CN111040034B - 一种抗人cd358的单克隆抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗人CD358的单克隆抗体及其用途。该单克隆抗体含有重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH和VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述VH和所述VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.2的第26‑36位所示、第51‑58位所示和第97‑109位所示；所述VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.4的第27‑37位所示、第55‑57位所示和第94‑99位所示。该单克隆抗体可特异识别人滤泡树突状细胞，可用于制备诊断滤泡树突状细胞肉瘤试剂。

Description

一种抗人CD358的单克隆抗体及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种抗人CD358的单克隆抗体及其用途。
背景技术
CD358，又被称为死亡受体6(Death receptor 6，DR6)，是肿瘤坏死因子受体超家族中的一员。在这个超家族中，共有8个具有死亡结构域的成员：TNFR1、FAS、DR3、DR4、DR5、CD358、NGFR和EDAR。这些分子在免疫系统的发育和功能中发挥着非常重要的作用。
CD358是I型跨膜糖蛋白，由655个氨基酸组成，与其它肿瘤坏死因子受体家族成员拥有相似的结构域，CD358胞外区含有四个半胱氨酸富集结构域，CD358胞内区含有死亡结构域。2009年，Klima等人详细报道了CD358的翻译后修饰(Biochim Biophys Acta.2009；1793(10):1579-87)。研究发现CD358是高度糖基化的蛋白，胞外区含有多个N-糖基化修饰位点(Asn82，Asn141，Asn252，Asn257，Asn278和Asn289)，多个O-糖基化修饰位点(Thr213，Thr221，Thr227，Thr238，Thr245和Thr254)和一个S-棕榈酸的修饰位点(Cys368)。通过免疫印迹对肿瘤细胞中的CD358进行蛋白水平检测，发现有两条大小分别为90kD和110kD的条带，推测为翻译后修饰的蛋白。
2009年，国际白细胞分类委员会给出了CD358在人外周血细胞中的表达谱，该报道显示CD358以极低的水平表达在单核细胞的表面(Immunol Lett,2011.134(2):p.104-12)。2016年，Li J.等人报道CD358表达在人血液来源的浆样树突状细胞(pDC)表面(ProteinCell.2016Apr；7(4):291-294)。但是CD358在淋巴组织中的表达一直不是很清楚。
滤泡树突状细胞(follocular dendritic cell，FDC)是位于淋巴结及脾脏滤泡中的树突状细胞。具有长突起，可与B细胞紧密接触，表达Fc受体，但不介导内吞作用，从而使抗原-抗体复合物在其树突上形成免疫复合物包被小体而长期保存，在激活B细胞中起重要作用，可能参与B细胞的免疫记忆应答。CD21是FDC的经典标志物，CD21是Ⅱ型补体受体，强阳性表达于FDC，可用于标记滤泡树突状细胞是否具有网状结构。
滤泡树突状细胞肉瘤(follicular dendritic cell sarcoma，FDCS)是一种非常罕见的原发于淋巴组织滤泡树突状细胞的恶性肿瘤。滤泡树突状细胞肉瘤多发生于颈区、腋窝淋巴结、扁桃体和甲状腺等。由于发生率极低,临床医生和病理医师对其临床表现、影像学表现和组织形态学表现容易认识不足,极容易误诊为其他类型的肿瘤。近年来,随着免疫组织化学技术的发展和多种特异性抗体的出现,使许多疑难肿瘤得到了明确诊断,免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值得到了普遍的认可,故针对性的免疫组化分析对正确诊断滤泡树突状细胞肉瘤非常重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何通过免疫组织化学的方法识别人滤泡树突状细胞。
为了解决以上技术问题，本发明提供了抗人CD358的单克隆抗体或其抗原结合部分。
本发明所提供的抗人CD358的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述抗人CD358的单克隆抗体的名称为3E3，所述单克隆抗体或其抗原结合部分含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区，所述VH和VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述VH和所述VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第26-36位所示；
所述VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第51-58位所示；
所述VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第97-109位所示；
所述VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第27-37位所示；
所述VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第55-57位所示；
所述VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第94-99位所示。
上述抗人CD358的单克隆抗体或其抗原结合部分中，所述VH和VL的框架区均来源于小鼠。
上述抗人CD358的单克隆抗体或其抗原结合部分中，所述VH的氨基酸序列可如序列表中SEQ ID No.2所示；所述VL的氨基酸序列可如序列表中SEQ ID No.4所示。
其中，SEQ ID No.2由120个氨基酸残基组成，SEQ ID No.4由109个氨基酸残基组成。上述抗人CD358的单克隆抗体或其抗原结合部分中，所述单克隆抗体可为鼠源单克隆抗体。
上述抗人CD358的单克隆抗体或其抗原结合部分中，所述单克隆抗体可为下述任一种：
a)由所述VH和所述VL连接得到的单链抗体；
b)含有a)所述单链抗体的融合抗体；
c)含有所述VH和所述VL的Fab；
d)含有所述VH和所述VL的完整抗体；
e)由保藏号为CGMCC No.16219的杂交瘤细胞系3E3分泌的单克隆抗体。
与上述抗人CD358的单克隆抗体或其抗原结合部分相关的生物材料也属于本发明的保护范围。所述生物材料可为B1)至B16)中的任一种：
B1)编码所述单克隆抗体或其抗原结合部分的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述生物材料中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为编码所述单克隆抗体或其抗原结合部分的基因。
上述生物材料中，所述基因可为如下A)或B)所述的DNA分子：
A)所述VH的CDR1的编码序列如SEQ ID No.1的第76-108位所示，所述VH的CDR2的编码序列如SEQ ID No.1的第151-174位所示，所述VH的CDR3的编码序列如SEQ ID No.1的第289-327位所示；所述VL的CDR1的编码序列如SEQ ID No.3的第79-111位所示，所述VL的CDR2编码序列如SEQ ID No.3的第163-171位所示，所述VL的CDR3的编码序列如SEQ ID No.3的第280-297位所示。
B)与A)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述单克隆抗体或其抗原结合部分的DNA分子。
其中，SEQ ID No.1由360个核苷酸组成，SEQ ID No.3由327个核苷酸组成。
上述生物材料中，B2)所述的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述单克隆抗体或其抗原结合部分的DNA，该DNA不但可包括启动所述单克隆抗体或其抗原结合部分基因转录的启动子，还可包括终止所述单克隆抗体或其抗原结合部分基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用现有的表达载体构建含有所述单克隆抗体基因表达盒的重组载体。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
上述生物材料中，所述转基因动物细胞系和转基因植物细胞系均可为非繁殖材料。
上述生物材料中，“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述生物材料中，90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％或99％的同一性的DNA分子。
上述单克隆抗体或其抗原结合部分，或上述生物材料在制备识别滤泡树突状细胞试剂或试剂盒中的应用或在制备诊断滤泡树突状细胞肉瘤试剂或试剂盒中的应用均属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述识别滤泡树突状细胞试剂或试剂盒可为免疫组织化学检测试剂或试剂盒。所述识别滤泡树突状细胞试剂或试剂盒含有所述单克隆抗体或其抗原结合部分，还可还有免疫组织化学检测所需的其它试剂。所述诊断滤泡树突状细胞肉瘤试剂或试剂盒可为免疫组织化学检测试剂或试剂盒。所述诊断滤泡树突状细胞肉瘤试剂或试剂盒含有所述单克隆抗体或其抗原结合部分，还可还有免疫组织化学检测所需的其它试剂。
上述应用中，所述滤泡树突状细胞可为人滤泡树突状细胞。
实验证明，本发明的抗人CD358的单克隆抗体3E3可特异识别人滤泡树突状细胞，可用于制备识别人滤泡树突状细胞和诊断人滤泡树突状细胞肉瘤的试剂。现有的其它抗人CD358的单克隆抗体，如2E8不能识别人滤泡树突状细胞。
保藏说明
参据的生物材料(株)：3E3
建议的分类命名：杂交瘤细胞系
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年08月23日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.16219
附图说明
图1为抗人CD358的单克隆抗体的免疫和筛选方法。
A为用pIRES2-EGFP-CD358对小鼠L细胞进行转染，48小时后通过绿色荧光蛋白GFP的表达来检测转染效率。左图为明场下细胞形态，中间图为荧光显微镜下GFP的表达，右图为流式细胞仪检测GFP的蛋白，数字显示GFP阳性细胞的比例。
B为阳性杂交瘤细胞的筛选方法。杂交瘤上清标记转染人CD358的293T细胞，再用羊抗小鼠IgG-PE抗体进行染色，通过R值的大小来筛选阳性杂交瘤克隆。
图2为抗人CD358的单克隆抗体3E3能够结合CD358。
A为流式细胞染色结果。
B为免疫沉淀与免疫印迹结果。
C为ELISA检测结果。
图3为抗人CD358的单克隆抗体3E3能够做免疫组化，识别滤泡网状结构；而抗人CD358的单克隆抗体2E8则不能识别滤泡网状结构。
A和B为3E3免疫组化结果。
C为2E8免疫组化结果。
图4为抗人CD358的单克隆抗体3E3识别的人CD358与人CD21共定位。
图5为抗人CD358的单克隆抗体3E3重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。黑色阴影区域依次为信号肽、CDR1、CDR2和CDR3。
图6为抗人CD358的单克隆抗体3E3轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。黑色阴影区域依次为信号肽、CDR1、CDR2和CDR3。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、抗人CD358的单克隆抗体3E3的制备
1、BalB/C小鼠的免疫
将pIRES2-EGFP载体(Addgene)的限制性内切酶BglII和SalI识别位点间的片段(小片段)替换为人CD358基因的全长CDS序列(GenBank Accession No.NM_014452.4(PRI30-JUN-2018)的第437-2404位)，保持pIRES2-EGFP的其它序列不变，得到表达人CD358同时表达GFP的重组表达载体，其名称为pIRES2-EGFP-CD358。
用pIRES2-EGFP-CD358对小鼠L细胞进行转染，48小时后通过绿色荧光蛋白GFP的表达来检测转染效率，结果如图1中A所示，GFP阳性细胞的比例为约为40％。GFP阳性细胞即为将pIRES2-EGFP-CD358转入小鼠L细胞得到的含有pIRES2-EGFP-CD358的重组小鼠L细胞。将pIRES2-EGFP-CD358质粒转入小鼠L细胞得到的重组细胞，命名为小鼠L细胞/pIRES2-EGFP-CD358。
将小鼠L细胞/pIRES2-EGFP-CD358作为免疫原。将转染5000000个小鼠L细胞/pIRES2-EGFP-CD358与20μg CpG1826(TAKARA合成)混合，得到0.5mL的细胞悬液。将细胞悬液通过腹腔注射的方式免疫6周龄BalB/C小鼠。每个月免疫一次，共免疫3次。最后使用同样方法进行加强免疫，并在4天后进行杂交瘤融合。
2、杂交瘤的融合
将免疫后待融合的小鼠处死，并取出脾脏细胞。通过细胞计数，将小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0按1:3(细胞数比)的比例混合，并使用50％PEG(Sigma)融合细胞。将融合后的细胞加入到60mL含1×HAT的RPMI培养基(Cellgro公司的产品，货号为15-041-CV)中(含10％(v/v)胎牛血清)，按每孔1-2滴的量加入到96孔细胞培养板中。随后，将杂交瘤细胞在37℃、5％CO2的条件下进行培养，3-4天进行半量换液。约10天后进行抗体筛选。
3、杂交瘤细胞筛选
具体操作如下：筛选前一天，将96孔细胞培养板中的上清吸出约100μL至96孔U形底的培养板中，并在原孔补入100μL新鲜的含1×HAT的RPMI培养基，继续培养细胞。收取转染pIRES2-EGFP-CD358的HEK293T细胞(将pIRES2-EGFP-CD358转入HEK293T细胞得到的重组细胞，将其命名为HEK293T/pIRES2-EGFP-CD358)，将其加至96孔U形底培养板中，10000个细胞/200μl/孔。2200rpm离心3min，甩出上清，并加入100μL杂交瘤培养上清，重悬后4℃孵育30min。孵育完毕，离心并甩出上清，每孔加入200μL FACS buffer，重悬并离心，之后甩出上清以达到清洗的目的。每孔加入1:400稀释于FACS buffer的PE标记的羊抗鼠IgG抗体(Biolegend公司的产品)，将细胞重悬后在4℃避光孵育30min。孵育后，将培养板进行离心并除去上清，按前述方法清洗细胞一次后加入200μL FACS buffer重悬细胞。最后，使用流式细胞仪Guava(Millipore)分析细胞GFP与PE信号，选出R值(GFP阳性细胞群的PE平均荧光强度与GFP阴性细胞群的PE平均荧光强度的比值)大的单克隆，如图1中B所示，然后继续进对这些选出的克隆进行至少3轮亚克隆和筛选。根据上述步骤，最终选择了稳定分泌抗人CD358的单克隆抗体3E3的单克隆杂交瘤细胞株3E3—杂交瘤细胞系3E3。杂交瘤细胞系3E3已于2018年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.16219。
4、抗人CD358的单克隆抗体3E3的序列
4.1RNA的提取
利用Trizol(Invitrogen)裂解杂交瘤细胞系3E3后，提取杂交瘤细胞系3E3的RNA。RNA提取的具体操作步骤如下：每1mL Trizol加入200μL三氯甲烷，充分震荡后静置10min；4℃、13000rpm离心15min；吸取400μL上清加至400μL预冷异丙醇中，混匀后-20℃静置过夜；4℃、13000rpm离心15min；弃上清，加入70％(v/v)乙醇水溶液；4℃、13000rpm离心10min；弃上清，加入70％(v/v)乙醇水溶液；弃上清，加入40μL水溶解，得到RNA溶液。
4.2cDNA的获得
吸取16μL步骤4.1制备的RNA溶液，加入1μL浓度为100nM的Oligo dT(Invitrogen)；70℃反应5min；立即放置冰上；分别加入1μL RNA酶抑制剂(Takara)，1μL浓度为10mM的dNTP(Takara)，1μL MLV反转录酶和5μL 5×缓冲液(Promega)；42℃反应60min；80℃处理10min，得到cDNA溶液。
4.3PCR扩增及测序
4.3.1PCR扩增
第一步PCR扩增：
以步骤4.2获得的cDNA溶液为模板，分别采用重链引物对(由重链引物F1和重链引物R1组成)和轻链引物对(由轻链引物F1和轻链引物R1组成)进行PCR扩增，依次获得编码重链的片段和编码轻链的片段。引物序列如下：
重链引物F1：5’-SARGTNMAGCTGSAGSAGTC-3’；
重链引物R1：5’-CTTGACCAGGCATCCTAGAGTCA-3’；
轻链引物F1：5’-GAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA-3’；
轻链引物R1：5’-GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3’。
其中，R＝a或g；Y＝c或t；M＝a或c；K＝g或t；S＝c或g；W＝a或t；V＝a，c或g；N＝a，c，g或t。
PCR反应条件：98℃预变性2min；98℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
第二步PCR扩增：
以第一步PCR扩增产物为模板，分别采用重链引物对(由重链引物F2和重链引物R2组成)和轻链引物对(由轻链引物F2和轻链引物R2组成)进行PCR扩增，依次获得编码重链的片段和编码轻链的片段。引物序列如下：
重链引物F2：5’-ATGGAATGGACCTGGGTCTTTCT-3’；
重链引物R2：5’-CTTGACCAGGCATCCTAGAGTCA-3’；
轻链引物F2：5’-ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3’；
轻链引物R2：5’-GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3’。
PCR反应条件：98℃预变性2min；98℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
4.3.2测序
分别将编码重链的片段和编码轻链的片段进行测序。测序结果如下：抗人CD358的单克隆抗体3E3的重链可变区(VH)的核苷酸序列和氨基酸序列见图5，第1-19位为信号肽，第20-139位氨基酸残基为成熟的VH序列。抗人CD358的单克隆抗体3E3的VH的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示(不包括编码信号肽的核苷酸序列)，氨基酸序列如SEQ ID No.2(不包括信号肽的氨基酸序列)。SEQ ID No.2的第26位－第36位所示的氨基酸序列为VH的CDR1的氨基酸序列，第51位－第58位所示的氨基酸序列为VH的CDR2的氨基酸序列，第97位－第109位所示的氨基酸序列为VH的CDR3的氨基酸序列。抗人CD358的单克隆抗体3E3的轻链可变区(VL)的核苷酸序列和氨基酸序列见图6，第1-19位氨基酸残基为信号肽，第20-128位氨基酸残基为成熟的VL序列。抗人CD358的单克隆抗体3E3的VL的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示(不包括编码信号肽的核苷酸序列)，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示(不包括信号肽的氨基酸序列)。SEQ ID No.4的27位－第37位所示的氨基酸序列为VL的CDR1的氨基酸序列，第55位－第57位所示的氨基酸序列为VL的CDR2的氨基酸序列，第94位－第99位所示的氨基酸序列为VL的CDR3的氨基酸序列。
实施例2、抗人CD358的单克隆抗体3E3特异识别滤泡树突状细胞
1、抗人CD358单克隆抗体3E3的制备与纯化
采用体内诱生法，将BALB/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞系3E3细胞5×106个/只，7-10天后采集腹水。利用Protein G(Pierce，89957)进行腹水纯化，得到抗人CD358单克隆抗体3E3，小瓶分装，-20℃保存。
2、抗人CD358单克隆抗体3E3可以结合人CD358
(1)流式细胞分析显示抗人CD358单克隆抗体3E3可以结合过表达在HEK293T/pIRES2-EGFP-CD358细胞表面的人CD358蛋白。具体流式细胞染色方法同实施例1杂交瘤细胞的筛选。具体的结果详见图2中A。其中，Isotype(mIgG2a，Biolegend，400224)，抗人CD358单克隆抗体2E8为Li J.等人文章(Protein Cell.2016Apr；7(4):291-294.)中用到的单克隆抗体。
(2)抗人CD358单克隆抗体3E3识别不同糖基化大小的人CD358蛋白。用pIRES2-EGFP-CD358转染HEK293T细胞，48小时后收集细胞。将细胞分别与抗人CD358单克隆抗体3E3和2E8抗体在冰上孵育标记30分钟后,洗掉多余抗体后裂解细胞，加入protein G沉淀抗体和与抗体结合的蛋白。图2中B为利用抗CD358-C段蛋白的兔多抗进行检测的结果,提示3E3和2E8抗体均能识别CD358的两条分子量不同的条带。
(3)ELISA结果显示抗人CD358单克隆抗体3E3可以结合人CD358，具体实验步骤如下：稀释人CD358蛋白(Sino Biological，10175-H08H)到浓度为5μg/ml，包被ELISA板子，100μL/孔，4℃过夜；用含0.05％Tween-20(Sigma)的PBST洗板3次，200μL/孔；用含0.1％BSA的封闭液进行封闭，200μL/孔，室温静置1h；用含0.05％Tween-20(Sigma)的PBST洗板3次，加入用封闭液稀释的不同浓度抗体100μL/孔，室温放置摇床作用1h；用含0.05％Tween-20(Sigma)的PBST洗板3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(中山金桥)室温放置摇床作用1h，用含0.05％Tween-20(Sigma)的PBST洗板5次，加入底物显色，室温放置5min，孔内液体颜色变深蓝色即可中止，450nm检测OD值。
3、抗人CD358单克隆抗体3E3能够做免疫组化，识别滤泡网状结构；而抗人CD358单克隆抗体2E8则不能识别滤泡网状结构。
免疫组化具体步骤如下：
(1)将人扁桃体石蜡片子脱蜡和水化处理：二甲苯中浸泡两次每次10分钟，然后无水乙醇中浸泡5分钟，然后95％乙醇中浸泡5分钟，然后75％乙醇中浸泡5分钟。
(2)PBS洗3次各5分钟。
(3)3％H2O2(80％甲醇稀释)处理，室温静置10分钟。
(4)PBS洗3次各5分钟。
(5)抗原修复，微波炉加热：在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)至沸腾后将组织放入，断电，间隔5分钟，反复3次。室温平衡20分钟。
(6)PBS洗3次各5分钟。
(7)滴加10％正常山羊血清封闭液，室温30分钟，甩去多余液体。
(8)滴加一抗3E3或2E8，室温静置1小时或4℃过夜。
(9)PBS洗3次每次5分钟，如果4℃过夜后需在室温复温30分钟。
(10)滴加羊抗鼠二抗(中山金桥),室温30分钟。
(11)PBS洗5次各5分钟。
(12)DAB显色1-10分钟，在显微镜下掌握染色程度。
(13)自来水冲洗0.5分钟。
(14)苏木精复染1分钟。
(15)自来水冲洗0.5分钟。
(16)脱水、透明：先75％乙醇中浸泡3分钟，然后95％乙醇中浸泡3分钟，然后无水乙醇中浸泡3分钟，然后二甲苯中浸泡3分钟，换二甲苯中浸泡3分钟，换二甲苯中浸泡3分钟
(17)中性树胶封片，镜检。
免疫组化结果详见图3，抗人CD358单克隆抗体3E3能够做免疫组化，识别滤泡网状结构；而抗人CD358单克隆抗体2E8则不能识别滤泡网状结构。
4、抗人CD358单克隆抗体识别人CD358与人CD21共定位
免疫组织荧光具体步骤如下：
(1)将人扁桃体石蜡片子，如实施例2处理，然后分别加入抗人CD358单克隆抗体3E3或抗人CD358单克隆抗体2E8和抗人CD21抗体(DAKO,M0784，Clone 1F8，mIgG1亚型)，室温孵育1h或者4℃过夜。
(2)PBS洗3次各5分钟。
(3)A549标记的羊抗小鼠IgG2a(Thermo Fisher，A-21135)和AF488标记的羊抗小鼠IgG1(Thermo Fisher，A-21121)，室温孵育1h。
(4)PBS洗3次各5分钟。
(5)H2O冲洗，凉干。
(6)加甘油缓冲液，封片、镜检。
免疫组织荧光结果详见图4，抗人CD358单克隆抗体3E3识别的人CD358与人CD21共定位，说明抗人CD358单克隆抗体3E3能识别FDC。
以上对本发明进行了详述。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 广东旋玉健康生物科技有限公司
<120> 抗人CD358的一种单克隆抗体及其用途
<130> GNCFH181826
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caggttcagc tgcagcagtc tggaactgaa ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60
tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt agctactgga tagagtggat aaggcagagg 120
cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtag ttctaactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct atcactgtgc aagggattac 300
tacggtctta gcatcgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Ile Arg Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Leu Ser Ile Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatgttttgc tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gaacattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaagggtc acatgttcca 300
ttcacgtcgg ctcgggacaa aggtaat 327
<210> 4
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Val Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Ser Ala Arg Asp Lys Gly Asn
100 105

Claims (9)

1.抗人CD358的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于：所述单克隆抗体或其抗原结合部分含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区，所述VH和VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述VH和所述VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第26-36位所示；
所述VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第51-58位所示；
所述VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第97-109位所示；
所述VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第27-37位所示；
所述VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第55-57位所示；
所述VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第94-99位所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于：所述VH和VL的框架区均来源于小鼠。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于：所述VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；所述VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。
4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于：所述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体。
5.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于：所述单克隆抗体是下述任一种：
a）由权利要求1或2所述的VH和权利要求1或2所述的VL连接得到的单链抗体；
b）含有a）所述单链抗体的融合抗体；
c）含有权利要求1或2所述的VH和权利要求1或2所述的VL的Fab；
d）含有权利要求1或2所述的VH和权利要求1或2所述的VL的完整抗体；
e）由保藏号为CGMCC No.16219 的杂交瘤细胞系3E3产生的单克隆抗体。
6.与权利要求1-5中任一权利要求所述的单克隆抗体或其抗原结合部分相关的生物材料，所述生物材料为B1）至B12）中的任一种：
B1）编码权利要求1-5中任一权利要求所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体；
B4）含有B2）所述表达盒的重组载体；
B5）含有B1）所述核酸分子的重组微生物；
B6）含有B2）所述表达盒的重组微生物；
B7）含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B8）含有B4）所述重组载体的重组微生物；
B9）含有B1）所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10）含有B2）所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11）含有B3）所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12）含有B4）所述重组载体的转基因动物细胞系。
7.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于：B1）所述核酸分子为编码权利要求1-5中任一权利要求所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的基因。
8.根据权利要求7所述的生物材料，其特征在于：所述基因为如下A）或B）所述的DNA分子：
A）所述VH的CDR1的编码序列如SEQ ID No.1的第76-108位所示，所述VH的CDR2的编码序列如SEQ ID No.1的第151-174位所示，所述VH的CDR3的编码序列如SEQ ID No.1的第289-327位所示；所述VL的CDR1的编码序列如SEQ ID No.3的第79-111位所示，所述VL的CDR2 编码序列如SEQ ID No.3的第163-171位所示，所述VL的CDR3的编码序列如SEQ ID No.3的第280-297位所示；
B）与A）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述单克隆抗体或其抗原结合部分的DNA。
9.权利要求1-5中任一权利要求所述的单克隆抗体或其抗原结合部分或权利要求6-8中任一权利要求所述的生物材料在制备识别滤泡树突状细胞试剂或试剂盒中的应用。
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