカイン活性化
リンパ球のＬＡＫ活性を示す図である。

【図９】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル抗
体を用いたサイトカイン活性化リンパ球の腫瘍細胞に対
する細胞障害におけるＴＲＡＩＬの関与を示す図であ
る。

【図１０】本発明の抗マウスＴＲＡＩＬモノクローナル
抗体を用いたサイトカイン活性化リンパ球の腫瘍細胞Ｌ
９２９に対する細胞障害におけるＴＲＡＩＬの関与を示
す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/577 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 15/00 Ｃ 33/577 Ａ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA28 BA43 CA04 DA02 EA04 GA03 4B063 QA01 QA18 QQ02 QR72 QX01 4B064 AG02 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA13 4B065 AA91Y AA92X AB01 AB02 AC14 CA24 CA25 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA14 DA76 EA50 FA72 FA74

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 非ヒト動物由来ＴＲＡＩＬのｃＤＮＡを
   該非ヒト動物と同種の株化細胞にトランスフェクション
   して形質転換細胞を調製し、該形質転換細胞で免疫した
   異種の非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と同種の
   ミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイ
   ブリドーマを培養することを特徴とする抗非ヒト動物Ｔ
   ＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法。
2. 【請求項２】 非ヒト動物が齧歯類動物であることを特
   徴とする請求項１記載の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノク
   ローナル抗体の製造方法。
3. 【請求項３】 齧歯類動物として、マウスとラットを用
   いることを特徴とする請求項２記載の抗非ヒト動物ＴＲ
   ＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法。
4. 【請求項４】 株化細胞が、マウスＢリンパ腫２ＰＫ−
   ３細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか
   記載の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製
   造方法。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか記載の抗非ヒト
   動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体の製造方法により得
   られることを特徴とする抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノク
   ローナル抗体。
6. 【請求項６】 非ヒト動物由来の腫瘍壊死因子関連アポ
   トーシス誘導リガンドに対して特異的に反応し、非ヒト
   動物由来のＦａｓリガンドや非ヒト動物由来の腫瘍壊死
   因子に対して交差反応せず、かつ、該非ヒト動物由来の
   腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの細胞障害
   活性を完全に阻害することを特徴とする請求項５記載の
   抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体。
7. 【請求項７】 非ヒト動物がマウスであることを特徴と
   する請求項５又は６記載の抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノ
   クローナル抗体。
8. 【請求項８】 抗非ヒト動物ＴＲＡＩＬモノクローナル
   抗体を有効成分として含有することを特徴とするＴＲＡ
   ＩＬ機能解析用試薬。
9. 【請求項９】 非ヒト動物がマウスであることを特徴と
   する請求項８記載のＴＲＡＩＬ機能解析用試薬。