KR101988216B1

KR101988216B1 - 상아모세포 표면에 특이적으로 결합하는 IgG 타입 단일 클론 항체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101988216B1
Application number: KR1020170164380A
Authority: KR
Inventors: 장영주; 강경정
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2017-12-01
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2019-06-12
Also published as: KR20190064990A

Abstract

본 발명은 치수 줄기세포에서 분화된 상아모세포 표면에 특이적으로 결합하는 IgG 타입 단일 클론 항체 및 이를 이용한 상아모세포 분화 확인, 상아모세포 분리, 상아모세포 분화 촉진 물질의 스크리닝용 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 상아모세포에 특이적으로 결합하는 IgG 단일 클론 항체를 이용하는 경우, 조직 재생 및 분화에 유용하게 사용될 수 있는 상아모세포를 효과적으로 분리, 정제할 수 있고, 상기 IgG 단일 클론 항체는 치수줄기세포를 상아모세포로 효과적으로 분화 촉진시키는 물질의 스크리닝에도 유용하게 사용할 수 있다.

Description

상아모세포 표면에 특이적으로 결합하는 IgG 타입 단일 클론 항체 및 그의 용도 {Monoclonal IgG type antibody specific binding odontoblasts surface and uses thereof}

본 발명은 치수 줄기세포에서 분화된 상아모세포의 표면에 특이적으로 결합하는 IgG 타입 단일 클론 항체 및 이를 이용한 상아모세포 분화 확인, 상아모세포 분리, 상아모세포 분화 촉진 물질의 스크리닝용 조성물 및 방법에 관한 것이다.

인간유래 치수줄기세포 (human dental pulp stem cells; hDPSCs)는 치아의 내부에 있는 치수 조직에서 얻을 수 있다. 치수줄기세포는 중간엽 줄기세포 (MSC)와 같은 다분화능을 가지는 세포로써 치아를 이루는 상아질 이외에 뼈조직, 혈관, 치수 결체조직 및 신경 등으로 분화될 수 있다.

한편, 치아에서는 상아 전구세포에서 치아 발생 (odontogenesis)을 통해 상아질을 만든다. 상아질은 법랑질, 백악질과 함께 치아를 구성하고 있는 고도로 석회화된 경조직들 중 하나이다. 상아질은 상아질 모세포라는 전구세포가 유리하는 신호분자와 단백질에 의해 주변 기질의 석회화를 유도함으로써 형성된다. 그러나 충치나 외상 등에 의해 이들 조직에 손상이 생길 경우 재생되기 매우 어려우므로 현재 치과적인 치료법은 치아 경조직과 유사한 물성을 지닌 치과용 재료로 치아를 충전하는 방식에 의하고 있다. 따라서 상아질로만 특정하게 분화될 수 있는 상아 전구세포를 치수줄기세포로부터 얻기 위한 최적의 분화 조건에 대한 연구의 필요성이 있다.

현재 치수줄기세포에서 상아 전구세포로의 분화를 유도하기 위한 유도 과정에는 주로 TGF-β 패밀리에 속하는 10여 가지의 사이토카인들이 관여할 가능성이 있다는 많은 결과들이 제시되어 있으나, 명확한 기전이 알려져 있지 않았다. 이런 이유로 현재는 임상 및 전임상 실험에서 손상된 치아 및 치아 주변 조직의 재생을 위해 대표적인 골 분화 촉진 인자로 알려진 BMP2 한가지의 인자만을 이용하고 있는 상황이다.

BMPs는 TGF-β 패밀리에 속하며 치수 재생 과정에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. TGF-β 패밀리에는 BMP 외에도 FGF-2 또는 TGFβ-1이 있으며, 이들이 치아 및 골재생에 관여할 가능성은 알려져 있으나, 주요 분화 인자 및 효율적인 분화 조건은 아직 확립되어 있지 않다. 즉, 인간 치아 내 치수조직으로부터 일차 배양된 인간 치수줄기세포를 상아질로 효율적으로 분화될 수 있는 상아질 전구세포로 유도 하기 위한 주요 분화 인자 및 효율적인 분화 조건은 아직 확립되어 있지 않다. 따라서 치수줄기세포에서 상아질로 분화될 수 있는 상아질 전구세포로의 효율적인 분화를 위한 연구가 필요한 상황이다.

또한 이와 같이 치수줄기세포에서 상아모세포로 효과적으로 분화시키더라도 이를 분리 정제하여 실제 이용하는 데에는 어려움이 있어왔다. 현재 상아모세포는 세포질 또는 세포외기질 특이적인 2-3종의 단벡질들이 특이 마커로 밝혀져 있으나 이를 이용하여 상아모세포를 효과적으로 분리 정제하는 것은 한계가 있어, 상아모세포를 조직 재생 및 분화에 이용하기에는 어려운 실정이다. 따라서 상아모세포를 효과적으로 분리, 정제 할 수 있는 세포 표면 발현 항원에 대한 연구의 필요성이 있으며, 나아가 이를 이용하여 상아모세포를 분리하기 위한 연구에 대한 필요성이 절실하다.

본 발명자는 상아모세포를 효과적으로 분리 정제하기 위한 연구를 계속하던 중, 상아모세포 표면에 특이적으로 결합하는 항체를 확인하고 이를 이용하는 경우 상아모세포를 효과적으로 분리 정제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 총 12 종의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체 및 이를 이용한 분화된 상아모세포 확인, 상아모세포 분리용 조성물, 키트 및 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또다른 목적은 미분화된 치수 줄기세포로부터 상아모세포로 분화를 촉진시키는 분화 촉진 물질 스크리닝용 조성물, 키트 및 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 총 12 종의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 12 종의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 12 종의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 포함하는 분화된 상아모세포 확인용 조성물 및 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 12 종의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 시료에 처리하는 단계; 를 포함하는 분화된 상아모세포 확인 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 12 종의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 포함하는 상아모세포 분리용 조성물 및 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 a) 상기 12 종의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 단일 클론 항체를 시료에 처리하는 단계; 및 b) 상아모세포와 결합된 항체를 분리하는 단계; 를 포함하는 상아모세포 분리 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 12 종의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 포함하는, 미분화된 치수 줄기세포를 상아모세포로 분화 촉진시키는 분화 촉진 물질 스크리닝용 조성물 및 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 a) 미분화된 치수 줄기세포에 상기 12종의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 처리하는 단계; b) 미분화된 치수 줄기세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 c) 상기 12종의 IgG 단일 클론 항체를 시료에 처리하여 결합 반응을 상기 a) 단계와 비교하는 단계; 를 포함하는 미분화된 치수 줄기세포를 상아모세포로 분화시키는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 상아모세포 표면에 특이적으로 결합하는 IgG 단일 클론 항체를 이용하는 경우, 조직 재생 및 분화에 유용하게 사용될 수 있는 상아모세포를 효과적으로 분리, 정제할 수 있고, 상기 IgG 단일 클론 항체는 치수줄기세포를 상아모세포로 효과적으로 분화 촉진시키는 물질의 스크리닝에도 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 rhBMP2 및 rhBMP4의 처리에 의하여 분화된 상아모세포와 hDPCs 에서 마커 발현의 차이를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본원 발명에 따른 상아모세포 특이적 항체 제조 방법을 간략하게 나타낸 도이다.
도 3은 IgG 타입의 항체 12 종이 인간 치수 줄기세포 (hDPSC) 대비 상아모세포 (Odontoblast) 표면에 잘 결합하는지를 확인하기 위한 유세포 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 상아모세포 특이적 IgG 타입 항체의 서열정보를 나타낸 도이다.
도 5 는 본 발명의 OD40, OD46, OD82B, OD142B, OD142D, OD149A, OD218A, OD218B, OD228, OD238, OD243A, OD256 의 치수조직 및 상아모세포 결합능 및 결합 위치를 확인한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 제공한다.

본 발명에 따른 IgG 단일 클론 항체는 인간 치수 줄기세포로부터 분화된 상아모세포에 특이적으로 결합할 수 있으므로, 상아모세포를 분리, 정제하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD40 IgG 항체;

b) 서열번호 7로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 8로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 9로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 10으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 11로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 12로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD46 IgG 항체;

c) 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 14로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 15로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 18로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD82B IgG 항체;

d) 서열번호 19로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 20으로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 21로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 22로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 23으로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 24로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD142B IgG 항체;

e) 서열번호 25 로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 26으로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 27로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 28로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 29로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 30으로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD142D IgG 항체;

f) 서열번호 31로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 34로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 35로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 36으로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD149A IgG 항체;

g) 서열번호 37로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 38로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 39로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 40으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 41로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 42로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD218A IgG 항체;

h) 서열번호 43으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 44로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 45로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 46으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 47로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 48로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD218B IgG 항체;

i) 서열번호 49로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 50 으로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 51 로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 52 로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 53으로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 54로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD228 IgG 항체;

j) 서열번호 55로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 56으로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 57로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 58 로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 59로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 60으로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD238 IgG 항체;

k) 서열번호 61로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 62로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 63으로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 64 로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 65로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 66으로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD243A IgG 항체; 및

l) 서열번호 67으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 68로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 69로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 70으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 71로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 72로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD256 IgG 항체; 로 이루어진 군에서 선택된 1종의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 제공한다.

본 발명에 있어, "상아모세포 (odontoblasts)" 란, 치수 전구세포로부터 분화된 세포로 치수의 주변부에 한 층의 세포층을 구성하는 원주 모양의 세포를 말한다. 상아모세포는 기능적으로 치아의 주된 구성 성분인 상아질을 직접적으로 만드는 역할을 하며, 이 세포 자체는 상아질 내측에 존재하는 치수(pulp) 조직의 한 구성성분으로 치아 내부의 치수강 벽에 배열되어 존재한다.

본 발명에서 치수줄기세포(dental pulp stem cell)는 치계 (dental origin) 중간엽 줄기세포의 일종으로, 상기 치계 중간엽 줄기세포는 '치계 상피세포의 영향을 받은 (일부분의) 줄기세포들을 의미하며, 중배엽성 기원으로 치아내부의 치수와 치아 주위조직에 분포하는 줄기세포를 말한다. 예컨대 치수줄기세포(dental pulp stem cell (DPSC)), 탈락 유치 줄기세포(stem cell from exfoliated deciduous teeth (SHED)), 치주 인대 줄기세포(periodontal ligament stem cells (PDLSC)), 치근단 유두 줄기세포(stem cell from the apical papilla (SCAP), 및 치배 줄기세포(dental follicle precursor cells (DFPC))가 있다.

본 발명에서 치수줄기세포는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간 유래의 세포일 수 있다.

본 발명의 치수줄기세포는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 이종(xenogenic) 세포일 수 있다.

치수줄기세포는 치아내부의 치수와 치아 주위 조직에 존재하고, 이를 분리 및 배양하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명의 "상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체" 는 치수 줄기세포로부터 분화된 상아모세포의 표면에만 특이적으로 발현하는 인자들에 결합하는 항체이며, 상기와 같이 정의된 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 의미한다.

본 발명의 항체는 분화 유도된 상아모세포를 면역원으로 이용하는 미끼 면역법 (Decoy immunization) 을 수행하여 수득될 수 있으며, 미끼 면역법을 통해 분화된 상아모세포의 표면에만 발현하는 분자들에 대한 단일클론 항체를 얻을 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 방법을 통해 수득된 총 12종의 IgG 단일클론 항체를 제공하며, 이는 본원 발명에서 각각 OD40, OD46, OD82B, OD142B, OD142D, OD149A, OD218A, OD218B, OD228, OD238, OD243A, OD256으로 명명된다.

본 발명에 있어 IgG 단일 클론 항체는 다음과 같은 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함한다.

OD40 IgG 항체는 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 73으로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 74로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 OD40 IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 97로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 98로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 할 수 있다.

OD46 IgG 항체는 서열번호 7로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 8로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 9로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 10으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 11로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 12로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 75로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 76으로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 OD46 IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 99로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 100으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 할 수 있다.

OD82B IgG 항체는 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 14로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 15로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 18로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 77로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 78로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 OD82B IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 101로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 102로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 할 수 있다.

OD142B IgG 항체는 서열번호 19로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 20으로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 21로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 22로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 23으로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 24로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 79로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 80으로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 OD142B IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 103으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 104로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 할 수 있다.

OD142D IgG 항체는 서열번호 25 로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 26으로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 27로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 28로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 29로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 30으로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 81로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 82로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 OD142D IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 105로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 106으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 할 수 있다.

OD149A IgG 항체는 서열번호 31로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 34로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 35로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 36으로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 83으로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 84로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 OD149A IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 107로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 108로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 할 수 있다.

OD218A IgG 항체는 서열번호 37로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 38로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 39로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 40으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 41로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 42로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 85으로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 86으로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 OD218A IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 109로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 110으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 할 수 있다.

OD218B IgG 항체는 서열번호 43으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 44로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 45로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 46으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 47로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 48로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 87로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 88로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 OD218B IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 111로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 112로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 할 수 있다.

OD228 IgG 항체는 서열번호 49로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 50 으로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 51 로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 52 로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 53으로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 54로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 89 로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 90으로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 OD228 IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 113로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 114로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 할 수 있다.

OD238 IgG 항체는 서열번호 55로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 56으로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 57로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 58 로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 59로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 60으로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 91 로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 92 로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 OD238 IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 115로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 116으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 할 수 있다.

OD243A IgG 항체는 서열번호 61로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 62로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 63으로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 64 로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 65로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 66으로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 93으로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 94 로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 OD243A IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 117로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 118로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 할 수 있다.

OD256 IgG 항체는 서열번호 67으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 68로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 69로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 70으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 71로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 72로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 95로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 96 으로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 OD256 IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 119로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 120으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 항체의 서열은 상아모세포 특이적 결합이라는 본원 발명의 목적을 달성할 수 있는 한 당 분야의 통상의 기술자의 기술적 상식에 따라 변화, 예컨대 보존적 치환될 수 있으며, 이를 통해 수득되는 이와 80 내지 99%의 서열 상동성, 바람직하게는 85 내지 99%, 더욱 바람직하게는 90 내지 99%의 상동성을 갖는 폴리펩티드를 모두 포함할 수 있다.

용어 “보존적 치환”은 한 부류의 아미노산이 동일한 부류의 다른 아미노산으로 대체되는 것을 말한다. 보존적 치환은 폴리펩티드의 구조 또는 기능 또는 둘 모두를 변경시키지 않는다. 보존적 치환의 목적을 위한 아미노산의 부류는 소수성(예를 들어, Met, Ala, Val, Leu), 중성 친수성(예를 들어, Cys, Ser, Thr), 산성 (예를 들어, Asp, Glu), 염기성(예를 들어, Asn, Gln, His, Lys, Arg), 입체형태 파괴물질(disrupter)(예를 들어, Gly, Pro) 및 방향족(예를 들어, Trp, Tyr, Phe)을 포함한다.

또한 본 발명의 IgG 단일 클론 항체는 분화된 상아모세포 표면 특이적 결합이라는 본원 발명 항체의 목적을 달성할 수 있는 한, 서열번호 1 내지 96으로 표시되는 각각의 CDR 영역, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 암호화하는 다양한 서열에 의해 암호화 될 수 있고, 특히 바람직하게는 각각의 서열번호 97 내지 120 으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이와 동등한 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 80 내지 99% 상동성, 90 내지 99% 상동성, 95 내지 99% 상동성을 갖는 염기서열에 의하여 암호화 될 수 있다.

본 발명의 IgG 단일 클론 항체는 분화된 상아모세포에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 예컨대 BMP2(bone morphogenetic protein 2) 및 BMP4(bone morphogenetic protein 4) 처리에 의하여 치수 줄기세포로부터 상아모세포로 분화된 세포에 특이적으로 결합할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 단일 클론 항체는 당해 분야에 공지된 방법에 의하여 제조될 수 있다. 일례로서, 화학적 펩티드 합성방법으로 제조할 수도 있고, 상기 단클론 항체를 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수도 있으며, 상기 단클론 항체의 면역원을 동물에 주사하여 얻어진 림프구로부터 유래된 하이브리도마 세포주를 사용하여 제조할 수도 있고, 다른 예로서, 분화된 상아모세포를 면역원으로 동물에 접종하고, 상기 동물로부터 얻어진 림프구를 사용하여 제작된 하이브리도마 세포주를 사용하여 제조할 수 있다.

따라서 본 발명은 IgG 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.

상기 하이브리도마 세포주란 2개의 다른 종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 세포로, 폴리에틸렌글리콜 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 어떤 종의 바이러스를 사용하여 둘 이상의 동종 세포나 이종 세포가 융합되어, 각기 다른 세포가 갖는 다른 기능을 하나의 세포 속에 통합시킨 세포 또는 세포주를 의미한다. 특히, 골수종 세포(myeloma cell)와 비장이나 림프절에 들어 있는 림프구 가운데 항체 생성세포의 선구세포인 B세포를 융합시킨 잡종세포는 단일 클론항체를 만들어내므로 연구와 임상에 널리 응용된다. 그 밖에 림포카인(생리활성물질)을 만들어내는 T세포와 그 종양세포인 하이브리드마 등도 실용화되고 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 바람직하게는 상아모세포가 면역화된 림프구와 골수종 세포가 융합된 세포일 수 있으며, 분화된 상아모세포에 특이적으로 결합하는 IgG 단일 클론 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주를 제한없이 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 IgG 단일 클론 항체를 포함하는 분화된 상아모세포 확인용 조성물 및 키트를 제공한다.

본 발명의 IgG 단일 클론 항체는 상아모세포, 바람직하게는 치수 줄기세포로부터 분화된 상아모세포에 특이적으로 결합하는 항체로, 분화 전의 치수 줄기세포 대비 상아모세포의 표면에 더 효과적으로 결합할 수 있다. 따라서 본 발명의 IgG 단일 클론 항체를 이용하면 시료 내 전구세포가 상아모세포로 분화되었는지 여부를 효과적으로 확인 및 판별할 수 있다.

이와 같은 분화 확인 및 판별을 위하여 본 발명의 항체는 구별가능한 표지물질로 표지될 수 있으며 상기 표지물질은 상기 단일 클론 항체에 결합되어 목적하는 표면 항원이 발현된 분화된 상아모세포를 구별 또는 분리하는데 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다. 예컨대 리간드, 비드(bead), 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광물질(fluorescer), 화학발광물질, 자성 입자, 합텐, 염료 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 바이오틴, 아비딘, 스트렙토아비딘 등의 리간드; 루시퍼라아제, 퍼옥시다아제, 베타 갈락토시다아제 등의 효소; 플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인, 핵사크로로-6-카르복시플루오레세인, 테트라크로로-6-카르복시플루오레세인, VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노 나프탈렌-1-술폰산, 쿠마린 및 이의 유도체, 시아닌-5, 루시퍼 옐로우, 텍사스 레드, 테트라메틸로다민, 야키마 옐로우, 칼 플루오르레드 610, 쿠마린, 이들의 유도체 등의 형광물질 등이 상기 표지물질에 제한없이 포함될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 IgG 단일 클론 항체를 시료에 처리하는 단계; 를 포함하는 분화된 상아모세포 확인 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 따르면 본 발명의 IgG 단일 클론 항체가 상아모세포 표면에 발현되는 특이적 항원에 결합하는 성질을 이용하여 치수 줄기세포가 상아모세포로 분화되었는지 여부를 용이하게 확인할 수 있다.

예컨대 본 발명의 IgG 단일 클론 항체는 검출을 위해 표지될 수 있으며, 시료 내 존재하는 치수 줄기세포가 상아모세포로 분화 유도된 경우 상아모세포에 결합된 IgG 단일 클론 항체의 표지 검출을 통해 분화된 상아모세포를 확인할 수 있다. 이 경우 본원 발명의 방법은 a) IgG 단일 클론 항체를 시료에 처리하는 단계; 및 b) 시료 내 세포와 결합된 IgG 단일 클론 항체를 검출하는 단계; 를 포함할 수 있다.

만약 분화되기 전 세포, 예컨대 치수 줄기세포를 포함하는 시료에서 검출되는 결합된 IgG 단일 클론 항체와 분화 유도 처리된 시료에서 검출되는 결합된 IgG 단일 클론 항체를 비교하여 분화 유도 처리된 시료에서 검출되는 결합된 IgG 단일 클론 항체의 함량이 증가한 경우, 치수 줄기세포가 상아모세포로 분화되어, 분화된 상아모세포가 시료에 존재함을 확인할 수 있다.

또한 본 발명은 IgG 단일 클론 항체를 포함하는 상아모세포 분리용 조성물 및 키트를 제공한다.

본 발명의 IgG 단일 클론 항체는 분화된 상아모세포를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 이를 이용하여 상아모세포를 시료, 예컨대 미분화된 치수 줄기세포와 혼재되어 있는 시료로부터 효과적으로 분리할 수 있다.

또한 본 발명은 a) 본 발명의 IgG 단일 클론 항체를 시료에 처리하는 단계; 및 b) 상아모세포와 결합된 항체를 분리하는 단계; 를 포함하는 상아모세포 분리 방법을 제공한다.

상아모세포와 결합된 항체를 분리하는 단계는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 수행될 수 있는데, 일 예로서, 유세포분석법, 면역침전법, 자기활성세포분리법, 크로마토그래피법 등을 사용할 수 있고, 다른 예로서, 형광물질로 표지된 조성물을 사용한 유세포분석법, 금 입자와 결합된 제제를 포함하는 조성물을 사용한 면역침전법, 자성 비드와 결합된 조성물을 사용한 자성분리법, 상기 제제와 결합된 비드가 충진된 컬럼을 이용한 크로마토그래피법 등을 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 IgG 단일 클론 항체를 포함하는, 미분화된 치수 줄기세포를 상아모세포로 분화 촉진시키는 분화 촉진 물질 스크리닝용 조성물 및 키트를 제공한다.

본 발명의 IgG 단일클론 항체는 분화된 상아모세포에 특이적으로 결합할 수 있으므로, 분화 촉진 후보 물질 처리 전의 결합 정도, 분화 촉진 후보 물질 처리 후의 결합 정도를 비교하는 데 사용되어 미분화된 치수 줄기세포를 상아모세포로 분화 촉진시키는 분화 촉진 물질의 스크리닝에 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 a) 미분화된 치수 줄기세포에 본 발명의 IgG 단일 클론 항체를 처리하는 단계; b) 미분화된 치수 줄기세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및 c) 본 발명의 IgG 단일 클론 항체를 시료에 처리하여 결합 반응을 상기 a) 단계와 비교하는 단계; 를 포함하는 미분화된 치수 줄기세포를 상아모세포로 분화시키는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 키트는 조성물의 제제가 고정된 기판 및 상기 IgG 단일 클론 항체에 특이적이고 형광물질이 결합된 2차 항체를 포함하는 면역형광법 키트가 될 수 있다. 다른 예로서, 상기 키트는 상기 조성물의 제제가 결합된 비드, 상기 비드가 충진될 수 있는 컬럼 및 전개용 완충액을 포함하는 크로마토그래피 키트가 될 수 있다. 또 다른 예로서, 상기 키트는 상기 조성물의 제제가 결합된 바이오틴, 자성비드가 결합된 스트렙타비딘 및 자성 발생장치를 포함하는 MACS 키트가 될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 상아모세포 특이적 단일클론 항체의 수득

인간 치수 세포 (human dental pulp stem cells; hDPCs) 의 일차배양을 위해, 단국대학교 치과대학병원의 IRB의 심의를 거쳐 성인환자 (20-27세)에서 제공받은 사랑니를 이용하였다. 인간 치수 조직은 치아를 절단하여 그 안에 들어있는 조직을 추출하여 얻었고, 잘게 자른 후, 3 mg/ml 콜라게나아제 1 형 (collagenase type I, Millipore), 4 mg/ml 디스파아제(dispase, Sigma-Aldrich)을 37℃ 에서 1시간 동안 처리하여 단일세포로 분리하였다 (Choi et al., 2015; Min et al., 2011). 분리된 단일 세포들은 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 20% 우태아 혈청 (FBS, Hyclone)과 항생제 (Lonza)가 첨가된 α-MEM (Hyclone)에 배양하였다. 인간 치수 유래 줄기세포를 상아모세포 (Odontoblast) 로 분화시키기 위해 10% FBS가 첨가된 α-MEM에서 배양된 hDPCs에 rhBMP2 (Sino Biological) 100ng/ml과 rhBMP4 (Prospec) 10ng/ml 를 동시에 처리하여 7일 동안 추가 배양하였다. rhBMP2 및 rhBMP4의 처리에 의하여 hDPCs는 상아모세포 (odontoblast)로 효과적으로 분화됨을 확인하였다. 또한 rhBMP2 및 rhBMP4의 처리에 의하여 분화된 상아모세포에서 hDPCs 과 비교하여 현저히 높은 발현량을 보이는 마커를 확인하였으며 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, rBMP2를 100 ng/ml, rBMP4를 10 ng/ml 처리하는 경우의 상아모세포 (odontoblast) 에서는 인간 치수 세포 (hDPCs) 와 비교하여 Runx2, osteopontin, osterix, BSP, DMP1, DSPP 유전자의 발현이 유의적으로 높게 발현함을 확인하였다.

분화된 상아모세포의 표면에만 발현하는 분자들에 대한 단일클론 항체를 얻기 위하여, 수득된 상아모세포를 면역원으로 이용하여 미끼 면역법 (Decoy immunization) 을 수행하였다. 음성 대조군 세포로는 분화시키지 않은 hDPCs를 이용하였다. 보다 구체적으로 배양기에서 배양된 세포들을 Enzyme Free Cell Dissociation Solution (Millipore)를 사용하여 떼어낸 후 약 5×10⁵개의 세포를 PBS 30μl에 부유하여 10마리의 6주령 Balb/c 마우스 (DBL)의 뒷 발바닥에 주사하였다. 이전에 보고된 방법을 참고하여 (Yin et al., 1997), 먼저 음성 대조군인 hDPCs를 오른쪽 뒷 발바닥에 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24일에 주사하여 면역반응을 유도하였고, 분화유도된 상아모세포(odontoblast)는 왼쪽 뒷 발바닥에 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24일에 주사하여 면역반응을 유도하였다. 24일째에, 왼쪽 오금에서 림프절을 추출하였고, 추출된 림프구는 (상아모세포가 면역화된 림프구; 8×10⁷세포/10마리) 골수종 세포 (ATCC)와 세포융합하도록 하였다. 융합된 하이브리도마 세포는 96-well plate에 20% FBS (Hyclone), HFCS (Roche), HAT (Sigma-Aldrich)가 첨가된 DMEM 배지와 함께 분주하였다 (Kohler and Milstein, 1975). 하이브리도마 배양 배지를 모아 항체 생산여부 및 상아모세포와의 결합 여부를 검증하기 위해 ELISA와 유세포 분석기를 이용하였다. 미끼 면역법을 이용하여 분화 유도된 상아모세포 표면에만 특이적으로 발현하는 인자에 결합하는 항체를 수득하기 위한 과정을 도 2에 간략히 나타내었다.

실시예 2. 단일 클론 항체 정제

실시예 1 을 통해 제조된 단일 클론 항체를 하이브리도마를 배양한 배지를 이용한 컬럼 크로마토그래피 (column chromatograph) 를 이용하여 정제하였다. IgG 타입 단일 클론 항체를 정제하기 위해 Protein G agarose (Incospharm) column을, IgM 타입 단일 클론 항체를 정제하기 위해 Protein L Agarose (Thermo) column을 이용하였다. 배지를 흘려보낸 후 PBS로 아가로오스를 세척하였고, 결합된 IgG, IgM 단일 클론 항체는 100mM 글리신 완충액 (pH 2.8)으로 용출한 후 즉시 1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0)를 첨가하여 중화하였다. PBS로 투석한 후 항체농도를 결정하였다.

2.1 단일 클론 항체의 isotyping 분석

정제한 단일 클론 항체의 면역 isotype을 결정하기 위해서, 96-well plate에 anti-mouse IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA, Igκ, Igλ로 먼저 코팅한 후, 10% FBS가 포함된 PBS로 차단하였다. 각 하이브리도마를 키운 배지 또는 정제된 단일 클론 항체를 첨가한 후 일정 시간 반응시키고, 이차 항체와 이어 반응 시켰다. 이차항체로는 horseradish peroxidase가 결합되어있는 항체를 사용하였으며, 450nm 파장에서 반응 여부를 확인하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1]

표 1에 나타낸 바와 같이 최종적으로 OD40, OD46, OD82B, OD142B, OD142D, OD149A, OD218A, OD218B, OD228, OD238, OD243A, OD256과 같은 IgG 타입 12종의 항체를 수득하였음을 확인하였다.

2.2 유세포 분석에 의한 항체 결합 친화도 측정

실시예 1을 통해 제조된 항체가 hDPCs 와 상아모세포 표면 중 상아모세포에서 더에 잘 결합하는지 여부를 확인하기 위한 세포-항체 반응에 대한 유세포 분석을 수행하였다. 보다 구체적으로 Enzyme Free Cell Dissociation Solution (Millipore)를 첨가하여 10분 동안 배양한 후 배양 접시에서 떼어 수집하였다. hDPSC 및 상아모세포를 약 3x10⁴개씩 나누어 1% BSA (GeneDEPOT)가 첨가된 PBS로 재현탁 한 후, 정제된 단일클론 항체 또는 하이브리도마 배양 배지를 첨가하여 1시간 동안 얼음 상에서 반응하였다. 세척 후, 2차 항체로써 FITC-conjugated anti-mouse IgG (1:100, Santa Cruz) 또는 PE-conjugated anti-mouse IgM (1:100, Santa Cruz)을 첨가하여 1시간 동안 얼음상에서 반응하였다. 세포 표면에 결합된 항체의 결합 정도는 FACS Calibur^™ (BD Biosciences)에 의해 분석하였고, Cell Quest pro와 WinMDI program을 사용하여 항체 결합 친화도를 정량화하였으며 그 결과를 도 3에 나타내었다. 대조군으로는 2차 항체만 반응시킨 세포를 사용하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, IgG 타입의 항체 12 종은 모두 hDPCs 대비 상아모세포에서 높게 발현하거나, 오직 상아모세포에서만 발현하는 항원에 결합되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 상기 12종의 단일 클론 항체들이 인간 상아모세포에 특이적으로 발현하는 표면항원에 특이적으로 결합하여 상아모세포를 순수하게 분리하는데 이용할 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 3. 항체 서열 분석

상기 실시예 1을 통해 수득한 항체의 유전자 서열을 분석하기 위하여 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 증폭하기 위한 프라이머를 Wang et al., 2000 등의 방법에 따라 합성하였다. 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다. 다른 isotype 인 경우 이에 적합한 프라이머를 합성하여 이용하였다.

[표 2]

하이브리도마 세포 (~1x10⁶세포)를 모아 total RNA를 추출하기 위해 Easy-spin^TMTotal RNA Extraction kit (Intron)을 사용하였다. cDNA는 Maxime RT-PCR PreMix Kit (Intron)를 이용하여 45 ℃에서 30분 동안 합성하였고, RT-PCR반응은 94℃에서 5분 동안 1 cycle, 94 ℃에서 1분, 45℃에서 1분, 72℃에서 1분 동안 30 cycles, 72℃에서 5분 동안 final cycle로 진행하였다. 중폭된 DNA조각은 pBluescript KS(+) vector로 클로닝하였고, 서열분석을 수행하였다. 항체의 콘센서스 도메인(consensus domain)은 Dr. Andrew C.R. Martin's Group databasedp 따라 분석하였다.

CDR 영역은 특정 항원을 인식하여 결합하는 부위로 CDR1, 2 는 가변영역(variable region, V)에서 발견되고, 중쇄의 경우 CDR3에서 일부 V영역과 다양성 영역(diversity region, D), 결합 영역(joining region, J) 들을 포함하고, 경쇄의 경우 CDR3에서V, J 영역을 포함하고 있다. 서열분석을 통해 확인된 IgG 타입 항체의 서열 정보를 도 4에 나타내었다.

또한, 이들 개별 항체들의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 염기서열을 서열번호 97 내지 120으로 나타내었다.

실시예 4. 조직면역염색 분석

각 단일 클론 항체를 대량 정제한 후, 인간 치아 내 치수 조직에서 이들 단일 클론 항체가 결합하는 항원들의 위치를 분석하기 위하여 조직 면역 염색을 수행하였다. 추출한 인간 치수 조직은 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, PFA)에 담가 고정하였고, PBS 세척 후에 30% 수크로오스에서 하루 동안 반응시켰다. 고정된 조직은 OCT compound (SAKURA)를 이용하여 블록으로 제조하였고, 10μm 두께로 section 하였다. PBS로 세척한 후, endogenous peroxidase 활성은 PBS에 희석된 0.3% H₂O₂를 첨가하여 억제하였다. 조직 절편을 차단 용액 (PBS에 serum, BSA, 0.1% tween 20이 첨가된 0.1% PBST)에서 한 시간 동안 실온에서 반응 시키고, 정제된 단일 클론항체를 16시간 동안 4℃에서 처리하였다. 0.1% PBST로 세척하고 biotin-conjugated anti-mouse IgG 을 처리한 후 한시간 동안 실온에서 반응 시키고, 30분 동안 실온에서 VECTASTAIN^® ABC Reagent를 처리하였다. 이후 DAB 기질을 첨가하면서 염색 정도를 모니터하였다. 조직 내 세포 핵은 Harris hematoxylin으로 염색하였고, 탈수 후에 Eukitt quick-harder mounting medium (Sigma-Aldrich)으로 봉입하여, 정립 현미경 (Nikon)으로 관찰하였고 그 결과를 도 5에 나타내었다. 대조군으로는 biotin-conjugated anti-mouse IgG를 사용하였다.

도 5 에 나타낸 바와 같이, 단일 클론항체는 치수조직의 변두리 부분인 상아모세포 층에 염색되는 것을 확인하였으며, 특이하게도 OD82B같은 경우는 상아모세포의 핵을 염색하는 것을 확인하였다. 또한 OD228과 OD256은 치수 줄기세포가 많이 위치하고 혈관이 위치하는 치수 코어 (pulp core) 부분에 염색이 되는 것을 확인하였다. 반면 대조군인 biotin-conjugated anti-mouse IgG으로 염색하였을 경우, 상아모세포층에서 염색을 뚜렷하게 확인하지 못했다.

상기와 같은 결과는 제조된 단일클론 항체들이 인간 상아모세포에서 특이적으로 발현하는 표면 마커를 인식하여 이를 분리하는데 사용할 수 있음을 나타내는 것이며, 이 후 이를 각종 진단용 항체로 이용될 수 있음을 나타낸다.

<110> Dankook University Cheonan Campus Industry Academic Cooperation Foundation <120> Monoclonal IgG type antibody specific binding odontoblasts surface and uses thereof <130> DANKOOK1-16p <160> 120 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OD40 Light chain CDR1 <400> 1 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser His Leu Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OD40 Light chain CDR2 <400> 2 Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OD40 Light chain CDR3 <400> 3 Gln His Phe Trp Gly Thr Leu Pro Thr 1 5 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OD40 heavy chain CDR1 <400> 4 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Gly Ile Gly Val Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OD40 heavy chain CDR2 <400> 5 His Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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cccaccgtac 300 acgttcggag ggggaccaag ctgaaataat cgggtt 336 <210> 110 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD218A heavy chain <400> 110 cttccggaat tccaggttca gctgcaggag tctggaggtg gcctggagca gcctggagga 60 tccctgaaac tctcctgtgc agcctcagga ttcgatttca gtagatactg gatgaattgg 120 gtccggcagg ctccagggaa agggctagaa tggattggag aaattaatcc agatagcagt 180 acgataaact atacgccatc tctaaaggat aaattcatca tctccagaga caacgccaaa 240 aatacgctgt acctgcaaat gagcaaagtg agatctgagg acacagccct ttattactgt 300 gcaagaccta tggggattac gaaggggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcacg 360 tctcttgca 369 <210> 111 <211> 347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD218B light chain <400> 111 gacattcagc tgacccagtc tccaaattca tgtccacatc agtaggagac agggtcagca 60 tcacctgcaa ggccagtcag gatgtgagta ctactgtagc ctggtatcaa caaaaaccag 120 gacaatctcc taaactactg atttactggg catccacccg gcacactgga gtccctgatc 180 gcttcacagg cagtggatct gggacagatt atagtctaac catcagcagt gtgcaggctg 240 aagacctggc actttattac tgtcagcaac 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atcagcagtg tacaagctga agacctggca gtttattact gtcatcaata cctctcctgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 360 360 <210> 114 <211> 346 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD228 heavy chain <400> 114 gacattcagc tgacccagtc tccagcatcc ctgtccgtgg caacaggaga aaaagtcact 60 atcagatgca taagcagcac tgatattgat gatgatatga actggtaaca gcagaagcca 120 ggggaacctc caaaactcct tatttcagag ggcaatagtc ttcgtcctgg agtcccatcc 180 cgattctcca gcagtggcta tggcacagat gttgttttta caattgaaaa aacgctctca 240 gaagatgttg cagattacta ctgtttgcaa agtgataaca tgccacacgt tcggaggggg 300 gaccaagctg gaaataaaac gggctgatgc tgcaccaact gtatcc 346 <210> 115 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD238 light chain <400> 115 tctcggaagc ttgacattca gctgacccag tctccatcct ccctggctat gtcagtagga 60 cagaaggtca ctatgagctg caagtccagt cagagccttt taaatagtag caatcaaaag 120 aactatttgg cctggtacca gcagaaacca ggacagtctc ctaaacttct ggtatacttt 180 gcatccgyta ggaaatctgg ggtccctgat cgcttcatag gcagtggatc tgggacagat 240 ttcactctta ccatcagcag tgtgcaggct gaagacctgg cagattactt ctgtcagcaa 300 cattatacca ctccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tgaatcaaag ctggatg 357 <210> 116 <211> 407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD238 heavy chain <400> 116 caagtcaagc tgcaggagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60 acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttatgata taggagtagg ctggattcgt 120 cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg tcacacattt ggtggaatga taataagtac 180 tataacacag ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctccaa caaccaggta 240 ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca gacactgcca catactactg ttctcgaata 300 ggttcctatt actatggtac tagctcccat tactatgtta tggactactg gggtcaggaa 360 cctcagtcac cgtctcctca gccaaaacga cacccccatc tgtctat 407 <210> 117 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD243A light chain <400> 117 gacattcagc tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtct ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaagcca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggaccaa 240 gaagattttg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatcc 348 <210> 118 <211> 374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD243A heavy chain <400> 118 tctttcggaa tttgaggttc agctgcagga gtctggagga ggcctggtgc aacctgggag 60 gcccatgaaa ctctcctgtg ttgcctctgg attcactttt agtgactact ggatgaactg 120 ggtccgccag tctccagaga aacgactgga gtgggtagca caaattagaa acaaaccttt 180 taattatgaa acatattatt cagattctgt gaaaggcaga ttcaccatct caagagatga 240 ttccaaaagt agtgtctacc tgcaaatgaa caacttaaga gctgaagaca tgggtatcta 300 ttactgtaca tccatagggt acgacgggtc gtttgcttac tggggccaag ggactctggt 360 cacgtctgct ggca 374 <210> 119 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD256 light chain <400> 119 gacattcagc tgacccagtc tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt caatggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagggtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttcct 300 ttcacgttcg gctcggggac agagttggaa ataaaacggg ctgatgctgc accaactgta 360 tcc 363 <210> 120 <211> 362 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OD256 heavy chain <400> 120 tcttccggaa aatcgaggtt cagctgcagg agtctggacc tgagctggta aagcctgggg 60 cttcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gatacacatt cactagctat gttatgcact 120 gggtgaagca gaagcctggg cagggccttg agtggattgg atatattaat ccttacaatg 180 atggtactaa gtacaatgag aagttcaaag gcaaggccac actgacttca gacaaatcct 240 ccagcacagc ctacatggag ctcagcagcc tgacctctga ggactctgcg gtctattact 300 gtgcaagggg ctatggcctc ggggactact ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcct 360 ca 362

Claims

a) 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD40 IgG 항체;
b) 서열번호 7로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 8로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 9로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 10으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 11로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 12로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD46 IgG 항체;
c) 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 14로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 15로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 18로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD82B IgG 항체;
d) 서열번호 19로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 20으로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 21로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 22로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 23으로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 24로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD142B IgG 항체;
e) 서열번호 25 로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 26으로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 27로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 28로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 29로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 30으로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD142D IgG 항체;
f) 서열번호 31로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 34로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 35로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 36으로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD149A IgG 항체;
g) 서열번호 37로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 38로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 39로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 40으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 41로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 42로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD218A IgG 항체;
h) 서열번호 43으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 44로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 45로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 46으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 47로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 48로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD218B IgG 항체;
i) 서열번호 49로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 50 으로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 51 로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 52 로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 53으로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 54로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD228 IgG 항체;
j) 서열번호 55로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 56으로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 57로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 58 로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 59로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 60으로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD238 IgG 항체;
k) 서열번호 61로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 62로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 63으로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 64 로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 65로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 66으로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD243A IgG 항체; 및
l) 서열번호 67으로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 68로 표시되는 경쇄 CDR2, 서열번호 69로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 70으로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 71로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 72로 표시되는 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 상아모세포 특이적 OD256 IgG 항체; 로 이루어진 군에서 선택된 1종의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 a) OD40 IgG 항체는 서열번호 73으로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 74로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제2항에 있어서, 상기 a) OD40 IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 97로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 98로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 b) OD46 IgG 항체는 서열번호 75로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 76으로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제4항에 있어서, 상기 b) OD46 IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 99로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 100으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 c) OD82B IgG 항체는 서열번호 77로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 78로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제6항에 있어서, 상기 c) OD82B IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 101로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 102 로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 d) OD142B IgG 항체는 서열번호 79로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 80으로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제8항에 있어서, 상기 d) OD142B IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 103으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 104 로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 e) OD142D IgG 항체는 서열번호 81로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 82로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제10항에 있어서, 상기 e) OD142D IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 105로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 106으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 f) OD149A IgG 항체는 서열번호 83으로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 84로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제12항에 있어서, 상기 f) OD149A IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 107로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 108 로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 g) OD218A IgG 항체는 서열번호 85로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 86으로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제14항에 있어서, 상기 g) OD218A IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 109로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 110으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 h) OD218B IgG 항체는 서열번호 87로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 88로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제16항에 있어서, 상기 h) OD218B IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 111로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 112로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 i) OD228 IgG 항체는 서열번호 89 로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 90으로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제18항에 있어서, 상기 i) OD228 IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 113으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 114로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 j) OD238 IgG 항체는 서열번호 91 로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 92 로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제20항에 있어서, 상기 j) OD238 IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 115로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 116으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 k) OD243A IgG 항체는 서열번호 93으로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 94 로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제22항에 있어서, 상기 k) OD243A IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 117으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 118로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 l) OD256 IgG 항체는 서열번호 95로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 96 으로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제24항에 있어서, 상기 l) OD256 IgG 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 119 로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 120으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 IgG 단일 클론 항체는 분화된 상아모세포 표면에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제26항에 있어서, 상기 분화된 상아모 전구세포는 BMP2(bone morphogenetic protein 2) 및 BMP4(bone morphogenetic protein 4) 처리에 의하여 치수 줄기세포로부터 상아모세포로 분화된 것을 특징으로 하는, 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 포함하는 분화된 상아모세포 확인용 조성물.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 포함하는 분화된 상아모세포 확인용 키트.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 시료에 처리하는 단계; 를 포함하는 분화된 상아모세포 확인 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 포함하는 상아모세포 분리용 조성물.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 포함하는 상아모세포 분리용 키트.
a) 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 시료에 처리하는 단계; 및
b) 상아모세포와 결합된 항체를 분리하는 단계; 를 포함하는 상아모세포 분리 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 포함하는, 미분화된 치수 줄기세포를 상아모세포로 분화 촉진시키는 분화 촉진 물질 스크리닝용 조성물.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 포함하는, 미분화된 치수 줄기세포를 상아모세포로 분화 촉진시키는 분화 촉진 물질 스크리닝용 키트.
a) 미분화된 치수 줄기세포에 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 처리하는 단계;
b) 미분화된 치수 줄기세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및
c) 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 상아모세포 특이적 IgG 단일 클론 항체를 시료에 처리하여 결합 반응을 상기 a) 단계와 비교하는 단계; 를 포함하는 미분화된 치수 줄기세포를 상아모세포로 분화시키는 물질의 스크리닝 방법.